Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние биологически активных веществ на созревание и оплодотворение in vitro ооцитов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние биологически активных веществ на созревание и оплодотворение in vitro ооцитов крупного рогатого скота"

На правах рукописи

РГ-Б ОД

Ахмолдаева Анар Муханбег/кановна^'^

Влияние биологически активных веществ на созревание и оплодотворение in vitro ооцитов крупного рогатого скота

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискания учёной степени кандидата биологических наук

Дубровины. Московская область - 2000.

Диссертационная работа выполнена в Российском унивсрсшсге дружбы народов и в отделе трансплантации эмбрионов сельскочоляйа пенных животных Всероссийского научно-исследовательского института жиношоводства (ВИЖ)

Научные руководители.

доктор биологических на>к, профессор 11.11. СЕР!'ЕКВ

доктор биологических наук, профессор И.А.ПОРФИРЬЕВ Официальные оппоненты, докггор биологических наук, профессор С В Советкин

кандидат биологических на>к И Г Клецко

Ведущее учреждение: Российская академия менеджмента в животноводстве

Защита диссертации состоится 'Д"" ¿¿^-у 2000г /Л

в .Л"..час, на заседании диссертационного совета Д 020 16.02 во Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства Адрес: 142012. п. Дубровицы, Подольского района, Московской области.

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института животноводства.

Автореферат разослан «<¡>¿¿,1*.2000г

/Я

у

Ученый секретарь диссертационного совета, /!/ кандидат биологических наук .П.Губанова

П0 * '

I 1

I Общая характеристика paooiu Актуальное!!. icvi>i Трансплантация змбрттон являсгся эффект вным ouoicmiojioi нческнм чстолим воспроизводства живогнш, который иаюльзусгся в насюящее время для ускорения генетического npoiрсссз и молочном скотоводстве. Низкий коэффициент рапнюжения крупного poiaroix) choia и продолжительный интервал поколений существенно ограничивают возможности селекции мелочною стада.

Современные экономические условия диктукп неотложную необходимость ионышения интенсивности селекционной работы но совершенствованию племенных и продуктивных качесгв животных, создания современных высокопродуктивных пород, линий и гибридов скота, отвечающих требованиям постоянно меняющейся конъюнктуре рынка.

В настоящее время в племенных хозяйствах генетический прогресс породы снижается из-за преждевременной выбраковки высокопродуктивных животных-вирусоноентелей. Для предотвращения исчезновения наиболее ценных животных можно использовать npoipaMMy эмбриопересадок. Получение эмбрионов от животных -внрусоносителей, их отмывание и обработка в растворе трипсина позволяют полностью удалить вирусы лейкоза, рннотрахента и др., располагающиеся на оболочках клеток. Использование в качестве реципиентов здоровых животных гарантирует оздоровление стада без понижения генетического потенциала. (Решегникова Н.М, 1997г)

Развитие биотехнологических методов позволяет на современном этапе эффективнее использовать репродуктивный потенциал высокопродуктивных животных. Однако использование новых биотехнологических методов, а также проведение исследований в области биологии эмбрионального развития сдерживаются высокими материальными затратами на получение эмбрионов на ранних стадиях развития.

Большое значение в решении данной проблемы отводится специализации по созреванию и оплодотворению ооцитов вне организма, с целью удовлетворения потребности науки и практики в ранних эмбрионах.

Одним из путей снижения стоимости эмбрионов является получение яйцеклеток при убое высокоценных коров после выбраковки на мясо и оплодотворение яйцеклеток in vitro.

Максимальное использование генетического фонда яйцеклеток возможно лишь в условиях созревания и оплодотворения in vitro.

Эффективность получения эмбрионов вне организма в настоящее время составляет

лишь 10% живого потомства. Низкий процент обусловлен, прежде веет, неполноценным созреванием ооц»пов in vitro. Для обеспечения полноценного созревания ооцитов необходимо смоделировать условия in vitro близкие к естественным Успех культивирования ооцитов вне организма зависит от многих факторов - качества культуральных сред, сочетания в культуральноп среде биологически активных веществ, соблюдения температурного и газового режимов, возраста, времени года и генотипа животного. Усовершенствовать существующие методы регуляции созревания ооцитов возможно путем включения клеточных элементов интактных фолликулов и кондиционных сред, а также путем воздействия на пострецепторные внутриклеточные посредники действия гормонов.

Применение метода трансплантации эмбрионов по системе МОЕТ (множественная овуляция и эмбриотрансплантация) ускоряет генетический прогресс в (0 раз по сравнению с методом искусственного осеменения (Решетникова Н.М, Мороз Т А, 1997)

Английские ученые проводили опыты по производству эмбрионов коров in vitro в большом количестве, и пришли к выводу, что применение этой технологии возможно в производстве, и в ближайшем будущем будет иметь огромное значение в развитии скотоводства (Лонерган Р., 1994г).

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы явилось совершенствование метода культивирования и оплодотворения вне организма ооцитов крупного рогатого скота.

Исследования влияния аффекта биологически активного вещества на созревание и оплодотворение ооцитов in vitro подразумевает следующие этапы: .

1) выявление оптимальной концентрации, в которой биологически активное вещество оказывает какой-либо эффект на мейоз ооцитов коров; ,

2) определение характера влияния биологически . активных веществ на оплодотворение, дробление и выход качественных эмбрионов на пролонгированных стадиях развития (морула, бластоциста).

Для,(достижения поставленной цели необходимо было решить следующие ссновньг? злпачи:

1. Определить влияние сезона года на созревание и оплодотворение ооциов крупного рогатого скота при культивировании вне организма.

2. Определить влияние эстральной сыворотки и гонадотропных гормонов на

созревание и оплодотворение ооцитов in vitro. А также выявить минимальную концентрацию эстральной сыворотки и гонадотропных гормонов, влияющих положительно на созревание ооцитов. 1

3. Выяснить роль гепарина и различных сред для капацитации и времени их соинкубирования с ооцитами на оплодотворяющую способность спермиев и их выживаемость в кулътуральных средах.

4. Изучить влияние фолликулов и их стенок, соматических клеток на развитие зародышей после экстракорпорального оплодотворения ооцитов in vitro.

Научная новизна Научная новизна исследований состоит в эффективности использования биологически активных веществ для созревания и оплодотворения оощгтов in vitro. Продемонстрирована возможность преодоления блока клеточного деления на стадии 8-16 бластомеров путем использования монослоя гранулезных клеток. Впервые была установлена оптимальная доза 50мкг/мл гепарина для капацитации спермы быков, при котором процент дробления составил 42,5%,

Практическая значимость работы. На основании результатов проведенных исследований разработаны оптимальные культуральные среды, с добавлением эстральной сыворотки и гонадотропных гормонов, при котором созрело ооцитов 56%, а оплодотворилось 50%. Предложено, минимизировать концентрацию эстральной сыворотки до 5% с добавлением 20мкл/мл ФСГ, что позволит получить до 59,7% созревших ооцитов и 58,1% оплодотворенных ооцитов in vitro. Показана одинаковая эффективность созревания, оплодотворения и развития ооцитов крупного рогатого скота в культуральных средах ТСМ-199, МРМ, МММ. Предложено сокультивирование на монослое гранулезных клеток для успешного преодоления 8-16 клеточного эмбрионального блока.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на ежегодных научно-практических конференциях Российского университета дружбы народов (1998-1999).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы две печатных работ в центральном журнале России "Молочное и мясное скотоводство" и " Племенное дело".

C^pУJ^^rvpa__Ji.oGь_c^!_^U!C№p^"ЦГ^Ui Диссершшонная работа изложена на 103 страницах машинописного текста н состоит из введения, обзора лшерапры. описания материалов и методики исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, вы волом н практических предложений. Цифровой материал предеганлен в ]0 таблицах, иллюстрирован 10 рисунками Список литературы включает 125 ис/очииков отечественных и зарубежных авторов

2. Материал и методика исследований

Эксперименты проводились на аспирироиакных из яичников яйцеклетках крупного рогатого скота. С Подольского экспериментального мясокомбината яичники доставляли в течение 1,5-2 часов. В экспериментах использовались яичники без патологических изменений. Яичники с геморрагическим желтым телом, фолликулярной кистой, с жировой Дистрофие:й, а также яичники от стельных животных отбраковывались.

Транспортировали яичники в лабораторию в термосе, при температуре физиологического раствора 37°С. Время от момента взятия яичников до постановки ооцитов на созревание составляло 2-2,5 часа.

Для получения ооцитов яичники неоднократно промывали в физиологическом растворе. Затем с помощью 5 мл шприца и иглы №18 с поверхности яичника аспирировали фолликулы с диаметром 2-8 мм. Аспирированную фолликулярную жидкость сливали в 10 мл центрифужную пробирку для отстоя.

Спустя 10-15 мин, при помощи пастеровской пипетки седименг помещали в 35 мм чашку Петри для поиска ооцитов. Поиск осуществляли под стереомикроскопом с увеличением в 100 раз.

Перед морфологической оценкой, ооциты 3 раза промывали в модифицированной среде /МРМ/, содержащей 20% фетальной сыворотки. Морфологическое состояние ооцит-кумулюсного комплекса служило селекционным критерием отбора ооцитов В эксперименте использовали округлые по форме ооциты с темной равномерно гранулированной ооплазмой, опалесцирующей оболочкой, с плотным компактным кумулюсом.

Для созревания ооцитов использовали среду МРМ с 20% эстральной сыворотки (инакгивированной ЗОмин., при 56°С) и добавлением 10 мкг/мл ФСГ, или модифицированная среда Менезо /МММ/ с аналогичными добавками, рН среды находилась в пределах 7,3-7,4.

Cpc.iv согроиапия в обьемс 400 мкл помещали н к\лы\рлльныс чашки и покрывали 400 мк.1 минеральным маслом, сишн.ш в СО» инкчбаюр на 'жнилиораник». Время

эквидибраиии среди составляло 1.5-2 часа, при шммерагурс 39'С. 5% СО и

максимальной влажности

После селекционной оценки, 20-30 оонитов па 400 мкл среды, с помощью пастеровской пинетки переносили в среду созревания Согревание ооцитов происходило в

СО» - инкуба юре Темпера!\ра созревании ооцигов была 394', время созревания 24 часа

Приготовление сред, а также все манипуляции, связанные с получением ооцитов н их постановкой на со зревание, происходили в максимально стерильных условиях.

Репродуктивные органы (яичники, яйцеводы, раз матки) для получения клеток доставлялись в лабораторию при температуре 4°С в среде ДМЕМ или в физиологическом растворе с добавлением антибиотиков и антимикот иков

В эксперименте использовали органы без патологических изменений в стадии фолликулярного роста.

Для получения клеток гранулезы фолликулы с диаметром 3-8 мм препарировались под стереомикроскопом в ламинарном боксе. С препарированного до теки фолликула, с его внутренней части с помощью глазного скальпеля, снимался слой клеток 35мм в чашку Петри Полученные клетки гранулезы трипсинизировались раствором Трипсин / ЕДТА и затем центрифировали при 4850, в течение 10 минут

Посев клеточного седимента осуществляли в 500 мкл среды ДМЕМ+20%

фетальной сыворотки, в культуральных чашках. Пассаж помещали в СО - инкубатор на 3

дня, при температуре 39"С; 5% СО2 и максимальной влажности. При получении монослоя клеток гранулезы клетки обрабатывали антибиотиками - митомицином С с концентрацией 10 мкг/мл

При использовании монослоя клеток гранулезы для сокультивирования с ооцитами культуральную среду предварительно (максимум за 3 дня) заменили на среду МРМ +■ 20% инактивированной астральной сыворотки коровы.

При получении эстральной сыворотки брали кровь в объеме 30-50 мл, полученные от коров или телок в пик охоты. Использовали одновременно кровь от нескольких животных. Полученные пробы выдерживали в холодильнике 3-4 часа, затем центрифугировали в течение 20 минут при 2000 оборотов в минуту, осторожно отбирали и

7

расфасовывали по 1-1,5мл и замораживали Перед употреблением оттаивали и инактинировали мри 56°С в течение 20->0 минуг

Для получения монослоя кумулюсных клеток, использовали кумулюсные клетки, оставшиеся после оплодотворения ооцит-кумлюсных комплексов Оплодотворенные ооциты осторожно поднимали пастеровской пипеткой и переносили в другую культуральную чашку. В оставшихся кумулюсных клетках меняли среду и культивировали в течение 7 дней до получения монослоя.

., Для получения монослоя эпителиальных клеток яйцевода в лаборатории яйцевод препарировали и промывали 20 mji PBS без Cat 4-/Мд++ раствором.

После промывки ФВС без Са >+/М д-1-+ раствором один конец яйцевода зажимали артериальной клеммой, а через другой пропускали 2-3 мл раствора Трипсин / ЕДГА. Предынкубировали 10 минут при комнатной температуре Затем клемму снимали и яйцевод промывали в 10 мл среды ДМЕМ+20% фетальной сыворотки теленка, и в центрифужной пробирке, центрифугировали 10 минут при 485G. Осадок ресуспензировали 5 мл ДМЕМ + 20% фетальной сыворотки теленка и проводили посев

клеточной культуры. Культивировали при 39°С, 5% СО2 в воздухе и максимальной влажности. В зависимости от пролиферативной активности клеток среду культивирования меняли через 48 часов. При достижении монослоя клетки обрабатывали митомицином С, меняли среду на МРМ + 20% астральной сыворотки.

Для экспериментов по оплодотворению in vitro использовали глубокозамороженную сперму, полученную на ЦСИО сельскохозяйственных животных голштино-фризской и немецкой черно-пестрой пород от быков класса элита-рекорд. Подготовку спермы к оплодотворению осущестшшш по методикам описанным Parrish и др. (1986). Для каждою опыта три гранулы спермы быка оттаивали 1 минуту при 37°С в водяной бане. Центрифужные пробирки (1,8 Мл) заполняли средой Sperm-Talp по 1мл, а на дно осторожно опускали по 200-220мкл спермоконцентрата.

Пробирки ставили, в инкубатор на I час при 39°С. При этом подвижные спермин поднимались, из разбавителя в выше расположенную среду, где они активируются. Спустя 1 час, около 750-800 мкд среды каждой пробирки осторожно сливали для центрифугации. Эту фракцию спермиев центрифугировали 10 минут, при 20°С. После этого осадок ресуспензировали Sperm-Talp и еще раз центрифугировали при тех же условиях. Отстой удаляли до 200 мкл, добавляли гепарин и сперму предынкубировали 15 минут при 39°С.

Онлоложорениеооцигон ¡п vii.ro проводили в среде ГБК.Т-ТА1.Р под минеральным маслом, в инкубаторе при 39°С, 5% СО и максимальной влажности.

Среду М:(*Г-ТАЬР в объеме 400 мкл помещали в культуральные чашки и покрывали 400 мкл минеральною масла. После 1-2 часовой эквшшбрации среды на рН, добавляли 20 мк< пенициллина, Юмкг гипотаурина и 1мкг эпинефрина, и 10мкг/мл гепарина

Для стабилизации концентрации веществ в среде минеральное масло предварительно эквилибрироаали со средой МРМ. В одну каплю среды оплодотворения РЕК.Т-ТА1.Р опускали по 20-25 ооцитов и в зависимости от активности добавляли 6-12мкл спермоконцентрата

После 18-20 часового культивирования ооцитов и спермиев, ооциты переносили в среду МРМ 120% эстральной сыворотки или МММ+20% эсгралъной сыворотки. Неоднократно промывали и с помощью вытянутой пастеровской пипеткой легким пипетированием удаляли часть кумулюсных клеток окружающих ооцит.

Оплодотворенные ооциты культивировали в 400 мкл среды МРМ+20% астральной

сыворотки или МММ+20% эстральной сыворотки в СО1 - инкубаторе при температуре

39°С, 5% СО* и максимальной влажности, время культивирования составляло 7-8 суток.

При сокультивировании с монослойнымн культурами соматических клеток репродуктивного тракта оплодотворенные ооциты по 20-35 на ячейку переносили на подготовленный монослой клеток и культивировали при тех же условиях.

Для цитогенегического анализа ранние зародыши (от 2х клеточных и выше) помещали в гипотонический раствор (1% раствора цитрата натрия на дистиллированной * воде). Зародыши экспонировали в гипотоническом растворе 2 минуты. Фиксацию-эмбрионов осуществляли смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислотой в соотношении 3:1. Окрашивали по Романовскому-Гимза. Отмывали клетки от красителя 96% спиртом.

Исследование проводили под 400 кратным увеличением микроскопа для определения оплодотворения, критерием которого служило наличие 2 про нуклеусов, 2 полярного тельца или хвоста спермия в перивителлиновом пространстве.

3. Результаты исследований

3.1. Влияние сезона года на созревание и оплодотворение ооциов крупного рогатого скота при культивировании вне организма.

Как показали наши исследования, одним из самых важных моментов, определяющих успех или неудачу экспериментов по культивированию ооцитов in vitro, является качество исходного материала При отборе яичников у коров и телок учитывали здоровье и возраст животного, а также стадию эстральнопо цикла

Golo. К и др. (1988) в своих экспериментах получили от 5 до 10 ооцитов на яичник, которые были пригодны для дальнейшего культивирования in vitro.

Количество ооцитов, аспирировамных с одного яичника, в наших экспериментах составило: в среднем 5,3 и только 3,6 ооцитов были оценены как'хорошие' на основе их морфологического состояния.

Ооциты по морфологическим критериям подразделяли на три группы (хорошие, средние и плохие). Стандартизируя т.о. состояние исходной популяции ооцитов и усовершенствуя условия культивирования ооцитов путем использования различных синтетических сред, сывороток и биологически активных веществ не дали стабильных результатов в разные сезоны года.

Также наибольшее число нормальных эмбрионов, по сообщению Гаврикова А.М, получено зимой и осенью (3,8 и 4,2), что составляет 57,6 и 70% от числа извлеченных зародышей. Весной получено до 35,2% дегенерированных эмбрионов, что было связано с нарушениями балансирования рационов по питательности, микро и макроэлементами и биологически активными веществами. Наиболее благоприятными периодами для получения морфологически нормальных эмбрионов, создания эмбриобанка и проведения эмбриопересадок является осень и зима.

Даже при культивировании в синтетических средах с добавлением пептидных и стероидных гормонов не дает стабильных результатов.

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1

Влияние сезона года на созревание и оплодотворение оонитов коров при культивировании их вне органтма

Месяц Число ооцитов, поставленных на созревание Число ооцитов, созревших до метафазы 2 Число дегенери-Рованных ооцитов Число оплодотворенных ооцитов Соотношение созревших к оплодотворен ним, %

Январь 70 52 23 29 : 55,7

Февраль 85 67 18 32 47,7

Март 45 28 19 13 46,4

Апрель 55 35 24 11 31,4

Май 60 42 28 14 33,2

Июнь 32 26 21 5 19,2

Июль 39 25 17 4 15,4

Август 50 43 22 6 13,9

Сентябрь 95 72 35 12 16,6

Октябрь 76 52 27 19 36,5

Ноябрь 49 32 12 13 40,3

Декабрь 110 62 38 27 43,5

В ходе наших экспериментов было установлено, что наиболее низкий процент созревания и оплодотворения приходится на весенне-летние месяцы (10-12%), а в осенне-зимний - составила (37-41%), то есть повышается. Низкий процент выхода ооцитов, вероятно, был обусловлен нарушением метаболических процессов в организме вследствие гиповитаминозов, сезонного гормонального дисбаланса.

Поэтому работы по культивированию ооцитов нужно проводить с учетом времени года. В связи с этим возникает необходимость в усовершенствовании культуральных сред за счет введения в состав различных биологически активных веществ в зависимости от времени года.

3.2. Созревание ооцитов в различных средах в присутствии сывороток и гонадотропных гормонов.

Для полного развития и последующего оплодотворения питательная среда, по мнению First и Parrish. (1987) должна содержать сыворотку крови. Из литературных источников известно, что при культивировании ооцитов коров используется БСА, фетальная сыворотка теленка и эсгральная сыворотка коров в очоте. По сравнению с БСА, по мнению Rutledge и др. (1987) фетальная сыворотка способствует кумулюсной экспансии, индуцированной ФСГ и улучшает жизнеспособность и окончание 1 мейсггического деления. Концентрация сыворотки может колебаться от 2% до 20%. При сравнении феталькой и эстральной сыворотки, наблюдается более полная экспансия кумулюсных клеток, высокая степень оплодотворения и развития ранних эмбрионов достигается при добавлении эстральной сыворотки.

В наших экспериментах для созревания ооцитов использовали модифицированную среду Паркера с добавлением 20% фетальной и эстральной сыворотки в присутствии гонадотропных гормонов, таких как ФСГ в дозе 10 мкг/мл и ЛГ 5мкг/мл, так и без них (табл.2).

Таблица 2.

Созревание ооцитов при добавлении в среды разных сывороток и гонадотропииов.

Показатель Среда

МРМ+20%фетальная сыворотка, ФСГ и ЛГ МРМ + эстральная сыворотка, ФСГ и ЛГ МРМ Астральная сыворотка

Число прокультивированных ООЦ1ГГОВ, п 40 50 45

Созрелсг ооцитов до метафазы 2, п (%) 12(30) 28 (56) 20 (44,4)

Дегенерировавших ооцитов, п (%) 28 (70) 22(44) 25 (55,5)

Процент созревших к ЧКСЛу ДСГС*1Срг1рО-ванных 1ft JV 56 44

Результаты показывают, что на созревание ооцитоз в большей степени влияет эстральная сыворотка, ФСГ и ЛГ (56%), чем фетальная сыворотка с гормонами на 26% ниже Показатели культивирования в среле с остраяьной сывороткой без гормональных добавок были ниже на 11,6% по сравнению с гормональными добавками Поэтому при созревании ооцитов можно использовать эстральную сыворотку даже без добавки в среду созревания шнадотропных гормонов. Эстральная сыворотка коров в охоте являегся как добавка белка среде созревания. При этом наступает полная экспансия кумулюсных клеток, включая корону радиата, а кумулюсная экспансия сопровождает созревание цитоплазмы, что в свою очередь ведет к полному созреванию ооцета.

Увеличить репродуктивные функции коров возможно посредством интенсивного использования огромного потенциала резерва оощгтов, заложенного в их яичниках. Для этого крайне необходимо разработать методы не только выделения из яичников и доведения яйцеклеток до зрелого состояния, но и их оплодотворения с целью культивироваиия эмбрионов вне организма. Сочетание в культуральной среде для ооцитов ряда биологически активных веществ может дать высокое обеспечение генетически полноценных яйцеклеток.

Так для оплодотворения ооцитов вне организма нами использовалась среда ТСМ-199 с добавлением 20% фетальной или эсгральной сыворотки, а также гипофизарных гормонов ФСГ в дозе 10мкг/мл и ЛГ 5мкг/мл и без них. Оплодотворенными считались ооциты, у которых наблюдалось второе полярное тельце и наличие 2-х и более бластомеров.

Для полного развития и последующего оплодотворения также необходимо наличие сыворотки крови. И в этом случае эстральная сыворотка эффективнее, чем фетальная. Это объясняется тем, что в эсгральной сыворотке находятся биологически активные вещества (ростовые факторы, аминокислоты) благоприятно влияющие на процесс оплодотворения (табл.3).

Таблица 3

Результаты оплодотворения ооцитов при включении в среду сывороток и гонадотропииов

Среда ТСМ-1 ад

Показатель Остальная сыворотка, ФСГ и ЛГ Эстральная сыворотка, ФСГ и ЛГ Эстральная сыворотка

Число созревших Ооцитов, п 12 28 20

Оплодотворенных ооцитов, п (%) 4(33) 14(50) 8 (40)

Из них 2-х бластомерных 3 6 4

4-х 1 3 2

8-х - 2 2

16-х - 3 -

Из таблицы видно, что при добавлении в среду эстральной сыворотки получено 40% оплодотворенных оощгтов, а при добавлении ФСГ и ЛГ на 10% увеличивается выход оплодотворенных ооцитов по сравнению с фетальной сывороткой, ФСГ и ЛГ всего 33% . Эти различия объясняются тем, что эстральная сыворотка содержит стероидные и гонадотропные гормоны.

Так же изучая влияние сред с минимальной концентрацией сыворотки крова на созревание ооцитов, снижали концентрацию эстральной сыворотки коров до 5% и добавляли различные концентрации гонадотропииов: ФСГ-20.мкл, 5мкл/мл среды, глутамина-150мкл (табл.4).

Таблица 4.

Влияние минимальной концентрации сыворотки крови коров на созревание ооцитов

! Всего Стадии развития ооцитов

Среда созревания ооцитов Диплогена Диакинез-метафаза-1 Метефаза-2

МММ - 10% эстральной сыворотки, п (%) 97 1 (1,0) 32 (33,0) 64 (66,0)

МПМ + 5% эстральной сыворотки, п (%) 71 3 (4,2) 29(40,8) 39 (55,0)

МПМ^5%эстральной сыворотки + 20мкд/мл ФСГ, п (%) 72 4(4,2) 25 (34,7) 43 (59,7)

МПМ + 5% эстральной сывороткн+5мкл/мл ФСГ +150мкл/ил глугамина, п (%) 68 4 (5,8) 26(38,2) 38 (56,0)

Число созревших ооцитов при добавлении в среду 10% эстральной сыворотки составил 66,0%, а 5% - 55,0%, добавление к этой среде 20 мкл ФСГ повышало норму созревания на 4,7%, а 5 мкл ФСГ и 150 мкл глугамина не влияли на созревание ооцитов.

Стимулирующий эффект сыворотки может быть объяснен действием содержащихся в ней ростовых факторов и аминокислот.

Оплодотворяемость в среде с 10% эстральной сывороткой была высокой (71,9%). При уменьшении концентрации эстральной сыворотки до 5% выход оплодотворенных ооцитов составил 30,8%, а при добавлении 20 мкл ФСГ повысило оплодотворяемость на 27,3%. Снижение концентрации ФСГ до 5 мкг и включение 150 мкл глугамина не влияло на этот показатель, однако выход зародышей был на 14,8% больше (табл.5).

Из оыта следует, что добавление в среду созревания 10% эстральной сыворотки обеспечивает (71,9%) созревания и оплодотворения ооцитов in vitro.

Таблица 5

Оплодотворяемостъ ооцитов крупного рогатою скога после созревания в среде с разной концагграцней астральной сыворотки крови

Среда созревания Число ооцитов, п ОплодотвоРилось. п (%) Получено зародышей, п(%) Процент От общего числа

МПМ+ 10% астральной сыворотки 64 46(71,9) . 27(58,7) 42,2

МПМ +• 5% эстральной сыворотки 39 1 12(30,8) | --

МПМ + 5% эстральной сыворотки + 20мкл/мл ФСГ 43 25 (58,1) 4 (16,0) 9,3

МПМ+ 5% эстральной сыворотки +5мкл/мл ФСГ + 150мкл/мл глутамина 38 13(34,2) 4 (30,8) 10,5

3.3. Культивирование ооцитов в различных культуральных средах.

В настоящее время известно, что в значительной мере жизнеспособность ооцитов и ранних эмбрионов зависит от правильности подбора питательной среды. Для культивирования ооцитов коров использукгг среды ТСМ-199, МРМ, Менезо, Игла, Хэма Р-10, Г-12, пригодные для нормального завершения ядерного и цитоплазматического развития внефолликулярных ооцитов. Осмотическое давление и рН культуральной среды необходимо устанавливать между 290-300 мидлосыоль и рН 7,2-7,4, что соответствует физиологическим условиям. Кроме того, в питательную среду добавлялось 20% астральной сыворотки. В наших экспериментах для сравнения использовали ТСМ-199, модифицированная среда Паркера (МРМ) и модифицированная среда Менезо (МММ), с буферными и энергетическими добавками (табл.6).

Таблица 6.

Результаты культивирования оститов в различных культуральлых среда.

Показатель Среда

ТСМ-199 МРМ МММ

Число ооцитов, п 100 170 90

Созрело ооцитов, п 65 105 55

Дегенерированных ооцитов, п 35 65 ! 35

Процент созревания 53,8 61,9 i 63,6

Проведенные нами исследования по изучению влияния применяемых сред показали, что число созревання ооцитов и оплодотворения составило: в среде ТСМ-199 -53,8%, МРМ - 61,9%, а в МММ - 63,6%, то есть не имеет существенных различий.

Однако среда ТСМ-199 и МММ более универсальны и их можно использовать при капацитации сперматозоидов, в отличии от модифицированной среды Паркера (МРМ).

3.4. Влияние дозы гепарина и времени капацитации спермиев на их оплодотворяющую способность.

Центральным моментом оплодотворения является слияние гаплоидных наборов хромосом мужской и женской гамет. Ему передшествует взаимодействие между спермием и яйцеклеткой, возобновление мейотического деления в ооците, формирование мужского и женского пронуклеусов, метаболические изменения. Яйцеклетки млекопитающих, достигшие стадии метафазы 2, считаются готовыми к оплодотворению, что касается спермиев, то они должны быть капанитированы, т.е. пройти комплекс физико-химических изменений, в результате чего спермий может проникать в яйцеклетку.

В наших экспериментах (табл.7) в качестве среды для капацитации использовалась среда SPERM-TALP, NA-лируват и BSA, добавляемый перед использованием.

Таблица 7.

Влияние дозы гепарина и времени капацитации на оплодотворяющую способность спермиев.

Число ооцитов, п Концентрация гепарина мкг/мл Время капацитации (мин) Процент дробящихся ооцитов

34 5 0 0

38 10 5 | 12,8 1

43 20 10 1 15,5 1

52 30 15 ; 25,8 1

25 40 20 ; зз,б

67 50 25 42,5

75 100 30 10,3

В ходе эксперимента было установлено, что оптимальной дозой гепарина при капацитации спермы быков является доза от 20 до 50 мкг/мл, а время капацитации от 10 до 25 минут. При этом самый высокий процент дробления ооцитов составил 42,5% при 50мкг/мл, 25мин.

Более высокие дозы гепарина снижают процент выхода оплодотворенных ооцитов, так как вызывают полиспермию и истощают энергетический запас спермиев.

3.5. Культивирование и сокультивирование предымплантационных эмбрионов на

монослоях соматических клеток.

Часто при культивировании предымплантационных эмбрионов многие исследователи сталкиваются с клеточным блоком, когда развитие эмбрнона останавливается на стадии 8-16 клеток. Стадия блокировки связаны по времени с основным началом транскрипции эмбрионного генома; с главными качественными изменениями в белковом синтезе; и с появлением активного нуклеуса.

Для того чтобы преодолеть этот блок, кспсльзуетси унд различных методов. В некоторых случаях используют промежуточных реципиентов, таких как кролик, помещают эмбрион в яйцеводы и извлекают его уже на более поздних стадиях развития, т.е. после прохождения клеточного блока.

В настоящее время для преодоления блока используется ряд соматических клеток,

в частности клетки кумулюса, эпителиальные клетки яйцевода, гранулезные клетки. Из этих клеток получают монослон, который используется для культивирования предимплантационных эмбрионов.

Мы же поставили перед собой задачу изучить влияние монослоя соматических клеток на преодоление клеточного блока Ооциты культивировали в среде МРМ с добавлением 20% эстральной сыворотки, оплодотворение проводили в среда ГЕЯТ-ТАЬР, а дальнейшее культивирование оплодотворенных оошпов проводили в среде Паркера. Полученные эмбрионы 6-8 бластомеров переносили на монослон соматических клеток. Первая группа не содержала соматических клеток и служила контролем, вторая группа ооцнтов сокультивировалась на монослое клеток кумулюса, третья на монослое эпителиальных клеток яйцевода и четвертая на монослое клеток гранулезы (табл 8)

Таблица 8.

Влияние монослоя соматических клеток на развитие оплодотворенных ооиитов.

Показатель Группа (монослой)

Контроль Клетки кумулюса Эпителиальные клетки яйцевода Клетки гранулезы

Число ооцнтов, п 55 39 22 43

Ооциты 8-16 клеточной стадии, п (%) 12 (21,8) 10(25,6) 6 (27,2) 15(34,8)

Ооциты остановившиеся в развитии, п (%) 43 (78,1) 29 (74,3) 16(72,7) 28(65,1)

Процент ооцитов прошедших блок 21,8 25,6 27,2 34,8

Исследования показали, что успешное преодоление 8-16 клеточного эмбрионального "блока" достигается при сокультивировании на монослое гранулезных клеток (34,8%), что на 13% выше контроля. При сокультивировании на монослоях кумулюсных клеток и эпителиальных клеток яйцевода, различия были незначительными (25,6-27,2%).

Роль монослоя в культуральных системах не совсем ясна, однако, после совместного культивирования оплодотворенных ооцитов с монослоями соматических клеток повышается степень дробления и развития ранних эмбрионов

Так же, при введении в среду созревания клеток гранулезы наблюдалось повышение числа созревших ооцитов на 13,3% (80% против 66,7%) по сравнению с контролем Кроме того, 20,8% ооцитов опытной группы оплодотворились, в то время в конгроле оплодотворенные ооциты отсутствовали (табл. 9).

Таблица 9

Влияние клеток гранулезы на созревание и оплодотворяемость ооцитов in vitro.

Показатель Среда созревания

ТСМ-199 + гормоны (контроль) ТСМ-199 + клетки гранулезы

Прокультивировано ооцитов, п 18 30

Достигли метафазы 2, п (%) 12(66,7) 24 (80,0)

Оплодотворились, п (%) 0 5 (20,8)

Число дробившихся 0 0

Клетки гранулезы, введенные в среду созревания в количестве 500 тыс/мл, повышают уровень созревания ооцитов и их оплодотворяемость.

, Период блокирования развития эмбрионов совпадает по времени с их потребностью в новых элементах питания. Поэтому усилия исследователей направлены на поиск различных природных и синтетических ростовых факторов в качестве добавок в культуральные среды. Удачной альтернативой этому является использование не только клеточных сокультур, но и их кондиционных сред, поскольку установлено, что на развитие эмбрионов влияет не фактор контакта с клетками, а трофический фактор, то есть секреция целого спектра питательных веществ.

Позднякова Т.Э (1994) установила, что культивирование в среде, кондиционированной клетками гранулезы, обеспечивает более оптимальные условия для созревания, что подтверждается не только высоким выходом ооцитов 72,7%, но и низким

процентом (6% против 16,4° о) яйцеклеток с дегенерацией хромосом.

Также установлено, что кондиционирование оошл-кумулюснымн клетками среды обеспечивают нормальное развитие зародышей в случае, если для культивирования используется аутогенная среда, то есть когда оплодотворенные ооциты помещают в среду, в которой они созревали (табл 10) 11

Таблица. 10.

Влияние кондиционной среды на оплодотворяемосгь ооцнтов и их дальнейшее развитие

Среда культивирования

Показатель МРМ+5%эстральной сыворотки (контроль) Кондиционная аутогенная Кондицинная гетерогенная

Число ооцитов, п 116 123 138

Созревших, п (%) 78 (67,2) 80 (65,0) 95 (68,8)

Оплодотворилось, п (%) 54 (69,2) 52 (65,0) 55 (57,9)

В т.ч. дробящихся, п (%) - 10(19,2) 8(14,5)

Ранних морул, п (%) - 8(80,0) 6 (75,0)

Бластоцисг, п (%) - 2 (20,0) . -

Несмотря на высокую степень оплодотворяемости в контрольной группе, дробление зародышей наблюдалось лишь в кондиционных средах (19,2% и 14,5%), причем стадии ранней морулы достигало большинство зародышей (80,0 и 75,0%) от числа дробящихся. .

Но в гетерогенной кондиционной среде оплодотворенные зародыши развивались только до стадии ранней морулы, дальше развитие прекратилось, а в аутогенной среде зародыши развились до бластоцисты 20%. .,,..,

4. ВЫВОДЫ.

1. При культивировании ооцнтов in vitro необходимо учитывать сезон года, так как он оказывает существенное влияние на выход созревших ооцитов.

2. Созревание и оплодотворение в присутствии астральной сыворотки, полученной от коров в раннем эсгрусе эффективнее, чем применение фетальной сыворотки.

3. При снижении концентрации эсгральной сыворотки до 5% с добавлениЫ

21

20мкл/мл ФСГ можно получить до 59,7% созревших ооцитов и 58,1% оплодотворенных ооцитов in vitro

4. Среду ТСМ-199 и МММ более универсальны, и их можно использовать при капацитации спермиев.

5. При капацитации спермиев с гепарином достигается высокая степень оплодотворяемости, оптимальная доза гепарина составляет от 10 до 50мг/мл, а время капацитации от 10 до 25 минут.

6. Однослойные клеточные культуры клеток репродуктивного тракта позволяют преодолеть эмбриональный "блок" предымплантационных эмбрионов на стадии 8-16 клеток.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. Для созревания и оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота, предлагается использовать минимальную концентрацию эстральной сыворотки до 5% с добавлением 20мкл/мл ФСГ, что позволит получить до 59,7% созревших ооцитов и 58,1% оплодотворивших ооцитов.

2. Для капацитации спермы быков, предлагается оптимальная доза 50мкг/мл гепарина, при котором процент дробления составляет 42,5%.

3. Для успешного предоления 8-16 клеточного эмбрионального блока предложено сокультивирование на монослое гранулезных клеток, при котором стадии метафазы 2 достигло 80% ооцитов, а оплодотворилось до 20,8%.

6. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОПУБЛИКОВАНЫ В СТАТЬЯХ.

1. А.Ахмолдаева, И.Порфирьев, Н.Сергеев. /Трансплантация эмбрионов и генетический прогресс. //Племенное дело. 2000г. № 1.

2. И.Порфирьев, А. Ахмодааева, Н.Сергеев. / Влияние биологически активных веществ на созревание и оплодотворение in vitro ооцитов крупного рогатого скота // Молочное и мясное скотоводство. 2000г. №1, № 2.

ty. Jt JLC&O г ■ /.ZCnS /кур. -{<£<S. ¿с,,С . -/¿ f

7 ^ЙС-^С/ Afj. 3. TUh- ¿//?/z /^VDM

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ахмолдаева, Анар Муханбетжановна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1. Строение и рост фолликулов.

2.2. Дцерно-цитоплазматическое созревание ооцитов.

2.3. Способность к созреванию и оплодотворению вне организма ооцитов крупного рогатого скота.

2.4. Методы извлечения ооцитов из яичников и отбор ооцитов для культивирования и оплодотворения in vitro.

2.5. Среды и сыворотки, используемые для созревания ооцитов коров.

2.6. Подготовка ооцитов для оплодотворения in vitro.

2.7. Культуры клеток, используемые для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота.

2.8. Культивирование и сокультивирование оплодотворенных ооцитов in vitro на монослоях различных соматических клеток.

3. Собственные исследования.

3.1. Материал и методика исследований.

3.2. Влияние сезона года на созревание и оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота при культивировании вне организма.

3.3. Созревание ооцитов в различных средах в присутствии сыворотки и гонадотропных гормонов.

3.4. Культивирование ооцитов в различных культуральных средах.

3.5. Влияние дозы гепарина и времени капацитации спермиев на их оплодотворяющую способность.

3 .6. Культивирование и сокультивирование предымплантационных эмбрионов на монослоях соматических клеток.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние биологически активных веществ на созревание и оплодотворение in vitro ооцитов крупного рогатого скота"

Актуальность темы. Трансплантация эмбрионов является эффективным биотехнологическим методом воспроизводства животных, который используется в настоящее время для ускорения генетического прогресса в молочном скотоводстве. Низкий коэффициент размножения крупного рогатого скота и продолжительный интервал поколений существенно ограничивают возможности селекции молочного стада.

Современные экономические условия диктуют неотложную необходимость повышения интенсивности селекционной работы по совершенствованию племенных и продуктивных качеств животных, создания современных высокопродуктивных пород, линий и гибридов скота, отвечающих требованиям постоянно меняющейся конъюнктуры рынка /50/.

В настоящее время в племенных хозяйствах генетический прогресс породы снижается из-за преждевременной выбраковки высокопродуктивных животных-вирусоносителей. Для предотвращения исчезновения наиболее ценных животных можно использовать программу эмбриопересадок. Получение эмбрионов от животных - вирусоносителей, их отмывание и обработка в растворе трипсина позволяют полностью удалить вирусы лейкоза, ринотрахеита и др., располагающиеся на оболочках клеток. Использование в качестве реципиентов здоровых животных гарантирует оздоровление стада без понижения генетического потенциала /38/.

Развитие биотехнологических методов позволяет на современном этапе эффективнее использовать репродуктивный потенциал высокопродуктивных животных. Однако использование новых биотехнологических методов, а также проведение исследований в области биологии эмбрионального развития сдерживаются высокими материальными затратами на получение эмбрионов на ранних стадия развития.

Большое значение в решении данной проблемы отводится специализации по созреванию и оплодотворению ооцитов вне организма, с целью удовлетворения потребности науки и практики в ранних эмбрионах.

Одним из путей снижения стоимости эмбрионов является получение яйцеклеток при убое высокоценных коров после выбраковки на мясо и оплодотворение яйцеклеток in vitro.

Максимальное использование генетического фонда яйцеклеток возможно лишь в условиях созревания и оплодотворения in vitro.

Эффективность получения эмбрионов вне организма в настоящее время составляет лишь 10% живого потомства. Низкий процент обусловлен, прежде всего, неполноценным созреванием ооцитов in vitro. Для обеспечения полноценного созревания ооцитов необходимо смоделировать условия in vitro близкие к естественным. Успех культивирования ооцитов вне организма зависит от многих факторов -качества культуральных сред, сочетания в культуральной среде биологически активных веществ, соблюдения температурного и газового режимов, возраста, времени года и генотипа животного. Усовершенствовать существующие методы регуляции созревания ооцитов возможно путем включения клеточных элементов интактных фолликулов и кондиционных сред, а также путем воздействия гормонов на пострецепторные внутриклеточные посредники.

Применение метода трансплантации эмбрионов по системе МОЕТ (множественная овуляция и эмбриотрансплантация) ускоряет генетический прогресс в 10 раз по сравнению с методом искусственного осеменения /39/.

Английские ученые проводили опыты по производству эмбрионов коров in vitro в большом количестве, и пришли к выводу, что применение этой технологии возможно в производстве, и в ближайшем будущем будет иметь огромное значение в развитии скотоводства /96/.

Цель и задачи исследований.

Целью нашей работы явилось совершенствование метода культивирования и оплодотворения вне организма ооцитов крупного рогатого скота.

Исследования влияния эффекта биологически активного вещества на созревание и оплодотворение ооцитов in vitro подразумевает следующие этапы: 1) выявление оптимальной концентрации, в которой биологически активное вещество оказывает какой-либо эффект на мейоз ооцитов коров; 2) определение характера влияния биологически активных веществ на оплодотворение, дробление и выход качественных эмбрионов на пролонгированных стадиях развития (морула, бластоциста).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Определить влияние сезона года на созревание и оплодотворение ооциов крупного рогатого скота при культивировании вне организма.

2. Определить влияние астральной сыворотки и гонадотропных гормонов на созревание и оплодотворение ооцитов in vitro. А также выявить минимальную концентрацию эстральной сыворотки и гонадотропных гормонов, влияющих положительно на созревание ооцитов.

3. Выяснить роль гепарина и различных сред для капацитации и времени их соинкубирования с ооцитами на оплодотворяющую способность спермиев и их выживаемость в культуральных средах.

4. Изучить влияние фолликулов и их стенок, соматических клеток на развитие зародышей после экстракорпорального оплодотворения ооцитов in vitro.

Научная новизна.

Научная новизна исследований состоит в эффективности использования биологически активных веществ для созревания и оплодотворения ооцитов in vitro. Продемонстрирована возможность преодоления блока клеточного деления на стадии 8-16 бластомеров путем использования монослоя гранулезных клеток. Впервые была установлена оптимальная доза 50мкг/мл гепарина для капацитации спермы быков, при котором процент дробления составил 42,5%.

Практическая значимость работы.

На основании результатов проведенных исследований разработаны оптимальные культуральные среды, с добавлением эстральной сыворотки и гонадотропных гормонов, при котором созрело ооцитов 56%, а оплодотворилось 50%. Предложено, минимизировать концентрацию эстральной сыворотки до 5% с добавлением 20мкл/мл ФСГ, что позволит получить до 59,7% созревших ооцитов и 58,1% оплодотворенных ооцитов in vitro. Показана одинаковая эффективность созревания, оплодотворения и развития ооцитов крупного рогатого скота в культуральных средах ТСМ-199, МРМ, МММ. Предложено сокультивирование на монослое гранулезных клеток для успешного преодоления 8-16 клеточного эмбрионального блока.

Схема основных процессов, протекающих при созревании и оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота.

Спермии Капацитация

Ооциты

Созревание ооцитов в средах

Акросомная реакция гиперактивация

Первое кополярное тельце метафазы 2

Пенетрация зоны пеллюцида

Слияние мембраны гамет

Деконденсация головки спермия

Завершение мейоза

Образование пронуклеуса

Образование пронуклеуса

Сингамия, деление

Культивирование эмбрионов в средах

Культивирование эмбрионов на монослоях различных соматических клеток

Трансплантация

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Ахмолдаева, Анар Муханбетжановна

5. ВЫВОДЫ.

1. При культивировании ооцитов in vitro необходимо учитывать сезон года, так как он оказывает существенное влияние на выход созревших ооцитов.

2. Созревание и оплодотворение в присутствии эстральной сыворотки, полученной от коров в раннем эструсе эффективнее, чем применение фетальной сыворотки.

3. При снижении концентрации эстральной сыворотки до 5% с добавлением 20мкл/мл ФСГ можно получить до 59,7% созревших ооцитов и 58,1% оплодотворенных ооцитов in vitro.

4. Среду ТСМ-199 и МММ более универсальны, и их можно использовать при капацитации спермиев.

5. При капацитации спермиев с гепарином достигается высокая степень оплодотворяемости, оптимальная доза гепарина составляет от 10 до 50мг/мл, а время капацитации от 10 до 25 минут.

6. Однослойные клеточные культуры клеток репродуктивного тракта позволяют преодолеть эмбриональный "блок" предымплантационных эмбрионов на стадии 8-16 клеток.

89

6. ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для созревания и оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота, предлагается использовать минимальную концентрацию астральной сыворотки до 5% с добавлением 20мкл/мл ФСГ, что позволит получить до 59,7% созревших ооцитов и 58,1% оплодотворивших ооцитов.

2. Для капацитации спермы быков, предлагается оптимальная доза 50мкг/мл гепарина, при котором процент дробления составляет 42,5%.

3. Для успешного преодоления 8-16 клеточного эмбрионального блока предложено сокультивирование на монослое гранулезных клеток, при котором стадии метафазы 2 достигло 80% ооцитов, а оплодотворилось до 20,8%.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ахмолдаева, Анар Муханбетжановна, п. Дубровицы, Московской обл.

1. Альм X, Х.Торнер / Факторы, влияющие на созревание ооцитов крупного рогатого скота при дозревании in vitro. // Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных. -Боровск. -1990. часть 2.-е 139-140.

2. Байбеков Ф. Р., Мальцева И. В. / Результаты культивирования ооцитов коров на монослое клеток яйцевода. // Опыт подготовки кадров для сельского хозяйства зарубежных стран. М. -1992. -с. 95-97.

3. Байбеков Ф.Р. / Усовершенствование метода культивирования и оплодотворения ооцитов коров in vitro в различных культуральных системах. // Автореферат. -Дубровицы. -1992г. -с.21-24.

4. Байтлесов Е.У., Бозымов К.К. / Влияние качества и стадии развития эмбрионов мясных коров на их жизнеспособность после оттаивания. // Вопросы интенсификации животноводства. Дубровицы. -1994. -с.50-59.

5. Бугров А.Д., Ткачев И.В. / Выход ооцитов крупного рогатого скота в зависимости от размеров яичников. // Научно-технический бюллетень. -Харьков. -1996. -с.22-26.

6. Бугров А.Д., Ткачев И.В. / Зависимость выхода и качества ооцитов от типоразмеров яичников коров. // Зоотехния. №6. -1999. -с.30-31.

7. Букаров Н., Еремина М. / Молочная корова начала третьего тысячелетия. // Молочное и мясное скотоводство. -1994. -№4. -с. 24-25.

8. Бурляева Б.В., Енина Л.В., Середин В.А. / Влияние фолликулярной жидкости на созревание ооцитов in vitro. // Морфо-функциональные показатели продуктивных животных. Сборник научных трудов. -Ставрополь. 1992. - с.73-77.

9. Гавриков А.М, Кинзеев В.Н. / Влияние сезона года на результаты трансплантации эмбриона. // Молочное и мясное скотоводство. -1993. №5. -с. 19-21.

10. Голубев А.К, Макарова З.Н, Завертяев Б.П. / Получение эмбрионов коров вне организма. // ЛенЦНТИ. -1987. -с.30-39.

11. Голубев А.К, Сироткин А.В, Кузьмина Т.И и др. / Регуляция созревания яйцеклетки у сельскохозяйственных животных. // Итоги науки и техники. Серия животноводство и ветеринария. -М. -1987. -Т. 19.-с 40-45.

12. Грин Н, Стаут У, Тейлор Д. / Оплодотворение. // Биология. / Изд. Мир. -1993. с.146-147.

13. Забелина Н.В. / Добавление ооцитов коров вне организма в гомологичной фолликулярной жидкости. // Автореферат. С.Петербург-Пушкино. -1995. -с.23-29.

14. Завертяев Б.П. / Состояние и перспективы исследований по получению эмбрионов крупного рогатого скота. // Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. -Алма-Ата. Талым". -1991. --с.67-76.

15. Качура В.С, Дзицюк В.В. / Капацитация спермотозоидов быка при оплодотворении вне организма и методы ее оценки. // Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных. -Боровск. -1990. -с.120-121.

16. Кесян А.З. / Разработка условий для обеспечения развития и криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота, полученных инвитро. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологичских наук. М. - 1993. --с. 13-15

17. Костина Г.А, Радаева И.Ф. / Влияние ростовых протеинов на пролиферативную активность культивируемых клеток. // Цитология. -1999. -т.41. 3/4. с.282.

18. Кочанов Н. Е и др. / Рост и атрезия фолликулов на яичниках циклирующей коровы. // Эстральный цикл коровы. Российская Академия наук. Уральское отделение. Коми научный центр. - Сыктывкар. - 1994. -с. 30-37.

19. Кузьмина Т.И и др. / Модернизация систем дозревания ооцитов коров для получения эмбрионов. // Международный симпозиум "Молекулярная генетика и биотехнология в оценке изменений генома сельскохозяйственных животных. Материалы собр. -1994. -стр.29.

20. Кузьмина Т.И., Кирюкова Ю.С., Гойло Т.А. / Влияние катионных белков фолликулярной жидкости на экстракорпоральное созревание ооцитов крупного рогатого скота. // Теория и практика использования БАВ в животноводстве. Киров. -1998. -с. 47-48.

21. Лебедева И.Ю., Гойло Т.А., Кузьмина Т.И. / Влияние бычьего пролактина на синтез ДНК в культуре клеток гранулезы коров. // Бюллетень ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных. С.Петербург. -1994. -с. 10-13.

22. Мадич А. / Стимуляция раннего эмбрионального развития. // Молочное и мясное скотоводство-1998. №2-с.21-23.

23. Маленько Г.П. / Получение ранних зародышей крупного рогатого скота при дозревании и оплодотворении ооцитов вне организма. // Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственныхживотных. -Боровск. -1990. -часть 2. -с.127-128.

24. Малиновский А.М., Мороз Т.А., Малиновская В.А. / Применение биостимуляторов при трансплантации эмбрионов. // Теория и практика использования БАВ в животноводстве. -Киров. -1998. -с. 56-57.

25. Мальцева И, Байбеков Ф.Р. / Оплодотворение ооцитов коров in vitro в зависимости от индивидуальных особенностей семени быков. // Опыт подготовки кадров для сельского хозяйства зарубежных стран. —М. -1992. -С.99-101.

26. Мамлеев Р.С, Куанышбеков Б.М, Зубриянов A.B. / Влияние гормонов и ростовых факторов на созревание ооцитов коров вне организма. // Казахский НИТИ животноводства. -1992. -с.34-35.

27. Морено Мело Вильма. / Совершенствование метода культивирования оплодотворенных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота. // Автореферат. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. М. - 1992. -с.8-12.

28. Петручек А.Н., Коровко В.И. / Физиотерапевтические методы повышения оплодотворяемости коров. // Вопросы повышения продуктивности в животноводстве, звероводстве и оленеводстве Дальнего Востока. Уссурийск. -1997. -с.53-55.

29. Позднякова Т.Э, Кузьмина Т.И. / Влияние рекомбинантрого бычьего соматотропного гормона на созревание ооцитов коров. // Бюллетень ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных. -Выпуск. 410. С.Петербург. - 1994. -с.7-9.

30. Позднякова Т.Э. / Мейотические преобразования хромосом при культивировании ооцитов коров с клетками гранулезы. // Автореферат. С-Петербург, -Пушкин-1994. -с. 20.

31. Решетникова Н.М. / Трансплантация эмбрионов как аналитический метод воспроизводства стада. // Биология воспроизведения и биотехнологические методы разведения. ВНИИ плем. Москва. -1992. -с 4-7.

32. Решетникова Н.М., Мороз Т.А., Малиновский А.М и соавторы. / Проблема интенсификации воспроизводства в племенном скотоводстве. // Современные аспекты селекции, биотехнологии, информации в племенном животноводстве. ВНИИплем. -Москва. -1997. -с.121-130.

33. Савченкова И.П. // Эмбриональные стволовые клетки в биологии: настоящее и будущее. -Дубровицы. -1999.

34. Свиридов Б.Е. / Закономерности роста фолликулов и созревание ооцитов в яичниках коров и при культивировании in vitro. // Автореферат. — С.Петербург. 1991. -с.7-9.

35. Сергеев Н.И, Лебедев В.И, Самоделкин В.И, Тяпугин Е.Л. /

36. Эффективность применения трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве. // Сельскохозяйственная наука Севера-Востока Европейской части России. Статьи научных трудов. -Киров. -1995. -том. 3. -€.65-69.

37. Сергеев Н.И, Смыслова В.И. / Морфологическая оценка эмбрионов. // Журнал "Зоотехния", М. - 1993. - №8. - с.23-25.

38. Сироткин А.В, Мамлиеев P.C. / Влияние пептидных гормонов на созревание ооцитов коров in vitro. // Трансплантация и культивирование эмбрионов крупного рогатого скота, с.н.т. -Ленинград. -1989. С.75-78.

39. Смыслова Н.И, Сергеев Н.И, Тарадайник Т.Е, Сингина Г.Н. / Культивирование созревших и оплодотворенных in vitro ооцитов в средах с клетками воспроизводительного тракта. // Доклады РАСХН. -1999. -№2. -с.47-49.

40. Соколовская И. И. / Второй международный симпозиум по иммунологии воспроизводства. II Жив март. -1969. -#3. -с.85-86.

41. Удавленникова H.H. / Получение и развитие потомства из созревших и оплодотворенных вне организма яйцеклеток коров. // Автореферат. -М. -1992. -с.5-6.

42. Хилькевич Н.М., Тяпугин Е. / Экономические аспекты трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве. // Молочное и мясное скотоводство. -1992. 5-6. -с. 16-17.

43. Швидерски Г, Блотнер С. / Оплодотворение яйцеклеток in vitro минимальным количеством спермиев в перивителлиновое пространство. // Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных.-Боровск.-1990 частъ2. -с 141.

44. Шегелъская Е.А., Щербак Е.В. / Динамика событий первого мейотического деления в ооцитах коров и свиней при культивировании вне организма. // Научно-технический бюллетень. Харьков. -1996.-с.26-30.

45. Шейкин В.Н. / Фолликулогенез в яичниках коров в различные фазы полового цикла. // Биотехнология размножения сельскохозяйственных животных. Научно-технический бюллетень (ВИЖ). Дубровицы.-1989г.-е. 18-21.

46. Эрнст Л.К, Голубев А.К, Макарова З.Н. / Культивирование эмбрионов из ооцитов коров. // Докл. ВАСХНИЛ. -1982. -№12. -с26-28.

47. Эрнст Л.К, Хачатуров Е.Н, Ярных Е.В. / Получение ранних эмбрионов крупного рогатого скота вне организма. // Сельскохозяйственная биология. -1987. -№12. -х.60-65.

48. Эрнст Л.К, Кузьмина Т.И, Джоббур З.И. / Комплексное тестирование качества ооцит-кумулюсных комплексов коров. // Серия биология животных. Издательство "Известие". Сельскохозяйственная биология, - 1994, -№2, -с43-48.

49. Эрнст Л.К., Макарова З.Н и др. / Получение потомства из дозревшей и оплодотворенной яйцеклетки коровы. // Вестник с.-х науки. -1983. -№7. ^с.77-86.

50. Эрнст Л.К, Прокофьев М.И. / Биотехнология сельскохозяйственных животных. // Москва. Колос. -1995. -с. 192.

51. Эрнст Л.К, Сергеев Н.И. / Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных. М. Агропромиздат. -1989.

52. Эрнст Л.К. / Крупномасштабная селекция новый этап совершенствования крупного рогатого скота. // Новое в животноводстве. -1985. -с. 14-35.

53. Эрнст Л.К. / Мейоз в ооцитах коров при культивировании их вне организма. // Доклад Всесоюзной ордена Ленина и орден трудового Красного Знамени академии сельскохозяйственных наук им.

54. В.И.Ленина. -М. -ноябрь 1987. -с.24-27.

55. Юрина Н.А., Торбек В.Э., Румянцева Л.С. Основные этапы эмбриогенеза позвоночных животных и человека. - Изд-во РУДН. - М. -1992. -с.17.

56. Austin C.R. / Observations on the penetration of the sperm into the mammalian eqq. //I. Sci.Res. Austral.-195 l.-V 4. -p. 581-596

57. Barnes F.L. /Characterization of the onset of embryonic control and early development in the bovine embryo. //Ph. D. Thesis. University of Winconsin. -1988. -p. 74.

58. Berg U, Brem G. / Developmental rates of in vitro produced IVM-IVF bovine oocytes in different cell co-culture systems. // Theriogenology.-1990.-vol.33.-#l. -p.195.

59. Berg U, Brem G./ Созревание и оплодотворение in vitro ооцитов, полученных при убое телок и коров, и последующее культивирование до стадии бластоцисты (ФРГ). //Zuchthygiene.-1989.-vol.24J3. -р.134-139.

60. Biggers J.D.et.al. The pattern of energy metabolism in the mouse oocyte and zygote. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1967. -v.58. -p.560-567.

61. Camous S, Heyman Y. / Влияние трофобластических пузырьков на развитие ранних эмбрионов крупного рогатого скота в культуре и выживание их после пересадки реципиентам.(ФРГ) //1. Reprod. Fertil. -1984. -vol.72. #2. -р.479-485.

62. Chang М.С. / Fertilizing capacity of spermatozoa Deposited into the fallopian tubes. //Nature.-Lond. -1951. -vol.168, -p.697-698.

63. Cheng W.T,Moor R.M,Polge С./ In vitro fertilization of pig and sheep oocytes matured in vivo and in vitro. // Theriogenology.-1986.-25. -p.146.

64. Chen-lu H.B and Lu К H./ Effect of protein supplements on in vitro maturation, fertilization and culture to blastocyst and natching stage of bovine oocytes. // -Theriogenology. -January-1990. -vol. 33. -#1. -p. 205.

65. Critser E. et.al. / The effect of semen extension camp and caffeine on in vitro fertilization of bovine oocytes. // Theriogenology. -1984. -vol.21. -p.625-631.

66. Critser E. S, Leibfried-Rutledge M.L. et.al. / Acquisition of development al competence during maturation in vitro. // Theriogenology. -1986. -vol.25. -#1. -p. 150-155.

67. Crosby J.M, Osbom J.C. et.al. / Follicle cell regulation of protein Synthesis and developmental competence in sheep oocytes. J. Reprod. Fert. -1981. -62. -p.575-582.

68. Crozet N. Ultrastructural aspects of in vivo fertilization in the cow. // Gamete. Res. -1984. -#10. -p.241-251.

69. Eppig., Downs S.M. / The effect of hypoxanthine on mouse oocyte growth and development in vitro; maintenance of meiotic arrest and gonadotropin -induced oocyte maturation. //Dev. Biol. -1987. -v. 119. -p.313-321.

70. Eyestone W.H, Ax R.L. / A review of ovarian follicular cysts in the cow with comparisons to the condition in women rats and rabbits. // Theriogenology. -1984. -vol. 22. -p. 109.

71. Eyestone W.H, N.L. First. / Характеристика остановки в развитии ранних эмбрионов коров, культивируемых in vitro. // Theriogenology. March. -1991. -vol. 35. #3. -p. 613-624.

72. Eyestone W.H. et.al. / Метод культивирования в яйцеводах овцы оплодотворенных яйцеклеток и двух клеточных эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты (США) // Theriogenology. -1987. -vol. 28. #1. -p. 1-7.

73. Eyestone W.H. et.al. Co-culture of early bovine embryos with oviductalepithelium. // Theriogenology. -1987. -v.27. #1. -p.228-233.

74. First N.Z, Barnes F.L. / Development of preimplantation mammalian embryos. Development of preimplantation embryos and their environment. // Alan R.Liss, Inc.-1989,-p. 151-170.

75. First NZ.Parrish J.J. / Capacitation of bovine sperm by heparin. //Biol.Reprod. -1988.-V.38.-p.l 171-1180.

76. First N.Z.Parrish J.J. / In vitro fertilization of ruminants. //J.Reprod.Fert.Suppl. -1987.-34.-p. 151-165.

77. Fukui Y, and Ono H. /In vitro development to blastocyst of in vitro matured and fertilized bovine oocytes. //Vet.Rec. -1988. -vl22. -p.282-283.

78. Fukui Y, Fukushima M.et.al./ Effect of gonadotropins, steroids and culture media on bovine oocyte maturation in vitro.// Theriogenology. -1982. -vol.18.-p.161-175.

79. Goto K, Kajihara Y. / Pregnancies after coculture of cumulus cells with bovine embryos derived from in vitro fertilization of in vitro matured follicular oocytes. It I.Reprod. Fertil.-l988.-83.-p.753-758.

80. Handrow R.R, Lenz R.W, Ax R.Z./ Structural comparisons between glycosaminoglycans to promote an acrosome reaction in bovine spermatozoa.//Biochem. Biophys.Res.Commun.-1982.-107 -p.1326-1332.

81. King W.A. / The pronucles of bovine ova fertilized in vitro. // Hereditas. -1985. -vol.102, -p.293-296.

82. Langlais J,K.D.Roberts. / A molecular model of sperm capacitation and the acrosome reaction of mammalian spermatozoa. //Gamete Res.-1985. -12. -p. 183-224.

83. Lee C.N et.al. / Glycosaminoglycans in ewe reproductive tracts and their influence on acrosome reactions in bovine spermatozoa in vitro. // J.Anim. Sci. -1986. -63. -p.861-867.

84. Lee C.N, Ax R.L. / Concentrations and composition of glycosaminoglycans in the female bovine reproductive tract. // J.Dairy. Sci. -1984. -67. -p.2006-2009.

85. Lee Myeng-Sik, Boh-Suk Yang et. al. / Transferable bovine embryo production by in vitro fertilization. // RDA The Reaserch Reports of the Rural Development Administration, Suwon, -Korea, -1993, -Vol.35,#2, december, -p.513-516.

86. Leibfried-Rutldge M.L. et.al. / Effect of fetal calf serum and bovine serum albumin on in vitro maturation and fertilization of bovine and hamster cumulus oocyte complexes. Biol. Reprod. -1986 -#35. -p. 850-857.

87. Lenz R.W, Ax R.L. / Proteoglicans from bovine follicular fluid enhances an acrosome reaction in bovine spermatozoa. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1982. -Vol.106, -p. 1092.

88. Lenz R.W. et.al. / In vitro Maturation and fertilization of bovine oocytes are temperature-dependent processes. //Biol. Reprod.-1983.-29. -p.173-179.

89. Lonergan, P.,C.Carolan,P.Mermillod. / Development of bovine embryos in vitro following oocyte maduration under defined conditions Reproduction. // Nutrition Development, Elsevier/INRA, -Paris, -1994, -vol. 34, #4, -p 329-339.

90. Lopata M.L. et.al. / A metod for collecting motell spermatozoa from human semen. //Fertil.Steril.-l976.-27 -p.677-684.

91. Moor.R.M,A.O.Trounson. I Hormonal and follicular factors affecting maturation of sheep oocytes and their subsequent development capacity. // J.Reprod.Fert. -1977.-vol.49. -p.101-109.

92. Moor.R.M. / Measurement of intercellular coupling between oocytes and cumulus cells using intracellular markers.// Exp. Cell.Res. -1980. -vol.126, -p. 15-26.

93. Parrish J.J,Susko-Parrish J.L et.al. / Bovine in vitro fertilization. // Prol. 11 Feet. Conf.A.1 and Reproduction. -1986.-pl20.

94. Parrish J.J,Susko-Parrish J.L et.al. / Role of heparin in bovine sperm capacitation. //Biol.Reprod.-1985.-32.(suppl I), -p 211.

95. Piedrahita LA. et.al. / Influence of feeder layer type on the efficiency of isolation of porcine embryo derived cell lines. // Theriogenology.-1990.-vol.34.-p.865-877.

96. Pincus Y, Enzmann E. / The comparative behavior of mammalian eggs in vivo and in vitro. // Exp, Med. -1935. -vol.62, -p.665-675.

97. Roberts R.M. / Minireview: Concepts Interferons and Maternal Recognition of Pregnancy. //Biol. Reprod.-1989.-vol.40.-p449-452.

98. Rodriguez H.F, Wiemer R.S. / A bilayered fetal-cell co-culture system for culturing bovine embryos. // Theriogenol ogy. -1990. vol. 3 3. -# 1. -p.309.

99. Rosenkranz C.F.Jr.,Neal L First. / Effect of free aminoacids and vitaminson cleavage and developmental rate of bovine zygotes in vitro. // Journal of animal science. -1994, -vol. 72, #2, p. 434-437.

100. Rutledge et.al. / Изучение возможности ооцитов крупного рогатого скота к дальнейшему развитию in vitro при созревании in vitro или in vivo (США). // Biol. Reprod. -1987. -v.36. #2. -p376-383.

101. Sanbuissho A, Coskun S. et.al. / Stimulatory action of epidermal Growth factor (EGF) on bovine oocyte maturation in serum free defined medium. // Theriogenology.-1990.-vol.33.-#l -p.318.

102. Sato E. et.al. / Prevention of spontaneous degeneration of mouse oocytes in culture by ovarian glicosaminoglicans. // Biol. Reprod. -1987. -vol.37, -p. 120.

103. Scodras J.M., Pollard J.W., Betteridge К,J. / Влияние типа соматических клеток на эмбриональное развитие коров в условиях сокультивирования. // Ontario, Canada. -Theriogenology. -January -1991. -vol. 35. -#1. -p. 269.

104. Suss U,et.al./ Cumulus expansion, in vitro fertilization and embryonic development after in vitro maturation of bovine oocytes in the presence of follicle stimulating of liteinizing hormone. // Reprod.Dom.Anim.-1990.-25. -p.3-13.

105. Voelkel S.A,et.al. / Use of a uterine-cell monolayer culture system for micromanipulated bovine embryos. // Theriogenology.-1985.-24.(3). -p.271-281.

106. Walker S.K.et.al. / In vitro culture of sheep embryos without co-culture: successes and perspectives. // Theriogenology.-1992.-vol.37. -p.111-126.

107. Wang Z.M, Macdonald. / Germination of red maple seed. Seed Science and Technology.// Theriogenology. -1993. -v 6. -p.785-790.

108. Yonis A.J, Backett T. / In vitro development of bovine oocytes into morulas and blastocysts. // Theriogenology.-1990.-vol.33.-#l.-p.362.

109. Zhou Song Chen. / Effect of supplement bovine follicular floid to the maturation medium on in vitro developmental ability of bovine follicular oocytes. // Chinese Journal of Animal and Veterinary Sciences. -Pekin. -1993. -Vol. 24. -No 6. -p.110-120.