Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетические и биохимические аспекты мейоза и оплодотворения ооцитов коров in vitro

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетические и биохимические аспекты мейоза и оплодотворения ооцитов коров in vitro"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

рг ^д______ _______________ ____________________На правах рукописи

1 U ДЛИ <ппо

КУЗЬМИНА

Татьяна Ивановна

УДК 636.2:591.391.2

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МЕЙОЗА И ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ООЦИТОВ КОРОВ IN VITRO

Специальность: 03.00.15 — Генетика

Л В 1 О РЕФ ЕРА)

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

1903

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных.

Научные консультанты — академик РАСХН Л. К. Эрнст; академик Петровской АНИ А. К. Голубев.

Официальные оппоненты: академик РБА, доктор биологических наук, профессор А. Ф. Яковлев; доктор медицинских наук, профессор А. И. Никитин; доктор биологических наук, профессор А. И. Жигачев.

Ведущее научное учреждение — Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства.

Защита диссертации состоится1993 года в ^^ час. ео- мил. на заседании Специализированного совета Д.020.07.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкин, Московское шоссе, 55а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

1993 года.

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор с.-х. наук, профессор

Ж. Г. Логинов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОШ

Актуальность темы. Использование биотехнологических методов в репродукции крупного рогатого скота обуславливает необходи -мость детального изучения процессов мейоэа, оплодотворения и

-раннего эмбрионального развития. Шогие фундаментальные иссле------------------------

дования проведены на лабораторных животных. Однако, экстрапо -дяция этих данных на домашних животных зачастую затруднительна и даже ошибочна. В последние годы достигнуты значительные успехи в использовании технологии пересадки эмбрионов при совершенствовании сельскохозяйственных животных. Активизируются иссле -дования, связанные с возможностью получения ценных сельскохо -зяйственных животных путем манипуляций с ранними зародышами дня создания химер и трансгенных эмбрионов с. уникальным генотипом особей, отличающихся высокой продуктивностью, устойчивостью к стрессам и заболеваниям.

Исходным моментом во всех этих исследованиях является нали -чиа d достаточном количестве эмбрионов, ооцитов и зигот. Вот почецу получила большое распространение-технология оплодотворения ооцитов, созревших вне организма. В ее основе лежит возможность получения эмбрионов иэ ооцитов, выделенных из яичников коров, выбракованных по каким-то причинам и убитых на мясоком -бинате. Перспективность такого подхода к решении проблемы показана в опытах по выращиванию вне организма зародышей, иэ кото -рых при последующей пересадке реципиентам было получено потом -ство (Эрнст Л.К. и др. 1983, 1992, Lu, Gordon 1989).

Возможность получения эмбрионов коров иэ созревших вне организма яйцеклеток представляет не только коммерческий интерес, но и является удобной базой для разработок методов генетической и клеточной инженерии. В то же время дозревание и оплодотворе -ние ооцитов in ^Проявляется одной из самых удачных моделей изучения завершающих этапов мейоза и раннего эмбриогенеза мле -копитшощих.

В настоячее время разработаны методы, позволяющие получать достаточно высокий процент ооцитов на стадии метафазы -П, однако, при последующем оплодотворении лишь треть из них развива -ется до стадии морулы и бластоцисты (Borg ir, Brem,1987).

Успех культивирования зависит от многочисленных факторов, из которых одним из самых важных является создание системы культивирования, обеспечивающей полноценное дозревание ооцитов, компетентных к оплодотворению и дальнейшему развитию в эмбрионы. Понятно, что моделирование процессов нуклеарного и цитоплазма-тического созреваний ооцитов, оплодотворения и раннего эмбриогенеза становится возможным на основе познания механизмов мей-' оза в оогенезе крупного рогатого скота. Однако, многие вопро -сы регуляторных механизмов мейоза и раннего эмбриогенеза до сих пор окончательно не выяснены. Так, остается открытым вопрос о причине ингибирования созревания ооцитов, хотя найден целый ряд веществ, получивших общее название ИСО (ингибиторы созревания ооцитов), природа которых являемся объектом исследования. Немногочисленны и противоречивы данные, касающиеся изучения асинхронности ядерного и цитоплазматического созревания яйце -клеток. Гипотезируются причины низкого выхода эмбрионов на стадиях бластоцисты.

Заманчивая идея использования огромного запаса ооцитов, содержащегося в яичниках убитых животных, до сих пор не стала реальностью, так как данные по получению эмбрионов от' индивиду -ольных животных свидетельствуют о малом выходе качественных ооцитов у отдельных особей. (Borg.Bram ,1990, Эрнст, Прокофьев и др.199^).

Необходимость в получении новых углубленных знаний, касающихся биохимических и цитоген'етических особенностей мейоза и раннего эмбриогенеза обусловили направление наших исследований.

Цель и задачи исследований. Выяснить и уточнить особенное -ти мейоза у коров на основе использования различных моделей дозревания и оплодотворения ооцитов вне организма и разработать цлтоморфофункциональные критерии оценки качества ооцит-кумулюс-ннх комплексов.. Стандартизировать отдельные этапы технологии созревания и оплодотворения ооцитов 111 vitro , Для достижения цели решались следующие задачи:

- изучить влияние гомологичной фолликулярной жидкости (Ш) и ео пептидов на дайоэ и оплодотворяемость ооцитов крупного рогатого скста;

- определить временные параметры мейотических преобразований хромосом в ооцитах при их культивировании в системах с ис -пользованием структурных элементов фолликула, ФЖ и ее пептидов;

_________- выявить эффект ФЖ,-ее пептидов и некоторых-фактороврос~-------------------

та на синтез ДНК в клетках гранулезы;

- исследовать характер ооцит-куцулюсных взаимодействий при созревании ооцитов в различных культуральных системах;

- разработать количественные морфофункциональные критерии оценки качества ооцит-кумулюсных комплексов и тканей фолликулов;

- изучить потенции к развитию в эмбрионы ооцитов, прокультивированных в различных культуральных системах;

- показать возможность прогнозирования степени компетентности исследуемых ооцитов к оплодотворению и дальнейшему развитию

в эмбрионы на основе разработанного комплексного теста качества ооцитов, включающего цитоморфологическуга характеристику ооцит -ку^люсного комплекса и определения функционального состояния ооцита.

Научная новизна и практическая значимость работы. Работа имеет фундаментально-прикладное значение и представляет первое всестороннее, комплексное исследование мейоза и оплодотворения

ооцитов коров на основе сравнительного анализа различных моде -лей созревания яйцеклеток крупного рогатого скота вне организма. Полученные данные представляют научную основу для работ в области технологии оплодотворения хп угЬп} клеточной и генетической инженерии. В работе впервые:

- установлено преимущество систем дозревания ооцитов, основанных на использовании структурных элементов фолликула, ФЖ и ее белков;

- разработан комплексный тест оценки качества ооцит-кумулюсных комплексов по яцерно-цитоплазматическому состоянию ооцита и

цитйморфологической характеристике окружащцих его кумулюсных клеток. (Положительное решение на изобретение №140702 );

- продемонстрирована возможность стандартизации условий культивирования за счет исключения сыворотки из среды дозревания ооцитов и использования вместо нее высокомолекулярных белков фолликулярной жидкости (£УМ). (Полаяштельное решение на изобретение № 132304 );

- выявлен положительный эффект катионкых белков ФЖ (молекулярной -массой от 60 до 90 цЦа) и катионного мозгового нейрит-стимулирующего белка /МНСБ/ (молекулярной массой 15 кДа) на мейоз ооцитов коров. (Авт.свид.№ 1659474);

- показано, что деструктивным изменениям в фолликулярных клетках сопутствуют нарушения механизмов транспорта электронов в дыхательной цепи;

- выявлены различные потенции ооцитов к партеногенетическо-му развитию в зависимости от условий их дозревания;

- разработаны модели внефолликулярного дозревания ооцитов, основанные на использовании ткани фолли«ула и (приоритет -нал справка № 5064958 ).

Апробация работы.. Материалы диссертационной работы доложены на ХХШ международной конференции ЕАЖ (Ленинград, 1982 г.), на I Всесоюзной конференции по цитогенетике с.-х. животных (Ленинград, 1985 г.), на Всесоюзном совещании "Трансплантация эмбрионов с.-х.животных" (Алма-Ата, 1989 г.), на научно-методическом совещании "Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота" (Жодино - 1989 г.), на Всесоюзном совещании "Фундамен -тальное и практическое применение в медицине с.-х. достижений биотехнологии" (Тарту, 1986 г.), научном семинаре "Использова -ние современных методов исследований в биологии" (Ленинград -Пушкин, 1988 г.) на Всесоюзной научно-технической конференции "Применение биотехнологии в животноводстве, растениеводстве, ветеринарии, медицине" (Ленинград, 1988 г.), Всесоюзной научной конференции "Физиология продуктивных животных - решению Продовольственной программы СССР" (Тарту - 1989), Международном симпозиуме "Через ооцит к эмбриону" (Чехословакия, 1990 г.), Бее--союзном совещании "Проблеуш развития биотехнологии в животно -водстве" (Москва, Дубровицы, 1990г.), научно-производственной конференции "Новые метода селекции и биотехнологии в животноводстве" (Киев, 1991), Российско-германском симпозиуме "Достиже -ния биотехнологии в животноводстве" (Москва .Дубровицы, 1992г.).,

Публикации. По теме диссертации опубликовано 38 работ,

Обьем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и предложений, списка

использованной литературы, включающего 256 источников, в т.ч. 199 иностранных. Работа изложена на <!47 страницах машинописного текста и содержит 2.-5" рисунков и таблиц.

-------------------МАТЕРИАЛЫ И - МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ---------------------------------------------

Работа выполнена с применением современных морфологических, гистологических, цитологических, цитогенетических, генетических, биохимических, биофизических и биотехнологических методов.

В экспериментах использовали реактивы и биопрепараты отече-^' ственного и импортного производства, а также ФЖ и ее белки, которые выделяли из фолликулов методом ono et ail (1986) с после -дующим фракционированием и гель-фильтрацией. В исследованиях использовали фракции БШ£ молекулярной массой от 5 до 15 кДа, по -лученные в сотрудничестве с коллегой из лаборатории химии белка С.-Петербургского Государственного университета Гойло Т.А. и сотрудником НИЦЫ (ФРГ) Мартином Гёце. Фракцию катионных белков из Ш получали путем экстракции 5% НС 10^ (Гончарова,Романюк и др.1987г.).

Электрофорез белков проводили в полиакрюташдном геле ne методу Корнберга (1975). Концентрацию белка в пробах определяли

по методу Лоури (1961 г.).

Объектом исследования служили овариальные ткани, ФЖ и ооцит-кумулюсные комплексы крупного рогатого скота черно-пестрой породы. При получении материала для исследований учитывали возраст животного, физиологическое состояние генитального тракта (в экспериментах использовали яичники животных без признаков видимой патологии). Животных овариоэктомиромли на конвейере С.-Петербургского мясокомбината, . яичлики . помещали в термос и доставляли в течение 1,5-2 часов в лабораторию при температуре 37,5°С. В соответствии с поставленными задачами в экспериментах использовали технологические приемы моделирования мейоза и ран -него эмбриогенеза, суть которых представлена на схемо '.рис.1).

Ооцит-кумулюсные комплексы извлекали из фолликулов диамет -ром от 3 до 6 мм аспирацией или разрезом, который проводили с использованием разработанного нами устройства для рассечения фолликулов {рацпредложение за № I:-:•/. ). Все процедуры по

отмыву, анализу качества гамет и эмбрионов, оплодотворению ооцитов проводили с помощью разработанного нами минитермоэкси-катора, обеспечивающего оптимальные режимы температуры и газового состава (рацпредложение за № 131/6).

Рис Л. Структурно-логическая схема проведения экспериментов

В своих исследованиях мы использовали различные модели до -зревания ооцитов вне организма^рис.2).

Базовой средой для культивирования служила ТС-199 с сывороткой и антибиотиками (100 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина). В качестве заменителя сыворотки использовали БФЖ в концентрации от 5 до 15%. для получения ткани фолликула последний выделяли из яичника и оценивали его качество. Нормальными счи -тали фолликулы, имеющие высокий тургор, прозрачную оболочку и хорошо развитую сеть кровеносных сосудов в теке. Препарирован -нуо ткань помещали в пенициллиновый флакон с 5 мл среда и культивировали в течение 24 часов при температуре 38-39°С. Для приготовления гистологических препаратов фолликулы фиксировали в ристворе Буэна. При гистологическом анализе учитывали число пикнотических ядзр в клетках теки и гранулезы. Гранулезу получали аз фолликулов диаметром от 3 до 6 мм. Клетки грацулезы

использовали для роста монослоя или для кондиционирования• сред. Наличие ростстимулирующей активности Ш, БФН и некоторых факторов роста определяли по интенсивности включения 3Н-тимиди— на в ДНК клеток грацулезы (Адаме, 1983 г.).

Рис.Методы моделирования дозревания ооцитов вне организма

После 24-2о-часового культивирования ооциты оплодотворяли свежепслученными или замороженными сперматозоидами предварительно капацктированными по методу Рагг1вЬ. (1986).Через 36-48 часов ранние зародыши поыецэли в предварительно полученную культуру эпителиальных клеток яйцевода коров (ьи еЬ аЦ1989). Контроль за ядерным созреванием ооцитов и оценку эмбрионов осуществляли с помощью цитогенетического метода ( Тагкоюзк! 1 , 1966).

Функциональное состояние ооцитов определяли по соотношению коферментов окислительного фосфорилирования НАДН/ФАД и содержа -нию внутриклеточного кальция. Состояние ооцитов оценивали по интенсивности флуоресценции НАДН и ФАД. Для определения кальция'

использовали флуоресцентный зонд (хлортетрациклин в концентрации ¿5 мкмоль).

Параметры проведения люминесцентного анализа:длины волн

возбуждения НАДН - 365 нм, ФАД - 436 нм, кальция - 380-400 нм;' регистрацию флюоресценции проводили на спектрах: 465 (НАДН), 530 (ФАД), Ca- 530 нм. Время облучения - до 10 сек.

Морфологическое состояние клеточных и тканевых культур фолликула, ооцитов, эмбрионов, их цитогенетические и гистологические препараты исследовали под микроскопом " OLIMPUS '

Материал документировали микрофотографиями. Фотографирование осуществляли на пленке "Микрат-ЗОО". Статистическую обработку полученных данных проводили общепринятыми не то;; «ли. I

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЭДКНИЕ

Фолликулярная жидкость и ее пептиды, как модель среды для созревания ооцитов

Фолликулярная жидкость - естественная среда созревания ооцитов. Более.двадцати лет назад исследователи начали использавать Ш в качестве среда для внефолликулярного созревания ооцитов. В результате было установлено, что жидкость малых по размеру фолликулов (3-6 мм) ингибирует, а больших, преовуляторных - ре-инициирует мейоз роцитов коров и обеспечивает его завершение. В наших ранних исследованиях (1982,1987 гг.) прослежена динамика преобразования хромосом в ооцитах коров, прокультивирован -ных в жидкости преовуляторных'фолликулов. Установлено, что жидкость фолликулов диаметром менее 6 мм ингибирует мейоз ооцитов коров,с ростом фолликула этот эффект исчезает.

Моделирование мейотического созревания ооцитов иа основе использования жидкости фолликула диаметром 3 мм (табл.1)позволило выявить следующие моменты: внесение в культуральцую сис -тему совместно о I0.& сыворотки не снимало ее ингибируюцего эффекта, причиной этого могло явиться нарушение баланса ингибиторов и стимуляторов.

Добавка в культур альную среду 10$ сыворотки при ферментативной обработке ¿1 обеспечила созревание ооцитов, что позволяет . ■ Идентифицировать фактор ингибирования как белок. Термическая обработка жидкости фолликулов диаметром 3 мм не снимала эффект ингибирования. Итак, гипотетический фактор ингибирования,

Таблица I

Эффект фолликулярной Жидкости на созревание ооцитов коров in vitro (диаметр фолликулов 3 мм, время культивирования-25 часов)___________________________________________

Варианты . эксперимента

,Кол-во - . % ооцитов

tor иницииро- на стававших ■ дии ме-мейоз та^азы-

% деге,-

——-г -нериро -

с активно ванных пролифер. ооцитов

кумулюсом

TC-I99.+50% ФЖ 37 48,6 ххх 8,1 *** 18,9ХХХ 24,3

TC-I99 +50# ФЖ +

+ Ю^етальной сыворотки 41 51,2 хх* 19,6 *** 31,7х* 21,95

TC-I99 +50% ФЖ

+ термическая обработка ■ 25 48 *** 4,2-*** ■ 2Q ххх 24

TC-I99 +50$ ФЖ •

10% фет.сыв.+ термич. обработка 34 41,2 ж 5,9 ш 17>бХХХ . 20,6

TC-I99 +50/5 И.

+ ферментативная обработка 58 25,9 *** _ 13,в*3™ '74|1ххх

TC-I99 +5(# ФЖ

+ 10/э фет.сыв. +

ферментативная ■

обработка 69 88,4 76,8 73,9 26,1

TC-I99 фе- 77,8 72,8 26,3

тальн.сыворотки 81 87,6

вероятно,имеет, белковую природу, термостабилен, с максималь' -ной ингибиругащей активностью в фолликулах малого диаметра.

Для выяснения характера влияния ФЖ на мейоз ооцитов коров нами была проведена серия экспериментов по культивированию яйцеклеток в ЪО% жидкости фолликулов диаметром 9 мм (нативной и подвергнутой термической и ферментативной обработке} Исследования показали, что нормальное течение мейотических процес -сов в ооцитах коров не нарушалось при кратковременной термообработке ФЖ (табл.2).

Введение в среду культивирования помимо инактивированной ФЖ 10% сыворотки обеспечило созревание на уровне контроля (куль-

гивирование ооцитов в ТС-199 с 10% фетальной сыворотки). Исследования показали ведущую роль пептидов в нормальном соз -ревании ооцитов: предварительная обработка ФЖ трипсином (0,04/0 вызвала значительный рост числа дегенерированных ооцитов (85,5$). •

Таблица 2 • •

Влияние -жидкости фолликулов 9 мм диаметром на мейоз ооцитов коров (время культивирования 25 часов)

Эарианты Число % ооцитов % деге-

эксперимента ооцитов инициировавших мейоз - созревших 1 с активно пролифери-рующим кумулюсом нерации

ТС-199 +50/о.М 91 90,1 72,5 72,5 23,1

ТС-199 +50% ФЖ + терм.обработка 49 83,7 77,6 67,3 26,5

ТС-199 +50$ ФЖ +10,'к фет.сыв. 55 89,1 78,2 74,5 25,5

ТС-199 +5(У/о ФЖ +ЮД фет.сив.+ тер.обработка 41 87,8 / 75,6 80,9 . 26,8

ТС-199 +50Й ФЖ + обр.ферм. 34 2>дххх 2э9ххх 8>еххх 85,б70"

ТС-199 +50/а ФЖ ' +10.?1 фет.сыв. + обр.ферм. 38 81,6 76,3 71,1 21,1

ТС-199 +Ш фет.сыв. 81 87,6 ' 77,8 72,8 28,3

Б последнее время большое внимание уделяется изучению белковых компонентов 4Ж. Предметом наших исследований явилось изучение влияния БМ на мейоз ооцитов коров. С этой целью прове -дены эксперименты по получению, 5сроматографическому разделению и электрофорезу белков фолликулярной жидкости с последующим тестированием их активности на культуре ооцитов коров. Анализ результатов по культивированию ооцитов в бессывороточ -них средах (с введением в культуральнуй среду ЕМ) и в средах совместно с сывороткой и Ш показал, что высокомолекулярные

(молекулярная масса от 35 «Да и выше) вполне заменяют сыворотку, а дополнение таких сред сывороткой нарушает нормаль-

hog течение мейоза (табл.3). БФЖ с молекулярной массой 5 и-15 нДа ингибировали мейотическое созревание ооцитов (табл.4). Интересные результаты получены _ при культивировании ооцитов в средах с высокомолекулярными БФЖ предварительно подвергнутыми термической обработке (табл.5). Термическая обработка не изменила характер действия высокомолекулярных белков, на уровне . контроля остался процент ооцитов, завершивших свое созревание. Не обнаружено достоверных различий и по числу ооцитов с дегенерацией хромосом. Что могло явиться причиной этого факта? Изве -стно, что факторы дифференцировки содержатся в тканях и жидкое-' тях организма в виде неактивного комплекса с ингибитором. Ин -тенеивный кратковременный прогрев активирует факторы дифференцировки. А если учесть тот факт, что молекулярная масса этих факторов превышает 30 кДа, то логично предположить, что одной из причин нормального созревания ооцитов в средах с высокомолекулярными, обработанными высокой температурой ЕФК может быть актива -ция факторов дифференцировки, ранее ассоциированных с ингибиторами мейоза. Предварительное прогревание низкомолекулярных БФЙ не изменило характера их влияния на мейоз (табл.5). Эффект инги-бирования сохранАЛСя, При исследовании динамики созревания популяции ооцитов в условиях использования ЕЖл обнаружено, что они способствуют синхронизации мейотических преобразований хромосом. в определенные временные промежутки большинство ооцитов находи -лось на идентичных стадиях мейоза. Одним из тестов физиологично-сти процесса внефолликулфного созревания ооцитов является ци -томорфологическая характеристика изменений окружающих ооцит-ку-мулюешх клеток. Нуклеарному созреванию, как правило, соцутст -вует "созревание" гранулезы, выражающееся в структурных изменениях кумулюса от плотного гомогенного до рыхлого, активно про -лиферирукмцего с последующим отслоением от ооцита. Внсокомолеку -лярпые БФЖ способствовали активному разрыхлению клеток, а низкомолекулярные тормозили пролиферацию кумулюса. Следовательно, выявленные белки-ингибиторы оказывают тормозящее влияние не толь -ко на хромосомные преобразования ооцитов в мейозе, но и на пролиферацию клеток кумулюса. Механизмы такого воздействия не совсем ясны. Анализ данных по выявлению митогенного эффекта 1лйд показал, что высокомолекулярные БФЖ оказываот положительный эффект на

Таблица 3

Влияние белков из фолликулярной жидкости (фракции 1,П,Ш) на созревание ооцитов коров (время культивирования 25 часов)

Варианты опыта

Число -

ооци- дишго-тов тене

% ооцитов на:

диакине- метафа- анафазе зе зе -I

% ооцитов с дегене-

телофазе + „„...„я метафазе П

Фракция I

Среда + снворотка-конт-роль -

Среда + Ш& (0,47 мг/мл)

Среда + 2щ> сыворотка + <ЁТ ШГ(0,47 мг/мл) . 1

Фракция П

Среда +2й% сыворотка-контроль

С£еда + БФЖ(0,24 ыг/мл)

Среда +2Сй сыворотка + Фг, Ша (0,24 мг/млУ и

Фракция Ш

Среда +20% сыворотка-конт-

Вреда БФЕ(0,18 мг/мя) С^е^а +20^ сыворотка

22 42

30

24 30

25

32

33

7,1 3,3

31 3,2

3,1 6,1

18,2 7,1

6,7 3,3

4,0 6,3

13,6 9,5

12,5 3,3

29,0'

8,0 4б)8

18,2 30,3

9,1 . 7,1

23,4 20,0 13,3

8,3 3,3

12,0 3.1

59,1

69)2

40,0

79,2 8б|7

64,5

40,9^

16,7

16,7 6.7

9,8х

|ХХХ

76,0 24,0 40,7ХХХ 18,7

45 4ххх 18>2

Таблица 4

Влияние белков фолликулярной жидкости после фильтрации на еефадексе & - 25 на мейоа ооцитов коров (время культивирования - 25 часов)

Среда Моле- Число

культивиро- кул яр- ооци-вания ная тов

масса

ц7%

7о ооцитов на стадиях:

дипло-тена

диаки- метафа- анафаза телофаза метафаза нез за,Д ' П

дегене-- раций

TG-I99 +ICJfo

фетальной

сыворотки

TC-I99 +БЗЖ ТС-199+1Ж

190 9(4,7) 10(5,3) 14(7,4) 8(4,2) 22(11,6) 89(46,8) 38(20,0)

15 5

ТС-199 + БОН +105 фетальной сыворотки 15

ТС-199 +ВИ +10% фетальной сыворотки 5

31

43

74

xxx

16(51,6)

XXX

39(90,7)

xxx

26(35,1)

xx

133 15(11,3)

ххх

ххх

XX

6(19,4) 6(19,4) 1(3,2) 2(4,7) 2(4,7)

22(29,7) 2(2,7) 1(1,4)

XXX X

38(28,6) 18(13,5) 8(6,0)

XXX

1(3,2)

XXX

3(4,1)

XXX

4(3,0)

XXX

1(3,2)

XXX

5(6,8)

XXX

38(28,6)

xx

10(32,3)

ххх 35(81,4)

15(20,3)

XXX 9(6,8)

Н-1

СЭ

' ■ Таблица 5

Влгянле Б52 различной молекуляэпой массы на созревание ооцитов коров .'(время кзльтквзрованая 25 часов)

Теща- Система Число % ооцитов на стадиях: ' % дегене-

пеская взгльтивяроватш ооци- дщш^- диашши цамздав^ шшаза голофааа цью- ргщ2Й

обра-' на 1 фаза

ботка П

- ТС-199+Б52 . eg (М > 35 кЛа) 11,2 1.2 6,7 1,2 6,7 73 , 11,2

+ К9») ' * 12,3 8,2 8,2 2,7 4,1 64,4 ' 12,3

- ТС—199+10^ (£ет.сыв.+ БФ1(М =15 кДа) ■ 74 •35,1 32,4 13,5 2,7 6,8 20,3

+' .ТС-199+10* $ет.сыв.+„„ Ь»2Ш = I5 ¿¿I 79 . 31,6 31,6 10,1 6,-3 . 10,1 10,1™0 17,7

- ТС-199+1СЙ ®ет.сыв.-ъ00 Б22(М =5 кДа) * I33 ' -15,8 28,6 ' . 15 6,1 4,5 30ххх 6,8

19,7 21,2 14,1 , ' 7,0 . 7,0 •я*** 11,3

-. ТС-199+Щ? фет.сыв. • контроль . 157 6,4 • 8,9 6,4 1.2 6,4. 70,7 13,4

синтез ДНК'В метках гранулезы (рио.З).

« 1 ....

0,01 0,05 0,25 5 10 25 50

Концентрация ФРФ, нг/мл

4 - сыворотка крови крупного рогатого скота

• - белки фолликулярной жидкости

• - фактор поста фибробластов

Рис.3. Влияние ЗЖ.ФРФ и сыворотки крупного рогатого

скота на стимуляцию синтеза ДНК в клетках гранулезы

Таким образом, проведенные исследования выявили суммарный положительный эффект высокомолекулярных белков как на клетки гранулезы, так и на мейоз ооцитов. Их использование повышает дролиферативнуга активность и синтез ДНК в клетках кумулюса, а также обеспечивает реишщлацию мейоза с последующи его завершением. Эти факты не противоречат концепции о центральной роли (Тактора промоции созревания, выделенного из ооцитов шпорцевой . . ' ■ 15 ■

лягушки fer n Герхартом (1980 г.) в регуляции как митотическо-го, так и-мейотического циклов на протяжении всех фаз оогенеза. Возможно, благоприятное влияние BSE на мейоз ооцитов коров объясняется созданием всех необходимых условий для трансформа -ции сигналов, вызывающих появление цитопдазматического фактора промоции созревания, который сейчас многие исследователи считают универсальным, ответственным за инициацию митотической фазы клеточного цикла эукариот.

Известно, что эмбриональные ткани и яйцеклетки компетентны к действию различных полипептидных факторов роста (ПШЬР), причем в раде случаев количество их специфически» рецепторов больше, чем у «саней животных в постнатальном пешоде онтогенеза ( Кусень, Ст»йк»,1985). Так как некоторые ППФР могут индуцировать дифференцировку клеток, то это существенно повышает их роль в регуляторных процессах на самых ранних этапах раэви -тия животных.

На примере МНСБ мы попытались выяснить характер действия белка, имеющего высакую пролиферативную активность, оцененно -го как активный митоген. Исследования показали невозможность созревания ооцитов в средах с МНСБ, лишенных сыворотки. Эффект стимулирования ыейоэа проявлялся лишь в присутствии сыворотки, при этом концентрация" МНСБ составила 200 нг/мл. Показан дозо-зависимый эффект МНСБ, время созревания ооцитов> в присутствии исследуемого белка составило 25-30 часов, а исследование динамики созревания ооцитов позволило выявить эффект синхронизации популяции культивируемых ооцитов (рис.4).

Одновременно наблюдали значительное улучшение качества культи -вирования за счет уменьшения числа ооцитов с дегенерацией хро -мосом.

Аналогичный эффект оказали катионные белки Ш в концентра -ции 90 мкг/мл. При этом наблюдали синхронизацию культуры ооци -тов, высокий выход ооцитов на стадии метафаэа -П при меньшем, по сравнению с контролем, числом ооцитов с дегенерацией хромо -сом.

Представленные данные исследований по влиянию различных пептидов на мейоз ооцитов коров, свидетельствуют о их высокой степени компетентности и о наличии рецепторов к этим пептидам.

í-диплвтена, 11 - дишинев.Ш - метафаза-|,1У - анафаза,-У - телофаза- , У1 - метафаза-П

-—--—--контроль-,-------—- опит------------------- -------------------■

100 90 Ю 70 60 ад

30

го

(О

20 Час.

1 П 1 Е 1 Й

i i s s а

(00 90 80

lObO •SO' 40 30' solo-

%

10 ч

яс.

—,—^

1 Ш 5 j К!

юо

30 8070 60

50-

мо х> го •ю-

25 Ч

80.

--о^^

/

Г 1 ш ш I S

I со 90 80 70 60 50 40 JO 20 ю-

15 час.

30 (О

P'hc.-I Динамика созревания ооцитов

I . Ж

коров в

средах с добав-

кой I.'iiCb /концентрация ¿UU нг/мл/

ЦитоморфеФункциональная характеристика фолликулярных клеток

Созревание ооцита - комплексный процесс, включшций мейо-тические преобразования ядра, цитоплазматичвские изменения и преобразования'мембраны. Многими исследователями детально «характеризованы хромосомные преобразования созревающего ооцита ^(Thibault, 197?, Kaufman, .1983, Курало , I9Q5) Гораздо меньше работ посвящено вопросам цитоплазматических изменений и преобразованиям мембраны ( Oran 1985, Crosby 1984, Tesa -ri , 1986). Однако, имеющиеся данные позволили ряду автров высказать предпелогкение о том, что созревание ядра* и созревание цитоплазмы ооцита - независимые процеосы Дыбан,'1988 В то лее время, имеется ряд исследований, свидетельствующих о хорреля -. ции изменений ядерного аппарата ооцитов с изменением белкового спектра цитоплазмы С М.С. Ganghey , Van Berh., 1977 ).

Важнейшими методами для изучения регуляторных механизмов, действующих на уровне клеток и тканей, являются методы спект -рального анализа в том числе люминесцентный , позволяющие изучать вопросы пространственной организации клеток, кинетику физико-химических процессов, имеющих месте непосредственно в клетке или её орган «идах. Иеобходиместь этих исследований вызвана тем, что изменения в.системах регуляции, обеспечивающих временную и пространственную организации биохимических реа#ций в клетках, являются, по-видимому, причинами различных нарушений, могущих приводить к гибели клеток и тк'аней. Важное место ъ этих исследованиях отводится митохондриям, которые являются наиболее чувствительной частью клетки и реакция их опережав?, а,нередко,по--видимоиу, определяет ответы других органелл и клетки в целом. ■ Однако, имеющиеся данные • механизмах, регулирующих процессы окислительного метаболизма клеток, основаны главным образом на результатах исследований, выполненных на изолированных митохон- • дриях. Практическая и теоретическая ценности таких работ значительно повышаются при условии сохранения в исследованиях физиологического' подхода, т.е. проведения исследований на уровне ин-тактгшх клеток и тканей.

При атоц следует отметить, что основным методом исследования систем окислительного метаболизма на клеточно-ткапевом уров-

не выступает люминесцентный анализ окислительно-восстановительных переходов пиридиннуклеотидов (ПН) и флавопротендов (<Ш).

— Поэтому^ проведение_сравнительных_лшинесцентных исследований на клеточном уровне представляется более перспективным для изучения окислительно-восстановительных процессов в созревающем ооците.

В наших исследованиях установлены значительные отличия по люминесцентным параметрам нормальных и дегенерированных ооцитов, а также тканей фолликулов (табл.6).

Как правило, деструктивным изменениям в ооцит-кумулгосных комп - ■ лексах и в тканях фолликулов (атретические фолликулы) сопутствовало возрастание соотношения НАДН/ФАД, которое составляло в нормальных ооцитах.1,4 усл.ед., а в оцененных как дегенериро -ванные - 2,1. Для тканей нормальных фолликулов различного диа -ме!ра этот показатель находился в пределах 1,18-2,9 усл.ед.,а в тканях атретических фолликулов 2,74-4,28 усл.ед. В процессе культивирования и развитая атретических процессов в тканях на -растало число клеток с пикнотическими ядрами и увеличивалось соотношение НАДН/ИАД (2,59 - 3,67 для нормальных и 4,89 - 8,3 для дегенерированных)Детальный анализ данных, полученных' при люминесцентном исследовании нормальных и дегенерированных ооцитов (включая ингибиторный анализ),показал, что при дегенерации ооцитов нарушается механизм транспорта электронов в дыхательной цепи. Так как рост коэффициента НАДН/ФАД в дегенерированных ооцитах обеспечивается за счет накопления восстановленных форм ФП,можно предположить нарушение в цепи передачи протона от ПН к Ш. А тот факт, что соотношение НАДИ/МД не изменяется на. разных стадиях мейоза, может явиться одним из косвенных дока -зательств гипотезированного ранее утверждения о независимости процессов ядерного и цитоплазматического созревания.

С целью повышения информативности знаний о характере нарушений процессов окислительного метаболизма в ооцитах были изучены параметры флуоресценции клеток в ответ на воздействие хлортетрациклина (табл.6).

Повышенная флюоресценция ооцитов при добавлении ХТЦ свидетельствует о накоплении в клетках мембрансвяэанного кальция. По данным литературы ионы кальция, в больших количествах на-

Цитоморфофункциональная характеристика структурных элементов

Таблица 6

Тип структурных Цитоморфологическая элементов фолли- характеристика кула ооцит-кумулюсного

комплекса или фолликула

Число Соотношение НАДН/ФАД, усл.ед.

ооцит--:-

куму - Время культивирования (час.)

О 25 30

лексов или фолликулов_

Интенсивность флуоресцен -ции кальция после.введения хлор-тетрациклина (усл.ед.)

Ооцит-кучулюсный Нормальный комплекс

Ооцит-кумулвсный С деструктивными комплекс изменениями

Ткань фолликула Нормальный диаметром З-о мм

Ткань фолликула йзретический дмамезром 3-6 мм

Ткань фолликула Нормальный диаметром 7-8 ш

Ткань фолликула Атретичеекий, диамезром 7-8 мм

"Ткань фолликула Нормальный диаметром 9-10 им

Ткань фолликула Атретичеекий диаметром 9-10 мы

61 1,4+0,018 1,4+0,018 1,4+0,018

44 2,1+0,012 2,1+0,012 2,1+0,012

47 1,18 1Тб2. 2,59

34 2,74 4,39х 4,89

56 2,81 2,33 2,92

51 • 3,67 5,55х 6,60х

53 2,90 3,53 3,67

36 4,28 7,45 8,30х

-1.2 *** 35,0

капливающиевя в клетках, выступают в роли разобщителя окислительного фосфорилирования (Кузьмина C.B.,1983).

Оценивая полученные нами результаты, можно предположить, что нарушения,выявленные в дыхательной цепи, связаны с увеличением уровня ионов кальция, ассоциированного с мембранами. Одновременно показана возможность прижизненной оценки функционального состояния ооцитов, в основе йотороЙ лежит испольэова- -ние различий в интенсивности флюоресценции нормальных и дегене-рированных ооцитов по соотношению ПН/ФП. Это позволило использовать данный параметр в качестве дополнительного теста каче -ства ооцитов. Предложенный тест дает возможность объективной оценки функционального состояния ооцит-нумулюсного комплекса, что и обусловило его использование при проведении экоперимеи -тов по дозреванию и оплодотворению ооцитов коров m vitro.

Моделирование условий созревания и оплодотворения ооцитов коров

Извлеченный из фолликула ооцит, лишенный влияния Ш и большей части структурных элементов фолликула, исключая куму-люсные клетки, реинициирует мейоз и.может завершить свое соз -ревание в культуральных средах с сывороткой. Еще в 1979 г. Биггерсом и Паузрсом высказана гипотеза о том, что спонтанное созревание ооцитов является артефактом, ответной реакцией на стресс, вызванный извлечением ооцита из фолликулов и потерей его окружения, обеспечивающего ооцит всем необходимым для дальнейшего развития. Если же к культуральной среде добавить ФЖ или некоторые ее компоненты, то среда становится более благо -приятной для созревания ооцитов. В плане этой гипотезы мы предприняли попытку выяснения роли отдельных Структурных эле -ментов фолликула и в созреваний ооцитов коров и их потен -ции к дальнейшему развитию в эмбрионы.

В наших исследованиях проанализированы различные параметры мейоза, оплодотворения и раннего эмбриогенеза, в том числе: мейотическое преобразование хромосом созревающего ооцита, степень разрыхления кумулюсных клеток, хромосомные нарушения, функциональное состояние ооцитов, их оплодотворяемооть, хроно-

логия оплодотворения, потенция ранних эмбрионов к развитию, нарушения в предимплантационном эмбриогенезе и, наконец, воз -можность партеногенетического развития ооцитов.

Известно, что интрафолликулярное созревание ооцитов связано' с обязательным присутствием гонадотропных гормонов. Оплодотворение таких ооцитов не привело к развитию эмбрионов до стадии бластоцисты (Голубев и др.,1987 г.). Несмотря на то,что как модель для созревания ооцитов, как могло бы показаться, фолликул представляет собой оптимальный вариант« результаты . по выходу эмбрионов из ооцитов, созревших в фолликулах были гораздо ниже» чем из внёфолликулярно созревших ооцитов. Возмож^ ность- использования Ш в качестве среды для созревания ооцитов показана в наших ранних работах. Выявлены оптимальные диаметры фолликулов, жидкость которых не оказывает отрицательного влия -ния на мейотическое созревание ооцитов. При использовании жид -кости фолликулов большого диаметра в-качестве среда созревания ооцитов получены эмбрионы (Голубев и др.1989 г.}. Однако при -менение 'Ж в целях совершенствования технологии оплодотворения in vitro затруднительно, т.к. ее состав неоднороден в тече -ние астрального цикла. В связи с этим, рледущим этапом в наших исследованиях, связанных с совершенствованием культуральных сред для дозревания ооцитов, явилось изучение возможности ис -пользования в качестве заменителей сыворотки высокомолекулярных пептидов И.

Необходимость создания бессывороточных сред для экстракор -' порального созревания ооцитов вызвана прежде всего вариабель -ностью результатов, получаемых при оплодотворении вне организ -ма. Так, в случав использования сывороток, флуктуация данных оплодотворяемоети составила от 0 до 65$. Понятно, что этот факт исключает возможность стандартизации сред для культивирования ооцитов. К тому же использование боннского материала в качестве источника получения ооцитов вносит дополнительно эле -мент неоднородности. Сочетание этих факторов может явиться дополнительной причиной снижения эффективности технологии оплодотворения 'ооцитов коров вне организма. Использование в качестве заменителя сыворотки высокомолекулярных БФЖ способствовало стабильности получения эмбрионов из созревших in vitro ооци-

тов, 'границы вариабельности результатов оплодотворяемости со-' ставили в этом случае от 35 до 65$. Введение в среду созревания ооцитов высокомолекулярных БФН обеспечило повышение качества ооцитов (табл.7,8), по сравнению с сывороткой, что выразилось в увеличении процента оплодотворяемос.ти и дробления,-

Таблица 7

Цитоморфофункциональная характеристика популяции ооцитов коров из яичников в стадии фолликулярного роста (среда созревания ТС-199 + 20$ фетальной сыворотки)

№ Число Число ци- % ооцитов % ооцитов % дробле-

яичника ооци- томорфоло- На стадии „ ндян/<мл ния "

тов гически ыетафазн- Tffnia

полнрцен - П 1.4*0,018

ных ооцитов

I 28 12 28,0 ' 7,14 7,14

2 34 15 38,2 8,82 5,88

3 31 Ю , 25,8 6,45 6,45

4 39 16 38,5 7,69 7,69

5 33 10 24,2 6,06 6,06

Всего: 165 63 32,73 7,27 6', 67

% от ин-

тактных 38,17 85,71 19,05 17,4

В последние годы ряд исследователей предпринял попытку использования для созревания ооцитов сред, кондиционированных клетками гранулезы. Из ооцитов, созревших в культуральных системах с использованием клеток гранулезы, получены полно -ценные эмбрионы ( Lu,Gordon ,1987). Однако, показано, что культивирование ооцит-куцулюсных комплексов с гранулезными клетками зачастую сопровождается увеличением числа ооцитов с дегенерированными хромосомами. Причиной этого может быть ма -рушение гормонального баланса (стероидов), т.к. данная система культивирования не дает возможности учитывать количество гранулезных клеток, окружающих ооцит, которые также,как и введенные в систему культивирования гранулезные клетки,явля -юте я продуцентами стероидов. Тем не менее в наших исследованиях показано положительное влияние гранулезных клеток на по-

лучение эмбрионов (табл.9,10).

Таблица 8

Цктоморфофункционадьная характеристика популяции ооцитов коров из яичников в стадии фолликулярного роста (среда созревания 1X1-199 + белки фолликулярной жидкости)

№ яичника Число • ооцитов Число цию-морфологи-• чески пол -неценных ооцитов % ооцитов % ооцитов ца стадии с шДНЛШ Метафазы - 1,4 М) П % дробле-( кия ,018

1 25. 10 32 20 • 20

2 29 9 27,59 17,24 20,68

3 33 10 27,27 12,12 9,09

4 31 25,81 16,12 12.9

5 29 б 27,59 13,79 17,24

Всрго: 147 47 . 27,80 15,65 15,65

% от ин-тактных 31,97 87,2 48,94ххх 48,Мх

Известно, что, фолликулы в процессе своего роста и развития продуцируют под контролем гипоталамо-гипофизарной системы де -сятки веществ различной природы. Ранее нами указывалось, что идеальной системой культивирования ооцитов могла бы явиться система интрафолликулярного созревания ооцитов. Однако до сих пор безуспешными явились попытки получения из таких ооцитов эмбриойов, способных к дальнейшему развитию. Понятно, что обеспечить условия созревания, адекватно отражающие мейотические преобразования ооцитов в организме, на основе культивирования такой сложной структуры, как целостный фолликул значительно труднее, чем клеточной или тканевой культуры. Проведенные эксперименты позволили разработать систему культивирования на основе тканевой культуры, включающей совокупность структурных элементов фолликула (строма, тека, гранулеза). Результаты по оплодотворению ооцитов, созревших в условиях применения тка -невой культуры, показали правильность наших предположений (табл.10). В исследованиях показано, что оптимальным размером фолликула, ткань которого используют для созревания ооцитов, является диаметр 3^6 мм. Эти результаты хорошо согласуются с имеющимися исследованиями характера атреткческих процессов

в антральных фолликулах. Положительное влияние культивирования ооцитов с тканью фолликулов также можно объяснить тесной кооперацией ооцит-кумулюсного комплекса с клетками ткани фолликула.

Таблица 9

Показатели контролируемых параметров мейоза и раннего эмбриогенеза при использовании различных моделей дозревания и оплодотворения ооцитов коров

Характеристика п системы культи- ооци-вирования той

Ядерное Функцио- % ооцит- Времен-

созрева- нальиое кумулюс- ныэ па-

ние, % состояние, ных комп- раметры

метафаз- % нормаль- лексов с созрева-

П ных ооци- высокой ния

тов степенью ооцитов

ЙЮ вне_мулюса_

ТС-199 +15% фетальной сыв, 87

ТС-199 + белки

?ол.жид-ти М>бб нДа) 139

ТС-199 +10? сыв.+ грануле-за 99

ТС-199 +153 остр.сыв. + ткань фол-ла 93 ( ¿= 6 мм)

ТС-199 +¿0% ФГ (фолликул а =8 мм) 121

ТС-199 +15/з эстоальной ' сыворотки 85

78,1 19,5ХХХ

89,2

72,7

89,2

87,6

84,7

39,4ХХ

84,9

59,5

88,2 82,4

56,3'

87,7

69,6

88,2

59,5

84,7

,хх

25

25

30

30

30

25

Анализ данных по созреванию и оплодотворению ооцитов позволил комплексно, в динамике оценить-потенции яйцеклеток, до -зревших в различных культуральных системах, к оплодотворению и дальнейшему развитию в эмбрионы. Как правило, наиболее высокие потенции к оплодотворению имели ооцит-кумулюсныв комплек -сы, кумулюс которых активно пролиферировал и к завершение культивирования отличался высокой степенью раэрыхлвмия, функ-

Таблица 10

Оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота при использовании .различных систем культивирования

Система п % оплодот- % 2-8 кле- % морул и % нормаль-культиви- осеме- воренных точных бластоцист ных рования. ненных

I 67 . 13,4 *** 4,5.ххх - -

п 109 60,55™ 36,7 . ' 18,35 50

ш 67 40,ЗЗ*** 31,3 31,3 • 33х*

1У 97 72,5 34,1 41 •50.

У 85 60,О** 30,6 16,5 26ххх

У1 91 64,8 - 36,3 15,4 .46

. циональное состояние яйцеклеток оценивалось, как нормальное (НАДН/ФАД = 1,4+0^018), ооцит к 25-30 часам культивирования достигал завершавших стадий мейоэа (метафаза-П). Наибольший процент эмбрионов на стадиях морулы и бластоцисты с положительными качественными характеристиками получен при дозревании •ооцитов в системах с использованием ткани фолликулов. 88,2 % ооцитов в этой группе имели кумулюс с высокой степенью разрыхления,,. Процент яйцеклеток на.Метафазе-Л составил 89,2-.84,9$ ооцитов оценивались как нормальные по функциональному состоя -

нии.

После внесения сперматозоидов в среду оплодотворения, ку- • да помещаются ооциты, происходит целый ряд процессов, закан-' чиващихся образованием зиготы с последующим развитием ее в эмбрионы. Установлены следующие хронологические параметры ци-томорфологических изменений в ооцитах, зиготах и ранних эмбрй-онах,коров при их оплодотворении. Отделение второго полярного тельца наблюдали через 6-8 часов после внесения спермы. Отмечены случаи наличия двух полярных телец через 36 часов от начала осеменения, иногда сохраняющихся в двухбластомерном зародыше. Формирование пронуклеусов происходило через 10-12 ча -сов, сближение через 12-15 часов. Отмечено асинхронное развитие мужского и женского пронуклеусов. Тестированы процуклеу -сы с деспирализованными хромосомами, а также с различной

степенью спирализации. Зсверисинем кариогамии являлось Зорми-' рование спнкарноаа, хромосош п/н этом находились на газллчнах

стадшгх сплрадлзациц. ЗрГ'03_2С^ЗЗ_часов_ после начала сплодотво-________

_;сипя 'ор.'лллэваллсь дсугсясточнш оглбрпопц. Сказчоац случаи ло-/лЗ.-сипя :.п;ого5лас'.,о..:о^:алс оауэдшой в этот ':;о срок. Цптогенети-ческнй анализ тают жабраоиов по выявил ядерного материала в них. Зх'от гол:т позволял определить такие клогл:и как атипичные, ■ подвергшиеся цнтотоьши без кариологических преобразований.

. При цптомор^ологпчсскол характеристике эмбрионов у станов- " лоно, что наибольшее число эмбрионов получено при использовании в, качестве модели для созревания ткани фолликула и БФд (табл.11). В этих случаях достоверно више процент эмбрионов, досгитах, стадии морулц и бластоцистц, а при цитогенетическом анализе¡таких эмбрионов отмечен наименьший выход фрагментированных клеток (табл.11.) Следует оголотнть, что для всех двухкпеточных эмбрионов характерно наличие ядер в интерфазном состоянии. Показатель соответствия числа ядер числу бластомеров уменьшается в соответствии со стадией дробления. При увеличении числа бластомеров асшгхроиность развития 'ядер возрастает и у же на стации 0-16 клеток в эмбрионах моино наблюдать ядерный материал на разных ' стадиях сиирализацпи: от интерфазного состояния до мптотичеешх пластинок. Этот факт, как обнаружено рядом исследователей, отнюдь не является критерием неполноценности эмбрионод 0Ь;бан и др., 1988 г.) В таких эмбрионах ыох'ут присутствовать бластоморц с пикнотцчос;симп ядрами. Последний факт следует учитывать при проведении исследований в клеточной" ¡шженерии, т.к. потенции Taifflx бластомеров к дальнейшему развитию, несмотря пл пслоглИ-тельную морфологическую характеристику, отрицательные. 3 1Л7дой исследуемой группе, за йсклотснпсм группы, где. ooi?mi дозревали совместно с т;лшо 5>олл:::;ула, получены 3-:с клсточнис эмЗр: они. Taicu образом, у о^рцопов крупного рогатого скота отмечается псинхронность второго деления дробления, ранее тестированная у зарО'дшей кролика и миши ( Gulyea, IS75, Spindle, 1262). Причш1у этого явления род авторов склонен видеть в неравномерном распределении некоторых компонентов цитоплазмы при пзрном дроблении ( Bennet , 1962).

В настоящоо время широко пзвестоп Ç-акт блока развития

м ш

Таблица П

Цитоморфологическая характеристика эмбрионов коров, полученных из ооцитов, созревших в различных системах культивировашга

Система культивирования

% эмбрионов на стадиях:

Число

2-х 3-4-х

»4-х клеточных

морул,

бласто-

цист

■ % дегенераций

■ (визуальная характеристика)

Всего На стадии иорул.олас-тошст

ТС-199 +10/° эстр.сыв.

ТС-199 + Б® (М масса > 65 кДа)

ТС-199 + ткань фолликула а в 3-6 мм

ТС-199 + гранулеэа

ТС-199 +5СЙ Ш . (а фолликула в 6 мм)

91 22 • 29,7 . 31,8 16,5®" 21,9*** 3,3

81 17,3 26 33,4 23,б30® 21 ^ 4,9

78 34,6 25,6 5,2 34,6 10,25 5,1

62 29,1 - £7,4 43,5 ' 6,45

97 31,6 26,3 : 10,5 31,6 1 12,3 ' 5,3

38 31,6 21,1 21,1 26,З*** 15,8 г 2,6

Таблица 12

Характеристика дегенерационных изменений в эмбрионах,полученных из ооцитов, созревших'в различных системах'культивирований

Система культивирования

/о клеток с:

% дегенераций

Число

эмбрио- фрагмен- неполным несоответ- обнаруженных при: ! нов тацией набором гр£ ствием чис- ене_ Бизу_ всего

томерах км^Етву мыском альной томерах ^^анализе харак-^ ;

ке

ТС-199 +10% фет.сыв.+ гормоны

ТС-199 +10$ эстр.сывор.

ТС-199 + Б® (М масса> 65 к^а)

ТС-199 + ткань фолликула ( ^ *6 мм)

ТС-199 + грацулеза

ТС-199 +5СЙ ( <1 -9 мм)

71 11,2 17,0 7 35,2 21,5 56,7:

64 ' 10,9 15,6 10,9 .37,5 21 58,5|

71 4,2 xxx 12,7 11,3 • 23,2 10,25 xx 38,5

58 5,2 xxx 13,8 8,6 27,6 6,5 xxx 34,1

50 4 xxx 20 6 30 12,3 42,3х

32 12,5 12,5 3,1 28,1 15,8 43, 9?

гс «о

эмбрионов на разных стадиях у млекопитающих. У коров - на стадии 8-16 клеток. Причиной этого, по мнению некоторых авторов, является.отсутствие каких-то гипотетических факторов, необходимых для преодоления блока. Считается, что эти факторы контролируются материнским геномом, унаследованным от яйцеклетки. В;настоящее время дискутируется вопрос об их природе и времени образования.

Характеризуя возможные причины низкого выхода дегенериро-венных эмбрионов в условиях применения структурных элементов фолликула и ее жидкости, уместно вспомнить результаты по соз -реванию ооцитов с использованием различных культуральных систем. Как показали данные исследований наименьший выход ооцитов с дегенерацией хромосом обнаружен в группах, где яйцеклетки созревали в присутствии' ткани фолликулов, $1 и ее белков, что возможно,.и обусловило увеличение выхода качественных эмбрионов. С другой стороны, эти системы дозревания, вероятно, спо -собствовали появлению в ооцитах цитоплазматических факторов, являющихся продуктом экспрессии материнских гейов, ответственных за нормальное развитие преимплантационных эмбрионов.

Провоцировать раннюю гибель зародышей, полученных технологией дозревания ооцитов вне организма, может их' партеногене-тическое развитие, которое, в основном, осуществляется по гаплоидному тицу. В наших исследованиях показано, что введение в ТС-199 ШК и ткани фолликула уменьшает потенции внефоллику -лярно' созревших ооцитов к партеногенезу.

Итак» получение полноценных эмбрионов крупного рогатого скота из дозревших вне организма ооцитов зависит от многочис -ленных факторов, определяющих нормальное мейотическое созревание ооцита, .его оплодотворение и развитие эмбрионов. Строгое соблюдение технологических параметров дозревания и оплодотворения ооцитов, стандартизация условий экспериментов стабилизируют результативность, позволяют расширить возможность использования полученных эмбрионов для целей генетической и клеточной инженерии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Моделирование условий созревания, оплодотворения и раннего эмбриогенеза в организме на основе структурных элементов $олликула,ФЛ и её пептидов позволило выявить биохимические и цитогенетические особенности глейотического созревания ооцитов, • оценить их потенции к дальнейшему развитию в полноценные эр,16- ■ рионы.

Ые¡готическое созревание ооцнтов представляет собой комплексный процесс, включающий ядерные, цитоплазматические, меиб-ранные преобразования, опосредованные влиянием большого коли-чеотва биологически активных веществ различной природы. Ве,пущая роль в контроле оогенеза принадлегкит регуляторным пептидам-ингибиторам и стимуляторам мейоза. Их баланс определяет- судьбу ооцита - полноценное развитие при после,дующем оплодотворении в эмбрионы или его гибель и элиминацию. Доказано, что мейоз-ивду-цирущими белками являются высокомолекулярные белки, выступающие в качестве заменителей сыворотки и оказывающие благотворное влияние как на мейотичбекие преобразования хромосом, тай и на йункцианальное состояние ооцита и окружающих его кумулюоных клеток. Жидкость фоллш^лов малых диаметров и низкомолекулярные белки проявляют мекоз-ингибирующую активность, замедляя процесс ядерного созревания ооцнтов. Э|фект ингибирования Ф2 проявляется при воздействии на слабоспирализованные хромосомы.

Обнаружено ноло;:штсльное влияние катион1шх белков и ЖСБ на созревание ооцнтов в присутствии сыворотки. Введение в куль-туральную среду этих болков сшпало количество ооцнтов с деге -нерацией хромосом. Мейоз-стимулцрующий аффект МНСБ и катионннх белков носил дозозависимый характер.

При дозрованип ооцнтов происходят цитоморЯологичзокие и Функциональные" изменения в ооцпт-кумулюсных комплексах. Хромо-сонным преобразованиям ооцита сопутствует активное разрыхление кумулюсных клеток. Использование цультуралышх систем на основе структурных элементов {¡юлликула способствовало улучшению пока -зателей культивирования, а именно: уменьшался выход ооцлтов о признаками дегенерации хромосом, возрастало число сортов с высокой степенью разрыхления кумулюоных клеток.

При деструктивных изменениях в ооцит-кумулюсных комплек -сах изменяется метаболизм ферментов окислительного фосфорили-рования, опосредованный нарушениями в дахательной цепи. Одно. временно наблюдается гипераккумуляций мембране вязанного кальция1. Аналогичные процессы наблюдались в тканях фолликулов при ,иха культивировании.

Предлагаемый нами подход к решению проблемы оценки качества ооцитов, а в дальнейшем, по-видимому, эмбрионов и бластоме-ров позволяет по флуоресценции ооцитов оценить функциональное состояние исследуемых объектов и спрогнозировать их дальнейшее развитие. Такой прогноз будет способствовать увеличений эффективности работ в области чранс плантации, генетической инженерии, клонировании за счет жесткой селекции ооцитов, эмбрионов, блаетомеров, в основе которой ле»ит комплексный экспресс-тест.

Одной из задач животноводства является получение как можно.большего числа потомков от высокопродуктивных животных. Метод трансплантации эмбрионов открыл возможность получения цу -тем суперовуляции от высокоценных животных эмбрионов на ран -них стадиях развития и пересадку их менее ценным в генетическом отношении самкам. Именно для увеличения числа потомков от элитных животных| а также для повышения эффективности разработок методов клеточной и генетической инженерии используется технология дозреваний и оплодотворения вне организма ооцитов из яичников убитых животных. Известно," что потенциальные возможности воспроизводства самок млекопитащих огромны. В их яичниках содержатся десятки тысяч ооцитов. В связи с этим в ранних разработках Технологии оплодотворения in vitro ставились задачи эффективного использования ооцитов из антраль-ных фолликулов путем их доращивания с последующим оплодотворением и культивированием преимплантационных эмбрионов. Однако, как показали исследования, лишь определенная часть ооцитов, выделяемых из яичников может,быть успешно прокультивирована с последующим оплодотворением, наибольшее число таких ооцитов находится в яичниках на стадии фолликулярного роста. Вот почему при необходимости получения эмбрионов от высокопродуктив -ных животных необходимо перед забоем тестировать стадию астрального,, цикла для увеличения эффективности проведения

эксперимента.

Оптимизировать результативность экспериментов по дозреванию и оплодотворению ооцитов коров in vitro возможно за счет модернизации системы культивирования. Использование в технологии внефолликулярного созревания ооцитов структурных элементов фолликула и бессывороточных сред обеспечивает улучшение показателей оплодотворяемости ооцитов и качества получаемых из них эмбрионов.

■ Использование культуры клеток гранулезы в качестве тест-сисяемы для выявления митогенного эффекта БЗД, катионных бел -ков и т.д. позволяет повысить информативность наших знаний о регуляторных механизмах мейоза млекопитающих.

Сравнительный анализ контролируемых параметров мейоза и оплодотворения ооцитов при использовании различных культуральных систем позволяет индивидуально и в комплексе оценивать роль различных веществ и структурных элементов фолликула в мейоти-ческом созревании ооцитов.

На основе изучения влияния жидкости фолликулов разного диаметра, Б&и, факторов роста, катионных белков, белков, имеющих штогенную активность, становится возможным гипотезировать вероятность полигенного контроля индукции созревания ооцитов, их компетенции к оплодотворению и дальнейшему развитию в эмбрионы. Внесение в системы культивирования структурных элементов фол -ликула позволяет приблизить условия созревания ооцитов, адекватно отражающие мейотическое созревание женских гамет в организме.

Полученные экспериментальные данные существенно дополняют наши знания в области эмбриогенетики, позволяя регулировать соз-. ревание ооцитов в культуре, вызывая ингибирсвание или реинициа-цию мейоза, с последующим изучением параметров оплодотворения и раннего эмбриогенеза.

Представляет интерес в перспективе моделирование систем культивирования на основе бессывороточных сред совместно с тканевой культурой фолликулов, что позволит при стандартизации за счет исключения сыворотки из составляющих культуральную сроду компонентов, максимально отразить условия созревания ооцитов в организме и сделать еще один шаг, способствуздий эффек-

тивному внедрению методов генетической и клеточной инженерии в практику животноводства.

Технологические успехи в разработке методов генетической и клеточной инженерии в течение последних 20 лет феноменальные, а это является предсказанием того, что новые достижения в этой области будут продолжаться или даже ускоряться, основываясь на дальнейшем развитии фундаментальных исследованиях в области биохимии, молекулярной биологии, цитологии, генетики.

ВЫВОДЫ

1. Материалы проведенного исследования в совокупности сданными литературы позволяют сделать вывод о возможности лоли-генно-каскадного контроля реинициации мейоза, его завершения

и приобретения ооцитом компетенции к оплодотворению и дальнейшему развитию в эмбрионы.

2. Разработан комплексный тест оценки цитоморфофункциональ-ного состояния ооцит-кумулюсного комплекса. Он позволяет про -гнозировать потенции ооцитов к дальнейшему созреванию, оплодотворению и развитию в зародыши на основе оценки качества хромосом ядра, функционального состояния цитоплазмы и степени раз -рыхления кумулюсных клеток.

3. Выявлена мейозстимуЛирующая активность в ВШ молекулярной массой свыше 35 ада. Введение в культуральную среду белков молекулярной массой от 35 до 65 кДа (в концентрации 0,22мг/мл)

и 65 кДа и выше (в концентрации 0,4? кг/мл) способствовало улучшению качества созревающих ооцитов, что выражалось в достовер -ном уменьшении выхода ооцитов с дегенерированными хромосомами и увеличений выхода дробящихся яйцеклеток после их осеменения с 17,4$ до 48,94% по сравнению с контролем.

4. Установлено, что белки с молекулярной массой от 5 до 35' кДа оказывают ингибирующий эффект на созревание ооцитов. При их введении 'в среду культивирования уменьшается процент ооци -тов как реинйциировавших мейоз, так и достоверно достигших ме-тафазы-П по сравнению с контролем. Эффект ингибирования белков не исчезал при их высокотемпературной обработке.

5. Обнаружен дозозависимый характер действия uiHCB и общей

фракции катионных балков ФЖ на мейотические преобразования хромосом. При добавках в культуральную среду МНСБ ( в концентрации ¿00 нг/мп) и катионных белков (в концентрации 90 мкг/мл) происходили достовернее увеличение выхода созревших ооцитов, уменьшение числа клеток с дегенерацией хромосом и синхронизация созревания ооцитов в культуре (авторское свидетельство № 1659474).

6. Использование в качестве тест-системы на митогенцую активность культуры клеток гранулеэы позволило повысить информативность знаний о характере действия ФЖ и ее пептидов на мейоз ооцитов коров. Обнаружено, что БФМ молекулярной массой свыше об кДа оказывают положительный эффект на синтез ДНК в клетках гранулезы.

7. Показано, что цитоморфологическая характеристика' ооцит-кумулюсных комплексов при их культивировании является одним из тестов, позволяющих оценить состояние ооцитов в динамике их дозревания. Установлено, что успешному ядерному созреванию ооцитов сопутствует активная пролиферация и разрыхление кумулос-ных клеток.

8. Выявленные различия в интенсивности флуоресценции нор -мальных и дегенерированных ооцитов, а также данные о гипераккумуляции дегенерированными ооцитами кальция могут Сыть использованы для ыорфофункциональной диагностики при проведении экспериментов по получению эмбрионов коров. (Положительное решение на изобретение № 140702 ) •

9. Установлено, что при дес'груктигшых изменениях ооцит-кумулюсных комплексов изменяется характер окислительно-восстановительных процессов в ооцитах и фолликулярных тканях. /у1я дегенерированных ооцитов характерно повышение соотношения НАДН/ФАД (¿,1 усл.ед. по сравнению с контролем 1,4 усл.ед.), как результат нарушений транспорта электронов в .дыхательной цепи. С нарастанием! атретических процессов в тканях фолликулов коэффициент КАДН/ФАД увеличивается (с 1,12 усл.ед. до 3,79 усл.ед.).

10. Моделирование созревания ооцитов на основе различных систем культивирования позволило выявить преимущество использования структурных элементов фолликула и БФЙ (в качестве за-

менителя сыворотки) по всей контролируемым параметрам мейоза и раннего эмбриогенеза коров (достижении ооцитада завершающих стадий развития,__ проценту дегенерации, оплодотворяемоети и качеству эмбрионов). (Приоритетная справка № 5064998 , положительное решение на изобретение № 132304 ).

IX. Обнаружена возможность партеногенетического развития ооцитов при внефолликулярном развитии ооцитов с использованием различных моделей культивирования. Наименьшие потенции к пар -теногенезу имели ооциты, созревшие в условиях применения Б5Ж. '

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ •

1.Использовать при совершенствовании технологии экстракорпорального созревания и оплодотворения системы дозревания ооцитов коров, включающие в свой состав ткань 3 -б мм фолликулов, отвечающих следующим цитоморфофункциональным характеристикам: высокий тургор, прозрачная внешняя оболочка, хорошо развитая сеть кровеносных сооудов, коэффициент НЛДН/ЗДЦ от 1,18 до 2,9 усл.ед.Для стандартизации условий культивирования в качестве заменителя сыворотки использовать Ш£ молекулярной массой более 35 кДа в концентрации 0,22-0,47 мг/мл.

2. При проведении экспериментов по получению эмбрионов из внефолликулярно созревших ооцитов осуществлять в динамике куль-.тивирования контроль за качеством ооцит-куадулюсных комплексов на основе комплексного теста, включающего цитоморфофункциональ-ную оценку ооцита (форма ооцита округлая, зона пеллюцида равномерная по ширине, тонкогранулированная ооплазма, коэффициент. НАДН/ФАД 1,4 + 0,018 усл.ед.).

3. для изучения влияния различных биологически активных веществ на мейоз использовать в 'качестве тест-системы на мито-генный эффект культуру клеток гранулезы.

4. Полученные данные о характере влияния ФЖ, БФЖ, факторов роста'на мейоз ооцитов коров, преобразованиях хромосом при культивировании ооцитов в различных культуральных системах, на- • чальных стадиях эмбриогенеза у коров могут быть использованы в учебных курсах по генетике и биотехнологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОЕАШШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ _______1.-Маылеев--Р.С.Голубев А.К., Кузьмина Т.И. и т. Влкя-----------------

ние 1ЩХЛ на созревание овоцитов коров вне организма Г/ Билл. ВНИНРГС. - 1981. - JÏ53. - С.40-41. ■

2. Кузьмина Т.И., Макарова З.Н. Прижизненная оценка ооци-

тов и рапних зародшеи млекопитающих с помощью витальных красителей // Балл. ВНИИРГЛ. - 1982. - ß56. - С.13-16.

3. Sdhct I.K., Голубев А.К;, Макарова З.Н., Кузьмина Т.И.

и др. Культивирование эмбрионов из ооцитов коров ПДокл. ВАСХНИЛ. - IS82. - !'-2. - С.26-28.

4. Эрнст Л.К., Голубев А.К., Кузылина Т.И. и др. Получение -эмбрионов KopoBin vit^уйат.конф.ЕАХ. - 1982. - С.1-8.

5.Эрнст Л.К., Голубев А.К., Макарова З.Н., Кузьмина Т.И. и др. Получение потомства из дозревшей и оплодотворенной in vitro яйцеклетки коровы // Вестник с.-х. науки. - IS83. - J57. -т 0.77-85.

6. Кузьмина Т.И., Макарова З.Н., Гузеватый O.E. Возможность использования фолликулярной иидкости для получения ¡эмбрионов коров //1У научио-произв.конф. "Пути повышения производительности с.-х. кивотицх".-Оренбург. - 1985. - С.52-53.

7. Макарова З.Н., Кузьмина Т.И., Каганская В.В. Цитологический и морфологический анализ развития яйцеклеток коров после оплодотворения in I Всесоюз.■конф, по цитоген.с.-х. животных. - 1985. - С.54-55.

8. Голубев А.К,, Макарова'З.Н., Кузьшша Т.И, К вопросу процесса оплодотворения in vitr0y кор9*уМатер. совещ. "Фундаментальное и ирактич. применение в медац. и с.-х. достижений био-техпологпл". - 1986. - С.195-196. Г

9. Каганская В.В., Кузьмина Т.И. Модификация сред для оп-лодотвор ния ооцитов коров путец введения в них биологически активных добавок //Б:злл.ВШ113т:т. - 1987. - £95. - С.24-25.

10. Гузеватпя O.E., Кузьмина Т.Н. Краткосрочное хранение ооцитов вне организма //Тез. докл.мол. ученых "Разработка методов бпошплеперпи в глв-ве для совершенств, продукт, и технолог, качеств с.-х. яивотнцх". - 1987. - С.29-31.

11. Кузьмина Т.И., Ткаченко C.B. Световой резким проведения экспериментов по получению эмбрионов вне организма //Тез.докл.

молодых учена: "Разработка методов биошпенерии в глв-ве для . совершенств, продуктов, и технолог, качеств с.-х. ншзотнцх".-1387. - С.32-33.

12. Голубев А.К., Сироткин A.B., Кузьмина Т.И., Макарова З.Н. Регуляция созревания.яйцеклеток с.-х. лшвотных // Итоги науки и техники сер. "2лвотноводстео- и ветерштрия". - т,15,-I9oß» — С. 132.

13. Голубев А.К., Кузьмина Т.И. Определение влияния С2К на созревание п оплодотворение ооцитов коров вне организма // Метод.ракоиенд. научного семинара "Использование современных методов исследований в биологии". - 1988. - С.8-12.

14. Кузьшша Т.Н., Голубев А.К., 3,т>ортяет\ Б.П. Моделирование условий созревания и оплодотворения ооцитов коров //Тез. ,докл. Всесоюз. научпо-технич. конф. "Применение биотехнологии .

гв животноводстве, растениевод., ветер., медицине". - 1908. -. С.1-2.

15. Кузьмина Т.И., Гойло Ï.A., Завертяев Б.П. ЭМзект белков фолликулярной-шщкости на мейоз ооцитов крупного * рогатого скота при их культивировании вне организма // Бгалл.ВШБ1РТ1Т. -1988. - !i> . С.25-27.

16. Гузеватый O.E., Макарова З.Н., Кузьмина Т.П. Динамика преобразования хромосом в ооцитах коров при их культивировании в зкидкости преовуляторных шолликулов // Трансплантация и культивирование эмбрионов крупного рогатого скота: Сб. научн. тр. ВШШРШ. - 1989. - С.44-48.

17.' Голубев А.К., Кузьмина Т.Н., Ткаченко C.B. Влияние аде-нозина и аденилатов на созревание ооцитов коров in. vitro // Трансплантация и культивирование эмбрионов крупного рогатого скота: Сб.научн.тр. / ВЫЙДЕТЕ. - 1989. - С.48-52.

18. Кузьмина Т.Н., Завортяев Б.П., Ткаченко C.B. и др". Гормональная регуляция ыепоза ооцитов коров в условиях их впе-

^олликулярного .культивирования ■// Мат. Всесоюз. коню. Тарту

3-15 сентября. - 1989. - 4.2. - 37 с.

19. Кузьмина Т.И., Дкаббур З.И., Завертяев'Б.П. Сезонные изменения оплодотворяемоети ооцитов коров при их культивировании вне организма // Бюлл.БШ1ЕГ2. - 1989. - J5II5. - С.25-26.

20. Дкаббур З.И., Кузылина Т.Н., Завертяев'Б.П. Оценка и отбор по жизнеспособности ооцитов крупного рогатого скота при их культивировании вне организма //Бюлл. ВПИПРИ. - 1989. -М09. - С.34-36.

• 21. Кузьмина- Т.И., Завертяев Б.П. Перспективы использования'эмбрионов коров, полученных из ооцитов, прокультивированных и оплодотворенных вне.организма, для трансплантации // Тез.докл. Всесоюз. совещу "Трансплантация эмбрионов с.-х. животных". - 1989. - С.15-16.

: ' 22. Кузьмина Т.И. Фолликулярная швдкость как модель среды для культивирования ооцитов коров //Тез.докл.Всесоюз.совещ. "Трансплантация эмбрионов с.-х. квотных".-IS89.--С.27-28.

23. Кузьмина Т.Н., Завертяев E.II., Ткаченко C.B. Перепек- . тивные метода получения эмбрионов для трансплантации //Бюлл. БШИш. - 1989. - 35 о.

24. Голубев А.К., Завертяев Б.П., Кузьмина Т.И. и др. Методические рекомендации по культивированию ооцитов коров // ВШЫРШ. - 1989. - 35 с. .

25. Завертяев Б.П., Кузылина Т.И. 'Детодн получения эмбрионов крупного рогатого скота вне организма //Центр НТИ и пропаганды» - -IS89.

26. Кузьмина Т.И., Завертяев Б.П., ШагиахметоЕа Г.А. Перспективы использования тканевой культуры фолликулов для созревания ооцитов коров вне организма // Тез. докл.Всесоюз. совещания "Проблемы развита биотехнологии в ¡кивотноводстве". - 1990. - С.22-24.

27. Кузьмина Т.И., Позднякова Т.О., Шагиахметова Г.А. Оценка качества исходно;; популяции оеток гршгулёзн с долью

получения моноолоя /Дчлл.ВШШРШ. - KI23. - 1990. - С.27-29.

28. Кузьмина Т.И., Гойло Т.А., Джаббур З.И. Протеолити-

—.чеокая-активнооть-Фолликулярной-}яидкостц-//Бюлл.ВШй1РШ. -__________

1990. - И19. - С.19-22.

29. Д:::аббур З.И., Кузьмина Т.Я., Шипев ИЛ". Спонтанное партеногенетическое развитие ооци-тов крупного рогатого окота пои их Ене^олликулярном культивировании //Бюлл.ВШЕПТЗ. -1990. - Л19. -С.29-31.

30. Zavertyaev В. Р. »Kuzmina T.I. In vitro оi bovine oocytes when using biologically active substances in culture medi-am.Matirial 4 Franco-ChechoSlovak meeting,199o,p.39.

31. Кузьмина Т.П., Шагиахметова Г.А., Завертяев Б.П. Модификация сред для экстракорпорального культивирования и оплодотворения оооттов крупного рогатого скота путем введения в лих гормонов //Иауч.консГ.. Биотехнология и воспроизводство в ;;швотноводотвв: Горки. - 1991. - С,36-37.

32. Кузьмина Т.П., Гойло Т.А., Позднякова Т.Э. Влияние протеинов Лоллику.лярнои жидкости на синтез да в культуре клоток грану лён //Еюлл.ВЬШРК;. - 1991. -.JJI29. - С.3-7.

33. Кузьмина Т.П., Малышев А.Ю. Гипераккумуляция меыбрая--связанного Ca" ооцитами коров при деструктивных изменениях ооцит-кумулюсного комплекса /7Бшл.ШШт£. - X99I. - JSI29. -О.7—9.

34. Кузьмина Т.П. Перспективы использования донорских ооцнтов коров в генетической и клеточной инженерии //Тез.докл.. научн.-произвол, конй. "Новые методы селекции и биотехнология в животноводстве". - 1991.

35. Кузьмина Т.П. ,оцит~кумулюсние взаимодействия при экстракорпоральном культивировании ооцнтов крупного рогатого скота //Докл.ВАСШШ. - 1991. - .т-6. - С.28-31.

Изобретения по теме диссертации

1. Эрнст Л.К., Голубев А.К., Кудрявцев И.В., Кузьмина и др. Способ получения партеногенетических зародышей. - Авторское свидетельство. - 1983. - Jé 1086808.

2. Эрнст JI.K., Голубев А.К., Макарова З.П., Кузьмина Т.Н. Способ получения эмбрионов коров. - Авторское свидетельство.-1987. - tö 13095е0.

' 3. Гончарова В.П., Голубев А.К., Кузьмина Т.Н., Гойло Т.А., Ромапюк В.А., Завертяев Б.П. Способ культивирования ооцнтов коров. - Авторское свидетельство. - 1991. - Si 1659474.

4. Кузьмина Т.Н., Гойло Т.А., Ткаченко C.B., Голубев А.К., Завертяев Б.II. Среда для культивирования ооцитов!» vitro. Положительное решение на изобрет. - 1992. - Jî 132304.

5. Кузьмина Т.П., Д-'лббур З.И., ¡Пагаюв И.В., Завортяов Б.П. Способ оцешш жизнеспособности ооцнтов. - Положительное решение на изобретение.-1992.- ГТ40702.

6. Кузьмина T. il. .Шагиахметова Г.А., Эрнст Л.К. Способ культивпрования ооцнтов.- Приоритетная справка.-1992.-;.'506499Ь.