Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние партеногенетических активаторов на преобразования хроматина и цитоплазматические изменения в ооцитах коров и свиней

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федосков, Евгений Дмитриевич, Санкт-Петербург-Пушкин

' -■:>' 3 / Л

- / «X/

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

ФЕДОСКОВ ЕВГЕНИИ ДМИТРИЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКИХ АКТИВАТОРОВ НА ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ХРОМАТИНА И ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ООЦИТАХ КОРОВ И СВИНЕЙ

Специальность 03.00.15 - Генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

Доктор биологических наук, проф. Т.И. Кузьмина

Доктор биологических наук Б.Е. Свиридов

Санкт - Петербург - Пушкин 1999

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................... 5

ВВЕДЕНИЕ................................................ 6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................... 9

1.1. Вид и пути партеногенетического развития млекопитающих. ... 9

1.2. Кариология раннего развития млекопитающих...............18

1.3. Причины гибели партеногенетических зародышей млекопитающих................................................ 23

1.4. Механизм активации партеногенетического развития......... 29

1.5. Участие кальция в раннем развитии млекопитающих........ 33

1.5.1. Роль кальция при оплодотворении ооцитов................ 33

1.5.2. Роль кальция при партеногенетической активации ооцитов. . 35

1.6. Митохондриальная активность в ооцитах млекопитающих. ... 37

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ............ . 43

2.1. Материал исследований................................. 43

2.2. Методы исследований.................................. 43

2.2.1. Выделение ооцит-кумулюсных комплексов и их оценка. ... 43

2.2.2. Культивирование ооцит-кумулюсных комплексов коров и свиней........................................................ 43

2.2.3. Способы активации ооцитов крупного рогатого скота и свиней........................................................ 44

2.2.3.1. Активация ооцитов крупного рогатого скота и свиней этиловым

спиртом....................................................... 44

2.2.3.1. Активация ооцитов коров электрическим током......... 45

2.2.4. Капацитация сперматозоидов и оплодотворение ооцитов

in vitro......................................................... 46

2.2.5. Получение монослоя клеток гранулезы и кумулюса крупного рогатого скота и кондиционированных сред для культивирования ооцитов свиней....................................................... 46

2.2.6. Измерение уровня кальция внутриклеточных депо в ооцитах и зиготах крупного рогатого скота................................. 47

2.2.7. Измерение уровня интенсивности флуоресценции родамина 123 в митохондриях яйцеклеток коров, активированных 8,0% этанолом..... 48

2.2.8. Цитогенетические исследования ооцитов, зигот и эмбрионов крупного рогатого скота и свиней................................ 50

2.2.9. Микроскопирование, микрофотосъемка и статистическая обработка полученных данных.................1.................. 51

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ........................ 52

3.1. Модификация методов активации ооцитов крупного рогатого скота.......................................................... 52

3.1.1 спиртом.

3.1.2

током.

Активация ооцитов крупного рогатого скота этиловым

..................................................... 52

Активация ооцитов крупного рогатого скота электрическим ..................................................... 64

2+

3.1.2.1. Влияние ионов Са на активацию ооцитов крупного рогатого скота электрическим током........................................ 64

3.1.2.2. Влияние числа электрических импульсов на активацию ооцитов крупного рогатого скота.......................................... 66

3.1.3. Влияние этилового спирта и электрического тока на ооциты коров.......................................................... 71

3.2. Партеногенетическое развитие ооцитов свиней............. 76

3.2.1. Активация ооцитов свиней этиловым спиртом............ 76

3.2.2. Влияние кондиционированных сред, полученных с монослоев клеток гранулезы или кумулюса коров, на созревание и партеногенетическое развитие ооцитов свиней......................................... 84

3.3. Динамика накопления кальция во внутриклеточных депо ооцитов

коров после их активации или осеменения in vitro......................................90

3.4. Интенсивность флуоресценции родамина 123 в митохондриях ооцитов крупного рогатого скота после их стимуляции к партеногенети-

ческому развитию и в интактных ооцитах....................................................99

ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................104

ВЫВОДЫ..............................................................................................117

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ....................................................119

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................120

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИФ - интенсивность флуоресценции

ИФр123 - Интенсивность флуоресценции родамина 123

КГ - клетки гранулезы

ЛГ - лютеинизирующий гормон

ОКК - ооцит - кумулюсные комплексы

PBS - фосфатно - солевой буфер

р123 - родамин 123

СА - среда активации

Са2+пх - кальций внутриклеточных хранилищ ТС-199 - среда для культивирования ФСГ - фолликуло-стимулирующий гормон ФСМ - функциональное состояние митохондрий

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Современные методы биотехнологии, позволяющие получать эмбрионы сельскохозяйственных животных для трансплантации, а также для целей клеточной и генетической инженерии из in vitro созревших ооцитов, были разработаны благодаря научным достижениям в области исследования механизмов регуляции мейоза и раннего развития млекопитающих. Новые достижения в технологиях репродукции будут продолжаться или даже ускоряться, основываясь на дальнейшем углублении фундаментальных исследований в области биологии развития, биохимической эмбриогенетики, необходимость в расширении которых не перестает быть актуальной.

Несомненно, что впечатляющие эксперименты по клонированию сельскохозяйственных животных, об успешном завершении которых сообщили в последние два года исследователи (Wilmut, 1997), вызвали новый интерес к разработке отдельных технологических приемов клонирования, эффективность которых в настоящее время остается на уровне 0,3 %. Известно также, что одним из методов создания генетически идентичных особей является их партеногенетическое развитие. Существенным моментом обеих технологий является активация яйцеклетки к дальнейшему развитию. В связи с этим выявление эффективного стимулятора активации ооцита к партеногенезу может оказаться полезным и для биотехнологии животноводства. Кроме того партеногенетические зародыши млекопитающих служат удобной биологической моделью для решения ряда актуальных задач экспериментальной эмбриологии и генетики развития. В 70-е годы нашего века были разработаны надежные методы искусственной активации яйцеклеток мышей (Tarkowski et al., 1971) и кроликов. Путем активации яйцеклеток коров холодовым шоком были получены зародыши коров (Эрнст и др., 1983, Кузнецов, 1985). Обнаружены случаи спонтанного партеногенетического развития ооцитов коров при их

экстракорпоральном созревании (Кузьмина, 1990). Несмотря на то, что в

|

отдельных случаях, полученные зародыши достигали стадии морулы или даже бластоцисты их жизнеспособность была низкой. Понятно, что исследования начальных стадий развития партеногенетических зародышей позволит подойти к пониманию причин их гибели и выбрать оптимальные режимы воздействия активирующих агентов.

Цели и задачи исследований. Целью исследования явилось изучение морфо - функциональных особенностей ооцитов коров и свиней, активированных к партеногенетическому развитию.

Для выполнения поставленной цели решались следующие задачи:

1 .Исследовать способность экстракорпорально созревших ооцитов коров и свиней вступать в партеногенетическое развитие при воздействии электрического тока или этанола;

2. Изучить факторы, влияющие на эффективность активации яйцеклеток коров и свиней электрическим током или этанолом;

3. Изучить динамику преобразования хроматина в активированных и интактных ооцитах, зиготах коров и свиней;

4. Исследовать динамику содержания ионов кальция во внутриклеточных депо интактных и активированных ооцитов коров;

5. Оценить функциональное состояние митохондрий в ооцитах коров до и после воздействия этанолом;

6. Выявить влияние кондиционированных сред, полученных с монослоев клеток гранулезы из фолликулов коров, на способность ооцитов свиней вступать в партеногенетическое развитие.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в сравнительном аспекте изучены некоторые функциональные особенности интактных и активированных ооцитов коров. Показано, что интенсивность флуоресценции родамина 123 в митохондриях активированных яйцеклеток коров изменялась параллельно с преобразованиями хроматина. Изучена

динамика содержания ионов кальция во внутриклеточных хранилищах ооцитов коров, созревших in vitro, после контакта со спермой и в яйцеклетках, активированных этанолом. Сравнительный анализ содержания кальция во внутриклеточных депо в ооцитах после их осеменения или активации к партеногенезу показал достоверные различия в динамике его накопления в первые 1, 2, 6 часов культивирования, что, вероятно, объясняется различными механизмами воздействия этанола и сперматозоидов на ооциты. Впервые показано, что кондиционированные среды, полученные с монослоев гетерологичных клеток кумулюса или гранулезы коров, индуцируют к партеногенетическому развитию ооциты свиней при созревании in vitro.

Определены режимы обработки ооцитов коров электрическим током, позволяющие получать партеногенетические зародыши. Предложен метод получения партеногенетических зародышей свиней на основе использования кондиционированных сред монослоев клеток кумулюса или гранулезы коров.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вид и пути партеногенетического развития млекопитающих

Термин «партеногенез» был впервые использован Ричардом Оуэном в

1949 году для обозначения «размножения без участия самца».

!

В ходе исследования проблемы, принятие термина уточнялось и расширялось. Так считалось, что партеногенез - это получение зародыша из женской гаметы с последующим развитием во взрослый организм (Веа1у Я.А., 1957).

В современной литературе партеногенез рассматривают как один из видов аномального развития (Ага1а е! а1., 1996), включающего активацию яйца и развитие особи только из яйцеклеток, т.е. без какого - либо участия мужской гаметы.

При партеногенезе развитие новой особи происходит только при участии женского набора хромосом. Поэтому пол развивающегося организма зависит от того, какими половыми хромосомами обладает женская особь. У всех млекопитающих пол определяется наличием X и У хромосом и женская особь обозначается XX, а мужская соответственно ХУ. Поэтому партеногены млекопитающих при диплоидном партеногенезе должны иметь набор хромосом «XX», а при гаплоидном - «X». Партеногены млекопитающих -всегда самки, это явление принято называть - «телитокия».

У млекопитающих описан как спонтанный так и искусственный партеногенез. Так по Дыбану, у мышей спонтанная гаплоидия возникает в 0,1-0.32% у свиней этот показатель выше и находится на уровне 11% (УоэЫёаМ., ег а1., 1990).

Первые попытки изучить возможности искусственной активации ооцитов млекопитающих были сделаны в 30-е годы. Основной причиной, побудившей к подобного рода исследованиям, была необходимость выяснить природу активации яйцеклеток, а так же провести сравнительное изучение

тех процессов, которые возникают в развивающихся яйцеклетках, в одном случае побужденных к развитию проникновением спермиев, а в другом -действием физических и химических факторов. К этому периоду относится серия работ Пинкуса и соавторов (Pincus G., 1939а, 1939b, Pincus G., Shapiro H., 1940a, 1940b) по искусственной активации ооцитов кролика с использованием теплового, холодового и осмотического шока.

Имеются сообщения о рождении партеногенетического потомства у кроликов, но эти эксперименты не удалось воспроизвести другим исследователям с использованием тех же самых методик (Chang M.С., 1952, 1954; Thibault С., 1941).

В пятидесятые годы исследования искусственного партеногенеза происходило менее интенсивно. Появились единичные работы, в которых в качестве активирующего агента применяли воздействие повышенной температуры (Chang M.С., 1952; Braden A.W.H., 1954) и холодовой шок (Thibault С., 1941; Chang М.С., 1952, 1954). Яйцеклетки при этом активировались, но очень немногие развивались до стадии бластоцисты ( Beatty R.A., 1957).

В семидесятые годы возобновился интерес к искусственному партеногенезу млекопитающих. Начало этому перспективному направлению экспериментальной эмбриологии и генетики положили работы Тарковского ( Graham C.F., 1970; Tarkowski А.К., 1970; 1971).

Известно, что партеногенетическое развитие идет по 2-м основным направлениям: гаплоидному и диплоидному.

Имеется несколько наиболее часто встречающихся типов гаплоидии, которые возможно получить в условиях эксперимента:

Ооцит завершает второе деление созревания причем один гаплоидный набор формирует пронуклеус, а второй переходит в состав второго полярного тельца, т.е. элиминируется. Затем в гаплоидном пронуклеусе осуществляется редупликация ДНК, и ооцит делится на 2 бластомера,

каждый из которых имеет ядро с гаплоидным набором хромосом, причем гомологичные хромосомы генетически идентичны. Этот путь чаще всего имеет место при индуцировании гаплоидного партеногенеза.

Мозаичные гаплоиды возникают когда ооцит, завершив первое деление созревание и минуя второе мейотическое деление, сразу же образует 2 гаплоидные клетки. Этот тип носит название "немедленного дробления" (Branden, Austin, 1954). Причем из-за неправильной ориентации веретена деления ооцит претерпевает не тангенциальное а поперечное деление и вместо маленького полярного тельца образуются1 две одинаковые клетки, т. к. деление идет после кроссинговера, то такие зародыши называют "мозаичными гаплоидами" (Kaufman M.N., Saachs, 1976).

Третий путь имеет место при условиях, когда после метафазы второго деления созревания и расхождения хромосом цитотомия не осуществляется, оба гаплоидных набора формируют два пронуклеуса. Дальнейшее развитие такого ооцита идет либо по гаплоидному, либо по диплоидному пути.

Диплоидные зародыши возникают когда после прохождения метафазы 2-го деления созревания расхождение хромосом не идет, оба гаплоидных пронуклеуса осуществляют синтез ДНК, а в митозе хромосомы объединяются в одну общую метафазную пластинку. После первого деления дробления образуется 2 диплоидных бластомера. Второй путь -ооцит не проходит второго деления созревания, и хромосомы формируют один большой диплоидный пронуклеус, после репродукции ДНК и дробления, образуются диплоидные бластомеры (Kaufman M.N., Saachs, 1976).

Приведенная выше классификация не учитывает все возможные варианты, происходящие при партеногенетической активации ооцитов млекопитающих.

Данная схема охватывает лишь случаи активации нормально созревших, овулировавших яйцеклеток млекопитающих, завершивших первое деление созревания, отделивших и не отделивших первое направительное тельце и находящихся на метафазе II (Tarkowski А.К., 1973; WitkowskaA., 1973a,b).

У мышей получены генетически однородные гаплоиды, мозаичные гаплоиды, гомо- и гетерозиготные партеногенетические диплоиды и это создает реальные предпосылки для исследования влияния не только гаплоидии, но и высоко гомозиготной диплоидии на эмбриональное развитие (Tarkowski, 1975).

Пути развития партеногенетических зародышей после индукции активации определяются свойствами активирующего агента. При оптимально подобранных условиях воздействия на ооциты мышей образуются однородные гаплоиды и небольшое число мозаичных гаплоидов. Такая картина наблюдалась после воздействия гиалуронидазы (Kaufman, 1973 а; 1974; 1976), среды, лишенной солей кальция и магния (Wittingham D.G., 1978, Kaufman M.N., 1981), этанола (Kaufman M.N., 1982; Cutbertson K.S.R., 1983).

Соотношение типов партеногенов в популяции активированных зародышей определяется в значительной мере постовуляторным возрастом яйцеклетки на момент воздействия активирующего агента (Kaufman M.N., 1983а).

Так, в случае активации зародышей мышей гиалуронидазой, через 6 - 7 часов после овуляции активировалось 60 - 70% яйцеклеток (Kaufman M.N., 1973а; Graham С.F., Deutsen Z.A., 1974). Практически все активированные яйцеклетки отделили второе направительное тельце и имели один пронуклеус, что свидетельствует о их гаплоидности. Этот тип, в принципе (морфологически) идентичен преобразованию материнских компонентов зиготы вскоре после активации и предопределен периферической

локализацией мейотического веретена и контрактильного кольца (Maro В., et al., 1984; 1986). При активации яйцеклеток гиалуронидазой через 13 часов после овуляции, количество активировавшихся было почти тоже, но большинство (60%) активировавшихся зародышей вступило в «незамедлительное дробление», что, по видимому, было следствием изменения структуры цитоскелета и миграцией мейотического веретена к центру яйцеклетки, вызванной постовуляторным старением. (Seöllösi D., 1973). Однако, при более интенсивном воздействии этих активирующих агентов возрастает количество мозаичных гаплоидов и обоих типов диплоидных партеногенов (Komar А.Р., 1973).

Таким образом, следует сделать вывод, что соотношение типов

партеногенов в популяции партеногенетических зародышей зависит от

i

природы и интенсивности активирующего воздействия, от пос