Роль клеток гранулезы при действии соматотропина и пролактина на мейоз ооцитов коров in vitro

Кибардина, Татьяна Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль клеток гранулезы при действии соматотропина и пролактина на мейоз ооцитов коров in vitro
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль клеток гранулезы при действии соматотропина и пролактина на мейоз ооцитов коров in vitro"

па правах рукописи

КИБАРДИНА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

РОЛЬ КЛЕТОК ГРАНУЛЕЗЫ ПРИ ДЕЙСТВИИ СОМАТОТРОПИНА И ПРОЛАКТИНА НА МЕЙОЗ ООЦИТОВ КОРОВ IN VITRO

03.00.15. - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0034579G4

Санкт-Петербург - Пушкин 2008 г.

003457904

Работа выполнена в лаборатории биологии развития ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения

сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Татьяна Ивановна Кузьмина

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Козикова Л.В. (ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН),

доктор медицинских наук, профессор,

Никитин А.И. (Балтийский институт репродуктологии человека)

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Зашита диссертации состоится

.2008 года

в 77 часов на заседании диссерта^онного совета Д.006.013.01 по защите диссертаций на соискание степени кандидата биологических наук при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 196601, Санкт-Петербург -Пушкин, Московское шоссе 55-а. Факс: (812) 465 99 89 spbvniigen@mail.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН

Автореферат разослан « ^» /сЯ^^и^ 2008

года.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г.Н.Сердюк

I. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Сочетание методов трансплантации эмбрионов, полученных in vitro, криоконсервации гамет и зародышей позволит значительно интенсифицировать селекционный процесс, увеличить число потомков от высокопродуктивных животных, а также от коров, с заболеваниями репродуктивных органов, нарушением гормонального фона и т.д. Технологии трансгенеза и клонирования дают возможность получать особи, резистентные к различным заболеваниям, способные производить биологически активные вещества, используемые в фармакологии, биомедицинских целях. Базовый метод всех этих эмбриотехнологий -получение зрелых яйцеклеток, пригодных к дальнейшему оплодотворению, получению трансгенных, клонированных животных. В связи с этим, начальный этап технологий (дозревание ооцитов in vitro) приобретает особую актуальность. Состав сред для дозревания, используемых различными исследователями неодинаков по своему составу, а интенсификация технологии и необходимость стабильности результатов требует их стандартизации. Ранее показано, что введение в среду созревания ооцитов рекомбинантного бычьего соматотропина (СТГ) совместно с сывороткой и клетками гранулезы или без них при дальнейшем оплодотворении способствует повышению выхода эмбрионов на стадии бластоцисты (Kuzmina Т. I. et al., 2007, Bevers М.М. and Izadyar F, 2002 ). Обнаружено также, что использование бычьего пролактина (ПРЛ) в качестве добавки при созревании ооцитов обеспечивает возрастание числа эмбрионов на завершающих стадиях доимплантационного развития (Kanitz W. et а!., 1996, Torner Н. et al.,1996). Созревание ооцита in vivo - результат сложных межклеточных взаимодействий гаметы и соматических клеток овариального фолликула, в первую очередь, клеток гранулезы (КГ), являющихся продуцентом многих факторов, обеспечивающих нормальное развитие растущего ооцита.

В связи с этим, представляет интерес исследование роли гранулезных клеток при действии пролактина или соматотропина на формирование зрелой яйцеклетки, а также изучение возможности моделирования на этой основе системы дозревания ооцитов с целыо повышения эффективности клеточных технологий репродукции.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 годы по теме: 06.01.03 « Исследовать молекулярно-генетические, биохимические, цитологические и эмбриологические процессы, лежащие в основе трансгенеза, создать генноинженерные конструкции и разработать способы, повышающие эффективность биоинженерных технологий получения животных с заданными свойствами» № гос. регистрации: 15070.7815014664.06.8.001.0.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - исследование роли клеток гранулезы из антральных овариальных фолликулов при

мейотическом созревании ооцитов in vitro в присутствии пролактина или соматотропина.

В соответствии с поставленной целью решались следующие конкретные задачи:

1. Исследовать действие пролактина и соматотропина, опосредованное клетками гранулезы, на мейоз ооцитов коров in vitro;

2. Оценить способность к развитию доимплантационных эмбрионов, полученных из ооцитов, созревших в присутствии пролактина и клеток гранулезы in vitro;

3.Охарактеризовать влияние пролактина и соматотропина на морфофункциональное состояние клеток гранулезы коров из овариальных антралъных фолликулов диаметром 3-5 мм при их культивировании с учетом:

-жизнеспособности клеток гранулезы (окрашивание прижизненным красителем);

- состояния хроматина гранулезных клеток (уровни дегенерации и пролиферации);

-стероидогенной активности клеток.

4. Проанализировать эффекты пролактина и соматотропина на клетки кумулюса ооцитов коров, созревших в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии пролактина или соматотропина.

Научная новизна. Впервые получены следующие данные:

- определена и охарактеризована роль клеток гранулезы из антральных фолликулов (диаметр 3-5 мм) в реализации действия ПРЛ и СТГ на завершение мейоза ооцитов коров in vitro, его динамику и способность к развитию доимплантационных зародышей;

- обнаружено, что ингибирующее действие СТГ и ПРЛ на процессы дегенерации КГ при их культивировании, не связано с их стероидогенной активностью;

- выявлено, что КГ, не связанные с ооцитами щелевыми контактами, опосредуют ингибирующее действие ПРЛ и СТГ на реинициапию мейоза ооцитов. Тормозящее действие СТГ и ПРЛ на динамику мейоза является обратимым;

- обнаружено, что среда, кондиционированная ГК в присутствии СТГ или ПРЛ, оказывает ингибирующее влияние на дегенерацию хроматина в ооцитах и окружающих его кумулюсных клетках in vitro;

показано, что в ооцитах коров, созревших в средах, кондиционированных КГ в присутствии ПРЛ или СТГ, снижается уровень кальция во внутриклеточных депо.

контактами, опосредуют действие пролактина и соматотропииа па завершение мейотического дозревания яйцеклетки in vitro. Анализ контролируемых параметров мсйоза, выявил положительные эффекты соматотроиина и пролактина в присутствии КГ на уровень дегенерации хромосом (снижение) и цитоплазматическое созревание яйцеклетки. Обнаруженное тормозящее влияние СТГ и ПРЛ на решшциацию мейоза ооцитов является обратимым, и не наблюдается при дальнейшем культивировании. Пролонгация дозревания предполагает возможность синхронизации ядерно-цитоплазматического созревания ооцита, что обеспечивает в дальнейшем приобретение яйцеклеткой способности к дальнейшему развитию. При этом повышался процент выхода нормальных эмбрионов, преодолевших блок развития на стадиях 8-16 клеток. Снижение уровня дегенерации хроматина в клетках гранулезы и кумулюса (субпопуляция КГ) под действием ПРЛ или СТГ не было связано с их стероидогенезом (содержанием прогестерона и эстрадиола). Результаты исследования позволяют предположить, что ПРЛ и СТГ влияют на продукцию КГ паракринно действующих факторов, участвующих в регуляции мсйоза. С учетом данных исследований для увеличения выхода зрелых яйцеклеток и нормальных эмбрионов коров in vitro предложена система дозревания ооцитов с использованием КГ (I06 кл/мл), пролактина (50 нг/мл) или соматотропииа (10 нг/мл).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и одобрены на ежегодных аспирантских сессиях и отчетах ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии, на Международных конференциях: 50-й ежегодной конференции Европейской Ассоциации по репродукции в животноводстве, Цюрих, 1999; «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» Боровск, 2000; 54-й ежегодной конференции Европейской ассоциации животноводства, Италия, 2003; на 11-ом международном конгрессе по биотехнологии в репродукции с/х животных, Чехия, сентябрь 2004; «Клеточное ядро» Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, 2007.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 нучных работ, в том числе - 6 в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, их обсуждения, выводов, предложений, списка использованной при написании диссертации литературы, включающего 265 источников, в том числе 235 на иностранном языке. Диссертация изложена на 136 страницах, включает 7 таблиц, 32 рисунка (в том числе 12 микрофотографий).

Положения, выносимые на защиту:

- Клетки гранулезы из антральных фолликулов диаметром 3-5 мм опосредуют действие пролактина или соматотропииа на завершение мейотического созревания яйцеклетки in vitro:

- Культивирование ооцитов из антральных овариальных фолликулов в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ или СТГ, приводит к торможению ядерного созревания в начале культивирования, при этом снижается уровень содержания кальция во внутриклеточных депо созревших яйцеклеток (маркер цитоплазматического созревания):

- Пролактин и соматотропин при культивировании ооцитов in vitro оказывают влияние на статус хроматина соматических клеток, снижая долю клеток с дегенерированным хроматином (СТГ) или, повышая число клеток с ядрами на стадии митоза (ПРЛ);

- Введение в систему дозревания ооцитов коров клеток гранулезы из фолликулов 3-5 мм в концентрации 10б клеток на мл среды совместно с пролактином (50 нг/мл) способствует повышению выхода нормальных эмбрионов на завершающих стадиях доимлантационного развития.

2. Материал и методы исследований.

Материалом для исследований служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК), клетки гранулезы из антральных фолликулов коров и половозрелых телок черно-пестрой породы, убитых на мясокомбинате Санкт-Петербурга. Яичники без видимых признаков патологии, находящиеся на стадии фолликулярного роста, или с развитым желтым телом доставляли в лабораторию в термосе при температуре 30-35°С в течение 1,5-2 ч. после овариоэктомии. ОКК выделяли аспирацией фолликулов, трижды промывали в среде ТС-199 «Биолот», Россия), содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 50 мкг/мл гентамицина («Sigma» США). В экспериментах использовали ооциты из фолликулов диаметром 3-5 мм с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным кумулюсом. Средой для культивирования служила ТС-199 с 10% ФБС, 0,55 мг/мл лактата кальция («Sigma» США), 0,23 мг/мл пирувата натрия («Serva», Германия) и 50 мкг/мл гентамицина. Культивирование проводили под минеральным маслом («Sigma» США). Статус хроматина ОКК, клеток гранулезы (КГ) и эмбрионов оценивали по методу Тарковского (Tarkowski, 1966). Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов проводили по методу Парриша (Parrish et al., 1986). КГ получали путем аспирации жидкости из фолликулов диаметром 3-5 мм с обширной васкуляризацией и высоким тургором и последующим центрифугированием при 250 g 10 мин. После удаления супернатанта клетки дважды отмывали путем ресуспендирования в среде ТС-199, содержащей 3 % ФБС («Sigma»), Конечную концентрацию клеток подсчитывали в гемацитометре, долю живых клеток определяли с помощью трипанового синего (0,1 %-ный раствор) («Serva» Германия). Для культивирования использовали суспензию КГ в концентрации (1,1 - l,6)10fi в 1 мл среды, при этом доля живых клеток составляла не менее 50-60 %. КГ культивировали в стеклянных флаконах при непрерывном встряхивании в среде ТС-199 («Sigma» США), содержащей 2 мг/мл БСА («Sigma» США), при 38.5 °С в атмосфере с 5% С02 в течение 48 ч. В опытных группах среда

содержала следующие добавки: 1. I1PJI (50 нг/мл); 2. CIT (10 нг/мл); 3. инсулин (100 нг/мл); 4. ПРЛ (50 нг/мл) + инсулин (100 нг/мл); 5. СТГ (10 нг/мл) + инсулин (100 нг/мл). В экспериментах использовали препараты гипофизарного бычьего пролактина (ПРЛ) (активность 20 МЕ/мг; Институт эндокринологии, Москва), рекомбинантного бычьего соматотрогшна (СТГ) («Monsanto», США) и бычьего инсулина ("Sigma", США). В выборе концентраций руководствовались данными, полученными ранее в лаборатории биологии развития (Kuzmina et al., 1999, 1998). Оценку статуса хроматина (уровни деструкции и пролиферации) и жизнеспособности КГ проводили через 24 и 48 часов культивирования. Наличие деструктивных изменений в ядрах КГ оценивали на основании критериев, описанных Jolly и соавторами (1997). При получении монослойной культуры клетки предварительно культивировали в среде ТС-199, содержащей 10 % ФБС и 50 мкг/мл гентамицина, в течение суток во флаконах (Flow) при 38.5 °С в атмосфере с 5 % СО2. Через 24 ч проводили смену среды, в опытные группы вносили бычий ПРЛ (50 нг/мл) или бычий СТГ (10 нг/мл). Культивирование клеток продолжали в течение 96 ч, проводя смену среды через 48 ч. Затем среду удаляли, клетки фиксировали и окрашивали азуром-эозином. Пролиферативную активность оценивали по среднему числу клеток гранулезы на условную единицу (усл. ед.) площади флакона. Подсчет клеток выполняли в 15-ти областях вдоль диагоналей флакона. Среду культивирования отделяли от клеток центрифугированием при 300 g 20 мин. В отобранные образцы кондиционированных сред добавляли лактат кальция (0,55 мг/мл) и пируват натрия (0,23 мг/мл), среды фильтровали через стерильный фильтр (22 мкм), хранили при температуре -20°С. Для определения 17(3 - эстрадиола и прогестерона среду, собранную через 48 и 96 часов после культивирования монослоя КГ, центрифугировали, расфасовывали и хранили при -20°С. Радиоиммунологический анализ содержания гормонов проводили в Институте биологии сельскохозяйственных животных (Думмерсторф, Германия). Для определения содержания депонированного Са2+ ооциты после 24 ч. культивирования очищали от кумулюса и инкубировали 5 мин при 37 "С в модифицированной среде Дюльбеко, содержащей 36 мкг/мл ггирувата Na и 1 мг/мл глюкозы, 40 мкМ хлортетрациклина в отсутствии СаС12.Затем клетки отмывали от инкубационной среды, переносили на специальное кварцевое стекло с ячейками объемом 0,05мл. Интенсивность флуоресценции в ооцитах измеряли флуориметрической установкой, состоящей из люминесцентного микроскопа, снабженного ртутной лампой постоянного тока ДРШ - 250 - 3, необходимыми светофильтрами и фотометрической насадкой ФМЭЛ - 1А. Спектр возбуждения комплекса хлортетрациклин - Са2+ - мембрана находился в области 380 - 400 нм, максимум флуоресценции регистрировали в области 530 нм. Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин - Са2+ - мембрана измеряли в условных единицах (усл.ед.). Длительность воздействия ультрафиолетового излучения на ооциты при проведении измерений не превышала 5 сек.

Для сравнения результатов, полученных в опытных и контрольных группах, использовали критерий %2 (Лакин Г.Ф., 1990) и критерий Стыодента с помощью статистической программы «Sigma Stat». Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: Р < 0,05; Р < 0,01; Р < 0,001.

Исследования проводили в соответствии со схемой, представленной на

рис.1

Рис. 1. Структурно-логическая схема экспериментов

3. Результаты собственных исследований 3.1. Влияние клеток гранулезы на способность к развитию ооцитов коров, созревших в присутствии пролактина in vitro Для выявления возможного участия КГ в реализации действия ПРЛ на созревание ооцитов, их оплодотворение и развитие доимплантационных эмбрионов были проведены эксперименты с использованием трех моделей дозревания ооцитов, представленных в таблице 1. Анализ результатов экспериментов не выявил достоверных различий в уровне созревших ооцитов в исследуемых группах. Доля оплодотворенных яйцеклеток во всех трех опытных группах была значительно выше (Р <0,001) чем в контроле. Максимальный результат получен в группе ооцитов, созревших в присутствии обоих компонентов: КГ и 50 нг/мл ПРЛ (76 % оплодотворения против 30 % в контроле (Р < 0,001). В этой же группе отмечены лучшие результаты по числу эмбрионов на стадиях 2-х-8 клеток (62 % против 18 % в контроле, Р < 0,001) и на стадиях морулы и бластоцисты (48% против 18 % в контроле, Р < 0,001).Увеличение числа доимплатационных эмбрионов при одновременном использовании КГ и ПРЛ и отсутствие различий в доле созревших ооцитов в группах свидетельствовало о возможном влияние ПРЛ на цитоплазматическое созревание яйцеклетки и предполагало участие КГ в опосредовании этого эффекта. В связи с этим, дальнейшие наши исследования были направлены

па изучение статуса хроматина и функциональной активности клеток кумулюса и гранулезы, определяющих и модулирующих, как мы предположили, характер действия ПРЛ и СТГ на созревание ооцитов in vitro.

Таблица 1. Влияние клеток гранулезы и пролакгина на созревание, оплодотворяемость ооцитов и развитие эмбрионов in vitro

(число ооцитов - 341,оплодотворившихся клегок - 241, 2-х-8 клеточных зародышей -170, морул и бластоцист - 89; 5 повторностей)

Среда созревания ооцитов %(п) созревания %(п) оплодотворившихся %(n) 2-x-8 клеточных %(n) морул, бластосцист (7 день)

ТС-199+10% ФБС 78,7 % (70/89) 30 % (29/98)" 18% (18/98)° -

ТС- 199+ 10 % ФБС *+ КГ" 85% (77/91) 58% (52/89) Ь 39 % (35/89)Г 18% (16/89)'

ТС-199+10 % ФБС + 50нг/мл пролактина 83 % (65/78) 67 % (68/101)L' 42% (42/101 )s 23% (23/101У

ТС-199+10%ФБС*+КГ* +50нг/мл пролактина 82% (68/83) 76% (92/121)d 62% (75/121)Ь 48% (58/12 l)k

* фетальная бычья сыворотка; ** 10 клеток гранулезы на мл среды. Достоверность различия сравниваемых значении: Р <0,001; Р < 0,.01 (критерии

Таблица 2. Характеристика эмбрионов коров, полученных из ооцитов, созревших в средах с 50 нг/мл пролакгина и гранулезой in vitro (2-32 клеточные )(число эмбрионов - 201; 5 повторностей)___

Группа экспери мента Среда созревания ооцитов Число эмбрионов (п) Нарушения, выявленные при визуальной характеристике %(п) Нарушения, выявленные при цитогеие тическом анализе %(п) Всего деге нери рован ных %(п)

Контроль ТС-199+ 10 % ФБС*+КГ" 98 27,6 % (27/98) 27,6 % (27/98) 55,2 3 (54/98)

Опыт ТС-199+10 % ФБС'+КГ" +50нг/мл пролактина 103 14,6% (15/103) 17,4% (18/103) 32,0 % Ь (33/103)

фетальная бычья сыворотка; КГ 10 клеток гранулезы на мл среды. Достоверность

а ь

различия сравниваемых значений: ' Р< 0,001 (критерий %2)

Данные по морфологической оценке эмбрионов, созревших в средах с добавлением 50 нг/мл ПРЛ в присутствии КГ, представлены в таблице 2. При визуальном анализе эмбрионов учитывали: правильность формы эмбриона и его диаметр; компактность и размер клеток; структуру эмбриона; наличие

больших везикул: форму зоны пеллюцида. При цитологическом анализе отмечали: фрагментацию цитоплазмы; неполный набор хромосом в бластомерах; несоответствие числа бластомеров количеству ядер; эмбрионы с пикнотическими ядрами в бластомерах. В результате исследований установлено, что введение ПРЛ совместно с КГ в систему дозревания ОКК достоверно снижает уровень дегенерированных эмбрионов с 55,2 % в контроле до 32,0 % в опытной группе (Р < 0,001).

3.2. Влияние соматотропина и пролактииа на мейотические преобразовании хромосом в ооцнтах коров in vitro. Обнаружено, что СТГ и ПРЛ в присутствии КГ оказывают тормозящее влияние (Р < 0,05), на реинициацию мейоза ооцитов через 6 ч культивирования (таблица 3). При этом от 80,4 до 84,0 % ооцитов в опытных группах оставались на стадии диплотены. Ингибирующее влияние было кратковременным и не наблюдалось через 12 ч инкубации ОКК. Не обнаружено достоверных различий в проценте ооцитов, достигших стадий телофазы и метафазы И, между контрольной и опытными группами через 18 и 24 ч культивирования (таблица 3). Внесение СТГ' и ПРЛ в культуру КГ приводило к достоверному снижению доли ооцитов с признаками дегенерации на всех исследованных этапах созревания, начиная с 6 ч. (таблица 4). Тормозящее влияние СТГ и ПРЛ, опосредованное клетками гранулезы, на реинициацию мейоза в ооцитах на ранней стадии их дозревания, вероятно, обусловливает снижение доли клеток с дегенерированным хроматином в опытных группах.

Таблица 3. Ядерное созревание ооцитов коров в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии ПРЛ и СТГ. __(число ооцитов - 1118; число повторностей от 4 до 6)._

Кондициониро- % (п) ооцитов на стадии % (п) ооцитов на стадиях

ванная среда диплотены Т I - М 11

6ч 12 ч 18 ч 24 ч

Конфоль: ТС- 57,6 % 11,3% 54,5 % 70,0 %

199+ 10%ФБС (60/104)3 (7/62) (49/90) (84/120)

Контроль + 50 80,4 % 1,7% 64,7 % 74,1 %

нг/мл ПРЛ (78/97) b (1/59) (68/105) (86/116)

Контроль+ 10 84,0 % 1,8 % 65,4 % 72,0 %

нг/мл СТГ (89/106)° (1/56) (51/78) (90/125)

Достоверные различия по сравнению с контролем: а* "а" ° Р<0,001 (критерий %2).

Под созреванием яйцеклетки понимают комплекс морфофункциональных изменений, как хроматина, так и ооплазмы. Возможно, пролонгация реинициации мейотических преобразований хромосом, способствовала завершению цитонлазматического созревания. В качестве маркера цитоплазматичесго созревания мы использовали уровень содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов. Известно, что в ОКК с деструктивными изменениями (неоднородный, ослизненный кумулюс, ооплазма с отслоением, гетерогенная) показатели интенсивности флуоресценции в ооцитах превышают таковые в нормальных (Кузьмина Т.И. и др. 2005). Выявленное нами положительное влияние пролактина и

соматотропина, опосредованное клетками гранулезы, на снижение уровня дегенерации хроматина ооцитов коров сопровождалось достоверным уменьшением содержания депонированного Са2> в ооцитах опытных групп, (таблица 5).

Таблица 4. Деструктивные процессы в ооцитах при культивировании ОКК

коров в средах, кондиционированных КГ в присутствии Г1РЛ и СТГ.

Кондиционированная среда % (п) дегенерированных ооцитов на разных этапах созревания

6ч 12 ч 18 ч 24 ч

Контроль: ТС-199+ 10 % ФБС 21.1 % (22/104)а 29,0 % (18/62)d 26,7 % (24/90)Г 30,0 % (36/120)k

Контроль + 50 нг/мл ПРЛ 9,3 % (9/97)Ь 13,6% (8/59) 13,3% (14/105)s 12,9% (15/116)'

Контроль+ 10 нг/мл СТГ 7,6 % (8/106)С 12,5 % (7/56)е 9,0 % (7/78)h 6,4 % (8/125)'"

(число ооцитов 1118, повторностей 4 (6, 12 и 18 ч ), повторностей 6 (24 ч )). Достоверные различия по сравнению с контролем: ^ ^ ^ Р<0,05; а'°" ^ Р<0,01; m Р<0,001,

(критерий %2).

Таблица 5. Уровень содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов коров, созревших в средах, кондиционированных КГ в присутствии Г1РЛ или СТГ (24 часа культивирования) п ооцитов - 112; 3 повторности__

Среды дозревания Число ооцитов (П) Интенсивность флуоресценции комплекса кальций хлортетрациклин (УЕ.)

ТС-199 + 10% ФЕС*+ КГ** 34 1,0 ± 0,07 а

ТС-199 + 10% ФБС*+ КГ** + 50нг/мл ПРЛ 44 0,67 ± 0,06 Ь

ТС-199 1 10% ФБС*+ КГ** + 10 нг/мл СТГ 34 0,60 ± 0,03 °

* фетальная бычья сыворотка;** 10 ' клеток гранулезы на 1 мл среды.

Достоверные различия по сравнению с контролем: а" ' а'° Р < 0,001 ( критерий Стыодента). 3.3. Функциональная активность и статус хроматина клеток гранулезы коров в монослойной культуре и в бессывороточных средах при действии пролактина или соматотропина. С целью идентификации факторов, вовлеченных в реализацию действия пролактина и соматотропина на ядерно-цитоплазматическое созревание яйцеклетки, были исследованы статус хроматина и уровень содержания прогестерона и эстрадиола, как маркеров стероидогенной активности клеток гранулезы, в монослойной культуре. Обнаружено, что ПРЛ оказывает стимулирующее действие (Р < 0,05) на пролиферацию КГ в монослойной культуре (рис. 2) в 1-2 сутки. СТГ не оказывал значительного эффекта на пролиферацию клеток в среде. Для дозревания ооцитов использовали среду, кондиционированную в 1-2 сутки. Данные по концентрации стероидных гормонов в кондиционированных средах были скорректированы с учетом плотности КГ в монослойной культуре. Установлено, что за 1-2 сутки в монослойной культуре КГ

синтезировали эстрадиола в контроле - 311,62 ± 81,63 пг/мл, в опыте - с ПРИ 295,35 ± 111,2 пг/мл, с СТГ" 287,55 ± 86,42 пг/мл, за 3-4 сутки 395,14 ± 132,73 пг/мл, 284,24 ± 123,7 пг/мл и 201,59 ± 60,17 пг/мл, соответственно. По синтезу прогестерона были получены следующие данные: на 1-2 сутки в контроле 14,11 ± 2,67 пг/мл, в опыте с ПРЛ - 9,53 ± 1,64 пг/мл, с СТГ - 11,28 ± 2,19 пг/мл, на 3-4 сутки 13,67 ± 2,33 пг/мл, 9,41 ± 2,28 пг/мл и 8,26 ± 2,5 пг/мл для каждой группы соответственно. Не обнаружено достоверных различий между опытными и контрольными группами. Полученные результаты указывает на то, что наблюдаемые нами in vitro эффекты ПРЛ и СТГ на ОКК коров не были обусловлены влиянием исследуемых гормонов на стероидогенную активность КГ.

S Я"

100 80 60 40 20 0

te*

f ■7W Щ//4 ми

Контроль ПРЛ (50 нг/мл) СТГ (10 нг/мл)

Рис. 2. Влияние ПРЛ и СТГ на пролиферацию КГ в монослойной культуре (5 повторностей, расчет производили на 1000 клеток). Контроль: ТС-199 + 10% ФБС; опыт ПРЛ: контроль + 50 нг/мл ПРЛ; опыт 2: контроль + 10 нг/мл СТГ. Достоверность различия сравниваемых средних значений: а' Р<0,05 (критерий Стьюдента).

Для изучения гормональных эффектов in vitro на деструктивные процессы в клетках гранулезы коров из антральных фолликулов, подвергшихся атрезии in vivo, необходимо было исключить факторы, которые могли бы влиять на полученные результаты, а именно, деление и дифференцировку клеток. С этой целью нами была использована система бессывороточного суспензионного культивирования гранулезных клеток. Данные по стероидогенезу КГ в бессывороточной системе были объедены от двух серий экспериментов: 1) ПРЛ и инсулин и 2) СТГ и инсулин для общего подсчета.

Таблица 6. Синтез прогестерона и эстрадиола клетками гранулезы коров из антральных фолликулов при культивировании в среде без сыворотки

группа 173-эстрадиол, пг/мл прогестерон, пг/мл

опыта 1 сутки 2 сутки 1 сутки 2 сутки

контроль 66,3 ± 9,7" 97,9 ± 15,4 2,36 ± 0,37 0,48 ± 0,08

инсулин 111,8 ±11,9" 82,9 ± 15,0 2,18 ±0,50 0,43 ± 0,09

ПРЛ 103,9 ± 11,6 68,7 ± 14,1 2,94 ± 1,0 0,45 ±0,12

ПРЛ+инсулин 109,2 ±22,3 66,9 ± 20,3 2,68 ± 0,88 0,33 ±0,10

СТГ 76,4 ± 11,9 93,2 ± 17,7 1,76 ±0,47 0,30 ± 0,07

СТГ+инсулин 71,6 ±6,8 98,3 ± 22,3 2,07 ±0,53 0,31 ±0,07

а Ь

( " Р<0,05, критерий Стьюдента; контроль и инсулин - 10 повторностей, для остальных групп опыта - 5 повторностей)

Обнаружено стимулирующее действие инсулина в концентрации 100 нг/мл на продукцию эстрадиола гранулезными клетками в течение первых суток культивирования, что согласуется с данными других исследователей, полученными в монослойной культуре этих клеток (Gong J.G, 1994). Этот эффект не наблюдался на вторые сутки, хотя секреция эстрадиола в контрольной группе достоверно не изменялась (таблица 6). В то же время, Г1РЛ и СТГ в использованной концентрации не влияли на эстроген-секреторную активность гранулезных клеток, причем стимулирующий эффект инсулина не проявлялся в присутствии этих гормонов. Ранее Spicer et al. при использовании монослойной культуры клеток гранулезы коров также наблюдали ингибирующее действие СТГ (300 нг/мл) на индуцированную ФСГ и инсулином продукцию эстрадиола при отсутствии его влияния на базальную секрецию этого стероида (Spicer L.J., 2007). Сходное действие ПРЛ было обнаружено рядом исследователей в монослойной культуре клеток гранулезы крыс (Fortune J.E. et al. 1986; Gitay-Goren H. et al., 1989; Gutiérrez C.G. et al., 1997). Таким образом, влияние СТГ, ПРЛ и инсулина на эстроген-секреторную активность клеток гранулезы, по-видимому, аналогично в суспензионной и монослойной культуре.

ПРЛ и СТГ не влиял на секрецию прогестерона клетками гранулезы. (таблица 6). Продукция прогестерона КГ значительно снижалась на вторые сутки культивирования во всех культуральных системах. Отсутствие влияния СТГ и ПРЛ на базальный стероидогенез гранулезных клеток позволило предположить, что ингибирующее действие гормонов на дегенерацию клеток не связано с регуляцией их стероидогенной активности. 3.4. Статус хроматина клеток кумулюса при их культивировании в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии пролактнна и соматотропина. После культивирования ООК в средах, кондиционированных КГ в присутствии ПРЛ и СТГ были оценены степень экспансии кумулюса, деструктивные процессы в клетках и их пролиферация. Не обнаружено достоверных различий между опытными и контрольными группами ооцитов rio степени экспансии кумулюса. Внесение СТГ в культуру КГ приводит к существенному снижению (Р < 0,01) процента клеток кумулюса с признаками дегенерации ядерного материала. Эффект ПРЛ менее выражен. Анализ данных по пролиферации кумулюсных клеток показал, что число клеток на стадии митоза повышается (Р < 0,05) только при использовании сред, кондиционированных КГ в присутствии ПРЛ (рис. 3). Этот факт позволяет предположить, что выявленный митогенный эффект ПРЛ на КГ мог быть не только прямым, но и опосредованным, в результате ПРЛ-индуцированной секреции клетками ростостимулирующего фактора, например, инсулиноподобного фактора роста I, являющегося стимулятором пролиферативной активности гранулезных клеток (Воробьева О.А., 1989).

S £ « s

и Й

Контроль

ПРЛ (50 нг/мл) СТГ (10 иг/мл)

Рис. 3. Деструктивные процессы в клетках кумулюса при культивировании ОКК коров в средах, кондиционированных КГ в присутствии ПРЛ и СТГ. Контроль: ТС-199 + 10% ФБС; опыт ПРЛ: контроль +50 нг/мл ПРЛ; опыт 2: контроль +10 нг/мл СТГ (3 повторности; п исследованных ОКК - 60). Достоверность различия сравниваемых средних значений: а' Р<0,01(критерий Стьюдента).

L. .о

1 i

с. 4 к

S 3 2 S ■fl

2 "

Ь Й*- 2 я я

Е «

И «

§ §

П 5

Контроль

ÜÉ§ ÜÉi

'////ss//// I*/&///}& //*//*//&,

.^///////л -W/tt'//

ПРЛ (50 нг/мл) СТГ (10 нг/мл)

Рис. 4. Пролиферация клеток кумулюса при культивировании ОКК коров в средах, кондиционированных КГ в присутствии ПРЛ и СТГ. Контроль: ТС-199 + 10 % ФБС; опыт ПРЛ: контроль 50 нг/мл ПРЛ; опыт 2: контроль + 10 нг/мл СТГ (3 повторности; п исследованных ОКК - 60). Достоверность различия сравниваемых средних значений: ' Р<0,05, (критерий Стьюдента).

3.5 Влияние пролакгина, соматотропина и инсулина на жизнеспособность клеток гранулезы и статус хроматина при их культивировании в бессывороточной системе. Известно, что используемая при культивировании животных клеток фетальная бычья сыворотка содержит разнообразные питательных вещества и факторы роста, которые создают оптимальные условия для роста и дифференцировки клеток in vitro. Инсулин использовали как «фоновый гормон» с известными антиапоптозным эффектом на овариальные клетки (Gong J.G. et al., 1993). С целью идентификации эффектов СТГ, ПРЛ и инсулина на КГ из антральных фолликулов коров, была использована бессывороточная система

культивирования. Жизнеспособность клеток оценивали при окрашивании трипановым-синим. Расчет производили на 1000 клеток. Обнаружено достоверное повышение (Р < 0,05) числа жизнеспособных клеток при действии инсулина и инсулин + СТГ на 2-е сутки культивирования.

контроль ПРЛ инсулин ПРЛ+инс.

Рис. 5. Влияние пролактина (ПРЛ) и инсулина на число КГ с нормальным хроматином при культивировании в бессывороточной системе (5 повторносгей), за 100 % принято число клеток с нормальным хроматином до культивирования. Контроль: ТС-199 + 10 % ФБС, опыт ПРЛ: контроль + 50 нг/мл ПРЛ; опыт 2. контроль + 10 нг/мл СТГ. Достоверность различия сравниваемых средних

э Ь с <1 с с

значений: " Р<0,05;" Р < 0,01; " Р < 0,05 (критерий Стьюдента).

Введение инсулина и ПРЛ в среду приводило к повышению числа КГ без признаков дегенерации хромосомного материала (рис. 5). Эффект наблюдали через 24 и 48 часов культивирования. Обнаружено постепенное снижение пролиферативной активности КГ при культивировании в среде, лишенной сыворотки. Доля клеток гранулезы, находящихся на различных стадиях митоза, от общего числа клеток с нормальным хроматином составляла в контроле 12,2 ± 1,9 % - до культивирования, 7,1 ± 1,2 % (Р < 0,05) - через 24 ч и 3,6 + 0,7 % (Р < 0,01) - через 48 ч культивирования. Не обнаружено достоверных различий в пролиферации клеток контрольной и опытных групп через 24 и 48 ч (рис. 6).

Введение СТГ и инсулина в среду приводило к повышению числа КГ без признаков дегенерации хромосомного материала (рис. 7). Через 24 ч. доля таких клеток, выраженная в процентах от их числа до культивирования, составляла в контрольной группе 45,8 ± 2,6 %, тогда как в среде с СТГ- 54,3 +

4.0 %, с инсулином - 59,6 ± 2,7 % (Р < 0,01) и с комплексом гормонов - 59,8 ±

3.1 % (Р < 0,01). Сходное соотношение наблюдали и через 48 ч.: в среде без гормонов оставалось 34,4 ± 2,7 % от начального числа клеток с нормальным хроматином, в присутствии СТГ, инсулина или одновременно обоих гормонов этот показатель достигал 43,9 ± 2,7 % (Р<0,05), 50,7 ± 4,0 % (Р<0,01) и 50,5 ± 2,8 % (Р<0,01) соответственно.

ей ег и

5 ё * I г

Ч £

16 -, 14

12 -10 8 6 4 2 О

а24ч ®48 ч

О ч

контроль ПРЛ инсулин ПРЛ+инс.

Рис. 6. Пролиферация КГ при культивировании в бессывороточной системе с ПРЛ и инсулином (5 повторностей), контроль: ТС-199+ 10% ФБС; опыт ПРЛ: контроль + 50 нг/мл ПРЛ; опыт 2: контроль + 10 нг/мл СТГ. Достоверность различия

8,с _ , „ „, а, Ь; Ь.с ,

сравниваемых средних значений: ' Р < 0,01;

' Р < 0,05 (критерий Стьюдента).

с« г

г о

О 8

в С

2 о

70 п 6050 -40 -30 20" ю-

□ 24 ч ®48 ч

контроль

СТГ' инсулин СТГ+инс.

Рис. 7. Влияние СТГ и инсулина на число КГ с нормальным хроматином при культивировании в бессывороточной системе (число повторностей 5), за 100% принято число клеток с нормальным хроматином до культивирования. Контроль: ТС-199 + 10 % ФБС; опыт ПРЛ: контроль + 50 нг/мл ПРЛ; опыт 2: контроль + 10 нг/мл СТГ.

и I)' о о с с!

Достоверность различия сравниваемых средних значений: ' " ' Р < 0,01; ' Р < 0,05 (критерий Стьюдента).

Ч и 0 ч контроль СТГ инсулин СТГ+инс.

Рис. 8. Пролиферация КГ при культивировании в бессывороточной системе с СТГ' и инсулином (5повторностей), контроль: ТС-199 + 10% ФБС; опыт ПРЛ: контроль + 50 нг/мл ПРЛ; опыт 2: контроль + 10 нг/мл СТГ. Достоверность различия сравниваемых средних значений: а" ' а'°' "С Р < 0,01 (критерий Стьюдента).

При оцененке пролиферативной активности КГ прокультивированных с инсулином и СТГ доля клеток, находящихся на стадии митоза, от общего числа с нормальным хроматином составляла в контроле 10,4 ± 1,3 % - до культивирования, 4,4 ± 0,2 % - через 24 ч и 2,6 ± 0,2 % - через 48 ч культивирования (рис. 8). Не обнаружено достоверных различий в пролиферации КГ в суспензионной культуре. Доля КГ с признаками дегенерации ядерного материала первоначально составляла в наших экспериментах - 23,1 ± 1,2 %. При культивировании в среде, лишенной сыворотки, происходило дальнейшее уменьшение числа клеток с нормальным хроматином до 45,8 ± 2,6 % и 34,4 ± 2,7 % от исходного количества через 24 и 48 ч соответственно.

Таким образом, поэтапное использование в данном исследовании различных систем культивирования клеток гранулезы (суспензионная, монослои, бессывороточное культивирование) позволило идентифицировать харакгер влияния пролактина и сомаготропина на процессы дегенерации хроматина и пролиферации клеток, реинициацию мейоза и его динамику, оплодотворяемость ооцитов, развитие доимплантационных эмбрионов и роль КГ в этих процессах. В связи с тем, что обнаруженные рядом автором ранее эффекты ПРЛ и СТГ на культивирование ооцитов в отсутствии КГ имели некоторые отличия по уровню дегенерации, степени экспансии кумулюсных клеток, параметрам цитоплазматического созревания ооцитов( Izadyar F. et al, 1996, Kuzmina TT, Pozdnyakova Т.Е., 1996, Kolle S. et al., 2003), анализ полученных нами данных позволяет утверждать об участии КГ в реализации эффектов СТГ и ПРЛ на формирование зрелой яйцеклетки in vitro и гипотезировать наличие паракринно действующих факторов,

продуцируемых КГ, не связанными контактами с ооцитом, вовлекающихся в регуляторные процессы мейотического дозревания яйцеклетки. Так, в качестве фактора, ингибирующего реинициацию мейоза, может быть предложен секрегируемый КГ свиней при введении ПРЛ низкомолекулярный белок (около 2 кДа, Channing A., Evans V., 1982). Снижение дегенераций хроматина соматотропином, опосредованное КГ, можно интерпретировать с учетом имеющихся в литературе данных о стимулирующем влиянии СТГ на синтез гормонального посредника действия соматотропного гормона на клетки организма - инсулиноподобного фактора роста (ИФР-1) (Sirotkin A.V., Markevich A.V., 1999) в КГ коров, а также с известным фактом о том, что ингибирующее влияние СТГ на апоптоз гранулезных клеток может опосредоваться ИФР I (Kolle S. et al., 2003). Несмотря на то, что в наших системах культивирования не обнаружено эффекта исследуемых гормонов на стероидогенез КГ, выявленные эффекты возрастания пролиферативной активности КГ могут свидетельствуют о возможном увеличении продукции эстрадиола (гормона, ответственного за формирование ряда факторов, обуславливающих завершение мейоза, а также фактора формирования мужского пронуклеуса) (Никитин А.И., Воробьева О.Ф.,1988) за счет роста числа нормально функционирующих клеток.

ВЫВОДЫ

1. Клетки гранулезы опосредуют влияние пролактина на формирование яйцеклетки коровы in vitro, о чем свидетельствует повышение числа нормальных эмбрионов на стадии морулы и бластоцисты, полученных из ооцитов, созревших с КГ и 50 нг/мл бычьего пролактина (48 % против 18 % в контроле, Р < 0,05)

2. Обнаружено, что одновременное использование пролактина и КГ в среде созревания ооцитов приводит к достоверному (Р < 0,001) снижению доли дегенерированных 2-32-х клеточных эмбрионов (32,1 % против 55,1 % в контроле).

3. Выявлено, что пролактин и соматотропин оказывают ингибирующее действие на процессы дегенерации в культивируемых КГ из фолликулов диаметром 3-5 мм, подвергшихся атрезии in vivo.

4. В присутствии сыворотки ПРЛ стимулирует пролиферацию КГ в монослойной культуре (83,38 % клеток на усл.ед. площади против 63,24 % клеток в контроле, Р < 0,05).

5. Показано, что ПРЛ и СТГ не влияют на стероидогенез КГ в бессывороточной суспензионной системе и монослойной культуре.

6. Клетки гранулезы, не связанные с ооцитами щелевыми контактами, опосредуют ингибирующее действие ПРЛ и СТГ на реинициацию мейоза ооцитов при их культивировании в среде, кондиционированной этими клетками. Ингибирующее действие гормонов на реинициацию мейоза является обратимым и не наблюдается при дальнейшем культивирования ооцитов.

7. Выявлено, что в ооцнтах коров, созревших в средах, кондиционированных КГ в присутствии пролактина или соматотропина, снижается уровень содержания кальция во внутриклеточных депо до 0,67 ± 0,06 усл. ед. (Р < 0,001) и 0,60 ± 0,03 усл. сд. (Р < 0,001), соответственно, по сравнению с контролем 1,0 ±0,07.

8. Среда, кондиционированная КГ в присутствии пролактина или соматотропина, оказывает ингибирующее влияние на дегенерацию хроматина в ооцитах при созревании in vitro (12,9 % , Р < 0,01 и 6,4 %, Р < 0,001, соответственно против 30,0 % в контроле).

9. Внесение СТГ в культуру КГ обеспечивает снижение процента кумулюсных клеток с дегенерированным хроматином (3,13 ± 0,36 % против 4,86 ± 0,55% в контроле, Р < 0,01) при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. С целыо повышения эффективности технологии получения биологически полноценных ооцитов in vitro использовать для их экстракорпорального дозревания следующую систему: ТС-199, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, 50 нг/мл бычьим пролактином совместно с клетками гранулезы (10 6 клеток/мл).

2. Результаты исследований могут быть использованы научными сотрудниками, аспирантами и студентами ветеринарных, сельскохозяйственных, медицинских ВУЗов, НИИ и специалистами биотехцентров репродукции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лебедева И.Ю. Ингибирующее действие пролактина и инсулина на процессы дегенерации в культивируемых клетках гранулезы коров из антральных фолликулов на ранней стадии агрезии / Т. В. Шелухина, Т.Н. Кузьмина // Цитология. - 1999. - Т. 41. - № 3-4. - С. 287.

2. Лебедева И.Ю. Влияние соматотропина, пролактина и инсулина на «летки гранулезы из атретических фолликулов коров / Т.И. Кузьмина, Т.В. Кибардина // Росс, физиол. жури. им. И М Сеченова. - 2004. - Т. 90 (10).-С. 1281-1288.

3. Лебедева И.Ю. Участие клеток гранулезы в опосредовании действия пролактина и соматотропина на ооцит-кумулюсные комплексы коров in vitro / Т.В. Кибардина, Т.И.Кузьмина // Цитология. - 2005. - Т. 47 (10).-С. 882-888.

4. Кузьмина Т.И. Динамика мейоза ооцитов коров при созревании в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии пролактина и соматотропина / Т.В. Кибардина, Лебедева И.Ю. // Онтогенез. -2005. - Т.36(5). - С.381-382.

5. Кузьмина Т.И. Партеногенетическое развитие эмбрионов коров из ооцитов неполовозрелых животных / Т.В. Кибардина // Онтогенез. -2005. - Т.36 (5). - С.377-378.

6. Кузьмина Т.И. Влияние пролактина на статус хроматина в ооцит-кумулюсных комплексах коров, выделенных их фолликулов разного

диаметра при созревании in vitro / Альм X., Торнер X., Скотти О.С., Т.В. Кибардина // Цитология. - 2007. - Т.49. - №9. - С. 763-764.

7. Кузьмина Т.И. Пролиферативная активность клеток гранулезы коров при культивировании в бессывороточной системе с пролактином и инсулином. / Лебедева И.Ю., Т.В. Шелухина // Межведомственный тематич. науч. сборник "Розведення i генетика тварин", Киев, Аграрна наука, 1999, №31-32, С. 138-140.

8. Лебедева И.10. Сравнительный анализ деструктивных процессов в клетках гранулезы коров при культивировании с соматотропином и инсулином / Т.В. Шелухина, Т.И. Кузьмина// Сб. науч. трудов ВНИИГРЖ. С.-Петербург, 2001. С.211-217.

9. Кибардина Т.В. Пролиферативная и стероидогенная активность клеток гранулезы в монослойной культуре в присутствии пролактина и соматотропина / И.Ю.Лебедева // Бюллетень ГНУ ВНИИГРЖ, 2004, выпуск 148, С. 25-28.

10. Лебедева И. 10. Влияние пролактина и соматотропина, опосредованное клетками гранулезы коров, на культивируемые клетки кумулюса / Т.В. Кибардина, Т.И. Кузьмина // Сб. науч. трудов ВНИИГРЖ. «Селекционно-генетические методы повышения продуктивности сельскохозяйственных животных».№2 С.-Петербург, 2006. С. 205-211.

11. Kuzmina T.l. Effect of somatotropin on nuclear status and morphology of bovine cumulus oocytes complexes. / T.V. Shelouchina, and N.N. Neckrasova // Book of Abstracts of the 50tli Annual Meeting of the Europian Association for Animal Production, Zurich, 1999, p. 164.

12. Шелухина Т.В. Тормозящее влияние соматотропина на деструктивные процессы в культивируемых клетках гранулезы коров из антральных фолликулов, подвергшихся атрезии. / И.Ю. Лебедева, Т.И Кузьмина // Мат. межд. науч. конф. «Актуальные проблемы биологии в животноводстве». Боровск, 2000 С. 443-445.

13. Kuzmina Т. I. Effects of somatotropin, prolactin, and insulin on in vitro degeneration and steroidogenic activity of bovine granulose cells from early atretic follicles /1. Yu. Lcbedeva, Т. V. Kibardina, F. Schneider, H. Aim, H. Tomer // Reprod. Dom. Anim. - 2002. - V. 37. - P. 240.

14. Lcbedeva I. Yu.. Granulosa cell-mediated actions of prolactin and somatotropin on bovine cumulus cells in vitro / Т. 1. Kuzmina, Т. V. Kibardina, F. Schneider, H. Aim, H. Tomer // Proc/ of the 54 th Annual Meet. Of EAAP. Italy. 2003. P. 227.

15. Kuzmina T.I. Granulosa-mediated impacts of prolactin and somatotropin on bovine oocyte maturation in vitro. / I. Yu. Lcbedeva, Т. V. Kibardina, F. Schneider, H. Aim, H. Tomer // Proceedings of the 11th International Congress on Biotechnology in Animal Reproduction at Velke Losiny, Czech Republic, September, 2004. P.74.

Подписано в печать Д/. 11. 2008 г. Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Объём 1 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ №

Отпечатано ризографе ГНУ СЗНИИМЭСХ Россельхозакадемии

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кибардина, Татьяна Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Развитие и атрезия фолликулов в яичниках млекопитающих.

1.1.1. Динамика фолликулогенеза.

1.1.2. Атрезия как физиологический процесс регрессии фолликулов.

1.1.3. Центральная роль гонадотропных гормонов в регуляции фолликулогенеза.

1.1.4. Влияние соматотропина и пролактина на рост, дифференцировку и дегенерацию фолликулярных клеток.

1.1.5. Стероидогенез соматических клеток фолликулов в яичниках млекопитающих.

1.2. Регуляция созревания ооцитов млекопитающих.

1.2.1. Мейотические преобразования хроматина и цитоплазматические изменения в процессе созревания ооцитов.

1.2.2. Участие гипофизарных гормонов в контроле оогенеза.

1.3. Влияние компонентов фолликулярной жидкости на приобретение ооцитами компетенции к овуляции.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1.Материал исследований.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Выделение ооцит-кумулюсных комплексов коров и их оценка

2.2.2. Культивирование ооцит-кумулюсных комплексов коров.

2.2.3. Выделение клеток гранулезы.

2.2.4. Культивирование клеток гранулезы в отсутствии сыворотки

2.2.5. Определение содержания стероидных гормонов — продуктов секреции клеток гранулезы при их культивировании in vitro

2.2.6. Получение монослойной культуры и кондиционированных сред.

2.2.7. Капацитация сперматозоидов, оплодотворение ооцитов in vitro, культивирование зигот и ранних эмбрионов.

2.2.8. Цитогенетический анализ ооцитов, зигот и эмбрионов крупного рогатого скота.

2.2.9. Определение содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов.

2.2.10. Микроскопирование, микрофотосъемка и статистическая обработка полученных данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Влияние клеток гранулезы на способность к развитию ооцитов коров, созревших в присутствии пролактина in vitro.

3.2. Влияние гипофизарных гормонов на соматические клетки фолликула (модель in vitro).

3.2.1. Эффекты пролактина, соматотропина и инсулина на клетки гранулезы при их культивировании в бессывороточной системе.

3.2.2. Статус хроматина клеток кумулюса при их культивировании в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии пролактина и соматотропина.

3.2.3. Функциональная активность клеток гранулезы коров в монослойной культуре под действием пролактина и соматотропина.

3.3. Влияние соматотропина и пролактина на мейотические преобразования хромосом в ооцитах коров in vitro.

3.4.Стероидогенез гранулезных клеток коров при их совместном культивировании с соматотропином, пролактином и инсулином

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль клеток гранулезы при действии соматотропина и пролактина на мейоз ооцитов коров in vitro"

Сочетание методов трансплантации эмбрионов, полученных in vitro, криоконсервации гамет и зародышей позволит значительно интенсифицировать селекционный процесс, увеличить число потомков от высокопродуктивных животных, а также от коров, с заболеваниями репродуктивных органов, нарушением гормонального фона и т.д. Технологии трансгенеза и клонирования дают возможность получать особи, резистентные к различным заболеваниям, способные производить биологически активные вещества, используемые в фармакологии, биомедицинских целях. Базовый метод всех этих эмбриотехнологий — получение зрелых яйцеклеток, пригодных к дальнейшему оплодотворению, получению трансгенных, клонированных животных. В связи с этим, начальный этап технологий (дозревание ооцитов in vitro) приобретает особую актуальность. Состав сред для дозревания, используемых различными исследователями неодинаков по своему составу, а интенсификация технологии и необходимость стабильности результатов требует их стандартизации. Существует несколько моделей созревания яйцеклеток in vitro, в их числе интрафолликуллярное (ооциты созревают внутри фолликулов, которые культивируют в различных питательных средах). Следует отметить низкий выход созревших яйцеклеток в этом случае, по сравнению с результатами экстрафолликуллярного дозревания ооцитов, выделенных из антральных овариальных фолликуллов животного и прокультивированных в синтетических питательных средах. Несмотря на то, что основные этапы многоступенчатой технологии получения эмбрионов in vitro разработаны и стандартизованы (селекция ооцитов, температурный и газовый режимы, капацитация спермы, среды для культивирования эмбрионов), начальный этап — дозревание донорских ооцитов, определяющий успешное формирование биологически полноценной яйцеклетки in vitro требует доработки. Ранее было показано, что введение в среду созревания ооцитов рекомбинантного бычьего соматотропина (СТГ) совместно с сывороткой и клетками гранулезы или без них при дальнейшем оплодотворении способствует повышению выхода эмбрионов на стадии бластоцисты [115, 116, 130, 132]. Обнаружено также, что использование бычьего пролактина (ПРЛ) в качестве добавки при созревании ооцитов обеспечивает возрастание числа эмбрионов на завершающих стадиях доимплантационного развития [11, 41, 131]. Созревание ооцита in vivo -результат сложных межклеточных взаимодействий гаметы и соматических клеток овариального фолликула, в первую очередь, клеток гранулезы (КГ), являющихся продуцентом многих факторов, обеспечивающих нормальное развитие растущего ооцита.

В связи с этим, представляет интерес исследование роли гранулезных клеток при действии пролактина или соматотропина на формирование зрелой яйцеклетки, а также изучение возможности моделирования на этой основе системы дозревания ооцитов с целью повышения эффективности клеточных технологий репродукции.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - исследование роли клеток гранулезы из антральных овариальных фолликулов в опосредовании влияния пролактина или соматотропина при мейотическом созревании ооцитов коров in vitro.

В соответствии с поставленной целью решались следующие конкретные задачи:

3.Охарактеризовать влияние пролактина и соматотропина на морфофункциональное состояние клеток гранулезы коров из овариальных антральных фолликулов диаметром 3-5 мм при их культивировании с учетом:

-жизнеспособности клеток гранулезы (окрашивание прижизненным красителем);

- состояния хроматина гранулезных клеток (уровни дегенерации и про лиф ерации);

-стероидогенной активности клеток.

Научная новизна. Впервые были получены следующие данные:

- выявлено, что КГ, не связанные с ооцитами щелевыми контактами, опосредуют ингибирующее действие ПРЛ и СТГ на реинициацию мейоза ооцитов. Тормозящее действие СТГ и ПРЛ на динамику мейоза является обратимым;

- обнаружено, что среда, кондиционированная КГ в присутствии СТГ или ПРЛ, оказывает ингибирующее влияние на дегенерацию хроматина в ооцитах и окружающих его кумулюсных клетках in vitro; показано, что в ооцитах коров, созревших в средах, кондиционированных КГ в присутствии ПРЛ или СТГ, снижается уровень кальция во внутриклеточных депо.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе использования модели экстракорпорального дозревания ооцитов обоснована гипотеза об участии клеток гранулезы в формировании зрелой яйцеклетки in vitro при созревании ооцитов коров с пролактином или соматотропином в следующей формулировке - клетки гранулезы из антральных овариальных фолликулов (диаметр 3-5 мм), не связанные с ооцитом щелевыми контактами, опосредуют действие пролактина и соматотропина на завершение мейотического дозревания яйцеклетки in vitro. Анализ контролируемых параметров мейоза, выявил положительные эффекты соматотропина и пролактина в присутствии КГ на уровень дегенераций хромосом (снижение) и цитоплазматическое созревание яйцеклетки. Обнаруженное тормозящее влияние СТГ и ПРЛ на реинициацию мейоза ооцитов является обратимым, и не наблюдается при дальнейшем культивировании. Пролонгация дозревания предполагает возможность синхронизации ядерно-цитоплазматического созревания ооцита, что обеспечивает в дальнейшем приобретение яйцеклеткой способности к дальнейшему развитию. При одновременном использовании клеток гранулезы (106 кл/мл) и пролактина (50 нг/мл) повышался процент выхода нормальных эмбрионов, преодолевших блок развития на стадиях 8-16 клеток. Снижение уровня дегенерации хроматина в клетках гранулезы и кумулюса (субпопуляция КГ) под действием ПРЛ или СТГ не было связано с их стероидогенезом (содержанием прогестерона и эстрадиола). Результаты исследования позволяют предположить, что ПРЛ и СТГ влияют на продукцию КГ паракринно действующих факторов, участвующих в регуляции мейоза. С учетом данных исследований для увеличения выхода зрелых яйцеклеток и нормальных эмбрионов коров in vitro предложена система дозревания ооцитов с использованием КГ (106 кл/мл), пролактина (50 нг/мл) или соматотропина (10 нг/мл).

Положения, выносимые на защиту:

- Клетки гранулезы коров из антральных фолликулов диаметром 3-5 мм опосредуют действие пролактина или соматотропина на завершение мейотического созревания яйцеклетки in vitro.

- Введение в систему дозревания ооцитов коров клеток гранулезы из фолликулов 3-5 мм в концентрации 106 клеток на мл среды совместно с пролактином (50 нг/мл) способствует повышению выхода нормальных эмбрионов на завершающих стадиях доимлантационного развития.

2000; 54-й ежегодной конференции Европейской ассоциации животноводства, Италия 2003; на 11-ом международном конгрессе по биотехнологии в репродукции с/х животных, Чехия, сентябрь 2004; «Клеточное ядро» Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, 2007.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, их обсуждения, выводов, предложений, списка использованной при написании диссертации литературы, включающего 265 источников, в том числе 235 на иностранном языке. Диссертация изложена на 136 страницах, включает 7 таблиц, 32 рисунка (в том числе 12 микрофотографий).

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Кибардина, Татьяна Викторовна

ВЫВОДЫ

7. Выявлено, что в ооцитах коров, созревших в средах, кондиционированных КГ в присутствии пролактина или соматотропина, снижается уровень содержания кальция во внутриклеточных депо до 0,67 ± 0,06 усл. ед. (Р < 0,001) и 0,60 ± 0,03 усл. ед. (Р < 0,001), соответственно, по сравнению с контролем 1,0 ± 0,07 усл. ед.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. С целью повышения эффективности технологии получения биологически полноценных ооцитов in vitro использовать для их экстракорпорального дозревания следующую систему: ТС-199, дополненную 10% фетальной бычьей сывороткой, 50 нг/мл бычьим пролактином совместно с клетками гранулезы (10 6 клеток/мл).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кибардина, Татьяна Викторовна, Санкт-Петербург-Пушкин

1. Бехтина, В. Г. Влияние гонадотропных гормонов на морфологию фолликулов в процессе их культивирования вне организма / В. Г. Бехтина,, П.Ф. Ковалев, Л.Д. Галиева // Бюл. ВНИИГРЖ. Л. - 1990. - Вып. 123. -С.24-27.

2. Воробьева, О.А. Факторы роста новые регуляторы репродукции / О.А. Воробьева //Цитология.- 1989.- Т.31,-№ 10.-С. 1139-1157.

3. Воробьева, О.А. Регуляция ингибирования и инициации мейоза ооцитов млекопитающих / О.А. Воробьева // Цитология. 1990. - Т.32, № 5. -С. 422-441.

4. Воробьева, О.А. Влияние гормонов и эпидермального фактора роста на созревание ооцитов в культуре / О.А. Воробьева, Ф.А. Свечникова // Цитология. 1987. - Т.29, № 9. - С. 1077-1089.

5. Голубев, А.К. Методические рекомендации по культивированию ооцитов и фолликулов коров / А.К. Голубев, Б.П. Завертяев, Т.И. Кузьмина -1989.-35с.

6. Денисенко, В.Ю. Участие протеинкиназы С в регуляции стимулированного пролактином освобождения Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней /В.Ю. Денисенко, Т.И. Кузьмина // Цитология. 2002. - № 44(6). - С. 551-554.

7. Дыбан, А.П. Раннее развитие млекопитающих / А.П. Дыбан//-Л.: «Наука», 1988. 228 с.

8. Каганская, В.В. Культивирование ооцитов коров с фолликулярными клетками / В.В. Каганская, Б.Е. Свиридов // Тез. докл. Всес. совещ./ Проблемы развития Биотехнологии в животноводстве. Дубровицы, 1990. — С.14-18.

9. Кузьмина, Т.И. Методы оценки функционального состояния донорских ооцитов, соматических клеток фолликулов и эмбрионовсельскохозяйственных животных. Методические рекомендации / Т.И. Кузьмина, В.Ю. Денисенко, И.Ю. Лебедева // М., 2005. - С.32.

10. Кузьмина, Т.И. Оценка генетической полноценности ооцитов коров при их культивировании вне организма : Автореф дис.канд. биол. Наук: 03.00.15 / Кузьмина Татьяна Ивановна. — Л., 1983. 21 с.

11. Кузьмина, Т.И. Эффекты пролактина в различных системах культивирования на созревание ооцитов коров! и их способность к дальнейшему развитию / Т.И. Кузьмина, И.Ю, Лебедева, X. Торнер, X. Альм // Онтогенез. 2001. -№ 32 (2). - С. 140-147.

12. Кузьмичев, Л.Н. Экстракорпоральное оплодотворение. Отбор, подготовка и тактика ведения больных / Л.Н. Кузьмичев, В.И. Кулаков, Б.В. Леонов // -Москва.: «Мир», 2001. 165 с.

13. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // М. : «Высш. Шк.»: — 1990. — 352 с.

14. Лебедев, В.А. Факторы, регулирующие реализацию эффектов соматотропина и пролактина на фолликулогенез у коров : Автореф дис.канд. биол. наук : 06.02.01 / Лебедев Владимир Александрович. — СПб.- Пушкин, 2000. 20 с.

15. Лебедева, И.Ю. Влияние пролактина на фолликулогенез и мейоз ооцитов коров : Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.15 / Лебедева Ирина Юрьевна. С-Пб,- Пушкин, 1995. - 20 с.

16. Лебедева, И.Ю. Характеристика соматотропин- и пролактинсвязывающих участков на клетках гранулезы коров при использовании гомологичных гормонов / И.Ю. Лебедева, В.А. Лебедев, Т.И. Кузьмина // Биохимия. 2001. - Т. 66, вып. 9. - С. 1188-1194.

17. Лебедева, И.Ю. Влияние пролактина на синтез ДНК в культивируемых клетках гранулезы коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина,• Е.Ф. Гойло // Цитология. 1995. - Т. 37( 3). - С. 220-226.

18. Лебедева, И.Ю. Характеристика соматотропин- и пролактинсвязывающих участков на клетках гранулезы коров прииспользовании гомологичных гормонов / И.Ю. Лебедева, В.А. Лебедев, Т.И. Кузьмина // Биохимия. 2001. - Т. 66 (9). - С. 1188-1194.

19. Лебедева, И.Ю. Модуляция пролактином ингибирующего влияния теофиллина на созревание ооцит-кумулюсных комплексов коров in vitro / И.Ю. Лебедева, О.С. Скотги, Т.И. Кузьмина // Цитология. 2006. - Т.48(12). - С. 1010-1015.

20. Лебедева, И.Ю. Взаимная модуляция регуляторного влияния пролактина и соматотропина на синтез ДНК в клетках гранулезы коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина В.А. Лебедев, Т.А. Гойло // Цитология. — 2000. Т. 42( 5). - С. 468-472.

21. Маленко, Г.П. Получение ранних зародышей крупного рогатого скота для целей трансплантации / Г.П. Маленко, В.П. Рябых, В.В. Титкова // Всес. совещ. / Трансплантация эмбрионов с/х ж.-х. Алма-Ата, 1989. - С.28-29.

22. Никитин, А.И. Факторы! регуляции дифференцировки соматических клеток фолликулов яичников млекопитающих / А.И. Никитин, О.Ф. Воробьева // Цитология. 1988. - Т. 30, № 10. - С. 1155-1171.

23. Никольский, Н.Н. Эпидермальный фактор роста / Н.Н Никольский, А.Л. Сорокин, А.Б. Сорокин // Л.: Наука, 1987. 200 с.

24. Позднякова, Т.Э. Мейотические преобразования хромосом при культивировании ооцитов коров с клетками гранулезы : Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.15 / Позднякова Татьяна Эрастовна. С-Пб -Пушкин, 1994. - 20 с.

25. Свиридов, Б.Е. Закономерности роста фолликулов и созревания ооцитов в яичниках коров при их культивировании in vitro : Автореф. дис. .докт. биол. наук: 03.00.15 / Свиридов Борис Евгеньевич. Ленинград-Пушкин, 1991.-35 с.

26. Скотти, О.С. Реализация действия пролактина на мейоз ооцитов коров: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.15 / Скотти Ольга Сергеевна. С-Пб, Пушкин, 2008. - 20 с.

27. Смирнова,- Т.А. Цитоморфологическая оценка фолликулов коров и критерии их отбора для культивирования и оплодотворения ооцитов: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.15 / Смирнова Тамара Андреевна. — Л.-Пушкин, 1991.-15 с.

28. Ткаченко, С.В. Влияние белков фолликулярной жидкости и аденилатов на прохождение мейоза ооцитами коров: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.15 / Ткаченко Сергей Васильевич. Л. - Пушкин, 1990.- 17 с.

29. Шагиахметова, Г.А. Влияние тканевой культуры фолликулов на мейотическое созревание и оплодотворение in vitro ооцитов коров : Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.15 // Шагиахметова Галина Альбертовна. СПб. - Пушкин, 1992. - 17 с.

30. Albarracin, J.L. Effects of roscovitine on the nuclear and cytoskeletal components of calf oocytes and their subsequent development / J.L. Albarracin, R. Morato, D. Izquierdo, T. Mogas // Theriogenology. -2005. V. 64. - P. 1740-1755.

31. Albertini, D.F. Cellular basis for paracrine regulation of ovarian follicle development / D.F. Albertini, C.M.H. Combelles, E. Benecchi, MJ. Carabatsos // Reprodaction. 2001. - V. 121. - P. 647-653.

32. Amit, Т. Growth hormone- and prolactin-binding proteins in mammalian serum / T. Amit, Z. Hochberg, M.J. Waters, RJ. Barkey // Endocrinology- 1992.-V. 131. P. 1793-1803.

33. Ando, M. Direct ovarian effect of growth hormone in the rabbit/ M. Ando, Y. Yoshimura, M. Iwashita, T. Oda, T. Karube, Y. Ubukata, M. Jinno, Y. Nakamura // Am. J. Reprod. Immunol. 1994. V. 31. P. 123-132.

34. Aguilar, J.J. Effect of homologous preovulatory follicular fluid on in vitro maturation of equine cumulus-oocyte complexes / J.J. Aguilar, G.L. Woods, M.H. Miragaya, L.M. Olsen, D.K. Vanderwall // Theriogenology. 2001. -V. 56.-P. 745-758.

35. Anguita, B. Developmental competence of bovine oocytes is not related to apoptosis incidence in oocytes, cumulus cells and blastocysts / B. Anguita, L. Vandaele, B. Mateusen, D. Maes, A. Van Soom // Theriogenology. 2007. - V. 67. - P. 537-549.

36. Atef, A. The potential role of gap junction communication between cumulus cells and bovine oocytes during in vitro maturation / A. Atef, P. Francois, V. Christian, S. Marc-Andre // Mol. Reprod. Dev. 2005. -V. 71.-P. 358-367.

37. Bartke, A. Role of growth hormone and prolactin in the control of reproduction: What are we learning from transgenic and knock-out animals? / A. Bartke // Steroids. 1999. -V 2. - P. 103-117.

38. Baumann, G. A second, lower affinity growth hormone-binding protein in human plasma / G. Baumann, M.F. Shaw // J. Clin. Endocrinol. Metab. 1990. V. 70. P. 680-686.

39. Beker, A.R. Effect of 17beta-estradiol on the in vitro maturation of bovine oocytes / A.R. Beker, B. Colenbrander, M.M. Bevers // Theriogenology. 2002. - V.58 (9). - P. 1663-1673.

40. Bevers, M.M. The role of prolactin during the oestrous cycle in cattle / M.M. Bevers, S.J. Dieleman, N.A.M. Kruip // Tijdschr. Diergeneeskd. -1988.-V. 113.-P. 1227-1236.

41. Billing, H. Gonadaln cell apoptosis: hormoneregulated cell demis / H. Billing, S.Y. Chun, K. Eisenhauer, A.J. Hsueh // Human Reproduction Update.- 1996. V.2. - P. 103-117.

42. Bodensteiner, K.J. Alterations in follicular estradiol and gonadotropin receptors during development of bovine antral follicles / K.J. Bodensteiner, M.C. Wiltbank , D.R. Bergfelt, O.J. Ginther // Theriogenology.- 1996. V. 45.-P. 499-512.

43. Bole-Feysot, C. Prolactin (PRL) and its receptor: actions, signal transduction pathways and phenotypes observed in PRL receptor knockout mice / C. Bole-Feysot, V. Goffin, M. Edery . // Endocr. Rev. 1998.- V. 19.-P. 225-268.

44. Bornslaeger, E.A. Involvement of cAMF — dependent protein kinase and protein phosphorylation in regulation of mouse oocyte maturation / E.A. Bornslaeger, P. Mattei, R.M. Schultz // Dev. Biol. 1986. - V. 114.-P. 453-462.

45. Brunet, S. Cytoskeleton and cell cycle control during meioticmaturation of the mouse oocyte: integratind time and space / S. Brunet, B.Maro//Reproduction.-2005.-V. 130.-P. 801-811.

46. Burgoyne, P.S. Prenatal oocyte loss in XO mice and its implication for the aetiology of gonadal dysgenesis in Xo woman / P.S. Burgoyne, T.G. Baker // J. Reprod. Rertil. 1985. - V. 75. - P. 633-648.

47. Cain, K. The Apaf-1 apoptosom: • a large caspas-activating complex. / K. Cain, S.B. Bratton, G.M. Cohen // Biochimie. 2002. - V. 84. - P. 203-214.

48. Campbell, B.K. The effect of the presence and pattern of luteinizing hormone stimulation on ovulatory follicle development in sheep / B.K. Campbell, N.R. Kendall D.T.Baird // Biol. Reprod. 2007. -V.76. -P. 719-727.

49. Campbell, B.K. Inhibin A is a follicle stimulating hormone-responsive marker of granulosa cell differentiation, which has both autocrine and paracrine actions in sheep / B.K. Campbell, D.T. Baird // J. Endocrinol.-2001.-V. 169.-P. 333-345.

50. Channy, C.P. Comparison of porsine granulose and cumulus cell properties: LH HCG reseptors / C.P. Channy, S. Lipford Stone, S. Flower // Biol. Reprod. - 1979. - V.20 suppl. - 125. - p. 74.

51. Chen, I. Identification of a factor in fetal serum thet stabilizes the cumulus extracellular matrix / I. Chen, S.J.T. Mao, W.J. Larsen // The Journal of Biological Chemistri. 1992. -V. 267 (17). - P. 12380-12386.

52. Chen, I. Functional significance of cumulus expansion in the mouse: roles for the preovulatory synthesisof hyaluronic acid within the cumulus mass / I. Chen, P.T. Russell, W.J. Larsen // Mol. Reprod. and Devel. 1993. - V. 34. - P. 87-93.

53. Colemana, N.V. In vitro maturation and early developmental capacity of bovine oocytes cultured in pure follicular fluid and supplementation with follicular wall / N.V. Colemana, G.V. Shagiakhmetova,

54. Y. Lebedeva, T.I. Kuzmina, A.K. Golubev I I Theriogenology. 2007. - V.67. -P.1053-1059.

55. Dharma, S.J. Fas and Fas ligand protein and mRNA in normal and atretic mouse ovarian follicles / S.J. Dharma, R.L. Kelkar, T.D. Nandedkar//Reproduction. -2003. V.126. -P.783-789.

56. Dissen, G.A. Neural neutropic control of ovarian development. In ' the Ovary / G.A. Dissen, W.L. Dees, S.R. Ojeda // Ed. Adashi E.Y., Raven Press. -1993.-P. 1-18.

57. Doppler, W. Regulation of gene expression by prolactin / W. Doppler // Reviews of Physiology, Biochemistry and Pharmacology / Eds. M.P. Blaustein . Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag. 1994. - V. 124: - P. 93-130.

58. Downs, S.M. A follicular fluid component prevents gonadotropin reversal of cyclic adenosine monophosphate-dependent meiotic arrest inmurine oocytes / S. M. Downs, J. J. Eppig'// Gamete Res. 1985. - V. 11. - P. 83-97.

59. Downs, S.M. A gap-junction-mediated signal, rather than an external paracrine factor, predominates during meiotic induction, in isolated mouse oocytes / S. M. Downs//Zygote. 2001. - V. 9(1). - P. 7182.

60. Downs, S.M. Involvement of purine nucleotide synthetic pathways in gonadotropin-induced meiotic maturation in mouse cumulus cell-enclosed oocytes / S. M. Downs // Mol. Reprod. Dev. 1997. -V. 46. - P. 155167.

61. Downs, S.M. Differential response of cumulus cell-enclosed and denuded mouse oocytes in a meiotic induction model system / S. M. Downs, R. Gilles, C. Vanderhoef, P.G. Humpherson, H.J. Leese // Mol Reprod Dev. 2006. -V. 73. - P. 379-389.

62. Downs, S. M. Culture conditions affect meiotic regulation in cumulus cell-enclosed mouse oocytes / S.M. Downs, A. M. Mastropolo //Mol. Reprod. Dev. 1997. -V. 46. - P. 551-566.

63. Downs, S.M. Specifity of epidermal growth factor action on maturation of the murine oocyte and the cumulus ooforus in vitro / S. M. Downs // Biol. Reprod. 1989. -V. 41. - P. 371-379.

64. Driancourt, M. A. Follicular dynamics in sheep and cattle / M. A. Driancourt// Theriogenology. 1991. - V.35. - P. 55-79.

65. Driancourt, M. A. Regulation of ovarian follicular dynamics in farm animals. Implications for manipulation of reproduction / M. A. Driancourt//Theriogenology. -2001. -V.55. P. 1211-1239.

66. Duggavathi, R. Short- and long-term effects of unilateral ovariectomy in sheep: causative mechanisms / R. Duggavathi, P. M. Bartlewski, D. M. W. Barrett, E. Bagu, N. C. Rawlings // Biol. Reprod. 2008. -V. 78.-P. 490-496.

67. Dusza, L. Role of prolactin in the regulation of ovarian function in pigs / L. Dusza, J.E. Tilton // J. Reprod. Fert. 1990. - V. 40 (Suppl). - P. 3345.

68. Eppig, J.J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals / J.J. Eppig // Reproduction. 2001. - V. 122. - P. 829838. Eppig J.J.

69. Eppig, J.J. The mammalian oocyte orchestrates the rate of ovarian follicular development / J.J. Eppig, K. Wigglesworth, F.L. Pendola // Proc. Natl. Acad Sci. U.S.S.A. 1985. V. 99. - P. 2890-2894.

70. Eusebi, F. Acetylcholine receptors in human oocytes / F. Eusebi, N. Pasetto, G. Siracusa // J. Physiol. 1984. - V. 346. - P. 321-330.

71. Fair, T. Follicular oocyte growth and acquisition of developmental competence / T. Fair // Anim. Reprod.Sci. 2003. - V. 78. - P. 203-216.

72. Ferrag, F. Immune function of prolactin (PRL) and signal transduction by PRL/GH7cytokine receptors: specificity, redundancy and lessons from chimaeras/ F. Ferrag, V. Goffin, H. Buteau, P.A. Kelly // Cytokines Cell. Mol. Ther. 1997. -V. 3. - P. 197-213.

73. Ferris, H.A. Mechanisms for pulsatile regulation of the gonadotropin subunit genes by GNRH1 / H.A. Ferris, M.A. Shupnik // Biol. Reprod. 2006. - V. 74. - P. 993-998.

74. Fortune, J.E. Ovarion follicular growth and development in mammals / J.E. Fortune // Biol. Reprod. 1994. - V. 50. - P. 225-232.

75. Fortune, J.E. Regulation of steroidogenesis in bovin preovulatory follicles / J.E. Fortune, S.M. Quick // J. Anim. Sci. 1988. - V. 66, Suppl. 2. - P. 1-8.

76. Fortune, J.E. Differentiation of dominant versus subordinate follicles in cattle/ J.E. Fortune, G.M. Rivera, A.C.O. Evans, A.M. Turzillo // Biol. Reprod. -2001. V. 65. - P. 628-654.

77. Fortune, J.E. Follicular development: the role of the follicular microenvironment in selection of the dominant follicle / J.E. Fortune, G.M. Rivera, M.Y. Yang // J. Anim. Sci. 2004. -V.82-83. - P. 109-126.

78. Fortune, J.E. Prolactin modulates steroidogenesis by rat granulose cells: II. Effects on estradiol / J.E. Fortune, R.N. Wissler, S.E. Vincent // Biol. Reprod. -1986. V. 35. - P. 92-99.

79. Fulop, C. Impaired cumulus mucification and female sterility in tumor necrosis factor-induced protein-6 deficient mice / C. Fulop, S. Szanto, D. Mukhopadhyay // Develop. 2003. - V. 130. - P. 2253-2261.

80. Gavenger, J.L. Morphologikal studies of the microcirculatory system of preovulatory ovine follicles / J.L. Gavenger, W.J. Murdoch // Biol. Reprod. 1988. - V.39. - P.989-997.

81. Gilchrist, R.B. Oocyte-somatic cell interaction during follicle development in mammals / R.B. Gilchrist, L.J. Ritter, D.T. Armstrong // Anim. Reprod. Science. 2004. - V. 82-83. - P. 431-446.

82. Goffin, V. Molecular aspects of prolactin and growth hormone receptors / V. Goffin, F. Ferrag, P.A. Kelly //Advances in Molecular and Cellular Endocrinology, edited by LeRoith D. London: JAI. 1998. - P. 1-33.

83. Gong, J.G. Effects of recombinant bovine somatotrophs, insulinlike growth factor-I and insulin on the proliferation of bovine granulose cells in vitro / J.G. Gong, D. McBride, T.A. Bramley, R. Webb // J. Endocrinol. 1993. - V. 139. - P. 67-75.

84. Gong, J.G. Effects of recombinant bovine somatotropin, insulin-like growth factor-I and insulin on bovine granulose cell steroidogenesis in vitro / J.G. Gong, D. McBride, T.A. Bramley, R. Webb // J. Endocrinol. 1994. -V. 143. - P. 157-164.

85. Grant, V.J. Sex-sorted sperm and fertility: an alternative view*/ V.J. Grant, L.W. Chamley // Biol. Reprod. 2007. - V. 76. - P. 184-188. .

86. Grant, V.J. Sex of bovine embryos may be related to mothers' preovulatory follicular testosterone / V.J. Grant, R.J. Irwin, N.T. Standley, A.N. Shelling, L.W. Chamley // Biol. Reprod. 2008. - V. 78. - P. 812-815.

87. Grosdemouge, I. Effects of deletion of the prolactin receptor on ovarian gene expression / I. Grosdemouge, A. Bachelot, A. Lucas, N. Baran, P.A. Kelli, N. Binart // Reprod. Biology and Endocrinology. 2003. - V. 1. -P. 1-16.

88. Henderson, K. Gonadotrophin and steroid concentration in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size / K. Henderson, A. McNeilly, I. Swanston // J. Reprod.Fertil. 1982. - V.65, N 2. - P. 467-473.

89. Hendriksen, PJ.IV1. Bovine follicular development and its effect on the in vitro competents of oocyte / РЛМ; Hendriksen, P.L. Vos, W.N., Steenweg, M.M. Bevers, S. J. DielemanV/ Theriogenology. 2000. - V. 53. ~ P. 11-20.

90. Hickey, Т.Е. Interactions: between androgen and growth factors in granulose cell subtypes of porsine antral follicles / Т.Е. Hickey, D.L. Marrocco, R.B. Gilchrist // Biol. Reprod. 2004. - V. 71. - P. 45-52.

91. Hillier, S.G. Follicular oestrogen synthesis: the 'two-cell, two-gonadotrophin' model revisited / S.G. Hillier, P.F. Whitelaw, C.D. Smyth // Mol. Cell. Endocrinol. 1994* -V. 100(1-2): -P. 51-54.

92. Hirshfield, A. N. Developmental of follicles in the. mammalan ovary / A.N. Hirshfield // Intern. Rev. Gytolog. 1991. - V. 124. - P. 43-101.

93. Hunter, M.G. Endocrine and paracrine control of follicular development and ovulation rate in farm species / M.G. Hunter, R.S.

94. Robinson, G.E. Mann, R. Webb // Anim. Reprod.Sci. 2004. - V. 82-83. - P. 461477.

95. Hussein, T.S. Oocyte-secreted factors enhance oocyte developmental competence / T.S. Hussein, J.G. Thompson, R.B. Gilchrist // Dev. Biol. 2006. -V. 296.-P. 514-521.

96. Imamov, O. Estrogen receptor beta in health and disease / O. Imamov, G.-J. Shim, M. Warner, J.A. Gustafsson // Biol. Reprod. 2005. - V. 73. -P. 866-871.

97. Johnson, A.L. Caspase-mediated apoptosis in the vertebrate ovary / A.L. Johnson, J.T. Bridghman // Reproduction 2004. - V.124. - P. 19 -27.

98. Johnson, A.L. Intracellular mechanisms regulating cell survival in ovarian follicles / A.L. Johnson // Anim. Reprod. Sci. 2003. - V. 78. - P. 185-201.

99. Jones, K.T. Mammalian egg activation : from Ca 2+ spiking to cell cycle progression / K.T. Jones // Reproduction. 2005. - V. 130. - P. 813823.

100. Kolle, S. Developmental changes in the expression of the growth hormone receptor messenger ribonucleic acid and protein in the bovine ovary / S. Kolle, F. Sinowatz, G. Boie, D. Lincoln // Biol. Reprod. -1998.-V. 59.-P. 836-842.

101. Kolle, S. Growth hormoh-related effects on apoptosis, mitosis, and expression of connexin 43 in . bovine in vitro maturation cumulus-oocyte complexes / S. Kolle, M. Stojkovic, G. Boie // Biol. Reprod. -2003.-V. 68.-P. 1584-1589.

102. Kline, J.B. Characterization of a novel and functional human prolactin receptor isoform (ASlPRLr) containing only one fibronectin-like domain / J.B. Kline, M.A. Rycyzyn, C.V. Clevenger // Mol Endocrinol. 2002. -V. 16.-P. 2310-2322.

103. Krasnow, J.S. Regulation of aromatase mRNA and estradiol biosynthesis in rat ovarian granulosa' and luteal cells by prolactin / J: S. Krasnow, G.J. Hickey, J.S. Richards // Mol. Endocrinol. 1990< V. 4. P: 13-21.

104. Kruip, T.A. Macroscopic classification of bovine follicles and its validation by micromorphological and steroid biochemical procedures / T.A*. Kruip, S.J. Dieleman // Reprod. Nutr. Develop. 1982. - V. 22. -P. 465-473.

105. Kuzmina, T.I: Effects of prolactin on intracellular stored calcium in the course of bovine oocyte maturation in vitro / T.I. Kuzmina, I.Yu. Lebedeva, H. Torner, H. Aim, V.Yu. Denisenko // Theriogenology. 1999. — V. 51.-P. 1363-1374.

106. Kuzmina, T.I. Effect of somatotropin on bovine oocyte maturation and early embryonic development in different culture systems / T.I. Kuzmina, H. Torner, H. Aim // Biotechnology, Agronomy, Society and

107. Environment. 1998. -V. 2, Special issue. - P. 73.

108. Larsen, W.J. Differential umodulation of rat folliclecell gap junction population at ovulation / W.J. Larsen, S.E. Wert, G.D. Brunner // Dev. Biol. 1987. - V. 123. - P. 61-71.

109. Lebedeva, I.Yu. Comparison of characteristics of somatotropin and. prolactin binding to bovine granulosa cells / I.Yu. Lebedeva, V.A. Lebedev, T.I. Kuzmina // Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 1998. — V. 2 (Special issue). - P. 67.

110. Lindner, Ch. Endocrine parameters of human follicular fluid and fertilization capacity of oocytes / Ch. Lindner, V. Lichtenberg, G. Westhof // Hormone and Metab. Res. 1988. - V.20 -N 4. - P. 243-246.

111. Lobie, P.E. Cellular localization of growth hormone receptor/binding protein in the male and female reproductive systems / P.E. Lobie, W. Breiphohl, J.G. Aragon, M.J. Waters // Endocrinology. 1990. -V. 126.-P. 2214-2221.

112. Lopez, H. Reproductive hormones and follicular growth during development of one or multiple dominant follicles in cattle / H. Lopez, R. Sartori, M.C. Wiltbank // Biol. Reprod. 2005. - V. 72. - P. 788-795.

113. Lucy, M.C. Regulation of ovarian follicular growth by somatotropin and insulin-lake growth factors in cattle / M.C. Lucy // J. Dairy Sci. 2000. - V. 83. - P. 1635-1647.

114. Lu, J.-C. Multiple internalization motifs differentially used by prolactin receptor isoforms mediate similar endocytic pathways / J.-C. Lu, P. Scott, G.J. Strous, L.A. Schuler // Mol Endocrinol. 2002. - V. 16. - P. 25152527.

115. Luo, W. Distinct regulation by steroids of messenger RNAs for FSHR and CYP19A1 in bovine granulosa cells / W. Luo, M.C. Wiltbank// Biol. Reprod. 2006. - V. 75. - P. 217-225. 127.

116. Lussier, J.G. Growth rates of follicles in the ovary of the cow / J.G. Lussier, P. Matton, J.J. Dufour // J. Reprod. Fertil. 1987. - V. 81. - P. 301307.

117. Machaca, K. Ca signaling differentiation during oocyte maturation /K. Machaca // J. Cell. Physiol. 2007. - V. 213. - P.331-340.

118. Malhi, P.S. Oocyte developmental competence in a bovine model of reproductive aging / P.S. Malhi G.P. Adams, R.J. Mapletoft, J. Singh // Reprod. and Fert. 2007. - V. - P.

119. Mailer, J.L. Interaction of steroids with the cyclic nucleotide system in amphibian oocytes / J.L. Mailer // Advaces inCyclic Nucleotide Research / Eds P. Greegard, G.A. Robinson. 1983. - V. 15. - P. 295-336.

120. Magnia, F. Biochemistry of growth and maturation in mammalian oocytes / F. Magnia, R. Canipari // Development in Mammals / Ed. M Johson. Amsterdam. 1977. - V. 2. - P. 1-30.

121. Markstrom, E. Survival factors regulating ovarian apoptosis -dependence on follicle differentiation / E. Markstrom, E.Ch. Svensson, R. Shao, B. Svanberg, H. Billig // Reproduction 2002. - V. 123. - P. 23-30.

122. Masui Y. Oocyte maturation / Y. Masui, H.J. Clarke // Int. Rev. Cytol. 1979. - V. 57.-P. 186-282.

123. Masui, Y. Cytoplasmik control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes / Y. Masui, K. Clarke // J. exp. Zool. -1971. -V. 177.-P. 129-146.

124. Mattioli, M. Effects of LH and FSH on the maturation of pig oocytes in vitro / M. Mattioli, M.L. Bacci, G. Galeati, E. Seren // Theriogenology. 1991.-V. 36.-P. 95-105.

125. Mattioli, M. Maturation of pig oocytes: observation on membrane potential / M. Mattioli, B. Barboni, M.L. Bacci, E. Seren // Biology of Rep. -1990.-V. 43.-P. 318-322.

126. Mattioli, M. NGF production in sheep follicles after gonadotrohpin stimulation / M. Mattioli, B. Barboni, L. Gioia, P. Lucidi // J. Reprod. and Devel. -1995. -Abstract Series, -n. 15. p. 80.

127. Mattioli, M. Effects ofLH and FSH on the maturation of pig oocytes in vitro / M. Mattioli, M.L. Bacci, G. Galeati, E. Seren // Theriogenology. 1991. - V. 36.-P. 95-105.

128. Mattioli, M. Concentration of cyclic AMF during the maturation pig oocyte in vitro and in vivo / M. Mattioli, G. Galeati, B. Barboni, E. Seren // J. Reprod. and Fertility. 1994. - V. 100. - P. 403-409.

129. Mattioli, M. Follicular factors influence oocyte fertilizability by modulating the intercellular cooperaty between cumulus cells and oocyte / M. Mattioli, G. Galeati, B. Bacci, E. Seren // Gamete Res. 1988. - V. 21. -P. 233-232.

130. Mazur, P. Cryopreservation of the germplasm of animals, used in biological and medical research: importance, impact, status, and future directions / P. Mazur, S.P. Leibo, G.E. Seidel // Biol. Reprod. 2008. - V. 78. - P. 2-12.

131. McGree, E.A. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles/ E.A. McGree, A.J. Hsueh // Endocrine Reviews. 2000. - V. 21. - P. 200-214.

132. McLaren, A. The embryo / A. McLaren // Reproduction in Mammals / Eds. C. Austin, R. Short. Cambridge, 1982. - P. 1-25.

133. Mehlman, Ь.М. Stop and starts in mammalian oocytes: recent advances in understanding the regulation of meiotic arrest and oocyte maturation / L.M. Mehlman // Reporduction. 2005. - V. 130. - P. 797-799.

134. Mendes, M.C. Effect of transitory hyperprolactinemia on in vitro fertilization of human oocytes / M.C. Mendes, R.A. Ferriani, M.M. Sala // J. Reprod. Med. 2001. - V. 46. - P. 444-450.

135. Mendoza, C. Follicular fluid markers of oocyte developmental potentiall / C. Mendoza, R. Ruiz-Requena, E. Ortega, N. Cremades, F. Martinez, R. Bernabeu, E. Greco, J. Tesarik // Human Reprod. 2002. - V. 17. - P. 10171022.

136. Mihm, M. Regulation of follicle wave growth in cattle / M. Mihm, M.G. Disrin, J.F. Roche // Reprod. Dom. Anim. 1996. - V. 31. - P. 531538.

137. Moore, G. Intercellular coupling in mammalian oocytes/ G. Moore, D.G. Cran // Development in Mammals / Ed. M.N Johnson. 1980. - V. 4. - P. 337.

138. Moore, G. cAMF in mammalian follicies cells and oocytes during maturation/ G. Moore, J. Crosby // J. Exp. 1981. - V. 216. - P. 205-209.

139. Moore, R.M. Temperature-induced abnormalities in sheep oocytes during maturation / R.M. Moore, J.B. Helson // J. Reprod. Fertil. 1985. - V. 75. -P. 467-473

140. Moore, G. Transcription of the mouse oocyte genome / G. Moore, S. Linter-Moore // Biol. Reprod. 1978. - V. 18. - P. 865-870.

141. Moor, R.M. Selective effect of gonadotropins on cell coupling, nuclear maturation, and protein synthesis in mammalian oocytes / R.M.

142. Moor, J.C. Osborn, D.G. Cran, D.E. Walters // J. Embriol. Exp. Morphol. 1981. -V.61.-P. 347-365.

143. Nagano, M.C. In Vitro Gamete Derivation from Pluripotent Stem Cells: Progress and Perspective / M.C. Nagano // Biol. Reprod. 2007. - V. 76. -P. 546-551.

144. Nogueira, D. Effects of long-term in vitro exposure to phosphodiesterase type-3 inhinitors on follicle and oocyte development / D. Nogueira, R. Cortvrindt, B. Everaerdt, Ji Smitz // Reproduction. 2005. - V. 130.-P. 177-186.

145. Oda, T. Effects of prolactin on fertilization and cleavage of human oocytes / T. Oda, Y. Yoshimura, Y. Takehara, S. Kohriyama, Y. Sano, K. Tanabe, T. Kobayashi, Y. Nakamura, T. Ohno, S. Nozawa // Horm. Res. — 1991. — V. 35, Suppl. l.-P. 33-38.

146. Palermo, R. Differential actions of FSH and LH during folliculogenesis / R. Palermo // Biol. Reprod. Biomed Onlin. 2007. - V.15(3). -P. 326-337.

147. Panigone, S. LH Signaling in Preovulatory Follicles Involves Early Activation of the EGFR Pathway / S. Panigone, M. Hsieh, M. Fu, L. Persani, M. Conti // Mol. Endocrinol. Online. 2008. - V. - P. -.

148. Pangas, S.A. The art and artifact of GDF9 activity: cumulus expansion and the cumulus expansion-enabling factor / S.A. Pangas, M.M. Matzuk // Biol. Reprod. 2005. -V.73. - P. 5 82-585.

149. Pearson, G. Mitogen-activated protein (MAP) kinase pathways: regulation and physiological functions / G. Pearson, F. Robinson, G.T. Beers, B.E. Xu, M. Karandikar, K. Berman, M.H. Cobb // Endocr Rev. 2001. -V. 22. -P. 153-183.

150. Peluso, J.J. Multiplicity of Progesterone's Actions and Receptors in the Mammalian Ovary / J.J. Peluso // Biol. Reprod. 2006. - V.75. - P. 2-8.

151. Peng, X.R. Localization of luteinizing hormone reseptor messenger ribonucleic acid expression in ovarian cell types duringfollicle development and ovulation / X.R. Peng, A.J.W. Hsuer, P.S. Lapolt // Endocrinology. 1991. -V. 129. - P. 3200-3207.

152. Perks, C.M. Prolactin acts as a potent surval factor against C2-ceramideinduced apoptosis in human granulose cells / C.M. Perks, P.V. Newcomb, M. Grohmann //Hum. Reprod. 2003. - V. 14. - P. 2672-2677.

153. Porter, D.A. Susceptibility of ovarian granulose cells to apoptosis differs in cells isolated before or after the preovulatory LH suge / D.A. Porter, R.M. Harman, R.G. Cowan, S.M. Quirk // Mol. Cell. Endocrinol. 2001. - V. 176. - P. 13-20.

154. Postel-Vinay, M.C. Growth hormone- and prolactin-binding proteins: soluble forms of receptors / M.C. Postel-Vinay // Horm. Res. 1996. - V. 45. - P. 178-181.

155. Postel-Vinay M.C., Growth hormone receptor: structure and signal transduction / M.C. Postel-Vinay, J. Finidori // Eur. J. Endocrinol. 1995. - V. 133.-P. 654-659.

156. Quesnel, H. Localization of binding sites for IGF-I, insulin and GH in the sow ovary / H. Quesnel // J. Endocrinol. 1999. - V. 163. - P. 363-372.

157. Quirk, S.M. Ovarian follicular growth and atresia: the relationship between cell proliferation and survival / S.M. Quirk, R.G. Cowan, R.M. Harman, C.L. Hu, D.A. Porter // J. Anim. Science. 2004. - V.82. - P.40-52.

158. Reynaud, К. Oocyte attrition. / К. Reynaud, M.A. Driancourt // Mol. Cell. Endocrinol. 2000. -V. 163. - P. 101-108.

159. Rivera, G.M. Development of Codominant Follicles in Cattle Is Associated with a Follicle-Stimulating Hormone-Dependent Insulin-Like Growth Factor Binding Protein-4 Protease / G.M. Rivera, J.E. Fortune // Biol, of Reprod. 2001.-V.65.-P.112-118.

160. Rodman, T. RNA synthesis in preovulatory mouse oocytes. / T. Rodman, R. Bachvarova // J.Cell Biol. 1976. - V. 70. - P. 251-257.

161. Roux, P.P. ERK and p38 MAPK-activated protein kinases, a family of protein kinases with diverse biologycal functions / P.P. Roux, J. Blenis // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2004. - Vol. 68. - N.2. -P. 320-344.

162. Schroeder, M.D. Inhibition of PRL-induced proliferative signals in breast cancer cells by a molecular mimic of phosphorylated PRL, S179D-PRL / M.D. Schroeder, J.L. Brockman, A.M: Walker, L.A. Schuler // Endocrynology. -2003. -N 144. P. 5300-5307.

163. Schoevers, E.J. Nuclear and cytoplasmic maturation of sow oocytes are not synchronized by specific meiotic inhibition with roscovitine during in vitro maturation / E.J. Schoevers, M.M.

164. Bevers, В.А. Roelen, В. Colenbrander // Theriogenology. 2005. - V. 63 - P. 1111-1130.

165. Schwertfeger, K.L. Prolactin stimulates activation of c-jun N-terminal kinase (JNK) / K.L. Schwertfeger, S. Hunter, L.E. Heasley, V. Levresse, R.P. Leon, J. DeGregori, S.M. Anderson // Mol Endocrinol. 2000. - V. 14. - P. 1592-1602.

166. Senbon, S. Interactions between the oocyte and surrounding somatic cells in follicular development: lesson from in vitro culture. / S. Senbon, Y. Hirao, T. Miyano // J. Reprod. and Develop. 2003. - V. 49. - P. 259-269.

167. Serdar, C. Mexanism of action of epidermal growth factor -induced porcine oosyt maturation / C. Serdar, C. Young // Mol.Reprod and Devel. 1995,- V. 42.-P. 311-317.

168. Shimada, M. Delay of nuclear maturation and reduction in developmental competence of pig oocytes after mineral overlay of in vitro maturation media / M. Shimada, N. Kawano, T. Terada // Reproduction. -2002. V. 124. - P. 557-564.

169. Sinha, Y.N. Structural variants of prolactin: occurrence and physiological significance / Y.N. Sinha // Endocr. Rev. 1995. - V. 16. - P. 354369.

170. Sirard, M.A. In vitro inhibition of oocyte nuclear maturation in the bovine / M.A. Sirard, N.L. First // Biol. Reprod. 1988. - V.39. - P. 229234.

171. Sirard, M.A. Timing of nuclear progression and protein, synthesis necessary for meiotic maturation of bovine oocytes /М.А. Sirard, H.M. Florman, M.L. Leibfried-Rutledge, F.L. Barnes, L. Sims, N.L. First // Biol. Reprod: 1989. -N 40. - P. 1257-1263.

172. Sirois, J. Ovarian follicular dynamics during the estrous cycle in heifers monitored by real-time ultrasonography. / J. Sirois, J.E. Fortune // Biol. Reprod. 1988. - V. 39. - P. 308-317.

173. Sirotkin. A.V. Growth hormone and prolactin affect oxytocin, vasopressin, progesterone and cyclic nucleotide secretion by bovine granulosa cells in vitro / A.V. Sirotkin, J. Nitray // J. Endocrinol. 1994. - V. 143,- P. 417-422.

174. Sirotkin, A.V. GH regulates secretory activity and apoptosis in cultured bovine granulosa cells through the activation of the cAMP/protein kinase A system / A.V. Sirotkin, A.V. Makarevich // J. Endocrinol. 1999. - V. -163.-P. 317-327.

175. Skinner, M.K. Ovarian thecal/interstitial cells produce an epidermal growth factor-like substance / M.K. Skinner, D. Lobb, J.H. Dorrington // Endocrinology.- 1987.-V. 121.-P. 1892-1899.

176. Soares, M.J. The prolactin and growth hormone families: Pregnancy-specific hormones/cytokines at the maternal-fetal interface- // Reproduction Biology and Endocrinology. 2004. - V. 2:51. - P. 15.

177. Spicer, L.J. Effects of estradiol on bovine thecal cell' function in vitro: dependence on insulin and gonadotropins / L.J. Spicer // J. Dairi Sci. 2005. - V. 88(7). - P. 2412-2421.

178. Spicer, L.J. Interactions among basic fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin, and insulin-like growth factor-I

179. F-I) on cell numbers and steroidogenesis of bovine thecal cells: role of IGF-I receptors / L.J. Spicer, R.E. Stewart // Biol. Reprod. 1996. - V.54. -P. 255-263.

180. Spicer, L.J. Interaction among bovine somatotropin, insulin, and gonadotropins on steroid production by bovine granulosa and thecal cells / L.J. Spicer, R.E. Stewart // J. Dairy Sci.- 1996. V. 79. - P. 813-821.

181. Spicer, L.J. Insulin-like growth factor-II stimulates steroidogenesis in cultured bovine thecal cells / L.J. Spicer, J.L. Voge, D.T. Allen // Mol. Cell. Endocrinol. 2004. - V. 30. - P. 227-52.

182. Song R. X. Membrane initiated estrogen signaling in breast cancer / R.X. Song, R. J. Santen // Biol. Reprod. 2006. - V.75. - P. 9-16.

183. Soto, A.M. Cell proliferation of estrogen-sensitive cells: the case for negative control / A. M. Soto, C. Sonnenschein // Endocrine Rev. 1987. — V. 8.-P. 44-52.

184. Sotelo, A.I. Concentration of free growth hormone-binding protein in the serum of mice is not regulated by growth hormone / A.I. Sotelo, F.P. Dominici, A. Bartke, D. Turyn // J. Endocrinol. 1997 - V. 153. - P. 319-325.

185. Sunderland, S.J. Selection, dominance and atresia of folliclesduring the oestrous cycle: of heifers / S.J. Sunderland, M.A. Crowe, M.P. Boland // J. Reprod. Fertil. 1994.-V. 101.-P. 547-555.

186. Sun, L. Ca2+ homeostatis regulates xenopus oocyte maturation / L. Sun, R. Hodeify, S; Haun, A.A. Charlesworth, A.M. MacNicol, S. Ponnappan, U. Ponnappan, C. Prigent, K. Machaca // Biol. Reprod. 2007. - V.107. - P. 6369. . ' '

187. Svensson E.G. Progesterone reseptor-mediated inhibition of apoptosis in granulose- cells isolated from ratstreated with human:, chorionic gonadotropin / E.G. Svensson, E. Markstrom, M. Andersson, II. Billing//Biol. Reprod. -2000-- V.63: -P; 1457-1464:

188. Tarkowski, A. An air-drying method for chromosomal preparation from mouse; eggs / A. Tarkowski // Cytogenetic. 1966. - V. 1. -P.394-400.

189. Tarkowski;. A.K. Nucleo-cytoplasmic interaction im oogenesis and* ealy embryogenesis in the mouse / A. Tarkowski//Embryonic Development. Part A. Genetik Aspects. / Eds M.M. Burger, R:Weber. N. Y.: -1982. -P. 407-416.

190. Tatemoto, H. Involvement of cyclic AMP-dependent protein kinase in chromatin condensation before germinal vesicle breakdown in bovine oocytes / H. Tatemoto, T. Terada // Animal Reprod. Science. 1996. - V. 44. -P.99-109.

191. Tosca, L. Effects of Metformin on Bovine Granulosa Cells Steroidogenesis: Possible Involvement of Adenosine 5' Monophosphate-Activated Protein Kinase (AMPK) / L. Tosca, C. Chabrolle, S. Uzbekova, J. Dupont // Biol. Reprod. 2007. - V.76. - P. 368-378.

192. To'th, S. Egg activation is the result of calcium signal summation in the mouse / S. To'th, D. Huneau, B. Banrezes, J.-P. Ozil // Reproduction. 2007. - V. 131. - P. 27-34.

193. Tosti, E. Fertilization and activation currents in bovine oocytes / E. Tosti, R. Boni, A. Cuomo // Reproduction. 2002. - V. 124. - P. 835846.

194. Tosti, E. Calcium ion currents mediating oocyte maturation events / E. Tosti // Reproductive Biology and Endocrinology 2006, 4:26.

195. Tsafriri, A. The role of oocyte maturation inhibitor in follicular regulation of oocyte maturation / A. Tsafriri, N. Dekel, S. Bar-Ami // J. Reprod. and Fertility. 1982. -V. 68. - P. 541-551.

196. Valdez, К. E. Regulation of apoptosis in atrezia of dominant bovine follicles of the fist follicular wave following ovulation / K.E. Valdez, S. Cuneo, M. Turzillo // J. Reprod. and Fertility. 2005. - V. 130. -P. 71-81.

197. Vanderhyden, B.C. Species differences in the regulation of cumulus expansion by an oocyte secreted factor (s) / B.C. Vanderhyden // J. Reprod. and Fertility. - 1993. - V. 98. - P. 219-227.

198. Vanderhyden, B.C. Mouse oocytes regulated granulisa cell steroidogenesis / B.C. Vanderhyden, J.N. Cohen, P. Morley // Endocrinology. -1993.-V. 133.-P. 423-430.

199. Van Loo, G. The role of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more then one bullet / G. Van Loo, X. Saelens, M. Van Gurp, M. MacFarlane, S.J. Martin, P. Vandenabeele // Cell Death Differ. -2002.-V. 9.-P. 1031-1042.

200. Vantaggiato, C. ERK1 and ERK2 mitogen-activated protein kinases affect Ras-dependent cell signaling differentially / C. Vantaggiato, I. Formentini, A. Bondanza, C. Bonini, L. Naldini, R. Brambilla // Journal of Biology. 2006. - Vol. 5. - N. 14.

201. Veldhuis, J.D. Divergent effects of prolactin upon steroidogenesis by porcine granulose cells in vitro: influence of cytodifferentiation / J.D. Veldhuis, P.A. Klase, J.M. Hammond // Endocrinology. 1980. - V. 107. - N.l. -P. 42-46.

202. Endocrinol. -2004. -V. 26(3). P. 241-258.

203. Wallis, M. Mechanism of action of prolactin / M. Wallis // Hormones and their actions. Pt.2. - Amsterdam etc.: Elsevier. - 1988. - P. 295-319.

204. Walters, K.A. Androgen Actions and the Ovary / K.A. Walters, C.M. Allan, D.J. Handelsman // Biology Reprod. 2007. - V. 78. - P. 380-389.

205. Wang, C. Induction of functional prolactin receptors by follicle-stimulating hormone in rat- granulosa cells in vivo and in vitro / C. Wang, A.J.W. Hsueh, G.F. Erickson // J. Biol. Chem. 1979. - V. 254. - P. 11330-11336.

206. Warzych, E. Maturation medium supplements affect transcript level of apoptosis and cell survival related genes in bovine blastocysts produced in vitro / E. Warzych, C. Wrenzycki, J. Peippo, D. Lechniak // Mol. Reprod. Dev. 2007. - V. 74. - P.280-289.

207. Wathes D.C., Perks C.M., Davis A.J., Denning-Kendall P.A. Regulation of insulin-like growth factor-I and progesterone synthesis by insulin and growth hormone in the ovine ovary//Biol. Reprod. 1995.-V. 53. - P. 882-889.

208. Webb, R. Development of the dominant follicle: mechanisms of selection and maintenance of oocyte quality / R. Webb, B.K. Campbell // Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 2007. - V. 64.-P. 141-163.

209. Webb, R. Control of follicular growth: local interactions andКnutritional influences / R. Webb, P.C. Garnsworthy, J.-G. Gong, D.G. Armstrong // J. Anim. Sci. 2004. - V. 82. - P. 63-74.

210. Webb, R. Role of growth hormone and intrafollicular peptides in follicle development in cattle / R. Webb, J.G. Gong, T.A. Bramley // Theriogenology. 1994. -V. 41. - P. 25-30.

211. Webb, R. Mechanisms regulating follicular development and selection of the dominant follicle / R. Webb, B. Nicholas, J.G. Gong, B.K. Campbell, C.G., Gutierrez, H.A. Garverick, D.G. Armstrong // Reprod Suppl.2003.-V. 61.-P. 71-90.

212. Whitaker, M. Calcium at fertilization and in early development/ M. Whitaker // Physiol Rev. 2006. - V. 86. - P. 25-88.

213. Wu, D. A Growth-maturation system that enhances the meiotic and developmental competence of porcine oocytes isolated from small follicles / D. Wu, Q. Cheung, L. Wen, J. Li // Biology of Reprod. -2007.-V. 75.-P. 547-554.

214. Zeuner, A. Apoptosis within bovine follicular cells and its effect on oocyte development during in vitro maturation / A. Zeuner, K. Muller, K. Reguszynski, K. Jewgenow // Theriogenology. 2003 - V.59. - P. 1421-33.

Информация о работе

Кибардина, Татьяна Викторовна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург-Пушкин, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Роль клеток гранулезы при действии соматотропина и пролактина на мейоз ооцитов коров in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы