Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА СОЗРЕВАНИЕ И ОПЛОДОТВОРЕНИЕ IN VITRO ООЦИТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА СОЗРЕВАНИЕ И ОПЛОДОТВОРЕНИЕ IN VITRO ООЦИТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА"

о4-3&&OS

На правах рукописи

Ах мол даева Анар Муханбеглсановна

Влияние биологически активных веществ на созревание и оплодотворение in vitro ооцитов крупного рогатого скота

03,00.13 - физиология человека и жившных

Автореферат диссертации на соискания учёной степени кандидата биологических наук

Дубровицы. Московская область - 2000.

cffp - p>07. - ¿MtJ?

/1иссерташюнная работа еымо.кгсна в Российском унивсрстьче дружим народов » s отделе трансплантации эмбрионов сельс«>холя1ип венных животных Всероссийского научно-исследовательского инеппута жи но 1 но во детва (ШГЖ)

Маучные руководители:

доктор биологических наук, профессор H.H. СЕРГЕЕВ доктор биологических наук, профессор И.Л.НОРФИРЬКВ Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессоре В Совет к» н

ка нам дат биологически* наук НГ Клсцко Ведущее учреждение: Российская академий менеджмента в животноводстве

Защита диссертации состоится " 2000г

в f.P... час, на заседании диссертацией но го со вега ДОЮ. 16 02 во Всероссийском научно-исследовательском институте жнвотноводстаа-Адрес: 142012. п. Дубровнцы, Подольского района. Московской области.

С диссертацией можно ознакомить."?' ь "чблиотеке Всероссийского научно-исследовательского института животно воз; г,,.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного со»(ет»,/ /У <г Р J

кандидат биологических наук ( yi^/yt/T'^ В.ПХубанова

. ■ -' ОСнцал *арактср>«гп1ка раСнмм, , ... „ •• •. < ..

. . Л*|уаль*н>с||>, 1«« ы.. Т^гснлат-аци* ,')мГ>цшМ(1>в . «влясгся, ^ффектииным

био(ехножм цчсским, «снычом, .во^нроинюлстна жим« пых, ко юры й нспольаустся, > настоящее нремя д.1» ускорения ¡«иегичсскот, нршрссс» » молочном скоюаодсгве. Мм^киЙ к^иффнциаи рлмножения крунио-о рсиагюи) скота н 11родш1ж»псльныи Интерпол поколений существеннощ/раничмваютвозможиосгиселекции молочного стада. ,. ..

„, Современные экономически« условия , диктукгг неотложную, необходимость повышения интенсивности селекционной работы.ж) соворшенсгвованию плененных и I |родукти иных . качеств ж ии^ицх, соодания современных высоюнгродугтменых пород, линий и енбрилив скот, шеечамммих требованиям ноооинно меняющейся конъюнктуре рынка... . ,,...; 1 .. •••.,,.. . . . ... • ... -.. ,.

.. В настоящее время в племенных. хозяйствахгенетический , прогресс породы снижается ; ил-т& .- преждевременной. выбраковки., высокопродуктивных ,животмых-вирусоносмгтеяем. /Ця предотвращения исчезновения наиболее ценных животных можно использовать ( про!рамму эмбриопересадо*. Получение; эмбриона*, от животных, . -внрусоноснтелей.т отмывание и обработка в растворе трипсина .позволяют папностыр удалить вирусы л ей кота, риютрахекта и др., располагающиеся, на оболочках клеток. Использование в качестве реципиентов здоровых животных гарантирует оздоровление стада беа понижения генетического потенциала. {Решетки ком КМ,, 1997г) .

. Развитие бнотехнологическнк методов. позволяет.. на современном этапе, эффективнее каыльэовгпъ репродуктивный потенциал высокопродуктивных животных. Однако использование новик. биотехнологичееккх методов, а. также: проведение исследований в области биологии эмбрионального раэвтн*. одерживаются, высокими материальными затратами на получение эмбрионов на ранних стадиях развил«.

Большое значение в решении данной проблемы отводится. специализации по созреванию к оплодотворению : ооцнтов внеорганизма, с целью удовлетворения потребности науки илрактнкк а ранних эмбрионах^ , . ,

Одним из путей снижения стоимости эмбрионов является получение яйцеклеток . ррн убое высокоценных норов после выбраковки на ьяоо и оплодотворение яйцеклеток ¡п

Максимальное использование генетического фонда ^йцвкяеток возможно .лишь в условиях созреванияи огцюдоге9ре(шят уияк'/Ч »««"♦¡»IV■ .

Эффективность получения ^мбрит^м» * вр^мя составляет

— ' - - центральная ■ ;-НАУЧНАЙ*Б%)1И0ТЕКА

МОС«. ....

- . ... садами* им, Н. А, ^имирд

Имв.№.

лить 10*/. живого потомства.' Низкий проLíeirrобусловлен, прежде accru, исиолтшснным Созреванием ооцнтов""»! vîtro.'' Для обеспечения. полноцстют- созревания : ооцитов иео&чидимо;; смоделировать условия ; fñ ' vitro- близкие неестественным. ' Успех ку л ьти ей рования ' оомнтов вне-. организма -зависит от' миом« факторов' • №и;ш . гультуралънЫх сред,' сочетания а культуральнО|Т'среде биологичйсш активны* вешеств, соблюдения - температурного и газового режимов, возраста, времени'гола-и генотипа животного!' Усовершенствовать' существующие методы регуляции созревания: ооцитов возможно"'путем ' включения'' плеточных1; зяементсиг-интак-гных" фолликулов- и-кондиционных сред; *& также путем воздействия на гюстрецегтгорные внутриклеточные посредники действия гормонов:* j •*' «'*■•'- '■>"" «ч. - ; •

Применение метола транегшантации эмбрионов по системе МОЕТ (множественная 0вуляция ; м'< эмбриотрансплгнтаиия) - ускоряет генетический"? прогресс" в 10 раз по сравнению с методой искусственного осеменения (Решетникова Н.М; Мороз Т А,* 1997) ' 1 1 ! Английские ученые проводили опыты' попроизводству гэмбрис)нов коров in vitro e большом количестве,' « пришли'к выводу, что применекмеэтой техноЛопшвотмомсио в : производстве, и -в'ближаДшеМ будущем ■ будет* иметь огромное значение в развитии ■ скотоводства(ЛонергаиК; ^MrJ.1Г * V '"' " ■ 1 •.<•«■- г

lUnt. втапачи исследований/ Целью"нашей работы1 явилось совершенствование метода культивирования- к оплодотворения- sñe организма ооцитов крупного рогатого скота ''"* '*■ 'i-si'rt^,'.с*..---jг- .i' чо"." ■ 4 ¡■ • >VM »-„ „ . i;iti.-r,-i. Í.

-г.' . .. lf+h

- Исследования влияния эффекта биологически Активного вещества на созревание и оплодотворение ооцитов irï"vitro подразумевает следующйеэтапы':'*7" 1 1 '*

I) • выявление'оптимальной концентрации^ : в которой; биологически 'активное

ЬещеОгво оказывот какой-либо эффект <на мейоз оститов коров; ' '' ........

г^.. ,-.. 2)7 - Определение ; характера ' влияния14 биологически - ' актнен ых ' веществ ~ на .. оплодотворение, дробление и! выход1 качественных ' эмбрионов ''на4 пролонгированных ;. стадйяхраэви™я(морула,бластоииста).1;'' ■ ■ 4)1 «* >■''"

достижения- поставленной ''цели необходимо'' было :1 решить 'следующие. основные задачи:- ' ' '

* '' '1 Г'' Определить- 'влияние сезона года 'на' созревание и ' оплодотворение ооциов

крупного рогатого скота при культивнровании вне оргаиюма.1'1'' - ' --ti " Определить-/ влияние-' астральной- ¿ыворотки - и' гонадотропньи - гормонов - на

созревание и оплодотворение ооцитов m vitro Л также выявшь минимальную концентрацию астральной сыворотки и гонадотропных горионое, влияющих положительно и» созревание ооцитоа. ,. ,, < -

3. Выяснить роль гепарина н различных сред для капашттации и времени их соинкубироаани я с ооцитами на оплодеггворяюшую способность слсрмнев и кх выживаемость е культуральных средах, ] _ ^

i Изучить влияние фолликулов и их стенок, соматических клеток Н& развитие зародышей после экстракорпорального оплодотворения оошггов in vitro.

Научна^ новизна Научная г новизна исследований состоит-в эффективности использования биологически активных веществ для созревания и оплодотворения оошггов -i«i vitro. Продемонстрирована возможность преодоления блока клеточного деления на стадии $-16 бдастомеров путем использования монослоя гранулезных клеток. Впервые была установлена оптимальная доз« 50мкг/мл гепарина для илацитаиии спермы быков, прм котором процент дробления составил 42,5V«. ^ .,.,-■

Практическая значимость, p^frrtvi. На основании, результатов проведенных, исследований разработаны оптимальные кудугуральиые среды, с добавлением астральной сыворотки И ;, гонадотропных- гормонов, при которой = созрело ооцитов 56%, в оплодотворилось- 50%, Предложено, минимизировать концентрацию эстральной сыворотки до 5% с добавлением 20Йкл/мл ■ ФСГ, чгго. позволит получить до * 59,7% созревших ооцитов и 58,1% оплодотворенных. оошггов mvitro. Показана одинакова* эффективность созревания, оплодотворения и развития ооцитов крупного рогатого скота«-культуральных средах ТСМ-199, МРМ.МММ. Предложено сокультнвировзние на монослое гранулезных клеток для успешного преодоления. S-16 клеточного эмбрионального блока. ■

Аррфбачця работы. Материалы диссертации допожекы на ежегодных научно-(фактических конференциях Российского университета дружбы народов (1998-1W9).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы дм печатных работ а центральном журнале России "Молочное и мясное скотоводство" и * Племенное дело".

* Диссертационная работа имкпксна «а 10.1

страница* машинописноготекста й состоктиз введения, об*>ра лик-ратурьи описанич материалов и методики исследований/ результатоо собстиснныч' исслелоиятн!. обсуждения, вы волан и практических предложений. Цифровой материал представлен в 10 таблицах, иллюстрирован 10 рисунками Список литературы включает 125 источников^ отечественных и зарубежных авторов ''

2. Материал и меюдика'исследований.

Эксперименты про водились на аспириропанкых из яичников яйцеклетках крупного рогато по скота. С Подольского экспериментального мясокомбината яичники доставляли в течение 1,5-2 часов.'' В экспериментах. использовались яичники 6е1 патологически* изменений. Яичники с геморрагическим желтым телом, фолликулярной кнстоП^ с жировой . дистрофией, а также яичники от стельных животных отбраковывались.

" Транспортировали яичникн в лабораторию в 'термосе,'.1 при температуре физиологического - раствора 37°С. Время* от момента взятия яичникоадо постановки ооцитов на созревание составляло 2-2,5 часа.

Для" получення ооцитов яичники' неоднократно ■ промывали а. физиологическом растворе.' Затем ¿"'помощью'5 мл шприца и иглы №18 с' поверхности. яичника аспнриров&ли > фолликулы, с диаметром 2-8 мм Аспирнрованную фолликулярную жидкость сливали в 10 мл центрифужную пробирку дня отстоя.'

Спустя 10-15 мин, при помощи пастеровской пипетки седимект помещали в 35 мм чашку Петри, для: поиска' ооцитов. Поиск осуществляли под сгереомикроскопом с увеличением« 100 раз. , > • >.

Перед морфологической оценкой, ооциты 3 раза промывали в модифицированной среде /МРМ/, содержащей 20% фетаяьнон сыворотки. Морфологическое состояние оошгг-кумулюсногокомплекса служило селекционным критерием - отбора" ооцитов. В эксперименте использовали* округлые: по■ форме ооциты с темной равномерно гранулированной ооплазмой, олапесцирующей' оболочкой, с плотным ' компактным * «умулюсом. ■ ■

Дня созревания ооцитов использовали среду МРМ с 20% астральной сыворотки (инактмвированной' ЗОмин., при 5б°С) и добавлением 10 мкг/мл ФСГ, или модифицированная среда Менезо /МММ/ с аналогичными добавками, рН - среды находилась в пределах 7,3-7,4.

Cpo.iv согревания в oÓi-cmi; 400 мкл помешали н (лдыурадьные чашки и покрывали 4ÜÜ мк.1 Mii<icpa.ti.iujM числом, era тин. н, <'(>»* ■ ■ iiHtv-vóamp. Ha'.iKKiijiiiôpaintKi. Прем*

jxBiunôpanim ерелы tt>ciaB.t»-»ü l.S-'í' vaca.'' при icMtieparype УУС, í% t'O» и максимальнойвлажности.

( После селсхниоиной опенки, 20-30 ооиггго« на 40<)-у>кл срелы. с помощью -паст ср о не коп ниисткн переносили в срелу созрев»ни* Стреван несюцитов происходило в

СО-ни купа юре Темпера!\ра созрелання оошггов была ЗЧ'С,: время созревания 24 часа.' Приготовление сред, а также псе манипуляции; Спяманнме с псоучением- ооинтов н их постановкой ira стрсвание, 'происходили в максимально стерильных условиях' " 1

PenpíUyvTHBHbie органы (яичники; яйцеводы.-pota чатки) для'получения клеток Л оставлялись в лабораторию при температуре 4¿C в среде ДМЕМ млн в физиологическом растворе с добавлением антибиотиков и антимнктиков'" '''

В эксперименте использовали органы 6ev патологических1 изменений' в стадий , фолликулярного роста. ' ' ; ■ ' '' ' ' * " ' ' ■ v' ■"* ' • ' '

Для получения клеток гранулезы фолликулыс диаметром 3-8 мм препарировались под стереомикроскопом в ламинарном боксе. С. препарированного до теки фолликула, с . его внутренней части с помощью глазного скальпеля, снимался слой клеток 35мм в чашку Петри. Полученные клетки гранулезы трипсин тировались раствором Трипсин / ЕДГА и затем ценггрифировали при 485G, в течение 10 минут. , 1 :

Посев клеточногоседимента. осуществляли . в 500 мкл среды ДМЕМ+20%.

фетальиой сыворотки^ в культуралькых чашках.* Пассаж помещали в СО>» инкубатор: на <3

дня, при температуре 39"С; 5% СО* и максимальной влажности. При получении монослоя клеток гранулезы клетки обрабатывали ' антибиотиками • мктомиинном > С с концентрацией Юмкг/млл ^ .... - ,■ *

_ ^ При использовании монослоя клеток (р&нулезы для еокулигивировапия с ооцитами * культуральную среду предварительно (максимум за 3 дня) заменили на среду МРМ ■»■ 20%; н нактивиро ванной эсграяьной сыворотки коровы. ... . ,

При получении эстральной сыворотки брали кровь в объеме 30-50 мл, полученные: от коров или телок в пик охоты. Использовали одновременно кровь от нескольких

'•■ -, '!■■.■ ■•. * ■ .....„.>■ . .',4»,.«Vïïi":. ■ • м. ■

животных. Полученные пробы выдержками в холодильнике 3-4 часа, затем

, г*. 1 л ;ч i j:.'. . ч. Í ■ ¿ п.. ...... i ..i,. - х - ' . "'.-Ч'*.-.

центрифугировали в течение 20 минут при 2Q0Û оборотов в минуту, осторожно отбирали и

расфасовывал» по ' I-t,5мл и эдморажмнали 1]еред у погреб лен нем опаивали и инактнвнровади при ч56°С в течение 20-30 минуг ! ■■-.„.....-. > ■■

.Для получения монослоя кумулюсныч клеток, использовали кумулюсные КЯСТКИ, оставшиеся после оплодотворения ооштг-кумяюсных комплексов () 1 Lki,ioifcopeHHbie ооциты осторожно поднимали пастеровской пипеткой и переносили в другую культуральнуто чашку.' U оставшихся кумулюсных клетках' меняли срезу к культивировали в течение 7 дней до получения монослоя. '

* - Для-получения монослояэютгелиальных клеток яйцевода в лаборатории яйцевод препарировали и промывали 20 мл PBS бе» Са+^/МД'Н- раствором.

После промывки ФВС без Са*+/Мд++ раствором один коней яйцевода зажимали аргернальнойклеммой, а через другой пропускали 2-3 мл раствора Трипсин/-ЕДТА. Предынкубировали■ 10 минут- при комнатной температуре. Затем: клемму снимали л яйцевод промывали в 10 мл среды ДМЕМ+20% фатальной сыворотки теленка, и в центрифужнойпробирке,,, центрифугировали. 10 минут при 485G. Осадок ресусленэмровали S ия ДМЕМ -+ 20% фетальной сыворотки теленка н проводили посев -

клеточной-культуры. > Культивировали при ЗЭ^-ЗУв-СО* в- воздухе и-максимальной влажности. В зависимости <гг пролиферативной активности клеток среду культивирования Меняли через 4$ часов. При достижении монослоя клетки обрабатывали митомнцином С, . менялкередунаМРМ + 20%эстральвойсьшороткн, ■"■■•"■'■ 1 . ^ '

Дня экспериментов по оплодотворению in vitro использовали глубокозаморожениую сперму, полученную на ЦСИО сельскохозяйственных животных полштиио-фризсксн; и немецкой. черно-пестрой пород от. быков ■ класса элита-рекорд. Подготовку спермы к оплодотворению осуществляли по методикам описанным Parrish и др. (1986). Для каждого опыт« три гранулы спермы быка оттаивали I минуту при 37°С в водяной бане. Центрифужные пробирки (1,8 мл) заполняли средой Sperm-Talp по I мл, а на дно осторожно опускали по 200-220мкл спермокониентрата.

Пробирки ставили, в инкубатор на 1час при 39°С. При этом подвижные спермин поднимались, из разбавителя в выше расположенную среду, где они активируются. Спустя I час, около 750-800 мкл среды каждой' пробирки осторожно сливали для центрнфугации. Эту фракцию спермнев центрифугировали 10 минут, при 20°С. После этого осадок ресуспензнровали Sperm-Talp' к еще раз центрифугировали при тех же условиях. Отстой удаляли да 200 мил, добавляли гепарин и сперму предынкубировали 15

г- ■" . и '" j - - L ■ ■■ v - 1 * * - - - ■ >■■.- ■ ■ 7 ч

минут при 39°С.

Онло.югнорение ооцитов ¡п уНгсг проводили в среде РЕЛТ-ТЛЬР под минеральным; маслом, в инкубаюре при Э9°С, 5% СО» и максимальной влажности. „

Среду К1\КТ-ТА|_Р в объеме 400 мкл помещали в культуральные чашки и-покрывали 400 мкл минерального масла. Поел« 1-2 часовой эквнлнбрации среды на рН, добавляли 20. мкг пенициллина, Юмкг. гипотаурнна и Ыкгэпинефрика,, иЛ0мкг/мл гепарина. . ■■ ■ , ... ■-.: - ■ * ■ ■ ■ , - ■■*» .".'■;-.

Для. сгабилиодии. концентрации у веществ .' » среде минеральное , масло предварительно эквилибрировали со средой МРМ. В одну каплю среды оплодот воре« ия-РЕЛТ-ТА1.Р опускали по 20-25 ооцитов и в зависимости от активности добавляли б*12мкя спермоконцентрата " ..л ,,. ■■■... 1- - >■ ■. - ■ м »■; . • • -

, После 18-20 часового, культивирования ооцитов и спермнев, ооцкгы. переносили в среду МГ>М*20% астральной.,сыворотки . или МММ+20% эстральной сыворотки,-Неоднократно промывали не помощью • вытянутой пастеровской' пипеткой легким ■ пипетироьанием удаляли часть кумулюсныхклеток окружающих ооцит.

Оплодотворенные ооциты культивировали в 400 мкл срады МРМ+20% астральной 1

сыворотки или МММ+20% астральной сыворотки в СО« инкубаторе при температуре

39"С, 5% СО" и максимальной влажности, время культивирования составляло 7-8 суток.

При . сокультивировании - с монослойными ■ культурами, соматических клеток репродуктивного тракта оплодотворенные ооцитыпо-20-35-на ячейку переносили • на 1 подготовленный монослон клеток и культивировали при тех же условиях. ...

Для цитогенегического анализа ранние, зародыши (от,2х,клеточных..н*выше).< помещали в гипотонический раствор (1% раствора цитрата натрия на дистиллированной ; воде). Зародыши - экспонировали: в гипотоническом-растворе. 2.'. минуты.«..Фиксацию;-; эмбрионов осуществляли смесью метилового егшрга и ледикой. уксусной - кислотой: в,-соотношении 3:1. Окрашивали по.Томановскому-Гкмза. Отмывали клетки от красителя 96%спиртом " . , ; ... - :..-•.! ■

Исследование проводили под. 400 кратным увеличением- микроскопа для определения оплодотворения, критерием которого служило наличие 2 лронуклеусов, 2 полярного тельца или хвоста спермия в перивигеллиновом пространстве.

3. Результаты исследований.

3.1. Влияние сезона года на созревание и оплодотворение ооннон

; крупного рогатою скота при 'культивировании вне органиима.

Как показали " наши1 исследования, ■ одним из самых важных моментов, определяющих успех или неудачу экспериментов по культивированию ооцитов in vitro, являемся качество исходного материала. При отборе яичников у коров и телок учитывал» здоровье И возраст животного,'а также стадию эстрадьного цикла.'

■ - ' Goto, К и др. (1988) в своих экспериментах получили от 5 до 10 ооцитов на яичник, которые были пригодны для дальнейшего культивирования in vitro.

' Количество ооцитов,'аспирирова иных с одного яичника, в наших экспериментах составило: в среднем 5,3 и только 3,6 ооцитов были оценены как'хорошие' на основе их морфологического состояния.1j '■* 1 .

Ооцнты по морфологическим критериям подразделяли на три группы (хорошие, средние и плохие)/' Стандартизируя т.о. состояние исходной популяции ооцитов и усовершенствуя, условия культивирования ооцитов путем использования различных синтетических сред, сывороток и биологически активных веществ ие далн стабильных результатов в разные сезоны года, • -

' > Также наибольшее число нормальных эмбрионов, по сообщению Гаврикоеа А.М, получено зимой и осенью (3,8 и 4,2), что составляет'57,6 н 70% от числа извлеченных зародышей. Весной получено до 35,2% дегенернро ванных эмбрионов, что было связано с нарушениями балансирования рационов пй'пнютеяьности, мнкро и макроэлементами и биологически активными 1 веществами.: Наиболее ' благоприятными периодами для получения морфологически нормальных эмбрионов, создания эмбриобанка и проведения эмбриопересалок является осень и зима,-"т ' ■■■■■" " "н '

* Даже при' культивировании в синтетических'средах с добавлением пептидных н стероидных гормонов не дает стабильных результатов. " '

--Л1 Результаты представлены в таблице 1, ' 1' * -'-■' ' -

ю

':'" ' ;•■■■■■■■■■■• ■ ¡ , F¡ ....'„■ . Таблица Г Влияние сезона года на созревание и осиодотиоренис оошггоп коров при культивировании их вне органшма

Месяц ,, Число ' * ixhíhtob, поставленных на созревание Число ! оошггов, созревших до метафазы 2 Число , дегенери-Ро ванных ооцнтов- - - Число .. оплодотворенных . ооцнтов Соотношение созревших к г оплодотворен, .. ,

Январь 70 52. ' 23 29 * 55,7'

Февраль 35 67 18 32 • . 47,7

Март 45 28 19 13 46,4 "

Апрель 55 35 24 II 31,4

Май 60 42 28 14 33,2

Июнь 32 , 26: 21 5 19,2

Июль 39 25 17 4 15,4 , .

Август 50 43 22 6 13,9

Сентябрь, - . 95 72 35 12 16,6

Октябрь 76 27 . ,19. ... 36-5.

Ноябрь 49 32;. . 12...... 13 40,3 -----

Декабрь:-. ПО . 62 ,.,■,38-. 27 «А,,,.

В ходе наш их экспериментов было установлено, что наиболее низкий процент созревания и оплодотворения приходится на весенне-летние месяцы (10-12%), а в осенне-зимний - составила (37-41%), то есть повышается. Нюкий процент* выхода ооиитов,1 вероятно, был обусловлен нарушением метаболических процессов в организме вследствие гигювитамннозое, сезонного гормонального дисбаланса ■ .

■ Поэтому работы по культивированию ооцитов нужно проводить с учетом времени -года. В связи с этим возникает необходимость в усовершенствовании культурадьных сред за счет введения в состав различных биологически активных веществ в зависимости от времени года. , 1 , ■

И

3.2, Созревание ооцитов в различных средах в присутствии сывороток и

гонздотропных гормонов. ■ .

Для полного развития и. последующего оплодотворения питательная среда, по

мнению First и Plumb. (1487) должна содержать сыворотку крови. Из литературных

источников 'известно, что' при культивировании ооцитов коров. используется БСА,

фетальная сыворотка теленка и астральная сыворотка коров в охоте. По сравнению с БСА,

по мнению Rutledge' и др. (1987) фетальная сыворотка способствует кумулюсной ■

экспансии, ' индуцирован но й ;ФСГ и улучшает жизнеспособность и. окончание .1

мейогического деления/. Концентрация сыворотки может колебаться от 2% до 20%. При

сравнении фетальной и ■астральной сыворотки, наблюдается более полная > экспансия

кумулюсных клеток, высокая степень оплодотворения и развития ранних эмбрионов

достигается при добавлении астральной сыворотки.. -

В наших экспериментах для созревания ооцитов использовали модифицированную

среду Паркера с добавлением-20% фетальной и астральной ■ сыворотки в присутствии ". i ■. ■ ■ гоиадотропных гормонов, таких как ФСГ в дозе 10 мкг/мд и ЛГ 5мкг/мл, так и без них

(табл.2). ' ' 1

ч ' ' * - . ;

' ' ' •* Таблица 2. 1

Созревание ооцитов при добавлении в среды разных сывороток и гонадотропинов.

Показатель " ■ . Среда • ч

МРМ+20%фетальная сыворотка, ФСГ и ЛГ МРМ + эстраяьная сыворотка, ФСГ и ЛГ МРМ+э (игральная -сыворотка

Число' прокультивированных оощггов, п ■ 40 5® 45

Созрелсг ооцитов *' * до метэфазы 2, п (%) - .....12(30) ;■'■■* 2S (56) 1 20(44,4)

Дегенерировавших оошггов, п (%). '* 28(70) 22(44) ' 25 (55,5)

Процент созревших к числу дегенернр*»^' ванных • 30 г . . '56 ■ 44"

Результаты показывают, что на созревание ооцитов в большей степени влияет астральная сыворотка, ФСГ и ЛГ (56%), чем ф стальная сыворотка с гормонами на 26% ниже. Показатели культивирования в среде с астральной сывороткой без гормональных добавок были ниже на, 11,6% по сравнению с гормональными добавками. Поттому при > созревании ооцитов можно использовать эстрадьную сыворотку даже без добавки в среду созревания гомадотропных гормонов. Эстральная сыворотка коров в охоте является как добавка белка среде созревания. При этом .наступает полная экспансия кумулюсных клеток, включая корону радизта, а кумулюсн&я*экспансия сопровождает созревание | цитоплазмы, что в свою очередь ведет к полному созреванию ооцнта. т 1

Увеличить репродуктивные функции коров возможно посредством интенсивного использования огромного потенциала резерва ооцитов, заложенного в их яичниках. Для этого крайне необходимо разработать методы не только выделения из яичников и доведения яйцеклеток до зрелого состояния, но и их оплодотворения с целью культивирования эмбрионов вне организма. Сочетание в культуральноЙ Среяе для ооцитов ряда биологически активных веществ может дать высокое обеспечение] генетически полноценных яйцеклеток. - .............

Так для оплодотворения ооцитов вне организма нами использовалась среда ТСМ* 199 с добавлением 20% фатальной нлн эстральной сыворотки, а также гипофизарных гормонов ФСГ в дозе 10мкг/мл и ЛГ 5мкг/мл и без них. Оплодотворенными считались ооцкга, у которых наблюдалось второе полярное тельце и наличие 2-х и более бяастомеров. - „

Для полного развития и последующего оплодотворения также необходимо наличие сыворотки кроен, И в этом случае эстральная сыворотка эффективнее, чем фетальная. Это объясняется тем, что в астральной сыворотке находятся биологически активные вещества (ростовые факторы, аминокислоты) благоприятно влияющие на процесс оплодотворения (табл.3).

" '," - * ' ' Таблица 3,

" Результаты оплодотворения ооцнтов при' включении а среду сыкороток и ' гонаяотропинов. -'-' '-■■'■»'■•'.-'■■ '

' - ' ' ' Среда ТСМ-1ОД ■ ■

Показатель ' Фатальная . ■ ! сывороткк. ■ ' ' ФСГ нЛГ Эстральняя 1 сыворотка. ФСГиЛГ " . Эегралъная сыворотка

Число созревших Ооцитов, п ?''"■'' . 12 20

Оплодотворенных ооцитов, п (%) " , ■ ,4(33) , , ,, , 14(50) Я (40)

И}' них 2-х блзсто мерных 6 . 4

4-х" 1 3 2

8-х - 2 2

1б-х - 3 -

И» таблицы видно, что при добавлении в среду астральной сыворотки получено 40% оплодотворенных ооцитов, а при добавлении ФСГ и ЛГ на 10% увеличивается выход оплодотворенных ооцитов по сравнению с фатальной сывороткой, ФСГ н ЛГ всего 33% . Эти-различия объясняются тем, что астральная сыворотка содержит стероидные и гонадотропные гормоны.

Так же изучая влияние сред с минимальной концентрацией сыворотки крови на созревание ооцитов, снижали концентрацию астральной сыворотки'коров до 5% и. добавляли различные концентрации гомадогропинов: ФСГ-20мкл, 5мкл/мл среды, глутзминз-150м*л (табл. 4).

Таблица 4.

Влияние минимальной концентрации сыворсггки грови коров на созревание -. ООЦИТОВ . ■■,■.■..■■■■',*',■; . .> ',■■• ■;■ ■ -

Среда созревания Всего ооцитов Стадии развития оошггов

; Диплотена ДиакинеЗ' мстафаэа-1 Метефаза-2

MUM- 10°-о -хлрал ы to и сыворотки, n(%) ■ 97 1 <1.0) 32 (33,0) 64(66,0)

МПМ + 5% астральной сыворотки, г (%) ' 7! : 3 (4,2) 29 <40.8) .39(55,0)

МПМоэстральной сыворотки +■ 20мкл/мл ФСГ, п (%) ■ ' 72 ■ ■ 4 {4,2) 25 <34,7) 43 (59,7)

МПМ + 5% астральной сыворотк »+5 мкл/мл ФСГ +150мкл/мл глутамина, п (%)' 68 4<5,8) 26 <38,2) 1 - 38 (56,0)

Число созревших ооцитов при добавлении в среду 10% эсгральной сыворотки составил 66,0%, а 5% - 55,0%, добавление к этой среде 20 мкя ФСГ повышало норму созревания на 4,7%, a S мкл ФСГ и 150 мкл глутамина не влияли на созревание ооцитов.

- Стимулирующий -.' эффект■ сыворотки ' может ' быть объяснен действием содержащихся в ней ростовых факторов и аминокислот.

> Оплсдотворяемость в среде с 10% астральной сывороткой была высокой (71.9%) При уменьшении концентрации астральной сыворотки до $'/• выход оплодотворенных' ооцитов составил 30,8%,' а при добавлении 20 мкл ФСГ повысило оплодотворяемосгь на 27,3%. Снижение концентрации ФСГ до 5 мкг и включение 150 мхл глутамина не влияло' на этот показатель, однако выход зародышей был на 14,8% больше (табл,5). .

Из оыта следует, что добавление в среду созревания 10% астральной сыворотки-обеспечивает (71,9%) созревания и оплодотворения ооцитов in vitro." j • '■ ■ "■• '''

'■■■-•* 1 ' • ■- 1 Таблица 5.

Оплодотяоряемость ооцитое крупного рогатою скота после созревания в ерше с разной кониогтраиней астральной сыворотки кроен ;

Среда согревания . Число ооинтов, п Огслодотео- ,! Получено -. Рклось, ; зародышей, п(%), | п(%). Процент От общего числа

МПМ+ 10% эстральной сыворотки * : 64 46(71,9) 27(58,7). 42,2

МПМ + .5% эстральной сыворотки " 12(30,8);

МПМ + 5% эстральной сыворотки + 20мкл/мд ФСГ 43 — 4(16.0) :. :

МПМ+- 5% эстральной сыворотки +5мкл/мл ФСГ + ]50мкл/мл глутамина - 3« 13(34,2) 4(30,8) .... 10,5

• : 3 ;3. Культивирование оощтто» в радднчньсх куяьтуральных средах.

': . " В настоящее время известно, что в значительной мере жизнеспособность ооцнтов и ранних- эмбрионов , зависит от правильности .подбора-■ питательной среды. Дня-, культивирования оошпов коров используют среды ТСМ-199, МРМ, Менеэо, Игла, Хэма Р-10, Р-!2, пригодные для. нормального завершения ядерного и иитоплазматнческого развития внефолликулярных ооцитов. Осмотическое давление и рН культуральной среды необходимо устанавливать между 290-300 мнллосмоль и^.-рН 7,2-7,4, что соответствует физиологическим • условиям... Кроме того, в питательную -.среду ; добавлялось' 20% ■■ астральной сыворотки. В наших экспериментах для сравнения использовали ТСМ-199, модифицированная среда Паркера (МРМ) н модифицированная среда Менезо (МММ), с буферными и энергетическими добавками (табл.6).

1й

Тзолииа û.

Результаты культивиропанн» оошггов в различных культуральных среда.

Показатель . Среда ' "

ТСМ-199 МРМ j МММ

Число оошгтов, п 100 170 - 90 .. -

Созрело ооиитов, п ■ ■ 105 : 55

Дегенери роеаиньгж 35 65 ! '35

ооцитов, п *

Процент созревания .«- 53,8 . 61.9 ' j .63,6 .

■ ' Проведенные нами исследования по изучению влияния" применяемых сред показали, что число созревания ооиитов и оплодотворения составило: в среде ТСМ-199 -53,&%,МРМ-61,9%, а в МММ -.63,тоесть не имеет существенны* различий. ,,,,

Однако среда ТСМ-199 и МММ более универсальны н их можно использовать при капацитации сперматозоидов, в отличии от модифицированной среды Паркера (МРМ)

3.4. Влияние дозы, гепарина и, временя . капац»гтаиин слермнеэ , на их оплодотворяющую способность.

Центральным моментом оплодотворения является слияние. гаплоидных наборов хромосом мужской н женской гамет. Ему лередшестеует взаимодействие между спермием и яйцеклеткой, возобновление мейотического деления в ооците, формирование мужского и женского про нуклеусов, метаболические изменения. Яйцеклетки млекопитающих, достигшие стадии метафазы 2, считаются готовыми к оплодотворению, что касается спермиев, то они должны быть капацитированы, т.е. пройти комплекс физико-химических

изменений, в результатечегоспермий может проникать в яйцеклетку. . ....... .

В наших экспериментах (табл.7) в качестве среды для калацитаиии использовалась среда SPERM-TALP, NA-пируват и BSA, добавляемый перед использованием.

,„>■■■", Таблица 7,

Влияние .дозы гепарина» времени капацчтации на оплодотворяющую способность спсрмнев.

Число ООЦИТОВ, п. } ■ / Концентрация гепарина ммУмл ■ - Время капашгтацин (мин) Процент дробящихся ООЦИТОВ : ' " 1

- 34 .... 5. 0 0

38 (0 5 12,8

-'■ 43 • 20 Ю ■ - • 15,5 г -

.- 52 » 15 • 25,8 ■

25 40 20 33,6

67 50 - - 25 . 42,5

75 100 - 30 10,3

' В"ходе эксперимента: было установлено, что оптимальной дозой гепарина1 прн капашггашт спермы быков является доза от 20 ао 50 мкг/мл, а время капацитаоии от-10 до'25" минут. При этом самый высокий процент дробления ооиитов составил 42,5% при, 50мкт/мл,25млн. ■ .-.->>..- "' "

Более высокие дозыгепарина снижают процент выхода оплодотворенных ооцитов, так как вызывают полиспермию и истощают энергетический запасепермиев.

3.5." Культивирование и со культивирование предымплантациопных эмбрионов на

монослояхсоматических югегок, ; ■ ' ' 1 ' '' '-■.'■■-■■

Часто при культивировании' преды«плантационных эмбрионов:' многие исследователи сшисиваются С клеточным^ блоком, ' когда развитие1 эмбриона останавливается.' на'стадии'8-16 клеток." Стадия' блокировки 'связаны: по времени с основным: началом* транскрипции '.эмбр но иного' Генома; с "главными1 качественными ■ изменениями«белковом синтезе; и~с появлением активного нуклеуса.- -■.-'-•''■■■'; *

" ' * Для того чтобы преодолеть этот блок, используется ряд различных методов. В некоторых 'случаях- исполыуют' промежуточных: реципиентов^ таких как* кролик, помешают эмбрион в яйцеводы н извлекают его уже на более поздних стадиях развития,. т.е. после прохождения клеточного блока.

В настоящее время для преодоления блока используется ряд соматических клеток,

в частности клетки ку мул юса, эпителиальные клетки яйцевода, гранулезные клетки. Ш этих клеток получают- монослой, который используется > для- культивирования предимплантационных эмбрнонов.'

Мы же поставили перед собой'задачу изучить влияние монослов соматических-клеток на преодоление. клеточного блокад Ооциты культивировали в среде МРМ с добавлением 20% астральной сыворотки, оплодотворение проводили.в среза FERT-TALP, а- дальнейшее кулътие1|рование оплодотворенных ■ ооцитов ' проводили в : среде Паркера. Полученные эмбрионы 6-8 бласгомеров переносили на монослой : соматических клеток. Первая группа не содержала соматических клеток и служила'контролем, вторая группа ооцитов со культивировалась на монослое клеток куму л юса, третья на монослое. эпителиальных клеток яйцевода и четвертая на монослое клеток гранулезы (табл.3).

■ ' ' Таблица 8.; '

Влияние монослоя соматических клеток на развитие оплодотворенных ооцитов.

Показатель.. -. Группа (монослой)

Контроль Клетки ку мул юса i _ Эпителиальные «летки яйцевода Клетки гранулезы.

Число ооцитов, п 55 22 ".43-

Ооциты 8-16 клеточной стадии, п (%) 12 (21,8) -, ,, 10(25,6) 6 <27,2), . . >5(34,8)

Ооциты остановившиеся в развитии, л (%) 43(78,1) 29 (74,3) " 16 (72,7 ) ' ' 28(65,1)

Процент ооцитов прошедших блок . 21,8. с -, . .. 25,6 , .. 27,2 ,, v 34,8

1 Исследования; показали, 1 что г успешное преодоление 8-16 > клеточного эмбрионального ''блока'* достигается при со культивировании на монослое гранулезных клеток (34,8%), что на' ] 3% выше контроля. При «»культивировании на монослоях кумулюсных' клеток н эпителиальных клеток яйцевода, различия были незначительным»« (25,6-27,2%).: ■ ■ . ••• ' •

с ^ Рои. моносло* в культу рал ьных системах и« совсем ясна, однако, после совместного культивирования оплодотворенных ооцитов с моносдоями соматических клеток повышается степень дробления и развития ранних эмбрионов.*

. Так же, при » введении в среду созревания ■ клеток. гранулезы наблюдалось повышение числа созревших ооцитов на 13,1% (80% против 66,7%) по сравнению с контролем. Кроме того, 20,8% ооцитов опытной группы оплодотворились, в то время в контроле оплодотворенные ооцнты отсутствовали (табл. 9). . .

Таблица 9,

Влияние клеток гранулезы на созревание и ошюдотворяемость -ооцитов 1п МП).

Показатель. Среда созревания - .

тем-199 + гормоны (контроль)< ТСМ-199 + клетки гранулезы

Про кул ьти вировано ооцитов,-пг :■ "... 1 . - ' 30 ' - :

Достигли мегафазы 2, _ п(%) 12(66,7) 4 ; 24(80,0) "

Оплодотворились, • 0 5(20,8)

Число дробившихся. 0 0

...»■- ■ . . . . .......

* Клетки гранулезы, ввезенные-в-.'среду. созревания , в количестве 500 тыс/мл,

повышают уровень созревания ооцитов и их ошюдотворяемость. ' ■■ -

, Период • блокирования ' развитая эмбрионов совпадает по времени : с их потребностью в новых элементах питания. Петому усилия исследователей направлены на поиск различных природных и синтетических ростовых факторов в качестве добавог в культур ал ьные среды Удачной альтернативой этому является использование не только-клеточных сокультур, но - н их кондиционных сред, - поскольку" установлено, что на развитие эмбрионов влияет не фактор контакта С клетками, а трофический фактор, то есть секреция целого спектра пнтаггедьных веществ.] . . г.

Позднякова Т.Э (1994) установила, .что.1 культивирование . в[ среде, кондиционированной клетками гранулезы, обеспечивает более оптимальные условия для созревания, что подтверждается не только высоким выходом ооцитов 72,7%, но и низким ■

процентом (6% против )6,4%) яйцеклеток с дегенерацией хромосом. ••

Также установлено, что кондкиионировашье оошгт-кумулюсными клетками среды' обеспечивают-"нормальное развэтис зародышей!'« случае, млн для' культивировання используется аутогенна* среда, то есть когда оплодотворенные оониты' помещают в среду.

в которой они созревали (табл. 10).

■ ■ v ■ ткбдица^О.

Влияние кондиционной среды на оллодотворяемость'сюцитов и'нх дальнейшее развитйе-Т J ' ' ' ;' ' - ':":-4 '-1-"-*

.. * -. -! Ч ■ * 1 И '' 1 1 Среда культивирования ; '' " ''

Показатель М РМ+5%эстрал ьиой Кондиционная; Конаицкниая

сыворотки аутогенная. гетерогенная

--< г > ; , t! .'..Ч . (контроль)" . 1..'Г .е..» ,, —1. \ . -

Числоооцитоп, л, ,г :,<(П6Г.>; .123.- ■ „ ; .

Созревших,я(%) . 80(65,0) •• ^35(68,8) i-

Оплодотворилось, п (%) 54(69Л) 52(65,0) -г ,J у. .... v55(57,9) ;

В т.ч. дробящихся,чП(%) ; . —:. :■ .ч -i ., 10(19,2) -8(14,5);

Ранних моруд, п (%) • , гг., 6 (75,0) ;f, »

Бластоцист, п (%) - . х' - —" г л _ ' ' 2(20,0)^ ... -Г™/ ч -

-. Несмотря на высокую степень,-'отытдотворяемости! вs контрольной 'группе;' дробление зародышей наблюдалось лишь в кондиционных средах (19.2%.и.14,5%), причем стадии раннейморулы достигала''большинство зародышей (80,0и75,С%) от числа -дробящихся.1 - < - НА.-- -Л Ч -1. г->и .■ '!*■;. J М .г-■.-■«-•/Л Л '

Но в гетерогенной кондиционной среде оплодеггворенные зародыши развивались только До стадии ранней морупы/далыое развтт№Гфе^1тиЛось,'''i'в кутогенной^среде зародыши развились до бластоцнсгы " J''' -л-''4 ; '

Г. ¿'.W, 'Л'Лг л> -.■>:; it

Л ..:.f. , 4. ВЫВОДЫ: I. При культивировании оошгтов in vitro необходимо учитывать сезон года, так как он оказывает существенное влияние «а выход созревших оощгговл , V?, (

: 4 2.'-Созревание и оплодотворение »'присутствии эстральной сыворотки,- полученной от коров в раннем эструсе эффективнее, чем применение фетальной сыворотки.

. 3. При снижении концентрации: эсгральной сыворотки ¡до 5% с добавлением

31

20мкл/мд ФСГ можно получить да 59,7% созревших ооцнтои и 58,1% оплодотеореиных ооцитовтукго _ ^ ^ ..,,,. .1Р ■ . -- . ■ .. ..

4. Среду ТСМ-199 н МММ более универсальны, н их можно, испольэоаагть. при капшнгацииспермнеа. 1-, ■ ■ ■■■■ . ■ ; - •

5/ При яап&интацнн спермнев ■ с гепарином достигаете* вькокал . степень оплодотворяемостн, оптимальная доза гепарина составляет от 10 до 50мг/мл, а время капаттцнн от 10 до 25 минут. , ... , .... г .

6. Однослойные клеточные культуры клеток репродуктивного тракта позволяют преодолеть эмбриональный •блоц' предымпдаитацнонных эмбрионов на стадии 8-16 .

| 5. ПРАКТИЧЕСЮ1Е ПРЕДЛОЖЕНИЯ. I. Для созревания и оплодотворения ооцитов крупного» роггггого скота, предлагается использовать минимальную концентрацию астральной сывороткн'до 5% с добавлением 20мкд/мя ФСГ; что позволит пояучкгь до 59,7% созревших оонитов и 58,1% оплодотворившихооштгов.' -'^'я.-ч '' ■ • '

• 2.* Дйя ■ капацитаиии.' спермы быков, предлагается - оггтмальная; доза 50мкг/мл' гепарина, при котором процент дробления составляет 42,5%. ' ' -*'' '

3. Для успешного предолення 8*16 клеточного эмбрионального блока предложено со кул ьти вирова ни е на монослое гранулезных клеток, при котором стадии метафазы 2' достигав 80% ооцитов, а оплодотворилось до 20,8%,. 1 ■ • I--- '

. , 6. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОШ ОПУБЛИКОВАНЫ В СТАТЬЯХ. 1, А-Ахмоядаева, КПсрфирьев, КСергеев. /Трансплантация эмбрионов н генетический , прогресс,//Племенноедйгю.2000г,№1. . , ....

..ИЛсрфирьев, А-Ахмапдаева, Н£«ргеев. / Влияние биологически активных веществ на > созревание и оплодотворение ш уйго ооцитов крупного рогатого скота. Я Молочное и мясное скотоводство. 2000г. »1, .4) I

/л "Л.1

¿^.¡гял&г. ■ ¿с, к. /¿л