Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние пролактина на фолликулогенез и мейоз ооцитов коров

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние пролактина на фолликулогенез и мейоз ооцитов коров"

од

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И РАЗВЕДЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВА Ирина Юрьевна

УДК 636.2:591.391.2

ВЛИЯНИЕ II РОЛ АКТ И НА НА ФОЛЛИКУЛОГЕНЕЗ И МЕЙ03 ООЦИТОВ КОРОВ

Специальность 03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ-ПУШКИН 1995

Работа выполнена в лаборатории культивирования эмбрионов Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животых, Санкт-Петербург.

Научные руководители — доктор биологических наук Т. И. Кузьмина; кандидат биологических наук Т. А. Гойло.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, академик РБА, профессор А. Ф. Яковлев; доктор медицинских наук, профессор А. И. Никитин.

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургская Государственная Академия ветеринарной медицины.

Защита состоится 1995 г. в /3 час. на

заседании Специализированного совета Д 020.07.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения сельскохозяйственных животных по адресу: 189620, Санкт-Петербург—Пушкин,

Московское шоссе, 55а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан «

2/) » феЬ^имЛ' 1995 г.

Ученый секретарь специализированного сонета доктор сельскохозяйственных наук,

профессор ' Ж. Г. Логинов

ОШЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Современные метода: биотехнологии,позволяющие получать эмбрионы крупного рогатого осота для трансичан-тацик.а также для целей клеточной и генетической инженерия,были разработаны благодаря научным достижениям в области исследования механизмов регуляции фолликулогенеза и жйоза оогатов у' млекопитающих. Однако значительная вариабельность результатов экспериментов по оплодотворению яйцеклеток, созревших in vitro, обусловливает необходимость более углубленного изучения этих . процэссов, в том числе на молекулярно-клзточном уровне.

В результате многочисленных исследований было показано,что пролахтин (ПРЛ) наряду с фолликулооздулируюшим и лютеинизир/-ющим гормонами выполняет у млекопитающих гонадотропнуга функцию,участвуя в регуляция фоллпкуло- и оогенеза (Никитин, Воро-бьева,1988; Воробьева,1990). Механизм действия ПРЛ на половые я соматические клетки фолликулов сложен и до сих пор мало понятен. Особый интерес представляет влияние этого гормона на мейоз п фалликулогенез у коров .поскольку одной из причин пони-■ жения фертальносги во время лактации у некоторых групп млекопитающих может олужйть повышение секреции ПРЛ в этот йериод (Карш и др.,1987). Учитывая тот фект.что фолликулогенеэ у жвачных имеет существенные отличия от такового у большинства изученных млекопитающих (Driancourt, 1991)( гонадотропная функция ПРЛ у коров является предметом научного исследования.

Цель и задачи исследований. Цель настоящего исследования -изучить роль ПРЛ в фолликулогенезе в завершении мейоза ооцп-тов у коров. Для достижения поставленной дали требовалось решить следующие задачи:

- изучить связывание ПРЛ с клетками гранулезы в динамике фолликулоге.не за}

- определить концентрацию ПРЛ в жидкости нормальных и атре-тических авральных-фолликулов различного диаметра;

- охарактеризовать митогенный эффект ПРЛ в культурах клеток гранулезы из разных по размеру фолликулов;

- изучить, эф|ект ПРЛ на содержание мембраносвязанного кальция в овариалышх клетках;.

- исследовать влияние ПРЛ на мейоз,ооцитов, их оплодотворение и развитие эмбрионов 111 Vitro. , ■■"■..

Научная новизна. Показано наличие специфического связывания

j

бычьего ПРЛ (6ПРЛ) о клетками гранулезы коров и определены значения констант диссоциации ПРЛ-рецепторнкх комплексов и концентрации рецепторов на клетках гранулезы о различной степенью дкффзренцировки. Обнаружено снижение содержания ПРЛ в жидкости атретических антральных фолликулов диаметром 10-20мм по сравнению с нормальными фолликулами того же диаметра.'Выявлен стимулирующий эфйзкт £ПРЛ на пролиферативную активность клеток гранулезы,зависящий от уровня дисМеренцировки клеток. Определены оптимальные концентрации гормона,при которых он благоприятно влияет на созревание ооцитов. Показано снижение содержания мамбраносвязанного'кальция в половых и соматичеа-ких фолликулярных клетках коров при воздействии 6ПРЛ.

Практическая значимость. Полученный вксперимзнтальные дан' ные могут быть использованы для дальнейших исследований маха- . низмов регуляции фолликулогенеза и мейоза ооцитов коров, что будет способствовать совершенствованию биотехнологии вне фолликулярного дозревания оойитов и их оплодотворения вне организма.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на отчетных аесоиях аспирантов (ШИИГЕЕ, 19931994), йа.1-й Международной научной конференции молодых ученых и специалистов (Киев,1994),на Международном симпозиуме "Молекулярная генетика и биотехнология в опенке и изменении, геномов сельскохозяйственных животных" (Санкт-Петербург,1994),на 1-м оъезда ВОГиС .(Саратов, 1994). ■•

Публикации..По теме исследований опубликовало 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и. методов исследований! результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и. предложений, списка использованной литарагуры, включавдего 194 источника, в т.ч. 151 иностранный. Работа изложена на {ЗЪ страницах машинописного текста и содержит 16 таблиц,5 рисунков, Щ микрофотографий. ' ■■...' ,

МАТЕРИАЛ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ •. .

Материалом дая исследований олужили фолликулярные ткани,кла- _ тки гранулезы (КГ) .фолликулярная жидкооть (в) и ооцит-кумулюс-• "йые,. комплексы (ШК) из антральных фолликулов коров и половозрелых телок .убитцх на Сашст-Летербургском ^мясокомбинате. Для еко-

периментов отбирали яичники без видимых признакоз патологии,на стадии фолликулярного роота или с развитым желтым телом. Яичники доставляли в лабораторию при температуре-37,5 С в течение 1,5-2 ч после' овариоэктомии.

Качество фолликулов оценивали визуально по морфологической характеристике и проценту КГ с пикнотическими ядрами. ,

Фолликулы, имеющие высокий тургор, прозрачную оболочку и обширную васкуляризацию, относили к нормальным. Фолликулы,не отвечающие этим требованиям, оценивали как атретические.

<М получали путем, аспирации фолликулов с последующим центрифугированием при 250 g 10 шк. Супернатант отсасывали .добавляли мертиолат до концентрации 100 мкг/мл, замораживали и хра-т нили при температуре -70°С для определения концентрации ПРЛ твердофазным радйоимэдунологическим методом (Маринченко и др., IS62). КГ пипетировали с минимальным количеством 0,9^-ного раствора цитрата натрия и фиксировали смесьи метанол-уксусная кислота (3:1). Препараты окрашивали по методу Гймза и подсчитывали число КГ с пиннотйчаскими ядрами.

Нидкость, аспирировакную из фолликулов, группировали в соответствии с их диаметром: 1-2, 3-5 и 6-Ю ш.

ОКК выделяли путем аспирации Ф2 из фолликулов диаметром 2-6 мм и промывали в среде ГС-199, содержащей 10% фатальной бычьей сыворотки (ФБС) и 50 мкг/мл гентомиципа. Для культивирования отбирали ооциты округлой форт, с гомогенной цитоплазмой, равномерной по ширине зоной пеллюцида, окруженные многослойна комтттнам ку^лйсом.

СКК культивировали в чайках Петри в каплях среды,покрытых, вазелиновым маслом,при температуре 33,в атмосфере с COg и 90$-ной влажностью. Использовали модифицированную среду Паркера на основе TC-I99 с геятомицином (50 мкг/мл). В соответствии с целями эксперимента применяли еледующие варианты систем культивирования: I -10$ ФШ, И-10% <ЗБС,- 15 щг/мл ФЗГ'и 500 нг/мл эстрадиола-I^fl, Ш-б мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БОА), 15 мкг/мл. ЗСГ и 500 нг/мл эстрадиола-1^3,1У - 20$ ' эстральной сыворотки. В опытные группы вносили различные дозы (12,5-100 нг/т)гшофизар1ного: 6ПРЛ (20,0-МЕ/мгУ. Концентрация . КГ (из фолликулов диаметром 2-6 мм) в системах культивирования составляла I06 клетскДя. . . . . ; • . ■

Ткани-морфологически нормальных фолликул.ов отделяли отиро-

íju яичника,цромывали в среде TC-I99 с гентомицином (50 мкг/ки) и культивировали в пенициллиновых флаконах о 5 m средй TC-I99, 10% ФЕС и гентомицином при температуре 38,5°С в течение 24 ч. В экспериментах использовали 6ДРЛ в концентрации 50 нг/мп.

Для определения содержания мембраиоовяванного в овари-алькых клетках использовали флуоресцентный зонд - хлортетрацик-лин. Ткань фолликула помещали в чашку Петри о физиологическим раствором, содержащим 40 мкМ хлортетрациклика.и инкубировали 5 шн при 37°С. Интенсивность флуоресценции измеряли в 3-5 различных участках ткани на люминесцентном микроскопе ЛШАМ-И-1. Из средней величины вычитали значение фонового излучения. Содержа- ' ние мег^фаноовязанного СА2+ выражали в условных единицах интенсивности флуоресценции фолликулярных'клеток.

Оовдты,.морфологически оцененные как нормальные .механически очищали от ку?даюсных клеток, помещали в кварцевые ячейки с физиологическим раствором,содержащим 40 мкМ хлортетрадаклина, и измеряли интенсивность флуоресценции.

Культуру КГ получали в соответствии с методикой, используемой в лаборатории культивирования эмбрионов ВНИИГР1 (Кузьмина и др.,1991), Интенсивность синтеза ДНК. в(КГ определяли по включению "^Н-тимидина в ДНК клеток. Для этого по (5-Ю)хЮ4 клеток культуры высевали в лунки 96-луночных панелей в 0,2 мл среды TC-I99,•содержащей ФБС. Панели с клетками помещали в ^-инкубатор (37°С, СО^, 100^ влажности). Через 2 сут культивиро- ; вания КГ среду в лунках заменяли на среды, содержащие бПРЛ в различной концентрации (5 нг/мл-50 мкг/мл). В экспериментах использовали среду TC-I99 без добавок либо ту же среду.содержащую или Ъ% ФБО, или 100 нг/мл инсулина, или 10 нг/ил реком-бинантного бычьего соматотропного гормона (6СТГ). Одновременно с бПРЛ в лунки вносили %-ммидин (37 кЕк/ш), КГ инкубировали 24 ч и определяли включение в них изотопа (Адаме,IS83)« Данные выражали в процентах от включения %-тимидина в клетки, инкубируемые в среде TC-I9Ô, содержащей Ь% ФБС,

Для ради ope цепторного анализа КГ выделяли иа фолликулов диаметром 1-2, 3-5 и 6-10 мм. Клетки дважды отмывали ресуспенди-рованием в 10 Ш трио-НСЙ-буфере,содержащем 0,1%~т& BOA,5 ьМ Mgce2 и 0,02%-т& мартиолат, рН 7,1, Концзнграцлю КГ подсчитывали в.камере Горяева, клетки замораживали и хранили .при температуре -20°С. .

Изучение■связывания бПРЛ с КГ коров проводили радиopeцептор-ным методом по образованию комплекса 1251-бПРЛ-рецептор. Радиоиодирование бПРЛ проводили модифицированным хлораминовым методом (Bolton, 1985). Концентрацию белка в суспензии КГ определяли по методу Лоури (Lowry et ai. ,1951). Реакционная смесь содержала 100 мкл клеточной оуспензии ((1-2)хЮ6 клеток),50 мкл> вышеописанного буфэра и.50 мкл 1251-бПРЛ (550000-650000 имп/ ши, удельная активность 0,5-1,0 МВк/мкг- бПРЛ). Неспецнфичес-кое связывание меченого гормона определяли в присутствии избытка нативного бПРЛ (125 жг/ж). Реакционную смесь инкубировали 42 ч при температуре 37°С в суховоздушом' термостате. Реакцию останавливали добавлением I мл охлажденного (4°С) буфераt Разделение свободаого и связанного с клетками гормонов осуществляли центрифугированием проб при 2000 g 30 мин, 4°С. После удаления супернаганта осадок дважды промывали I мл холодного буфера. Измерение радиоактивности проб и первичную обработку данных проводили на автоматическом гамма-счетчике. Специфическое связывание определяли по разнице между общим и неспецифическим связыванием. Кривые замещения получали при инкубации •^Ь-бПРЛ с клеточной суспензией в присутствии возрастающих концентраций нативного бПРЛ. Полученные данные обрабатывали на ПЭВМ по программе "Дельта" (ИФХБ им.А.Н.Белозерского)'.

Для изучения конкурентного связывания бПРЛ и 6СТГ с КГ коров смесь суспензии клеток и *251-бПРЛ инкубировали о возрастающими количествами 6СТГ и, параллельно, с возрастающими количествами бПРЛ в тех же концентрациях.

Капацитацига сперматозоидов и ошюдотворейие ооцитов Проводили в соответствии с методом Parrish et al.(1906).

Контроль за ядерным созреванием ооцитов и оценку эмбрионов осуществляли о помощью цзтогенетичеокого метода (Tarkowslci, 1966).Для морфологической оценки фолликулов, (КК и эмбрионов использовали микроскоп МБС-9 при увеличении. 2x14. Исследования хромосом в ооцитах и эмбрионах, и подсчет числа КГ о пикно-тическими ядрами проводили под микроскопом "Olympua" при увеличении 900х.

Для статистической обработки полученных данных использовали критерий Стьюдекта и метод "хи-квадрат".

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Лактогенные рецзпторы на клетках гранулезы из антральшдс фолликулов коров. Одним из критериев функциональной .активности гормона служит характерно тика его рецепторов на клетках-мишенях. У крыс, свиней и человека было показано,что ПРЛ действует на фолликул через специфические рецепторы, находящиеся на плазматической мембране КГ (Rolland, Hanmond, 1975; Wang et al., 19T9 ; Ben-David, Schenker, 19S2). В наших Исследованиях изу-. чено взаимодействие бПРЛ с рецепторами на КГ коров из антраль-ных фолликулов различного диаметра.

Нами бьшо показано наличие.специфического связывания *251-бПРЛ с КГ коров из фолликулов диаметром 1-10 мм. (от 8,2 до 36,1$) ,что свидетельствует о присутствии рецепторов к ПРЛ ■ на КГ этого вида. При изучении влияния степени дифференцировки . КГ на параметры взаимодействия бПРЛ со своими рецепторами использовали клетки из фолликулов диаметром 1-2, 3-5, и 6-10 мм. Конкурентлое связывание меченого и нативного бПРЛ с клетками во всех случаях на графике Скэтчарда описывалось прямой лини-, ей "(рис.1) .что указывает на существование одного типа ПРЛ-овя-зыващих участков на КГ коров. Константа,дисооциаций ПРЛ-рецэ-пторных комплексов и концентрация лак тоге иных рецепторов на. клетках (тайд.1) не зависели от стадии созревания фолликулов. Отсутствие достоверных различий в параметрах связывания ■ 1251-бЛРЛ с'КГ коров на.разных стадиях дафференцирокки свиде-тельдгвует о том, что по мере роота антрального фолликула эти клетки'не меняют свою чувствительность к ПРЛ. В продассе фолликулярного оозревакия количество КГ увеличивается, что должно приводить к усилению влияния этого гормона на антральный, фолликул. .

КГ коров содержат большое количество ПРЛ-связывавдих участков -(6,46-6,78 )хЮ6 на I клетку (табл.,1). При этом константа ' диссоциации составляет (4,07—4М, что говорит о низком сродстве рецепторов к ПРЛ. Низкая цффиннооть лак тоге шшх рецепторов предполагает необходимость длительного воздействия ПРЛ для реализации его биологического эффекта. 'Влияние ПРЛ на фолликул может быть весьма существенным даже при низкой кокнрн-"традии гормона благодаря наличию большого количества лактоген-ных рецепторов на КГ коров.

■ Рис.1 Специфическое связывание бПРЛ с лактогенными рецепторами на КГ коров из антральных фолликулов различного диаметра: . 1-2(а), 3-5(б) и 6-10 мм (з). По оси абсцисс - количество связанного с клеткам! меченого и немеченого гормонов (В) ,по оси ординат-отношение связанного гормона к свободному (В/р).

- • • тос ' ''

Таблица i. Цараметры взаимодействия I-бПРЛ с рецепторами на КГ коров в зависимости от диаметра онтралькых фолликулов

Диаметр Число Константа Концентрация рецепторов,

фоллику- экспери- диссоциации число связывающих участ-лов, мм ' ментов Кд, M ков на I клетку '

1-2 3 (4,58+0,79)хЮ-7 • (6,78+0,96)хЮ^ ' '

3-5 4 (4,87+0.67)хЮ~; ' (6,46Т0,36)Х10° "

6-10 4 (i,J?±0,26)xI0~F (6,64T0,90)xI0

Первичная структура. ПРЛ гомологична первичной структуре СТГ на ~ 30$. В литературе имеются данные о наличии перекрестного связывания этих гормонов о рецепторами на клетках-мишенях (Wang et al., 1979; c&daan, Wallis,1901). В наших экспериментах проведен сравнительный анализ конкурентного связывания бПРЛ и бСЧТ при взаимодействии с лактогенными рецепторами на КГ коров из фолликулов диаметром 3-5 мм. Этот анализ показал,что при одних и тех же концентрациях бПРЛ и 6СТГ равнозначно конкурируя! о 1251-бПРЛ за-связывание о КГ (табл.2). Это свидетельствует об одинаковой способности этих гормонов взаимодействовать с лакгогеннгши рецепторами.

Наличие на КГ коров одного типа лактогенных рецепторов.которые связывают и бПРЛ, и 6СТГ, предполагает возможность дей-

Таблица 2. Конкурентное связывание. 1251-бПРЛ, 6ПРЛ и 6СТГ . с КГ коров из фолликулов диаметром 3-5 мм

Концентрация Число Специфическое связывание 125]_бПРЛ

добавленного окопе- _с КГ, % от контроля__

гошона (6ПРЛ римен- в присутствии в присутствии

или 6СТГ) , нМ тов_' 6ГЕРЛ_ бСТГ.

О • 3 100* -100*

• 217 3 72,8+3,4 78,5+6,3

1087 3 33,9+2,8 35,6+2,9 '

2174 .3 18,2+1,9 15,8+2,9

3630 3 5,4+2,2 5,6+1,0

X 125

В качество контроля взяты значения связывания 1-бПРЛ с КГ в отсутствие немеченых гормонов. ,

ствия обоих гормонов на клетки через одни и те же участки связывания. ' • •

Содержание пралактина в жидкости антралъных фолликулов различного диаметра. Реализация эффекта гормона на фолликулярные клетки зависит не только от наличия специфических рецепторов на клетках-мишекях, но и от его концентрации в <Ш. Нами изучено содержание ПРЛ в жидкости антральных фолликулов разного диаметра из яичников коров на стадиях фолликулярного роста и желтого тела (табл. 3, 4).

Таблица 3. Содержание ПРЛ в жидкости антральных фолликулов коров в яичниках на стадии фолликулярного роста

Диаметр фэлли- Число исследован- Концентрашя ПРЛ кулов, мм .■ ■ них яичников_в Ф£,.нг/мл

Г- 2 7 3,7+1,1

3- 5 • 26 5,4 + 0.6

6-10 25 6,6 + 0,6х

_11-20;_ 76 7,6 + 0, б3*

Примечание. Уровень вероятности достоверности разности средних арифметических: Х-Р<0,05; зсс~Р <0,01; -^-Р« 0,001, ■ В таблицах 5-7, II - обозначения те же .

Таблица, 4. Содержание ПРЛ в жидкости антральных фолликулов • _коров в яичниках на стадии желтого тела _

Диаметр фолли- Число исследован- Концентрация ПРЛ

кулов, мм_них яичников _в Фа, нг/т

3- 5 25 7,0 + 0,7

" 6-10 17 6,8 +0,6

11-20 18 6,0 + 0,4

В яичниках на стадии фолликулярного роста концентрация ПРЛ в ФЯ достоверно возрастала с увеличением диаметра фолликулов от 3-5 до 11-20 мм (от 5,4+0,6 до 7,6+0,5 нг/мл, Р< 0,01). Разнида между уровнем ПРЛ в жидкости фолликулов диаметром 1-2 и 11-20 мм бьиа более значительной (в 2 раза). Напротив, концентрация гормона в жидкости фолликулов из яичников на стадии желтого тела при увеличении их диаметра достоверно не изменялась.

Итак, динамика содержания ПРЛ в жидкости растущих антраль-шос фолликулов коров, в лютеальцую и фолликулярную фазы различна .

Концентрация пролактина в яидкооти антралъных фолликулов • диаметром 10-20 мм с различными признаками атрезии. В яичниках млекопитающих наблюдается гетерогенность популяции антральных фолликулов по ряду морфологических и биохимических признаков (Driancourt,1991). Согласно одной из гипотез, в основе фолликулярной гетерогенности лежат различия в микроваскуляризации фолликулов, что приводит к различному снабжению последних гормонами и другими субстратами ( Moor, seamark, 1986).

В нашей работе исследована зависимость между наличием признаков атрезии в антральных фолликулах коров диаметром 10-20 мм и концентрацией ПРЛ в <Ж. Обнаружено достоверное различие в содержании ПРЛ между жидкостью морфологически нормальных и атре-тических фолликулов -(табл.5). В не а еретических фолликулах концентрация гормона составляла 9,5+0,9 нг/мя, что.бьио в 1,7 раза выше,чем в фолликулах о признаками атрезии (Р< 0,001).

Аналогичная зависимость между содержанием ПРЛ в жидкости . нормальных и атретических фолликулов наблюдалась при использовании в качеотве признака атрезии процента КГ о пикнотичес-* ними ядрами (табл.6). Не обнаружено достоверного различия в концентрации гормона между жидкостью' фолликулов, содержащих менее 20$ и 21-40$.КГ с пикнотическими ядрами. При увеличении количества пикнотических клеток свыше 40$ уровень ПРЛ в ФЖ снижался в 1,5 раза (?< 0,05).

В таблице 7 представлены, данные по содержанию ПРЛ в жидкости фолликулов, оцененных сушарно: по морфологической характеристике и по числу КГ с пикнотическими ядрами. Во всех фолликулах о признаками-атрезии уровень ПРЛ в ФЕ был достоверно ниже, чем в фолликулах без признаков, последней; Концентрация гор-

Таблида 5. Содержание ПРЛ в жидкости нормальных и атретичес-ких антральных фолликулов коров диаметром'10-20 мм

Морфологическая харак- Число исследован- Концентрация ПРЛ теристика фолликула ных фолликулов в Ф2, нг/мл

Нормальный ' 35 9,5 + 0,9 •

Атретаческий . 24 5,6 + ОД***

Таблица 6. Содержание ПРЛ в жидкости антральных фолликулов коров с различным уровнем пикнотических клеток гранулезы (диаметр фолликулов 10-20 мм)

Количество КГ с пикно- Число исследован- Концентрация ПРЛ . тическими ядрами, % ных фолликулов в нг/мл,

Меньше 20 22 '8,6 + 1,1

21-40 16 9,2 + 1,0

Больше 40 21 . 6,2 + 0,8х

Таблица 7. Содеркание ПРЛ в жидкости антральных фолликулов' коров о различными признаками атрезии (диаметр фолликулов 10-20 мм)

Количество КГ Морфологическая Число ис- Концентрация с пикнотически- характеристика следованных ПРЛ в Фж, ми-ядрами, %■ фолликула фолликулов нг/мя

.Меньше 40 нормальный 24 -10,6+1,0

Меньше 40 . атретический 14 б.Э+О.б***

Больше 40 нормальный II ' 7,2+1,3х

Еольшб-40, атретический ' 10 5,2+0 ,'7ХХХ

мона была наиданыпей в жидкости фолликулов, оцененных как ат-ретические по обоим используемым критериям (5,2^0,7 нг/мл), в то время как в нормальных о низким уровнем пикнотических КГ она была максимальной и составляла 10,6+1,0 нг/мл (Р<0,001).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том,что снижению уровня. ПРЛ в Ф2 сопутствует нараотание атре-' тических процессов в антральных фолликулах коров диаметром 10-20 мм. ■ .

Митогеккый эффект пролактана в культура клеток грануле вы. "Известно,что ПРЛ оказывает ростостимулирующий эффект яа клетки молочной железы, печени и ряда других тканей у некоторых

Рис.2 Влияние бПРЛ на интенсивность включения %-тимидина в КГ коров из фолликулов диаметром 3-5 мм. По оси абсцисс-концентрация бПРЛ, нг/мл; по оси ординат -включение %-тимядина, % от включения в контроле (в среде ТС- ■ 199,содержащей Ь% 5БС). 1-4-при культивировании клеток в различных средах: I-в среде TG-I99; 2-в среде ТС-19Э + 5$ <5БС; 3-в среде TC-I99 + инсулин (100 нг/мл); 4-в среде TC-I99 + +6СТГ (10 нг/мл). Вертикальные отрезки - стандартные ошибки средних арифметических значений (п»Э-5) '

видов млекопитающих (Wallis, 1988). Нами изучено влияние бПРЛ на синтез ДНК в КГ коров из антральных фолликулов различного ' диаме ара.... '

При проведении исследований оказалось,что бПРЛ стимулирует включение %-тимидина в'ДЖ КГ из фолликулов диаметром 3-5 мм (рис.2). Митогенный эффект гормона в различных средах был выражен в разной степени, но во всех случаях носил дозозависи-шй характер.'

В среде, лишенкой сыворотки, но содержащей 5 нг/мл бПРЛ, оинтез ДЖ в клетках происходил о такой яе интенсивностью,как в среде .содержащей5% ФЕС, в отсутствие бПРЛ. При увеличении концентрации гормона до -5 шг/мд. его митогенное 'влияние снижалось в 1,6 раза (Р< 0,01). " •

100

60 500 5ООО 50000

50000

Рис.3 Влияние бПРЛ на интенсивность включения "^Н-тимидина

в КГ Коров из фолликулов различного' диаметра, а-в среде ТС-199; б-в среде ТС-199+5$ ФБС. 1-3-клеоки из фолликулов разного диаметра: 1-1-2 мм; 2- 3-5 мм; 3' -6-10 мм. Остальные обозначения те же, что и на рис.2

Клетка, культивируемые в среде, содержащей Ъ% ФЕЮ, были более чувствительны к изменению концентрации СПРЛ. Максимальный мигогенный эффект наблюдали при содержании гормона 50 кг/мл: в

этом случае включение %-тишдина в ДНК было в 3 раза више ,чем в контроле. При концентрации бПРЛ 500 нг/мл его ростостицулиру-ице.е влияние на КГ достоверно снижалось.

Аналогичный характер влияния бПРЛ на синтез ДНК в КГ наблюдали и в среде, содержащей 100 нг/мл инсулина. При этом совместное ыитогенное действие обоих гормонов в целом было аддитивным.

В среде, содержащей 10 нг/мл 6СТГ, изменилась максимально эффективная концентрация бПРЛ, которая оказалась равной 5 мкг/шь а не.50 нг/мл, как в предцвущих средах.

При изучении митогенного эффекта бПРЛ на КГ. из фолликулов различного диаметра оказалось,что его влияние на пролиферацию. КГ с различным уровнем дифференцировки различно.

В бесоывороточной среде бПРЛ оказывал максимальный митоген-ный эффект на КГ из фолликулов диаметром 1-2 мм (рис.З.а). В целом, влияние гормона на синтез ДНК в КГ из фолликулов диаметром 1-2 и 3-5 мм зависело от его концентрации. Интенсивность включения %-тишдина в ДНК КГ из фолликулов диаметром. 6-10 мм с увеличением содержания'бПРЛ не изменялась.

В среде, содержащей 5% ФБС, митогенный эффект бПРЛ на клет- . ки из фолликулов диаметром 1-2 мм был при всех концентрациях достоверно выше ,чем на клетки из фолликулов диаметром 3-5 мм (рис,3,6). В этих условиях чувствительность КГ из малых и средних фолликулов к увеличению содержания бПРЛ в среде возрастала. В концентрации 50 нг/мл. гормон оказывал, максимальный рос-тосводлирующий эффект.'При увеличении содержания бПРЛ в среде, до 500 нг/т включение %-тишдвна в ДНК клеток достоверно снижалось. С другой стороны,, митогенное влияние бПРЛ на КГ из фолликулов диаметром 6-10 мм не завиоело от его концентрации в среде культивирования. ' •

Таким образом, митогенный эффект бПРЛ на КГ коров определяется стадией фолликулярного созревания, а на клетки фолликулов диаметром 1-2 и 3-5 ш его влияние носит дозозавясимый характер.

Влияние пролактина'на мейоз и оплодотворение ооцитов при их культивировании в разных системах. В последние года рядом исследователей показано, что наряду о гонадотронными и стероидными гормонами важную роль в регуляции оогенеза у млекопитающих играет также и ПРЛ (Lindner et al., 1988} Wise, Maurer,

1988). В настоящем исследовании изучали эффект бПРЛ в различных концентрациях (12,5-100 нг/мл) на ядерное созревание ооци-тов коров in vitro (табл.8). В качестве контроля служила среда ТС-Г99, содержащая 10% ФБЗ.

Таблица 8. Влияние бПРЛ в различных концентрациях на ядерное созревание ооцитов коров (врет культивирования - 24 ч)

"Труппа опыта ■

Число тщ ооци- w тов

% ооцитов на стадиях мэйоза: Т +■ M-II

Ж

M-I А

го5" Н°РМ'

% ооци-* TOB с признаками де-генерации

1. Контроль Опыт

(12.5 нг/мл ПРЛ)'

2. Контроль

Опыт (25 кг/мл ПРЛ)

3. Контроль

Опыт (50 нг/мл ПРЛ)

4. Контроль ,

Опыт (Г00 нг/мя ПРЛ)

39 - 30.8 5.1 43 - 18.6 18.6

103 1.0 13.6 102 1.0 8.8

22.3 20.6

-Г 64.1 - . 62.8

2.9 60.2 1.0 68.9

51.3 38.5 58.1 25.6

52.4 19.4 67.6х 7.8'

х

129

23.3 13.2 0.8 62.8 55.8 24.8

104 2.9 4.d"* II.5 2.9 77.9х 73.f* 13.59.7

X

62 3.2 9.7 68 7.4 8.8

4.8 72.6 69.4 22.6 Y хх ххх ххх

26.5х 10.3 47.1 30.9 58.8

Примечание. Контроль: ТС-Ю9+Ю$ ФЕС. Опыт: ТС-199 +10$ ФЮ+ +6ПРЛ в различных концентрациях. ДП-диплотена; Ж г диаки-нез; М-1 -ыстафаза-1; А-анафаза; Т+М-П- телофаза+метафа-за-11. Уровень вероятности достоверности различий между опытом и контролем: Х-Р<0,05; ** - Р<0,01; ^ - Р<0,001. В таблицах 9-10 обозначения те же. •

В среде с 25 нг/мл бПРЛ число срзревших ооцитов без признаков дегенерации хромосом было выше,чем в контроле (67,6 против 52,4$, Р<0,05). При этом доля яйцеклеток с хромосомными анома лиями составила 7,8$ по сравнению с 19,4$ в груше, созревшей без бПРЛ (Р<0.05).

При использовании среды, содержащей 50 нг/мл бПРЛ, через 24 ч культивирования 77,9$ ооцитов находилось на стадиях тело-фазы-метафазы-П (в контроле - 62,8$, Р< 0,05). В этих условиях число оовдтов с дегенерированныш хромосомами было ниже,чем в контроле (Р< 0,05).

Увеличение концентрации бПРЛ до. 100 нг/мл привело к резкое снижению числа созревших ооцитов о 72,6$ в контроле до 47,1$ в опыте (Р<0,01) при одновременном возрастании доли клеток с признаками дегенерации хромосомного материала (58,8 против 22,6$, Р<0,001). ■

Полученные данные свидетельствуют о дозозависимом характере влияния бПРЛ на созревание ооцитов коров in vi-tro. Диапазон концентраций гормона от 25 до 50 нг/мл.является оптимальным для культивирования клеток, т.к. в этих условиях возрастает доля ооцитов без хромосомных нарушений на завершающих стадиях ме-йоза. В концентрации 50 нг/мл бПРЛ сказывает на ооциты два эффекта .которые выражаются в стимуляции ядерного созревания и снижении .выхода яйцеклеток с признаками дегенерации хромосом.

Для изучения суммарного влияния бПРЛ, ФСГ и эстрадиола-17/ на завершение мейоза ооцитов' использовали две куль ту рал ыше системы: I-TC-I99 с 10$ ФБС; II - TC-I99 с БОА (6 мг/ш) (тайл.9). В среду добавляли 15 мкг/мл ФСГ и 500 нг/мл зстрадиода-17р . В экспериментах использовали бПРЛ в концентрации 00 нг/мл.

В. случае использования среды, содержащей ВЗА, 5СГ и эстра-диол, не наблюдали достоверных различий между опытной и контрольной группами в количестве ооцитов, завершивших свое созревание . Однако в среде с бПРЛ число нормально созревших клеток было выше,чем в среде без него (66,2 против 50,0$, Р< 0,05). При этом выход ооцитов о хромосомными дегенерациями был достоверно наяе в опыте (23,9$),по сравнению о контролем (40,2$).

При кокультивировании GKK о КГ введение бПРЛ в среду о БСА. и гормонами привело'к снижению общего числа ооодтов о аномалиями хромосом-о 47,0$ до 31,9$ (Р<0,05). Внесение КГ в культу-ральную систему, включающую бПРЛ в комплексе с ФСГ, эстрадио-лом и БОА, не оказало влияния на выход.клеток о признаками дегенерации хромосомного материала (31,8 и SO соответственно) . . •

Использование среды содержащей 10$ ФБО и комплекс гормонов, изменило характер влияния 6ПРД на ооцяты коров. В срздеобПРЛ продант ооцитов на отадиях телофаэы-мзтафазы-11 был выше, чем в среде без бПРЛ (87,1 против 66,2$, Р<0,01), а различий в количестве клеток с дегенерациями хромосом между опытной и контрольной группами не обнаружено. '

Таким образом, на фоне комплекса гормонов бПРЛ (50 нг/мл)

"."'■" Ц

Таблица 9. .Созревание ооцитов коров в различных

культуральных системах в присутствии 50 нг/мл бЦРЛ (время культивирования - 24 ч)

~ ' ' Чи- % ооцитов на стадиях мейоза: % оовд-

Среда ело . Т + М-И гоизна-

культивирования ДП ДК М-1 А каш

тов ' норм, дегене-

■ 1 рации

- 70,6 50,0 40,2

1.4 78,9 66,2х 23,9х 3,0 59,0 46,0 47,0

1,0 61,Г 50,4 31,9х

- 75,6 61,5 30,8

2.5 73,8 61,3 31,8 5,4 66,2 66,2 • 12,2 1,4 87,^85,7х 7,1

может оказывать на ооциты оба наблюдаемых ранее эффекта,но их реализация зависит от системы культивирования.

В литературе существуют противоречивые мнения относительно действия ПРЛ в.организме на созревание и оплодотворяемость ооцитов млекопитающих (Reinthaller et al., 1967i Lindner et el., 1988). В связи с этим мы исследовали влияние бПРЛ (50 нг/мл). на оплодотворение ооци.тов, .оозревших в условиях его применения (табл.Ю).

При использовании культуральной системы »включающей ФГО.ФСГ и эстрадиол.возрастанию доли ооцитов на завершающих стадиях мейоза в опытной группе (86,4 против 69,3$ в.контроле,Р<0,05) сопутствовало увеличение числа раздробившихся клеток (51,2 по сравнению с 34,j$, P<0,05). Введение бПРЛ в среду не повлияло на качество эмбрионов и их потенции к дальнейшему развитию.

В среде, содержащей 20$ астральной сывородаи,не обнаружены доотоверные различия между опытом.и контролем по регистрируемым параметрам мейоза и раннего эмбриогенеза.

1.ТС-Г99+КА+Э+ ' +ФСГ

ТС-199+БСА+Э+ +ЗСГ+ПРЛ

2 .ТС-199+БСА+Э+ ' ТС-199+БСА+Э+

•дамг+прл

3 .ТС-199+ВЗА+?+ •+4СГ+ПРЛ

ТС-199+ЖА+Э+

4.ТС-199+105&Ж!ч

+<К!Г

TC-I99+I0?5OT3-t +ФСГ+ПРЛ

102 1,0 2,0 26,5

71 - 2,8 16,9

100 - 1,0 37,0

ИЗ 1,8 3,5 32,7

78 • - 2,6 21,8

80 1,3 2,5 20,0

■ 74 - 4.1 24,3

• 70 - 1,4 10,0х

Примечание. Э - эстрадйол-17^'

Таблица 10. Влияние бПРЛ (bu нг/ш) на созревание и оплодотворение ооцигов коров

Варианта опыта

Чи- * °0-сло 3PSB~

10 тов

от числа эмбрио-

дро-бящи-хся клеток

нов

2-8 кл.

и с приз-

пгл 1ИКаш мл да гене-

рации

1. ТС -I99+-I0$®BC +5СГ +Э ТС-199+Ю^ФБС+ФСГ+Э+ПРЛ

2.ТС-199+20^ЭС ТС-199+20£ЭС+ПРЯ

Примечание. Э ЭС

85 69,3

84 86,4х

66 76,9

_ 73 75,0

эстрадиол-17/ ; астральная сыворотка.

34,1 55,2 - 44,8

51,2х 58,1 2,3 39,5

72,7 58,3 8,3 33,3

69,9 54,9 13,7 31,4

В целом, результаты экспериментов свидетельствуют о том,что в концентрации 50 нг/мл бПРЛ не оказывает отрицательного влияния на способность ооцитов к оплодотворению и дальнейшему развитию in vitro. Введение гормона в ореду созревания ооцитов повышает выход дробящихся клеток, однако проявление этого эффекта зависит от компонентов культуральной системы.

Содержание мембраносзязанного кальция в овариальнШс клетках при воздействии пролактина. В настоящее врет хорошо известно, что кальций является универсальным "вторичным посредником"дей-ствия многих гормонов и факторов роота (Авдонин, Ткачук,1994). С целью изучения роли ионов Са2"1" в опосредовании эффектов бПРЛ на овариальные клетки нами исследована динамика содержания мэ-мбраносзязанного Са2"1" в ооцитах и клетках тканей фолликулов диаметром 10-20 ш при воздействии бПРЛ в концентрации 50 нг/мл (Ta6jj.II).

Для культивирования СКК бвди использованы изученные ранее системы (табл.8,9), в которых бПРЛ оказывал на мейоз ооцитов различное действие.

В культуральннх системах, где эффект бПРЛ на мейоз выражался в снижении'доли ооцигов.о признаками дегенерации хромосом (I и Ш), наблюдали достоверное уменьшение содержания мембрана-связанного Са2+ в клеиах. В случае, проявления стимулирующего действия гормона на ядарноа созревание ооцитов при отсутствии его влияния на выход щтогенедачеоки полноценных клеток (Ш не обнаружено снижение уровня мзмсрапосвязаняого Са^в осцитах.

Таблица II. Динамика содержания мембраноовязанкого Са в ооцитах и фолликулярных клетках яичников коров при воздействии 6ПРЛ в концентрации 50 нг/мл

--;-—-<-:---;-

Содержание мембраноовязанкого Са , Система ** уод.ед. ' 1

культивирования дова_ _ ■ . Время экспозиции

кия

О ч

' 2.5 ч 24 Ч -

1,33+0,08' 1,60+0,07

(п~=15) (гГа38)

1,01+0,06хх Г,30+0,07^

(а~=23) (п =35)

1,34+0,05 2,16+0,06

(гГ=27) (п~=37)

1,46+0,07 2,18+0,07 •

(гГа18) и~=2а)

1,51+0,08 2,20+0,07

(хГ=19) (п~=34)

1,27+0,06х 1,98+0,05х*

(¿"=21) (л~=32)

1,00+0,01

. (¿"=11)

о^з+о.ог***

(п~=17)

I. ТС-199+10$ФВЗ ооциты 1,08+0,05

1С-199+Щ?ФВС+ 1,08+0,05

■ +ПРЛ (хГ=39)

П. ТО-199+105ШЗС + ООЦИТЫ 1.33+0.05 +Э+ОТ (п~=32)

' ТС-199+10",ФЗС+ 1,33-Ю,05

+Э+ФСГ+-ПРЛ (¿"=32)

Ш. ТС-199+ЕСА+Э+ ооциты 1,33+0,05

(п=32)

ТС-19Э+БСА+Э+ 1,33+0,05

. +<КЗГ+ПРЛ (п =32)

1У.ТС-199+1О0МО 0,95+0.01

лярные , . -клетки л а.=¿4)

ТС-199+1($ФШ+ 0,95+0,01

^ ■ (в ¿29)

При культивировании тканей фолликулов в среде, содержащей 10$ ФВС, введение 6ПРЛ обусловило достоверное понижение содержания мембраносвязанного Са2+" в клетках.

Таким образом, полученные данные предполагают возможность участия ионов Са' в опосредовании действия 6ПРЛ на половые и соматические овариальные клетки.

вывода

I. Показано наличие одного типа ПРЛ-свяэывамцих участков на клетках гранулезы из антральных фолликулов коров. Константа диссоциации ПРЛ-рецепторних комплексов составляет (4,37--4,87)хЮ-^ М при концентрации рецепторов (6,46-6,78)хЮ6 на I клетку. С ростом фолликулов параметры взаимодействия бГЕРЛ с рецепторами не изменяются,.; что свйдетельствуе т об одинако-, вой чувствительности к ЛРЛ клеток гранулезы с различной степенью дифференцировки. • Обнаружено наличие конкурентного связы-

вания бПРЛ и бСТГ с клетками гранулезы из фолликулов диаметром 3-5 мм.

2. Динамика содержания ПРЛ в жидкости растущих антральных фолликулов яичников коров на стадии фолликулярного роста и желтого тела различна. В яичниках на стадии фолликулярного роста концентрация гормона в фолликулярной жидкости возрастает в 2 раза (с 3,7+1,1 до 7,6+0,5 нг/мл) при увеличении диаметра фолликулов от 1-2 до 11-20 мм,

3. Установлено, что уровень ПРЛ в жидкости нормальных и атретических антральных фолликулов диаметром 10-20 мм раэли-чен(Ю,6+1,0 нг/мл и от 7,2+1,3 до 5,2+0,5 нг/мл, соответственно), что может свидетельствовать об участии гормона в фолликулярной селекции.

4. Показано, что бПРЛ оказывает митогенный эффект на клетки гранулезы из антральных фолликулов коров, который определяется степенью цитодиффэренцировки и для клеток из фолликулов диаметром 1-2 и 3-5 мм имеет дозозависимый характер.Совместное влияние 6ПРЛ и. инсулина, на синтез ДНК в клетках гранулезы является аддитивным, а суммарное ми'тогенное действие 6ПРЛ и 60ТГ указывает на взаимосвязь их аффектов. ,

5. В концентрации 50 нг/вд'бПРЛ снижает содержание 'мембра-носвязанного кальция в соматичеокйх (с 1,00+0,01 до 0,73+ 0,02 уол.ед.) и половых (о 1,60^0,07 до 1,30+0,07 усл.ед.) овариальных клетках коров при их культивировании в среде TC-I99 о 10% ФЕС.

. 6. Эффект/введения бПРЛ в среда дозревания ооцитов in vitro носит дозозависимый:,характер. В концентрации 50 кг/мл бПРЛ оказывает положительное влияние на завершение мейоза,что выражается вошгазшш доли ооцитов о признаками дегенерации хромосом (о 24,8 до 23,5%) или в увеличении количества яйдаклеток,достигших завершающих о'тадий.майоэа (о 69,3'до 86,4^)-,при одновременном возрастании числа дробящихся платок (о 34,1 до 51,2$).

. ПРАКТИЧЕШИВ ПрВДОШИЯ .

I, Для повышения эффективности овднки качества антральных фолликулов'диаметром 10 мм и более рекомендуется попользовать в качеотве дополнительного Критерия концентрацию пролактина в фолликулярной ЖИДКОСТИ ,

3. Материалы диссертации могут быть использованы в учебных

курсах По генетике, физиологии и биотехнологии.

Список работ, опубликованных по теш диссертации

1. Лебедева И.Ю., <6эдосимов В.А., Кузьмина Т.И., Лебедев В.А. Связывание пролактина о клетками гранулезы коров // Вал. ВНИИВД,- 1993,-Вып. 137.-С.26-00, ' •

2. Лебедева И.Ю. Влияние пролактина на мейотическое созревание ооцитов коров in vi-tro // Тез.докл. I Межд. науч.конф. молодых ученых и специалистов,- Киев, 1994,- С.45.

3. Лебедева И.Ю., Кузьмина Т..И., Лебедев В.А. Участие пролактина в регуляции фолликулогенеза у коров // Мат.межд.симпозиума 24-26 мая, Санкт-Петербург - Пушкин.- 1994,- C.32-S3.

4. Кузьмина Т.И., Лебедева Й.Ю., Дениоенко В.Ю. Динамика содержания мембраноовязанного кальция в овариальных клетках коров при воздействий бычьего пролактина // Мат.меад.симпозиума 24-26 мая, Санкт-Петербург - Душкин.- 1994.- C.4I-42.

5. Лебедева И.Ю., Лебедев В.А., Федосимов В.А., Кузьмина Т.Н. Лактогенные рецепторы на клетках гранулезы коров // ■Биохимия.- 1994.-Т.59.-Вып.7.-C.I062-I066.

6. Лебедева И.Ю., Гойло Т.А*, Кузьмина Т.И. Влияние бычьего пролактина на синтез ДНК в культуре клеток гранулезы коров // Вол. ВШШГЕЙ.- 1994.- Вып.140.- СДО-13. '

7. Лебедева Й.Ю. Митогеюшй аффект пролактина на клетки гранулезы коров о различной степенью цитодифференцировки // Генетика.- 1994,- Т.30, Приложение.- С.87.

Подписано к печати I3-.02.95.

Формат 60x84I/l6. П.л.1. Заказ 49. рд. Тирах 100 РТП. Тип.ВИР, г.Павловск . '