Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мейотические преобразования хромосом при культивировании ооцитов коров с клетками гранулезы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мейотические преобразования хромосом при культивировании ооцитов коров с клетками гранулезы"

ВСЕРОССИЙСКИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

^ д На правах рукописи

' ; 5 УДК 636.2:591.391.2

ПОЗДНЯКОВА Татьяна Эрастовна

МЕЙОТИЧЕСКИЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ХРОЛ\ОСОЛ\ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ООЦИТОВ КОРОВ С КЛЕТКАМИ ГРАНУЛЕЗЫ

Специальность: 03.00.15— Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученом степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ — ПУШКИН 1994

Работа выполнена в лаборатории культивирования эмбрионов Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных. Санкт-Петербург.

Научные руководители — доктор биологических наук, академик Петровской АНИ А. К. Голубев; доктор биологических наук Т. И. Кузьмина.

Официальные оппоненты — доктор медицинских наук, профессор А. И. Никитин; кандидат биологических наук В. Г. Ба-вин.

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургский ветеринарный институт.

Защита состоится ¿/¿'•{¡Го,?. 1994 г. в . . час.

на заседании Специализированного совета Д 020.07.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, Санкт-Петербург — Пушкин, Московское шоссе, 55а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «

1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор сельскохозяйственных наук, профессор

ж. Г. ЛОГИНОВ

ОЕЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы метод дозревания и оплодотворения оспитов крупного рогатого скота находит все более широкое применение в практике животноводства. Полученные с помощью оплодотворения /л »> tro эмбрионы используют для трансплантации, а так-то для разработки методов клеточной и генетической инженерии. Однако нестабильность результатов и невозможность стандартизации технологических параметров проведения экспериментов вызывает необходимость изучения процессов, моделирующих события, отражающие механизмы фолликуло- и оогенеза {Samadle, 1993).

Как известно, у крупного рогатого скота в процессе селекции фолликулов, завершающейся доминированием одного из них, вовлекайте." паракринные, зидокринные и аутокринные сигналы. Детальное понимание этих процессов, определяющих рост и дифференцировку онуляторных фолликулеп у крупного рогатого скота, является, предпосылкой для развитие новых методик и усовершенствований уже существующих ре чимов контроля за овуляцией, суперовуля1р1ей и дозреванием ооцитов (Лл/лйгсвд/ , I99D. Моделирование процесса дозревания ооцитов в культуральных средах с клеточными элементами фолликула, в частности, с гранулезой позволяет определять роль-фолликулярного эпителия в завершении мейоза, приобретении компетенции созревших ооцитов к дальнейшему оплодотворения и потенции полученных эмбрионов к пролонгированному развитию.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось выяснение и уточнение влияния клеток гранулезы и продуктов их секреции на ме/стические преобразования хромосом у коров, оплодотворение ооцитов и развитие эмбрионов; определение характера взаимодействия соцпта и клеток кумуласа в системе ооцит-кумулюс при 1к гнефолликулярном дозревании. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- изучить характер ооцит-кумулгасных взаимодействий при созревании ооцитов с использованием различных культуральных систем;

- гыявитн хромосомные нарушения в ооцитах в процессе их дозревания в различных культуральных системах и типы хромосомных нарушении п огбрионах крупного рогатого скота, полученных

irí л/«' в условиях применения клеток грзнулелк;

- охарактеризовать пролиферативнуга активность клет<ж гранулезы при воздействии на них некоторых биологически активных веществ (белков фолликулярной жидкости - Ш'К , сыворотки крови, гормонов, факторов роста) путем изучения синтеза ДНК и клетках;

- определить эффект гиперконцентраций эстрациола, как одного из продуктов секреции клеток гранулезы на мей.оз ооцитов коров.

Научная новизна. Разработана система культивирование ооци-тов на основе бессывороточных сред, кондиционированных клетками гранулезы. В качестве заменителя сыворотки предложены ЙН молекулярной массой свыше 65 кДа. Впервые в условиях применение предложенной системы изучены временные параметры созревания ооци-тов, получены эмбрионы на стадиях морулы и бластоиисты.

Установлен характер влияния рекомбинантного бычьего сомато-тропного гормона (6СТГ) на завершение мейоза ооцитов коров. Выявлены оптимальные концентрации эстрациола, 6СГГ, благоприятно влияющих на созревание ооцитов коров и их оплодотьоряемость.

Практическая значимость. Предложены методы культивирования ооцитов коров с использованием культуры, клеток гранулезы на основе бессывороточных сред, а также добавки 6СТГ ь среды (в концентрации b нг/мл), позроллющие повысить выход оплодотворенных яйцеклеток и ранних эмбрионов на стадиях морулы и бластоиисты.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на отчетах лаборатории культивирования эмбрионов в I9bb-I993 гг., на аспирантских сессиях Г9с59-19Э1 гг., на Всесоюзной научной конференции "Физиология продуктивных животных -решению Продовольственной программы СССР" (Тарту, I9CQ), на 1-й Международной научной конференции молодых ученых и специалистов (Киеб, 1994), на Международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов сельскохозяйственных животных" (Санкт-Петербург, 1994).

Публикации. По теме исследований опубликовано 9 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и предложений, списка использованной литературы, включающего 185 источников, в т.ч. 140 иностранных. Работа изложена на //¿'страницах маишно-

писного текста и содержит V рисунков, 14 таблиц,микрофотографий.

МАТЕРИАЛ И ГЖГОДИ ИССЛВДОМНЯЛ

Г'атспиалом для исследований служили ооцит-кумулюсные комплексы (СКЮ, фолликулярная жидкость (Ф'К) и клетки гран.улезы (КП, гыделеннне и:? яичников коров и телок черно-пестрой породы, убитых на Санкт-Петербургском мясокомбинате.

После вскрытия брючной полости скота яичники отсекали, помещали и термос и доставляли в течение 1,Ь-2 часов в лабораторию при температуре 37,Ь° С. Дли экспериментов отбирали яичники п стадии фолликулярного ростп бел видимой пэталогии.

Оопит-кумулюсные комплексы аспирировали совместно с фолликулярной жидкостью с помощью щприпа из фолликулов диаметром 2-0 мм. Затем промывали их три рала в стандартной среде ТС-199 на растворе Орла с добавлением гомологичной фетальной сыворотки, гепарина и гентамипина (в концентрации I ед/мл и 10 ед/мл соответственно^.

Перед культивированием проводили морфофункциональную оценку ооцит-кумулюсных комплексов. Для созревания отбирали ооцитм с темное, равномерно гранулированной иитоплалмой и плотным, компактным, многослойным кугулюсом. Ооцит-кумулюсные комплексы помоплли б чашки Петри в капли среды для культивирования под вазелиновое масло, п атмосферу 9СЙ-ной влажности с Ь% СО,,. Средой для культивирование случила ТС-19Э с 10-20% феталыюй или астральной сывороткой крупного рогатого скота и гентамицином (10 ед/мл^ В случае использования феталыюй сыворотки ТС-199 дополнялась комплексом гормонов, обеспечивающих компетентность ооцитов к последующему оплодотворении - фолликулостимулируй-:цим (ФСП, острадиолом, лптеинизируодим (ЯГ) в концентрации 10 мкг/мл, ЬО нг/мл и Ю еп/мл соответственно. Время культивирования составляло 24-26 часов.

В качество заменителя сыворотки использовали В51 с различной молекулярном массой, полученные в соответствии с методикой, разработанной в лаборатории химии белка СИГУ, путем экстракции с ноплоцу**:1им разделением на фракции: БИ I фракции молекулярной массой свыше 65 кДа, ¡1 фракции - ГЗЬ-бЬ кДа и Ш фракции - 35-

10 кДа. Состав среды для культивирования соответствовал следующему соотношению основных компонентов: ТС-199 или Хом Ф-10, Ъ% БФ'Я и 10 ед/мл гентамицина.

Гранулезу получали из фолликулярной жидкости, аспирирован-ной из фолликулов диаметром от 3 до 6 мм. Фолликулярную жидкость помещали в центрифужные пробирки со стандартной средо(< ТС-199 и Ь% фетальной сыворотки. Гранулезу отмывали от сопутствующих элементов центрифугированием в течение Ъ-7 минут при 2000 об/мин. Осадок ресуспендировали в среде следующего состава: ТС-199, 10% фетальной сыворотки, 10 ед/мл гентамицина, 2,Ь ^/мл фунги-зона помещали во флаконы фирмы " и культивировали при тем-

пературе 30,5° С в атмосфере Ь% СО^. Смену среды проводили через 48 часов. Жизнеспособность и пролиферативную активность клеток гранулезы контролировали с помощью инвертированного микроскопа МШ-13. Количество клеток гранулезы определяли путем подсчета в гемацитометре, Оценку жизнеспособности перец постановкой на культивирование проводили с помощью красителя трипанового синего (0,4%). Полученные клетки гранулезы использовали для роста монослоя или кондиционированных сред. Наличие ростстимулирующей активности фолликулярной жидкости, ЕФЖ, гормонов и некоторых факторов роста определяли по интенсивности включения %-тймицина в ДНК клеток гранулезы (Адаме, 1983).

После 24-26-часового культивирования ооциты оплодотворяли свежеполученными или замороженными сперматозоидами, предварительно капацитированными по методу (19ь6) с использованием среды ТАХР. Эмбрионы 2-4-клеточной стадии обнаруживали через 36-4У часов после осеменения, отмывали в среде и помещали для дальнейшего культивирования в капли с культурой эпителиальных клеток яйцевода («¿м- 19В9).

Контроль за ядерным созреванием оопитов и оценку :н:брионов осуществляли с помощью цитогенетического метода (, 1966). Морфологическую оценку яйцеклеток и эмбрионов проводили с помощью бинокуляра МБС-9 при увеличении 2Ь х.

Цитогенетические препараты исследовали под микроскопом " 06)/при1 " при увеличении 900 х. Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ 013СУДЦЕНИЕ

Использование клеток гранулезы г, технологии получения эмбрионов коров ¡л ч/ &о

В настоящее время в ряде лабораторий мира используют клетки гранулезы для создания систем дозревания ооцитов и культивирования предимплантационных эмбрионов. С целью совершенствования данного приема в наших исследованиях предложены способы оценки качества гранулезных меток, используемых для получения их монослоя или кондиционированных сред. Необходимость разработки таких методов возникла вследствии того, что популяция гранулезных клеток, выделенных из фолликулов, весьма гетерогенна. В основу качественной оценки бьи взят пикнотический индекс клеток гранулезы, как один из признаков атрезии. Полученные данные позволили сделать выводы в целесообразности использования популяции гранулезных клеток, имеющих пикнотический Индекс не более Ш (табл.П.

Таблица I. Образование монослоя клетками гранулезы в зависимости от степени атрезии исходной популяции клеток

Число Число экспе- кле-римен- ток тов

Число клеток с пик-нотическим индексом

Время достижения полного монослоя, 4Ь часов

Состояние культуры на 72 часа, %

интакт. с приз.

дегенер.

3 300 15 Ь + 100

4 400 Ш 20 + 80 20

3 300 90 30 ■ _ 50 50

Таким образом, предварительное тестирование качества исходной популяции клеток позволяет повысить эффективность проведения экспериментов по экстракорпоральному созреванию и оплодотворению ооцитов коров.

Один из перспективных методов получения биологически полноценных эмбрионов коров /л ¡///-го основан на использовании для дозревания ооцитов клеток гранулезы в виде кондиционированных сред или монослоя. Моделирование условий созревания и оплодотворения ооцитов коров на основе кондиционированных сред или

монослоя более приближенно отражает естественные процессы мороза в организме. В то же время, использование модели экстрафоллик.у-лярного созревания яйцеклеток позволяет подойти к решению проблем механизмов оогенеза на уровне взаимоотношений полотых (ооци-ты) и соматических (гранулеза) клеток.

Известно, что добавление в культуральную среду гранулезных клеток положительно отражается на развитии ооцитов (Shnny,n,/А-/- , I9Ü4; , 1967). Клетки гранулезы секретируыт г. сре-

ду вещества, которые способны стимулировать развитие ооцитов. Б наших экспериментах по изучению влияния клеток гранулезы на созревание ооцитов мы использовали культуру клеток гранулезы в виде монослоя и кондиционированной среды. Исследование показали, что в среде, кондиционированной клетками гранулезы (2 х Ю^кл/мл), был наиболее высокий выход созревших ооцитов (табл.2). Ь отой группе опыта выход ооцитов на завершающих стадиях мепоза бил наивысшим (72,7$). Созревание ооцитов на монослое клеток гранулезы п сравнении с контролем не имеет достоверных различий -Ы,Ь% и 60$ соответственно. Отмечен низкий вьгход ооцитов с дегенерацией хромосом .(6%) в группе опыта, где использовали кондиционированную среду.

Таблица 2. Созревание ооцитор коров в условиях применения культуры клеток гранулезы (время культивирования 24 часа)

Группы Чис- Дл Дк MI Л Т-Ш % деге-

опыта ло--------------нераций

ооци- выход ооцитов на стадиях мейоза, % тов

Контроль 70 3,6 10,9 16,3 7,2 60,0 16,4

На монослое 66 6,0 '5 Т о, 1 21,2 12,1 Ь7,Ь It., I

Кондиционирован. 66 9,0 12,1 6,0 72,7 6х

(2х10иклЛш)

Примечание. Дп - диплотона; Дк - диакинез; MI - метафаза-1; к - анафаза; Т-Ш - телофаза-метафаэа П.

Из результатов проведенных экспериментов следует, что культивирование в среде, кондиционированной клетками гранулезы, обеспечивает более оптимальные условия для созревания, что под-

Таблица 3. Кокультивирование ооцитов коров с клетками гранулезы

!гп Число % ооцитов на стадиях: % дегенерации на стадиях: Обяее л'-н^-н.рацля ш оош---,--:--число

тов Дп Дк Н1 А Т-МН Дп Дк М1 А Т-МП дегенераиий, %

ТС-129 + Ш •

и°Т* СЫВ + XX XXX X

X КРкл/мл. 58 4,8 5,2 2а,3 II,В 49,9 - 2,о 5,2 10,4 6,9 24,3 ГС-199 + ш

¿ет. сыв. • хх

+ 1-2 х 10°кл/мл 66 - 9,0 12,1 - 72,7 - 1,51 1,51 - 3,03 6,06

Контроль 70 3,6 10,9 18,3 7,2 60,0 2,1 2,1 4,5 1,5 6,2 16,4

тверждаотся не только высоким выходом ооцитоп на завершающих стадиях мейоза, но и низким процентом яйцеклеток с дегенерацией хромосом.

С целью выяснения характера влияния клеток гранулезы на мейотические процессы в ооцитах коров, дозревающих вне организма, мы использовали различные концентрации клеток гранулезы. Полученные результаты представлены в табл.3.

При культивировании ооцитов в среде ТС-19Э с 10% фетальной сыворотки и клетками гранулезы в концентрации 1-2 х 10° кл/мл, завершающих стадий мейоза достигли 72,7$ ооцитов (в контроле 6052). При этом отмечали низкий процент ооцитов с дегенерацией хромосом (6,06%) по сравнению с контролем (16,4%).

Введение в среду дозревания ооцитов клеток гранулезы в концентрации 5-6 х 10 кл/мл обусловило получение нижеописываемых данных. На стадии диплотены осталось ооцитов, 40,1% ооцитов остановили свое развитие на стадии метафазы-1-анафазы и лить 49,9% ооцитов достигли стадии метафаэы-П. Достоверно увеличился процент клеток с дегенерацией хромосом до 24,3% (в контроле . 16,4%) в основном, за счет блока анафазы-1.

Таким образом, отмечен положительный эффект использования клеточной культуры гранулезы в качестве системы дозревания. Оптимальные результаты по дозреванию ооцитов и снижению выхода яйцеклеток с дегенерацией хромосом получены при культивировании ооцитов с клетками гранулезы в концентрации 1-2.х 10^ кл/мл.

С целью получения эмбрионов крупного рогатого скота при дозревании ооцитов в культуральную среду вносили клетки гранулезы в концентрации 2 х 10° кл/мл. Данные экспериментов приведены в табл.4.

Таблица 4. Использование кокультуры клеток гранулезы при экстракорпоральном оплодотворении

Варианты опыта Число Ядерное со— % опло— % 2-Ь- % морул ооци- зревание, дотво- ■ клеточ. и блас-тов % МП ренных "тоцист

Контроль ТС-199 + 15%

фет. сыв. 67 78,1 13,4 4,5

ТС-199 +15% ■ ххх ххх

фет. сыв. ч КГ 99 72,7 40,33 31,3 16,4

(2 х Ю6 кл/мл)

В условиях применения культуры клеток гранулезы увеличивается выход эмбрионов до 40,33$ по сравнению с контролем (13,4%). Выход морул и бластоцист в опыте составил 16,4%, тогда как в контрольной группе их не было. Разница между опытом и контролем статистически достоверна как по оплодотворяемости ооцитов, так и по выходу эмбрионов.

Использование* высоких доз зстрадиола л качестве добавки в среды

Одном из важнейших функций гранулезных клеток является их стероидогенная активность. Считают, что стероиды, в т.ч. эстра-диол, стимулируют полноценное цитоплазматическое созревание ооцитов, способствуя синтезу ряда факторов, ответственных за оплодотворение (Дыбам, I9L-B1. В то же время известны данные о том, что введение в культуральные среды физиологических концент--раций зстрадиола вызывает уменьшение количества клеток с хромосомными нарушениями ( FuKui с/cit, I9&2). Представленные вьпле данные мокно было бы интерпритировать с учетом концентрационного цисбалланса продуцируемого КГ зстрадиола. В связи с этим мы исследовали концентрационный эффект эстрадиола на мейотическое преобразование хромосом ооцитов коров.

При цитогенетическом анализе ооцитов, прокультивированных в TC-I99 с 20% фетальной сыворотки и 0,1 мкг/мл эстрадиола, обнаружено, что стадии метафаза-П через 25 часов культивирования достигли 76,7% ооцитов, против 75% в контроле (табл.5). На стадии анафазы находились 12,Ь<% ооцитов (в контроле но обнаружено). Число ооцитов с дегенерацией хромосом в опытной группе составило 19,1%, причем 9,1% цегенераций приходилось на блок анафазы, тогда как в контроле нарушений такого типа не наблюдали.

Не обнаружено достоверных различий по контролируемым параметрам мейоза в группах, где ооииты созревали' в присутствии эстрадиола в концентрации I мкг/мл и без него, как по проценту ооцитов, достигших завершающих стадий мейоза Ь0,9% (76,2% в контроле), так и по числу ооцитов с признаками дегенераций хромосом (13,9% и 14,0% соответственно).

С увеличением концентрации эстрадиола, вводимого в качестве добавки в среду культивирования до 10 мкг/мл, уменьшилось число

. Таблица 5. Контролируемые параметры меГюза ооцитов коров, созревших в условиях применения эстрадиола (время культивирования 25 часов)

Концентра- Чис- п(%) ооцитов на стадиях мейоза % цегенераций на стадиях ыейоза Общее

иия эстра- ло .---число

циола ' ооци- Дп Дк М1 А Т МП Дп Дк М1 А Т МП дегене-

тов ' ра^ий,

0,1 ыкг/мл 0 178 3 6 б 23 - 140 1,1 2,2 2,2 9Д - 4,5 19,1

1.7 а,4 3,4 12,8 78,7

К 120 4 16 10 ■ - - 90 1,2 3,3 7,2 - - 6,6 18,3

3,3 13,3 8,3 75,0

I мкг/мл 0 131 3 3 5 4 о 104 2,5 1,3 2,5 1,3 4,8 13,9

2,3 2,3 3,8 3х 1,5 79,4

к. 114 9 9 8 I 3 ' 84 2,6 1,7 2,6 - 1,7 О } 14,5

7,9 7,9 7,0 0,9 ' 2,6 73,6

10 мкг/мл 0- 185 10 10 49 24 7 87 2,1 ^ т 1 5,3 9,2 1,9 ^ л и 25,9ХХ

5,4 Ь,4 26,5ХХХ 12,9 о п и , 1 4'7ХХ

к 101 5 10 6 - Г~1 ! 72 1.Э 3,9 2,9 - 2,9 •5 Р 14,Ь

4,9 9,9 Ь ,9 6.3 71,2

Примечание. Среда культивирования - ТС-13Э + 20Г= фет. . сыв

О - опыт; К - контроль.

созревших клеток. Стадии метафазы-П достигли 47/5 ооцитов, против 71,2% б контроле, а на стадии метафазы-1-анафазы остановили свое развитие 33,4% ооцитов. Достоверно увеличился процент клеток с цегенерированными хромосомами - 25,9$ против 14,8 в контроле .

Влияние белков фолликулярной жидкости и клеток гранулезы на мейоз и оплпдотворяемость ооцитов коров

Ранее было показано положительное влияние БЕЗ на мейоз ооцитов коров в качестве заменителя фетальной сыворотки (Ткачен-ко, 1990^. В наших исследованиях мы изучали влияние клеточных культур фолликула, а также БЕК на созревание ооцитов коров.

Выявлена возможность использования бессывороточной среды для дозревания ооцитов коров в культуральной системе с использованием клеток гранулезы. Данные по влиянию I, 11 и Ш фракций белков фолликулярной жидкости и клеток гранулезы на созревание ооцитов представлены в табл.6.

Таблица 6. Влияние БМ и клеток гранулезы на созревание ооцитов коров (время культивирования 24 часа)

15 п/п Группы Число опыта ооцитов п (%) ооцитов на стадиях мейоза пф де-генерпр! ванных ооцитов

Л" Дк М1 А Т-М11

Т Контроль 70 6 8,6 10 14,3 16 22,8 6 8,6 26 37,1 6 0,6

И БЕК I + КГ 70 - 6 8,6 8 11,4х - 52 4 74,Зххх 5,7

Ш Ш И + КГ 80 - 14 17,5 10 12,5х - 50 6 62,5ХХХ 7,5

1У БЕЛ Ш + КГ 60 10 16,6ХХ 8 13,3 26 43)3ххх 2 3,3 10 16,6 4 6,6

У Контроль + + КГ 66 - 6 9,09 8 12,1х - 48 4 72,7ХХХ 6,06

Примечание. Контроль - Хэм Ф-12 + 10% фет. сыв.

КГ в концентрации 2 х Юб кл/мл; БМ 5%.

При культивировании ооцитов в среде с 5% ЕИ I и II фракций и клетками гранулезы 74,3 и 62,ооцитов соответственно достигали завершающих стадий мейоза. В контроле - 37,1%. Культивирование ооцитов с Ь% Ш фракции и клетками гранулезы ингибиро-вало мейоз. Так, после 24 часов культивирования 43,3% ооцитов находилось на стадии М1.

При культивировании ооцитов в среде с 10% фетальной сывороткой и КГ такте получен высокий выход ооцитов на завершающих стадиях мейоза (72,1%).

' Не обнаружено достоверных различий между системами культивирования в присутствии клеток гранулезы с СИ и без них, как по проценту ооцитов, достигших стадий метафазы-П, так и по числу ооцитов с признаками дегенераций хромосом. Обе группы имели достоверные различия с контролем по основному показателю мейо-тического созревания - выходу яйцеклеток на завершающих стациях мейоза (72,7% и 74,3$ в- опытных и 37,1% в контрольной группе). При культивировании ооцитов в среде Хэм Ф-12 и 10$ фетальной сыворотки в течение 24 часов 22,Ь% ооцитов остановили свое развитие на стадии М-П, что вероятно, объясняется несбалансированностью питательной среды, а возможно и недостатком гормонов, продуцентами которых являются гранулезные клетки.

При оплодотворении ооцитов, созревших в условиях применения БФЧ I, П и Ш фракций и КГ, получены следующие результаты. При введении БЕК П фракции в концентрации 0,22 нг/мл и КГ в культуральную среду достоверно увеличился процент дробления после осеменения яйцеклеток по сравнению с контролем (табл.7). В опыте, выход дробящихся клеток составил 32$, в контроле - 7,6''. Среда с БФ1 I фракции и КГ также обеспечила более высокий выход ранних зародышей по сравнению с контролем на 9,7$.

Таблица 7. Получение эмбрионов крупного рогатого скота из ооцитов, прокультивированных с ВН и клетками гранулезы

Группы Чис- п(%) ооци- Получено % от числа эмбрионов

опыта ло ■ тов на эмбрионов -

ооци- Т-МП__2-й морул бласто-

_тов п % п %__"нст

Контроль

Хэм Ф-12 + 70 26(37,1) 2 7,6 100 + 10% фет.сыв.

Окончание таблицы 7

Группы • Чис- пДО ооци- Получено % от числа эмбрионов

опыта ло тов на эмбрионов -

ооци- Т-МП__2-Ь морул бласто-

TOB п % п % ЦИСТ

Хэм '5-12 + Ufo ххх ххх

БИ I + КГ 70. 82(74,3). 9 17,3 33,3 33,4 33,3

Хзм Ф-12 + 1>% ххх ххх

D54 П + КГ 80 80(62,8) 16 32,0 80,0 20,0

Из табл.7 видно, что в условиях применения БФ1 и КГ (2 х I06 кл/мл) увеличивается не только выход эмбрионов, но и улучшается их качество. Они достигают более поздних стадий развития, таких как морула и бластописта.

Влияние 6СТГ на созревание и оплодотворение ооцитов коров

При обработке животных рекомбинантным 6СТГ существенно увеличивается число качественных, пригодных для трансплантации эмбрионов ( (lieftí «/ сс£ , 1990). Представляет интерес возможность использования рекомбинантного 6СТГ для целей получения эмбрионов in. i/i tro .

В результате проведенных исследований показано, что введение в среду для дозревания ооцитов 6СТГ в концентрации 5 нг/мл обуславливает повышение выхода созревших ооцитов (табл.8). При •отом к 24 часам культивирования 100$ клеток в этой группе (У) реинициировали мейоз, а процент ооцитов с дегенерированными хромосомами был в 3 раза ниже, чем в контрольной (8,3% против 18,3/5). С увеличением концентрации 6СТГ до I мкг/мл уменьшилось число созревших клеток, а в случае использования 6СТГ в концентрации 100 мкг/мл все 100% клеток имели дегенерированные хромосомы. Снижение концентрации 6СТГ до 4 нг/мл при выходе созревших ооцитов на уровне контроля (80,8% против 40% в контроле) способствовало уменьшению числа ооцитов с хромосомными нарушениями (8/о - У1 группа, 18,3% - контроль).

Таким образом, эффект рекомбинантного 6СТГ на мейоз ооцитов коров носит дозозависимый. характер. Из результатов проведенных исследований следует, что культивирование ооцитов с 6СТГ в

концентрации 5 нг/мл обеспечивает более полноценное созревание яйцеклеток, что подтверждается не только оптимальным выходом ооцитов на завершающих стадиях мейоза, но и низким процентом яйцеклеток с дегенерацией хромосом.

Выявив оптимальную концентрацию 6СТГ для созревания яйцеклеток, мы провели серию.экспериментов по их оплодотворению. Сравнительные данные трех экспериментов по влиянию бС'ГГ на оплодотворение ооцитов и общепринятого метода (контроль) представлены в табл.9. Анализ полученных данных выявил вариабельность результатов по созреванию и оплодотворению ооцитов в разных экспериментах.

Таблица 8. Влияние рекомбинантного 6СТГ (в различных концентрациях) на созревание ооцитов коров (время культивирования Р4 часа)

Группа опыта

Чис- п(%) ооцитов на стадиях мейоза ло

ооци- Дп тов

Дк

MI

п(%) де-

-генери-

T-MIJ рованных ооцитов

I - контроль ТС-199 + 20% фет. сыв.

П - TC-I99 + 20% фет. сыв. + 6СТГ 100 мкг/мл

Ш - TC-I99 + 2.0% фет. сыв. + 6СТГ I мкг/мл

IV- ТС-19Э + 20% фет. сыв. + 6СТГ 10 нг/мл

V- TC-I99 + 20% фет. сыв. + 6СТГ 5 нг/мл

VI-ТС-199 + 20%

^ет. сыв. + 6СТГ нг/мл

120

2 1,6

44 -

10 8,4

27

22,5

II

9,2

4L! 40

22 18,3

44 100

48 20,9 5 10,4 8 . 16,7 5хх>: 10,4 41,6

56 2 . Ь 14 29 6

3,5 Ь,9 25 51,9 10,7

75 _ .4 Т9 2.х 46ххх ' 61,4 4 х

5,3 2Ь,4 2,6 ^ 3

65 - _ 27 XXX 41,5 - 33 5'

50,5 8х

Так, в первом эксперименте процент созревших ооцитов в контрольной группе был 40%, в то время как во П и Ш - '7Ь% и !Л соответственно. В опытных группах выход ооцитов на завершающих стадиях мейоза в I, П и Ш экспериментах оказался 70%, 90% и «9 соответственно.

В первом эксперименте, в отличии от двух последующих, процент оплодотворенных клеток в опытно?1 группе был значительно выше, чем в контрольной (61,3% против При этом в конт-

рольной группе не было эмбрионов,- в то время как использование 6СТГ позволило в данном эксперименте получить 15,7% морул.

Во втором и третьем экспериментах выход оплодотворенных клеток составил в опытной группе 80-Ь2%, зто на 27-30% выше, чем в контроле (50-55%).

Обобщение данных по всем трем экспериментам показывает, что в среднем оплодотворенных ооцитов в опытных группах было 75,2% против 4-1,5% в контроле, а выход морул - соответственно 29,2% и 0%. Разница между опытом и контролем статистически достоверна как по оплодотворгемости ооцитов, так и по выходу морул.

Таблица 9. Влияние рекомбинантного 6СТГ на созревание и оплодотворение ооцитов коров

Вариант опыта Чисто % созрев- п(%) оплодо-ооци- ' ших ооци- творенных tob тов яйцеклеток

Эксперимент I

контроль

опыт

30 2Ь

48 70хх

4 (28,5) 12 (63,ПХХХ

п(%) морул

3 (15,7)

Эксперимент И контроль ' опыт

30 30

78 90

12 (50) 24 (80)ххх

2 (9) 9 (30)ххх

Эксперимент Ш

контроль

опыт

25 33

Ы

ьэ

Средняя по экспериментам (%) контроль 85 ' 69

опыт 91 83

II (55)

24 (82)ххх

24 (44,5)

60 (75,2)хх"

3 (15) 12 (42)ххх

5 (8)

24 (29,2)ххх

Примечание. Опыт: ТС-199 t- 20% эстр.сыв. + 6СТГ (5 нг/мл); контроль: TC-I99 + 20% эстр.сыв.

Таким образом, в наших экспериментах показано исключительно благоприятное влияние О'СТГ не только на созревание ооцитов,

но и на их компетентность к оплодотворению. Несмотря на различное качество исходного материала в разных сериях опытов при добавке в среды 6СТГ в концентрации Ь нг/мл был получен достоверно более высокий по сравнению с контролем выход как оплодотворенных яйцеклеток, так и эмбрионов, достигших более поздних стадий развития.. Все это, по-видимому, свидетельствует о способности 6СТГ снимать начальную атреэию клеток.

Синтез ДНК в клетках гранулезы при воздействии Ш>'К, 6СТГ, ХГ и пролактина

Для уточнения характера влияния БФ5 и гормонов на мейоз ооцитов коров наш! предпринята попытка выявления их митогенного эффекта на фолликулярные клетки гранулезы. Культуру клеток использовали как тест-систему.

В качестве добавок, стимулирующих пролиферацию клеток, использовали фракции I, П и Ш ШЖ; овечий пролактин (ПРЛ - 0,110 ед/мл); хорионический гонадотропин человека (ХГ - 0,110 ед/мл) и рекомбинантный бычий СТГ (Ь-ЬО нг/мл). Одновременно с добавками в лунки вносили I мкКи/мл Н-тимидина, клетки культивировали 24 часа. В качестве контроля принимали величину интенсивности включения изотопа в пробах, не содержащих добавок (100%).

Выявлен дозозависимый характер действия добавок на синтетическую активность ДНК клеток гранулезы. I и II фракции БФЖ дали максимальный митогенный эффект в концентрации I мкг/мл, ХГ - в концентрации 5 ед/мл, 6СТГ - 10 иг/мл, овечий пролактин - в концентрации I ед/мл.

Ооцит-кумулюсные взаимодействия при дозревании ооцитов

При исследовании влияния различных биологически активных веществ было показано, что активное разрыхление кумулюсных клеток в процессе культивирования ооцитов сопутствует нормальному завершению мейотических преобразований хромосом. Так, при использовании жидкости из фолликулов диаметром более б мм в качестве системы дозревания, мы получили следующие результаты: у 72,Ъ% созревших яйцеклеток кумулюс был сильно разрыхленным,

а у 9,9% ооцитов, не реинициировавших мейоз в процессе культивирования, он так и остался компактным. В случае использования жидкости из фолликулов диаметром 3-6 мм, предварительно подвергшейся термической обработке, лишь 4,2% ооцитов достигли завершающих стадий мейоза. Одновременно r этой же группе лишь 20% ооцитов имели кумулюс с высокой степенью разрыхления, а 52% ца-ке не реинициировали мейоз.

При использовании в качестве системы дозревания Ф'З, лишенную белков, 97,1% ооцитов не реинициировали мейоз, при этом лишь 3,8% комплексов отличались высокой степенью разрыхления кумулюсных клеток, а 85,3% ооцитов имели хромосомы с признаками дегенерации.

76% и 62,5% ооцитов, созревших в средах с добавками БФ'Н I и ЕФЯ II фракций и клетками гранулезы, были окружены разрыхленными клетками кумулюса, при отом все ооциты инициировали мейоз.

При введении в культуральную среду 6СТГ и ФСГ 61,4% и 65,2% ооцитов соответственно достигали стадий телофаза-метафа-за-П. Лишь у 3,5% и 4,5% ооцитов, не реинициировавших мейоз, кумулюс оставался неразрыхленным.

В группе опыта, где в культуральную среду добавляли 5Р5, 63,2% ооцитов достигли завершающих стаций мейоза, 65% ооцитов имели разрыхленный кумулюс.

Цитомор?1ологическая характеристика эмбрионов коров, полученных при экстракорпоральном оплодотворении ооцитов

Цитоморфологический анализ позволил обнаружить дегенера-циснные изменения в эмбрионах, полученных из ооцитов, созревших в условиях применения различных моделей дозревания. Наивысший процент фрагментировэнных клеток наблюдали в группе, где созревание протекало в отсутствии гранулезы и эстрадиола (11,2%). Введение в культуральные среды клеток гранулезы и эстрадиола снижало этот процент до 4,4. Во всех группах были получены эмбрионы с неполным набором хромосом в отдельных бластомерах, а также с отсутствием в некоторых из них ядерного материала (несоответствие числа ядер числу бластомеров). Однако достоверной разницы по этим показателям между исследуемыми группами не обнаружено.

ВЫВОДИ

1. Мейотические преобразования хромосом, приводпцие к образованию компетентных к оплодотворению яйцеклеток, протекают на основе тесного ооцит-кумулюсного взаимодействия, сопровождающегося вначале усилением синтеза ДНК и пролиферации фолликулярных клеток, с последующим их разрыхлением.

2. Фолликулярная жидкость и ее белки обладают ростстимули-руютей активностью. При введении их в среды в оптимальной концентрации повышается синтез ДНК в клетках гранулезы. Сходным действием обладают сыворотка крови, гормоны (ХГ, ФСГ, 6СТГ, про-лактин), фактор роста фибробластов.

3.Оценка качества клеток гранулезы для получения моностог и кондиционированных сред позволяет повысить эффективность дозревания и оплодотворения оопитов коров т, \tii-ro . Перспективной для этих целей является попул"ЦИя клеток гранулезы с пикно-тическим индексом не более 20%. Использование сред, кондиционированных клетками гранулезы, позволяет уменьшить число ооцитоп с дегенерацией хромосом (6% против 16,4% в контроле).

4. Белки фолликулярной жидкости с молекулярной массой свыше 65 ¡сДа и клетки гранулезы в оптимальной концентрации 2 х х 10^ кл/мл оказывают положительное влияние на мейотическио преобразования хромосом, а также на оплодотворяемость оопитов. Выход 'созревших ооцитов составил 74,3%, оплодотворенных - 17,3%, достигших стации бластоцисты - 33,3%.

8. Выход созревших ооцитоп, прокультивированных в средах кондиционированных клетками гранулезы в повышенной концентрации (5-6 х 10° кл/мл), снижается за счет блока мейоза на метафазе-1, что возможно вызывается гиперсекрецией эстрадиола. Высокие же концентрации эстрадиола (10 мкг/мл) обуславливают блок мейоза в ооцитах именно на метафазе-1 (?6,5%1.

6. Введение в качестве добавки в культурлльнно среды 6СТГ в концентрации 5 нг/мл оказывает положительное влияние на ядор-но-цитоплазматичсское созревание, что выражается в уменьшении процента ооцитов с хромосомными нарушениями СБ,3% против 1В,3% в контроле11, поглгаенни их опяодотвопяемос.ти (75,2^ против 44,5% в контроле'1 и потппци''1 эмбрионов к дальнейшему развитии (29,2,'' эмбрионов достигли стадии »рулы против 8% в контроле).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для совершенствования методов дозревания и оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота можно использовать бессыво-роточнуга систему на основе TC-I99 с Ь% ВФЯ молекулярной массой свыше бЬ кДа, кондиционированную клетками гранулезы (в концентрации 2 х 10 кл/мл), а также добавки 6СТГ в среды (в концентрации 5 нг/мл).

2. Материалы диссертации могут быть использованы в учебных курсах по генетике и биотехнологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРГАЦИИ

1. Макарова Э.Н., Позднякова Т.Э., Гузеватый O.E. Роль куль-туральной среды в процессе получения эмбрионов коров вне организма // Бюлл. ВНИИРГЗ. - Вып.Со. - 1965. - С.27-29.

2. Позднякова Т.Э. Получение эмбрионов крупного рогатого скота 'm в зависимости от качества гамет // Бюлл. ВШЭДРП.

- 1987. - № 95. - С.25-26.

3. Кузьмина Т.И., Завертяен Б.П., Ткаченко C.B., Позднякова Т.Э. Гормональная регуляция мейоза ооцитов коров в условиях их внефолликулярного культивирования // Мат. Всесоюз. конф. Тарту 13-15 сентября. - I9Ü9. - 4.2. - С.37.

4. Кузьмина Т.И., Позднякова Т.Э., Ыагиахметова Г.А. Оценка качества исходной популяции клеток гранулезы с целью получения монослоя // Бюлл. ЬШШГРН. - J.« 123. - 1990. - С.27-29.

5. Кузьмина Т.И., Гойло Т.А., Позднякова Т.Э. Влияние протеинов фолликулярной жидкости на синтез ДНК в культуре клеток гранулезы // Бюлл. EHIfflirPL - 1991.-» 129. - С.3-7.

о. Позднякова Т.О., Забелина Н.В. Совершенствование систем дозревания ооцитов коров для целей экстракорпорального оплодотворения // Мат. 1-й Международной конф. молодых ученых и специалистов 16-17 февраля. Тез. докл. Киев. - 1994. - С.73.

7. Кузьмина Т.И., Шагиахметова Г.А., Позднякова Т.Э. Эффективность модификации сред для оплодотворения и использование спермы нескольких быков при оплодотворении in r/'fro // Тез. докл. научно-практ. конф. 19-20 мая, Киев. - 1994. - С.82.

8. Кузьмина Т.Н., Шагиахметова Г.А. Позднякова Т.Э. Модер-

пизация систем дозревания ооцитов коров для получения эмбрионов // Мчт. симпозиума 24-26 мая, Санкт-Петербург - Пушкин. - 1994. -1.29-30.

• 9. Позднякова Т.Э., Кузьмина Т.И. Влияние рекомбинантного бычьего соматотропного гормона на созревание ооцитов.коров // Билл. ВНИИГРЖ. - 1994. - № 140. - С.7-10.