Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль мембрансвязанного кальция в мейотическом созревании и оплодотворении ооцитов коров

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Роль мембрансвязанного кальция в мейотическом созревании и оплодотворении ооцитов коров"

. .

ВСЕРОССИЙСКИ И НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ "2 , СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

ДЕНИСЕНКО Виталий Юрьевич

УДК 636.2:591.391.2

РОЛЬ МЕМБРАНСВЯЗАННОГО КАЛЬЦИЯ

В МЕЙОТИЧЕСКОМ СОЗРЕВАНИИ И ОПЛОДОТВОРЕНИИ ООЦИТОВ КОРОВ

Специальность 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ—ПУШКИН

1995

Работа выполнена в лаборатории культивирования эмбрионов Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных, Санкт-Петербург—Пушкин.

Научные руководители — доктор сельскохозяйственных паук, профессор Б. П. Завергяев; доктор биологических наук Т. И. Кузьмина.

Официальные оппоненты — доктор медицинских паук, профессор А. И. Никитин; кандидат биологических наук'И. Ш. Шапиев.

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургская Государственная Академия ветеринарной медицины.

заседании диссертационного совета Д 020.07.01 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук во Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « » ЬиС/ЛЛ Кх. 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук,

Защита состоится

1995 г? в час. на

профессор

Ж. Г. Логиноз

'общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время биотехнология itaK перспективное п приоритетное напрз&чение в кивотнозодотве развивается ускоренными теииали. Одним пз ваяных ее раэделов является клеточная илязнеряя, в основа которой лежит культивирс^ валив'гамат к эмбрионов ««- vilro .

В последние года достигнуты существенные успехи а разработке методов культивирования и экстракорпорального оплодотворения ооцитов коров и получения на этой, основе эмбрионов (Эрнст и др., IS83; Кугьмлна, IS93). Технология оплодотворегшя invUro приобрела большое значение как в практическом - источник получения эмбрионов для целей трансплантация, клеточной и генетической'инженерии, так и в теоретическом плане - моделирование дозревания ооцитов на основа различных систем культивирования, что позволяет изучать механизмы мейоза и раннего эмбриогенеза. .

Однако до ми пор в технологии экстракорпорального созрэ-вшшя и оплодотворения ооцитов существует ряд нерешенных вопросов. Один из них - изучение механизмов функцпоначьйой активности фолликулов и социтов и роли в этих процессах ионов Са.

В связи о-этим возникает необходимость в получения данных, касащихся флуктуации мембрансвязанного Са в процессе фолла-куло- и оогенеза, его роли в мейотическом созревании ооцита и развитии ранних вибрионов.

Цель и задачи исследований. Целью исследований явилось изучение роли мембрансвяэанного Са в мейотическом созревания и оплодотворении ооцитов коров '<-«- vilra , в соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:1.

- определить содержание мембрайсвязэнного Са а ткани фол»-

ликулов ПРИ КУЛЬТИВИРОВащШ и vitro ;

- выявить характер влияния пролактина на интенсивность флуоресценция 'мембрансвяэанного Са в ооцитах й тканях фолликулов коров;

- изучить влияние ФСГ* пролактина н эстрадиола на содор-гание йембраноЁязаняого Са в клетках гранулезы из фолликулов различного диаметра;

- исследовать оодерлание мембрансвяэанного Са в ооцитах коров па различиях стадиях мейоза;.

- изучить содержание кофермеитов окислительного фосфори-

лировашш в ооцитах, зш'отах и эмбрионах;

- провести морфофункциональнуп оценку качества эиг.от и эмбрионов коров, полученных ^¡¿гр ,

Научная новизна. Разработан способ оценки'качества ооцн-тов и эмбрионов люминесцентным методом по уровню содержания в них мембрансвязанного кальция, В ооцитах обнаружено увеличение содержания мембрансвязалного Са при прохождении стадий мейоза. Установлено, что морфологические изменения эмбрионов, тканей фолликулов солровоадагагся гипераккумуляцаей в них мембраксвя- . эашшго Са. В эмбрионах с увеличением числа бластомероэ возрастает интенсивность флуоресценции мембрансвяэанного кальция и количество восстановленного НАШ. Показано, что при введении в среду культивирования пролактина увеличивается содержание мембрансвязашшго Са в гранудезе 'фолликулов диаметром 10 ш и уменьшается в гранулезэ .фолликулов диаметром 2-6 ш,.

Практическая значимость. Разработан метод комплексной оценки качества ооодтов к вибрионов, включая морфологическую характеристику и функциональное состояние (содержание в исследуемых объектах мембрансвязанного Са).

Апробагою работы. Основные результаты исследований доло-зкёнц и обсувдеиы на отчетных сессиях аспирантов ВШИГРЖ (1992, 1393 гг.), на 1-й международной научной конференции молодая ученых и специалистов (Киев, 1994), на .Мзвдународвом симпозиума "'Моледлярная Генетика и биотехнологий в оценке и иэмецешш геномов сельскохозяйственных животных" {Санкт-Петербург - Пушкин, 1994).

11убл!|кащта. По материалам диссертации опубликованы три работы» .

Объем и стцукуурл дйосертацта. Диссертация состоит из введения, обзора литератури, материалов и методов исследований, обсуждения, выводов И предложений, списка использованной литературы, вюшчавдего Г?1? источников, а том числа 144 иностранцах.-Работа изложена на страницах машинописного текста я содержит 12 таблиц, I рисунок, 7. микрофотографий.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом служили ооциты я фолликула, выделенные из яичников коров и телок, убитых на Санкт-Петербургском мясокомбинате. Яичники помещали а термос со средой TC-I99 и антибиотиками (стрептомицин - 50 миг/мл, пенициллин - 100 ед/мл). Время досг тавга материала в лабораторию составляло 1,5-2 часа. Для экспериментов использовали яичники на стадии фолликулярного роста.

Ооццт-кумулвсные комплексы асплрировалп совместно с фолликулярной жидкостью и клетка!,ffl гранулеэы га фолликулов диаметром от 2 до 6 км и помещали в чашку Петри. Для экспериментов использовали ооциты округлой формы с тонкогранулировавной ооплазмой, равномерной по ширине зоной пеллзоцвда, окруженной не менее, чем 5-тыо слоя,m клеток кумулюса. Перед культивированием ооцит-^г-мулюсныа комплексы тризды промывали в TC-I99 с 10$ фетальной сыворотки-крупного рогатого скота с'добавлением гепарина и ген-тамицина в концентрации I ед/мл и 10 ед/мл соответственно.

Фолликулы из яичников коров выделяли в соответствии с методическими рекомендациями, разработанными в лаборатории культивирования эмбрионов (Л., 1969). 3 зависимости от диаметра, фолликулы объединили в три группы: I - диаметр 3 мм, П - 6 мм и Ш - 10 мм и более.

Визуальными критериями полноценности фолликулов служили: упругий гургор, прозрачная внешня оболочка, развитая сеть кровеносных сосудов. Фолликулы, морфологическая характеристика которых не соответствовала данным требованиям, классифицировали как атретические.

Фолликулы промывали в среде ТС-1ЭЭ с добавлением гепарина (I ед/мл) и гентамйцина (10 ед/мл). Тканевую культуру фолликулов получали путем их разрыва при помощи глазных пинцетов в чашке Петри с 5 мл среды и I0&.фатальной сыворотки крупного рогатого скота и освобоздоная от фолликулярной жидкости. Затем ткань фолликула три раза промывали в среде TC-I99 с добавлением 10$ фетальной сыворотки для удаления остатков фолликулярной жидкости и отслоившихся клеток гранулеэы.

Клетки гранулеэы извлекали из фолликулов диаметром 2-10 юл путем аспирации. Фолликулярную жидкость отбирали в иеницил-

линовый флакон в присутствии I мл среды ТС-19Э с 10?! фетальной сыворотки и генташцина £10 ед/мл). Гранулезу освободцали от фолликулярной кидкости центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5-7 шнут. Суперкатант удаляли, а к осадку добавляли свежую среду и ресуспендировали его. Процедуру повторяли три раза.

Клетки гранулезы и ткань фолликулов культивировали в среде ТС-199 с 10% феталыюй сыворотки и различными гормональными добавками - фолликулосткмулирувдего гормона (15 мкг/мл), эстра-даола (500 нг/мл) и пролактина (6-50. нг/мл). Продолжительность культивирования составляла 2,4 я 18 часов.

Жизнеспособность клеток гранулезн определяли с помощью тряпанового синего и по пикнотичаскому индексу. Последний равнялся отношений количества клеток с Еикнотическими ядрами к числу нормальных клеток, умноженному на 100$. Раочет производили на 500 клеток.

Капацитаци» спермы производили по метода Рси-г^к с использованием среды ТА1Р (Ригг^а , 1986).

Ранние эмбрионы <2-4 клеточные) культивировали в среде ТС-199 с 10% фетальной сыворотки и эпителиальными клетками яйцевода {ЧсгЛа». «С, 1990).

Функциональное состояние ооцитов и эмбрионов исследовали методом лшинесцентного анализа ( ¡-"г-илк&л., 1967), модифицированного в.соответствии с объектом исследований (ооциты и вибрионы)^ лаборатории культивирования шбрионов (Кузьмина, Малышев, 1991). ■ .

•Для определения внутриклеточного кальция использовали флуоресцентный зонд - хлортетрациклин (ХТЦ) в концентрации 40 мк»1оль.

Параметры проведения люминесцентного анализа: длины волн возбуждения НАДЯ - 365 нм, ФАД - 436 нм, кальция - 380-400 юл; регистрацию флуоресценции проводили в спектрах: 465 (1ЩЩ), 530 (ФАЮ , Са2+ - 530 нм. Бремя облучения - до 10 оек.

Перед, проведением измерений ооциты и эмбрионы при необходимости очищали от кумулюса, промывали и переносили в физиологический раствор, содержаний ХТД в концентрации 40 мкйоль. Клетки помещали на специальное кварцевое стекло о ячейкам объемом 0,1 мл и инкубировали с ХТД в течений 5 минут. Длительность воздействия УФ излучения на клетку пхш проведении

измерений не превышала 10 секунд.

Спектр.возбуждения ХТЦ-Са-мембрана находится э области 380-400 нанометров, максимум флуоресценции регистрировали в .области 530 нм.

Ткань фолликула промаваля, переносили в Физиологический раствор с концентрацией ХТД 40 шйоль, размещали в чашках Петри диаметром 45 ш и проводили измерение»

Предварительно выделенные и отмытые клетки гранулезы рэ-суспендировали в физиологическом раствора с Щ» фетальной сыворотки. Перед снятием показателей на люминесцентном микроскопе клетки гранулезы разводили физиологическим раствором с ХТЦ до конечной концентрации Х'ГЦ 40 мкЛоль и проводили измерение..

Цитогенетнческие препарата ооцитов л эмбрионов готовили по методу Тарковского.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью критерия Сгьадекта.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСШЕШ КССЛЗДОЗАШЙ И ИХ 0БСУ£ДЕНЯЕ

Цито:.*.ор$о-?уккцпокалькая характеристика структурных элементов фолликула. 3 настоящее время-в технологии экстракорпорального дозревания ооцитоз широко применяются тканевые к клеточные к} ль туры фолликулов. Механизм положительного влияния систем культивирования, основанных на использовании структурных элементов фолликула, до спх пор не ясен.

Ранее были показаны высокие результаты при использовании для оплодотворения Сма!« ооцигов, полученных при дозревании в системах на основе клеточных и тканевых культур, выделенных из фолликулов диаметром 2-й к.; (Кузьмина, Завертяев, Шагиахме-това, 1990).

Для выяснения возможности положительного воздействия структурных элементов фолликула на дозревание компетентных к оплодотворению ооцатов были проведены эксперименты по изучению эффекта различных гормональных добавок на морфофункциональные изменения в соматических и половых клетках фолликулов.

При проведении экспериментов контролировали следующие параметры: содержание мембрансвязанного Са в тканях и клетках фолликула, количество НАДН и ФАД в пронуклеусах и эмбрионах,

пики о тиче ский вадеко в клетках гранулезы, цитогенетический мониторинг ооцитов.

Объектами исследований служили структурные элементы фолликула. В экспериментах охарактеризовали популяцию антральных фолликулов различного диаметра (от 3 до 10 ш), выделонних из яичников на стадии фолликулярного роста. Учитывалась морфологические признаки-(размер, состояние оболочки, тургор) и функциональное состояние (б качестве маркера использовали содержание мембрансвяэанного Са). К нормальным относили фолликулы с высоким тургором и равномерной сетью капилляров.

Таблица I. Содержание Са в структурных элементах нормальных и атретических фолликулов

Тип структурнцх элементов фолликулов Морфологическая характеристика Число Интенсивность фяуорес-(п) ценцил мекбрансвязан-иого Са (В)

0 часов

ткань фолликула нормальные 28 0,67 + 0,03

диаметром 3 ш дегенерированные 12 0,97 + 0,03

_ и _ нормальные 21 0,92 + 0,04 1,44 + о.ое30^

диаметром 6 ш дегекерировшшые 12

- " - нормальные 32 0,92 + 0,01 ■ 1,06 + О.ОЗ**

диаметром 10 мм дегенерированные 27

гранулеза гранулеза гранулеза (фоллида 2-6 мм) гранулеза (сболликул I 0 ш й более) 0,011 + 0,0002 0,019 + 0,0004хх

ооцит ооцит на стадии дшлотены 1,21 + 0,08

Примечание. Уровень вероятности достоверности разности средних арифметических: х~ Р<0,05; хх_ Р<0,01; ххх- Р<0,001.

Обнаружено, что ткань нормалтих фолликулов диаметром 3 ш по содержанию мемб рансвязанного Са не имела достоверных различий о тканью из фоллшсулоь такого же диаметра, но имевших признака! дегенерации - 0,07 + 0,03 против 0,97 + 0,06 (табл.I). О увеличением диаметра атретических фолликулов (6 мм) содержание

мембрансвязанного Са и них было выла, чем в нормальных (1,44 + 0,08 против 0,92 £ 0,04), а в ткани 10 ш фолликулов о признаками агрезии концентрация мембрансвязанного Са составила 1,06 + 0,03 против 0,96 + 0,01 в ткани нормальных фоллш;улоз.

Исследование интенсивности флуоресценции клеток гракулезы, выделенных из антральных фолликулов размером 10 ж и более показало, что содержание мембрансвяэанного Са в них достоверно выше, чем в гранулезе из фолликулов небольшого даамэсра (З-о мм).

Ооциты, оцененные в комплексе с кумулюеными клетка;.® как нормальные, на стадии диплотены имели интенсивность флуоресценции 1,21 + 0,08, в то время как яйцеклетки с признаками дегенерации флуоресцировали с шменсивностьв 0,89 + 0,03.

Такал образом, в результате исследований установлено, что деструктивным наруиенкям сопутствует изменение биохимических Показателей - содержание мембрансвязанного Са как в сторону увеличения его концентрации (ткань фолликула, гранулезные клетки), так и уменьшения (ооциты).

Влияние гормонов на содср.танке г.-омбрансвязанного Са в клетках гранулезы из йолдякулов различного диаметра. Результаты измерений содержания мембрансвязанного Са в различные временные промежутки в гранулезных клетках из фолликулов диаметром 9 2-5 мм представлены в таблице 2.

Данные таблицы свидетельствуют, что увеличение' содержания мембрансвязанного Са происходит при культивировании клеток гранулезы в отсутствие гормонов. Этот показатель растет по мере возрастания времени культивирования. При внесении в культураль-ную среду различных концентраций пролактина (от 12 до 50 нг/мл) в клетках отмечалось понижение содержания мембрансвязанного Са.

Культивирование клеток гранулезы в течение 18 часов в среде с пролактином в концентрация 50 нг/мл (Ц группа опыта) привело к достоверному снижению-'их интенсивности флуоресценции о 17,7 + 0,8 до 14,6 + 0,2 мЗ (Р<0,05). В остальных группах, где гранулезу культивировали 18 часов в присутствии пролактина 25 нг/мл и 12 нг/мл, показатели были достоверно ниже контроля и составляли 11,9 + 0,7 (Р<0,01) и 12,3 + 1,9 (Р<0,05) соответственно.

Из результатов экспериментов следует, что добавление про-лактина в различных концентрациях обеспечивает через 18 часов культивирования снижение интенсивности флуоресценции клетками гранулезы из фолликулов. диаметром 2-6 ш.

Таблица 2. Интенсивность флуоресценции момбрансвязанного Са в клетках гранулезы фолликулов диаметром 2-6 мм после воздействия пролактина

Среда

культивирования

Пшено тич. индекс {%)

(Г

Интенсивность флуоресценции мембран-связанного Са (мВ/клетку)

Время культивирования (час)_

~~ 2 4 18

I. ТС-1ЭЭ + 5% сыворотки (Контроль) П. К+ пролактин (20 нг/ыл) 10-15 И!, К+ пролактин (25 нг/мл) 10-15 17. К+ пролактин (1% нг/мл) 10-15

10-15 11,2+1,0 14,7+0,4 14,3+1,2 17,7+0,0 (И=4) (п=3) (п=3) (Е=3)

18,2+1,7 15,7+1,5 14,6+0,2

' (п=3) (П=3) (П=3)

16,1+0,7 14,5+1,4 II,9+0,7х*

(п=3) (п*0) (п^З)

13,0+0,4х 8,9+0,8Х 12,3+1,9х

(п=3) (п~3) (п=3)

Сходные результаты получены при культивировании клеток гранулезы из фолликулов диаметром'2-6 ш в средах, содержащих 4СГ, оЬтрадиол и пролактин (табл.3). Концентрация ФСГ и эстра-диола в опытных группах была постоянной, а концентрация пролактина различной во всех группах экспериментов (от 6 нг/ыл до 50 нг/ыл),

■Культивирование гранулезы в присутствии ФСГ и зстрадиола не оказывало-влияния на интенсивность флуоресценции.

Добавление пролакиша (50 нг/мл) вызывало в клетках гранулезы снижение интенсивности флуоресценции, которое было статистически достоверно (Р<0,05). При культивировании гранулезы о пролактином в концентрации от 6 нг/мл до 25 нг/мл отмечается снижение содержания мембрансвязанного Са. Эффект носил дозоза-р^симый характер: использование минимальной концентрации про-

лактина вызывало снижение интенсивности флуоресценция гранулезных клеток до 3,5 + 0,2.

Таким образом, совместное применение пролактина с ФСГ и эстрадиолом в системе культуры клеток гранулозы вызывает в них падение флуоресценции, по своим шнсазатеяям значительно превышающее таковое при использовании одного пролактина.

Анализируя данныо экспериментов по получении эмбрионов из ооцитов, созревших в система культуры меток гранулезы и комплекса гормональных добавок, с учетом динамики с-одорхаяпя кембран-.связанного Са в гранулезных клетках, ысяшо предположить, что низкое содержание Са в грану лозе свидетельствует об усилении функциональной активности, в результате чего-возможно создание системы дозревания, адекватно огражювдй условия мейотичоского созревания, что создает возможность приобретения ооцитаг.га компетенции-к дальнейшему оплодотаорекиэ а развитию в эмбрионы.

Таблица 3. Эффект различных систем культивирования на интенсивность флуоресценции глембраксвязанного Са в клетках гранулезы из фолликулов диаметром.2-6 ш

Система культивирования

Пиккогич. индекс {%)

О

Интенсивность связанного Са

мембран-

Зрекя культивированля (чао)

18

I. \ЮГ+ эстрадкол (Контроль) 10-15 П. К+ пролактин (50 нг/мл) 10-15 Ш. К+ пролактин (25 нг/мл) 10-15 1?. К+ пролактин (12 нг/мл) 10-15 7. К+ пролактин ■ (О нг/мл) 10-15

10,8+0,6 10,5+0,6 7,5+0,4 10,6+0,6 (п=3) (п=3) (я^З) (п=3) , 9,6+0,5 7,2+0,4 7,8+0,6х (п=3) . (я=3). (п^З) 7,4+0,4х 6,6+0,3 7,5+0,9 (п==3) (п=3) (u=3) 5,7+0,5ХХ4,2+0,2хх5,8+0,6х* (п=3) (д^З) (ix"^3> .3,5+0,§2,8+0,§ХХ4,3+0, (п=5) (п=3) (п=3)

В таблице 4 представлены данные о влиянии различных концентраций пролактина на содержание мембрансвязаяного Са в клетках грану лазы из фолликулов диаметром Ю ми и более.

Введение, в среду пролактина в концентрации 50 иг/мл через 18 часов культивирования обусловливает достоверное повышение содержания мемдраксвязаяного Са в клетках гранулезы из фолтку- • лов диаметром 10 ш и более с 30,0 + 4,2 до 47,0 + 3,7 мВ (Р<0,05). После добавления 25 нг/мл пролактина через 2 часа экспозиции содеряание мембраневязанного Са в клетках гранулезы Ш группы бы-г • ло больше, чем в контроле 38,0 + 4,6, но меньше, чем во второй группе (50 нг/мл). После культивирования в течение 18 часов показатель интенсивности флуоресценции Са (1Д группа) возрос, но не имел достоверного различия с контролем. .

Таблица 4. Влияние пролактина на интенсивность флуоресценции мембраксвязанного Са в клетках гранулезы фолликулов диаметром 10 мм .и более

Среда Пикнотич. Интенсивность Флуоресценции

культивиро- индекс мембраксвязанного Са ГмЗ/клетку)

вания {%) ——---

Бремя культивирования (час)

0 2 4 18

I. ТС-199 + 20-40 17,8+1,2 (п=3) 38,0+4,6 ЬМ) 31,0+2,1 (п=3) 30,0+4,2 (п=3)

Ь% сыворотки

(Контроль)

П. К+ пролактин 48,0+2,1 37,0+1,4 47,0+3,7х

(50 нг/мл) 20-40 (п=4) (п=3) (п=3)

Ш. К + пролактин 39,5+3»б 35,0+3,9 43,0+4,4

(25 нг/мл) 20-40 (и=4) (п^З)

IУ., К+ пролактин 35,0+2,5 32,0+2,1 40,0+9,2

(12 нг/мл) 20-40 (А) (п=3) (п==3)

Добавление пролактина (12 нг/мл) в среду культивирования гранулезных клеток вызыве о снижение интенсивности флуоресценции в опытной группе по сравнению о контролем. Через 18 часов 1/кспо-

нирования в клетках гранулезы содержание мембрансвязанного Са практически не отличалось от такового после 2 часов культивирования и было ниже, чем во П и Ш группах.

Такта,1 образом, в результате экспериментов установлено, что добавление пролактпна в различных концентрациях (от 12 нг/мл до: 50 нг/мл) в среду культивирования вызывало снижение кнтенсивноо-гл флуоресценции мембрансвязанного Са в клетках гранулезы из фолликулов диаметром 10 ш и более.

Яри культивировании клеток гранулезы из. фолликулов диаметром 10 ил установлено, что в условиях применения различных гор-коков интенсивность флуоресценции мембрансвязанного Са неоднозначна (табл.5).

Таблица £. Интенсивность флуоресценции мембрансвязанного Са в клетках гранулезы из фолликулов диаметром 10 мм и более, культивированных с различными гормонами

Среда

культивирования

Пикнотич. индоко

{%)

0

Интенсивность йлуорзспеншга , мембрансвязанного Са Тл.З/клзтку)

Время культивирования (час)

18

I. ФСГ+ эотрадиол (Контроль) 20-40 П. К+ пролактин (50 нг/мл) 20-40 И. К+ пролактин (25 нг/мл) 20-40 17. К + пролактин (12 иг/мл) 20-40

18,8+0,9 (в=4)

27,8+2,6

(п=3) 28,7+4,2 (п=3)

43,7+3,9 (й=3) 44,0+4,2

43,0+1,2

(п=3) 44,7+1,Iх

(п=5)

30,3+3,6 43,5+2,6 42,7+1,Iх

(п=3) (п=3) (п=3)

29,9+3,7 45,0+1,9 44,0+1,2Х

(п=3) (п=3) (п=3)

В контроле среда содерзкала 4СГ и эстрадиол, которые в процессе культивирования вызывали увеличение содержания мембрансвязанного Са в клетках гранулезы.

В опытных группах; помимо, пролактина в различных концентрациях, в среде культивирования присутствовал ФСГ и аотрадиол.

Интенсивность флуоресценции клеток гранулозы после 2 часов культивирования с пролакташом (12 нг/ил) была равна 29,3 + 3,7 (17 группа). Присутствие в среде культивирования пролактина в концентрации' 25 лг/ил й 50 иг/мл не влияло насодоркание ыембран-связанного Са в гранулезных клетках. Через 2 часа экспозиции интенсивность флуоресценции момбрансвязанного Са в гранулезных клетках этих групп составила соответственно 30,3 + 3,6 ц 28,7 + + 4,2 мЗ. Увеличение сроков культивирования оказало значительное влияние на рост ннтонсквноста флуоресценция в клетках гра-нулезы. Разница меаду. показателями содержания Са при ¡культивировании гранулезных клеток в течение 2 п 18 часов была достоверной во всех опытных группах (Р<0,05).

Установлено, что добавление пролактина в различных концентрациях не вызывало 'изменение, интенсивности флуоресценции ыембран-свкзанного Са в клетках грапулезц из фоллицулов диаметром 10 мм и более. С увеличением времени культивирования гормоны (¡¡ЮГ, эстрадиол и пролактин) вызывают в метках гранулеэы возрастание интенсивности флуоресценция в контрольной и опытных группах.

В глотках гранулезы из фолликулов диаметром 10 ш и более содержание мембрансвязашюго Са было значительно выше, чем в грану лез е из фолликулов диаметром 2-6 -ш. Процент созревания ооцитов и количество эмбрионов при культивировании на гранулезе из фолликулов диаметром 10 км и более, напротив, был ниже,- чем на гранулезе из фолликулов диаметром 2-6 ш. Одной из'причин этого моает быть снижение концентрата прогестерона в фолликулярной жидкости больших-фолликулов при увеличении концентрации пролактина ( Нап^л ^ «е., 1988). •

Интенсивность фяуореоцешуш ненбрансзязанного Са в оо!тстах и ткани фолликулов после воздействия пролактина. При культивировании ткани из фолликулов различного диаметра в среде "0-199 в присутствии ЮЙ'фетальной снворотч■ вами но выявлено значительных различий в содержании ыембрансвязанного Са.

В выборе концентрации пролактина для культивирования фолликулярных клеток глы исходили из того, что в период преовулятор-ного пика его содержание в фолликулярной жидкости составляло около 50 нг/мл (табл. 6).

Таблица 6. Влияние бычьего пролактина на интенсивность' флуоресценции момбрансвязанного Са в ткани фолликулов коров диаметром 10 ш и более

(¿орфолоилеская Интоисизность йлу.оросцснции кембрансвязанного характеристика * 0а /т

ткани -V». --

Время культивирования (час)

О . 24 ■

контроль опыт контроль опыт

Нормальная 0,95+0,01 0,95+0,01 1,00+0,01 0,73+0,02х

TKalib (п=2Э) (п=29) (п=П) (п=17) ■

1,08+0,04 1,00+0,04 1,07+0,07 0,94+0,02х

ноя т^а (д~22) . (п-} -(п=-а)

При добавлении пролактина в ткани иятактных фолликулов через 24 часа культивирования интенсивность флуоресценции по сравнению с контроле;.« была достоверно ниже (0,73 + 0,02 против' 1,00 + 0,01; Р<0,05). 3 тканях фолликулов о признаками дегенерации после воздействия пролакпша в течение 24 часов снизалось содержание мембрансвязанного Са, однако в меньшей степени, чем в ткани иятактных фолликулов (0,34 + 0,02 против 1,07 + 0,07; Р<0,05).

Такал образом, добавление пролактина способствует сшиешто содер:шния глембрансвязашого Са в ткани фолликулов, и по-видимому, способствует увеличению количества ооцитов, созревших на культуре ткани. Одной из возможных гипотез механизма влияния пролактина на созревание ооцитов является шгибирование пролак-тином синтеза аядрогеноз клетками-теки,, хсоторые в свою очередь ингибируют решшдаацшэ нейоэа в ооцктах {Magoffin- , 1982; г.;« с 1981).

В литературе имеются'давние.о том, что иультивированаа ооцитов в присутствии пролактина приводит к увеличению количества созревших яйцеклеток и снижении количества догенерированных ооцитов. Эффект пролактина носил дозозависимнй.и положительный характер при концентрации 50 кг/мл (Лебедева, 1994).

В наших исследованиях установлено, что культивирование ооцитов в среде ТС-199 с 10$ фетальйой сыворотки без добавления пролактина приводит к увеличению интенсивности флуоресценции мембрансвязанного Са (табл. 7). Через 24 часа культивирования этот показатель был равен 1,60 + 0,07.

Добавление в среду культивирования пролактина в концентрации 50 нг/мл снижает в ооцитах содержание мембрансвязанного Са через 24 часа культивирования до 1,30 + 0,07 (Р<0,05),

Таблица 7. Интенсивность руоресценцш мембрансвязанного Са в ооцитах коров при воздействии пролактина

Время Интенсивность флуоресценции мембрансвязанного

культивирования са (В) в ооцитах коров, прокультивированных

(час)

без пролактина с пролактином

0 1,08+0,05 1,08+0,05

(п^ЗЭ) . . (п=3"5)

1 1,17 + 0,07 1,09 + 0,05

(п~20) (п~2В)

■2,5 1,33 + 0,08. 1,01 + 0,06

(п~15) (п=23)

24 1,60 + 0,07 1,30 + 0,07х

(п=38) <п=35)

Таким образом, присутствие.в среде культивирования пролактина вызывает в ооцитах снижение интенсивности флуоресценции мембрансвязанного Са.

Содержание мембрансвязанного | Са в ооцитах крупного рогатого скота та различных стадг;ях ыейоза. Анализ данных литературы свидетельствует о связи мевду количеством внутриклеточного Са и прохождением стадий мейоза в ооцитах (Р^г,;* 1985). Нами исследована динамика содержания мембрансвязанного Са в ооцитах коров при их мейоткческом созревании (табл. 8).

При культивировании ооцитов в среде ТС-199 с 10$ фетальной сыворотки без гормонов интенсивность флуоресценции мембрансвязанного Са на различных стадиях мейоза различалась по своим

показателям. Так на стадии диплотены интенсивность флуоресценции была равна соответственно 1,21 + 0,08, по мере продвижения ооци-та по стадиям мейоза она увеличивалась до 1,67 + 0,09 на стадия талофазы и 1,47 + 0,10 на стадии метафазы П. Снижение содержания мембрансвязанного. Са на стадии дшшшеза можзт свидетельствовать о реинициации мойоза ¿n- v¿fcro .

Дегенерированные ооциты на стадии диплотены имели показатели интенсивности 0,В9 + 0,03", что могло быть следствием деструктивных изменений клеточных мембран.'

По нашим даннил дозревание яйцеклеток ^ v¿tra сопровоада-ется повышением уровня мембрансвязанного Са на стадии метафазы П по сравнению с метафазой I (1,47 +.0,10 против 1,26 + 0,11).

Таблица 8. Интенсивность флуоресценции мембрансвязанного Са в ооцитах на различных стадиях мейоза

Стадии мейоза . Количество ооцитов Интенсивность Зшуоресценции мембрансвязанного Са (В)

Дидлотена (дегенер.) 12 0,89 + 0,03ххх

Диплотена 14 1,21 + 0,08

Диаюшез 10 1,03 + 0,20

Метафаза I Телофаза 15 16 1,26 + 0,11 1,67 + О.ОЭ*** 1,47 + 0,10х

Метафаза П 23

Таким образом,;динамика содержания мембрансвязанного Са в ооцитах коров при их мейотическом созревании имеет тенденцию к возрастанию.

Морфофункциональная оценка качества зигот и эмбрионов коров, полученных vibro , AfCya.2o.Kc. el (1986) было показано, что во время оплодотворения яйцеклеток хомячка наблюдаются осцилляции цитозольного Са. В нашем исследовании были проведены измерения интенсивности флуоресценции мембрансвязанного Са, НАДЯ и ФАД в ооцитах коров после их оплодотворешш ^ v.'/ro(Tабл 9).

Показано, что интенсивность флуоресценции мембрансвязанного Са в созревших ооцитах составила 1,47 + 0,10, в зиготах иктек-

сивность флуоресценции снижалась до 1,28 + 0,08. Содержание мембрансвязанного Са в яйцеклетках с каряологическими нарушениями находилось на уровне 1,26 + 0,05, .

Интенсивность флуоресценции НАДН и ФАЛ в ооцитах на стадии мегафазы П была ниже, чем в клетках с прокуКлаусами и составила соответственно: НАДН - 1,20 + 0,12 И 1,38 + 0,09; ФАД - 0,44 + + 0,10 к 0,66 + 0,03.

Таким образом, после оплодотворения ооцитов в них уменьшается интенсивность флуоресценции мембрансвязанного Са и отношение НАДН/ФАД, что может свидетельствовать об активации метаболизма в зиготе.

Таблица 9. Интенсивность флуоресценции созревших и оплодотворенных £и \zilro- ооцитов

Клетки на Число 'Интенсивность флуоресценции (усл.ед.)

стадии с„\ - ■- ■-■ ■—.....-....... — ................. -

.Са НАШ ОАД НЛДН/ФАД

(В) . (в) (в) .

Метафаза П 23 1,47+0,10 • 1,20+0,12 0,44+0,10 2,8+0,2

Пронуклеусы 25 1,26+0,08 .1,38+0,09 0,66+0,03х 2,04+0,07ХХ

Лронуилеусы 24 1,26+0,05 1,20+0,09 0,55+0,03 2,23+0, КХ

(дегенэр.)

Результаты измерений в эмбрионах интенсивности флуоресценции мембрансвязанного Са, показателей флуоресценции НАДН и ФАД представлены в таблице 10.

■ Анализ данных показывает, что в эмбрионах с увеличением числа бластомеров растет интенсивность флуоресценции мембрансвязан-кого Са. Так в 2-х клеточных зародышах интенсивность флуоресценции составила 1,78 + 0,14, в 4-х клеточных - 2,4 + 0,1, в 8-ми клеточных достигала 2,26 + 0,10.

В эмбрионах, морфологически оцененных как догене рпрованные, на стадии 2-х бластомеров показатель интенсивности равнялся 3,47 + 0,40 и.был достоверно выше, чем в интактных эмбрионах на этой стадии развития.

Измерения интенсивности флуоресценции НАДН- и ФАД, проведен-нве на эмбрионах разной степени развития, показали тенденцию к

ее возрастанию. По мере роста в '¿морионах числа бластомеров увеличиваются, показатели как НАДН, так а ОДЦ. Интенсивность флуоресценции НАДН в 2-х клеточных эмбрионах была равна 1,18, в 4-х клеточных - 1,28, в 8-ш клеточных - 1,45. Флуоресценция окис-' ленной формы ФАД также увеличивалась от двухклаточных до восьми-2иеточных эмбрионов и равнялась соответственно 0,52, 0,65 и 0,66,

В дегенерированных 2-х клеточных эмбрионах интенсивность флуоресценщш НАДН и ФАД была выше, чем в интактных 2-х клеточных (НАДН - 1,48, ЭД - 0,88).'

Таблица 10. Интенсивность флуоресценции эмбрионов коров, полученных при оплодотворении «г ч&ГО

Стадия Количество Интенсивность флуоресценции (усл.ед.)

дробления эморлонов ———-■—•--—--■——-—

эмбрионов СШ Са НАДН . ФАД НАДН/ФАД _(В) (В) (В) _

2-х клет. 21 1,78+0,14 1,18^0,05 0,52+0,03 2,26+0,05 (нормальные)

2-х клет. 10 3,47+0,40ХХ|,48+0,25 0,88+0,0^1,70+0,0^"

(дегенерир.) •

4-х клет. 17 2,4+0,РХ 1,28+0,07 0,65+0,04* ^бб+о.о!** (нормальные)

0-ми клет. 4 2,26+0,16* 1,45+0,15 0,68+0,03^ 2,10+0,06 (нормальные)

Таким образом, интенсивность флуоресценции мембрансвязанного Са, НАДН и ФАД в эмбрионах увеличивается о ростом, числа бластомеров. В деганерированных эмбрионах происходит гидераккумуляция мембрансвязанного Са, а также увеличение показателей НАДН и ФАД.

ВЫВОДЫ

I. Содержание мембрансвязанного Са в клетках гранулезы, выделенной из фолликулов диаметром 2-6 мм, ниже чем его содержание в клетках гранулезы из фолликулов диаметром 10 мм и более (11,2 + + 1,0 против 17,8 + 0,4 мВ).

2. Эффект пролактина в концентрации 50 нг/мл на ткани фолликулов и клетки гранулезы из фолликулов диаметром 10 ш и более неодназначен. Интенсивность флуоресценции мембрансвязанного Са в клетках гранулезы возрастает с 30,0 + 4,2 до 47,0 + 3,7, а в ткали фолликулов снижается с 0,95 + 0,01 до 0,73 + 0,02.

3. Интенсивность флуоресценции мембрансвязанного Са в ооцитах коров зависит от стадии мейоза. Наименьший ее показатель выявлен в даакинезе - 1,03 + 0,20, наибольший - на стадии телофазы 1,67 +

+ 0,09.

4. При оплодотворении ооцитов содержание мембрансвязанного Са уменьшается с 1,47 + 0,10 В (интенсивность флуоресценции на стадии метафазы Ш до 1,28 + 0,08 (показатель интенсивности флуоресценции в оплодотворенных яйцеклетках).

5. В эмбрионах по мере увеличения числа йластомеров количество восстановленного НАДЯ возрастает. Б 2-х клеточных эмбрионах этот показатель был равен 1,16, в 4-х клеточных 1,28 и в 8-ш клеточных 1,43 В,

6. С увеличением числа бластомеров в эмбрионах отмечается повышение интенсивности флуоресценции мембрансвязанного Са.' Так в 2-х клеточных эмбрионах она составляет 1,78 + 0,14 В, в 4-х клеточных 2,4 + 0,1 В, в 8чя1 клеточных .2,26 + 0,15 В. В 2-х клеточных дегенерированяых эмбрионах интенсивность флуоресценции возрастает до 3,47 + 0,40 против 1,78 + 0,14 В в интактных ймбрионах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Использовать в технологии получения эмбрионов разработанный критерий комплексной оценки качества структурных элементов фолликула, ооцитов, эмбрионов.

2. Материалы диссертации могут быть использованы в уч'бных курсах по генетике, физиологии ж биотехнологии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

I. Кузьмина Т.Н., Лебедева И.Ю., Денисенко В.Ю. Динамика содержания мембрансвязанного кальция в овариальных клетках коров при воздействии бычьего пролактина // Мат. межд. симпозиума

24-26 мал, Огл.чт-ПоторЙурГ-Пупш'Ц. - IS94. - о.41-43.

2. Дешювико Б.КЗ., куавйпга Т.П. ¿озмояша иахшкаш »его-иалышх взашодойствлй в процоссо фолшуулегеиеза // Г гл. ЕНШГГРК. - 1994. - Dun.140, - с.3-6.

3. Денаоеш» В,Ю. Содерзапка иег.}бваксв5зсшгого казысш э ова-ряальши клетках // Таз. докл. I йицй паута, кой®. колода учета я специалистов. - Клез, 1994. - с.27.