Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РЕАЛИЗАЦИЯ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛАКТИНА НА МЕЙОЗ ООЦИТОВ КОРОВ

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "РЕАЛИЗАЦИЯ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛАКТИНА НА МЕЙОЗ ООЦИТОВ КОРОВ"



на правах рукописи

с

СКОТТИ ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

РЕАЛИЗАЦИЯ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛАКТШ1А НА МЕЙОЗ ООЦИТОВ КОРОВ

03.00.15. - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург-Пушкин 2008 г.

Работа выполнена в лаборатории биологии развития ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики к разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемин

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Татьяна Ивановна Кузьмина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Свиридов Б.Е. (ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН),

доктор медицинских наук, профессор,

Никитин А.И. (Балтийский институт репродуктологии

человека)

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Защита диссертации состоится 2008 года

в \\ часов на заседании диссертационного совета Д.006.013.03 по защите диссертаций на соискание степени кандидата биологических наук при П1У Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 196601, Санкт-Петербург — Пушкин, Московское шоссе 55-а. Факс:(812)465 99 89 spbvniigen@inail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИНГТЖ РАСХН

Автореферат разослан << » ' ^ 2008года.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г,И.Сердюк

1ЧАУ-МСКА имени К.А. Тимирязева I. Общая хдоетер&с№&|ДОЯН<У 1111 Желе зной л Актуальность проблемы. В настоящее

репродуктивных технологий, в основе *лгтр).^„ .^ту"-1" rnnt*nR

дозревания ооцнтов in vitro, такие, как трансплантация эмбрионов, клонирование, трансгенез, получение эмбриональных стволовых клеток были разработаны и совершенствуются благодаря научным разработкам в области исследования механизмов регуляции фолликулогенеза и созревания ооцитов. Вопрос о приобретении яйцеклеткой, созревшей in vitro, компетентности к оплодотворению и дальнейшему развитию эмбрионов сохраняет свою актуальность. В процессе завершения мейоза вне организма важную роль играет система культивирования. Введение в среды для культивирования различных гормонов и биологически активных веществ позволяет выявлять характер их воздействия на хроматин соматических клеток фолликула и гамет, оценивать их способность к оплодотворению и дальнейшему формированию эмбрионов. Ведущая роль фолликулостимулирующсго и лютеннизирующего гормонов в регуляции фолликуло- и оогенеза твердо установлена. В то же время, возможная роль пролактина (ПРЛ) в механизмах формирования биологически полноценной яйцеклетки недостаточно ясна. Рядом авторов обнаружено, что пролактин оказывает стимулирующий эффект на созревание ооцнтов (Lindner et al., 1988; Chang et al., 1998; Wise et al., 1987; Кузьмина и др., 2001)- Выявлено, что качество ооцитов, полученных от суперовулированных телок коррелирует с увеличенным содержанием в фолликулах ПРЛ (Wise et al., 1994), Добавление ПРЛ в среду культивирования ооцитов благоприятно влияет при оплодотворении in vitro на выход полноценных эмбрионов на стадии бластоцисты (Kanitz et al., 1996, Tomer et al.,1996). В литературе представлены данные об экспрессии мРНК рецепторов пролактина в ооцитах и ранних эмбрионах мышей, а также в овариальных клетках овец, что указывает на возможность прямого воздействия пролактина на формирование зрелой яйцеклетки (Picazo et al., 2004; Kía-pekou et al., 2005).

В этой связи, вопрос о механизмах действия пролактина на мейоз ооцитов и путях их реализации становится актуальной проблемой генетических основ репродуктивной биологии.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 годы. 06.01.03 — Исследовать молекулярногенетнческие, биохимические, цитологические и эмбриологические процессы, лежащие в основе трансгенеза, создать геннойнженерные конструкции и разработать способы, повышающие эффективность биоинженерных технологий получения животных с заданными свойствами. JMsr гос.регистрации: 15070.7815014664.06.8.001.0.

Пели и задачи исследований. [¡аср^^Уд^даТ^ы ~ г

исследование механизмов реализации э< |

ЦИБ им сил Н.11. Железнова ¡ ; Фонх научной литературу ¡

L_____i

ооцитов при их созревании, оплодотворении и развитии

доим плантационных эмбрионов in vitro.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Сравнить степень чувствительности овариальных клеток из фолликулов разного диаметра к воздействию пролактина, с учетом:

- стадии мейоза ооцитов;

- степени экспансии клеток кумулюса;

- уровня пикнозов в кумулюсе;

- оплодотворяемостн ооцитов;

- развития доим плантационных эмбрионов;

2. Охарактеризовать влияние пролактина па кинетику мейоза в ооцитах коров из фолликулов разного диаметра;

3. Изучить характер действия пролактина на активацию киназы гистонов III и м итоге «активируемых протеи нкиназ (MAP киназ) в процессе созревания ооцитов коров in vitro;

4. Выявить эффекты днбутирил-цАМФ (дбцАМФ) на завершение мейоза в ооцитах, созревших в присутствии пролактина, их оплодотворение и развитие эмбрионов;

5. Проанализировать роль цАМФ/протеинкиназа Л - зависимого сигнального пути в реализации действия ПРЛ на созревание окруженных кумулюсом ооцитов коров.

Научная новизна. Впервые выявлено и охарактеризовано влияние пролактина на кинетику мейоза в ооцитах, выделенных из фолликулов коров разного диаметра.

Впервые показано вовлечение в процессы реализации эффектов пролактина на мейоз ооцитов in vitro киназы гистонов HI и MAP киназы.

Впервые идентифицирован характер действия дбцАМФ на завершение мейоза в ооцитах, созревших в присутствии ПРЛ, дальнейшее их оплодотворение и развитие эмбрионов.

Впервые получены данные, свидетельствующие о возможном участии иАМФ- зависимою внутриклеточного пути в опосредовании действия ПРЛ на ооцит-кумулюсмые комплексы коров.

Тео ист и ч ее ь'я я и практическая значимость работы. Теоретически обоснована модель реализации действия пролактина на созревание коровьих яйцеклеток. Выявлено, что характер влияния пролактина на созревание ооцнтов коров, их способность к оплодотворению и дальнейшее развитие эмбрионов зависит от диаметра исходного фолликула, то есть от степеии диффереицнровки фолликулярных клеток. Обнаружено пролонгирующее действие ПРЛ на процесс мейоза ооцитов, которое, вероятно, способствует синхронизации ядер но-цнто плазм этического созревания и обуславливает приобретение яйцеклетками компетентности к оплодотворению. Полученные результаты дополняют имеющиеся представления о внутриклеточных сигнальных путях реализации эффектов пролактина in vitro на мейоз в ооцитах коров. Паши экспериментальные

данные доказывают, что действие гормона может осуществляться через разные сигнальные пути, в том числе и через цАМФ-зависимый путь, по крайней мере частично, как па уровне синтеза и распада цАМФ, так и через регуляцию активностей MAP киназ И киназы гистонов HI. Анализ результатов исследований по выявлению эффектов пролактина и теофиллина на ооцит н его кумулюс свидетельствует о сопряжении сигнального каскада, индуцированного ПРЛ, в оошгг-кумулюсных комплексах коров, и ц AM Ф-завис имого внутриклеточного пути. Экспериментальные данные позволяют предположить, что запуск определенного сигнального каскада ПРЛ в ооцит-кумулюсном комплексе зависит от стадии фолликулярного созревания, соответственно, степени зрелости яйцеклетки. Практическая ценность работы представлена разработкой системы дозревания ооццтов из фолликулов диаметром 3-5, 58 мм на основе использования 50 нг/мл ПРЛ, позволяющей повышать выход биологически полноценных яйцеклеток и эмбрионов коров. Аиробация работы. Материалы диссертации были представлены и одобрены на ежегодных аспирантских сессиях и отчетах ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии, на Менаду народных конференциях: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» Пущнно (2005, 2007 годы), «Клеточное ядро» Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, 2007. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 - в журнале, входящем в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и результатов исследований, их обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной при написании диссертации литературы, включающего 215 источников, в том числе 194 на иностранном языке. Диссертация изложена на 125страницах,включает 7таблиц, 21 рисунок. Положения, выносимые на защиту;

1. Эффекты пролактина на соматические клетки овариальиых фолликулов коров и ооцит при мейотическом созревании яйцеклетки in vitro носят комплексный характер и зависят от диаметра фолликула.

2. MAP киназы (ERK1 и ERK2) и киназа mстонов HI опосредуют эффект пролактина на динамику ядерного созревания ооцитов коров in vitro.

3. цАМФ/протеинкиназа А — зависимый сигнальный путь вовлекается в реализацию действия ПРЛ иа мейоз ооцитов коров in vitro.

4. Использование пролактина (50 нг/мл) при экстракорпоральном дозревании ооцитов, выделенных из фолликулов диаметром 5-8 мм обеспечивает высокий выход эмбрионов на стадиях поздней морульг, бластоцисты (52,6% против 25% в контроле, Р < 0,05).

2. Материал н методы исследований. Исследования были выполнены согласно представленной структурно-лопгческой схеме экспериментов (рис. I). Материалом для исследований служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) из а «тральных фолликулов коров и половозрелых телок

черно-пестрой породы, убитых на мясокомбинате Санкт-Петербурга. Яичники без видимых признаков патологии, находящиеся на стадии фолликулярного роста, или с развитым желтым телом доставляли в лабораторию в термосе при температуре 30-35°С в течение 1,5-2ч после овариэктомии. ОКК выделяли аспирацией фолликулов, промывали 3 раза в среде ТС-199 ("Sigma", США), содержащей 10% фетальной сыворотки (ФБС) н 50 мкг/мл гентамицина. Для экспериментов отбирали ооциты с гомо1ч;пиоЙ цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным кумулюсом. Культивирован не ОКК проводили в среде ТС-199 с 10% ФБС, 0,55 мг/мл лактата кальция ("Serva", Германия), 0,23 мг/мл пирувата натрия ("Serva", Германия), 1,27 мг/мл 1 IEPES-буфера («Merck», Германия) и 50 мкг/мл гентамицина под минеральным маслом («Sigma»). В среду с опытными группами вносили гниофизарный бычий ПРЛ (активность 20,0 МЕ/мг; Институт эндокринологии, Москва) б концентрации 50 нг/мл, теофиллин (ТФ) (5мМ; ICN, США). В отборе концентраций руководствовались данными, полученными ранее в лаборатории биологии развития (Kuzmina et al., 1999). Статус хроматина ОКК и эмбрионов оценивали по методу Тарковского (Tarkowski, 1966). Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов проводили по методу Парриша (Parrish et al., 1986). Диализ активности киназы гистонов HI и MAP киназ осуществляли в соответствии с методом Мотлика и соавторов (Motlik et al., 1996). Ооииты (по 10 клеток на образец) промывали 4 раза в фосфатном буферном растворе (ФБР), переносили в пробирки, содержащие 3 мкл ФБР, и замораживали при -70 "С. После размораживания добавляли 4 мкл буфера А (15 мМ параннтрофенилфосфат, 60 мМ р-глинерофосфат, 15 мМ EGTA, 0,1 мМ ЭДГА, I мМ ДТТ, 0.25 мМ Na3VO„, 60 мкг/мл лейпептшш и 60 мкг/мл апротпнипа). Содержимое пробирок перемешивали на вортексе и центрифугировали при 10000 g в течение 15 сек, Реакцию инициировали, добавляя 5 мкл буфера Б (25 мМ Хепес, рН 7,2, 5 мМ паранитрофспилфосфат, 60 мМ Р-глицерофосфат, 25 мМ MgClj, 15 мМ ЭДТА, 0,1 мМ EGTA, 20 мкМ ингибитор цАМФ-за виси мой протеин киназы (Sigma, Германия), 60 мкг/мл лейпептина и 60 мкг/мл апротинина), 600 мкМ АТФ, 2 мг/мл гистона HI (Boehringer, Германия) в случае измерения активности киназы гистонов Ш и 600 мкМ АТФ, 3 мг/мл MAP (миелин основной белок) при измерении активности MAP киназ ir 500 мкКи/мл 1)гР]-АТФ (Amersham, Германия). Через 30 мин инкубации при 30 °С реакцию прекращали, добавляя 15 мкл 2-х кратного ФБР, Образцы инкубировали в течение 3 мин при 95 °С и разделяли на 15 %-пом SDS PAGE геле. Гели окрашивали Кумассн синим R250 (Serva, Германия), высушивали и подвергали авторадиографни и денситометрии. Измеренную киназную активность выражали в процентах от максимального уровня активности киназы гнетоноп HI и MAP киназ. Иммуноблотгппг с антителами к р44 (ERK1) и р42 (ERK.2) проводили, учитывая, что

с

активность ми е л н ис вязы вающей протеин кииазы (МБР) отражает активность MAP киназ. Ооциты отмывали 5 раз в среде, свободной от белков (PBS), лизировалн в Юмкл в буфере SDS с 5% 2-меркаптоэтанола и хранили отдельно при -80° С до электрофореза. Образцы разделяли на 9% SDS PAGE геле (доля бисакриламнда в сепарационном слое - 100:1). Сепарированные белки перемещали на мембраны Immobilon-P (Millipore, Eschborn,Germany) в tank-buffer аппарате (200 мА, 1 час). Блоты инкубировали при комнатной температуре в 10% Teleost желатине (Sigma), растворенном в 0,05 % Tween-20 Tris-буфферком физиологическом растворе, pH 7,4 (TTBS) в течение часа до обработки ERKI антителом (Santa Cruz, sc-94, 1:1000 в TTBS), полученным против иммуноглобулинов кролика, сконъюгированные с пероксндазой хрена (Amersham, 1:5000 в TTBS). После интенсивного отмыва (>1 часа, > 5 повторностей) блоты подвергали процедуре ECL хемилюмннесценции согласно инструкциям производителя (Amersham). Для сравнения результатов, полученных в опытных и контрольных группах, использовали критерий ^2 (Лакин, 1990) с помощью статистической программы Sigma Stat. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: Р<0,05; Р<0,01; Р<0,001.

Рис. 1. Структур но-логическая схема экспериментов 3. Результаты собственных исследований 3.1. Вл II ян не пролактнна на созревание ооцитов, выделенных нз фолликулов разного диаметра. Известно, что концентрация ПРЛ в организме млекопитающих по мере роста фолликулов возрастает. Повышение уровня ПРЛ в фолликулярной жидкости (ФЖ) наблюдается на стадии фолликулярного роста до наступления овуляции, когда отмечается резкое падение уровня гормона в зрелых фолликулах (Henderson et al., 1982; Subramanian et al., 1988). Увеличение концентрации ПРЛ в ФЖ созревающего фолликула указывает на важную роль гормона в пролиферации, дифференцировке фолликулярных клеток и созревании

ооцитов. Исходя из этих данных, нами были исследованы эффекты ПРЛ на способность ооцитов к созреванию, оплодотворению и развитию донмплантацнонных эмбрионов из фолликулов разного диаметра. Наибольшее число созревших ооцитов при культивировании в отсутствии гормонально!» воздействия отмечалось в группе клеток, выделенных из фолликулов диаметром 3-5 мм. В данной группе число ооцитов, находящихся на стадии метафазы II составляло 81,6%, что достоверно выше значения данного показателя в группе клеток, выделенных из фолликулов менее 3 мм (Р<0,05), где процент ооцитов, достигших продвинутых стадий ядерного созревания равнялся 46,6%- (таблица I). Между группами ОКК из фолликулов диаметром 3-5 и 5-8 мм не было выявлено статистически достоверных различий по числу ооцитов, достигишх стадии метафазы II. Полученные результаты свидетельствуют о высокой компетентности к развитию ооцитов, выделенных из фолликулов диаметром 3-5 и 5-8 мм по сравнению с ооцнтами, выделенными из фолликулов диаметром менее 3 мм. При внесении ПРЛ в среду культивирования отмечалась тенденция к увеличению числа ооцитов, находящихся на стадии метафазы II, извлеченных из фолликулов диаметром менее 3 мм и 5-8 мм. В то же время эффект ПРЛ на уровень созревания ооцНтов, выделенных из фолликулов диаметром 3-5 мм, отсутствует. Это указывает на то, что действие ПРЛ на ядерное созревание и последующее развитие эмбрионов in vitro зависит от размера фолликула. При осеменении ооцнтов, созревших in vilro, наивысший уровень оилодотворяемости был отмечен в группе ОКК, выделенных из фолликулов диаметром 5-8 мм (70%), а самый низкий - в группе ооцитов, выделенных из фолликулов менее 3 мм, где доля оплодотворившихся яйцеклеток составляла 61,7 %. При развитии эмбрионов, полученных из ооцитов фолликулов малого диаметра, был отмечен и самый низкий уровень образования морул и бластоцист. ПРЛ не оказывал влияние на оплодотворяемость ооцитов, выделенных из всех групп фолликулов. Однако, отмечались различия в действии гормона на формирование морул и бластоцист из ооцитов фолликулов разного диаметра. Так, ПРЛ не влиял на уровень развития эмбрионов до стадии морулы или бластоцисты из ооцитов фолликулов диаметром 3-5 мм и менее Змм. При этом ПРЛ оказывал положительное влияние на развитие морул и бластоцист из ооцитов, выделенных из фолликулов диаметром 5-8 мм. Полученные результаты показывают, что характер действия ПРЛ на созревание ооцнтов коров, их способность к оплодотворению и дальнейшее развитие эмбрионов зависит от диаметра исходного фолликула, то есть от степени днфференцнровки фолликулярных клеток.

3.2. Деструктивные процессы в клетках ку мул юса ооцнтов при их культивированнн в средах с мролактнном. Созревание ооцита in vitro -это результат взаимодействия ооцита С окружающими его клетками кумулюса (Eppig, 2001). При проведении экспериментов по выявлению уровня пнкнозов в кумулюсе при культивировании ооцнтов in vitro из

фолликулов разного диаметра с ПРЛ и без него показано, что наибольший уровень дегенерированных кумулюсных клеток характерен для группы ОКК, выделенных из фолликулов диаметром менее 3 мм (29,6%). После 24 часов культивирования отмечено повышение пнкнотического индекса во всех исследуемых группах. Внесение ПРЛ в среду лри культивировании в течение 24 часов значительно снижает число пикнотических ядер в ОКК, выделенных из фолликулов диаметром 3-5 мм (5,7 % против 25 %, Р< 0,01). В целом полученные результаты свидетельствуют о том, что ПРЛ снижает уровень клеток с пикнотическнми ядрами в кумулюсе, способствуя, таким образом, увеличению числа кумулюсных клеток, которые являются продуцентами эстраднола. Эстрадиол, в свою очередь, способствует образованию фактора промоции созревания. Вероятно, ПРЛ, увеличивая число жизнеспособных кумулюсных клеток, способствует приобретению ооцитами компетенции к созреванию in vitro и дальнейшему оплодотворению.

Таблица 1, Влияние пролактина на созревание ооцитов, выделенных из фолликулов разного диаметра, оплодотьоряемость и развитие эмбрионов коров in vitro (п ооцитов — 153,п оплодотворившихся клеток — 238, п

раздробившихся — 214, п морул и бдастоцист — 78; 3 повтори ости)

№3 метр фол ли-кула (мм) концентр ациж ПРЛ (яг/мл) %(П) созревания (число клеток на стадии метафазы II) % (п) оплодотворившихся клеток %(п) раздробивших ся клеток %(п) морул/ бластоцист (7-ой день)

<3 50 62,1 (18/29) 67,7 (42/62) 64,5 (40/62) 12,9(8/62)'

0 46,6 (14/30)* 61,7 (37/60) 36,7 (34/60) 13,3 (8/60)

3-5 50 81,6 (34/42) 62,9(56/89) 49,4 (44/89) 23,6 (21/89)"

0 81,6 (31/38)° 64,0 (48/75) ' 58,7 (44/75) 21,3 (16/75)

5-8 50 85,7 (6/7) 68,4(13/19) 68,4(13/19) 52,6(10/19)'

0 74,1 (5/7) 70,0 (42/60) 65,0 (39/60) 25(15/60/

Достоверность различия сравниваемых значений: *■b Р<0,01 ; ГР<0,05;41 Р<0,05; с'еР<0,05

33. Влияние пролактина на кинетику мейоза в ооцитах коров in vitro.

С целью выявления характера действия ПРЛ на ядерное созревание ооцитов были проведены эксперименты по изучению влияния гормона на кинетику мейоза in vitro. Обнаружено, что ре инициация мейоза происходила через 6 часов; стадии метафазы I ооциты достигали через g,l 18,24, анафазы I - 13,45-14,95, ранней телофазы I - 15,62-15,99, поздней телофазы 1 — 17,62-17,96 и метафазы II - 21,48-22,99 часов от начала культивирования (таблица 2). Анализ данных экспериментов показал, что время завершения ядерного созревания ооцитов возрастает (Р<0,01) при увеличении диаметра фолликулов. ПРЛ тормозил мейоэ в ооцитах, выделенных из разных фолликулов, на различных стадиях ядерного созревания. Так, внесение гормона в среду культивирования вызывало

замедление перехода от метафазы I к анафазе I в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм. В отсутствии ПРЛ анафаза 1 наступала через 13,45±0,72, а при воздействии гормона - через 16,07±0,82 часов, Р<0,05. ПРЛ способствует увеличению продолжительности метафазы I от 5,34 до 8,10 часов, Р<0,05. При созревании оошггов из фолликулов диаметром 4-5 мм, тормозящее влияние гормона было обнаружено при переходе от ранней к поздней телофазе I, а также от поздней телофазы I к метафазе И. Время от начала культивирования ооннтов из фолликулов диаметром 4-5 мм до стадии поздней телофазы I возрастало от 17,96±0,77 до 20,28±0,79 (Р=0,09), до стадии метафазы П ог 22,99*1,04 до 25,91 ±0,95 (Р=0,01). Сравнительный анализ средней продолжительности различных стадий мейоза показал сходные результаты (таблица 3), Так, в присутствии ПРЛ наблюдалась пролонгация стадии метафазы I в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм и стадии телофазы 1 в ооцитах из фолликулов диаметром 4-5 мм. Выявленное пролонгирующее действие ПРЛ на процесс мейоза ооцнтов, вероятно, способствует синхронизации ядерно-цнтоштазматического созревания яйцеклетки. Возможно, наблюдаемые эффекты являются следствием взаимодействий оонига с клетками кумулюса в присутствии пролактина.

Таблица 2. Эффект бычьего пролактина (50 иг/мл) на кинетику мейоза ооцнтов коров, выделенных из фолликулов разного диаметра ____(п ооцитов —686; 3 повторности)_ ______

Диаме Экспсрн Чис Иремя от начала согревания оонитов ло Сталин мейоза 150", ч

метал ь ;ю Лиакикез Мстафхш 1 Анафаза 1 Тслофаза ( Телофата 1 Чеп)ф;ил 11

на* ООН ранняя поздняя

фол- группа НТО

ликул в

ОН

(мм)

2-3 контроль 172 6,12 + 0,44 8,1110,29' 13,4510,72° 15,62 + 0,77 17,62 1 0,84® 21,48 ±0,97'

2-3 ОПЫТ 165 6,56 ± 0,46 7,97 ± 0,27* 16,07 ±0,82" 17,36 ±0,83 18,60 ± 0,87 23,20+ 1,11

4-5 контроль 177 5,73 ±0,52 8,24 + 0,26 14,95 + 0,65 15,99 ±0,69 17,96 + 0,77* 22,99 +1,04е

4-5 опыт 172 6.82 ± 0,47 8,87 ± 0.23ь 16,39 ±0,67"' 16,78 ± 0,69 20.28 + 0,79г 25,91 *0,951'

Р общее Р-0,42 Р-0,05 1>-0,02 Р=0,39 Р-0,09 Р-0,01

* 150 — время, нри ко тором ооциты с 50 %-ной вероятностью находятся на данной стадии мейоза или завершили ее. Разные буквы показывают достоверные различия между средними значениями (Р<0,05; критерий х ). Контроль: ТС 199+10% ФБС; Опыт: ТС199+10%ФБС+50нг/мл пролактина

ю

Таблица 3. Продолжительность стадий мейоза при культивировании ооцитов коров из фолликулов разного диаметра в присутствии пролактнна

Диаметр фолликулов (мм) Экспериментальная групп» Число ооци ТОЙ Средня» продолжительность стадии мейом AtSO', ч

Днакинез Метяфаза 1 Анафаза! Телофаза 1 (рапняя.Нг поздняя) Телофаза 1 нодняя

2-3 2-3 4-5 4-5 контроль опыт контроль опыт 172 165 177 172 1,99 ± 0,38 1,41 ±0,33 2,51 ±0,40 2,05 ± 0,37 5,34 ± 0,83* 8,10± 0,95ь 6,71 ±0,71 7,52 ± 0,67 2,17 ± 0,56е 1,29 ±0,49 1,04 ±0,40 0,39 ± 0,25" 5,86 ±0,91' 5,84 ± 0,95е 7,00 ± 0,92* 9,13 ± 1,00г 3,86 ±0.81 4,60 ± 0,88 5,03 ± 0,86 5.63 ± 0,98

Р общее Р=0,3) РН>,22 Р=0,01 Р=0,04 Р=0,58

*At50 - интервал времени между началом двух последовательных стадий мейоза. Разные буквы показывают достоверные различия между средними значениями (Р<0,05; критерий х2)- Контроль: ТС 199+10% ФБС; Опыт: ТС199+10% ФБС+50нг/мл пролактнна.

3.4. Активация киназы гистонов III в процессе созревания ооцитов коров in vitro в присутствии пролактнна. Рейн и ц нация мейоза регулируется фактором, промотирующим созревание (MPF). Активность MPF оценивают по уровню активности киназы гистоиов HI. Поэтому параллельно с исследованием влияния ПРЛ на кинетику мейоза были изучены изменения активности киназы гистонов HI в процессе созревания ооцитов коров in vitro. Полученные результаты показали, что характер изменений активности киназы зависел от диаметра исходных фолликулов. Так, в ооцитах нз фолликулов диаметром 2-3 мм активность киназы возрастала к б ч культивирования (рис. 2а), что соответствует времени реинициации мейоза, и достигала максимума между 12 и 14 ч (стадия метафазы 1), а затем снижалась к 18 ч (поздняя телофаза I), и вновь возрастала к 24 ч созревания (метафаза 11) — второй пик. При культивировании ооцитов из фолликулов диаметром 4-5 мм повышение активности киназы гистонов HI отмечается позднее (между 8 и 10 ч), что соответствует стации метафазы I (рис. 2Ь). Между 10 и 12 ч наблюдалось быстрое снижение активности киназы, однако, к 24 часам культивирования наблюдалось повторное возрастание киназной активности. Между ооцитами всех исследуемых групп через 6 ч (Р<0,05), 12 ч (Р<0,001) и 14 ч созревания (Р<0,001) были обнаружены достоверные различия в активности киназы гистонов HI (рис. 2). В ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм на 6, 12 и 14 часов созревания активность киназы гистонов HI выше, чем в ооцитах из фолликулов диаметром 4-5 мм. Результаты указывают на то, что 6, 12 и 14 часов созревания являются критическими точками мейоза. При добавлении ПРЛ (50 нг/мл) активация киназы гнстонов HI в ооцитах как нз малых, так и больших фолликулов происходила позже и была менее значительной, чем в контроле. Ингибирующее влияние ПРЛ па киназную

активность было выражено значительнее в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм, в которых гормональный эффект проявлялся через 6 ч (Р<0,01), 10 ч (Р<0,05), 12 ч (Р<0,05) и 14 ч (Р<0,001) культивирования. В группе ооцитов из фолликулов диаметром 4-5 мм достоверное различие между контрольной и опытной группой было обнаружено только через 8 ч созревания ооцитов (Р<0,001). Анализ полученных данных свидетельствует о том, что снижение активности киназы глстонов HI на ранних стадиях мейоза предшествует пролонгации завершения ядерного созревания ооцитов коров. Результаты исследований также показывают, что в ооцитах из фолликулов диаметром 2-3 мм, в которых торможение мейоза под действием ПРЛ происходило на более ранней стадии (метафазе I), ингибирующее влияние гормона на активность киназы гистонов HI наблюдается раньше, чем в ооцитах из более зрелых фолликулов. 3.5. Влияние н рол актина на активацию MAP кнназ при созрсваннн ооннтов коров in vitro. Известно, что во время созревания ооцитов млекопитающих происходит активация MAP хин аз (Hajnal and Berset, 2002), Сообщается, что их активация необходима для запуска фактора, промотирующего созревание (MPF), активация которого в свою очередь индуцирует разрыв зародышевого пузырька, что позволяет ооциту вступать в М-фазу первого мейотнческого цикла. Одним из эффектом ПРЛ является активация белок-активирующего комплекса (АР-1), который играет основную роль во многих клеточных процессах, в том числе в пролиферации и дифференцнровке клеток (Gutzman et al., 2004). MAP киназы, фосфорилируя АР-1, играют важную роль в транедушии экстраклеточных сигналов в клетке для регуляции различных метаболических процессов (Nebreda and Ferby, 2000). MAP киназы — это большое семейство киназ, которое включает в себя c-Jun N-концевые киназы, р38 MAP киназы и ERK киназы, В литературе имеются данные, указывающие, что ПРЛ передает свой сигнал в клетке через каскад MAP киназ, в частности ERK1 и ERK2. В связи с этим, нами было исследовано влияние ПРЛ на изменения активности ERJC1 и HRK2 при созревании ооцитов. В наших экспериментах активация MAP киназ происходила около 6 часов после начала созревания ооцитов (рис. 3). После этого периода активность киназ достигала своего максимального значения приблизительно от 8 до 12 часов, что соответствует стадии метафазы I, Активность MAP киназ оставалась неизменной до метафазы II и снижалась между 14 и IS часами культивирования, и затем достигала свой второй максимум на 22-24 часа (метафаза II). Однако, между ооцнтами, выделенными из фолликулов разного диаметра, наблюдались отличия по уровням активности MAP киназ. Так, было обнаружено, что полная активация MAP киназ в ооцитах из фолликулов диаметром 4-5 мм происходит через 12 часов как в группах клеток, культивированных с ПРЛ, гак и без пего (рис. За). Тогда как киназы в ооцитах из фолликулов диаметром 2-Змм активируются только частично на данный период

культивирования, а полностью - примерно только через 1S часов от начала культивирования {рис. ЗЬ).

При действии ПРЛ отмечалось пролонгирование мейоза в ооцнтах, выделенных как из малых, так и больших фолликулов (р<0,05). Наблюдалось повышение активности MAP кип аз на 6 час культивирования как в ооцнтах, инкубированных в присутствии ПРЛ, так и без гормона. Однако, после 6 часов в ооцитах, подвергшихся воздействию ПРЛ, активность киназ снижалась (р<0,05). Затем, через 8 часов от начала культивирования вновь отмечалось повышение активности MAP кипа') в ооцитах, инкубированных в присутствии ПРЛ, выделенных как из больших, так и малых фолликулов. Отмечены некоторые различия активностей MAP киназ в ооцитах из фолликулов разного диаметра после действия ПРЛ в течение 14 часов культивирования. Так, в ооцнтах из больших фолликулов ПРЛ снижал активность кнпазы на 14 часов культивирования, а в ооцитах, выделенных из малых фолликулов, наоборот, повышал. На 24 часа наблюдалась противоположная картина: активность MAP киназ при воздействии гормона возрастала в ооцнтах из больших фолликулов, но снижалась в ооцитах из малых фолликулов. Механизм, посредством которого ПРЛ вызывает изменения в динамике мейотической профессии, до сих пор не яссн. По-видимому, ПРЛ замедляет процесс мейоза, снижая активность MAP киназ, участвующих в его реинициашги. Возможно, ПРЛ опосредует свои эффекты через кумулюсные клетки, стимулируя секрецию вещества, нпгибирующего созревание ооцнтов, снижая активность протеин-кии аз. Существуют экспериментальные данные, показывающие, что ПРЛ опосредует ингнбирующее действие посредством выделения Са2+ из внутриклеточных депо (Kubelka et al., 1995). Мобилизация Са2> может являться причиной инактивации кннззы птстонов Ml и MAP киназ. Это, по-видимому, обуславливает снижение активностей протеннкиназ при воздействии ПРЛ.

ВрСыЯ К у II" Н1)Н;ЧВй»1* ч Врем* куыкшрнроьания. «I

Рис. 2. Влияние 111'Л на изменение активности кнпазы гистонов Ш при созревании щ VIIго ооцнтов коров из фолликулов диаметром 2-3 (а) и 4-5 мм (б), п оонитов — 150, 3 новторностп. Достоверность различия сравниваемых значений: *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001 по сравнению с контролем (критерий х')•

3.6. Влияние теофнллпна it п рол актин а на созревание ооцитов коров. С целью изучения цАМФ-зависимых внутриклеточных механизмов в опосредовании действия ПРЛ на созревание были проведены эксперименты по выявлению характера эффектов теофиллина (ТФ), ингибитора фосфодиэстераз - ферментов, отвечающих за деградацию цАМФ, на мейоз ооцитов коров in vitro. Для исследования влияния ПРЛ и ТФ на реинициацию мейоза ооцитов коров ОКК культивировали в течение б часов (таблица 4). В результате экспериментов было обнаружено, что добавление ТФ в среду созревания приводит к значительному повышению доли ооцитов, находящихся на стадии диплотены, по сравнению с контролем (95,3 % против 60,0%, Р<0,001)- Тормозящее действие ТФ на реинициацию мейоза ооцитов не наблюдалось при культивировании ОКК в присутствии ПРЛ и ТФ. Одновременное внесение в среду ТФ и ПРЛ приводило к статистически достоверному снижению числа ооцитов на стадии диплотены (до 76,9 %) по сравнению с группой ОКК, инкубируемых в присутствии только одного ТФ (Р<0,05).

j а

е на i < "».

1 S^A^bsi

В* ..........

| i t I L4 Г* it N 2t

^ Upbu культнниронаннк, 4

<1 6 I 10 II 14 IS 24 II Врсыя кульгмвнривмАи. ч

Рис. 3, Влияние I1PJ1 на изменение активности МАР-киназ при созревании in vitro ооцитов коров из фолликулов диаметром 4-5 мм (а) и 2-3 мм (б), п ооцитов - 150, 3 повторности. Достоверность различия сравниваемых значений: Р<0,05, Р<0,01, Р<0,001 по сравнению с контролем (критерий х2)-

Таблица 4. Влияние п рол актина и теофиллина на реинициацию мейоза в ооцитах коров (время культивирования - 6 часов) (п ооцнтов — 160,3

повторностн).

группа Число ОКК п (%) ооцитов на стадиях

Диплотена Диакинез-Метафаза!

К 40 24 (60)" 16(40)

К+50иг/мл ПРЛ 38 25 (65,8) 13 (34,2)

К+5мМ ТФ 43 41 (95,3)ь 2(4,7)

К+ 5 мМТФ+50нг/млПРЛ 39 30 (76,9)с 9(23,1)

L4

К - ТС199+10% ФВС. Достоверность различия сравниваемых значений: *-ь Р < 0,001; с Р < 0,05

При культивировании ОКК коров в течение 24 часов сохраняется тормозящее влияние ТФ на ядерное созревание ооцитов (таблица 5). Так, доля ооцитов, находящихся на стадии тслофазы I или мстафазы Н, составляла только 12,5 % в этих условиях, тогда как в контроле она достигала 62,7 % (Р<0.001).

Таблица 5, Влияние иролакпша и теофиллина на ядерное созревание ооцитов коров (время культивирования - 24 часа) (п ооцитов - 225; 3 __повторности)

Группа Число ОКК п (%) ооцитов на стадиях

Дин лоте 1 га Днакинез-Анафаза Телофаза-МстафазаН

К 54 4(7,8) 15(29,4) 32 (62,7)"

К+50нг/мл ПРЛ 52 6(11,5) 6(11,5) 40 (76,9)"

К+5мМ'ГФ 56 3 (5,4) 46 (82,1) 7(12,5)=

К+5 м МТФ+ 5 0 н г/мл 1ГРЛ Г 63 I (1,6) 39 (61,9) 23 (36,5)"

--------'-С-С-----^-,—И---,Г ,, .---' , _:_i_,

К - ТС 199+10%ФБС. Достоверность различия сравниваемых значений: ^ Р < 0,001; c'd Р< 0,01;b'd Р< 0,001

Внесение ПРЛ в среду с ТФ обусловливало достоверное повышение доли ооцнтои, достигших завершающие стадии созревания (до 36,5 %, Р<0,01). Однако, в этой группе уровень созревших ооцитов был достоверно ниже, чем в группе с одним ПРЛ (36,5 % против 76,9 %, Р<0,001). Таким образом, показано, что ПРЛ подавлял ннгибируютсе влияние ТФ на ядерное созревание ооцитов, однако супрессивный эффект ПРЛ не был полным. Морфологический анализ ОКК после 24 часов культивирован]« показал, что ТФ и ПРЛ оказывают влияние на степень экспансии кумулюса. Таблица 6. Морфофуикциональное состояние клеток кумулюса в ооцит-кумулюспых комплексах в присутствии пролактина и/или теофиллина ( п ОКК - 243, время культивирования - 24 часа)

j группа i < Число ОКК п (%) ооцитов с различной степенью экспансии кумулюса

высокая средняя низкая

[К 64 22 (34,4)а 35 (54,7) 7(10,9)*

[ К+50нг/мл ПРЛ 60 29(48,3)" 25 (41,7) 6(10)'

К+5мМТФ 60 2 (3,3)е 33 (55) 25 (41,7)8

1 К+5м МТФ+5 Он г/мл ПРЛ 59 10 (16,9)d 34 (57,6) 15(25,4)"

К - ТС 199+10% ФБС. Достоверность различий сравниваемых значений: " Р<0,001;е к Р < 0,001;м Р <0,001;f,h Р < 0,05; t'd Р< 0,05

В присутствии ТФ доля ОКК с высокой степенью экспансии кумулюса снижалась (с 34,4 % до 3,3 %, Р<0,001) (таблица 6). При одновременном внесении в среду ТФ и ПРЛ отмечено увеличение процента ОКК с высокой степенью экспансии клеток кумулюса (до 16,9 %) по сравнению с группой ОКК, обработанных ТФ (Р<0,05), Однако, процент

этих ОКК был достоверно ниже, чем в среде с одним ПРЛ (Р<0,001). Полученные данные показывают, что ПРЛ может тормозить ингибирующее действие ТФ на экспансию кумулюса в ÖKK коров in vitro.

Известно, что высокая внутриклеточная концентрация цАМФ, повышающего активность протеинкинэзы А, обусловливает ингибирование реннициадин мейоза ооцитов у млекопитающих, в том числе у коров {Conti et at., 2002). В нашем исследовании было показано, что добавление производных цАМФ в среду культивирования ОКК связано с полным или кратковременным блокированием возобновления мейоза. Кроме того, экспансия клеток кумулюса у мышей также регулируется цАМФ-завнсимыми внутриклеточными механизмами (Ochsner et al., 2003). ТФ, являясь ингибитором фосфодиэстераз, подавляет деградацию цАМФ в клетках и, следовательно, повышает его внутриклеточную концентрацию. Поэтому ТФ в концентрации ■ 5 мМ кратковременно тормозил реннициациию мейоза, а также ингибировал ядерное созревание ооцитов и экспансию кумулюса. При этом ПРЛ (50 нг/мл) частично подавлял выявленное ингибирующее влияние ТФ на созревание ОКК коров. Полученные данные свидетельствуют о том4 что одним из эффектов ПРЛ на ОКК, по-видимому, является снижение внутриклеточной концентрации цАМФ путем активации фосфодиэстераз, или ингибирование активности протеинкиназы А. Такое действие ПРЛ могло бы быть результатом пересечения сигнального каскада, индуцированного гормоном в ОКК, и цАМФ/протеицкиназа А-зависимого внутриклеточного пути. 3.7. Влияние цАМФ на созревание ооцитов и развитие доимплантационных эмбрионов коров In vitro. Для исследования влияния цАМФ на реипициацию мейоза и созревание ооцитов коров in vitro ОКК инкубировали в среде с добавлением 50 нг/мл ПРЛ и 1 мМ дбцАМФ. Время инкубации клеток составляло б и 24 часа, затем клетки отмывали от дбцАМФ. После чего ОКК культивировали в среде ТС 199 с добавлением 20% бычьей фетальной сыворотки. В результате экспериментов было выявлено тормозящее влияние дбцАМФ на созревание ооцитов коров. Было обнаружено, что время инкубации в среде с содержанием дбцАМФ влияет на уровень созревания ооцитов. В группе ОКК, подвергавшихся воздействию дбцАМФ в теченне 24 часов, отмечали достоверное снижение числа ооцитов на стадии метафазы И по сравнению с контролем (18,3 % против 62,5% я 28,3% против 56,7% соответственно, Р<0,05) и экспериментальной группой ОКК, инкубированных в среде с дбцАМФ в течение б часов (18,3 % против 56,0% и 28,3% против 76,0%, Р<0,05) (таблица 7).

Отмечено, что при обработке дбцАМФ в течение 24 часов снижение доли ооцитов на стадии метафазы II более выражено, чем при инкубации в среде с дбцАМФ в течение 6 часов. Уровень созревания ооцитов не имел достоверных различий с контролем в случае менее продолжительного воздействия дбцАМФ, поскольку тормозящее влияние цАМФ снималось через 6 часов инкубации. Однако, при воздействии дбцАМФ в течение 24

часов не наблюдается полного торможения мейоза и остановки созревания, что указывает на возможность преодоления ингнбирующсго эффекта цАМФ на ядерное созревание. В работе В1!ос1еаи е1 а1. показано, что высокие концентрации цАМФ в клетке повышают активность фосфодиэстераз, участвующих в деградации цАМФ (ВКо<1еаи е1 а!., 1993). Таким образом, происходит снижение уровня цАМФ, что приводит к снятию блока мейоза.

Данные исследования также показывают, что, вероятно, присутствие ПРЛ в средах экспериментальных групп ОКК обусловливало снижение уровня цДМФ в клетках, поэтому не отмечено полной остановки мейоза в ооцитах коров. Наблюдаемые факты свидетельствуют о возможном участии цАМФ в реализации регуляторпого влияния ПРЛ на процессы созревания ооцитов вне организма.

Таблица 7. Эффект ПРЛ и дбцАМФ на созревание и способность к развитии коровьих ооцитов, созревших in vitro (п ооцитов — 82, n ____осемененных ооцитов - 459; 3 повторности)_____

система культи гшроваиня СС i о о с % ооцитов на стадии мстафазы II (рани сП) % ооцитоп па стадии метафазы H(всего) * я к t> 1 g i % 1 % оплодотио рившихся клеток % м ору л, бдасто- цист

Ю-5 Он г/мл ПРЛ 29 62,5s ± 7,7 86,7*± 6,6 145 78,5*± 2,2 25,14 2,2

К+50нг,'млПРЛ И мМ дбцАМФ (6 ч.) 25 5б,0а± 11,6 76,0'±7,4 161 6t,8b± 5,0 13,54 1,3

К+50нг/млПРЛ ! мМ дбцАМФ(24 ч.) 2S 18,3" L 7,4 28,3*±10,4 153 56,4" ± 5,7 5ДЬ± 1,0

к - тс I'm 20% фьг.

Достоверность различий сравниваемых значений: " Р<0,05 3.8. Эффекты дбцАМФ на о i г л ояотво ря е мост ь ооцитов и развитие эмбрионов. Так как условия созревания ооцитов in vitro имеют о гром г roe значение в оплодотворяемостн н способности к дальнейшему развитию эмбрионов, нами было изучено влияние дбцАМФ и 11PJ1 на оплодотворяемость ооцитов и выход эмбрионов на стадии мору л ы и бластоцнсты. В данном эксперименте всего было осеменеино 459 ооцитов, созревших в трех системах культивирования: в присутствии только ПРЛ в среде созревания, а также с предварительной обработкой дбцАМФ в течение 6 и 24 часов. Доля оплодотворившихся яйцеклеток, созревших в кул ьтурал ьной среде с добавлением ПРЛ, составила 78,5%. Отмечено достоверное снижение числа оплодотворившихся ооцитов, подвергнутых предварительной обработке дбцАМФ в течение б и 24 часов, но сравнению с контролем (61,8% и 56,4% против 78,5% соответственно, Р < 0,05) (таблица 7). Доля ооцитов, достигших стадии метафазы II при предварительной обработке дбцАМФ в течение б часов составляла

76±7,4%, а при воздействии дбцАМФ в течение 24 часов — 28,3±10,4%. Процент оплодотворившихся ооцигов в первой группе ОКК составлял 61,8±5,0, а во второй - 56,4±5,7. Полученные результаты свидетельствуют о том, что дбцАМФ не тормозит полностью мейоз, ннгибирующий эффект данного агента был не полный и кратковременный. Возможно, что ПРЛ снижал концентрацию дбцАМФ, как это было показано в наших экспериментах по изучению совместного влияния ПРЛ и ТФ, ингибитора фоефодиэстераз на ядерное созревание ооцитов коров in vitro. Таким образом, результаты экспериментов показывают, что в условиях исследованной нами системы дозревания ооцитов in vitro ПРЛ оказывает положительное действие на завершение мейотического созревание ооцитов коров, способность ооцитов к оплодотворению и дальнейшему развитию эмбрионов, что является одним из маркеров завершения цитоплазматического созревания яйцеклетки. Предварительная обработка дбцАМФ в течение б и 24 часов оказывала негативное влияние на оплодотворяем ость ооцитов и дальнейшее развитие эмбрионов. Однако тормозящее влияние повышенной концентрации дбцАМФ в среде культивирования было не полным, возможно, в результате снижения пролактином внутриклеточного уровня цАМФ.

ВЫВОДЫ

1. ПРЛ тормозит ядерное созревание ооцитов из фолликулов диаметром 2-Змм и 4-5 мм (Р<0,05) на разных стадиях мейоза. Внесение ПРЛ в среду культивирования приводило к замедлению перехода от метафазы I к анафазе I в ооцнтах из фолликулов диаметром 2-3 мм (13,45±0,72 против 16,07±0,82). При созревании ооцитов из фолликулов диаметром 4-5 мм тормозящее влияние гормона было обнаружено при переходе от ранней к поздней телофазе I (17,96±0,77 против 20,28±0,79), а также от поздней телофазы I к метафазе II (22,99±1,04 против 25,91±0,95).

2. Показан высокий выход эмбрионов на стадиях морулы и бластоцнсты, выделенных из фолликулов диаметром от 5 до 8 мм и созревших в средах с 50 иг/мл ПРЛ (52,6% против 25% в контроле, Р <0,05).

3. Преобразование хроматина при созревании ооцитов коров in vitro сопряжено с изменением активности киназы гистонов HI. Снижение активности киназы гистонов Ш под влиянием ПРЛ в начале культивирования ооцитов обуславливает торможение их ядерного созревания.

4. Ингибирующее влияние пролактина на активацию MAP киназ приводило к торможению мейотического созревания ооцитов коров in vitro, особенно на ранних стадиях (диплотена, диакинез).

5. Теофиллин оказывает ингибирующее действие на ре инициацию мейоза, ядерное созревание и экспансию кумулюса в ооцит-кумулюсных комплексах коров, при этом повышается доля ооцитов на стадии диплотены (95,3 % против 60,0% в контроле, Р<0,001),

снижается число ооцитов, достигших стадии телофазы и мстафазы II (12,5% против 62,7 % в контроле, Р<0,001), уменьшается процент ооцитов с высокой степенью экспансии кумулюса (3,3% против 34,4% в контроле, Р<0,001).

6. Пролактнн частично подавляет блокирующие эффекты теофиллнна на созревание ОКК коров, что выражается в снижении числа ооцитов на стадии диилотепы ( 76,9%, против 95,3%, Р<0,05) после 6 часового культивирования с ТФ и ПРЛ и увеличении доли ооцитов, достиппих стадии телофазы и метафазы II (36,5% прошв 12,5% Р<0,01) после 24 часов культивирования, при одновременном увеличении числа ОКК с высокой степенью экспансии кумулюса ( 16,9% против 3,3%, Р<0,05).

7. дбцЛМФ ингибирует достижение ооцнтами стадии мстафазы II (28,3±10,4 против 86,7±6,б Р<0,05) при культивировании ооцитов с пролактином в течение 24 часов.

8. Обнаружено, что дбцАМФ оказывает ннгибнрующее действие на способность ооцитов к оплодотворению и развитию донмплантационных эмбрионов. В группах ооцитов, п ре инкубированных с дбцАМФ и ПРЛ в течение 6 или 24 часов выход оплодотворенных клеток составил 61,8±5,0 и 56,4±5,7 против 78,5±2,2, Р<0,05, а процент морул и бластоцист - 13,5±1,3 и 5,2±1,0 против 25,1±2,2 в контроле, Р<0,05.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. При получении эмбрионов in vitro для их применения и клеточных тех полотях репродукции (трансплантация эмбрионов, клонирование, траксгенез) с целью повышения качества зрелой яйнеклегки использовать для культивирования ооцпты из фолликулов диаметром 3-5, 5-8 мм. Дозревание яйцеклеток проводить в ТС-199, 10% фетальной бычьей сыворотки с добавлением 50 иг/мл бычьего пролактииа.

2. Результаты исследований могут быть использованы научными сотрудниками, аспирантами и студентами впери парных, сельскохозяйствен! г ых, медицинских ВУЗов, 111111 и специалистами б потех центров, для научных исследований и практическое применения.

Список работ, опубликованных по теме днсссртацнн

1. Кузьмина Т.И. Эффект пролактииа на апоптоз в соматических и половых клетках овариадьных фолликулов коров / Альм Х„ Торнср X., Скотти О.С., Мурза Г.В. // Межд. Копф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущнно, июнь. - 2007. — С. 319322.

2. Кузьмина Т.И. Влияние пролактииа на статус хроматина п ооцит-кумулюсных комплексах коров, выделенных их фолликулов разного диаметра при созревании in vitro / Альм X., Торнер X., Скотти О.С., Кибирднна Т.В. // Цитология. - 2007. - Т.49. - №9. - С. 763-764.

3. Лебедева И.Ю., Скотти О.С., Кузьмина Т.И. Созревание ооциг-кумулюсных комплексов коров в присутствии теофиллнна и пролактииа // Сб.пауч.трудов ГПУ ВНИИГРЖ. «Селекцнонно-

1-е нети чес кие методы повышения продуктивности с/х животных»: С.Петербург. - 2006. -№2. - С. 211-217.

4. Лебедева И.Ю., Скотти О.С., Кузьмина Т.И. Модуляция пролактином ингибирующего действия теофидлина на созревание ооцит-кумулгосиых комплексов коров in vitro И Цитология. — 2006, -Т.48 - №12. - С. 1010-1015.

5. Лебедева И.Ю., Скотти О.С., Кузьмина Т.И. Участие цАМФ-зависимого внутриклеточного механизма в реализации действия пролактина на ооцат-кумулюсные комплексы коров // Межд.конф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, июнь 2005. -С. 314-317.

6. Скотти О.С. Действие пролактина на блок мейоза ооцитов коров, вызванный теофиллином // Бюллетень ГНУ ВНИИГРЖ., С.Петербург. - 2006. - выпуск 149. - С. 6-8.

Подписано в печать 17.03.2008 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объём 1 печ. д. Тираж 100 экз. Заказ № Л

Отпечатано на ризографе ГПУ СЗНИ11МЭСХ