Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние тканевой культуры фолликулов на мейотическое созревание и оплодотворение in vitro ооцитов коров

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние тканевой культуры фолликулов на мейотическое созревание и оплодотворение in vitro ооцитов коров"

Ь.

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

IIа правах рукописи УДК 636.2:591.391.2

ШАГИАХМЕТОВА Галина Альбертовна

ВЛИЯНИЕ ТКАНЕВОЙ КУЛЬТУРЫ ФОЛЛИКУЛОВ

НА МЕЙОТИЧЕСКОЕ СОЗРЕВАНИЕ И ОПЛОДОТВОРЕНИЕ IN VITRO ООЦИТОВ КОРОВ

Специальность: 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ-ПУШКИН 1992

Работа выполнена в лаборатории культивирования эмбрионов Все российского научно-исследовательского института генетики и развсдепи; сельскохозяйственных животных. Санкт-Петербург.

Научные руководители — доктор сельскохозяйственных наук, про фессор Б. П. Завертяев; кандидат биологических паук Т. И. Кузьмина.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессо; А. И. Жигачев; доктор биологических наук Б. И. Протасов.

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт акушерст ва и гинекологии им. Д. О. ОттО РАМН.

Защита состоится «44 » 1992 года в 44 час. н;

заседании Специализированного совета Д 020.07.01 по защите докторских диссертаций при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных (189620; Санкт-Пе тербург—Пушкин, Московское шоссе, 55а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

.Автореферат разослан « 3 > Н&сХ^/л^5 1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных

наук, профессор Ж. Г. Логиное

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важным направлением современной биотехнологии в животноводстве, позволяющим более полно использовать генетический потенциал ооцитов самок, является экстракорпоральное оплодотворение созревших in vLir-o ооцитов. Кроме практического значения в воспроизводстве сельскохозяйственных животных, особенно однополого вида - крупного рогатого скота, экстракорпоральное оплодотворение ооцитов и культивирование ранних эмбрионов могут рассматриваться как база для разработки перспективных методов клеточной и генетической инженерии - деление эмбрионов, клонирование, создание генетических мозаиков и перенос генов в зиготы и ранние эмбрионы.

В настоящее время достигнут существенный прогресс в биологии оплодотворения in vitro у ряда млекопитающих. Так, у 20 видов млекопитающих зарегистрировано оплодотворение ооцитов вне организма. У некоторых видов после пересадки эмбрионов реципиентам получено живое потомство. Однако в технологии экстракорпорального созревания и оплодотворения ооцитов имеется ряд нерешенных задач. И одна из них - создание оптимальных условия созревания и оплодотворения, обеспечивающих высокий выход ооцитов, компетентных к оплодотворению и дальнейшему развитию в эмбрионы на стадиях морулы и бластоцисты.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось изучение влияния тканевой культуры фолликулов на мейотичеокое созревание и оплодотворение in vitro ооцитов коров. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработать оптимальные условия созревания ооцитов на основе тканевой культуры фоллшдглов;

- исследовать динамику мейотического созревания ооцитов на тканевой культуре фолликулов;

- изучить влияние тканевой культуры фолликулов на оплодо-творяемость ооцитов и выход эмбрионов;

- изучить мейотпческие преобразования хромосом в ооцитах коров, прокультивированных в условиях тканевой культуры с ис- . пользованием гормонов и белков фолликулярной жидкости;

- провести цитоморфологическую оценку структурных элементов ткани фолликулов при их культивировании.

т

Научная новизна работы. Разработан способ культивирования ооцитов на основе тканевой культуры фолликулов. Предложена оуе-да культивирования для тканей фолликулов, обеспечивающая оптимальные условия созревания ооцитов. Изучена динамика созревания ооцитов в условиях тканевой культуры фолликулов. Установлено, что включение е среду культивирования ткани фолликулов оказывает положительное влияние на мейотическое созревание и оплодотворение ооцитов коров. Впервые получены эмбрионы на стадиях морулы и бластоцисты при использовании разработанной системы культивирования.

Практическая значимость работы. Предложен модифицированный метод культивирования ооцитов коров с использованием тканевой культуры фолликулов, позволяющий повысить выход оплодотворенных яйцеклеток и ранних эмбрионов на стадиях морулы и бластоцисты. Данный метод рекомендуется использовать в биотехнологии культивирования и. оплодотворения ооцитов коров.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на отчетных сессиях аспирантов ВНИИРГЖ (1990, 1991 гг.), на Всесоюзном научно-техническом совещании "Проблемы развития биотехнологии в животноводстве" (Дубровицы, 1990), на научно-практической конференции "Биотехнология и воспроизводство в животноводстве" (Горки, 1991).

Публикации. По теме диссертации опубликовано три работы.

Объем и структура диссертации. Диссертавдя состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов и обсуадения, выводов и списка использованной литературы, включающего Х8б источников, в том числе 142 иностранных. Работа изложена на Ю8 страницах машинописного текста и содержит I рисунок, 13 таблиц, $ микрофотографий.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом для исследований служили ооциты и антральные фолликулы, выделенные из яичников коров и телок, убитых на Санкт-Петербургском мясокомбинате.

После вскрытия брюшной полости животного, яичники отсекали и помещали в термос с питательной средой ТС-199 с антибиотика-.ци. В течение 1,5-2-х часов яичники доставляли в лабораторию.

Для экспериментов отбирали яичники в стадии фолликулярного роста или с развитым желтым телом, а патологические (кистозные и геморрагические) , от стельншс самок и со свежей овуляцией отбраковывали. Яичники трижды отмывали физиологическим раствором с антибиотиками (стрептомицин - 50 мкг/мл, пенициллин - 100 ед/мл)

Ооцигы вмести с фолликулярной жидкостью аспирировали с помощью шприца из фолликулов диаметром 2-6 мм. Затем промывали 'их три раза в стандартной среде TC-I99 на растворе Эрла с добавлением 10$ фатальной сыворотки крупного рогатого скота, гепарина (I ед/мл) и гентомицина (10 ед/мл).

Морфологическую оценку ооцитов осуществляли визуально. Критерием их пригодности к культивированию считали наличие расширяющегося лучистого вонца, правильность формы и однородность' окраски ооцита, а "акта наличие многослойного кумулюса.

' Извлечение фолликулов производили, используя метод, разработанный в лаборатории культивирования эмбрионов.

После выделения фолликулов производили оценку их качества. При этом учитывали диаметр фолликулов, а также их функциональное состояние. Фолликулы классифицировали на три группы: к первой группе относили фолликулы, имеющие диаметр 3-6 мм, ко второй -7-8 мм, к третьей - 9-10 мм.

Нормальными считали фолликулы, имеющие высокий ту prop, проз- • рачную оболочку и хорошо развитую сеть кровеносных сосудов в те-ке. Фолликулы, не отвечающие этим требованиям, классифицировали , как дегенеркрсванные.

Фолликулы промывали в стандартной среде TC-I99 на растворе Эрла с добавлением гепарина и гентомицина в концентрации I ед/мл и 10 ед/мл соответственно. Для получения тканевой культуры фолликул разрывали глазными пинцетами в чашке Петри с 3 мл среды. Затем трехкратным промыванием ткани освобождали ее о'т фолликулярной Ш1ДКОСТИ.

Препарированную ткань помещали в пенициллиновкй флакон с 5 мл среды и культивировали в течение 24 часов нри температуре 38-39°С. Для культивирования использовали среду TC-I99 на растворе Эрла с добавлением 10$ фотальной сыворотки крупного рогатого скота и гентомицина (10 ед/мл).

После культивирования ткань фолликула извлекали из флакона препаровальной иглой, а полученная кондиционированная среда слу-

жила для дальнейшего культивирования ооцитов.

При исследовании функционального состояния тканей фолликулов использовали культуральные среды, модифицированные цутем введения в них сыворотки, комплекса гормонов - фолликулостиму-лирущего (ФСГ),.эстрадиола, хорионического гонадотропина человека (10?) и инсулина с концентрацией 10 мкг/мл, 50 нг/мл, 10 ед/мл и 4 ед/мл соответственно.

Для приготовления гистологических препаратов индивидуально фиксировали ткань каздого 'фолликула в растворе Буэна. Заливку препаратов производили через парафин. Срезы окрашивали гематоксилином соответственно Эрлиху и Бемеру. При анализе гистологических препаратов учитывали количество пикнотических ядер в клетках теки и гранулезы.

Для культивирования ооцитов использовали среду ТС-199 на растворе Эрла с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого окота и гентошщина (10 ед/мл).

Ооциты культивировали в пенициллиновых флаконах с плотно притертой пробкой или под.вазелиновым маслом в присутствии Ъ% . СО,, в воздухе, 90$ влажности и температуре 38-39°С. В первом случае, в пенициллиновый флакон с 5 мл культуральной среды помещали препарированную и отмытую ткань фолликула. Затем, используя ее в качестве подложки, с помощью пипетки помещала ооциты в количестве 25-30 штук. Во втором случав, а чашку Петра наливала 2 мл культуральной среды, ааливали ее вазелиновым маслом к препаровальными иглами вносила ткань фолликула. Затеи .ткань расправляла а шшеткой помещала на ее поверхность ооциты (1015 штук). "

Бремя инкубации составляло 5, Ю, 15, 20, 24, 25 и 30 часов.

Для улучшения условий культивирования в исходную среду добавляли комплекс гормонов в составе ФСГ, эстраднол и ХГ с концентрацией 10 мкг/мл, 60 нг/мл я 10 ед/мл соответственно. При использовании одаоротки крови коров, находящихся д эструсе, гормоны не добавляли.

Капацитаци» снормы прородшш по методу РагтЬ с использованием средиТЛ1Р.. Наиетты со опермиями разморакивали на водяной бане при температуре 37°С. В три флакона, гдо находилось по I мл т§олаЙ среду, подслаивали со 250 мкл оперыиев. Затем . на 1 чао флаконы помещали в ?армостат при температуре 38-39°с.

После этого из них отбирали по 700 мкл надосадочной жидкости в центрифужную пробирку и центрифугировали в течение 10 минут при 2,5 тно. об/мин. Затем шприцем отсасывали супернатант, оставляя 100 мкл осадка. В пробирку добавляли равное количество среды с гепарином (5 ед/мл) и итерировали сперму в течение ■ 15'минут. Суспензию разбавляли средой в соотношении 1:1.

Яйцеклетки, предназначенные для оплодотворения, оплывали в среде TC-I99 с 10% фетальной сыворотки крупного- рогатого скота и гентомицином (ГО ед/мл),

В чашки Петри раскапывали среду для оплодотворения. Затем капли покрывали вазелиновым маслом. В каждую каплю, содержащую 200 мкл среды, помещали по 50 мкл суспензии спермы и по 10 ооцитов. Чашки закрывали крышками и ставили в термостат при температуре 38-3'9°С, содержанием С02 в воздухе Ъ% и влажностью

• После 24 часов контакта со спермой из капель отбирали по 180 мкл среды и добавляли столько же свежей. Затем снова культивировали. Через 36-48 часов после осеменения эмбрионы развивались до 2-4-х клеточной атадш.

Для нормального развития ранних зародышей до стадий мору-лы и бластоцисты использовали в среде культивирования эпителиальные метки яйцевода. Дня получения культуры эпителиальных клеток яйцевода.брали его часть длиной около 4 см. Воронку предварительно отсекали. В чашку Петри с 5 мл ареды помещали участок яйцевода и, зажав пинцетом среднюю его часть, в оба конца от нее выдавливали содержимое тупой стороной скальпеля. Затем дозатором в пробирку переносили всю среду с эпителием. Через несколько секунд осаждения надосадочнуго жидкость отбирали, оставляя примерно I мл осадка, и добавляли свежую среду. Эту операцию повторяли три раза. Оставшийся I мл осадка осторожно пи-петировали 10-15 раз. В чашки Петри раскапывали среду TC-I99 с 20% фетальной сыворокти и комплексом гормонов -или только сыворотку крови крови коров, находящихся в эструсе, как ото указано выше.

На 200 мкл среда добавляли по 4 мкл осадка эпителиальных клеток яйцевода. Эпителиальные клетки яйцевода культивировали под вазелиновым маслом при температуре 38-39°С с Ъ% COg в воздухе и 90$ влажности в течете 36-48 часов.

Элбрионы на стадии 2-4-х клеток отмывали в среде, затем помещали для дальнейшего культивирования в капли о культурой эпителиальных клеток яйцевода. Предварительно из капель отбирали по 25 глкл среды с клетками эпителия и помещали туда дробящиеся зародыши.

Цитогенетические препараты мейотических хромосом ооцитов готовили по методу Тарковского. При оценке качества полученных эмбрионов также использовали метод Тарковского.

Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми статистическими метод at ли.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУДДЕНИЕ

Созревание ооцитов на тканевой культуре и в кондиционированных средах из ткани фолликулов разного диаметра.

С целью воспроизведения \л vitro естественных условий созревания ооцитов, мы использовали тканевую культуру и кондиционированные среды из ткани фолликулов разного диаметра. Поставленная задача основывалась на необходимости выявления оптимального размера фолликулов, позволяющих получать наибольший выход ооцитов на завершающих стадиях цейоза с наименьшим числом яйцеклеток, имеющих хромосомные нарушения.

Моделирование условий созревашш ооцитов коров на основе использования тканевой культуры фолликулов подразумевает, в первую очередь, разработку оптимального состава сред, обеспечивающих нормальный процесс культивирования тканей.

В связи с этим, нами были исследованы атретические процессы в ткани фолликулов при их культивировании в средах, модифи- . цированных за счет введения добавок биологически активных веществ.

Результаты проведенных гистологических исследований представлены в таблице I. '•

Как следует из приведенных данных, при включении в среду TC-I99 10$ фатальной сыворотки и гормонов ФСГ, ХГ и эстрадиола (опыт II) происходит снижений атретических процессов в клетках ткани фолликулов. В этом ьарианто опыта пикнотический индекс составил 19% против 2&% в контроле. В опыте III, отлича-аЗщбмся от предыдущего дополнительным включением в ^льтураль-

ную среду инсулина, происходило увеличение количества клеток с пикнозом (пикнотический индекс составил 29/1). Максимальные показатели пикнотического индекса (42-45$) наблюдались в опытах I и 17. Таким образом, оптимальной средой для культивирования ткани фолликулов является ТС-199 с 10% фетальной сыворотки и гормонами ФСГ, ХГ и эстрадиолом.

Таблица I

Влияние сыворотки кров« и гормонов (ФСГ, ХГ, эстрадиола, инсулина) на цитоморфологические изменения в ткани фолликулов .(клетки теки и гранулезы)

Число Продолжительность культивирования (час) Среда нуль- !*ОЛЛ11- 0_24

тивирования кулов нормаль- пшшоти- нормаль- пикноти-ные клет- ческле пые клет- ческие ки, /ь клетки,% юг, % клетки,%

Контроль _

ТС-199+1СЙ

Фетальной

сыворотки

Опыт I

ТС-199

Опыт II

ТС-19Э+Ш1

фетальной

сыворотки+

гормоны

Опыт III

ТС-199+Ю/0

фетально2

сыв0р0ткд+

гормонш-инсулин

Ошт 17 ТС-199+10?

фетальной

сыворотки+

инсулин

12

16

13

15

18

87,0 80,0 85,0

80,0 82,0

13,0 74,0 26,0

20,0х ' ' 55,0х 45,0™

15,0 81,0' 19,0

20,0х 71,0 29,0

18,0 58,0 42,0

|ХХ

Примечание. Расчет пиккоза проводился на ЮСО клеток

Радом исследователей обнаружена корреляция между размером антральных фоллицулов и компетенцией находящихся в них ооцитов к созревании. Данные о созрозании ооцитов коров при

о

ко-культивировании с тканью фолликулов разного диаметра представлены в таблице 2.

Таблица 2

Созреванце ооцитов коров на тканевой культуре фолликулов разного диаметра (время культивирования - 24 часа)

Чис-Группы ло опыта ооцитов

а(%) ооцитов на стадиях мейоза

ДИ

дк

1,1-1

А

Т-ьМ-П

п($)де-генери-розанных ооцитов

Контроль Ткань фолликула З-б мм

Ткань фолликула 7-8 мм

Ткань фолликула 9-10мм

137 72

68

75

4

3

4

5,5

12 9

8 11,2

23 17 7

9,8

17

12,5

7 ' 9,8

57

41

42

58хх

2 10 _ II 4 36

3 14,7х 16,2 5,8 53

4 10 13 2 ^ 39

5,3 13,4 17,4 2,6х* 52

24' 17,5

4 «г

5,б5®

5 V

7,3х

9,3х

Примечание. ДП - диплотена; ДК - диакинез; М-1 - метафа-за I; А - анафаза; Т+М-И - телофаза + метафаза II.

Видно, что ткань фоллшдгла диаметром 3-6 мм оказывает наиболее благоприятное влияние на мейотическое созревание ооцитов. В этой груше опыта выход ооцитов на завершающих стадиях мейоза был наивысшим (58%). В устальных группах, в которых ооу ревание ооцитов проходило в присутствии тканей фолликулов диаметром 7-8 и 9-10 мм,'процент созревших яйцеклеток составил 52-53. Отмечен низкий выход ооцитов с дегенерацией хромосом (5,6У1)" в группе опыта, где использовали ткань фолликулов диаметром 3-6 мм. Из результатов проведенных экспериментов следует, что ко-культивироваш.о ооцитсв с тканью фолликулов диаметром 3-6 мм обеспечивает более Полноценное созревание ; яйцеклеток, что подтверждается не только оптимальным выходом оодйтоа на завершающих стадиях мейоза, но и 'низким процентом яйцеклеток с дегенерацией хромосом. 8

Сходные данные получены при культивировании ооцитов в средах, кондиционированных тканями фолликулов разного диаметра (таблица 3). Наилучшие результаты по выходу яйцеклеток на завершающих стадиях мейоза получены в группах опыта, где использовалась среда, кондиционированная тканью фолликулов диаметрам 3-6 и 7-8 ш (52-57$ против 41 в контроле). Исполь- . зование среды, кондиционированной тканью фолликулов диаметром 9-10 мм снизило выход созревших ооцитов (10,5$).

Учитывая, что по данным литературы в фолликулах большого размера увеличивается количество клеток с признаками атрезии, причиной низкого выхода ооцитов на завершающих стадиях мейоза при использовании тканей таких фолликулов являются последствия деструктивных изменений в них.

Таблица 3

Созревание ооцитов коров в средах, кондиционированных тканями Фолликулов разного диаметра (время культивирования -

- 24 часа)

Группы опыта

Число

ооци-

п(%) ооцитов на стадиях мейоза

де-генерированных

тов дк М-1 А т+м-и ооцитов

Контроль ■137 4 3 12 9 23 17 17 12,5 57 41 24 17,5

Ткань Фолликула 3-6 мм 56 2 3,5 4 7,1 13 23,2 е - 29 52 8 14,2

Ткань фолликула 7-8 мм

Ткань Фолликула 9-10мм

79

39

I 1.2

I

2,5

5

6,3

18 23

82

I 45 г.г*** 57х

9

11,3

10,5^ 5,03®

Динамика созревания ооцитов на тканевой культуре фолликулов.

При изучен;® влияния тканей фолликулов разного размера на

Таблица 4

Динамика созревания ооцигов на тканевой культуре фолликулов диаметром 3-6 мм

Время Тщсшш вульти-олыта

Число

вирова-ндя (ч) тов-

Выход ооцитов на. стадиях мейоза (%)

ДП

ДК

й-1

А Т+М-П хромосом

% оохштов Цитомор^шогические иэ-

лр^Грнй_ менения в ткани фолли-с дегене-_го^лов {%)

нормальные шишотическне

рацией

клетки

клетки

Контроль Опыт 5 76 65 77,0 300.03® 7,7 - - 3,8 11,5 95,0 5,0

Контроль Опыт Ш 4В 56 33.0 23.1 55,6 73,1х 3,8 3,7 •7,7 88,5 11,5

Контроль Опыт 15 63 59 20,0 11,2х 20,0 48,0 44,4ХХХ33,<3Х 4,0 7,0 8,0 4,0 85,0 15,0

Контроль Опыт 20 66 78 2,6 20,0 ц^ххх 201б •2,1 7,1 5,9 52,2 58,8. - 16,0 З.О*** 81,0 19,0

Контроль Опыт 25 52 61 - 7,7. -20>8ххх 81з 19,2 4,2ХХХ 57,7 60,7 15,4 6,0х 80,0 20,0

Контроль Опыт 30 83 59 3,0 8,8 6,5 12,7 14,7 50,0 -58,0 16,8 ■ 32,330® . 56 44

созревание ооцитов важно определить не только оптимальный диаметр фолликулов, но и выяснить временные параметры созревания яйцеклеток в условиях применения тканевой культуры фолликулов для последующего оплодотворения.•

Динамика созревания ооцитов на тканевой ку^туре фолликулов диаметром 3-6. ш отражена в таблице 4.

Установлено, что оптимальным временем культивирования ооцитов в условиях тканевой культуры фолликулов является 2025 часов (выход созревших ооцитов составил 58,8-60,7$). Использование тканевой культуры фолликулов позволило сократить дегенерацию материала хромосом ооцитов до 3-6$ при их культивировании в течение 20-25 часов. В контрольных группах в • этот период процент ооцитов с кариологическими аномалиями составил 16-15,4. После 30 часов культивирования выход дегене-рированных яйцеклеток резко возрос и составил 32,3$ против 16,8 в контроле.

Анализ гистологических препаратов тканей фолликулов показал, что после 5 часов в культуре пикнотический индекс составил 5%, через 10 часов он был вдвое выше, через 25 часов -20$. При культивировании тканей в течение 30 часов процент пикнотических клеток возрастал до 44.

Таким образом, с увеличением продолжительности культивирования до 30 часов возрастает количество дегенерировшшых ооцитов и число шшштичеоких ядер в клетках теки и гранулезы.

Цитогенетическая характеристика ооцитов при использовании различных систем культивирования.

В этом разделе диссертации мы исследовали варианты культивирования яйцеклеток с применением феталыюй сыворотки и сыворотки крови коров в эструсе, а также белков фолликулярной жидкости в условиях тканевой культуры фолликулов..

Результаты цитогенетического анализа ооцитов при использовании различных систем культивирования представлены в таблице 5.

Показано, что применение белков фолликулярной жидкости первой фракции (М=65.000 Да) в концентрации 0^7 мг/мл в сочетании с тканевой культурой фолликулов диаметром 3-6 мм не оказало отрицательного влияния на хромосомы яйцеклеток. Выход созревших ооцитов в этом опыте составил 50,5-65$ против 41,1 в

Таблица 5

Патогенетическая характеристика ооцитов при культивировании в среде с белками фолликулярной жидкости фракции I и тканью фолликулов различного диаметра (время культивирования - 24 ч)

Группы опыта Число п{%) о'оцитов на стадиях мейоза п{%) де-генери-

ооцитов дп Ж M-I T+M-II рованных ооцитов

Контроль 68 - 3 —• 32 28 5

ТС-199+ 5% БФЗ-1 4,5 _ , 47 41,1 7,4

Опыт I 80 4 . 4 §ххх 4

ТС-199+ 5 5 20ххх ' 5 •

5% БФЖ-1

+ ткань

Фолликула *

3-6 мм >

Опыт II ТС-199+ 5% БФ2-1 65 - - 27 41,5 33 50,5 5 8

+ ткань

Лолликула

7-8 мм

т^1 67 2 2 27 29 7

5%БФ1-1 3 3 40,3 43,2 10,5

+ ткань 1

фолликула

9-IU ММ

Примечание. БФЖ-1 - белки фолликулярной жидкости первой •фракции.

контроле. Использование тканей фолликулов диаметром 9-10 ш (опыт III) усилило процессы дегенерацдй материала хромосом до 10,5$ (против 7,4% в контроле), а-выход созревших яйцеклеток при этом составил 43,2%,

Таким образом, выявлено положительное влияние белков фолликулярной жидкости первой фракции на созревание ооцитов в условиях применения тканевой культуры фолликулов.

Данные исследований по влиянию сыворотки крови на созревание ооцитов в условиях тканевой'культуры фолликулов представлены в таблице 6.

Показано положительное влияние эстральной сыворотки в сочетании с тканью фолликулов па состояние ядерного материала

Таблица 6

Влияние фетальной и астральной сшзороток на созревание ооцктов и их оплодотво-ряемость при использовании тканевой культуры фолликулов (время культивирования - 24 часа)

п($) оллодотво- а{%) дегснери-решшх яйцекло- рованных ооци-ток тов

Группы опыта

Число

ООЦЕ-тов

п($) ооцлтов на стадиях ¡леЛоза

ДП

да

М-1

Т+1Л-И

Контроль

ТС-199+20$ фе- 88 тальной сыво-ротки+гормоны

Опыт I

ТС-199+20$ детальной сыво-ротки+гормоны +ткань фолликула

90

4 24 4 - 32

.4,5 27,3 4,5 - 36,4

8_ 14 4 50

дХ 9 16ХЕ: 4 бб^

5 10

24 27,3

|кх

Опыт II

ТС-199+20$ астральной сыворотки .

74

3ххх

удххх

■ 11

7

10ххх

Опыт III ТС~199+20$ эс-тралъной сыво-ротки+ткань фолликула

84

9 II 4 55 Ю.7ХХ2 13,5 65,4:

ххх

18 60х

5

5,9***

3

4

ооцитов. При использовании тканей фолликулов выход-созревших ооцитов в группах с фатальной и эстральной сыворотками составил 56 и 65,4$ соответственно. Причем, отмечена тенденция к снижению доли ооцитов с дегенерацией хромосом. Использование

астральной сыворотки позволило увеличить выход созревших ооцитов до 70%, процент яйцеклеток с аномалиями хромосом составил 10. В контрольной группе, где использовали только фе-тальяую сыворотку, 27,3% ооцитов оказались с нарушениями ядерного материала. Использование тканевой культуры фолликулов в; сочетании с сывороткой крови коров, находящихся в астру се, при созревании ооцитов благотворно влияло на их оплодотвордемость. В этой группе процент о'плодотворяешетн составил 60, тогда как при введении лишь одной эстральной сыворотки этот показатель - был 45. При использовании фетальной сыворотки оплодотворенные яйцеклетки не зарегистрированы. Добавление ткани фолликулов позволило получить 10,j оплодотворенных яйцеклеток.

Экстракорпоральное оплодотворение оохтктов; созревших - на ттсаневой культуре фолликулов.

Выявив' оптимальные параметры созревания яйцеклеток в условиях тканевой культуры фолликулов, ш провели серию экспериментов по оплодотворению таких ооцитов.

В таблице 7 отражены результаты трех экспериментов по влиянию тканевой культуры фолликулов на оплодотворение ооцитов и-выход эмбрионов (совместные эксперт,тенты II и III вы* полнены в апреле 1991 г. в Научно-производственном биотехнологическом центре по животноводству).

■ Показано, что использование тканевой культуры фожцгкулов . повышает процент созревания ооцитов. 3 эксперт тентах по оплодотворению яйцеклеток, созревших'в условиях тканевой культура, мы установили, что они являются компетентными к оплодотворению и развитию в эмбрионы при пролонгированном ;з'йъти-вировшгаи. Обобщив результаты проведенных экспериментов, можно заметить, что использование тканевой культуры фолликулов при созревании ооцитов увеличило их выход на завершающи стадиях мейоза с 70,7 в контроле до 62,6^, повысило опло-дотворяемость с 42,2 в контроле до 72,5%. Выход морул и бластоцист в контрольных группах 0Ш1 Б СрЙДНОМ St6%, я Я ОЯ1П?—

Таблица 7

Влияние тканевой культуры фолликулов на созревание и оплодотворение социтов

Вариант опыта

Число ооцитов

созрев,-

п($) оплодо- п($) морул

ших ооцитов

и бласто-

цист

Эксперимент I

Контроль Опыт 30 30 б2* 69х 18®*** 3(17)

Эксперимент Контроль Опыт II 30 28 82 90 я®*** УЗ«

Эксперимент Контроль Опыт III 23 33 78 89 27®ххх 17 (Щ***

Средняя по экспериментам ($) Контроль 83 70,7

Опыт 91 82,6

ных 41$. Разница между опытом и контролем статистичеокк доотб-верна.

Все эмбрионы, полученные в результате экспериментов, били подвергнуты цитоморфологической оценке.(таблица 8).

Анализ полученных данных показывает, что в опытных грун-пах каждого из экспериментов процент раздробившихоя клеток был значительно выше:, чем в контрольных (53-78 против 20-48). В контрольных группах выход эмбрионов на стадиях 2-4-х клеток был выше, чем в опытных и находился в пределах 50-67 и 12-56$ соответственно. Однако в контрольных группах не обнаружены эмбрионы на стадии бластоцисты, а морул зарегистрировано лишь 8-9$. >

Во втором и третьем экспериментах использование тканей фолликулов позволило получить 20-46$ морул и 15-19$ бласто- -цист соответственно.

Введение тканевой культуры фолликулов в среду созревания ооцитов сократило выход эмбрионов с признаками догонераций

.XX

Таблица ö

Цитоморфологическая характеристика эмбрионов, полученных с использованием ткани фолликулов

Вато„, Чис- п«)дро- . из них а{%) эмбрионов на п($)де-йариант ло бящихся стадиях: генорн-

опыта ооци- клеток -стадиях.--.пован-

тов 2-4-х Ь-В-и мору- бласто-Г,,^ „-л _клеток клеток лы_цисты-

Эксперимент I .,„„, _ Tivrnv '

Король 30 X|{|0jxxx Jgj: 2(13) II 6)> «

Эксперимент II ,,„« r>(?c.\

КРОЛЬ 30 2Q(7j)Xxx 8S« 5(25) ШЬ™ 3(Ь)• Ш Эксперимент III

Контроль 23 H(48)m 6(55) ; ^)„I(9) - 3(27Y

Опыт 33 26(78) зиг)™* 4(I5)> 12(46) 5(19) 2(8)

(дробление неравномерно, число ядер, не соответствует количеству бластомеров) с 25-27% в контроле до 8-10$.

Результаты анализа данных трех экспериментов-выявили тен->-денцию, отражающую преимущество использования предлагаемого спо* соба культивирования.ооцитов (по сравнению с контролем) как по выходу созревших ооцитов; так и по числу оплодотворенных ооцитов и эмбрионов, достигших стадий морулы и бластоцисты.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован метод культивирования ооцитов коров. Предложена среда культивирования с добавлением ткани фолликулов, обеспечивающая оптимальные условия мейотичоского созревания и оплодотворения ооцитов.

2. При соблюдении разработанных условий ко»вультивирова-ния с-тканью фол;гикулов стадии метафэзы второго мейотического деления достигают 58/о ооцитов (в контроле 41/»).

3. Использование ко-культивирования с тканью фолликулов-позволило получить оплодотворяемость яйцеклеток на уровне 6082$, в то время как в контрольных группах процент оплодотворениях ооцитов составил 26-56.

4. Созревание ооцитов в условиях применения тканевой-'•куль*--typH фолликулов обеспечивает при дальнейшем оплодотворении -.выт

ход эмбрионов на стадиях морулы и блаотоцисты до 63)'.

5. Виявлено, что оптимально!! средой для культивирования тканей! фолликулов является ТС-199 с 10% Стальной сыворотки й гормонами (ЮГ, ХГ и эстрадиолом). При использовании данной среды в процессе культивирования тканей 'зарегистрирован самый низкий процент шшютических клеток.

6. Исследована динамика атретических процессов в ткани . фолликулов по мере ее культивирования. Через 25 часов культивирования процент пшшотических клеток в ткани фолликулов составил 20, а через 30 часов произошло их удвоение. Оптимальным временем для культивирования ткани следует считать 25 часов.

7. Установлен положительный эффект на созревание ооцитов тканевой культуры фолликулов диаметром 3-6 мм в сочетании о'5% белков фолликулярной жидкости с молекулярной массой 65,000Да и выше. Выход созревших ооцитов составил при этом 65$, а ооцитов

с аномалиями хромосом -5$ (по сравнению с 41,1 и 7,4/5 в контрол^.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для получения эмбрионов коров на стадиях морулы и блас- ■ тоцисты рекомендуется использовать систему созревания ооцитов

на основе тканевой культуры фолликулов.

2. Материалы диссертации могут быть использованы ? учебных курсах по генетике и биотехнологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЛЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кузьмина Т.И., Завертяев Б.П., Шагиахметова Г.А. Перспективы использования тканевой культуры фолликулов для созревания ооцитов коров вне организма//Всес. совещ. Проблемы развития биотехнологии в животноводстве: Дубровицы.-1990.- С.22-24.

2. Кузьмина Т.И., Позднякова Т.Э., Шагиахметова Г.А. Оценка качества исходной популяции клеток гранулезы с целью получения монослоя//Б:ол. ВШИРГН.-Вып.123.-Л.-1990.- С. 27-29.

3. Кузьмина Т.И., Шагиахметова Г.А., Завертяев Б.П. Модификация сред для экстракорпорального культивирования и оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота путем введения в них гормонов//Науч.конф. Биотехнология и воспроизводство в животноводстве: Горки. - 1991. - С. 36-37.