Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

РАЗВИТИЕ КЛОНИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И МЫШЕЙ IN VITRO, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ ИХ РЕКОНСТРУИРОВАНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "РАЗВИТИЕ КЛОНИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И МЫШЕЙ IN VITRO, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ ИХ РЕКОНСТРУИРОВАНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ"



на правах рукописи л

КИРИЕНКО КОНСТАНТИН ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗВИТИЕ КЛОНИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И МЫШЕЙ IN VITRO, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ ИХ РЕКОНСТРУИРОВАНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.00.23. - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

п. Дубровицы, Московская обл. 2007 г.

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Научный руководитель: • доктор биологических наук, профессор Владимир Павлович Рябых

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук, профессор,

член-корреспондент РАСХН Наталия Анатольевна Зиновьева

• доктор биологических наук Вугар Алинияз огяы Багирое

Ведущая организация - Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина

Защита диссертации состоится « » ноября 2007 года

в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.006.013.01 во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, Московская область,

Подольский район, л. Дубровицы, ВИЖ. т/факс (4967)65-11-01

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа. Автореферат разослан « / 2. » дктября. 2007 года.

Учёный секретарь диссертационного кандидат биологических наук

В. П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время одним из наиболее перспективных направлении ускоренного размножения высокоценных животных признается клонирование их путем трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки. Особенно интенсивно исследования по клонированию животных стали развиваться после получения овечки Долли (У/ЛтШ I. е! а!., 1997), когда было показано, что в организме взрослых животных имеются недифференцированные клетки, обладающие тотипотентными свойствами, которые могут быть использованы в качестве источников кариопластов для получения клонированных животных генетически идентичных исходным прародителям.

Несмотря на то, что за последние годы в области клонирования животных достигнуты определенные успехи, они пока в большей степени носят эмпирический характер, поэтому положительные результаты сильно варьируют от эксперимента к эксперименту. Основной причиной такой нестабильности результатов является недостаточность фундаментальных знаний о глубинных механизмах, обусловливающих процесс репрограммирования кариопластов цито пластам и, и факторов, влияющих на этот процесс.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что в лучших экспериментах при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток взрослых животных у некоторых видов млекопитающих удается получить определенный процент бластоцист, однако средние показатели получения живого потомства у этих видов варьируют от 1 до 15% от числа пересаженных эмбрионов. Такие низкие показатели получения клонированного потомства большинство исследователей объясняет следствием ненадлежащего репрограммирования кариопласта цитопластом, что приводит ко многим аномалиям эмбрионального развития. По современным представлениям для обеспечения осуществления полного эмбриогенеза и развития до взрослого организма в реконструированных клетках должна быть сохранена правильная плоидносгь хромосом и в процесс репрограммирования в строгой последовательности должна включиться вся система генов ядра соматической клетки.

От момента получения клеток источников цитопластов и клеток- доноров кариопластов до получения живого потомства стоит целый ряд экспериментальных манипуляций и большое количество еще не понятых механизмов, которые влияют на развитие реконструированных эмбрионов. Кроме того, отдельные принципиальные теоретические положения, которые были положены в основу стратегии получения овечки Долли, в последнее время не нашли своего подтверждения в исследованиях других авторов. Особенно это касается вопросов о стадии клеточного цикла ядер клеток, используемых в качестве кариопластов и степени активации цитоплазмы клеток реципиентов (цитопластов). Поэтому, в настоящее время ученые, занятые проблемой клонирования животных, вынуждены вернуться к последовательным и более глубоким исследованиям каждого этапа технологии клонирования. Начиная от исследований влияния полноты энуклеации яйцеклеток при получении цитопластов и кончая исследованиями о влиянии клеточного цикла кариопластов и системы культивирования на дальнейшее развитие реконструированных эмбрионов.

Исходя из вышеизложенного, для повышения эффективности технологии клонирования, основанной на трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки, исследования должны быт!

при осуществлении каждого этапа ленного регулирования.

Целн II задачи исследований.

Целью исследований являлось изучение факторов лимитирующих процесс развития реконструированных яйцеклеток и на основе полученных результатов усовершенствование основных этапов технологии клонирования млекопитающих. Для достижения поставленной цели считали необходимым решить следующие задачи:

определить местоположение метафазной пластинки относительно I полярного тельца в яйцеклетках разных видов млекопитающих и выявить факторы, влияющие на его изменение, в связи с энуклеацией;

определить оптимальные режимы электрослияния кариопласта с цитопластом при реконструировании клеток разных видов млекопитающих; изучить влияние условий активации цитопластов на репрограммирование карио-пластов;

изучить развитие эмбрионов, реконструированных с использованием кариопла-стов, находящихся в разных фазах клеточного цикла;

найти оптимальные системы культивирования реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота и мышей.

Научная новизна исследований.

Впервые показана динамика местоположения метафазной пластинки и I полярного тельца относительно друг друга в ооцитах мышей, овулировавших in vivo, и ооцитах крупного рогатого скота, дозревавших in vitro. Установлено, что в течение первых 3-4 часов после первого мейотического деления не происходит существенной миграции ни метафазной пластинки относительно I полярного тельца, ни Г полярного тельца относительно метафазной пластинки. Выявлено, что причиной интенсивной миграции I полярного тельца в перивителлиновом пространстве относительно метафазной пластинки, наблюдаемой в мышиных ооцитах при энуклеации, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюсаи различными перемещениями ооцита.

Установлено, что цитопласты, полученные путём энуклеации ооцитов крупного рогатого скота, дозревавших in vitro в течение 20-23 часов, способны репрограммировать ядра соматических клеток взрослых животных и обеспечивать развитие реконструированных эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты.

Установлено, что воздействие фактором, ингибирующим фосфорилирование белков -б-ди метилам ино пурином (б-DMAP), на реконструированные клетки крупного рогатого скота и мышей сразу после активации их ионофором-Са** препятствует переходу этих клеток в метафазу Ш, и способствует их дальнейшему развитию до стадии бластоцисты.

Впервые показано, что эмбрионы крупного рогатого скота, реконструированные путём трансплантации ядер клеток кумулюса взрослых животных в эну к леиро ванные ооци-ты, дозревавшие in vitro, развиваются до стадии бластоцисты в простой синтетической среде яйцевода мышей с оптимизированным содержанием калия (KSOM), под газовой фазой - 5% COj, 5% 02,90% Nj

Практическая значимость работы.

Результаты исследований, полученные при изучении динамики местоположения метафазной пластинки относительно I полярного тельца (ПТ), могут быть использованы для повышения результативности процесса энуклеации яйцеклеток млекопитающих.

Результаты исследований, направленных на установление оптимальных режимов электрослияния кариопласта с цитопластом и на определение условий активации реконструированных клеток, могут быть использованы для повышения эффективности реконструирования эмбрионов млекопитающих разных видов.

Результаты исследований, полученные при изучении влияния фазы клеточного цикла ядра соматической клетки, используемого в качестве кариопласта, на последующее развитие реконструированных эмбрионов, могут быть использованы в работах по получению клонированных млекопитающих.

Система культивирования в среде DMEM на фидерном слое пол газовой фазой 5% С02 в воздухе, а также в среде KSOM и KSOM с добавлением заменимых и незаменимых аминокислот (KSOM/AA) под газовой фазой 5% СОг, 5% Oj.90% Ns, может быть использована для культивирования естественно оплодотворенных, партеногенетически активированных и реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота.

Положения, выносимы« на защиту.

1. В мышином ооците, находящемся на стадии метафазы К, в течение первых 3-4 часов после первого мейотического деления не происходит существенной миграции ни ме-тафазной пластинки относительно 1 полярного тельца, ни 1 полярного тельца относительно метафазной пластинки. Причиной интенсивной миграции I полярного тельиа в пернви-теллиновом пространстве относительно метафазной пластинки, наблюдаемой в мышиных ооцитах при энуклеации, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса.

2. Активация клеток крупного рогатого скота и мышей, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер свежеполученных клеток кумулюса, только электрическим током в процессе электрослияния или с последующей дополнительной активацией 7% этанолом, не позволяет получить приемлемого выхода клонированных эмбрионов на стадии бластоцисты.

3. Воздействие фактором, ингибирующим фосфорилирование белков, на реконструированные клетки крупного рогатого скота и мышей сразу после активации их ионо-фором-Са"', препятствует переходу этих клеток в стадию метафазы III.

4. Эмбрионы крупного рогатого скота, реконструированные путем трансплантации ядер клеток кумулюса взрослых животных в энуклеированные ооциты, дозревавшие in vitro, развиваются до стадии бластоцисты в простой синтетической среде яйцевода мышей с оптимизированным содержанием калия (KSOM), под газовой фазой - 5% С02> 5% 02, 90% Ni.

Апробация работы.

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных отчетных сессиях ВНИИФБиП в период с 2003 по 2006г., а также на:

- Международной научно практической интернет-конференции «Управление функциональными системами организма» (г. Ставрополь, 2006 г.)

- IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (г, Боровск, 5-7 сентября 2006 г.)

- VI Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (п. Дубровицы, 19-20 декабря 2006 г.)

- IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 6-7 декабря 2006 г.)

- конкурсе молодых ученых в рамках IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г, Пущино, 6-7 декабря 2006 г.)

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной

литературы и приложений. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, включает 13 таблиц и 29 рисунков. Список литературы содержит 209 ссылок, в том числе 193 на английском языке.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводились в лаборатории клеточной инженерии ГНУ Всероссийский научно-исследовательского институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных в соответствии с планом научно-исследовательской работы отдела биотехнологии.

Методическую основу исследований составляла технология клонирования млекопитающих путем трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки, принципиальная схема которой представлена на рис. 1.

Рис. 1. Принципиальная схема клонирования млекопитающих при использовании в качестве кар иол ластов ядер соматических клеток.

2.1. Получение клеток источников цмтопластов

Ооциты крупного рогатого скота получали из антральных фолликулов (2-6 мм в диаметре) яичников, которые доставляли в лабораторию в течение 3-4 час после убоя коров на мясокомбинате. Дозревание ооцитов ш vitro проводилось группой Сметан иной И.Г. по методике отработанной в лаборатории.

В опытные группы отбирали только ооциты с первым полярным тельцем (на стадии метафазы II), через 20-24 час после постановки их на дозревание.

При реконструировании мышиных эмбрионов в качестве цитопластов были использованы энуклеированные ооциты на стадии метафазы II, полученные через 12-14 часов после введения самкам-донорам гибридных мышей Fl (CBAxC57BL) хорионического гона-дотропина человека (ХГч).

2.2. Получение клеток источников кари о пластов

При реконструировании эмбрионов крупного рогатого скота в качестве кариопластов использовали свежеполученные клетки кумулюса округлой формы, размером 10-12 мкм.

В экспериментах по реконструированию мышиных ооцитов в качестве источника кариопластов использовали свежеполученные клетки кумулюса округлой формы, размером 10-12 мкм, а так же мышиные фетальные фибробласты, размером 15-20 мкм.

Для синхронизации мышиных фетальных фибробластов в фазах G2-M клеточного цикла их культивировали в течение 6-9 часов в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка (ЭТС) и 0,4 мкг/мл колцемида, который деполимеризуег ту-булин митотического веретена. После этого флотирующие клетки собирали, отмывали от колцемида в ДМЕМ +10% ЭТС и использовали в качестве кариопластов.

2.3. Реконструирование клеток

Энуклеацию ооцитов и реконструирование клеток осуществляли микрохирургическим методом (McGrath J., So Iter D., 1983), на установке, включающей в себя комплект микроманипуляторов фирмы "N ал Shiga" и инвертированный микроскоп типа «Diaphot-TMD» фирмы "Nikon", оснащённый оптикой дифференциально-интерференционного контраста (DIC по Номарскому).

Все микрохирургические манипуляции проводили в камере типа Фонбрюна. Основные инструменты для микрохирургических манипуляций изготавливали по методике, предложенной Фонбрюном (Fonbnine Р., 1949) в модификации Никитина В.А. (Никитин., 1986).

Перед микрохирургией группу ооцитов инкубировали в течение 20 мин в манипуля-ционной среде М2 (для оошггов мыши) или среде Тираде-HEPES (Т-Н) (для ооцитов крупного рогатого скота), содержащих цитоскелетный ингибитор - цитохалазин Б в концентрации 5-7,5 мкг/мл.

Локализацию метафазной пластинки определяли методом флуоресцентной микроскопии. Клетки инкубировали в среде М2, содержащий 10 мкг/мл красителя Hoechst 33342 в течение 10 мин при 37°С, затем проводили микроскопию (5-10 сек) на флуоресцентном микроскопе типа MJI-2A.

При реконструировании единичные кариопласты (кумулюсные клетки или фибробласты) вводили в перивителлиновое пространство энуклеированных ооцитов через прокол в прозрачной оболочке.

2.4. Электрослияние кариопластов с цитопластами

Слияние цитопласга с кариопластом осуществляли с помощью контроллера электрослияния (ИБП РАН, г. Пущино) в камере с параллельными электродами в среде Циммермана (Zimmerman V. et al, 1982). Электрослияние осуществляли в два этапа: сначала с помощью переменного тока (500 кГц, 10 сек) ориентировали реконструированные клетки между электродами так, чтобы кариопласты и цитопласты располагались перпендикулярно электродам, и после этого подавали прямоугольные импульсы постоянного тока напряжением 1,5-2,0 kB/см (для клеток крупного рогатого скота) и 2,0-3.3 кВ/см (для

мышиных клеток), продолжительностью 10 мксск. Слияние производили с помощью трех последовательных электрических импульсов с интервалом в 30 минут.

2.5. Активация цито пластов

Активацию проводили как на интактных (без энуклеации), так и на реконструированных мышиных оошсгах (через 1-1,5 часа после установления факта электрослияния). Ин-тактные ооциты на стадии метафазы К (Mil) и цито пласты получали через 13 ч после введения ХГч самкам донорам яйцеклеток.

Реконструированные клетки и интактные ооциты крупного рогатого скота и мышей были разбиты на группы и подвергнуты различным вариантам физической и химической активации, о которых будет указано в разделе 3. Результаты исследований.

2.6. Культивирование реконструированных и па рте ногенетн чески активированных клеток

Реконструированные и партеногенетическн активированные эмбрионы крупного рогатого скота культивировали в средах DMEM, KSOM и KSOM/AA.

В течение первых 48-ми часов клетки крупного рогатого скота культивировали в средах, обогащенных 4мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), а затем - 10%

этс.

Культивирование проводили в микрокаплях (10-12 эмбрионов на 1 каплю объемом 50-60 мкл) с фцдерным слоем из клеток кумулюса коровы и без фидерного слоя, под слоем минерального масла («Sigma», США) в увлажненной атмосфере воздуха с 5% СОг, либо под газовой фазой 5% С02; 5% 02; 90% N2 в течение 10 сут при 38,5 *С. При культивировании в KSOM или KSOM/AA через каждые 48 часов эмбрионы крупного рогатого скота переносили в капли свежей среды. Через каждые 24 часа регистрировали процесс развития эмбрионов.

Реконструированные и партеногенети1чески активированные мышиные эмбрионы культивировали так же в микрокаплях в средах М16, CZB, KSOM под слоем минерального масла в увлажненной атмосфере воздуха с 5% С02 в течение 96 часов при 37 °С, Через каждые 24 часа регистрировали процесс развития эмбрионов. Среды М2, М16, CZB и KSOM приготовляли из реактивов фирмы «Sigma» (США) в условиях лаборатории.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение факторов, влияющих на изменение местоположения метафазной пластинки и полярного тельца в ооцитах крупного рогатого скота и мышей

Первым этапом в технологии реконструирования эмбрионов является получение ци-топласта путем удаления генетического ядерного материала яйцеклетки, т.е. энуклеация яйцеклетки. Неполное удаление хроматина из яйцеклетки приводит в дальнейшем к нарушению развития реконструированного эмбриона. Чаше всего энуклеацию яйцеклеток проводят «вслепую», ориентируясь на местоположение I полярного тельца (ПТ). Однако в многочисленных экспериментах, проведанных на мышиных яйцеклетках, было установлено, что энуклеация «вслепую» очень часто бывает неполной, при этом нередко удаляется только полярное тельце и не удаляется метафазная пластинка.

Для проведения более полной энуклеации яйцеклеток были предприняты попытки окрашивать ДНК хроматина с помощью витального флуоресцентного красителя Hoechst 33342. Однако для выявления ДНК хромосом, окрашенной этим красителем, яйцеклетку

необходимо подвергнуть ультрафиолетовому (УФ) облучению, которое может оказать отрицательное влияние на дальнейшее развитие реконструированных эмбрионов.

Для выяснения причин неудачной энуклеации яйцеклеток млекопитающих нами была предпринята попытка изучить процесс миграции метафазной пластинки в мышиных ооцитах МП, овулировавших in vivo, и в ооцитах МИ крупного рогатого скота, дозревших in vitro, и выяснить факторы, влияющие на этот процесс.

Первая серия исследований была проведена на мышиных ооцитах, находящихся на стадии мегафазы II, полученных через 12,13 и 14 часов после введения овуляторной дозы ХГч самкам гибридных мышей F1 (CBA*C57BL), Клетки кумулюса удаляли мягким пи-петированием в 0,1% растворе гнап уронил азы в капле среды М2.

Местоположение метафазной пластинки в ооцитах МП определяли методом флуоресцентной микроскопии, в результате чего были дифференцированы на три основные области расположения метафазной пластинки относительно I полярного тельца;

ПППТ— прямо под полярным тельцем;

БСПТ - близко в стороне от полярного тельца;

ДСГГТ - далеко е стороне от полярного тельца (рис. 2).

ш

r (прямо подоопяриын тельцем)

\ -:■.

бспт

____- (близко в стороне от

/"^«.Д;полярного тельца)

■Р'-'Я

'■ .. ЙСПГ .J'. ■■■ .....(далеко в стороне от

/

полярноготепьиа)

Рис, 2. Местоположение метафазной пластинки в ооцитах МП,

В экспериментах на мышиных ооцитах, полученных через 12, 13 и 14 часов после введения самкам-донорам овуляторной дозы ХГч, местоположение метафазной пластинки не зависело от времени получения ооцитов в пределах данных экспериментов. В большинстве случаев (90%) метафазная пластинка располагалась в области ДСПТ, в 10% случаев -в области БСПТ (рис.3).

Следовательно, в мышиных ооцитах, подвергавшихся воздействию различных манипуляций, связанных с удалением клеток кумулюса, положение первого полярного тельца не является ориентиром локализации метафазной пластинки.

Доля ооцитов

□ Область ПППТ £3 Область БСПТ ■ Область ДСПТ

Рис.3. Местоположение метафазной ш?астинки в мышиных ооцитах МП, полученных через 12 - 14 ч после введения ХГч, н подвергнутых процессу снятия клеток кумулюса.

При детальном анализе полученных результатов было отмечено, не смотря на то, что в исследуемый период в большинстве случаев метафазная пластинка располагалась далеко а стороне от полярного тельца (вариант ДСПТ), но находилась она на периферии ооцита под цитоплазматической оболочкой, а не перемещалась в центр клетки, как следовало бы ожидать. Этот факт дает основание полагать, что за короткое время наблюдений более интенсивно перемешается не метафазная пластинка к центру ооцита, а первое полярное тельце в пери вите л ли новом пространстве, как свободная структура, в процессе манипуляций, связанных с удалением клеток кумулюса.

Для выяснения этого предположения нами была проведена вторая серия экспериментов. Для того чтобы максимально исключить влияние манипуляций, связанных с удалением клеток кумулюса, на перемещение полярного тельца в перивителлиновом пространстве, были получены ооциты мыши на стадии метафазы I (MI). Ооциты на стадии Ml извлекали из предовуляторных фолликулов методом аспирации, очищали от клеток кумулюса и ставили надозревание до выделения I полярного тельца (стадия МП).

Полученные таким способом мышиные ооциты МП были осторожно окрашены Hoechst 33 342 и подвергнуты флуоресцентной микроскопии для идентификации расположения метафазной пластинки относительно первого полярного тельца.

Анализ результатов этого эксперимента показал (рис,4), что, е относительно спокойно лежащем ооците, в течение первых 3-4 часов после первого мейотического деления (выделения первого полярного тельца) не происходит существенной миграции метафазной пластинки относительно 1 полярного тельца, также как и полярного тельца относительно метафазной пластинки. И только через 5-6 часов после выделения I полярного тельца наблюдается смещение его относительно метафазной пластинки и перемещение метафазной пластинки к центру ооцита. Таким образом, полученные результаты показали, что причиной миграции I полярного тельца относительно метафазной пластинки в мышиных ооцитах на стадии МП, полученных методом вымывания ооцит-кумулюсных комплексов из яйцеводов мышей, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса. Следовательно, энуклеацию мышиных ооцитов на стадии МП следует проводить под микроскопом с дифференциально-интерференционным контрастом, при котором МП визуализируется в виде просветленной зоны в ооплазме.

□ Область ПППТ

□ Область БСГТТ ■ Область ДСГТТ

Рис. 4. Изменение местоположения метафазной пластинки в мышиных ооцитах, дозревших in vitro, в зависимости от времени прошедшего с момента выделения первого полярного тельца.

Третья серия экспериментов была направлена на изучение местоположения метафаз-ной пластинки в ооцитах МП крупного рогатого скота, дозревавших in vitro. Через 20 час после постановки на дозревание ооциты очищали от клеток кумулюса и продолжали культивировать в течение 3 час (II группа), 6 час (III группа) и 11 час (IVrpynna). Затем, по истечении указанного времени проводили флуоресцентную микроскопию ооцитов разных групп.

Таблица 1

Изменение местоположения метафазной пластинки в ооцитах крупного рогатого скота, дозревших in vitro, в зависимости от времени, прошедшего с момента постановки на дозревание

№№ гр. Время после постановки на дозревание (час) Местоположение метафазной пластинки (%)

ПППТ БСПТ ДСПТ

1 20 95,0 5,0 0

И 23 63,3 33,3 3,4

Ш 26 50,0 33,3 16,7

IV 31 17,4 47,8 34,8

Анализ данных (табл. 1), полученный в экспериментах на ооцитах крупного рогатого скота дозревавших in vitro, указывает на то, что в период с 20 до 26 часов с момента постановки ооцитов на дозревание положение I полярного тельца может являться ориентиром локализации метафазной пластинки. Возможно, это связано с меньшим размером перивителлинового пространства у ооцита крупного рогатого скота, чем у мышиного, что делает I полярное тельце коровьего ооиита менее подвижным относительно других структур яйцеклетки.

Результаты этих исследований указывают на то, что энуклеацию ооцитов крупного рогатого скота можно проводить «вслепую», путем аспирации части ооплазмы в области I полярного тельца, через 20-26 часов от начала постановки их на дозревание, с получением высокой доли эну к леи роаанн ых яйцеклеток. .

3.2. Определение оптимальных режимов электрослняння кярмолластов и цитопластов различного происхождения

В результате проведенных манипуляций по реконструированию клеток получали комплекс цитопласт-кариопласт, который состоял т двух частей: цитопласта - энуклеи-рованного ооцита и кариопласта - клетки кумулюса, разделенных цитоплазм атическими мембранами. Для получения реконструированного эмбриона необходимо, чтобы карио-пласт (ядро клетки кумулюса) переместилось внутрь цитопласта. Это перемещение ядра и слияние его с цитопластом может произойти только при образовании пор в цитоплаз-матических мембранах клеток в результате воздействия на них некоторых химических или физических факторов. В последнее время для слияния кариопласта с цитопластом чаще всего используют постоянный электрический ток.

Многочисленными исследованиями установлено, что с увеличением напряжения прямоугольного импульса до определенного уровня возрастает эффективность слияния цитопласта с кариопластом. Однако при повышении напряжения выше этого уровня значительно увеличивается количество разрушенных клеток.

Идеальным объектом для изучения параметров электрослияния кариолластов с цито-п ластам и являются бласгомеры в 2-клеточных эмбрионах, так как они имеют одинаковый размер и плотно прижаты друг к другу, В связи с этим площадь контакта цитоплазматических мембран у них больше, что является очень благоприятным условием для электрослияния. Исходя из этого, на первом этапе наших исследований для определения приемлемого напряжения прямоугольного импульса в качестве модели были использованы бласгомеры 2-клеточныхэмбрионов. После слияния эмбрионы культивировали вереде М1б,

Таблица 2

Влияние величины прямоугольного импульса на эффективность слияния бластомеров в 2-клеточных мышиных эмбрионах, и их развитие в условиях in vitro

№№ гр. Напряжение импульса (кВ\см) Кол-во эмбрио нов Слияние Развитие эмбрионов до стадии:

п % 2-4-кл. 8-1б-кл. бластоцисты

п % п % п %

1 2,0 32 30 93,8±3,1 27 90,0±0,б 26 86,7±2,б 24 80,0±1,2

II 2,7 40 38 95,0±2,5 34 89,5 ±1,6 32 84,2±1,4 29 7б,3±2,2

Ш 3,3 36 34 94,4±2,7 28 82,4±4,9 28 82,4±4,9 22 б4,7±2,7

Полученные результаты (табл. 2) свидетельствуют, что повышение напряжения прямоугольного импульса с 2,0 кВ\см до 3,3 кВ\см достоверно не отразилось на эффективности слияния бластомеров. Однако, с увеличением напряжения импульса с 2,0 кВ\см до 3,3 кВ\см, доля слившихся бластомеров двуклеточных эмбрионов, сохранивших способность к развитию до стадии бластоцисты, достоверно (р<0,01) уменьшилась на 15,3%. Вероятно, повышение величины прямоугольного импульса до 3,3 кВ\см существенно увеличивает неблагоприятное воздействие электрического тока на эмбрион, и проявляется оно в

наиболее критический период развития - при переходе от стадии морулы к стадии бла-сто цисты.

Исходя из результатов этого исследования, для дальнейшей работы по реконструированию эмбрионов нами было выбрано в качестве ориентировочного напряжение прямоугольного импульса равное 2,0 кВ\см, которое обеспечивает высокую эффективность ( 94%) электрослияния бластомеров в 2-клеточных эмбрионах.

Однако при реконструировании эмбрионов крупного рогатого скота и мышей с использованием в качестве источников кариопластов соматических клеток различного происхождения, эффективность электрослияния резко снижалась (табл. 3), по сравнению с эффективностью слияния бластомеров в 2-клеточных эмбрионах (29,2-47,4% против 93,895,0%, соответственно). При этом эффективность слияния была несколько ниже при использовании в качестве источника кариопластов фстальных фибробластов, чем клеток кумулюса (29,2% против 37,4% соответственно).

Таблица 3

Электрослияние цитопластов с кариопластами различного происхождения

№Xs гр. Кариопласт Цитопласт Количество комплексов цитопласт-кариопласт Эффективность электрослияния

п %

I клетка кумулюса мышиный ооцит 530 198 37,4±1,2

II клетка кумулюса мышиная зигота 60 24 40,0±2,б

Ш фетальный фибробласт мышиный ооцит 89 26 29,2±4,4

IV клетка кумулюса ооцит крупного рогатого скота 340 161 47,4±1,9

Относительно невысокая эффективность электрослияния цитопласта с кариопластом, при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток, по-видимому, обусловлена малой площадью контакта между цитолластом крупного размера и маленьким кариопластом (75-150 мкм против 10-12 мкм, соответственно). Кроме того, существенное значение имеют также различия между типами клеток по биохимическим свойствам клеточных мембран. В связи с этим, для каждого нового типа комплексов цитопласт-кариопласт необходимо проводить уточнение режима электрослияния.

Наряду с кариопластом в процессе электрослияния участвует и цитопласт, о влиянии которого на этот процесс известно очень мало. Проведенные нами исследования, по изучению влияния вида цитопласта на эффективность электрослияния, показали (табл. 4), что при использовании в качестве источника цитопластов, как оплодотворенных яйцеклеток (зигот), так и неоплодотворенных (ооцитов) не было отмечено существенной разницы в эффективности электрослияния цитопластов с кариопластами, источником которых были клетки кумулюса (40,0% и 36,0%, соответственно).

Таблица 4

Электрослияние кариопластов с цитопластами различного происхождения

№№ гр. Тип клеток-реципиентов Количество комплексов цитолласт-кариопласт Напряжение импульса (кВ/см) Эффективность слияния

п %

1 зиготы 20 2,0 S 40,0 ±10,0

II зиготы 40 3,3 16 40,0 ±0,9

III ооциты 278 2,0 100 Зб,0±1,9

Таким образом, проведенные исследования показали, что эффективность элекгро-слияния цитопластов с кариоп ластам и, источниками которых являются соматические клетки различного происхождения, значительно ниже, по сравнению с эффективностью слияния бластомеров в 2-клеточных эмбрионах. При этом фетальные фибробласты сливались с цитопластами хуже, чем клетки кумулюса. Отмечено, что цитопласты, полученные как из оплодотворенных, так и неоплодотворенных яйцеклеток сливаются с кариопласта-ми с одинаковой эффективностью.

3.3. Анализ факторов влияющих на активацию реконструированных н партено-генетических эмбрионов

После электрослияния ядро клетки-донора попадает в цитоплазму энуклеированного ооцита и подвергается воздействию находящихся в ней факторов, от которых зависит дальнейшее развитие реконструированной клетки.

У большинства видов млекопитающих созревание ооцитов блокируется на стадии ме-тафазы второго мейотического деления (М П). Это блокирование осуществляется за счет действия фактора способствующего созреванию ооцита (maturation promoting factor, MP F).

Ядро соматической клетки (кариопласт), помещённое в энуклеированный ооцит (ци-топласт), сразу подвергается действию высокой активности MPF, в результате чего у него распадается ядерная оболочка, происходит преждевременная конденсация хромосом и оно переходит в состояние аналогичное стадии метафазы If мейоза. Для того чтобы вывести ядро реконструированной клетки из этого состояния и запустить митотическое деление клетки её необходимо активировать. В естественных условиях активация яйцеклетки происходит во время оплодотворения, когда сперматозоид, проходя через цито-плазматическую мембрану, запускает серию внутриклеточных колебаний концентрации ионов кальция (Са^). Эти внутриклеточные изменения концентрации Са++ в цнтозоле, приводят к инактивации MPF и выводят ооцит из метафазной блокады, тем самым, запуская возобновление м итотического цикла.

Оказалось, что не только воздействие сперматозоида на цитоплазматическую мембрану может вызывать серию колебаний концентрации внутриклеточного Са**, но и целый ряд искусственных физических и химических факторов, таких как электро им пульс, этанол и ряд других веществ.

До недавнего времени (1997-1998 гг.) в работах по клонированию животных в качестве активирующего агента широко использовали постоянный электрический ток, с помощью которого осуществляли электрослияцие цнтопласта с кариопластом и одновременно активацию реконструированных эмбрионов. Это выглядело довольно технологично, т.к.

одним действием осуществлялось и слияние кариопласта с цитопластом и активация реконструированных клеток.

На начальных этапах исследования нами также было проведено изучение влияния активации электрическим током клеток реконструированных с использованием цитопластов различного происхождения, В качестве источника кариопластов были использованы све-жеполученные клетки кумулюса, находящиеся в фазе СО-й! клеточного цикла. Культивирование мышиных реконструированных эмбрионов проводили в среде М16 под газовой фазой - 5% С03 в воздухе.

Анализ результатов этих экспериментов показал (табл.5), что увеличение напряжения прямоугольного импульса с 2,0 до 3,3 кВ/см, при активации эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве цитопластов энуклеированных зигот, не оказало влияния на развитие эмбрионов до стадии бластоцисты (12,5% против 12,5%, соответственно). Не было отмечено достоверных различий в развитии до стадии морулы и при активации электрическим импульсом 2,0 кВ/см мышиных эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве цитопластов, как энуклеированных зигог, так и ооцитов (12,5% против 6,5%, соответственно). Дополнительная активация 7% этанолом сразу после активации электрическим импульсом эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве цитопластов энуклеированных ооцитов, достоверно повышала процент развития эмбрионов до стадии морулы с 6,5% до 42,6%. Однако, только лишь небольшая часть (3,7%) эмбрионов развивалась до стадии бластоцисты при тех же условиях культивирования.

Таблица 5

Развитие реконструированных мышиных эмбрионов в зависимости от состояния клеток-реципиентов и способа активации цитопластов

№№ гр. Тип клеток-реципиентов Кол-во реконстр. эмбрионов Активация Развитие реконструированных эмбрионов до стадии:

2-4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

п % п % п % п %

I зиготы 8 эл.имп. 2,0 кВ/см 8 100±0,0 4 50,0±13,3 1 12,5±10,0 0 0

И зиготы 16 эл.имп, 3,3 кВ/см 14 87,5±6,б 8 50,0±9,1 2 12,5±б,6 0 0

Ш ооциты 46 эл.имп. 2,0 кВ/см 43 93,5±3,1 25 54,3 ±2,5 3 б,5±2,8 0 0

IV ооциты 54 эл.имп, 2,0 кВ/см + этанол 47 87,0±3,1 34 63,0 ±3,5 23 42,б±4,5 2 3,7±3,С

Таким образом, активация мышиных эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер свежеполученных клеток кумулюса, только электрическим импульсом в процессе электрослияния или с последующей дополнительной активацией 7% этанолом, не позволяет получить приемлемого выхода клонированных эмбрионов на стадии бластоцисты.

В последние годы в зарубежной литературе появились сообщения, свидетельствующие о том, что при активации клеток искусственными активаторами часто происходит

только кратковременное снижение активности МРР, которая затем быстро восстанавливается и вызывает переход клеток в состояние нового метафазного ареста, получившего название - метафаза III. Кроме того, сообщалось, что разные агенты по разному воздействуют на процессы поступления ионов Ca** в цитозоль клетки и динамику изменения концентрации их в цнтозоле. Основываясь на результатах этих сообщений, нами в дальнейших исследованиях в качестве активирующего агента был использован кальциевый ионо-фор A 23IS7, который в отличие от электрического тока и этанола высвобождает ионы Са++ только из собственных депо клетки и не способствует поступлению в цитозоль клетки экзогенного Ca** из культуральной среды. Кроме того, для предотвращения перехода ядра реконструированной клетки в состояние метафазы III нх сразу после активации ио-нофором-Са++ культивировали в среде содержащей 6-диметиламино пурин (6-DMAP), в результат« чего ингибировалось восстановление активности MPF,

На первом этапе наши исследования были направлены на выяснение оптимального времени воздействия кальциевым ионофором А 23187 на мышиные ооциты, с целью их активации к партеногенетическому развитию. Результаты, полученные в этих исследованиях (табл. 6), показали, что воздействие на интактные мышиные ооциты монофором-Са** в течение 1; 3; или 5 минут не оказало существенного влияния на развитие партеногенетических эмбрионов до стадии морупы (100,0; 98,2 и 97,0%, соответственно). Однако, процент развития эмбрионов до стадии бластоцисты в группе ооцитов, подвергавшихся воздействию ионофора-Са++ в течение 5-ти минут (III гр.), было достоверно ниже, по сравнению с другими группами (I и II гр.). По-видимому, более длительное воздействие на клетки ионофором-Са** (III гр.), оказало определенное негативное влияние на развитие эмбрионов до стадии бластоцисты.

Таблица б

Развитие партеногенетических мышиных эмбрионов in vitro в зависимости от продолжительности активации ионофором-Са"

№№ гр. Режим активации Кол. кп,, шт Развитие партеногенетических эмбрионов до стадии:

2-кл. 4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

П % п % п % п % п %

I 1 мин ионофор-Са" + 3 ч 6-DMAP 82 82 100±0,0 82 100*0,0 82 100*0,0 82 100±0,0 72 87,8±1,7,

11 3 мин ионофор-Са" + 3 ч 6-DMAP 56 55 98,2±1,7 55 98,2±1,7 55 98,2±1,7 55 98,2*1,7 48 85,7±2,2

111 5 мин ионо- фор-Са" + 3 ч б-DM АР 67 67 100±0,0 67 100±0,0 65 97,0±1,8 65 97,0±1,8 52 77,б±1,8

Исходя из результатов этих исследований, в последующих экспериментах для активации мышиных реконструированных эмбрионов нами был выбран наиболее щадящий режим - I мин, ионофор-Са" + 3 часа 6-ЬМАР, так как он позволил при наименьшем времени воздействия на клетки ионофором-Са""" получить наивысший процент развития эмбрионов до стадии бластоцисты.

3.4. Влияние различных срез для культивирования in vitro на развитие партено-генетнческн активированных мышиных эмбрионов

На эффективность технологии клонирования влияет большое число факторов, среди которых существенное значение имеет среда для культивирования реконструированных эмбрионов.

Поэтому в серии экспериментов нами были протестированы среды по их влиянию на развитие партеногенетически активированных мышиных эмбрионов, которые часто используют как модельные объекты в экспериментах по культивированию эмбрионов млекопитающих, Было проведено сравнительное испытание трех культуральных сред, наиболее часто используемых для культивирования мышиных эмбрионов - М16, CZB и KSOM.

Таблица 7

Развитие партеногенетических мышиных эмбрионов in vitro в различных культуральных средах

№Ка гр. Среда культивирования Кол. кл., шт Развитие партеногенетических эмбрионов до стадии:

2-кл. 4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

п % п % п % п % п %

I М1б 40 36 90,0±1,9 31 77,5±2,2 30 75,0±2,2 27 67,5±l,l 22 55,0±4,4

11 CZB 38 37 97,4±2,2 35 92,1±1,0 35 92,1±1,0 33 86,8±3,8 32 84,2±2,9

III KSOM 54 52 50 92,6±2,8 50 92,б±2,8 50 92,б±2,8 48 88,9±3,1

Анализ результатов (табл. 7) свидетельствует о том, что наиболее подходящей средой для культивирования партено генетически активированных мышиных эмбрионов является среда KSOM. Развитие до стадии бластоцисты в этой среде было выше на 4,7% чем в среде CZB (p<0,367), и на 33,9% (р<0,003) - чем в среде М16.

Различная жизнеспособность мышиных партеногенетических эмбрионов в различных культуральных средах обусловлена их составом, а также соотношением входящих в них компонентов.

Исходя из результатов этого эксперимента последующих работах для культивирования реконструированных и партеногенетически активированных мышиных эмбрионов была использована среда KSOM в сочетании с газовой фазой - 5% С02 в воздухе.

3.5. Развитие In vitro клонированных мышиных эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла

До 1999 г. считалось, что при использовании в качестве цитопластов энуклеированных ооцитов МН, а в качестве кариопластов - ядер соматических клеток, кариопласт должен находиться в фазе G0-G1, так как только в этом случае сохраняется правильная плонд-ность хромосом в реконструированных клетках. Однако в 1999 г, появились работы Vir-gon с соавторами (на коровах) и Cibelli (на козах), согласно которым стадия клеточного цикла кариопласта при данном варианте реконструирования не имеет существенного значения.

С целью проверки объективности этого положения в отношении реконструированных мышиных эмбрионов нами было проведено две серии экспериментов.

В первой серии в качестве источника кариопластов были использованы свежеполу-ченные клетки кумулюса, которые по данным (БсЬ^г AW, \УЫ«т$Ьат Ов, Snowden Я., 1996) находятся в фазах ОО-в! клеточного цикла. Во второй серии экспериментов в качестве источника кариопластов использовали фетальные фибробласты 3-го пассажа, синхронизированные в фазах 02-М клеточного цикла.

В обеих сериях экспериментов в качестве китопластов были использованы энуклеи-рованные ооциты, находящиеся на стадии МП. Активацию реконструированных клеток проводили в режиме — ионофор-Са" {1 мин) + б-ЭМАР (3 час). Культивирование реконструированных эмбрионов проводили в среде К50М под газовой фазой - 5% С02 в воздухе.

Таблица 8

Развитие т ¥1(го клонированных мышиных эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер клеток, находящихся в разных фазах клеточного

цикла

Фазы кл. цикла карно-пласта Кол-во коплексов цитопласт-кариопласт Кол-во реконструированных эмбрионов Развитие клонированных эмбрионов до стадии:

2-4-кл, 8-16-кл, морулы Зластоцисты

п % п % п % п %

G0-G1 252 98 95 9б,9±1,б 73 74,5±4,1 60 61,2±4,б 25 49,0±2,4

G2-M 23 6 5 83,3±12,5 5 83,3*12,5 4 6б,7±25,0 3 50,0±0,0

Анализ результатов этих экспериментов показал (табл. 8), что при использовании в качестве источника кариопластов свежеполученных клеток кумулюса, находящихся в фазах C0-G1 клеточного цикла {[ гр.), 96,9% реконструированных клеток вступало в стадию деления дробления и 49% достигло стадии бластоцисты.

При использовании в качестве источника кариопластов фетальных фибробластов, синхронизированных в фазах G2-M клеточного цикла (II гр.), в деление дробления вступило 83,3% реконструированных клеток и 50,0% их достигло стадии бластоцисты, то есть не было отмечено существенной разницы между группами. Кроме того, эти исследования показали, что проведение активации ионофором-Са** (1 мин) + 6-DMAP (3 час) и культивирование в среде KSOM позволило повысить количество реконструированных клеток, сохраняющих способность к дроблению до стадии морулы, и значительно повысить развитие эмбрионов до стадии бластоцисты, по сравнению с активацией электрическим импульсом + 7% этанол и культивированием в среде М16 (табл. 5).

Таким образом, результаты этих исследований показали, что, по крайней мере, при реконструировании мышиных эмбрионов, в качестве источников кариопластов могут быть использованы клетки, находящиеся как в фазах G0-GI клеточного цикла, так и в фазах G2-M.

3.6. Изучение влияния различных культу рал ьных систем на развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro

Как известно для клонирования наиболее желательным объектом из сельскохозяйственных животных является крупный рогатый скот. Но корова является малоплодным животным, и получить от неё достаточное количество яйцеклеток, необходимых для

использования их в качестве цитопластов, весьма проблематично. Кроме того, получить от коровы яйцеклетки нехирургнческим методом очень трудоёмко и дорого.

В связи с этим, наиболее приемлемым вариантом выглядит использование для работ по клонированию яйцеклеток крупного рогатого скота, полученных in vitro. В отличие от многоплодных животных, у которых реконструированные клетки можно трансплантировать животным-реципиентам хирургическим способом сразу после активации и кратковременного культивирования, у крупного рогатого скота хирургический вариант трансплантации реконструированных клеток не приемлем из-за большой трудоемкости. Поэтому реконструированные эмбрионы крупного рогатого скота, наиболее целесообразно культивировать in vitro до стадии бластоцисты и полученные бластоцисты трансплантировать в матку коров-реципиентов нехирургическим способом.

Для выявления наиболее приемлемой системы культивирования реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота было проведено исследование влияния различных условий культивирования на их развитие до стадии бластоцисты.

Реконструированные эмбрионы культивировали в следующих условиях;

I гр. - в среде DMEM под газовой фазой - 5% С02 в воздухе;

II гр. - в среде DMEM на фидерном слое, состоящем из клеток кумулюса коровы, под газовой фазой - 5% СО} в воздухе.

Таблица 9

Развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота в среде БМЕМ в различных культуральных системах

№№ гр. Кол-во комплексов цитопласт-кариопласт Эффективность слияния Развитие реконструированных эмбрионов до стадии:

2-4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

п п % п % п % п % п %

1 34 19 55,9±5,1 7 36,8±3,2 4 21,0tfc4,0 1 5,3±4,8 0 0±0

11 134 64 47,8±3,7 46 71,9±9,5 39 60,9±10,l 26 40,б± 10,6 13 20,3±12,4

В результате проведенных экспериментов (табл. 9) установлено, что, при культивировании реконструированных эмбрионов в среде БМЕМ под газовой фазой 5% СО! в воздухе развитие основной массы эмбрионов останавливалось на стадии 8-16-ти бластомеров и только небольшая часть их (5,3%) достигала стадии морулы. Однако при культивировании реконструированных клеток в той же газовой фазе, но на фидерном слое, состоящем из клеток кумулюса, 71,9% реконструированных эмбрионов развивалось до стадии 2-4-х бластомеров, стадии 8-16-ти бластомеров достигали 60,9% эмбрионов, и 40,6% - достигли стадий морулы, 20,3% - стадии бластоцисты.

Улучшение условий культивирования за счСт использования фидерного слоя из клеток кумулюса обусловлено тем, что многие клеточные линии при своем размножении выделяют цитокины, такие как фактор роста фибробластов и фактор ипгибирования лейкемии, которые оказывают благоприятное влияние на развитие эмбрионов.

При использовании фидерного слоя (II гр.) более чем 50% реконструированных эмбрионов проходят 8-1б-к легочный блок. Большая часть 8-1б-клеточных эмбрионов достигает стадии морулы. Однако дальнейшее развитие реконструированных клеток до стадии

бластоцисты существенно тормозится. Вероятно, такая остановка в развитии эмбрионов связана с недостатком некоторых субстратов, которые для своего питания используют и клетки фидерного слоя.

Таким образом, проведенные исследования показали, что цитопласты, полученные путем энуклеации ооцитов крупного рогатого скота, дозревавших in vitro, способны репро-граммировать кариопласты соматических клеток и обеспечивать их развитие, по крайней мере, до стадии морулы/бластоцисты, Использование фидерного слоя из клеток кумулюса позволяет культивировать реконструированные клетки до стадии морулы/бластоцисты в атмосфере воздуха с 5% С02.

Однако, хотя система культивирования реконструированных эмбрионов на фидерном слое, состоящем из клеток кумулюса, и позволяет получать удовлетворительные результаты, условия культивирования, создаваемые в данной системе, слишком вариабельны и не стабильны из-за невозможности получения одинакового фидерного слоя в разных экспериментах. Кроме того, для поддержания жизнедеятельности клеток фидерного слоя концентрация глюкозы в культур альной среде необходима в пределах 5 rVi, тогда как для развития эмбрионов - 1г/литр, Это различие в потребности глюкозы необходимо постоянно учитывать и каким-либо образом нивелировать, т.к. повышенное содержание глюкозы отрицательно влияет на развитие эмбриона на ранних стадиях (от зиготы до 8-1б-кл. стадии). Поэтому наиболее технологичными признаются культуральные системы, без использования фидерного слоя.

При культивировании in vitro обычных эмбрионов крупного рогатого скота, в отличие от мышиных, используются системы культивирования под газовой фазой - 5% С02,5% Oj , 90% N2, содержащей низкую концентрацию 02. Кроме того, в предыдущих экспериментах нами были получены обнадеживающие результаты при культивировании реконструированных мышиных эмбрионов в среде KSOM под газовой фазой- 5% С03 в воздухе. Исходя из этого, нами была предпринята попытка создать систему для культивирования реконструированных и партеногенетически активированных эмбрионов крупного рогатого скота, основанную на использовании среды KSOM под газовой фазой - 5% СО2, 5% Ог, 90% Nj.

Среда KSOM представляет собой оптимизированную синтетическую среду яйцевода мышей. Особенностью этой среды является оптимизированное соотношение солей металлов (в частности калия и магния), энергетических компонентов (соотношение лактаг / пируват = 50) и наличие EDTA, для связывания следовых количеств тяжелых металлов в среде.

В первой серии экспериментов в качестве контрольной модели для испытания новой культуральной системы были использованы ооциты крупного рогатого скота, активированные к партеногенетическому развитию.

Культивирование партеногенетических эмбрионов крупного рогатого скота проводили по следующей схеме:

I гр.-в среде KSOM +10% ЭТС под газовой фазой- 5% СОг, 5% 02, 90% Ыг;

II гр. - в среде KSOM/AA+10% ЭТС (с добавлением заменимых и незаменимых аминокислот по прописи для среды MEM), под газовой фазой- 5% С02,5% 02> 90% Nj.

При культивировании яйцеклеток крупного рогатого скота, активированных к партеногенетическому развитию, в среде KSOM под газовой фазой-5% СОь 5% Ог, 90% в деление дробления вступило 53,3% яйцеклеток, до стадии морулы развилось 20,0% партеногенетических эмбрионов и только 6,7% достигло стадии бластоцисты. Однако когда в среду KSOM были добавлены заменимые и незаменимые аминокислоты, в концентрациях по прописи для среды MEM, количество партеногенетических эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты, увеличилось до 22,3% (табл. 10).

Этот факт даёт основание считать, что обогащение среды КЗОМ заменимыми и незаменимыми аминокислотами улучшает условия культивирования яйцеклеток крупного рогатого скота, активированных к партеногенетическому развитию.

Таблица 10

Развитие партеногенетических эмбрионов крупного рогатого скота в средах КЗОМ и КБОМ/АА под газовой фазой 5% С02, 5% 02,90% N.

№№ Гр. Кол-во ооцитов Развитие партеногенетических эмбрионов до стадии:

2-4-кл, 8-16-кл. морулы бластоцисты

п % п % п % п %

I 15 8 53,3 5 33,3 3 20,0 1 6,7

II 130 63 48,5 48 36,9 35 26,9 29 22,3

На основании результатов исследований первой серии экспериментов была проведена вторая серия экспериментов, в которой реконструированные эмбрионы культивировали по схеме, использованной для партеногенетических эмбрионов (первая серия).

Анализ результатов этой серии экспериментов показал (табл. 11), что практически одинаковый процент реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота достигал стадии бластоцисты как в I, так и во II группе (22,2 и 23,7%, соответственно). Из результатов этого эксперимента следует, что добавление к среде КБ ОМ заменимых и незаменимых аминокислот не оказало видимого влияние на развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты в отличие от партеногенетических эмбрионов, которые хуже развивались в среде без аминокислот (табл.10). Этот факт, по-видимому, свидетельствует о том, что для развития яйцеклеток ахти в про ванных к партено генетическому развитию требуются культуральные условия более высокого уровня.

Таблица 11

Развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота в средах КБОМ и КЗОМ/АЛ под газовой фазой 5% С02> 5% 90%

№№ гр. Количество комплексов цитопласт-кар поп ласт Эффективность слияния Развитие реконструированных эмбрионов до стадии:

2-4-кл, 8-16-кл. морулы бласгонисты

п % п % л % п % п %

I 28 9 32,1 ±5,9 4 44,4±5,0 4 44,4±5,0 4 44,4±5,0 2 22,2*2,5

II 82 38 46,3 ±2,6 19 50,0±4,7 13 34,2±2,7 10 26,3 ±9,1 9 23,7±9,8

В данном эксперименте нами не было обнаружено разницы в развитии реконструированных эмбрионов при культивировании их в среде без аминокислот и с добавлением аминокислот (22,2 и 23,7%, соответственно). По-видимому, этот факт можно объяснить тем, что в этом эксперименте по технологическим причинам результаты исследований

оценивались только no развитию реконструированных эмбрионов до стадии ранней бластоцисты, и не исследовалось качество этих бластоцист, их способность к дальнейшему развитию и выходу из блестящей оболочки.

Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что в культуральной системе, основанной на использовании среды KSOM и KSOM/AA под газовой фазой 5% С02, 5% 02, 90% Nj_ развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота происходит с такой же эффективностью, как и на фидерном слое, состоящем из клеток кумулюса. Однако культуральная система без использования фидерного слоя более технологична и наиболее стабильна, т.к. лишена такого вариабельного фактора, как монослой клеток кумулюса.

4. ВЫВОДЫ

1. В мышином остите на стадии метафазы П, не подвергавшемся сильным механическим воздействиям, в течение первых 3-4 часов после первого мейотического деления, не происходит существенной миграции ни метафазной пластинки относительно I полярного тельца, ни I полярного тельца относительно метафазной пластинки. Причиной миграции I полярного тельца относительно метафазной пластинки в ооцитах мыши на стадии МП, полученных методом вымывания ооцит-кумулюсных комплексов из яйцеводов мышей, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса и различными перемещениями ооиита,

2. В ооцитах МП крупного рогатого скота, дозревших in vitro, через 20-23 часа после постановки их на дозревание метафазная пластинка располагается прямо под I полярным тельцем либо близко в стороне от полярного тельца в 96,б - 100% случаев. Механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса с ооцита не оказывают существенного влияния на смещение полярного тельца относительно метафазной пластинки.

3. При активации мышиных клеток, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер свежеполученных клеток кумулюса, только электрическим током в процессе элекгрослияния, не наблюдается развития реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты. При дополнительной активации 7% этанолом сразу после электрослияния определённая часть (3,7%) реконструированных эмбрионов развивается до стадии бластоцисты.

4. Активация яйцеклеток мыши к партеногенетическому развитию иоиофором-Са" с последующим трех часовым культивированием в среде содержащей 6-DMAP, приводит к значительному повышению доли развития эмбрионов до стадии бластоцисты, по сравнению с активацией электрическим током и 7% этанолом. Уменьшение времени экспозиции мышиных яйцеклеток в ионофоре-Са" с 5 минут до 1 минуты существенно не сказывается на эффективности активации, однако позволяет увеличить долю развития партеногенетически активированных эмбрионов до стадии бластоцисты (87,8% против 77,6%, соответственно),

5. Для культивирования партеногенетически активированных мышиных эмбрионов до стадии бластоцисты наиболее подходящими являются среды K.SOM (88,9% от числа активированных эмбрионов) и CZB (84,2%). В меньшей степени для этого подходит среда МI б (55,0%).

6. При реконструировании мышиных эмбрионов в качестве источников кариопластов могут быть использованы как клетки находящиеся в фазах G0-G1, так и в фазах G2-М с одинаковой эффективностью развития реконструированных эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты.

7. Цитопласты, полученные путем энуклеации ооцитов крупного рогатого скота, дозревавших in vitro до стадии метафазы П в течение 20 часов, способны репрограмми-ровать кариопласты соматических клеток и обеспечивать их развитие, по крайней мере, до стадии бласто цисты.

8. Использование фидерного слоя из клеток кумулюса коровы позволяет культивировать реконструированные эмбрионы крупного рогатого скота до стадии бластоцисты в среде DMEM под газовой фазой • 5% СОг в воздухе. Для культивирования реконструированных и партеногенетическн активированных эмбрионов крупного рогатого скота без фидерного слоя может быть использована среда KSOM, обогащенная незаменимыми и заменимыми аминокислотами, под газовой фазой- 5% С02, 5% Ог, 90% N2.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Удаление клеток кумулюса с мышиных ооцитов МП, предназначенных для получения цитопластов, необходимо проводить преимущественно с помощью 0,1% раствора гналуронидазы и в меньшей степени с использованием пипетирования и особенно обработки на вортексе,

2. Энуклеацию мышиных яйцеклеток МИ необходимо проводить по положению мета-фаэной пластинки, которая визуализируется в виде просветленной зоны, а не по расположению I полярного тельца.

В работах по клонированию крупного рогатого скота энуклеацию ооцитов МП, дозревавших in vitro, целесообразно проводить «вслепую», через 20-23 часа после постановки на дозревание, путем удаления первого полярного тельца и части прилегающей к нему цитоплазмы.

4, Для активации реконструированных клеток к митотическому делению и дальнейшему развитию эмбрионов целесообразно обрабатывать их ионофором-Са4"1" (10 мкМ) в течение 3 минут для клеток крупного рогатого скота и в течение 1 минуты -для мышиных, с последующим культивированием в течение 3 часов в среде содержащей 6-DMAP (2 мМ).

5, В работах по клонированию крупного рогатого скота для культивирования реконструированных эмбрионов целесообразно использовать среду KSOM/AA без фидерного слоя или DM ЕМ в сочетании с фидерным слоем.

СПИСОК

работ опубликованных по теме диссертации

1. Кириенко К.В., Логинов А.Г., Алгулян A.C., Рябых В.Г1. Развитие партено-генетических и реконструированных мышиных эмбрионов при разных вариантах активации. // Материалы Международной научно практической интернет-конференции «Управление функциональными системами организма», Аргус, 2006, с. 28-31.

2. Кириенко К.В., Логинов А.Г., Сметанина И.Г., Татар и нова Л.В., Алгулян A.C., Рябых В.П. Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота при использовании в качестве цитопластов ооцитов, дозревавших in vitro. // Материалы IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006, с. 240-242.

3. Кириенко К.В., Логинов А.Г., Алгулян A.C., Рябых В.П, Развитие партено-генетаческих и реконструированных мышиных эмбрионов в зависимости от способа их активации. // Материалы IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006, с. 242-243.

Кирменко К.В., Логинов А.Г., Ал гул ян A.C., Рябых В.П. Развитие партеногенетических и реконструированных мышиных эмбрионов в зависимости от режима активации. // Материалы VI Международной научной конференции «Современные достижения н проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубро-вицы, 2006, с. 70-73.

Логинов А.Г., Кириенко К.В., Сметанина И.Г., Татаринова Л.В., Алгулян A.C., Рябых В.П. Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота при использовании в качестве кариопластов соматических клеток. // Материалы VI международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровины, 2006, с. 133-135.

Кириенко К.В, Влияние способа активации на развитие партеногенетических и реконструированных мышиных эмбрионов. // Материалы IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А, Овчинникова, Москва, 2006, с, 98-99,

Логинов А.Г., Кириенко К.В., Сметанина И.Г., Татаринова Л.В., Алгулян A.C., Рябых В.П. Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота при использовании в качестве цитопластов ооиитов, дозревавших in vitro. И Материалы IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, 2006, с. 138-139.

К.В. Кириенко, А.Г. Логинов, A.C. Алгулян, И.Г. Сметанина, Л.В, Татаринова, В.П. Рябых. Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота путем трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные ооциты, дозревавшие in vitro. //Сельскохозяйственная биология, 2007, № 4. с, 53 -61.

Издательство ВНИИФБиП с/х животных Лицензия ИД № 03641 Тираж 100 экз. 249013. г. Боровск. Калужская обл., пос. ВНИИФБиП