Оценка биологической полноценности ооцитов свиней на основе маркеров ядерно-цитоплазматического созревания

Мурза, Галина Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Оценка биологической полноценности ооцитов свиней на основе маркеров ядерно-цитоплазматического созревания
ВАК РФ 06.02.07, Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Оценка биологической полноценности ооцитов свиней на основе маркеров ядерно-цитоплазматического созревания"

па правах рукописи

084607047

Мурза Галина Валерьевна

ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПОЛНОЦЕННОСТИ ООЦИТОВ СВИНЕЙ НА ОСНОВЕ МАРКЕРОВ ЯДЕРНО-ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО СОЗРЕВАНИЯ

06.02.07 - Разведение, селекция и генетика с.х.животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - Пушкин 2010 г.

004607047

Работа выполнена в лаборатории биологии развития ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии

Научный руководитель:

Татьяна Ивановна Кузьмина

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Свиридов Борис Евгеньевич доктор биологических наук (ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН)

Никитин Анатолий Илларионович

доктор медицинских наук, профессор (Балтийский институт репродуктологии человека)

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Защита диссертации состоится «Jf» Ш&Ы_2010 года

в W часов на заседании диссертационного совета Д.006.013.01 по защите докторских диссертаций в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 196601, Санкт-Петербург - Пушкин, Московское шоссе 55-а, e-mail: spbvniigen@mail.ru, факс: 8(812) 465- 99- 89

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН

Автореферат разослан « "/J? » _2010 года.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор __ Г.Н.Серднж

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Последнее десятилетие ознаменовалось интенсификацией разработки и совершенствования инновационных клеточных репродуктивных биотехнологий в свиноводстве (Prather R.S, et al., 2003). Получения эмбрионов in vitro для трансплантации, трансгенез и клонирование, создание линий эмбриональных стволовых клеток для дальнейшей ксенотрансплантации органов - все эти технологии основываются на базовом методе созревания донорских ооцитов свиней in vitro (Miyoshi К., et.al., 2002, Boquest A.C., et al., 2002). Несмотря на несомненные успехи в этой области, оплодотворяемость ооцитов, развитие из них интактных, клонированных или трансгенных эмбрионов продолжают оставаться на низком уровне (Ikeda K,Takahashi Y., 2001 ;Соу P., et al., 2005; Won J.Y.,2009). Множество факторов детерминируют формирование зрелой яйцеклетки in vitro: возраст животного-донора, размер фолликула, морфология ооцит-кумулюсного комплекса, среда для созревания ооцитов и культивирования эмбрионов, качество сперматозоидов, температурный и газовый режимы (Marchai R., et al., 2001; Dubuc A., Sirard M.. A., 1995; Nagai T., 2001). Отбор ооцит-кумулюсных комплексов для культивирования - начальный этап клеточных репродуктивных технологий, определяющий дальнейший успех или неудачу экспериментов (Sirard М.А.,2007). Исходная популяция донорских ооцитов, используемых в экспериментах, гетерогенна. Разработка эффективных тестов оценки качества ооцит-кумулюсных комплексов -важная задача эмбриотехнологов. Рост ооцита и формирование зрелой яйцеклетки в организме - комплексный процесс преобразрвания хроматина и структурно-функциональных изменений ооплазмы и клеточных органелл. В связи с этим, особый интерес представляет сравнительный анализ статуса хроматина кумулюса и ооцитов, функционального состояния митохондрий, уровня содержания кальция в ооцитах, выделенных из фолликулов разного диаметра, и отобранных с помощью витального красителя бриллиантового кристаллического голубого (ВСВ - индикатора активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PDH).

Диссертационная работа выполнена в соответствии с программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 годы по теме: 06.01.03 «Исследовать молекулярно-генетические, биохимические, цитологические и эмбриологические процессы, лежащие в основе трансгенеза, создать генноинженерные конструкции и разработать способы, повышающие эффективность биоинженерных технологий получения животных с заданными свойствами» № гос. регистрации: 15070.7815014664.06.8.001.0.

Цели и задачи исследований. Цель настоящей работы - исследовать процесс формирования зрелой яйцеклетки свиньи in vitro на основе маркеров ядерно-цитоплазматического созревания и разработать

эффективный тест биологической полноценности ооцитов с целью раннего прогнозирования способности к развитию из них эмбрионов

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Провести мониторинг овариальных фолликулов свиней с учетом диаметра фолликула, степени васкуляризации, тургора, статуса хроматина соматических клеток фолликула (кумулюса и гранулезы), уровня содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов;

2. Оценить исходную популяцию донорских ооцитов свиней, выделенных из фолликулов разного диаметра на основе ВСВ-теста (маркер активности G6PDH) и содержания депонированного кальция;

3. Определить интенсивность флуоресценции родамина 123 (ИФР123) в ооцитах свиней с нормальным и дегенерированным хроматином на разных стадиях мейоза;

4. Оценить перспективы использования различных систем культивирования для получения зрелых яйцеклеток и доимплантационных эмбрионов свиней на основе следующих параметров:

- стадии мейоза ооцитов;

- степени экспансии клеток кумулюса;

- уровня пикнозов в клетках кумулюса;

- интенсивости флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos;

- оплодотворяемости ооцитов;

- развития доимплантационных эмбрионов.

Научная новизна. Впервые были получены следующие данные:

- дегенерация хроматина соматических клеток антральных фолликулов свиней сопровождается возрастанием уровня содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов;

- на основе ВСВ-теста выявлена гетерогенность популяции донорских ооцитов свиней. В фолликулах диаметром менее 3 мм содержится достоверно меньшее число ВСВ (+) ооцитов по сравнению с фолликулами d - 3-5 и более 5 мм (71% против 86%, соответственно);

- растущие ВСВ (-) и завершившие фазу роста ВСВ (+) ооциты отличаются по уровню содержания кальция во внутриклеточных депо;

- изменения в интенсивности флуоресценции родамина 123 в ооцитах связаны со статусом хроматина (стадией мейоза и дегенерацией);

- при использовании в среде созревания ВСВ(+) ооцитов свиней структурных элементов фолликула и фолликулярной жидкости снижается доля ооцитов с дегенерацией хроматина, возрастает интенсивность флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos; повышается число эмбрионов на завершающих стадиях доимплантационного развития.

Прослежена динамика флуоресценции родамина 123 в ооцитах на разных стадиях мейоза, отмечены достоверные различия в показателях интенсивности флуоресценции ооцитов с нормальным и дегенерированным хроматином. Показано что процесс формирования зрелой яйцеклетки сопровождается повышением интенсивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos в ооцитах, созревших в присутствии структурных элементов фолликулов. Деление ооцитов на «растущие» и «выросшие» с помощью индикатора активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы позволило выявить гипераккумуляцию ионов кальция во внутриклеточных депо ВСВ(+) ооцитов, что может свидетельствовать о снижении уровня метаболической активности перед реинициацией мейоза. Проанализирован характер ооцит-кумулюсных взаимодействий в процессе созревания ооцитов в различных системах культивирования. Активная экспансия клеток, снижение уровня пикнозов свидетельствует о возможности увеличение «продуктов» секреции клеток кумулюса (не затронутых деструктивными изменениями), детерминирующих формирование факторов, ответственных за приобретение ооцитами компетентности к завершению мейотического созревания, оплодотворению и развитию эмбрионов. Практическая ценность работы представлена разработкой системы дозревания ВСВ(+) ооцитов свиней из фолликулов диаметром 3-5 мм на основе использования структурных элементов фолликула и его жидкости, позволяющей повышать выход зрелых яйцеклеток и биологически полноценных эмбрионов свиней.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 2 - в журнале, входящем в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и одобрены на ежегодных аспирантских сессиях и отчетах ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии, на Международных конференциях: "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии", ВИЖ, Москва, 2008; «Пути интенсификации отрасли свиноводства в странах СНГ», Гродно, Беларусь, 26-27 августа 2009; 25-й ежегодной конференции Европейской Ассоциации по трансплантации эмбрионов, Польша, сентябрь 2009; "Научное обеспечение развития АПК в условиях реформирования", Санкт-Петербург-Пушкин, январь 2009.

Положения, выносимые на защиту:

Популяция ооцитов свиней из фолликулов диаметром 3-5 мм гетерогенна и состоит из ВСВ(+), завершивших фазу роста (86%) и ВСВ(-)ооцитов растущих (14%);

В ВСВ(+) ооцитах свиней уровень содержания кальция во внутриклеточных депо превышает таковой в ВСВ (-) ооцитах;

Деструктивные изменения хроматина в кумулюсных и гранулезных клетках из фолликулов свиней сопровождаются возрастанием уровня содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов;

Уровень интенсивности флуоресценции родамина 123 в ооцитах свиней изменяется в зависимости от статуса хроматина (стадии мейоза и дегенерации);

В ооцитах, созревших в присутствии структурных элементов фолликулов (стенок фолликулов - СФ) и фолликулярной жидкости (ФЖ), достоверно возрастает интенсивность флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos;

Использование для созревания ооцитов in vitro структурных элементов фолликулов (диаметр d = 3-5мм) в комплексе с гормонами и ФЖ (d фолликулов 3-5мм) позволяет получать 38% эмбрионов на стадиях поздней морулы, бластоцисты.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и результатов исследований, их обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной при написании диссертации литературы, включающего 230 источников, в том числе 216 на иностранном языке. Диссертация изложена на 121 странице, включает 10 таблиц, 27 рисунка (в том числе 17 фотографий).

2. Материал и методы исследований. Исследования выполнены согласно представленной структурно-логической схеме экспериментов (рис. 1). Материалом служили ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) из антральных фолликулов свиней породы Ландрас в возрасте 6-8 месяцев, убитых на мясокомбинате «Самсон» г. Санкт-Петербурга. Яичники без видимых признаков патологии, находящиеся на стадии фолликулярного роста или с развитым желтым телом доставляли в лабораторию в термосе при температуре 30-35°С в течение 1,5-2ч после овариоэктомии. Выделенные ОКК промывали трижды в среде ТС-199 ("Sigma", США), содержащей 5 мкг/мл гепарина и 50 мкг/мл гентамицина. В экспериментах использовали ооциты, выделенные из фолликулов d: <3 мм; 3-5 мм; 5-8 мм, окруженные не менее чем 5-6 слоями клеток кумулюса, с гомогенной по структуре ооплазмой и равномерной по ширине зоной пеллюцида. В системе экстракорпорального созревания использовали стенки фолликулов (СФ) и фолликулярную жидкость (ФЖ). ФЖ аспирировали из фолликулов d 3-5 мм, центрифугировали при 1900xg в течение 30 минут, фильтровали через фильтр d =1-1,2 мм и инактивировали при температуре 56 °С в течение 30 мин. Для проведения ВСВ теста ОКК подвергали воздействию ВСВ(В-5388, Sigma) в растворе Дюльбекко с добавлением 0,4 % бычьего сывороточного альбумина (BSA, А-7888) в концентрации 13 тМ и экспозиции 60 минут. После воздействия раствора ВСВ ОКК делили на две группы: ооциты с голубой окраской цитоплазмы ВСВ (+) и неокрашенные -ВСВ (-). Для определения содержания депонированного Са2+ ооциты предварительно очищали от кумулюсных клеток, инкубировали 5 мин. при

37 °С в модифицированной среде Дюльбекко, содержащей 36 мкг/мл пирувата Na и 1 мг/мл глюкозы, 40 мкМ хлортетрациклина в отсутствии СаС12. Нагруженные клетки отмывали от инкубационной среды, содержащей хлортетрациклин, переносили на кварцевое стекло с ячейками объемом 0,05мл. Интенсивность флуоресценции в ооцитах измеряли флуориметрической установкой, состоящей из люминесцентного микроскопа, снабженного ртутной лампой постоянного тока ДРШ - 250 - 3, необходимыми светофильтрами и фотометрической насадкой ФМЭЛ - 1А. Спектр возбуждения комплекса хлортетрациклин - Ca 2+ - мембрана находился в области 380 - 400 нм, максимум флуоресценции регистрировали в области 530 нм, интенсивность флуоресценции в условных единицах (усл.ед.). Длительность воздействия ультрафиолетового излучения на ооциты при проведении измерений не превышала 5 сек. ИФР123 в ооцитах определяли в соответствии с методом, разработанным в лаборатории биологии развития (Кузьмина Т.И. и др., 2005). Для определения интенсивности флуоресценции флуоресцентного зонда MitoTracker Orange CMTMRos (Sigma) в ооцитах, ОКК инкубировали в 500 нМ раствора CMTMRos при температуре 37 °С в течение 30 минут, отмывали от красителя в фосфатном буферном растворе, содержащем 3 % сыворотки или 0,3 % бычьего сывороточного альбумина. Ооциты очищали от кумулюса в 0,1 %-ном растворе трипсина (5-10 минут), фиксировали в формальдегиде и отмывали фосфатным буферным раствором. Просмотр проводили на флуоресцентном микроскопе - длины волн возбуждения и эмиссии составляли - 540 нм, 570 нм. Интенсивность измеряли с помощью фотометра (NIKON Photometry system Р 100).

ОКК культивировали в NCSU 23 (North Carolina State University-23) с добавлением 10% ФЖ (d = 3-5 мм), гормонов (ЮМ.Е.хорионического гонадотропина человека +10 М.Е. хорионического гонадотропина лошади) и СФ в течение 22 часов, затем ооциты и СФ промывали, проводили смену ФЖ и культивировали в течение следующих 20-22 часов, без гормонов. После 42-44 часов культивирования ОКК обрабатывали 0,1% гиалурони-дазой в NCSU 23, промывали, помещали в среду следующего состава: 1мМ кофеина с 0,1% BSA. Для оплодотворения ооциты переносили в капли среды (50 мкл) под вазелиновым маслом и помещали на 30 минут в СО2 инкубатор. Семя хряков (нативное) помещали в среду Дюльбекко, дополненную 0,1% BS А, пенициллином и стрептомицином в концентрации 100 ед./мл и 50 мкг/мл (рН=7,2), центрифугировали при 1900 об/мин 4 мин., процедуру повторяли трижды. Концентрация спермы для оплодотворения составляла 5х105 сперматозоидов на мл. Среду для оплодотворения эквилибрировали с кофеином и BS А в С02 инкубаторе в течение 18-24 часов. После оплодотворения клетки очищали от кумулюса. После инкубации ооцитов со сперматозоидами в течение 8 часов зиготы отмывали трижды в среде для культивирования эмбрионов (NCSU23) и пересаживали в четырехлуночные плата в среду NCSU23 , инкубировали при 39 0 С в атмосфере 5% С02. Все реактивы производства фирмы («Sigma»), Статус

хроматина ОКК и эмбрионов оценивали по методу Тарковского (Tarkowski, 1966).

Для сравнения результатов, полученных в опытных и контрольных группах, использовали критерии у2, Стыодента (Лакин, 1990) с помощью статистической программы Sigma Stat. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: Р<0,05; Р<0,01; Р<0,001.

Рис. 1. Структурно-логическая схема экспериментов 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Оценка статуса хроматина соматических клеток антралышх овариальных фолликулов и уровня содержания кальция в ооцитах. Несмотря на значительный прогресс в совершенствовании систем культивирования, число получаемых in vitro жизнеспособных эмбрионов свиней отличается высокой вариабельностью и в среднем достигает лишь одной трети от культивируемых ооцитов. Это объясняется неоднородностью популяции донорских ооцитов, и, прежде всего, морфо-функциональным состоянием антральных фолликулов из которых извлекаются гаметы (Hansen, PJ. 2006; Sirard, М.А. 2006). У свиней в каждом цикле овулирует 14-20 фолликулов. Популяция фолликулов по морфологическим и биохимическим показателям гетерогенна, и даже фолликулы одного размера могут различаться по концентрации стероидов в фолликулярной жидкости, числу клеток гранулезы, рецепторов к ЛГ, степени васкуляризации. Известно, что способность к развитию ооцитов низкая, если они выделены из атретических фолликулов (Zeuner, А. 2003). Руководствуясь этим фактом, мы провели анализ морфологических (диаметр фолликулов, их тургор, степень васкуляризации фолликулов,

диаметр ооцитов, процент пикнотичееких ядер в клетках кумулюса и гранулезы) и биохимических (уровень содержания Са24 во внутриклеточных депо ооцитов) показателей. В растущем фолликуле взаимодействие между ооцитом и соматическими фолликулярными клетками необходимо для нормального развития ооцита и самого фолликула в целом, как структурной функциональной единицы. Нами было установлено, что число пикнотичееких клеток в гранулезе антральных фолликулов коррелирует с уровнем пикнозов в клетках кумулюса ооцитов (рис.2). Клетки кумулюса и гранулезы в нашей работе отбирались из фолликулов ё 3-5 мм, поскольку при увеличении диаметра фолликулов повышается процент клеток с признаками дегенерации хроматина. В результате проведенных исследований обнаружены достоверные различия по уровню пикнотичееких ядер в клетках кумулюса и гранулезы фолликулов I группы, характеризующихся обширной васкуляризацией, плотной сетью капилляров без признаков дегенерации (контуры сосудов ровные), МНР (микроциркуляторное русло) с 5 балльной оценкой, ооплаз-ма - тонкозернистая, гомогенная, кумулюс-светлый, однородный, многослойный, компактный, равномерно окружающий ооцит, корона радиата четко выражена и III группой фолликулов со слабо развитым МЦР (1-2 балла), отсутствием капиллярной сети, гетерогенным кумулюсом и ооплазмой, имеющей включения (2,7 + 0,06 против 15,7 + 0,47 и 4,0 + 1,0 против 17,0+ 1,98 .соответственно Р<0,001(рис.2).

1МЦР л МЦР I!! ицр

Рис. 2. Уровень пикнотичееких ядер в соматических клетках фолликулов свиней с различной степенью развития МЦР (59 фолликулов, 3 повторности). Вертикальные отрезки - ошибки средних значений. Достоверность различия: а'ь Р<0,001 (критерий Стьюдента).

Ранее обнаружено, что деструктивным процессам в клетках гранулезы, ОКК сопутствует гипераккумуляция кальция во внутриклеточных депо (Kuzmina, T.I. 1999). В наших исследованиях выявлено, что во внутриклеточных депо ооцитов, выделенных из фолликулов III группы, содержание депонированного кальция достоверно

выше, чем в ооцитах, выделенных из фолликулов I группы (1,43 + 0,07 усл.ед против 0,93 + 0,04 усл.ед.) (Р< 0,001) (рис.3), что может свидетельствовать о снижении уровня метаболизма в ооцитах в зависимости от степени атрезии фолликулов. На основе проанализированных данных логично было предположить, что наиболее перспективными в плане потенций к дальнейшему созреванию и оплодотворению следует считать ооциты, выделенные из фолликулов первой группы.

□ Кальций

^ о

= I

§ х

1Л -

_ ч 1.2 ял"

5 5 й -

s ; о 1

* S 55 г.,

g а 0.8

и а f 1 = 0.6 s e-f

л g. S 0.4

* а ni

ia о О Н

<= а

5- о

ШЦР

II MUP

III МЦР

Рис. 3. Уровень содержания Са +во внутриклеточных депо свиных ооцитов, выделенных из фолликулов с различной степенью развития МЦР (87ооцитов, 3 повторности). Вертикальные отрезки - ошибки средних значений. Достоверность различия а'ь Р<0,001 (критерий Стьюдента). 3.2. Родамин 123 как маркер функционального состояния митохондрий в ооцитах свиней. Использование прижизненных красителей, в частности родамина 123, специфически связывающегося с функционально активными митохондриями, позволяет применять его для оценки локализации и транслокации митохондрий в ооплазме. В ооцитах свиней ядерное созревание прогрессирует с очень высокой скоростью, но оно не соответствует полному физиологическому созреванию, подразумевающему комплекс цитоплазматических изменений и преобразование хроматина. В тоже время, незавершенность цитоплаз-матического созревания может привести к неспособности ооцитом завершить созревание in vitro. Одним из маркеров цитоплазматического созревания является морфофункциональное состояние митохондрий (Tomer, Н. 2007,2004; Van Blerkom, J.2004). Kruip и др. обнаружили взаимосвязь между функционированием клеточных органелл и состоянием хроматина ооцитов. Они показали, что атретические изменения, происходящие в ОКК, вызывают не только нарушения перемещения митохондрий, но и ведут к уменьшению их числа, а при далеко зашедшей атрезии митохондрии теряют свою активность и лизируются. Известно, что ИФР123 в морфологически нормальных ОКК коров выше, чем в

дегенерированных (Kuzmina, T.l. 1998). Нами обнаружено, что в ооцитах свиней ИФР123 изменялась в соответствии с изменениями состояния хроматина. В ооцитах с признаками дегенерации хроматина ИФР123 на стадиях диплотены, метафазы I и телофазы I - метафазы II достоверно ниже, чем в нормальных (рис.4) (Р<0,001). Полученные данные свидетельствуют о том, что при созревании ооцитов свиней in vitro, преобразованиям хроматина сопутствуют изменения в митохондриальной активности. На стадии метафазы II ИФР123 в ооцитах с нормальным хроматином достоверно ниже, чем на стадии диплотены (1,53±0,35 усл. ед. и 2,63±0,21 усл. ед. соответственно)(Р<0,001). Последний факт может свидетельствовать о снижении метаболической активности при блоке развития ооцитов на стадии метафазы II перед оплодотворением яйцеклеток.

□ Норма и Дегенерация

Днплотена Мегафаза1 Телофазз I --

Мегафаза II

Рис.4. Интенсивность флуоресценции родамина 123 в ооцитах свиней на разных стадиях мейоза при культивировании in vitro. Вертикальные отрезки - ошибки средних значений. Число ооцитов-239, 3 повторное™. Достоверность различия a'b Р<0,01;c,d Р<0,05;e f Р<0,001;а,е Р<0,05 (критерий Стьюдента).

3.3. ВСВ-диагностика популяции ооцитов свиней, выделенных из фолликулов разного диаметра. При оценке, как исходной популяции ооцитов, так и яйцеклеток после созревания, ведется отбор нескольких клеток (не менее 20), по результатам анализа которых оценивают всю популяцию. Понятно, что огромный интерес представляет индивидуальная оценка клетки, предварительно тестированной на жизнеспособность и пригодной к дальнейшему культивированию. Применение в качестве зонда для прижизненного тестирования ооцитов бриллиантового кристалл-лического красителя (brilliant cresyl blue - ВСВ) - индикатора активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (G6PDH) обеспечивает возможность использования отобранных клеток для дальнейшего культивирования ооцитов, их оплодотворения и получения эмбрионов. ВСВ детерминирует

интрацеллюлярную активность G6PDH, которая играет важную роль в клеточном росте, являясь ключевым ферментом пентозофосфатного цикла. Активность фермента возрастает в растущем ооците, к моменту завершения роста его активность снижается. Нетоксичность данного красителя при его использовании в качестве теста при определении уровня G6PDH была показана на ооцитах овец, в зависимости от их размера, а также при определении компетенции к мейотическому дозреванию ооцитов коров (Roca, J.1998; Rodn'guez-Gonza'lez, Е. 2002). Нами была предпринята попытка охарактеризовать популяцию ооцитов свиней, выделенных из фолликулов разного диаметра по морфофункциональному состоянию, с учетом ВСВ теста и уровня содержания кальция во внутриклеточных депо. Выявлена гетерогенность исходной популяции ооцитов свиней, выделенных из фолликулов разного диаметра на основании ВСВ теста. Наибольшее число ВСВ (+) ооцитов свиней обнаружено в фолликулах d 35 и более 5 мм (86% против 71%, Р<0,01) (рис. 5).

Диизрфоппмрвв 34 шм

Дивнетр фопикупив <3 ми

О ВСЕ + Ы НОВ

Дюмэтр фолпжрюв >5 им

14%

86%

Рис.5. ВСВ-диагностика ооцитов свиней, выделенных из фолликулов разного диаметра. ВСВ(-) - растущие ооциты, ВСВ(+) - ооциты, завершившие фазу роста. Число ооцитов - 826, число повторностей - 5. Достоверность различия31 ;а'сР<0,01 (критерий %2).

Показано, что ВСВ(+) и ВСВ(-) ооциты различаются по уровню содержания кальция во внутриклеточных депо. Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана в ВСВ (+) ооцитах, выделенных из фолликулов разного диаметра, превышала таковую в ВСВ(-) ооцитах. Максимальный уровень содержания кальция во внутриклеточных депо обнаружен в ВСВ (+) ооцитах, выделенных из фолликулов диаметром более 5мм (1,06 ± 0,06 усл.ед.) (таблица 1).

Таблица I.

Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-кальций во внутриклеточных депо ооцитов свиней после

Диаметр фолликула п оцитов Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана -кальций (усл.ед.)

ВСВ(-)ооциты ВСВ(+)ооциты

<3мм 181 0,60± 0,04 а 0,79 ± 0,03 ь

3-5мм 82 0,67 ± 0,05 d 0,86 ± 0,06 е

> 5мм 59 0,65 ± 0,03 8 1,06 ± 0,06 h

(Критерий Стьюдента).

Полученные данные, свидетельствующие о низком уровне депонированного кальция в ВСВ (-) ооцитах, предполагают высокий уровень активности синтетических процессов в ооцитах, не завершивших свой рост.

3.4. Моделирование систем дозревания ооцитов свиней in vitro 3.4.1. Морфология и статус хроматина клеток кумулюса при их культивировании в различных системах. После культивирования ОКК в средах, содержащих гормоны, ФЖ, СФ были оценены степень экспансии кумулюса, деструктивные процессы в клетках и их пролиферация. Исследования показали, что использование NCSU 23, с добавлением 10% ФЖ, СФ увеличивает долю ОКК с высокой степенью экспансии кумулюса при созревании ооцитов in vitro (таблица 2).

Таблица 2.

Морфология кумулюса при культивировании ОКК свиней в различных системах (44 часа, число ОКК —401; 3 повторности)

Система культивирования Число ОКК Число (%) ОКК с различной степенью экспансии кумулюса

высокая средняя низкая

ЫС8и 23+ 'Гормоны (контроль) 101 77(76)а 10(10) 14(15)

М^Ш 23+ 'Гормоны +10% **ФЖ 99 86(87)ь 6(6) 7(7)

Ж^и 23+ "Гормоны +*"СФ 103 69(67)с 21(20) 13(13)

ЫСБи 23+ 'Гормоны + 10% **ФЖ + "*СФ 98 93(95)" 2(2) 3(3)

Достоверность различия сравниваемых значений (критерий % ) .....Р<0,001.МС5и 23

- синтетическая питательная среда; гормоны - ЮМ.Е.хорионического гонадотропина человека + 10 М.Е. хорионического гонадотропина лошади; ФЖ - фолликулярная жидкость ((1 фолликулов 3-5 мм); "СФ - стенки фолликулов (ё фолликулов 3-5 мм).

Результаты по оценке статуса хроматина (число клеток с пикнотическими и митотическими ядрами) в кумулюсе представлены в таблице 3. Наименьшее количество клеток с пикнотическими ядрами в клетках кумулюса отмечается в группе ооцитов прокультивированных в средах с добавлением СФ и в группе с добавлением, как ФЖ, так и СФ, и составляет 12%. Максимальное количество митотических клеток кумулюса отмечается в группе, где ооциты были прокультивированы совместно с 10% ФЖ и СФ, это достоверно выше, чем доля митотических клеток в группе ооцитов прокультивированных в среде МС8и-23 с добавлением гормонов (6% против 4%) (Р<0.001).

Таблица 3.

Статус хроматина в кумулюсе ооцитов при культивировании ооцит-кумулюсных комплексов свиней в различных системах (время культивирования 44 часа) ___

Система культивирования Число ОКК Число кумулю -сных клеток Характеристика хроматина в кумулюсе

Число клеток с пикнотичес кими ядрами, п (%) Доля митотических клеток от общего числа с нормальным хроматином, п(%)

Ж^и 23+ Гормоны 103 10403 2185(21)" 8218/329f (4)

Ж^и 23+Гормоны +10% ФЖ 96 9504 1711(18)" 7793/399g (5)

N081123+ Гормоны + СФ 101 9898 1188(12)° 8710/505h (6)

ЫСБи 23+ Гормоны + 10% ФЖ +СФ 101 10302 1241(12)d 9061/553k(6)

Контроль(до культивирования) 94 9100 182(2)е 8918/980m (И)

Число исследованных ОКК - 401. Достоверность различия сравниваемых значений (критерий f): Р0.001; ас PcO.OOl; a,d Р0.001; ^ Р<0.001;Ьс Р<0.001;МР<0.001; ь'е PcO.OOl;с>е Р0.001; d'e PcO.OOl; f'gP<0.001; fh PO.OOl; tk P<0.001;tm P<0.001;&ш P<0.001; h'm P<0.001; Km P<0.001. 3.4.2. Влияние фолликулярной жидкости и структурных элементов фолликула на экстракорпоральное созревание ооцитов in vitro. Согласно литературным данным, ооциты телок, классифицированные как ВСВ (+), имели значительно более высокий уровень развития бластоцист, чем ВСВ (-) (12.3, 1.6%, соответственно) (Pujol, М. 2004, Alm et al.,2005).

Высокая активность G6PDH в ооцитах отрицательно коррелирует с показателями созревания и оплодотворения свиней in vitro (Ericsson, S.A. 1993). Основываясь на этих данных, для дальнейших исследований мы использовали исключительно ВСВ (+) ооциты, как наиболее компетентные к дальнейшему развитию.

Для выявления оптимальной среды для созревания ооцитов были проведены эксперименты с использованием моделей дозревания ооцитов на основе использования структурных элементов фолликула - клетки теки и гранулезы и ФЖ (описание групп по составу моделей дозревания см. таблица 2, стр.13). Анализ статуса хроматина ооцитов после экстракорпораль-ного созревания показал, что наибольшее число созревших ооцитов обнаружено в группе, где клетки культивировали с гормонами, ФЖ и СФ (86% ооцитов на стадии метафазы II против 84 % в группе ооцитов, прокультивированных с 10% ФЖ (Р<0,05))(таблица 4). Введение в систему дозревания СФ и ФЖ обусловило снижение уровня ооцитов с дегенерированным хроматином (14% против 28%).

Таблица 4.

Созревание ооцитов свиней в различных системах культивирования (44 часа культивирования). Число ооцитов - 421, число повторностей -5

Система культивирования Число ооцитов п(%) ооцитов не реиници ировавш их мейоз п(%) ооцитов реиници ировавш их мейоз п(%) ооцитов на стадии метафаз ы-II п(%) дегенер и- рованны X ооцитов

NCSU 23+ Гормоны (контроль) 98 10(10) 14(14) 74(76) 27(28)"

NCSU 23+Гормоны +10% ФЖ 121 12(10) 7(6) 102(84)а 25(21)

NCSU 23+ Гормоны + СФ 95 16(17) 13(14) 66(70)ь 28(30)f

NCSU 23+Гормоны + 10%ФЖ+СФ 107 8(8) 7(7) 92(86)° 15(14)h

Достоверность различия сравниваемых значений (критерий %2): "•ь Р<0,05; b'c Р<0,05; d'h Р<0,05;f,h Р<0,05.

В следующей серии экспериментов мы оценили потенции к развитию ооцитов, созревших в различных системах и оплодотворенных in vitro (таблица 5). Введение в систему дозревания СФ и ФЖ способствует возрастанию, как числа дробящихся клеток 21% (контроль), 41% (среда с

10%ФЖ), 52% (среда с 10%ФЖ и СФ), так и количества эмбрионов на стадиях морулы и бластоцисты 7% против 18%, 38% соответственно.

Таблица 5.

Развитие доимплантационных эмбрионов свиней из ооцитов, созревших в различных системах культивирования (число ооцитов — 408, число дробящихся клеток -157, число морул и бластоцист - 79, 5

Система культивирования Число ооцитов %,число дроблений %,число эмбрионов на стадии морулы, бластоцисты (144 часа)

КСЗи 23+Гормоны (контроль) 99 21 (21/99)3 7 (7/99)е

>Ои 23+Гормоны +10% ФЖ 103 41 (42/103)" 18 (19/103/

ЫСБи 23+ Гормоны + СФ 97 38(37/97)° 12(12/97)®

М:Би 23+Гормоны + 10%ФЖ+СФ 109 52 (57/109)" 38(41/109)ь

Достоверность различия сравниваемых значений (критерий х2)'-а-ь Р< 0,05;а>с Р<0,05; м Р<0,001; Р=0,05; е'гР< 0,05;сД Р< 0,001; ?ьР<0,05;ь1,Р<0,001.

Данные по морфофункциональной оценке эмбрионов свиней, созревших в средах с добавлением ФЖ и СФ представлены в таблице 6. При визуальном анализе качества эмбрионов учитывали следующие параметры: правильность формы эмбриона; компактность; отклонение в размере клеток; цвет и структура эмбриона; наличие больших везикул; форма зоны пеллюцида; наличие фрагментов клеток. Цитологический анализ проводили с учетом следующих показателей: фрагментация цитоплазмы; характеристика набора хромосом в бластомерах; несоответствие числа бластомеров количеству ядер; эмбрионы с пикнотическими ядрами в бластомерах. В экспериментах были проанализированы эмбрионы на стадиях от 2 до 32 клеточных. Не обнаружено достоверных различий между экспериментальными группами по уровню дегенераций, выявленных, как при визуальной характеристике, так и при цитологическом анализе. В группах, где для культивирования использовали структурные элементы фолликула и фолликулярную жидкость наблюдали тенденцию к

увеличению доли эмбрионов с положительными качественными характеристиками с 40 % в контроле до 19 % в опытной группе.

Таблица 6.

Морфологическая характеристика эмбрионов свиней, полученных из ооцитов, созревших в различных системах (2-32 клеточные). Число

эмбрионов — 224, повторностен - 3

Среда созревания ооцитов Число эмбри онов Нарушения, выявленные при визуальной характерист ике, п(%) Типы нарушений, выявленные при цитологическом анализе, п(%) Всего дегенериро ванных, п(%)

NCSU 23+Гормоны (контроль) 59 15(25) 9(15) 24(40)

NCSU 23+Гормоны +10% ФЖ 53 11(21) 5(9) 16(30)

NCSU 23+ Гормоны +СФ 57 12(21) 4(7) 16(28)

NCSU 23+Гормоны + 10%ФЖ + +СФ 55 8(15) 2(4) 10(19)

3.4.3. Использование MitoTracker Orange CMTMRos для оценки функционального состояния митохондрий в ооцитах свиней, созревших в различных системах культивирования. Описанные нами выше результаты по оценке состояния митохондрий ооцитов с помощью родамина 123 показали возможность его использования в качестве индикатора функционального состояния митохондрий, однако, процедура проведения анализа имеет недостаток - быстрое «выгорание» красителя при микроско-пиировании, что затрудняет процедуру оценки препарата. Для выяснения возможных причин положительного действия предлагаемой системы дозревания (с добавлением 10% ФЖ и СФ) на потенции к развитию прокультивированных в ней ооцитов, нами были проведены эксперименты по анализу интенсивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos (зонда для тестирования функционального состояния митохондрий) в яйцеклетках после 44 часов экспозиции. Обнаружены достоверные различия в показателях интенсивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos между группами ооцитов созревших в среде NSCU-23 с гормонами и в среде NSCU-23 со стенками фолликулов и фолликулярной жидкостью (127,4 ±10,53 против 366,23±15,05(дА соответственно, Р<0.001) (таблица 7).

Таблица 7.

Интенсивность флуоресценции MitoTrackcr Orange CMTMRos (цА) в ооцитах свиней после 44 часов культивирования (число ооцитов -180,3

повторности)

Система культивирования Число ооцитов Интенсивность флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos (дА)

NCSU23+roPMOHbi (контроль) 47 127,4 ±10,53a

NCSU23 +Гормоны +10% ФЖ 45 254,66±13,05b

NCSU23+ropMOHbi + СФ 43 289,23± 12,82°

NCSU23+ Гормоны+10%ФЖ + СФ 45 366,23±15,05d

Достоверность различия сравниваемых значенийР< 0,001;Р< 0,001; ' Р< 0,001;°'СР< 0,001 (Критерий Манна-Уитни).

Резюмируя представленные результаты, следует отметить, что формирование биологически полноценных, зрелых яйцеклеток in vivo зависит от множества факторов, детерминирующих судьбу ооцита -развитие при последующем оплодотворении эмбриона или же элиминацию ооцита из яичника в результате апоптозных изменений. В настоящем исследовании мы проанализировали потенции к дальнейшему развитию донорских ооцитов в зависимости от их происхождения (диаметр фолликула, состояние хроматина фолликулярных клеток), ядерных и цитоплазматических изменений, сопровождающих завершающие стадии мейотического созревания, выявили связь морфологических критериев качества ооцита с показателями метаболической активности (уровень содержания кальция и функциональное состояние митохондрий) и на этой основе смоделировали систему культивирования, обеспечивающую высокий выход зрелых яйцеклеток in vitro. Результаты проведенных исследования позволили нам предложить эффективный тест для оценки исходной популяции донорских ооцитов свиней (ВСВ диагностика), обосновать целесообразность введения в систему культивирования ооцитов структурных элементов фолликула, что обеспечило при дальнейшем оплодотворении, увеличение выхода из них биологически полноценных эмбрионов.

ВЫВОДЫ

1. В фолликулах (d 3-5 мм) с обширной васкуляризацией, высоким тургором уровень соматических клеток с пикнотическими ядрами достоверно ниже, чем в фолликулах с морфологическими признаками дегенерации (4,0 + 1,0 % против 17,0 ± 1,98 %, Р<0,001).

2. Обнаружено, что дегенерация хроматина в соматических клетках фолликулов сопровождается достоверным возрастанием уровня содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов.

3. Установлено, что в ооцитах с дегенерированным хроматином на разных стадиях мейоза снижается уровень флуоресценции родамина 123 по сравнению с ооцитами с нормальным хроматином (диплотена -2,22±0,37усл.ед. против 2,63±0,21усл.ед., Р<0,01; метафаза I - 1,77±0,37 усл.ед., 2,51±0,37 усл.ед., Р<0,05, метафазы II - 0,77±0,12 усл.ед., 1,53±0,35 усл.ед., Р<0,001).

4. Выявлена гетерогенность исходной популяции ооцитов свиней, выделенных из фолликулов разного диаметра, на основании ВСВ-теста. Наибольшее число ВСВ (+) ооцитов обнаружено в фолликулах d 3-5 мм и более 5 мм (86% % против 71% ооцитов, выделенных из фолликулов d < 3 мм, Р<0,001).

5. Обнаружено, что ВСВ(+) и ВСВ(-) ооциты свиней , выделенные из фолликулов разного диаметра, различаются по уровню содержания кальция во внутриклеточных депо. Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-кальций в ВСВ(+) ооцитах, выделенных из фолликулов разного диаметра превышала таковую в ВСВ(-) ооцитах.

6. Внесение в среду дозревания ВСВ(+) ооцитов свиней структурных элементов фолликулов (стенок фолликулов d - 3-5мм) и 10% фолликулярной жидкости (d - фолликулов 3-5 мм) снижает долю ооцитов с дегенерированным хроматином (14% против 28%, Р<0,05).

7. Уровень интенсивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos в ВСВ(+) ооцитах, созревших в системе с фолликулярной жидкостью (d 3-5 мм) и стенками фолликулов (d 3-5 мм) достоверно превышает таковой в ооцитах, прокультивированных без структурных элементов фолликулов и фолликулярной жидкости (366,23±15,05ца против 127,4 ±10,53 ца, Р < 0.001)

8. Созревание ВСВ(+) ооцитов в системе с фолликулярной жидкостью и структурными элементами фолликула обеспечивает высокий выход эмбрионов на завершающих стадиях доимплантационного развития. (7% против 38%, Р < 0.001).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В технологиях получения эмбрионов свиней in vitro, клонировании, трансгенезе с целью получения биологически полноценных яйцеклеток проводить предварительное ВСВ - тестирование исходной популяции ооцитов. Для созревания ооцитов использовать ВСВ(+) ооциты.

2. С целью повышения эффективности технологии получения зрелых яйцеклеток in vitro использовать для их экстракорпорального созревания следующую систему: среда NCSU-23 с 10 М.Е. хорионического гонадотропина человека, 10 М.Е. хорионического гонадотропина лошади,

дополненную 10% фолликулярной жидкости (ё 3- 5 мм) и стенками фолликулов (с! 3- 5 мм).

3. Результаты исследований могут быть использованы научными сотрудниками, аспирантами и студентами ветеринарных, сельскохозяйственных ВУЗов, НИИ и специалистами биотехцентров репродукции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Денисенко В. Ю. Влияние эстрадиола на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиньи, стимулированное совместным действием пролактина и теофиллина / Т. И. Кузьмина, Г. В. Мурза // Цитология. - 2007. - Т. 49. - № 9. - С.739-740. г

2. Кузьмина Т.И. Компетентность к партеногенезу ооцитов коров, выделенных из фолликулов разного диаметра / О.С. Скотти, Г.В. Мурза // Цитология. - 2009. -Т. 51. -№ 9. -С. 772.

3. Кузьмина Т.И. Стандартизация систем дозревания донорских ооцитов коров для их использования в клеточных технологиях репродукции / Т.Э. Позднякова, Г.В. Мурза, Т.В. Кибардина // Известия С.-Петербургского Аграрного Университета. - 2008. -№11. - С. 74-77.

4. Мурза Г.В. Получение эмбрионов свиней из ооцитов, созревших и оплодотворенных in vitro / Т.И. Кузьмина // "Научное обеспечение развития АПК в условиях реформирования" Сб. научн. трудов. Агр. Универ. - С.-Петербург, 2009. - С. 206-208.

5. Кузьмина Т.И. Оценка качества донорских ооцитов свиней, используемых в клеточных технологиях репродукции / Г.В. Мурза, Т.Э. Позднякова, А.И. Ганджа И Известия С.-Петербургского Аграрного Университета. - С.-Петербург, 2010.-№18. -С. 112-117.

6. Скотти О.С. Моделирование систем экстракорпорального дозревания ооцитов коров / Г.В. Мурза // Конф. "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии". ВИЖ. -Москва, 2008. -С. 286-289.

7. Kuzmina Т. Effect of somatotropin on the development competence of bovine oocyte from follicles in different diameter / H. Tomer, H. Aim, G. Murza, A. Egiazarian // 24th Scientic meeting, PAU. - France, 2008. -P. 180.

8. Кузьмина Т.И. Использование структурных элементов фолликулов в технологии созревания ооцитов свиней in vitro / Г.В. Мурза, О.С. Скотти // Сборн. научн. трудов: Пути интенсификации отрасли свиноводства в странах СНГ. - Гродно, Беларусь, 2009. - С. 76-78.

9. Kuzmina Т. Partenogenetic development of bovine embryos produced from in vitro matured oocytes depending on culture system and age animals / H. Tomer, H. Aim, G. Murza, W. Kanitz // 25th Scientific meeting European Embryo Transfer Association (A.E.T.E). - Poland, 2009. -P. 202.

Подписано к печати 18 мая 2010 г. Формат 60x80 1/16. Бумага офсетная. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 118 Отпечатано в типографии ГНУ СЗНИИМЭСХ Санкт - Петербург - Павловск, пос. Тярлево, Фильтровское шоссе,3

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мурза, Галина Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фолликулогенез свиней.

1.1.1. Механизмы, регулирующие фолликуло- и оогенез свиней, в зависимости от степени половой и физиологической зрелости.

1.2. Фундаментальные основы мейотического созревания ооцитов млекопитающих.

1.2.1. Преобразования хроматина при созревании ооцитов.

1.2.2. Цитоплазматические изменения в процессе формирования зрелой яйцеклетки.

1.2.3. Роль митохондрий и других органелл в созревание ооцитов.

1.3. Биологические и технологические аспекты созревания ооцитов и получения эмбрионов свиней in vitro.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материал исследований.

2.2. Методы исследований

2.2.1. Выделение фолликулов, фолликулярной жидкости и ооцит-кумулюсных комплексов из яичников свиней.

2.2.2. Морфометрический анализ популяции фолликулов.

2.2.3. Окраска ооцитов бриллиантовым кристаллическим красителем.

2.2.4. Определение уровня содержания кальция в ооцитах свиней.

2.2.5. Оценка функционального состояния митохондрий в ооцитах свиней с использованием флуоресцентных зондов.

2.2.6. Культивирование ооцит-кумулюсных комплексов.

2.2.7. Оплодотворение яйцеклеток свиней in vitro.

2.2.8. Культивирование эмбрионов свиней.

2.2.9. Оценка состояния ядерного материала в клетках гранулезы и кумулюса.

2.2.10. Цитогенетический анализ хроматина ооцитов эмбрионов.

2.2.11. Микроскопирование, микрофотосъемка и статистическая обработка полученных данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Морфометрическая характеристика популяции овариальных фолликулов свиней.

3.2. Оценка статуса хроматина соматических клеток антральных овариальных фолликулов и уровня содержания кальция в ооцитах.

3.3. Родамин 123 как маркер функционального состояния митохондрий в ооцитах свиней.

3.4. Бриллиантовый кристаллический краситель, как индикатор активности глюкозо- 6 -фосфатдегидрогеназы в ооцитах свиней.

3.4.1. ВСВ-диагностика популяции ооцитов свиней, выделенных из фолликулов разного диаметра.

3.5. Моделирование систем дозревания и оплодотворения ооцитов свиней vitro.

3.5.1. Морфология и статус хроматина клеток кумулюса при их культивировании в различных системах.

3.6. Культивирование ооцитов свиней в различных системах.

3.6.1. Исследование роли фолликулярной жидкости и структурных элементов фолликула в формировании зрелой яйцеклетки in vitro.

3.6.2. Использование MitoTracker Orange CMTMRos для оценки адекватности систем дозревания ооцитов свиней in vitro.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Оценка биологической полноценности ооцитов свиней на основе маркеров ядерно-цитоплазматического созревания"

Последнее десятилетие ознаменовалось интенсификацией разработки и совершенствования инновационных клеточных репродуктивных биотехнологий в свиноводстве [163]. Технология получения эмбрионов вне организма для трансплантации, трансгенез и клонирование свиней, созданияе линий эмбриональных стволовых клеток для дальнейшей ксенотрансплантации органов основываются на базовом методе созревания донорских ооцитов свиней in vitro [141, 26]. Несмотря на несомненные успехи в этой области, уровень оплодотворяемости ооцитов и развития интактных, клонированных или трансгенных эмбрионов продолжает оставаться на низком уровне [99, 38]. Множество факторов вовлечены в процессы экстракорпорального созревания ооцитов, их культивирования и оплодотворения: возраст животного-донора, размер фолликула, морфология ооцит-кумулюсного комплекса, среда для созревания ооцитов и культивирования эмбрионов, качество сперматозоидов, температурный и газовый режимы [126, 50]. Отбор ооцит-кумулюсных комплексов для культивирования - начальный этап клеточных репродуктивных технологий, определяющий дальнейший успех или неудачу эксперимента [185]. Исходная популяция донорских ооцитов, используемых в экспериментах, гетерогенна, Разработка эффективных тестов оценки качества ооцит-кумулюсных комплексов - важная задача эмбриотехнологов. Рост ооцита и формирование зрелой яйцеклетки в организме — комплексный процесс преобразования хроматина и структурно-функциональных изменений ооплазмы и клеточных органелл. В связи с этим, особый интерес представляет, сравнительный анализ статуса хроматина кумулюса и ооцитов, функционального состояния митохондрий, уровня содержания кальция в ооцитах, выделенных из фолликулов разного диаметра, и отобранных с помощью витального красителя бриллиантового кристаллического голубого (ВСВ — индикатора активности). Настоящее исследование посвящено разработке эффективных тестов качества исходной популяции донорских ооцитов свиней и созревших гамет.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы — исследовать процесс формирования зрелой яйцеклетки свиньи in vitro на основе использования маркеров ядерно-цитоплазматического созревания и разработка систем культивирования для интенсификации клеточных репродуктивных технологий.

В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:

1. Провести мониторинг овариальных фолликулов свиней с учетом диаметра фолликула, васкуляризации, тургора, статуса хроматина женских гамет и соматических клеток фолликула (кумулюса и гранулезы), уровня содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов;

2. Оценить исходную популяцию донорских ооцитов свиней, выделенных из фолликулов разного диаметра с учетом ВСВ-теста (маркер активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы) и уровня содержания депонированного кальция;

3. Проанализировать возможность использования родамина 123 для оценки функционального состояния ооцитов на различных стадиях мейоза;

- стадии мейоза ооцитов;

- степени экспансии клеток кумулюса;

- уровня пикнозов в кумулюсе;

- интенсивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos;

- оплодотворяемости ооцитов;

- развития доимплантационных эмбрионов.

Научная новизна. Впервые были получены следующие данные:

- на основе ВСВ-теста выявлена гетерогенность популяции донорских ооцитов свиней. В фолликулах диаметром менее 3 мм содержится достоверно меньшее число ВСВ(+) ооцитов по сравнению с фолликулами диаметром - 3-5 и более 5 мм (71% против 86%, соответственно);

- растущие ВСВ(-) и завершившие фазу роста ВСВ(+) ооциты отличаются по уровню содержания кальция во внутриклеточных депо;

Теоретическая и практическая значимость работы. На основе использования маркеров ядерно-цитоплазматического созревания (статус хроматина, уровень содержания депонированного кальция, функциональное состояние митохондрий) теоретически обоснована и разработана модель экстракорпорального созревания ооцитов свиней. Прослежена динамика флуоресценции родамина 123 в ооцитах на разных стадиях мейоза, отмечены достоверные различия в показателях интенсивности флуоресценции родамина 123 в ооцитах с нормальным и дегенерированным хроматином. Показано, что процесс формирования зрелой яйцеклетки сопровождается повышением интенсивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos в ооцитах, созревших в присутствии структурных элементов фолликулов. Деление ооцитов на «растущие» и «выросшие» с помощью индикатора активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы позволило выявить гипераккумуляцию ионов кальция во внутриклеточных депо ВСВ(+) ооцитов, что может свидетельствовать о снижении уровня метаболической активности перед реинициацией мейоза. Проанализирован характер ооцит-кумулюсных взаимодействий в процессе созревания ооцитов в различных системах культивирования. Активная экспансия клеток, снижение уровня пикнозов свидетельствует о возможности увеличение «продуктов» секреции клеток кумулюса (не затронутых деструктивными изменениями), детерминирующих формирование факторов, ответственных за приобретение ооцитами компетентности к завершению мейотического созревания, оплодотворению и развитию эмбрионов. Практическая ценность работы представлена разработкой системы дозревания ВСВ(+) ооцитов свиней из фолликулов диаметром 3-5 мм на основе использования структурных элементов фолликула и его жидкости, позволяющей повышать выход зрелых яйцеклеток и биологически полноценных эмбрионов свиней.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе - 2 в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и одобрены на ежегодных аспирантских сессиях и отчетах ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии, на Международных конференциях: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», с. Пущино, 2007; "Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных: роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии", ВИЖ, Москва, 2008; «Пути интенсификации отрасли свиноводства в странах СНГ», Гродно, Беларусь, 26-27 августа 2009; 25-й ежегодной конференции Европейской Ассоциации по трансплантации эмбрионов, Польша, сентябрь 2009; "Научное обеспечение развития АПК в условиях реформирования", Санкт-Петербург-Пушкин, январь 2009.

Положения, выносимые на защиту:

Популяция ооцитов свиней из фолликулов диаметром 3-5 мм гетерогенна и состоит из ВСВ(+) и ВСВ(-) ооцитов, т.е. завершивших фазу роста (86%) и растущих (14%);

В ВСВ(+) ооцитах свиней уровень содержания кальция во внутриклеточных депо превышает таковой в ВСВ (-) ооцитах;

В ооцитах, созревших в присутствии структурных элементов фолликулов (стенок фолликулов — СФ) и фолликулярной жидкости (ФЖ), достоверно возрастает интенсивность флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos;

Использование для созревания ооцитов in vitro структурных элементов фолликулов (диаметр 3-5мм) в комплексе с гормонами и ФЖ (диаметр фолликулов 3-5мм) позволяет получать 38% эмбрионов на стадиях поздней морулы, бластоцисты.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, их обсуждения, выводов, предложений, списка использованной при написании диссертации литературы, включающего 230 источников, в том числе 216 на иностранном языке. Диссертация изложена на 121 странице, включает 10 таблиц, 27 рисунков (в том числе 17 фотографий).

Заключение Диссертация по теме "Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных", Мурза, Галина Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. В фолликулах (диаметром 3-5 мм) с обширной васкуляризацией, высоким тургором уровень соматических клеток с пикнотичеекими ядрами достоверно ниже, чем в фолликулах с морфологическими признаками дегенерации (4,0 ± 1,0 % против 17,0 ± 1,98 %, Р < 0,001).

3. Установлено, что в ооцитах с дегенерированным хроматином на разных стадиях мейоза снижается уровень флуоресценции родамина 123 по сравнению с ооцитами с нормальным хроматином (диплотена - 2,22±0,37 усл.ед. против 2,63±0,21 усл.ед., Р < 0,01; метафаза I - 1,77±0,37 усл.ед., 2,51±0,37 усл.ед., Р < 0,05, метафазы П - 0,77±0,12 усл.ед., 1,53±0,35 усл.ед., Р < 0,001).

4. Выявлена гетерогенность исходной популяции ооцитов свиней, выделенных из фолликулов разного диаметра, на основании ВСВ-теста. Наибольшее число ВСВ(+) ооцитов обнаружено в фолликулах диаметром 3-5 мм и более 5 мм (86% против 71% ооцитов, выделенных из фолликулов диаметром менее 3 мм, Р < 0,001).

5. Обнаружено, что ВСВ(+) и ВСВ(-) ооциты свиней, выделенные из фолликулов разного диаметра, различаются по уровню содержания кальция во внутриклеточных депо. Интенсивность флуоресценции комплекса хлортетрациклин-мембрана-кальций в ВСВ(+) ооцитах, выделенных из фолликулов разного диаметра превышала таковую в ВСВ(-) ооцитах .

6. Внесение в среду дозревания ВСВ(+) ооцитов свиней структурных элементов фолликулов (стенок фолликулов диаметром - 3-5мм) и 10% фолликулярной жидкости (диаметр фолликулов 3-5 мм) снижает долю ооцитов с дегенерированным хроматином (14% против 28%, Р < 0,05).

7. Уровень интенсивности флуоресценции MitoTracker Orange CMTMRos в ВСВ(+) ооцитах, созревших в системе с фолликулярной жидкостью (диаметр фолликулов 3-5 мм) и стенками фолликулов (диаметр фолликулов 3-5 мм) достоверно превышает таковой в ооцитах, прокультивированных без структурных элементов фолликулов и фолликулярной жидкости (366,23±15,05 |ла против 127,4 ±10,53 jaa, Р < 0,001)

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В технологиях получения эмбрионов свиней in vitro, клонировании, трансгенезе с целью получения биологически полноценных яйцеклеток проводить предварительное ВСВ — тестирование исходной популяции ооцитов. Для созревания ооцитов использовать ВСВ(+) ооциты, как завершивших стадию роста.

2. С целью повышения эффективности технологии получения биологически полноценных ооцитов in vitro использовать для их экстракорпорального созревания следующую систему: среда NCSU-23 с 10 М.Е. хорионического гонадотропина человека, 10 М.Е. хорионического гонадотропина лошади, дополненную 10% фолликулярной жидкости из фолликулов диаметром 3- 5 мм и стенками фолликулов (диаметр фолликулов 3- 5 мм).

3. Результаты исследований могут быть использованы научными сотрудниками, аспирантами и студентами ветеринарных, сельскохозяйственных, медицинских ВУЗов, НИИ и специалистами биотехцентров репродукции.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Мурза, Галина Валерьевна, Санкт-Петербург-Пушкин

1. Бехтина, В. Г. Влияние гонадотропных гормонов на морфологию фолликулов в процессе их культивирования вне организма / В. Г. Бехтина, П.Ф. Ковалев, Л.Д. Галиева // Бюл. ВНИИГРЖ. Л. - 1990. - Вып. 123. - С.24 - 27.

2. Голубев, А.К. Методические рекомендации по культивированию ооцитов и фолликулов коров / А.К. Голубев, Б.П. Завертяев, Т.И. Кузьмина -1989.-С. 35.

3. Денисенко В.Ю., Кузьмина Т.И., Шокин О.В. Зависимость освобождения Са из внутриклеточных депо от уровня NADH и FAD в оплодотворенных и неоплод отворенных яйцеклетках коров // Цитология. 2005. - Т.47. - №.8. - С.704-708.

4. Дыбан, А.П. Раннее развитие млекопитающих/ А.П. Дыбан II — Л.: «Наука», 1988.-С. 228.

5. Каганская, В.В. Культивирование ооцитов коров с фолликулярными клетками / В.В. Каганская, Б.Е. Свиридов // Тез. докл. Всес. совещ./ Проблемы развития Биотехнологии в животноводстве. Дубровицы, 1990. - С.14-18.

6. Кузьмина, Т.И. Методы оценки функционального состояния донорских ооцитов, соматических клеток фолликулов и эмбрионов сельскохозяйственных животных. Методические рекомендации / Т.И. Кузьмина,

7. B.Ю. Денисенко, И.Ю. Лебедева // М., 2005. - С.32.

8. Кузьмина, Т.И. Эффекты пролактина в различных системах культивирования на созревание ооцитов коров и их способность к дальнейшему развитию / Т.И. Кузьмина, И.Ю, Лебедева, X. Торнер, X. Альм // Онтогенез. — 2001.-№32 (2).-С. 140-147.

9. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин // М. : «Высш. Шк.»: - 1990.1. C. 352.

10. Лебедева, И.Ю. Взаимная модуляция регуляторного влияния пролактина и соматотропина на синтез ДНК в клетках гранулезы коров / И.Ю. Лебедева, Т.И. Кузьмина В.А. Лебедев, Т.А. Гойло // Цитология. 2000. - Т. 42( 5). - С. 468-472.

11. Лебедева, И.Ю. Модуляция пролактином ингибирующего влияния теофиллина на созревание ооцит-кумулюсных комплексов коров in vitro / И.Ю. Лебедева, О.С. Скотти, Т.И. Кузьмина // Цитология. 2006. - Т.48(12). - С. 1010-1015.

12. Маленко, Г.П. Получение ранних зародышей крупного рогатого скота для целей трансплантации / Г.П. Маленко, В.П. Рябых, В.В. Титкова // Всес. совещ. / Трансплантация эмбрионов с/х ж.-х. Алма-Ата, 1989. - С.28-29.

13. Никитин, А.И. Факторы регуляции дифференцировки соматических клеток фолликулов яичников млекопитающих / А.И. Никитин, О.Ф. Воробьева//Цитология. 1988. - Т. 30, № 10. - С. 1155-1171.

14. Никольский, Н.Н. Эпидермальный фактор роста / Н.Н Никольский, А.Л. Сорокин, А.Б. Сорокин // Л.: Наука, 1987. С. 200.

15. Шагиахметова, Г.А. Влияние тканевой культуры фолликулов на мейотическое созревание и оплодотворение in vitro ооцитов коров: Автореф. дис. . канд. биол. наук: 03.00.15 // Шагиахметова Галина Альбертовна. С-Пб. -Пушкин, 1992.-С. 17.

16. Abeydeera, L.R. In vitro production of embryos in swine / L.R. Abeydeera // Theriogenology. 2002. - V. 57. -N. 1. - P. 256-273.

17. Al-Katanani, Y.M. Effect of season and exposure to heat stress on oocyte competence in Holstein cows / Y.M. Al-Katanani, F.F. Paula-Lopes, P.J. Hansen // Journal of Dairy Science. -2002. -V. 85. -P. 390-396.

18. Altura, B. Ca2+ coupling in vascular smooth muscle: Mg2+ and buffer effects on contractility and membrane Ca2+ movements / B. Altura, A. Carella, P. Turlapaty // Can. J. Physiol. Pharm. -1982. -V. 60. -P. 459^182.

19. Arlotto, T. Aspects of follicle and oocyte stage that affect in vitro maturation and development of bovine oocytes / T. Arlotto, J.L. Schwartz, N.L. First, M.L. Leibfried Rutledge // Theriogenology. 1996. -V. 45. -P. 943-956.

20. Armstrong, D.T. Effects of maternal age on oocyte developmentalcompetence / D.T. Armstrong // Theriogenology. 2001. -V. 55. -P. 1303-1322.

21. Beitner, R. Control of glycolytic enzymes through binding to cell structures and by glucose-1,6-bisphosphate under different conditions: the role of Ca2+ and calmodulin / R. Beitner // Int. J. Biochem. 1993. -V. 25. -P. 297-305.

22. Black, J.L. Oogenesis and ovarian development in the prenatal pig / J.L. Black, B.H. Erickson // Anatomical Record. -1968. -V. 161. P. 45-56.

23. Blondin, P. Manipulation of follicular development to produce developmentally competent bovine oocytes / P. Blondin, D. Bousquet, T. Hermenegilde, F. Barnes, M.A. Sirard // Biol. Reprod. 2002. -V. 66. -P. 38-43.

24. Blondin, P. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes / P. Blondin, M.A. Sirard // Mol. Reprod. Dev. 1995. -V. 41. -P. 54-62.

25. Boquest A.C. Production of cloned pigs from cultured fetal fibroblast cells / A.C. Boquest, C.G. Grupen , S J. Harrison , S.M. Mcllfatrick , R.J. Ashman, A.J. d'Apice , M.B. Nottle // Biol. Reprod. 2002. -V. 66. -N. 5. -P. 1283-1287.

26. Booth, P.J. The effect of oxygen tension on porcine embryonic development is dependent on embryo type / P.J. Booth, P. Holm, H. Callesen // Theriogenology. 2005. -V.63. -P. 2040-2052.

27. Briissow, K. P. Follicular and oocyte development in gilts of different age / K. P. Briissow, J. Ratky, H. Tomer, I. Egerszegi, F. Schneider, L. Solti, A. Tuchscherer // Acta Vet. Hung. -2002. -V. 50. -P. 101-110.

28. Calarco, P.G. Polarization of mitochondria in the unfertilized mouse oocyte / P.G. Calarco // Dev. Genet. 1995. -V. 16. -P. 36-43.

29. Camous, S. Plasma prolactin LH, FSH, and estrogen excretion patterns in gilts during sexual development / S. Camous, A. Prunier, J. Pelletier // J. Anim. Sci. -1985. -V. 60. -P. 1308-1317.

30. Campbell, A. Measurement of intracellular calcium ions and oxygen radicals in polymorphonuclear leucocyte-erythrocyte 'ghost' hybrids / A. Campbell, M.B. Hallett //J. Physiol. 1983. -V. 338. -P. 537-50.

31. Chakraborti, T. Mitochondria and calcium: from cell signalling to cell death / T. Chakraborti, S. Das, M. Mondal, S. Roychoudhury, S. Chakraborti // Cell. Signal. -1999. -V. 11. -N. 2. -P. 77-85.

32. Coleman, D. A. Factors affecting ovarian compensation after unilateral ovariectomy in gilts / D. A. Coleman, M. W. Fleming, R. A. Dailey // J. Anim. Sci. -1984. -V. 59. -P. 170-176.

33. Coy, P. Birth of piglets after transferring of in vitro-produced embryos pre-matured with R-roscovitine / P. Coy, R. Romar, S. Ruiz, S. Canovas, J. Gadea, F. Garcia Vazquez, C. Matas //Reproduction. 2005. -V. 129. -N. 6. -P. 747-755.

34. Cran, D.G. Cortical granules during oocyte maturation and fertilization / D.G. Cran // J. Reprod Fertil. 1989. -V. 38. -P. 49-62.

35. Dekel, N. Protein phosphorylation/dephosphorylation in the meiotic cell cycle of mammalian oocytes / N. Dekel // Reviews of Reproduction. -1996. — V. 1.- P. 82-88.

36. De Loos, F. Heterologous cell contacts and metabolic coupling in bovine cumulus oocyte complexes / F. De Loos, P. Kastrop, P. Van Maurik, Т.Н. Van Beneden, T.A.M. Kruip // Mol. Reprod. Dev. 1991. -V. 28. -P. 255-259.

37. De Loose, F. Structural aspect of bovine oocyte maturation in vitro/ F. De Loose, P. Van Maurik, T. Van Beneden, T.A. Kruip // Molecular Reproduction and Development. -1992. -V. 31. -P. 208-214.

38. De Rensis, F. Correlation between LH response to challenges with GnRH and naloxone during lactation, and LH secretion and follicular development after weaning in the sows/ F. De Rensis, G. R. Foxcroft // Anim. Reprod. Sci. -1999.-V. 56.-P. 143-152.

39. De Schepper, G.G. A cytochemical method for measuring enzyme activity in individual mouse oocytes / G.G. De Schepper, C.J. van Noorden, F. Koperdraad // J. Reprod Fert. 1985. -V. 74. -P. 709-716.

40. De Schepper, G.G. Age-related change of glucose-6-phosphate dehydrogenaseactivity in mouse oocytes / G.G. De Schepper, С.J. van Noorden, J.M. Houtkooper // Histochem J. 1987. -V. 19. -P. 467^170.

41. Di Zerega, G.S. Folliculogenesis in the primate ovarian cycle / G.S. Di Zerega, G.D. Hodgen // Endoc Rev. 1981. - V.2. -N. 1. -P. 27-49.

42. Downs, S. M. Culture conditions affect meiotic regulation in cumulus cell-enclosed mouse oocytes / S.M. Downs, A. M. Mastropolo // Mol. Reprod. Dev. 1997. -V. 46. - P. 551-566.

43. Driancourt, M.A. Effect of gonadotropin deprivation on follicular growth in gilts / M.A. Driancourt, A. Locatelli, A. Prunier // Reprod Nutr Dev. -1995. -V. 35. -P. 663-673.

44. Driancourt, M.A. Follicular dynamics in sheep and cattle / M.A. Driancourt // Theriogenology. 1991. -V. 35. -P. 55-68.

45. Dubuc, A. Effect of coculturing spermatozoa with oviductal cells on the incidence of polyspermy in pig in vitro fertilization / A. Dubuc, M.A. Sirard // Mol Reprod Dev. 1995. - V. 41. -N. 3. -P. 360-367.

46. Ducibella, T. Quantification and localization of cortical granules during oogenesis in the mouse / T. Ducibella, P. Duffy, J. Buetow // Biol Reprod. -1994.-V. 50.-P. 467-473.

47. Ducibella T. Changes in cell surface and cytoplasmic organization during early embryogenesis in preimplantation mouse embryo / T. Ducibella, T. Ukena, M. Kamovsky, E. Anderson // J. Cell Biol. -1977. -V. 74. -P. 153-157

48. Ducibella, T. Oocyte meiotic maturation and correlation with an egg-induced modification of the zone Pellucida / T. Ducibella, S. Kurasava, S. Rangarajan // Dev. Biol. -1990. V. 137. -P. 46-55.

49. Duranthon, V. The developmental competence of mammalian oocytes: a convenient but biologically fuzzy concept / V. Duranthon, J.P. Renard // Theriogenology. 2001. -V. 55. -P. 1277-1289.

50. Dvorak, M. Delivery after intrauterine embryo transfer obtained by fertilization and oocyte culture in vitro / M. Dvorak, J. Tesarik, P. Travnik, L. Pilka, P. Ventruba, K. Krejci, J. Soska // Cesk Gynekol. 1985. - V. 50. -N. 7. -P. 452-459.

51. Ebensperger, C. Changes at the hamster oocyte surface from the germinal vesicle stage to ovulation / C. Ebensperger, C. Barros // Gamete Res. — 1984.-V. 9.-P. 387-397.

52. Eppig, J.J. Development in vitro of mouse oocytes from primordial follicles / J.J. Eppig, M.J. O'Brien // Biology of Reproduction. -1996. -V. 54. P. 197-207.

53. Eppig, J.J. Coordination of nuclear and cytoplasmic oocyte maturation in eutherian mammals / J.J. Eppig // Reprod. Fertil. Dev. -1996. -V. 8. -N. 4. -P. 485-489.

54. Eppig, J.J. Relationship between the developmental programs controlling nuclear and cytoplasmic maturation of mouse oocytes / J.J. Eppig, R.M. Schultz, M. O'Brien, F. Chesnel // Developmental Biology. -1994. -V. 164. -P. 1-9.

55. Ericsson, S.A. Assessment of porcine oocytes using brilliant cresyl blue / S.A. Ericsson, M.L. Boice, H. Funahashi, B.N. Day // Theriogenology. -1993.-V. 39.-P. 214.

56. Esbenshade, К. L. Changes in plasma hormone concentrations associated with onset of puberty in the gilt / K. L. Esbenshade, A. M. Paterson, T. M. Cantley, B. N. Day // J. Anim. Sci. -1982. -V. 54. -P. 320-324.

57. Esbenshade, K. L. Ovarian response to pregnant mare serum gonadotropin and porcine pituitary extract in gilts actively immunized against gonadotropin releasing hormone / K. L. Esbenshade // J. Anim. Sci. -1987. -V. 65. -P. 1768-1774.

58. Fair, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity / T. Fair, P. Hyttel, T. Greve // Mol Reprod Dev. 1995. -V. 42. -P. 437-442.

59. Fortune, J.E. Follicular development: the role of the follicular microenvironment in selection of the dominant follicle / J.E. Fortune, G.M. Rivera, M.Y. Yang // J. Anim. Sci. 2004. -V.82-83. - P. 109-126.

60. Fortune, J.E. Ovarion follicular growth and development in mammals / J.E. Fortune // Biol: Reprod. 1994. - V. 50. - P. 225-232.

61. Fouladi-Nashta, A.A. Impact of dietary fatty acids on oocyte quality and development in lactating dairy cows / A.A. Fouladi-Nashta, C.G. Gutierrez, J.G. Gong, P.C. Garnsworthy, R. Webb // Biology of Reproduction. -2007. -V. 77. -P. 9-17.

62. Funahashi, H. Advances in in vitro production of pig embryos / H. Funahashi, B.N. Day // Journal of Reproduction and Fertility Supplement. -1997. -V. 52.-P. 271-283.

63. Funahashi, H. Effect of tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMP-1) on early development of swine oocytes matured and fertilized in vitro / H. Funahashi, E.W. Mclntush, M.F. Smith, B.N. Day // Theriogenology. -1997 b. -V. 47. -P. 277.

64. Funahashi, H. Low salt maturation medium enhances the histone HI kinase activity of porcine oocytes at the end of in vitro maturation / H. Funahashi, T.T. Stumpf, N.H. Kim, B. Day // Journal of Reproduction and Development. -1996.-V. 42.-P. 109-115.

65. Giacomello, M. Mitochondrial Ca2+ as a key regulator of cell life and death / M. Giacomello, I. Drago, P. Pizzo, T. Pozzan // Cell Death Differ. -2007. -V. 14.-N. 7.-P. 1267-1274.

66. Ginther, O. J. Major and minor follicular waves during the equine estrous cycle / O. J. Ginther // J. Equine Vet. Sci. -1993. -V. 13. -P. 18-25.

67. Gosden, R.G. Numbers of follicles and oocytes in mammalian ovaries and their allometric relationships / R.G. Gosden, E.E. Telfer // Journal of Zoology London. -1987. -V. 211. -P. 169-175.

68. Greenwald, G.S. Isolation and preliminary characterization of pig primordial follicles /G.S. Greenwald, R.M. Moor // Journal of Reproduction and Fertility. -1989. -V. 87. -P. 561-571.

69. Grupen, C.G. Cysteamine enhances in vitro development of porcine oocytes matured and fertilized in vitro / C.G. Grupen, H. Magashima, M.B. Nottle //Biology of Reproduction. -1995. -V. 53. -P. 173-178.

70. Guthrie, H. D. Effects of gonadotropin treatment on ovarian follicle growth and granulosa cell aromatase activity in prepuberal gilts / H. D. Guthrie, D. J. Bolt, B. S. Cooper // J. Anim. Sci. -1990. V. 68. -P. 3719-3726.

71. Guthrie, H. D. Follicular atresia in pigs: Measurement and physiology / H. D. Guthrie, R. W. Grimes, B. S. Cooper, J. M. Hammond // J. Anim. Sci. -1995. -V. 73. -P. 2834-2844.

72. Guthrie, H. D. The follicular phase in pigs: Follicle populations, circulating hormones, follicle factors and oocytes/ H. D. Guthrie // J. Anim. Sci. -2005. -V. 83. -P. 79-89.

73. Hagemann, L.J. Influence of the dominant follicle on oocytes from subordinate follicles / L.J. Hagemann // Theriogenology. -1999. —V. 51. —P. 449459.

74. Hansen, P.J. Realizing the promise of IVF in cattle--an overview / P.J. Hansen // Theriogenology. 2006. -V. 65. -N. 1. -P. 119-125.

75. Hickey, Т.Е. Interactions between androgen and growth factors in granulose cell subtypes of porsine antral follicles I Т.Е. Hickey, D.L. Marrocco, R.B. Gilchrist // Biol. Reprod. 2004. - V. 71. - P. 45-52.

76. Hirao, Y. In vitro growth and maturation of pig oocytes / Y. Hirao, T. Nagai, M. Kubo, T. Miyano, S. Kato // Journal of Reproduction and Fertility. -1994. -V. 100. -P. 333-339.

77. Hulshof S. C. J. Isolation and characterization of preantral follicles from foetal bovine obaries / S. C. J. Hulshof, J. L. Figueiredo, J. E. Beckers, M. M. Bevers, R. Vanden Hurk //Vet. Quartery. -1994. -V. 16. -P. 78-80.

78. Hunter, A.G. Stage dependent effects of inhibiting RNA and protein synthesis on meiotic maturation of bovine oocytes in vitro / A.G. Hunter, R.M. Moor // J. Dairy Sci. 1987. -V. 70. -P. 1646-1651.

79. Hunter, M. G. Histological evidence for heterogeneity in the development of preovulatory pig follicles / M. G. Hunter, S. A. Grant, G. R. Foxcroft // J. Reprod. Fertil. -1989. -V. 86. -P. 165-170.

80. Hunter, M. G. Evidence for and implications of follicular heterogeneity in pigs / M. G. Hunter, T. Wiesak // J. Reprod. Fertil. -1990. -V. 40. -P. 163-177.

81. Hunter, M. G. Oocyte maturation and ovum quality in pigs / M. G. Hunter // Reviews of Reproduction. 2000. -V. 5. -P. 122-130.

82. Hyttel, P. Oocyte growth, capacitation and final maturation in cattle / P. Hyttel, T. Fair, H. Callesen, T. Greve // Theriogenology. 1997. -V. 47. -P. 23-32.

83. Hyttel, P. Rapid method to prepare mammalian oocytes and embryos for transmission electron microscopy / P. Hyttel, I. Madsen // Acta Anat. 1987. — V. 129. -P. 12-14.

84. Hyttel, P. Ultrastructural features of preovulatory oocyte maturation in superovulated cattle / P. Hyttel, H. Callesen, T. Greve // J. Reprod. Fertil. 1986. — V. 76. -P. 645-656.

85. Hyttel, P. Ultrastructure of in-vitro oocyte maturation in cattle / P. Hyttel, K.P. Xu, S. Smith, T. Greve // J. Reprod Fertil. 1986. -V. 78. -P. 615625.

86. Ikeda, K. Effects of maturational age of porcine oocytes on the induction of activation and development in vitro following somatic cell nucleartransfer / К. Ikeda, Y. Takahashi // J. Vet Med Sci. 2001. -V. 63. -N. 9. -P. 1003-1008.

87. Inoue, M. Activation of mitogen-activated protein kinase during meiotic maturation in porcine oocytes / M. Inoue, K. Naito, F. Aoki, Y. Toyoda, E. Sato // Zygote. -1995. -V. 3. -P. 265-271.

88. Kaplan, G. rRNA accumulation and protein synthetic patterns in growing mouse oocyte / G. Kaplan, S.L. Albern, R. Bachvalova // J. Exp. Zool. -1982.-V. 220.-P. 361-370.

89. Kastrop, P.M. Changes in protein synthesis and phosphorylation patterns during bovine oocyte maturation in vitro / P.M. Kastrop, M.M. Bevers, O.H. Destree, T.A.M. Kruip // J. Reprod Fertil. 1990. -V. 90. -P. 305-310.

90. Kastrop, P.M. Protein synthesis and phosphorylation patterns of bovine oocytes maturing in vivo / P.M. Kastrop, M.M. Bevers, O.H. Destree, T.A.M. Kruip // Mol. Reprod. Dev. 1991. -V. 29. -P. 271-275.

91. Kikuchi, K. Histone HI kinase activity during in vitro fertilization of pig follicular oocytes matured in vitro / K. Kikuchi, K. Naito, F.P. Daen, Y. Izaike, Y. Toyoda//Theriogenology. -1995. -V. 43. -P. 523-532.

92. Kim, N.H. Microfilament assembly and cortical granule distribution during maturation, parthenogenetic activation and fertilisation in the porcine oocyte / N.H. Kim, B.N. Day, H.T. Lee, K.S. Chung // Zygote. 1996. -V. 4. -P. 145-149.

93. Kishida, R. In vitro maturation of porcine oocytes using a defined medium and developmental capacity after intracytoplasmic sperm injection / R. Kishida, E.S. Lee, Y. Fukui // Theriogenology. 2004. -V. 62. -P. 1663-1676.

94. Knox, R. V. Plasma gonadotropins and ovarian hormones during the estrous cycle in high compared to low ovulation rate gilts / R. V. Knox, G. Vatzias, С. H. Naber, D. R. Zimmerman // J. Anim. Sci. -2003. -V. 81. -P. 249-260.

95. Krieger, С. Mitochondria, Ca2+, and neurodegenerative disease / C. Krieger, M. Duchen // Eur. J. Pharm. -2002. -V. 447. -P. 177-188.

96. Krisher, R.L. The effect of oocyte quality on development / R.L. Krisher // Journal of Animal Science. -2004. -V. 82. -P. 14-23.

97. Kruip, T. Structural changes in bovine oocytes during final maturation in vitro / T. Kruip, D. Cran, T. Van Beneden, S. Dieleman // Gam.Res. — 1983. -V. 8. -P. 29-47.

98. Kubelka, M. Time sequence of germinal vesicle breakdown in pig oocytes after cycloheximide and p-aminobenzamidine block / M. Kubelka, J. Motlik, J.J. Fulka, R. Prochazka, Z. Rimkevikova, J. Fulka // Gam. Res. 1988. -V. 19.-P. 423-431.

99. Kuzmina, T.I. Effect of prolactin on intracellular stored calcium in the course of bovine oocyte maturation in vitro / Т. I. Kuzmina, I.Yu. Lebedeva, H. Tomer, H. Aim, V.Yu. Denisenko // Theriogenology. 1999. - V.51. -N.7. -P.1363-1374.

100. Kuzmina, T.I. Mitochondrial activity during the maturation of bovine oocytes in vitro / T.I. Kuzmina, L.D. Galieva, E.D. Fedoskov, L.D. Ignatenko // Reprod. Dom. Anim. 1998. -V. 33. -P. 149.

101. Laurincik, J. Bovine cumulus expansion and corona-oocyte disconnection during culture in vitro / J. Laurincik, P. Kroslak, P. Hyttel, J. Pivko, A.V. Sirotkin//Reprod. Nutr. Dev. 1992. -V. 32. -P. 151-161.

102. Levesque, J.T. Resumption of meiosis is initiated by the accumulation of cyclin В in bovine oocytes / J.T. Levesque, M.A. Sirard // Biol. Reprod. 1996. -V. 55. -P. 1427-1436.

103. Li, C.J. Changes in the 3-dimentional distribution of mitochondria during meioticdivisions of mouse oocytes / C.J. Li, B.Q. Fan // Theriogenology. -1997.-V. 48.-P. 33-41.

104. Lonergan, P. Development of bovine embryos in vitro following oocyte maturation under defined conditions / P. Lonergan, C. Carolan, P. Mermillod // Reprod. Nutr. Dev. 1994a. -V. 34. -P. 329-339.

105. Lucy, M. С. Ovarian follicular growth in sows/ M. C. Lucy, J. Liu, C. K. Boyd, C. J. Bracken // Reprod. Suppl. 2001. -V. 58. -P. 31-45.

106. Machatkova', M. Developmental competence of bovine oocytes: effects of follicle size and the phase of follicular wave on in vitro embryo production / M. Machatkova, K. Krausova, E. Jokesova, M. Tomanek // Theriogenology. -2004. -V. 61. -P. 329-335.

107. Machaty, Z. Developmental changes in the intracellular Ca2+ release mechanisms in porcine oocytes / Z. Machaty, H. Funahashi, B.N. Day, R.S. Prather // Biol. Reprod. -1997. -V. 56. -N. 4. -P. 921-930.

108. Madison, V. Selection of immature bovine oocytes for developmental potential in vitro / V. Madison, B. Avery, T. Greve // Animal Reproduction Science. -1992. -V. 27. -P. 1-11.

109. Magnia, F. Biochemistry of growth and maturation in mammalian oocytes / F. Magnia, R. Canipari // Development in Mammals / Ed. Johson M. Amsterdam. - 1977. - V. 2. - P. 1-30.

110. Mangia, F. Biochemical studies of growing mouse oocytes: preparation of oocytes and analysis of glucose-6-phosphate dehydrogenase and lactate dehydrogenase activities / F. Mangia, C.J. Epstein // Dev. Biol. — 1975. -V. 45.-P. 211-220.

111. Manjunatha, B.M. Selection of developmentally competent buffalo oocytes by brilliant cresyl blue staining before IVM / B.M. Manjunatha, P.S. Gupta, M. Devaraj, J.P. Ravindra, S. Nandi // Theriogenology. -2007. -V. 68. -P. 1299-1304.

112. Mao, J. Reproductive, metabolic, and endocrine responses to feed restriction and GnRH treatment in primiparous, lactating sows / J. Mao, L. J. Zak, J. R. Cosgrove, S. Shostak, G. R. Foxcroft // J. Anim. Sci. -1999. -V. 77. -P. 724735.

113. Marchal, R. Meiotic and developmental competence of prepubertal and adult swine oocytes /R. Marchal, J.M. Feugang, C. Perreau, E. Venturi, M. Terqui, P. Mermillod // Theriogenology. 2001. -V. 56. -N. 1. -P. 17-29.

114. Masui, Y. Cytoplasmik control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes / Y. Masui, K. Clarke // J. exp. Zool. — 1971.-V. 177.-P. 129-146.

115. Matas, C. In vitro penetration assay of boar sperm fertility: effect of various factors on the penetrability of immature pig oocytes / C. Matas, E. Martinez, J.M. Vazquez, J. Roca, J. Gadea // Theriogenology. -1996. -V. 46. -P. 503-513.

116. Mattioli, M. Effect of follicle somatic cells during pig oocyte maturation on egg penetration and male pronuclear formation / M. Mattioli, G. Galeati, E. Seren // Gamete Research. -1988. -V. 20. -P. 177-183.

117. Mattioli, M. Follicular factors influence oocyte fertilizability by modulating the intercellular co-operation between cumulus cells and oocytes / M. Mattioli, G. Galeati, M.L. Bacci, E. Seren // Gamete Research. -1988. -V. 21. -P. 223-232.

118. Mattioli, M. Concentration of cyclic AMF during the maturation pig oocyte in vitro and in vivo / M. Mattioli, G. Galeati, B. Barboni, E. Seren // J. Reprod. and Fertility. 1994. - V. 100. - P. 403-409.

119. Mauleon, P. Ovarian development in young mammals / P. Mauleon, D.B. Crighton // In Control of Ovulation/ Ed. by Crighton D.B. Butterworths, London. - 1978.-P. 141-158.

120. May-Panloup, P. Spermatozoon mitochondrial DNA / P. May-Panloup, M.F. Chretien, Y. Malthiery, P. Reynier // Gynecol Obstet Fertil. 2006. -V. 34. -N. 9. -P. 847-854.

121. McLaren, A. The embryo / A. McLaren//Reproduction in Mammals / Eds. Austin C., Short R. Cambridge. - 1982. - P. 1-25.

122. Mehlman, L. Redistribution and increase in cortical inositol 1,4,5-trisphostphate receptors after meiotic maturation of the mouse oocyte / L. Mehlman, K. Mikoshiba, D. Kline // Dev. Biol. -1996. -V. 180. -P. 489-498.

123. Mehlman, L.M. Stop and starts in mammalian oocytes: recent advances in understanding the regulation of meiotic arrest and oocyte maturation / L.M. Mehlman // Reporduction. 2005. - V. 130. - P. 797-799.

124. Merry, N.E. Cytoskeletal organization in the oocyte, zygote, and early cleaving embryo of stripe-faced dunnart (Sminthopsis macroura) / N.E. Merry, M.H. Johnson, C.A. Gehring, L. Selwood // Mol. Reprod. Dev. 1995. - V. 41. -P. 212-224.

125. Miyoshi, K. Utility of rapidly matured oocytes as recipients for production of cloned embryos from somatic cells in the pig / K. Miyoshi, S.J. Rzucidlo, S.L. Pratt, S.L.Stice // Biol. Reprod. 2002. -V. 67. -N. 2. -P. 540-545.

126. Moor, R.M. Maturation of pig oocytes in vivo and in vitro / R.M. Moor, M. Mattioli, J. Ding, T. Nagai // Journal of Reproduction and Fertility Supplement. -1990. -V. 40. -P. 197-210.

127. Moor, R.M. Regulation of oocyte maturation in mammals / R.M. Moor, G.M. Warnes // In Control of Ovulation / Eds. by Crighton D.B. et al. -Butterworths, London. 1978. -P. 159-176.

128. Moore, G. cAMF in mammalian follicies cells and oocytes during maturation/ G. Moore, J. Crosby // J. Exp. -1981.-V. 216. -P. 205-209.

129. Moore, G. Intercellular coupling in mammalian oocytes / G. Moore, D.G. Cran // Development in Mammals / Ed. M.N Johnson. 1980. - V. 4. -P. 3-37.

130. Morbeck, D.E. Kinetics of follicle growth in the prepubertal gilt / D.E. Morbeck, K.L. Esbenshade, W.L. Flowers, J.H. Britt // Biology of Reproduction. -1992.-V. 47.-P. 485-491.

131. Motlik, J. Breakdown of the germinal vesicle in pig oocytes in vivo and in vitro / J. Motlik, J. Fulka // Journal of Experimental Zoology. -1976. -V. 198.-P. 155-162.

132. Motlik, J. Factors affecting meiotic competence in pig oocytes / J. Motlik, J. Fulka// Theriogenology. -1986. -V. 25. -P. 87-96.

133. Motlik, J. Meiotic competence in vitro of pig oocytes isolated from early antral follicles / J. Motlik, N. Crozet, J. Fulka // Journal of Reproduction and Fertility. -1984. -V. 72. -P. 323-328.

134. Murphy, B. D. Formation and early development of the corpus luteum in pigs / B. D. Murphy, N. Gevry, T. Ruiz-Cortes, F. Cote, B. R. Downey, J. Sirois //Reprod. Suppl. -2001. -V. 58. -P. 47-63.

135. Naito, K. Comparison of histone HI kinase activity during meiotic maturation between two types of porcine oocytes matured in different media in vitro / K. Naito, F.P. Daen, Y. Toyoda 11 Biology of Reproduction. -1992. -V. 47. -P. 43-47.

136. Naito, K. Fluctuation of histone HI kinase activity during meiotic maturation in pig oocytes/ K. Naito, Y. Toyoda // Journal of Reproduction and Fertility. -1991. -V. 93. -P. 467-473.

137. Newton, H. In vitro growth of oocyte- granulosa cell complexes isolated from cryopreserved ovine tissue / H. Newton, H. Picton, R.G. Gosden // Journal of Reproducetion and Fertility. -1999. -V. 115. -P. 141-150.

138. Nishi, Y. Change of the mitochondrial distribution in mouse ooplasm during in vitro maturation / Y. Nishi, T. Takeshita, K. Sato, T. Araki // J. Nippon Med. Sch. -2003. -V. 70. -N. 5. -P. 408-415.

139. Niwa, K. Effectiveness of in vitro maturation and in vitro fertilization techniques in pigs / K. Niwa // Journal of Reproduction and Fertility Supplement. -1993.-V. 48.-P. 49-59.

140. Okada, A. Development of a cortical granule-free area of cortex and the perivitelline space in the hamster oocyte during maturation and following ovulation / A. Okada, R. Yanagimachi, H. Yanagimachi // J. Submicrosc. Cytol. — 1986.-V. 18.-P. 233-247.

141. Oxender, W.D. Ovarian development in fetal and prepubertal pigs / W.D. Oxender, B. Colenbrander, D.M. van de Wiel, C.G. Wensing // Biology of Reproduction. -1979. -V. 21. -P. 715-721.

142. Perreault, S.D. Importance of glutathione in the acquisition and maintenance of sperm nuclear decondensing activity in maturing hamster, oocytes / S.D. Perreault, R.R. Barbee, V.L. Slott // Dev. Biol. 1988. -V. 125. -P. 181-186.

143. Petters, R.M. Culture of pig embryos / R.M. Petters, K.D. Wells // J. Reprod Fertil Suppl. -1993. -V.48. -P.61-73.

144. Plancha, C.E. Protein synthesis requirement during resumption of meiosis in the hamster oocyte: early nuclear and microtubule configuration / C.E. Plancha, D.F. Albertini //Mol. Rewprod. Dev. 1992. - V. 33. -P. 324-334.

145. Plancha, C.E. Cytokeratin dinamics during oocyte maturation in the hamster requires reaching of metafase I / C.E. Plancha // Differentiation. 1996. -V. 60. -P. 87-98.

146. Prather R.S. Transgenic swine for biomedicine and agriculture / R.S. Prather, R.J. Hawley, D.B. Carter, L. Lai, J.L. Greenstein // Theriogenology. -2003.-V. 59.-N. l.-P. 115-123.

147. Prunier, A. Patterns of plasma LH, FSH, oestradiol and corticosteroids from birth to the first oestrous cycle in Meishan gilts / A. Prunier, M. Chopineau, A. M. Mounier, P. Mormede //J. Reprod. Fertil. -1993. -V. 98. -P. 313-319.

148. Pujol, M. Developmental competence of heifers oocytes selected using the brilliant cresyl blue (BCB) test / M. Pujol, M. Lopez-Bejar, M.T. Paramio // Theriogenology. 2004. -V. 61. -P. 735-744.

149. Rajakoski, E. The follicular system in sexually mature heifers with special reference to seasonal, cyclical and left-right variations / E. Rajakoski // Acta Endocrinol. 1960. -V. 52. -P. 1-68.

150. Ratky, J. Ovarian activity in gilts including some characteristics of a native breed / J. Ratky, K. P. Brussow // Reprod. Dom. Anim. -1998. -V. 33. -P. 219-222.

151. Roca, J. Selection of immature pig oocytes for homologous in vitro penetration assays with brilliant cresyl blue test / J. Roca, E. Martinez, J.M. Vazquez, X. Lucas // Reprod. Fert. Dev. 1998. -V. 10. -P. 479-485.

152. Rodgers R. J. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid / R.J. Rodgers, Irving-Rodgers H.F. // Biol. Reprod. -2010. V. 82. -N. 6. -P. 1021-1029.

153. Rodri'guez-Gonza'lez, E. Selection of prepuberal goat oocytes using the brilliant cresyl blue test / E. Rodri'guez-Gonza'lez, M. Lopez-Be'jar, E. Velilla, M.T. Paramio // Theriogenology. -2002. -V. 57. -P. 1397-1409.

154. Schwarz, T. Growth of the ovarian follicles in the oestrous cycle in goats in Polish. / T. Schwarz, E. Wierzchos // Medycyna Wet. -2000. -V. 56. -P. 194-197.

155. Schwarz, T. Physiological mechanisms of ovarian follicular growth in pigs / T. Schwarz, M. Kopyra, J. Nowicki // Acta Veterinaria Hungarica. -2008. -V. 56.-N. 3.-P. 369-378.

156. Shamsuddin, M. Maturation-related changes in bovine oocytes under different culture conditions / M. Shamsuddin, B. Larsson, H. Rodriguez-Martinez // Anim. Reprod. Sci. 1993. -V. 31. -P. 49-60.

157. Shea, B.F. Human follicular oocytes and their maturation in vitro/ B.F. Shea, R.D. Baker, J.P. Latour // Fertility and Sterility. -1975. -V. 26. -P. 1075-1082.

158. Shen, X. In vitro antrum formation of oocyte-cumulus-granulosa cell complexes from pig early antral follicles / X. Shen, K. Hirata, T. Miyano, S. Kato // Journal of Mammalian Ova Research. -1997. -V. 14. -P. 183-190.

159. Sirard, M.A. Contribution of the oocyte to embryo quality / M.A. Sirard, F. Richard, P. Blondin, C. Robert // Theriogenology. -2006. -V. 65. -P. 126-136.

160. Sirard, M.A. Follicle-oocyte-sperm interactions in vivo and in vitro in pigs / M.A. Sirard, A. Dubuc, D. Bolamba, Y. Zheng, K. Coenen // Journal of Reproduction and Fertility Supplement. -1993. -V. 48. -P. 3-16.

161. Sirard, M.A. The culture of bovine oocytes to obtain developmentally competent embryos / M.A. Sirard, J.J. Parrish, C.B. Ware, M.L. Leibfried-Rutledge, N.L. First // Biol. Reprod. 1988. -V. 39. -P. 546-552.

162. Sirard, M.A. Timing of nuclear progression and protein synthesis necessary for meiotic maturation of bovine oocytes / M.A. Sirard, H.M. Florman, M.L. Leibfried-Rutledge, F.L. Barnes, M.L. Sims, N.L. First // Biol. Reprod. -1989. -V. 40. -P. 1257-1263.

163. Sirard, M.A. From biological fundamentals to practice, and back / M.A. Sirard // Theriogenology. 2007. -V. 68. -P. 250-256.

164. Smith, M.F. Production of tissue inhibitor of metalloproteinases 1 by porcine follicular and luteal cells / M.F. Smith, C.N. Kemper, G.W. Smith, T.L. Goetz, V.L. Jarrell // Journal of Animal Science. -1994. -V. 72. -P. 1004-1012.

165. Sorensen, R.A. Relationship between growth and meiotic maturation of the mouse oocyte / R.A. Sorensen, P.M. Wassarman // Dev. Biol. 1976. —V. 50.-P. 531-536.

166. Sutovsky, P. Dynamic changes of gap junctions and cytoskeleton during in vitro culture of cattle oocyte cumulus complexes / P. Sutovsky, J.E. Flechon, B. Flechon, J. Motlik, N. Peynot, P. Chesne // Biol. Reprod. 1993. -V. 49. -P. 1277-1287.

167. Szollosi, D. The nuclear envelope: its breakdown and fate in mammalian oogonia and oocytes / D. Szollosi, P. Calarco, R. Donahue // Anat. Rec. 1972. -V. 174. -N.3. -P. 325-339.

168. Szybek, K. In vitro maturation of oocyte from sexually inmmaturemice / K. Szybek // J. Endocrinol. 1972. -V. 54. -P. 527-528.

169. Tarkowski, A. An air-diying method for chromosomal preparation from mouse eggs / A. Tarkowski // Cytogenetic. 1966. — V. 1. -P. 394-400.

170. Tsafriri, A. Influence of follicular maturation and culture conditions on the meiosis of pig oocytes in vitro / A. Tsafriri, C.P. Channing // J. Reprod. Fertil. 1975. -V. 43. -P. 149-152.

171. Tsuma, V. T. Hormones profiles around weaning in cyclic and anoestrous sows/ V. T. Tsuma, S. Einarsson, A. Madej, N. Lundeheim // J. Vet. Med. A. -1995. -V. 42. -P. 153-163.

172. Tsutsumi, O. Determination of enzyme activity of energy metabolism in the maturing rat oocyte / O. Tsutsumi, K. Satoh, Y. Taketani, T. Kato // Mol. Reprod. Dev. 1992. -V. 33. -P. 333-337.

173. Urdaneta, A. Effect of the addition of glutathione and glucose to the culture medium on embryo development of IVM-IVF prepuberal goat oocytes / A. Urdaneta, A.R. Jime'nez, D. Izquierdo, M.T. Paramio // Zygote. 2003. -V. 11. — P. 131-138.

174. Van Blerkom, J. Morphodynamics of nuclear and cytoplasmic reorganization during the resumption of arrested meiosis in the mouse oocyte / J. Van Blerkom //Prog Clin Biol Res. 1989. -V. 294. -P. 33-51.

175. Van Blerkom, J. Microtubule mediation of cytoplasmic and nuclear maturation during the early stages of resumed meiosis in cultured mouse oocytes / J. Van Blerkom // Proc Natl Acad Sci USA.- 1991. -V. 88. -N. 11. -P. 50315035.

176. Van Blerkom, J. Mitochondria in human oogenesis and preimplantation embryogenesis: engines of metabolism, ionic regulation and developmental competence / J. Van Blerkom // Reproduction. -2004. -V. 128. -P. 269-280.

177. Van Blerkom, J. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochodrial donation and the issue of heteroplasmy / J. Van Blerkom, J. Sinclair, P. Davis // Human Reproduction. -1998. -V. 13. -P. 28572868.

178. Van Blerkom, J. Mitochondrial reorganization during resumption of arrested meiosis in mouse oocyte/ J. Van Blerkom, M.N. Runner // Am. J. Anat. -1984. -V. 171.-P. 335-355.

179. Van Blerkom, J. Molecular differentiation of the rabbit ovum. III. Fertilization-autonomous polypeptide synthesis / J. Van Blerkom // Dev. Biol. -1979. -V. 72. -N. 1. -P. 188-194.

180. Van de Wiel, D. F. Post-weaning anoestrus in primiparous sows: LH patterns and effect of gonadotropin injection and boar exposure / D. F. van de Wiel, P. Booman// Vet. Quart. -1993. -V. 15. -P. 162-166.

181. Vassena, R. Morphology and developmental competence of bovine oocytes relative to follicular status / R. Vassena, R.J. Mapletoft, S. Allodi, J. Singh, G.P. Adams // Theriogenology. -2003. -V. 60. -P. 923-932.

182. Wai T. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility / T. Wai, A. Ao, X. Zhang, D. Cyr, D. Dufort, E. A. Shoubridge // Biol. Reprod. -2010. -online.

183. Wang, L. Mitochondrial functions on oocytes and preimplantation embryos / L. Wang, D. Wang, X. Zou, C. Xu // J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2009. -V. 10. -N. 7. -P. 483-492.

184. Wassarman, M. The mammalian ovum // The physiology of reproduction / Ed. by Knobil E., Neil D. New York, USA Raven Press. - 1988. -V. l.-P. 69-102.

185. Wehrend, A. The meiotic cell cycle in oocytes of domestic animals / A. Wehrend, B. Meinecke // Reproduction in Domestic Animals. -1998. -V. 33. -P. 289-297.

186. Wickramasinghe, D. Cell cycle control during mammalian oogenesis / D. Wickramasinghe, D.F. Albertini // Curr. Top. Dev. Biol. 1993. -V. 28. -P. 125-153.

187. Wilding, M. Mitochondrial aggregation patterns and activity in human oocytes and preimplantation embryos / M. Wilding, B. Dale, M. Marino, L. diMotteo, C. Alviggi, M.L. Pisaturo, L. Lombardi, G. De Placido // Hum. Reprod. -2001. -V. 16.-P. 909-917.

188. Willis, P. Fine structure of equine oocyte maqtured in vitro for 24 hours / P. Willis, A.B. Caudle, R.A. Fayrer-Hosken // Mol. Reprod. Dev. 1984. -V. 37. -P. 87-92.

189. Windsor, D.P. Assessment of ram sperm mitochondrial function by quantitative determination of sperm rhodamine 123 accumulation / D.P. Windsor, I.G. White // Molecular reproduction and development. 1993. - V.36. - P. 354360.

190. Yen, H. W. Follicular development and maturation in gilts selected for an index of high ovulation rate and high prenatal survival/ H. W. Yen, J. J. Ford, D. R. Zimmerman, R. K. Johnson // J. Anim. Sci. -2005. -V. 83. -P. 130-135.

191. Yoshida, M. Role of glutathione in the maturation and fertilization of pig oocytes in vitro / M. Yoshida // Molecular Reproduction and Development. -1993.-V. 35.-P. 76-81.

192. Zamboni, L. Fine morphology of the follicle wall and follicle cell-oocyte association / L. Zamboni // Biol. Reprod. 1974. -V. 10. -P. 125-149.

193. Zeuner, A. Apoptosis within bovine follicular cells and its effect on oocyte development during in vitro maturation /А. Zeuner, K. Miiller, K. Reguszynski, K. Jewgenow // Theriogenology. -2003. -V. 59. P. 1421-1433.

194. Zhang, L. Cumulus cell function during bovine oocyte maturation, fertilization, and embryo development in vitro / L. Zhang, S. Jiang, P.J. Wozniak, X. Yang, R.A. Godke // Mol. Reprod. Dev. 1995. -V. 40. -P. 338-344.

195. Zi^ba, D. A. Pattern of follicular development in high fecundity Olkuska ewes during the estrous cycle / D. A. Zi^ba, M. Murawski, T. Schwarz, E. Wierzchos // Reprod. Biol. -2002. -V. 2. -P; 39-58.

196. Zuccotti, M. Chromatin organization during mouse oocyte growth / M. Zuccotti, A. Piccinelli, P.G. Rossi, S. Garagna, C.A. Redi // Mol. Reprod. Dev. 1995. -V. 41. -P. 479-485.

Информация о работе

Мурза, Галина Валерьевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург-Пушкин, 2010
ВАК 06.02.07

Диссертация

Оценка биологической полноценности ооцитов свиней на основе маркеров ядерно-цитоплазматического созревания - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы