Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Дозревание ооцитов коров вне организма в гомологичной фолликулярной жидкости

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Дозревание ооцитов коров вне организма в гомологичной фолликулярной жидкости"

РГ6 од - 1 ЯНВ 1996

На правах рукописи

ЗАБЕЛИНА Наталья Викторовна

ДОЗРЕВАНИЕ ООЦИТОВ КОРОВ ВНЕ ОРГАНИЗМА В ГОМОЛОГИЧНОЙ ФОЛЛИКУЛЯРНОЙ ЖИДКОСТИ

Специальность: 06.02.01—Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург—Пушкин 1995

Работа выполнена кафедре генетики, биотехнологии и ботаники Санкт-Петербургского государственного аграрного университета.

Научные руководители - академик ПАНИ, доктор биологических наук, профессор А. К. Голубев; доктор биологических наук Т.И.Кузьмина.

Официальные оппоненты - доктор биологических наук А.Д.Комис-саренко; кандидат биологических наук Л.В.Козикова.

Ведущая организация — Санкт-Петербургская государственная Академия ветеринарной медицины.

Защита состоится «24» января 1996 г. в 14 час. 30 мин на заседании заседании Диссертационного совета Д 120.37.05 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук в Санкт-Петербургском государственном аграрном университете по адресу: 189620, Санкт-Петербург-Пушкин, Петербургское шоссе, 2, аудитория 342.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан « ' » С/^.-(С&Ь ¿лЬ- 1995 г.

( !

Ученый секретарь о

диссертационного совета СС I

ССОЪе (СгЦ Т. А. Заморская

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время, несмотря на значительные успехи в разработке эффективных методов биотехнологии получения эмбрионов in vitro, остается нерешенной проблема создания систем дозревания ооцитов и развития эмбрионов, наиболее приближенных к их условиям завершения мейоза, оплодотворения и предимплан-тационного эмбриогенеза in vivo. Многочисленные исследования, проведенные в этой области, посвящены изучению влияния различных биологически активных веществ (гормонов, факторов роста и т.д.) на полноценное созревание яйцеклеток,подбору их концентраций и времени введения в системы культивирования ооцитов. Однако подобные исследования не позволяют стандартизировать условия завершения мейоза на основе введения в культу-ральную среду всех этих многочисленных факторов, регулирующих мейоз в организме. Вот почему все больше исследователей (Tellez-Martinez M.С., 1994; Sun F.J., 1994) возвращается к идее использования в качестве среды для дозревания ооцитов фолликулярной жидкости (ФЖ), как модели наиболее адекватно отражающей физиологические процессы in vivo. С другой стороны, систему ткань фолликула — ФЖ можно оценить как максимально характеризующую взаимодействие структурных элементов фолликула и продуктов их секреции, и с этой точки зрения ее использовать в качестве модели изучения процессов мейоза и раннего эмбриогенеза.

Цель и задачи исследований. Цель наших исследований состояла в создании системы дозревания и оплодотворения ооцитов на основе использования в качестве модели культуральной среды жидкости и ткани фолликулов. В соответствии с поставленной целью решали следующие задачи:

— выяснить характер влияния интактной и термически обработанной гомологичной ФЖ из фолликулов диаметром 15—18 мм на завершение мейоза и оплодотворение ооцитов коров in vitro;

— изучить эффект совместного использования ткани и жидкости фолликулов (в качестве системы дозревания яйцеклеток) на созревание ооцитов и раннее развитие эмбрионов;

— провести цитоморфологическую характеристику эмбрионов коров, полученных в условиях применения структурных элементов фолликула и ФЖ;

— изучить содержание мембрансвязанного Са в ооцитах и эмбрионах;

— сравнить концентрацию пролактина (ПРЛ), как одного из гипофизарных гормонов, выполняющих гонадотропную функцию, в нативной ФЖ и подвергшейся высокотемпературному воздействию (при 56°С и 100°С).

Научная новнзна. Впервые показана возможность оплодотворения ооцитов коров, созревших в 100% гомологичной ФЖ. Выявлен положительный эффект введения ткани фолликула в ФЖ на созревание и оплодотворяе-мость ооцитов. Показано, что использование термически обработанной ФЖ (30 мин при 56°С, 20 сек при 100°С) не оказывает отрицательного влияния на скорость ядерного созревания и частоту дегенерации хромосом, оплодотво-ряемость ооцитов и раннее развитие эмбрионов.

Практическая значимость. Разработан способ дозревания и оплодотворения ооцитов коров в 100% ФЖ. Показана возможность совершенствования разработанного способа путем введения добавок, в частности, ткани фолликулов.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на отчетных сессиях аспирантов (СПГАУ, 1993 — 1994), на 1-й Международной научной конференции молодых ученых и специалистов (Киев, 1994), на 2-й Международной научной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 1995).

Публикации. По теме исследований опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация со-

стоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и предложений, списка использованной литературы, включающего 146 источников, в т.ч. 101 иностранный. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста и содержит 14 таблиц, 10 рисунков, 6 микрофотографий.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом для исследований служили ФЖ, фолликулярные ткани и ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) из антральных фолликулов коров и половозрелых телок, убитых на Санкт-Петербургском мясокомбинате. Для экспериментов отбирали яичники без видимых признаков патологии, на стадии фолликулярного роста или с развитым желтым телом. Яичники доставляли в лабораторию при температуре 35—37°С в течение 1.5—2 ч после ова-риоэктомии.

ФЖ извлекали пункцией из антральных фолликулов диаметром 15—18 мм, содержащих 1.8—2.5 мл жидкости. После аспирации ФЖ центрифугировали при комнатной температуре 10 мин при 2000 об/мин. Суперна-тант отсасывали, фильтровали (МШрога 0.45 т) и добавляли гепарин до конечной концентрации 5 ед/мл. Полученную ФЖ подвергали термической обработке: Система 1 — инактивация жидкости при 56°С в течение 30 мин; Система 2 — t=100oC, экспозиция 20, 30, 40, 45 сек. Образцы ФЖ до и после термической обработки замораживали при температуре — 20°С для определения концентрации ПРЛ твердофазным радиоиммунологическим методом (Маринченко и др., 1982).

Фолликулы диаметром 3—6 мм выделяли, используя метод, разработанный в лаборатории культивирования эмбрионов ВНИИГРЖ (Голубев и др., 1989).

Качество фолликулов оценивали визуально по морфологической характеристике.

Нормальными считали фолликулы, имеющие высокий тургор, прозрачную оболочку и хорошо развитую сеть кровеносных сосудов в-теке. Фолликулы, не отвеча-

ющие этим требованиям, оценивали как атретические.

Фолликулы промывали в стандартной среде ТС-199 на растворе Эрла с добавлением гепарина и гентамицина в концентрации 1 ед/мл и 10 ед/мл соответственно. Для получения тканевой культуры фолликул разрывали глазными пинцетами в чашке Петри с 3 мл среды. Затем трехкратным промыванием ткани освобождали ее от ФЖ.

ОКК выделяли путем аспирации ФЖ из фолликулов диаметром 2—6 мм и промывали в среде ТС-199, содержащей 10% фетальной сыворотки (ФС) и 50 мкг/мл гентамицина. Для культивирования отбирали ооциты округлой формы, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойным компактным кумулюсом.

ОКК культивировали в чашках Петри в каплях среды, под вазелиновым маслом, при температуре 38.5°С в атмосфере воздуха с 5% СО2 и 90%-ной влажностью. Использовали модифицированную среду Паркера на основе ТС-199 с гентамицином (50 мкг/мл). В соответствии с целями эксперимента применяли следующие варианты систем культнвирования: ТС-199+10% ФС (контроль); 100% ФЖ+5 ед/мл гепарина (1 группа опыта); 100% ФЖ+ + ткань фолликула + 5 ед/мл гепарина (2 группа опыта). Образцы ФЖ до и после культивирования замораживали при температуре — 20°С для определения концентрации ПРЛ.

Капацитацню сперматозоидов и оплодотворение ооцитов проводили в соответствии с методом РагпэЬ et а1. (1986).

Для определения содержания мембрансвязанного Са2+ в ооцитах и эмбрионах использовали флуоресцентный зонд - хлортетрациклин. Ооциты и эмбрионы, морфологически оцененные как нормальные, механически очищали от кумулюсных клеток, помещали в кварцевые ячейки с физиологическим раствором, содержащим 40 мкМ хлортетрациклина и измеряли интенсивность флуоресценции на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ-И-1. Из полученной величины вычитали значение фонового значения. Содержание мембрансвязанного Са2+ 4

выражали в условных единицах интенсивности флуоресценции клеток.

Контроль за ядерным созреванием ооцитов и эмбрионов осуществляли с помощью цитогенетического метода (Tarkowski,1966). Для морфологической оценки фолликулов, ОКК и эмбрионов использовали микроскоп МБС-9 при увеличении 2x14. Исследования хромосом в ооцитах и эмбрионах проводили под микроскопом "Olympus" при увеличении 900 х.

Для статистической обработки полученных данных использовали критерий Стьюдента и метод "хи-квадрат".

Результаты собственных исследований и их обсуждение Созревание и оплодотворение ооцитов коров в условиях применения неинактивированной ФЖ. Фолликулярная жидкость является сложной, многокомпонентной, нативной средой жизнедеятельности женских гамет. В ней формируется обобщенный регуляторный сигнал, направляющий развитие ооцита. Большой интерес представляет использование ФЖ как естественной среды созревания при культивировании ооцитов вне организма. Во многих лабораториях мира ведутся работы по изучению состава ФЖ и влияния ее компонентов на созревание ооцитов in vitro (Morgan et al., 1990; Wood et al., 1993; Reed et al.,1993).

С целью моделирования in vitro естественных условий созревания ооцитов мы использовали в качестве среды 100% гомологичную ФЖ из антральных фолликулов диаметром 15—18 мм с объемом жидкости 1.8—2.5 мл. В ряде экспериментов применяли добавки в среды тканевой культуры из фолликулов диаметром 3—б мм. Согласно данным литературы, в фолликулах такого размера слабо выражены атретические процессы (Кузьмина, 1993; Lonergan et al.,1994)

Время культивирования составляло 28 часов, т.к., в соответствии с данными литературы (Гузеватый,1988), время созревания ооцитов в ФЖ in vitro находится в диапазоне 28—34 ч.

После культивирования не обнаружено достоверных

различий по выходу созревших ооцитов между контрольной и 1-й опытной группой (61.0% и 48 .7% соответственно), а также по проценту яйцеклеток с признаками дегенерации хромосом (5.3% и 2 .6% соответственно) (табл. 1). Однако при культивировании в ФЖ с тканью фолликула число ооцитов на поздних стадиях мейоза было выше на 25.1%, чем в контроле (Р<0.01) и на 37.4%, чем в 1-й опытной группе (Р<0.001).

Во всех случаях наблюдали большое число ооцитов, остановивших свое развитие на стадии М-1, кроме группы где культивирование проводили с использованием ткани фолликула (30.6 — 34.2% против 11.1%).

Анализ полученных данных дал основания утверждать, что наиболее оптимальным является вариант, где в качестве среды была использована 100% ФЖ с тканью фолликулов . Он обеспечивал достаточно высокий (86 .1%) выход числа ооцитов на завершающих стадиях мейоза и низкий (7.7%) процент яйцеклеток с дегенерацией хромосом .

После осеменения ооцитов (табл.2) не отмечено достоверных различий по проценту выхода эмбрионов (60.0% и 51.9% соответственно).

Но между контролем и опытом обнаружена значительная разница по числу эмбрионов находящихся на продвинутых стадиях развития (>8-ми клеток): Контроль-11.1%; Опыт 1 — 28.6% (рпс.1)

Подобная картина имела место и при ко-культи-вировании ооцитов с тканью фолликулов в 100% ФЖ (табл.3). Мы не наблюдали достоверных различий по проценту выхода эмбрионов между контрольной и опытной группами: 58.3% и 69.0% соответственно. Однако в контрольной группе не было обнаружено ни одного эмбриона на продвинутых стадиях развития (>8- ми клеток). В то же время при использовании ФЖ с тканевой культурой в качестве культуральной среды было получено 75.9% эмбрионов на поздних стадиях развития (рис. 2).

Не было также обнаружено достоверной разницы по выходу эмбрионов с признаками дегенерации между 6

1. Реинициация мейоза при культивировании ооцитов коров с использованием неинактивированной ФЖ и ткани фолликулов. (Время культивирования - 28 ч)

Среда культивирования Число ооцитов п Выход ооцитов на различных стадиях мейоза (%) % ооцитов инициировавших мейоз % ооцитов• с признаками дегенерации

ДП ДК М-1 А+Т+М-2

Контроль ТС-199+

+10% фетальной 38 2.8 5.6 30.6а 61.0е 97.2 5.3

сыворотки

Опыт 1

ФЖ(УФЖ=1-8- 78 1.3 15.8 34.2 48.7е 98.7 2.6

2.5 мл)+гепарин

(5 ед/мл)

Опыт 2

ФЖ(Уфж=1.8- 78 - 2.8 11.1Ь 86.1а 100.0 7.7

2.5 мл)+гепарин

(5 ед/мл) ткань

фолликула диа-

метром 3-6 мм

Примечание. ДП - Диплотена, ДК - диакинез, М-1 - метафаза-1, А+Т+М-2 - анафаза+телофаза+ +метафаза-2; в табл. 6, 9 обозначения те же. " а,Ь - Р < 0.05; е'а - Р < 0.01; ^ - Р < 0.001.

2. Использование неинактивированной ФЖ в качестве питательной среды для получения эмбрионов коров in vitro

Число % Число оп- Число п , %

Группы прокульти- созревших лодотво- (%) Дро-

опыта вированных ооцитов ооцитов (А+Т+М-2) ренных яйцеклеток бящихся зигот 2-Х 3-Х 4-Х 6-8 >8 из них с признаками дегенерации

Контроль ТС-199+ 56 60.5 45 27, 16, 2, 5, 1, 3, 10.

+10% фетальной 60.0 59.3 7.4 18.5 3.7 11.1 37.0

сыворотки

Опыт 1

ФЖ(УфЖ=1.8-2.5 62 48.0 54 28, ю, 2, 7, 1, 8, 9,

мл)+гепарин 51.9 35.7 7.1 25 3.6 28.С 32.1

(5 ед/мл)

п — число полученных эмбрионов на различных стадиях.

GO

Рис. 1. Влияние неинактивированной ФЖ и ткани фолликула на выход

эмбрионов коров на разных стадиях развития. Контроль: ТС-199+10% фет. сыв.; Опыт 1: 100% ФЖ ^фж= =1.8-2.5 мл)+гепарин.

Контроль

6-й (25.0%)

4-Х (25.0%) Опыт 2

(0.0%)

1-Х (25.0%)

< -X (25.02

-3-х (0.0%)

(24.17

>0 (75.9%)

Рис. 4. Влияние неинактивированной ФЖ и ткани фолликула на выход

эмбрионов коров на разных стадиях развития. Контроль: ТС-199+10% фет. сыв.; Опыт 2:100% ФЖ (Уфж= =1.8-2.5 мл)+ткань фолликула диаметром 3-6 мл + гепарин.

контрольной и 1-й и 2-й опытными группами (37.0— 35.7% 32.1%, 37.9% соответственно).

Анализ данных проведенных нами экспериментов (табл.2, 3) показывает, что применение в качестве куль-туральной среды 100% неинактивированной ФЖ позволяет создать эффективную систему дозревания ооцитов, способных к оплодотворению и дальнейшему развитию. При этом было отмечено увеличение выхода эмбрионов на более поздних стадиях развития.

Влияние неинактивированной ФЖ на содержание мембрансвязанного Са2+ в ооцитах и эмбрионах коров, полученных после оплодотворения in vitro. Одним из важных моментов, определяющих эффективность технологических приемов получения эмбрионов из созревших и оплодотворенных вне организма яйцеклеток, является контроль за их качеством. В настоящее время хорошо известно, что универсальным внутриклеточным посредником в регуляции множества биохимических процессов в клерке является кальций (Strieker et al.,1994).

С целью изучения динамики накопления кальция в ооцитах в процессе культивирования в гомологичной ФЖ, а также после их оплодотворения in vitro, нами проведены эксперименты по определению содержания мембрансвязанного Са2+ в клетках. В опытах использовали ОКК и эмбрионы морфологически оцененные как нормальные . В соответствии со временем экспозиции происходило увеличение содержания мембрансвязанного Са2+ как в контрольной, так и в опытной группах (табл. 4). Однако достоверной разницы между результатами этих групп не отмечено.

Было установлено, что содержание мембрансвязанного Са2+ увеличивается в эмрионах по мере увеличения в них числа бластомеров (табл.5).

Ранее нами было показано, что после оплодотворения ооцитов дозревших в 100% ФЖ коров, увеличивается выход эмбрионов на поздних стадиях развития (>8-ми клеток, рис. 2). При исследовании содержания мембрансвязанного Са2+ было установлено, что использование ю

3. Использование неинактивированной ФЖ и ткани фолликула в качестве питательной среды для получения эмбрионов коров in vitro

Группы опыта Число прокультивированных ооцитов % созревших ооцитов Число оплодотворенных яйцеклеток Число (%) дробящихся зигот п, %

2-Х 3-Х 4-Х 6-8 >8 из них с признаками дегенерации

Контроль ТС-199+ 54 59.0 48 28, 7, 7, 7, 7, - ю,

+10% фетальной 58.3 25 25 25 25 - 35.7

сыворотки

Опыт 2

ФЖ(Уфж=1.8-2.5 58 80.5 42 29, - - 7, - 22 11,

мл)+ткань фоллику- 69.0 24.1 75.9 37.9

ла диаметром 3-6

мм+гепарин (5 ед/мл)

•к

п — число полученных эмбрионов на различных стадиях.

4.Динамика накопления мембрансвязанного о_1_

Са^ в ооцитах, прокультивированных в неинактивированной ФЖ

Система культи - Содержание мембрансвязанного Са2+ (усл.ед)

Время экспозиции (ч)

0 22 28

Контроль: ТС-199+10% фета-льной сыворотки Опыт 1: 1.08+0.05а (п=39) 1.54±0.04Ь (п=10) 1.67±0.08° (п=1б)

ФЖ (Уфж-1.8- 2.5 мл)+гепарин (5 ед/мл) 1.08±0.05а (п=39) 1.48±0.04Ь (п=12) 1.7010.09е (п=18)

Примечание, п - число исследованных ооцитов.

а'Ь - Р<0.001; а-с - Р<0.001.

• П I

5. Со держание мембрансвязанного Са в эмбрионах коров, полученных при различных условия культивирования

Система культи-рования Содержание мембрансвязанного Са2+ (усл.ед)

Эмбрионы на разных стадиях развития

2-х 4-х >8

Контроль: ТС-199+10% фета-льной сыворотки Опыт 1: ФЖ (неинакти-вированная)+ге-парин (5 ед/мл) 1.59+0.03а (п=7) 1.30+0. 04е1 (п=7) 1.90±0.07Ъ (п-5) 1.77+0.08е (п=С) 2.22±0.06° (п-5) 2.00±0.0бк (п=4)

Примечание. Уфж = 1.8-2.5 мл п — число исследованных эмбрионов.

- Р<0.05; а'с - Р<0.001; - Р<0.05; Ь-с - Р<0.01; - Р<0.001; - Р<0.001;

е'к - Р<0. 05; с>к - Р<0.05.

этой культуральной системы снижает накопление мем-брансвязанного Са2+ в эмбрионах.

Результаты свидетельствуют о том, что использование в качестве среды созревания 100% ФЖ коров не влияет на содержание мембрансвязанного Са2+ в ооцитах, хотя и приводит к некоторому его уменьшению в эмбрионах .

Созревание и оплодотворение ооцитов коров в условиях применения инактивированной ФЖ. По химическому составу ФЖ близка к сыворотке (Edwards, 1974). Она содержит сходные белки, аминокислоты, сахара, ферменты, гонадотропные и стероидные гормоны и т.д. В настоящее время в культуральных системах применяют сыворотку, инактивированную нагреванием при 56°С в течение 30 мин. Нами исследовано влияние обработки ФЖ на созревание в ней ооцитов, а также на выход эмбрионов после их оплодотворения.

Для культивирования ОКК были использованы изученные ранее системы (табл. 1). ФЖ подвергалась нагреванию при 56°С в течение 30 мин.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение в качестве культуральной среды ФЖ, подвергшейся инактивации (56°С, 30 мин), ни только не уменьшает число ооцитов, достигших завершающих стадий мейоза, но и достоверно увеличивает их выход при ко-культивировании с тканью фолликула в 100% ФЖ (PcO.OOl, табл. 6).

Также обнаружено, что тепловая обработка ФЖ при 56°С в течение 30 мин не снижает способности к оплодотворению ооцитов, созревших в условиях ее применения (табл. 7).

При этом, межу контрольной и опытными группами не отмечено достоверной разницы в проценте ооцитов и эмбрионов с признаками деструктивных изменений.

В целом, результаты экспериментов свидетельствуют о том, что тепловая обработка ФЖ при 56°С в течение 30 мин не снижает способности ооцитов к созреванию и оплодотворению.

Влияние высокотемпературной обработки ФЖ на

13

ее физическое состояние и возможность использования в качестве среды культивирования ооцитов in vitro. Одним из основных компонентов ФЖ являются белки, имеющие широкий спектр действия на фолликулогенез и мейотическое созревание ооцитов (Krummen et al., 1993). С учетом различной термостабильности белков, содержащихся в ФЖ, нами проведены эксперименты по изучению влияния продолжительности высокотемпературного воздействия (при 100°С) на физическое состояние жидкости, извлеченной из фолликулов диаметром 15—18 мм. Исследована также возможность использования такой ФЖ в качестве среды культивирования ооцитов вне организма.

В результате экспериментов выяснилось, что 20 сек является максимально допустимым временем нагревания, при котором не происходит изменения физического состояния ФЖ (табл.8).

Анализ данных по культивированию ооцитов в ФЖ, предварительно подвергшейся термической обработке при 100°С (табл.9), показал, что нагревание в течение 20 сек не оказывает отрицательного влияния на свойства ФЖ, которые обеспечивают полноценное созревание яйцеклеток .

Однако следует обратить внимание на результаты созревания ооцитов в ФЖ, обработанной в течение 40 сек. В этой группе все ооциты находились или на поздних стадиях созревания (82.1%), или в стадии дегенерации (17.9%). Возможно, что дегенерация в этих ооцитах наступила в результате их перезревания.

Дозревание и оплодотворение ооцитов коров в условиях применения ФЖ, подвергшейся высокотемпературной обработке. По данным литературы, значительная часть ингибиторов и стимуляторов мейоза, входящих в состав ФЖ, имеют белковую природу и представлены как термостабильными, так и термолабильными белками (Guraya, 1985).

С целью выяснения биохимической природы биологически активных факторов, входящих в состав жидкости больших антральных фолликулов и влияющих на 14

6. Реинициация мейоза при культивировании ооцитов коров с использованием инактивированной"

ФЖ и ткани фолликулов (Время культивирования - 28 ч)

Среда куль- Число Выход ооцитов на различных стадиях мейоза (% ) % ооцитов % ооцитов

п ДП ДК М-1 А+Т+М-2 вших мейоз дегенерации

Контроль ТС-199+ +10% фетальной сыворотки 43 2.5 5.0 37.5а 55.0Ь 97.5 7.0

Опыт 1 ФЖ(Уфж=1.8-2.5 мл)+гепарин (5 ед/мл) 50 2.3 2.3 34.0° 61.4а 97.7 12.0

Опыт 2 ФЖ(Уфж=1.8-2.5 мл)+гепарин (5 ед/мл)+ткань фолликула диаметром 3-6 мм 58 - 1.9 5.6е 92.6к 100.0 6.9

''обработки = 56С; ЭКСП03ИЦИЯ " 30 мин- а'е ~ р < 0.001; - Р < 0.001; Ь' - Р < 0.001; - Р < 0.01.

с,е

7. Использование инактивированной" ФЖ и ткани фолликулов в качестве питательной среды

для получения эмбрионов коров in vitro

Число % Число оп- Число п %

Группы прокульти- созревших лодотво- (%) Дро-

опыта вированных ооцитов ренныхяй- бящихся 2-8 клето- с признаками

ооцитов цеклеток зигот чных дегенерации

Контроль ТС-199+ CL 51.5

+10% фетальной 65 53 28, 52.8 19, 67.9 9, 32.1

сыворотки

Опыт I £

ФЖ(Уфж=1.8-2.5 60 59.8 48 24, 50 15, 62.5 9, 37.5

мл)+гепарин

(5 ед/мл)

Опыт II С.

ФЖ(Уфж=1.8-2.5 58 90.3 40 28, 70 16, 57.1 12, 42.5

мл)+геиарин

(5 ед/мл)+ткань

фолликула диамет-

ром 3-6 мм

t„=„„-„^„„ = 56°С; экспозиция: 30 мин. ^^ оораоотки

""п - число полученных эмбрионов.

а,с

- Р < 0.001:

Ь,с

- Р < 0.01.

8. Влияние продолжительности высокотемпературной обработки на консистенцию ФЖ

Объем Экспози- Состояние ФЖ: Группы опыта ФЖ, ция, сек гелеобразное

мл (+), жидкое (-)

ФЖ + гепарин 1 20 ---

ФЖ + гепарин 1 30 - -/+

ФЖ + гепарин 1 40 - -/+

ФЖ + гепарин 1 45 +

Примечание. Уф_ж_-1.8-2.5 мл, 1обработкн=Ю0'С, Конц. гепарина - 5 ед/мл.

9. Влияние времени термической обработки ФЖ на ядерное созревание ооцитов коров (время культивирования — 28 ч)

Условия Экспо- Число % ооцитов

культи- зиция проку- на стадиях

вирова- высоко- льтиви--

ния темпера- рованных Дк-М-1 Т-М-2

турной ооцитов обработ ки, сек

% ооцитов с признаками дегенерации

ФЖ+ 20 30 30.0 63.3 6.7

гепарин

ФЖ+ 30 25 32.0 60.0 8.0

гепарин

ФЖ+ 40 28 - 82.1 17.9

гепарин

Примечание. ^^„^-«(ГС, Уф ж =1.8-2.5 мл, Конц. гепарина - 5 ед/мл.

10. Реинициация мейоза при культивировании ооцитов коров с использованием ткани инактивированной"

ФЖ и фолликулов. (Время культивирования — 28 ч)

Среда Число Выход ооцитов на различных стадиях мейоза (%) % ооцитов % ооцитов

рования тов п ДП ДК М-1 А+Т+М-2 вших мейоз дегенерации

Контроль ТС-199+ +10% фетальной сыворотки 35 - 6.1 33. за 60.6° 100.0 5.7

Опыт 1 ФЖ(Уфж=1.8-2.5 мл)+гепарин 5 ед/мл) 88 1.2 1.2 22.3 75.За 98.8 8.0

Опыт 2 ФЖ(Уфж=1.8-2.5 мл)+1'епарин (5 е;(/мл)+ткань фолликула диаметром 3-6 мм 83 2.6 - 15.4Ь 82.0е 97.4 6.0

" а Ь г р Н р

гобтЙ тки = 100С; экспозиция - 20 сек. ' - Р < 0.05; ' - Р < 0.01; ' - Р < 0.05.

созревание ооцитов, нами проведены эксперименты по культивированию последних в жидкости фолликулов диаметром 15—18 мм, подвергшейся высокотемпературному воздействию (табл. 10).

Для культивирования ОКК были использованы изученные ранее системы (табл. 1, 6) • ФЖ подвергали нагреванию при 100°С в течение 20 сек.

Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что термически обработанная ФЖ обеспечивает нормальное созревание ооцитов. В процессе культивирования наблюдали возрастание числа ооцитов достигих завершающих стадий мейоза в 1-й опытной группе по сравнению с контролем (75.3% и 60.6% соответственно). Введение в среду культивирования ткани фолликула достоверно увеличивало процент созревших ооцитов по сравнению с таковым в контроле (82.0% и 60.6% соответственно, Р<0.01). Однако в этих условиях не отмечено достоверной разницы по проценту раздробившихся зигот и числу эмбрионов с признаками дегенерации между опытными и контрольной группами (табл. 11).

Таким образом, использование обработанной при 100°С жидкости больших антральных фолликулов, одной или в сочетании с тканью фолликула, приводит к ускорению ядерного созревания ооцитов, однако не влияет на способность раздробившихся зигот к дальнейшему развитию .

Содержание иммунореактивного ПРЛ в ФЖ в зависимости от способа ее термической обработки. В настоящее время рядом исследователей показано, что наряду с гонадотропными и стероидными гормонами в ФЖ содержится и ПРЛ, который участвует в регуляции фолли-куло- и оогенеза у этих животных (1гаЬага,1991; Лебедева,1995). Учитывая также тот факт, что ПРЛ является полипептидным гормоном, синтезируемым гипофизом, мол. масса которого около 23 к Да, что находится в диапазоне, близком к мол.массе ЛГ и ФСГ (около 25 кДа), можно допустить, что применяемая нами термическая обработка оказывает сходное влияние на все три указанных гормона.

В связи с этим, методом радиоиммунологического анализа нами изучено содержание ПРЛ в жидкости, извлеченной из антральных фолликулов диаметром 15—18 мм, в зависимости от способа ее обработки: неинактиви-рованная ФЖ; инактивированная ФЖ 1 (56°С, 30 мин); инактивированная ФЖ 2 (100 С, 20 сек) (табл. 12).

Полученные данные показывают зависимость содержания иммунореактивного ПРЛ от температуры и продолжительности нагревания ФЖ. Тепловая обработка ФЖ при 56°С в течение 30 мин приводит к снижению содержания иммунореактивного ПРЛ, в то время как таковая при 100°С в течение 20 сек не оказывает влияния на его содержание.

Выводы

1. Показано, что гомологичная жидкость фолликулов диаметром 15—18 мм является полноценной средой для культивирования и оплодотворения ооцитов коров. Она не уступает общепринятой системе (среда ТС-199+10% фет.сыв.), а в некотором отношении ее превосходит — выход эмбрионов на более поздних стадиях развития (>8-ми клеток) был всегда выше в опыте (фолликулярная жидкость), чем в контроле;

2. Установлен положительный эффект на созревание ооцитов добавок в ФЖ ткани фолликулов диаметром 3—6 мм. Выход созревших клеток увеличивался на 25 .1% по сравнению с контролем (Р<0.01);

3 . Ооциты и эмбрионы, полученные с использованием ФЖ, существенно не отличались по содержанию мем-брансвязанного Са2+ от контрольной группы, что свидетельствует об их удовлетворительном состоянии;

4 . Показано, что термическая обработка ФЖ (30 мин при 56°С и 20 сек при 100°С) не оказывает влияния на ее физические свойства и культуральные качества;

5. Использование для культивирования ФЖ, подвергшейся термической обработке при 100°С в течение 20 сек, способствовало более высокому выходу созревших ооцитов (75.3%) по сравнению с контролем (59.0%).

6. При тепловой инактивации ФЖ (56°С, 30 мин)

11. Использование инактивированной" ФЖ и ткани фолликулов в качестве питательной среды для

получения эмбрионов коров in vitro

Число % Число оп- Число •к-к п , %

Группы прокульти- созревших лодотво- (%) дро-

опыта вированных ооцитов ренныхяй- бящихся 2-8 клето- с признаками

ооцитов цеклеток зигот чных дегенерации

Контроль ТС-199+

+10% фетальной 56 58.2 44 26, 59.0 17, 65.4 9, 34.6

сыворотки

Опыт 1

ФЖ(Уфж=1.8- 62 73.8 54 29, 18, 62.1 11, 37.9

2.5 мл)+гепарин 53.7

(5 ед/мл)

Опыт 2

ФЖ(УфЖ-1.8. 50 81.5 38 25, 14, 56.0 11, 44.0

2.5 мл)+гепарин 65.8

(5 ед/мл)+ткань

фолликула диамет-

ром 3-6 мм

J »обработки = 100 С; 20 сек" ьэ п - число полученных эмбрионов.

12. Содержание иммунореактивного ПРЛ в ФЖ в зависимости от способа ее обработки

(объем фолликулов =1.8-2. 5мл)

Способ обработки ФЖ Число независи- Концентрация

мых определений ПРЛ в ФЖ, нг/мл

Неинактивированная 'РЖ Инактивированная ФЖ 1 Инактивированная ФЖ 11

19.9+0.9 14.0+1.3 22.3+1.1

Примечание.Ц'Ь - Р<0.05,Ь'° - Р<0.01.

уменьшается содержание иммунореактивного ПРЛ с 19.9+ +0.9 нг/мл до 14.0+1.3 нг/мл. Кратковременная высокотемпературная обработка (100°С, 20 сек) не влияет на концентрацию ПРЛ в ФЖ.

Практические предложения

1. Рекомендуем использовать гомологичную фолликулярную жидкость, содержащую 5 ед/мл гепарина, в качестве одной из базовых сред при созревании и оплодотворении ооцитов коров in vitro.

3. Материалы диссертации могут быть использованы в учебных курсах по генетике, физиологии и биотехнологии, селекции и воспроизводству сельскохозяйственных животных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Позднякова Т.Э., Забелина Н.В. Совершенствование системы дозревания ооцитов коров для целей экстракорпорального оплодотворения й Мат. 1-й Международной конф. молодых ученых и специалистов 16—17 февраля. Тез. докл. Киев.- 1994.-С.73.

2. Кузьмина Т.П., Шагиахметова Г.А., Забелина Н. В. Цитоморфологическая характеристика эмбрионов коров, полученных из экстракорпорально созревших .и оплодотворенных ооцитов Й Мат. Всеукраинской юбилейной научно-практической конф. Тез. докл. Киев. -1994.-С.63.

3. Кузьмина Т.И., Позднякова Т.Э., Шагиахметова Г.А., Забелина Н.В. Кариологические нарушения в эмбрионах коров, полученных из экстракорпорально созревших ооцитов // Мат. Международной научной конф. 5—8 сентября. Боровск.-1995 .-С. 195 .

4. Голубев А. К., Забелина Н. В., Кузьмина Т. И., Шагиахметова Г.А. Дозревание ооцитов коров в гомологичной фолликулярной жидкости // Мат. Международной научной конф. 5—8 сентября. Боровск.-1995 .-С. 176.