Развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота и мышей in vitro, в зависимости от условий их реконструирования и культивирования

Кириенко, Константин Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота и мышей in vitro, в зависимости от условий их реконструирования и культивирования
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота и мышей in vitro, в зависимости от условий их реконструирования и культивирования"

на правах рукописи

КИРИЕНКО КОНСТАНТИН ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗВИТИЕ КЛОНИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И МЫШЕЙ IN VITRO, В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ ИХ РЕКОНСТРУИРОВАНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

03.00.23. - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Боровск - 2007

003064724

Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных

Научный руководитель: - доктор биологических наук, профессор

Рябых Владимир Павлович

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук

Багиров Вугар Алинияз оглы

- кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Шевченко Вилорий Григорьевич

Ведущая организация - Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ)

Защита диссертации состоится « 10 » октября 2007 года

в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.006.030.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Адрес института: 249013, г. Боровск Калужской обл.,

ВНИИФБиП с/х животных, тел.(495) 996-34-15, факс. (484-38) 4-20-88

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан « 2.С » ¿^¿и^с-Т^ 2007 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Лазаренко В.П.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время одним из наиболее перспективных направлений ускоренного размножения высокоценных животных признается клонирование их путем трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки. Особенно интенсивно исследования по клонированию животных стали развиваться после получения овечки Долли (\Vilmut I. й а1.,1997), когда было показано, что в организме взрослых животных имеются недифференцированные клетки, обладающие тотипотентными свойствами, которые могут быть использованы в качестве источников кариопластов для получения клонированных животных генетически идентичных исходным прародителям.

Несмотря на то, что за последние годы в области клонирования животных достигнуты определенные успехи, они пока в большей степени носят эмпирический характер, поэтому положительные результаты сильно варьируют от эксперимента к эксперименту. Основной причиной такой нестабильности результатов является недостаточность фундаментальных знаний о глубинных механизмах, обусловливающих процесс репрограммирования кариопластов цитопластами, и факторов, влияющих на этот процесс.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что в лучших экспериментах при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток взрослых животных у некоторых видов млекопитающих удается получить определенный процент бластоцист, однако средние показатели получения живого потомства у этих видов варьируют от 1 до 15% от числа пересаженных эмбрионов. Такие низкие показатели получения клонированного потомства большинство исследователей объясняет следствием ненадлежащего репрограммирования кариопласта цитопластом, что приводит ко многим аномалиям эмбрионального развития. По современным представлениям для обеспечения осуществления полного эмбриогенеза и развития до взрослого организма в реконструированных клетках должна быть сохранена правильная плоидность хромосом и в процесс репрограммирования в строгой последовательности должна включиться вся система генов ядра соматической клетки.

От момента получения клеток источников цитопластов и клеток- доноров кариопластов до получения живого потомства стоит целый ряд экспериментальных манипуляций и большое количество еще не понятых механизмов, которые влияют на развитие реконструированных эмбрионов. Кроме того, отдельные принципиальные теоретические положения, которые были положены в основу стратегии получения овечки Долли, в последнее время не нашли своего подтверждения в исследованиях других авторов. Особенно это касается вопросов о стадии клеточного цикла ядер клеток, используемых в качестве кариопластов и степени активации цитоплазмы клеток реципиентов (цитопластов). Поэтому, в настоящее время ученые, занятые проблемой клонирования животных, вынуждены вернуться к последовательным и более глубоким исследованиям каждого этапа технологии клонирования. Начиная от исследований влияния полноты энуклеации яйцеклеток при получении цитопластов и кончая исследованиями о влиянии клеточного цикла кариопластов и системы культивирования на дальнейшее развитие реконструированных эмбрионов.

Исходя из вышеизложенного, для повышения эффективности технологии клонирования, основанной на трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки, исследования должны быть направлены на изучение процессов, происходящих при осуществлении каждого этапа технологии и на разработку методов их целенаправленного регулирования.

Цели и задачи исследований.

Целью исследований являлось изучение факторов лимитирующих процесс развития реконструированных яйцеклеток и на основе полученных результатов усовершенствование основных этапов технологии клонирования млекопитающих. Для достижения поставленной цели считали необходимым решить следующие задачи:

определить местоположение метафазной пластинки относительно I полярного тельца в яйцеклетках разных видов млекопитающих и выявить факторы, влияющие на его изменение, в связи с энуклеацией;

определить оптимальные режимы электрослияния кариопласта с цитопластом

при реконструировании клеток разных видов млекопитающих;

изучить влияние условий активации цитопластов на репрограммирование карио-

пластов;

изучить развитие эмбрионов, реконструированных с использованием кариопла-стов, находящихся в разных фазах клеточного цикла;

найти оптимальные системы культивирования реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота и мышей.

Научная новизна исследований.

Впервые показана динамика местоположения метафазной пластинки и I полярного тельца относительно друг друга в ооцитах мышей, овулировавших in vivo, и ооцитах крупного рогатого скота, дозревавших in vitro. Установлено, что в течение первых 3-4 часов после первого мейотического деления не происходит существенной миграции ни метафазной пластинки относительно I полярного тельца, ни I полярного тельца относительно метафазной пластинки. Выявлено, что причиной интенсивной миграции I полярного тельца в перивителлиновом пространстве относительно метафазной пластинки, наблюдаемой в мышиных ооцитах при энуклеации, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса и различными перемещениями ооцита.

Установлено, что цитопласты, полученные путём энуклеации ооцитов крупного рогатого скота, дозревавших in vitro в течение 20-23 часов, способны репрограммировать ядра соматических клггок взрослых животных и обеспечивать развитие реконструированных эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты.

Установлено, что воздействие фактором, ингибирующим фосфорилирование белков -6-диметиламинопурином (6-DMAP), на реконструированные клетки крупного рогатого скота и мышей сразу после активации их ионофором-Са++ препятствует переходу этих клеток в метафазу III, и способствует их дальнейшему развитию до стадии бластоцисты.

Впервые показано, что эмбрионы крупного рогатого скота, реконструированные путём трансплантации ядер клеток кумулюса взрослых животных в энуклеированные ооци-ты, дозревавшие in vitro, развиваются до стадии бластоцисты в простой синтетической среде яйцевода мышей с оптимизированным содержанием калия (KSOM), под газовой фазой - 5% С02, 5% 02, 90% N2.

Практическая значимость работы.

Результаты исследований, полученные при изучении динамики местоположения метафазной пластинки относительно I полярного тельца (ПТ), могут быть использованы для повышения результативности процесса энуклеации яйцеклеток млекопитающих.

Результаты исследований, направленных на установление оптимальных режимов электрослияния кариопласта с цитопластом и на определение условий активации реконструированных клеток, могут быть использованы для повышения эффективности реконструирования эмбрионов млекопитающих разных видов.

Результаты исследований, полученные при изучении влияния фазы клеточного цикла ядра соматической клетки, используемого в качестве кариопласта, на последующее развитие реконструированных эмбрионов, могут быть использованы в работах по получению клонированных млекопитающих.

Система культивирования в среде DMEM на фидерном слое под газовой фазой 5% СО2 в воздухе, а также в среде KSOM и KSOM с добавлением заменимых и незаменимых аминокислот (KSOM/AA) под газовой фазой 5% С02, 5% 02,90% N2, может быть использована для культивирования естественно оплодотворенных, партеногенетически активированных и реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота.

Положения, выносимые на защиту.

1. В мышином ооците, находящемся на стадии метафазы II, в течение первых 3-4 часов после первого мейотического деления не происходит существенной миграции ни ме-тафазной пластинки относительно I полярного тельца, ни I полярного тельца относительно метафазной пластинки. Причиной интенсивной миграции I полярного тельца в периви-теллиновом пространстве относительно метафазной пластинки, наблюдаемой в мышиных ооцитах при энуклеации, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса.

2. Активация клеток крупного рогатого скота и мышей, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер свежеполученных клеток кумулюса, только электрическим током в процессе электрослияния или с последующей дополнительной активацией 7% этанолом, не позволяет получить приемлемого выхода клонированных эмбрионов на стадии бластоцисты.

3. Воздействие фактором, ингибирующим фосфорилирование белков, на реконструированные клетки крупного рогатого скота и мышей сразу после активации их ионо-фором-Са++, препятствует переходу этих клеток в стадию метафазы III.

4. Эмбрионы крупного рогатого скота, реконструированные путём трансплантации ядер клеток кумулюса взрослых животных в энуклеированные ооциты, дозревавшие in vitro, развиваются до стадии бластоцисты в простой синтетической среде яйцевода мышей с оптимизированным содержанием калия (KSOM), под газовой фазой - 5% С02, 5% 02 , 90% N2.

Апробация работы.

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на ежегодных отчётных сессиях ВНИИФБиП в период с 2003 по 2006г., а также на:

- Международной научно практической интернет-конференции «Управление функциональными системами организма» (г. Ставрополь, 2006 г.)

- IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (г. Боровск, 5-7 сентября 2006 г.)

- VI Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных» (п. Дубровицы, 19-20 декабря 2006 г.)

- IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 6-7 декабря 2006 г.)

- конкурсе молодых ученых в рамках IV съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 6-7 декабря 2006 г.)

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной

-б-

литературы и приложений. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, вкл!очает 13 таблиц и 29 рисунков. Список литературы содержит 209 ссылок, в том числе 193 на английском языке.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводились в лаборатории клеточной инженерии ГНУ Всероссийский научно-те-спедсительекси-о институт физиологи», биохимии и питания сельскохозяйственных животных в соответствии с планом паучно-исоледовательсксй работы отдела биотехнологии.

Методическую основу исследований составляла технология клонирования млекопитающих путем трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки, принципиальная схема которой представлена на рис. I

ичроспого хявдткоги

купы'.'рд клетеж ©

Кпстка-мсточник ядра (карлопласт)

живо п гос-реципнент

' Гр ЯНЯ ШННТТШ! Ш клетки

лЧУ!:,!. КС :ип\-1:::г.-т-кзрисч1лзст

Рсколстрш р о ващга я кн^тха

КЛ0>ШриВ,11[Ние жикзпше

Рис. 1. I [ринпипральная схема клонирования млекопитающих при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток.

2.1. Шшучсние клеток источников цитопластов

Ооциты крупного рогатого скота получали иа антральных фолликулов (2-6 мм в диаметре) яичников, которые доставляли в лабораторию в течение 3-4 чае после убоя коров на мясокомбинате. Дозревание оонитов т Шго проводилось группой С метан иной И.Г. но методике отработанной в лаборатории.

В опытные группы отбирали только ооциты с первым полярным тельцем (на стадии метафазы II), через 20-24 час после постановки их на дозревание.

При реконструировании мышиных эмбрионов в качестве цитопластов были использованы энуклеированные ооциты на стадии метафазы II, полученные через 12-14 часов после введения самкам-донорам гибридных мышей F1 (CBAXC57BL) хорионического гона-дотропина человека (ХГч).

2.2. Получение клеток источников кариопластов

При реконструировании эмбрионов крупного рогатого скота в качестве кариопластов использовали свежеполученные клетки кумулюса округлой формы, размером 10-12 мкм.

В экспериментах по реконструированию мышиных ооцитов в качестве источника кариопластов использовали свежеполученные клетки кумулюса округлой формы, размером 10-12 мкм, атак же мышиные фетальные фибробласты, размером 15-20 мкм.

Для синхронизации мышиных фетальных фибробластов в фазах G2-M клеточного цикла их культивировали в течение 6-9 часов в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка (ЭТС) и 0,4 мкг/мл колцемида, который деполимеризует ту-булин митотического веретена. После этого флотирующие клетки собирали, отмывали от колцемида в ДМЕМ +10% ЭТС и использовали в качестве кариопластов.

2.3.Реконструирование клеток

Энуклеацию ооцитов и реконструирование клеток осуществляли микрохирургическим методом (McGrath J., Solter D., 1983), на установке, включающей в себя комплект микроманипуляторов фирмы "Narishiga" и инвертированный микроскоп типа «Diaphot-TMD» фирмы "Nikon", оснащённый оптикой дифференциально-интерференционного контраста (DIC по Номарскому).

Все микрохирургические манипуляции проводили в камере типа Фонбрюна. Основные инструменты для микрохирургических манипуляций изготавливали по методике, предложенной Фонбрюном (Fonbrune Р., 1949) в модификации Никитина В. А. (Никитин., 1986).

Перед микрохирургией группу ооцитов инкубировали в течение 20 мин в манипуля-ционной среде М2 (для ооцитов мыши) или среде Тироде-HEPES (Т-Н) (для ооцитов крупного рогатого скота), содержащих цитоскелетный ингибитор - цитохалазин Б в концентрации 5-7,5 мкг/мл.

Локализацию метафазной пластинки определяли методом флуоресцентной микроскопии. Клетки инкубировали в среде М2, содержащий 10 мкг/мл красителя Hoechst 33342 в течение 10 мин при 37°С, затем проводили микроскопию (5-10 сек) на флуоресцентном микроскопе типа MJI-2A.

При реконструировании единичные кариопласты (кумулюсные клетки или фибробласты) вводили в перивителлиновое пространство энуклеированных ооцитов через прокол в прозрачной оболочке.

2.4. Электрослияние кариопластов с цитопластами

Слияние цитопласта с кариопластом осуществляли с помощью контроллера электрослияния (ИБП РАН, г. Пущино) в камере с параллельными электродами в среде Циммермана (Zimmerman V. et al., 1982). Электрослияние осуществляли в два этапа: сначала с помощью переменного тока (500 кГц, 10 сек) ориентировали реконструированные клетки между электродами так, чтобы кариопласты и цитопласты располагались перпендикулярно электродам, и после этого подавали прямоугольные импульсы постоянного тока напряжением 1,5-2,0 кВ/см (для клеток крупного рогатого скота) и 2,0-3.3 кВ/см (для

мышиных клеток), продолжительностью 10 мксек. Слияние производили с помощью трех последовательных электрических импульсов с интервалом в 30 минут.

2.5. Активация цитопластов

Активацию проводили как на интактных (без энуклеации), так и на реконструированных мышиных ооцитах (через 1-1,5 часа после установления факта электрослияния). Ин-тактные ооциты на стадии метафазы II (МП) и цитопласты получали через 13 ч после введения ХГч самкам донорам яйцеклеток.

Реконструированные клетки и интактные ооциты крупного рогатого скота и мышей были разбиты на группы и подвергнуты различным вариантам физической и химической активации, о которых будет указано в разделе 3. Результаты исследований.

2.6. Культивирование реконструированных и партеногенетически активированных клеток

Реконструированные и партеногенетически активированные эмбрионы крупного рогатого скота культивировали в средах DMEM, KSOM и KSOM/AA.

В течение первых 48-ми часов клетки крупного рогатого скота культивировали в средах, обогащенных 4мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), а затем - 10% ЭТС.

Культивирование проводили в микрокаплях (10-12 эмбрионов на 1 каплю объемом 50-60 мкл) с фидерным слоем из клеток кумулюса коровы и без фидерного слоя, под слоем минерального масла («Sigma», США) в увлажненной атмосфере воздуха с 5% С02, либо под газовой фазой 5% С02; 5% 02; 90% N2 в течение 10 сут при 38,5 °С. При культивировании в KSOM или KSOM/AA через каждые 48 часов эмбрионы крупного рогатого скота переносили в капли свежей среды. Через каждые 24 часа регистрировали процесс развития эмбрионов.

Реконструированные и партеногенетически активированные мышиные эмбрионы культивировали так же в микрокаплях в средах Ml6, CZB, KSOM под слоем минерального масла в увлажненной атмосфере воздуха с 5% С02 в течение 96 часов при 37 "С. Через каждые 24 часа регистрировали процесс развития эмбрионов. Среды М2, Ml6, CZB и KSOM приготовили из реактивов фирмы «Sigma» (США) в условиях лаборатории.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение факторов, влияющих на изменение местоположения метафазной пластинки и полярного тельца в ооцитах крупного рогатого скота и мышей

Первым этапом в технологии реконструирования эмбрионов является получение ци-топласта путём удаления генетического ядерного материала яйцеклетки, т.е. энуклеация яйцеклетки. Неполное удаление хроматина из яйцеклетки приводит в дальнейшем к нарушению развития реконструированного эмбриона. Чаще всего энуклеацию яйцеклеток проводят «вслепую», ориентируясь на местоположение I полярного тельца (ПТ). Однако в многочисленных экспериментах, проведённых на мышиных яйцеклетках, было установлено, что энуклеация «вслепую» очень часто бывает неполной, при этом нередко удаляется только полярное тельце и не удаляется метафазная пластинка.

Для проведения более полной энуклеации яйцеклеток были предприняты попытки окрашивать ДНК хроматина с помощью витального флуоресцентного красителя Hoechst 33342. Однако для выявления ДНК хромосом, окрашенной этим красителем, яйцеклетку

необходимо нодоергнугь у л ьграфио л его лому (УФ) облучению, которое может оказать отрицательное влияние на дальнейшее развитие р еко н ст р у и рованных эмбрионов.

Для выяснения причин неудачной энуклеации яйцеклеток мщкопитающих нами была предпринята попытка изучить процесс миграции метафазной пластинки й мышиных оонйтах Mil, оау.шроваиших in vivo, и в ооцитах Mi Г крупного рогатого скота, дозревших in vitro, и выяснить факторы, влияющие на этот процесс.

Первая серия исследований была проведена на мышиных ооцитах, находящихся на стадии мегафазы II, полученных через 12, 13 и 14 часов после введения ову.чяторпой дозы ХГч самкам гибридных мышей F1 (CBA>'C57BL). Клетки кумулюса удаляли мягким пи-петированием в 0.1% растворе гиалуронидазьг н капле среды М2.

Местоположение метафазной пластинки в ооцитах МП определяли методом флуоресцентной микроскопии, jí результате чего были дифференцированы па три основные области расположения метафазной пластинки относительно I полярного тельца: 111 It 11 - прямо под полярным тельцем', ВО IT - близко в стороне от полярного тельца; ДСПТ - далеко в стороне от полярного тельца (рис. 2).

rtnni

(прямо под полярным тельцем)

БСПТ

(бгизко в стороне .от попарного тельца)

Щ . ft

ДСПТ

(далеко в стороне от попярною тельца)

Рис. 2. Местоположение метафазной пластинки я ооцитах МП.

I'. экспериментах па мышиных ооцитах. полученных через 12, 1,1 и 14 чаши иоелс введения самкам-донорам овуляториой дозы ХГч, местоположение метафазной пластинки не зависело от времени получения попитол в пределах данных экспериментов. В большинстве случаев (90%) метафазпая пластинка располагалась в области ДСПТ, в 10% случаев -в области ЬСШ (рис.3)

Следовательно, и мышиных ооцитах, подвергавшихся воздействию различных манипуляций, связанных с удалением клеток кумулюса. положение первого полярного тельца не является ориентиром локализации метафазной пластинки.

9 .Щ

% 90 80-И 70 60 50 40 30 20 10 0

Доля ооцитов

□ Область ПППТ Н Область БСПТ О Область ДСПТ

Рис.3. Местоположение метафазной пластинки в мышиных ооцитах MII, полученных через 12 - 14 ч после введения ХГч, и подвергнутых процессу снятия клеток кумулюса.

При детальном анализе полученных результатов было отмечено, не смотря на то, что в исследуемый период в большинстве случаев метафазная пластинка располагалась далеко в стороне от полярного тельца (вариант ДСПТ), но находилась она на периферии ооцита под цитоплазматнческой оболочкой, а не перемещалась в центр клетки, как следовало бы ожидать. Этот факт даёт основание полагать, что за короткое время наблюдений более интенсивно перемещается не метафазная пластинка к центру ооцита, а первое полярное тельце в перивителлиновом пространстве, как свободная структура, в процессе манипуляций, связанных с удалением клеток кумулюса.

Для выяснения этого предположения нами была проведена вторая серия экспериментов. Для того чтобы максимально исключить влияние манипуляций, связанных с удалением клеток кумулюса, на перемещение полярного тельца в перивителлиновом пространстве, были получены ооциты мыши на стадии метафазы I (MI). Ооциты на стадии MI извлекали из предовуляторных фолликулов методом аспирации, очищали от клеток кумулюса и ставили на дозревание до выделения I полярного тельца (стадия MII).

Полученные таким способом мышиные ооциты МИ были осторожно окрашены Hoechst 33342 и подвергнуты флуоресцентной микроскопии для идентификации расположения метафазной пластинки относительно первого полярного тельца.

Анализ результатов этого эксперимента показал (рис.4), что, в относительно спокойно лежащем ооците, в течение первых 3-4 часов после первого мейотического деления (выделения первого полярного тельца) не происходит существенной миграции метафазной пластинки относительно I полярного тельца, также как и полярного тельца относительно метафазной пластинки. И только через 5-6 часов после выделения I полярного тельца наблюдается смещение его относительно метафазной пластинки и перемещение метафазной пластинки к центру ооцита. Таким образом, полученные результаты показали, что причиной миграции I полярного тельца относительно метафазной пластинки в мышиных ооцитах на стадии MII, полученных методом вымывания ооцит-кумулюсных комплексов из яйцеводов мышей, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса. Следовательно, энуклеацию мышиных ооцитов на стадии MII следует проводить под микроскопом с дифференциально-интерференционным контрастом, при котором МИ визуализируется в виде просветленной зоны в ооплазме.

□ Область ПППТ 0 Область БСПТ

□ Область ДСПТ

Рис. 4. Изменение местоположения метафазной пластинки в мышиных ооцитах, дозревших in vitro, в зависимости от времени прошедшего с момента выделения первого полярного тельца.

Третья серия экспериментов была направлена на изучение местоположения метафазной пластинки в ооцитах МП крупного рогатого скота, дозревавших in vitro. Через 20 час после постановки на дозревание ооциты очищали от клеток кумулюса и продолжали культивировать в течение 3 час (II группа), 6 час (III группа) и 11 час (IVrpynna). Затем, по истечении указанного времени проводили флуоресцентную микроскопию ооцитов разных групп.

Таблица 1

Изменение местоположения метафазной пластинки в ооцитах крупного рогатого скота, дозревших in vitro, в зависимости от времени, прошедшего с момента постановки на дозревание

№№ гр. Время после постановки на дозревание (час) Местоположение метафазной пластинки (%)

ПППТ БСПТ ДСПТ

I 20 95,0 5,0 0

II 23 63,3 33,3 3,4

III 26 50,0 33,3 16,7

IV 31 17,4 47,8 34,8

Анализ данных (табл. 1), полученный в экспериментах на ооцитах крупного рогатого скота дозревавших in vitro, указывает на то, что в период с 20 до 26 часов с момента постановки ооцитов на дозревание положение I полярного тельца может являться ориентиром локализации метафазной пластинки. Возможно, это связано с меньшим размером перивителлинового пространства у ооцита крупного рогатого скота, чем у мышиного, что делает I полярное тельце коровьего ооцита менее подвижным относительно других структур яйцеклетки.

Результаты этих исследований указывают на то, что энуклеацию ооцитов крупного рогатого скота можно проводить «вслепую», путем аспирации части ооплазмы в области I полярного тельца, через 20-26 часов от начала постановки их на дозревание, с получением высокой доли энуклеированных яйцеклеток.

3.2. Определение оптимальных режимов электрослияния кариопластов и цито-пластов различного происхождения

В результате проведенных манипуляций по реконструированию клеток получали комплекс цитопласт-кариопласт, который состоял из двух частей: цитопласта - энуклеи-рованного ооцита и кариопласта - клетки кумулюса, разделенных цитоплазматическими мембранами. Для получения реконструированного эмбриона необходимо, чтобы карио-пласт (ядро клетки кумулюса) переместилось внутрь цитопласта. Это перемещение ядра и слияние его с цитопластом может произойти только при образовании пор в цитоплаз-матических мембранах клеток в результате воздействия на них некоторых химических или физических факторов. В последнее время для слияния кариопласта с цитопластом чаще всего используют постоянный электрический ток.

Многочисленными исследованиями установлено, что с увеличением напряжения прямоугольного импульса до определенного уровня возрастает эффективность слияния цитопласта с кариопластом. Однако при повышении напряжения выше этого уровня значительно увеличивается количество разрушенных клеток.

Идеальным объектом для изучения параметров электрослияния кариопластов с цито-пластами являются бластомеры в 2-клеточных эмбрионах, так как они имеют одинаковый размер и плотно прижаты друг к другу. В связи с этим площадь контакта цитоплазматиче-ских мембран у них больше, что является очень благоприятным условием для электрослияния. Исходя из этого, на первом этапе наших исследований для определения приемлемого напряжения прямоугольного импульса в качестве модели были использованы бластомеры 2-клеточных эмбрионов. После слияния эмбрионы культивировали в среде М16.

Таблица 2

Влияние величины прямоугольного импульса на эффективность слияния бластомеров в 2-клеточных мышиных эмбрионах и их развитие в условиях in vitro

№№ гр. Напряжение импульса (кВ\см) Кол-во эмбрио нов Слияние Развитие эмбрионов до стадии:

п % 2-4-кл. 8-16-кл. бластоцисты

п % п % п %

I 2,0 32 30 93,8±3,1 27 90,0±0,6 26 86,7±2,6 24 80,0±1,2

II 2,7 40 38 95,0±2,5 34 89,5±1,6 32 84,2±1,4 29 76,3±2,2

III 3,3 36 34 94,4±2,7 28 82,4±4,9 28 82,4±4,9 22 64,7±2,7

Полученные результаты (табл. 2) свидетельствуют, что повышение напряжения прямоугольного импульса с 2,0 кВ\см до 3,3 кВ\см достоверно не отразилось на эффективности слияния бластомеров. Однако, с увеличением напряжения импульса с 2,0 кВ\см до 3,3 кВ\см, доля слившихся бластомеров двуклеточных эмбрионов, сохранивших способность к развитию до стадии бластоцисты, достоверно (р<0,01) уменьшилась на 15,3%. Вероятно, повышение величины прямоугольного импульса до 3,3 кВ\см существенно увеличивает неблагоприятное воздействие электрического тока на эмбрион, и проявляется оно в

наиболее критический период развития - при переходе от стадии морулы к стадии бла-стоцисты.

Исходя из результатов этого исследования, для дальнейшей работы по реконструированию эмбрионов нами было выбрано в качестве ориентировочного напряжение прямоугольного импульса равное 2,0 кВ\см, которое обеспечивает высокую эффективность ( 94%) электрослияния бластомеров в 2-клеточных эмбрионах.

Однако при реконструировании эмбрионов крупного рогатого скота и мышей с использованием в качестве источников кариопластов соматических клеток различного происхождения, эффективность электрослияния резко снижалась (табл. 3), по сравнению с эффективностью слияния бластомеров в 2-клеточных эмбрионах (29,2-47,4% против 93,895,0%, соответственно). При этом эффективность слияния была несколько ниже при использовании в качестве источника кариопластов фетальных фибробластов, чем клеток кумулюса (29,2% против 37,4% соответственно).

Таблица 3

Электрослияние цитопластов с кариопластами различного происхождения

№№ гр. Кариопласт Цитопласт Количество комплексов цитопласт-кариопласт Эффективность электрослияния

п %

I клетка кумулюса мышиный ооцит 530 198 37,4±1,2

II клетка кумулюса мышиная зигота 60 24 40,0±2,6

III фетальный фибробласт мышиный ооцит 89 26 29,2±4,4

IV клетка кумулюса ооцит крупного рогатого скота 340 161 47,4±1,9

Относительно невысокая эффективность электрослияния цитопласта с кариопластом, при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток, по-видимому, обусловлена малой площадью контакта между цитопластом крупного размера и маленьким кариопластом (75-150 мкм против 10-12 мкм, соответственно). Кроме того, существенное значение имеют также различия между типами клеток по биохимическим свойствам клеточных мембран. В связи с этим, для каждого нового типа комплексов цитопласт-кариопласт необходимо проводить уточнение режима электрослияния.

Наряду с кариопластом в процессе электрослияния участвует и цитопласт, о влиянии которого на этот процесс известно очень мало. Проведенные нами исследования, по изучению влияния вида цитопласта на эффективность электрослияния, показали (табл. 4), что при использовании в качестве источника цитопластов, как оплодотворенных яйцеклеток (зигот), так и неоплодотворенных (ооцитов) не было отмечено существенной разницы в эффективности электрослияния цитопластов с кариопластами, источником которых были клетки кумулюса (40,0% и 36,0%, соответственно).

Таблица 4

Электрослияние кариопластов с цитопластами различного происхождения

№№ гр. Тип клеток-ргципиентов Количество комплексов цитопласт-кариопласт Напряжение импульса (кВ/см) Эффективность слияния

п %

I зиготы 20 2,0 8 40,0 ±10,0

II зиготы 40 3,3 16 40,0 ±0,9

III ооциты 278 2,0 100 36,0±1,9

Таким образом, проведенные исследования показали, что эффективность электрослияния цитоплагтов с кариопластами, источниками которых являются соматические клетки различного происхождения, значительно ниже, по сравнению с эффективностью слияния бластомеров в 2-клеточных эмбрионах. При этом фетальные фибробласты сливались с цитопластами хуже, чем клетки кумулюса. Отмечено, что цитопласты, полученные как из оплодотворенных, так и неоплодотворенных яйцеклеток сливаются с кариопластами с одинаковой эффективностью.

3.3. Анализ факторов влияющих на активацию реконструированных и партено-генетических эмбрионов

После электрослияния ядро клетки-донора попадает в цитоплазму энуклеированного ооцита и подвергается воздействию находящихся в ней факторов, от которых зависит дальнейшее развитие реконструированной клетки.

У большинства видов млекопитающих созревание ооцитов блокируется на стадии ме-тафазы второго мейотического деления (M II). Это блокирование осуществляется за счет действия фактора способствующего созреванию ооцита (maturation promoting factor, MPF).

Ядро соматической клетки (кариопласт), помещённое в энуклеированный ооцит (ци-топласт), сразу подвергается действию высокой активности MPF, в результате чего у него распадается ядерная оболочка, происходит преждевременная конденсация хромосом и оно переходит в состояние аналогичное стадии метафазы II мейоза. Для того чтобы вывести ядро реконструированной клетки из этого состояния и запустить митотическое деление клетки её необходимо активировать. В естественных условиях активация яйцеклетки происходит во время оплодотворения, когда сперматозоид, проходя через цито-плазматическую мембрану, запускает серию внутриклеточных колебаний концентрации ионов кальция (Са++). Эти внутриклеточные изменения концентрации Са++ в цитозоле, приводят к инактивации MPF и выводят ооцит из метафазной блокады, тем самым, запуская возобновление митотического цикла.

Оказалось, что не только воздействие сперматозоида на цитоплазматическую мембрану может вызывать серию колебаний концентрации внутриклеточного Ca+t, но и целый ряд искусственных физических и химических факторов, таких как электроимпульс, этанол и ряд других веществ.

До недавнего времени (1997-1998 гг.) в работах по клонированию животных в качестве активирующего агента широко использовали постоянный электрический ток, с помощью которого осуществляли электрослияние цитопласта с кариопластом и одновременно активацию реконструированных эмбрионов. Это выглядело довольно технологично, т.к.

одним действием осуществлялось и слияние кариопласта с цитопластом и активация реконструированных клеток.

На начальных этапах исследования нами также было проведено изучение влияния активации электрическим током клеток реконструированных с использованием цитопластов различного происхождения. В качестве источника кариопластов были использованы све-жеполученные клетки кумулюса, находящиеся в фазе С0-С1 клеточного цикла. Культивирование мышиных реконструированных эмбрионов проводили в среде М16 под газовой фазой - 5% С02 в воздухе.

Анализ результатов этих экспериментов показал (табл.5), что увеличение напряжения прямоугольного импульса с 2,0 до 3,3 кВ/см, при активации эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве цитопластов энуклеированных зигот, не оказало влияния на развитие эмбрионов до стадии бластоцисты (12,5% против 12,5%, соответственно). Не было отмечено достоверных различий в развитии до стадии морулы и при активации электрическим импульсом 2,0 кВ/см мышиных эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве цитопластов, как энуклеированных зигот, так и ооцитов (12,5% против 6,5%, соответственно). Дополнительная активация 7% этанолом сразу после активации электрическим импульсом эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве цитопластов энуклеированных ооцитов, достоверно повышала процент развития эмбрионов до стадии морулы с 6,5% до 42,6%. Однако, только лишь небольшая часть (3,7%) эмбрионов развивалась до стадии бластоцисты при тех же условиях культивирования.

Таблица 5

Развитие реконструированных мышиных эмбрионов в зависимости от состояния клеток-реципиентов и способа активации цитопластов

№№ гр. Тип клеток-реципиентов Кол-во реконстр. эмбрионов Активация Развитие реконструированных эмбрионов до стадии:

2-4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

п % п % п % п %

I зиготы 8 эл.имп. 2,0 кВ/см 8 100±0,0 4 50,0±13,3 1 12,5±10,0 0 0

II зиготы 16 эл.имп. 3,3 кВ/см 14 87,5±6,6 8 50,0±9,1 2 12,5±6,6 0 0

III ооциты 46 эл.имп. 2,0 кВ/см 43 93,5±3,1 25 54,3 ±2,5 3 6,5±2,8 0 0

IV ооциты 54 эл.имп. 2,0 кВ/см + этанол 47 87,0±3,1 34 63,0 ±3,5 23 42,6±4,5 2 3,7±3,0

Таким образом, активация мышиных эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер свежеполученных клеток кумулюса, только электрическим импульсом в процессе электрослияния или с последующей дополнительной активацией 7% этанолом, не позволяет получить приемлемого выхода клонированных эмбрионов на стадии бластоцисты.

В последние годы в зарубежной литературе появились сообщения, свидетельствующие о том, что при активации клеток искусственными активаторами часто происходит

только кратковременное снижение активности MPF, которая затем быстро восстанавливается и вызывает переход клеток в состояние нового метафазного ареста, получившего название - метафаза III. Кроме того, сообщалось, что разные агенты по разному воздействуют на процессы поступления ионов Ca"14" в цитозоль клетки и динамику изменения концентрации их в цитозоле. Основываясь на результатах этих сообщений, нами в дальнейших исследованиях в качестве активирующего агента был использован кальциевый ионо-фор А 23187, который в отличие от электрического тока и этанола высвобождает ионы Са++ только из собственных депо клетки и не способствует поступлению в цитозоль клетки экзогенного Са++ из культуральной среды. Кроме того, для предотвращения перехода ядра реконструированной клетки в состояние метафазы III их сразу после активации ио-нофором-Са4-1" культивировали в среде содержащей 6-диметиламинопурин (6-DMAP), в результате чего ингибировалось восстановление активности MPF.

На первом этапе наши исследования были направлены на выяснение оптимального времени воздействия кальциевым ионофором А 23187 на мышиные ооциты, с целью их активации к партеногенетическому развитию. Результаты, полученные в этих исследованиях (табл. 6), показали, что воздействие на интактные мышиные ооциты иопофором-Са++ в течение 1; 3; или 5 минут не оказало существенного влияния на развитие партеногене-тических эмбрионов до стадии морулы (100,0; 98,2 и 97,0%, соответственно). Однако, процент развития эмбрионов до стадии бластоцисты в группе ооцитов, подвергавшихся воздействию ионофора-Са"14" в течение 5-ти минут (III гр.), было достоверно ниже, по сравнению с другими группами (I и II гр.). По-видимому, более длительное воздействие на клетки ионофором-Са++ (III гр.), оказало определенное негативное влияние на развитие эмбрионов до стадии бластоцисты.

Таблица 6

Развитие партеногенетических мышиных эмбрионов in vitro в зависимости от продолжительности активации ионофором-Са4^

м» гр. Режим активации Кол. кл., шт Развитие партеногенетических эмбрионов до стадии:

2-кл. 4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

п % п % п % п % п %

I 1 мин ионо- фор-Са++ + 3 ч 6-DMAP 82 82 100±0,0 82 100±0,0 82 100±0,0 82 100±0,0 72 87,8±1,7

II 3 мин ионо- фор-Са++ + 3 ч 6-DMAP 56 55 98,2±1,7 55 98,2±1,7 55 98,2±1,7 55 98,2±1,7 48 85,7±2,2

III 5 мин ионо-фор-Са"14" + 3 ч 6-DMAP 67 67 100±0,0 67 100±0,0 65 97,0±1,8 65 97,0±1,8 52 77,6±1,8

Исходя из результатов этих исследований, в последующих экспериментах для активации мышиных реконструированных эмбрионов нами был выбран наиболее щадящий режим - 1 мин. ионофор-Са++ + 3 часа б-БМАР, так как он позволил при наименьшем времени воздействия на клетки ионофором-Са++ получить наивысший процент развития эмбрионов до стадии бластоцисты.

3.4. Влияние различных сред для культивирования in vitro на развитие партено-генетически активированных мышиных эмбрионов

На эффективность технологии клонирования влияет большое число факторов, среди которых существенное значение имеет среда для культивирования реконструированных эмбрионов.

Поэтому в серии экспериментов нами были протестированы среды по их влиянию на развитие партеногенетически активированных мышиных эмбрионов, которые часто используют как модельные объекты в экспериментах по культивированию эмбрионов млекопитающих. Было проведено сравнительное испытание трех культуральных сред, наиболее часто используемых для культивирования мышиных эмбрионов - Ml 6, CZB и KSOM.

Таблица 7

Развитие партеногенетических мышиных эмбрионов in vitro в различных культуральных средах

№№ гр. Среда культивирования Кол. кл., шт Развитие партеногенетических эмбрионов до стадии:

2-кл. 4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

п % п % п % п % п %

I М16 40 36 90,0±1,9 31 77,5±2,2 30 75,0±2,2 27 67,5±1,1 22 55,0±4,4

II CZB 38 37 97,4±2,2 35 92,1±1,0 35 92,1±1,0 33 86,8±3,8 32 84,2±2,9

III KSOM 54 52 96,3±3,3 50 92,6±2,8 50 92,6±2,8 50 92,6±2,8 48 88,9±3,1

Анализ результатов (табл. 7) свидетельствует о том, что наиболее подходящей средой для культивирования партеногенетически активированных мышиных эмбрионов является среда KSOM. Развитие до стадии бластоцисты в этой среде было выше на 4,7% чем в среде CZB (р<0,367), и на 33,9% (р<0,003) - чем в среде Ml6.

Различная жизнеспособность мышиных партеногенетических эмбрионов в различных культуральных средах обусловлена их составом, а также соотношением входящих в них компонентов.

Исходя из результатов этого эксперимента последующих работах для культивирования реконструированных и партеногенетически активированных мышиных эмбрионов была использована среда KSOM в сочетании с газовой фазой - 5% С02 в воздухе.

3.5. Развитие in vitro клонированных мышиных эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла

До 1999 г. считалось, что при использовании в качестве цитопластов энуклеированных ооцитов МИ, а в качестве кариопластов — ядер соматических клеток, кариопласт должен находиться в фазе G0-G1, так как только в этом случае сохраняется правильная плоид-ность хромосом в реконструированных клетках. Однако в 1999 г. появились работы Vir-gon с соавторами (на коровах) и Cibelli (на козах), согласно которым стадия клеточного цикла кариопласта при данном варианте реконструирования не имеет существенного значения.

С целью проверки объективности этого положения в отношении реконструированных мышиных эмбрионов нами было проведено две серии экспериментов.

В первой серии в качестве источника кариопластов были использованы свежеполу-ченные клетки кумулюса, которые по данным (Schuetz AW, Whittingham DG, Snowden R., 1996) находятся в фазах G0-G1 клеточного цикла. Во второй серии экспериментов в качестве источника кариопластов использовали фетальные фибробласты 3-го пассажа, синхронизированные в фазах G2-M клеточного цикла.

В обеих сериях экспериментов в качестве цитопластов были использованы энуклеи-рованные ооциты, находящиеся на стадии MIL Активацию реконструированных клеток проводили в режиме - ионофор-Са++ (1 мин) + 6-DMAP (3 час). Культивирование реконструированных эмбрионов проводили в среде KSOM под газовой фазой - 5% С02 в воздухе.

Таблица 8

Развитие in vitro клонированных мышиных эмбрионов, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер клеток, находящихся в разных фазах клеточного

цикла

Фазы кл. цикла карио-пласта Кол-во коплексов цитопласт-кариопласт Кол-во реконструированных эмбрионов Развитие клонированных эмбрионов до стадии:

2-4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

п % п % п % п %

G0-G1 252 98 95 96,9±1,6 73 74,5±4,1 60 61,2±4,6 25 49,0±2,4

G2-M 23 6 5 83,3±12,5 5 83,3±12,5 4 66,7±25,0 3 50,0±0,0

Анализ результатов этих экспериментов показал (табл. 8), что при использовании в качестве источника кариопластов свежеполученных клеток кумулюса, находящихся в фазах G0-G1 клеточного цикла (I гр.), 96,9% реконструированных клеток вступало в стадию деления дробления и 49% достигло стадии бластоцисты.

При использовании в качестве источника кариопластов фетальных фибробластов, синхронизированных в фазах G2-M клеточного цикла (II гр.), в деление дробления вступило 83,3% реконструированных клеток и 50,0% их достигло стадии бластоцисты, то есть не было отмечено существенной разницы между группами. Кроме того, эти исследования показали, что проведение активации ионофором-Са++ (1 мин) + 6-DMAP (3 час) и культивирование в среде KSOM позволило повысить количество реконструированных клеток, сохраняющих способность к дроблению до стадии морулы, и значительно повысить развитие эмбрионов до стадии бластоцисты, по сравнению с активацией электрическим импульсом + 7% этанол и культивированием в среде Ml6 (табл. 5).

Таким образом, результаты этих исследований показали, что, по крайней мере, при реконструировании мышиных эмбрионов, в качестве источников кариопластов могут быть использованы клетки, находящиеся как в фазах G0-G1 клеточного цикла, так и в фазах G2-M.

3.6. Изучение влияния различных культуральных систем на развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro

Как известно для клонирования наиболее желательным объектом из сельскохозяйственных животных является крупный рогатый скот. Но корова является малоплодным животным, и получить от неё достаточное количество яйцеклеток, необходимых для

использования их в качестве цитопластов, весьма проблематично. Кроме того, получить от коровы яйцеклетки нехирургическим методом очень трудоёмко и дорого.

В связи с этим, наиболее приемлемым вариантом выглядит использование для работ по клонированию яйцеклеток крупного рогатого скота, полученных in vitro. В отличие от многоплодных животных, у которых реконструированные клетки можно трансплантировать животным-реципиентам хирургическим способом сразу после активации и кратковременного культивирования, у крупного рогатого скота хирургический вариант трансплантации реконструированных клеток не приемлем из-за большой трудоёмкости. Поэтому реконструированные эмбрионы крупного рогатого скота, наиболее целесообразно культивировать in vitro до стадии бластоцисты и полученные бластоцисты трансплантировать в матку коров-реципиентов нехирургическим способом.

Для выявления наиболее приемлемой системы культивирования реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота было проведено исследование влияния различных условий культивирования на их развитие до стадии бластоцисты.

Реконструированные эмбрионы культивировали в следующих условиях:

I гр. - в среде DMEM под газовой фазой - 5% С02 в воздухе;

II гр. - в среде DMEM на фидерном слое, состоящем из клеток кумулюса коровы, под газовой фазой - 5% С02 в воздухе.

Таблица 9

Развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота в среде ЭМЕМ в различных культуральных системах

№№ гр. Кол-во комплексов цитопласт-кариопласт Эффективность слияния Развитие реконструированных эмбрионов до стадии:

2-4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

п п % п % п % п % п %

I 34 19 55,9±5,1 7 36,8±3,2 4 21,0±4,0 1 5,3±4,8 0 0±0

II 134 64 47,8±3,7 46 71,9±9,5 39 60,9±10,1 26 40,6±10,6 13 20,3±12,4

В результате проведенных экспериментов (табл. 9) установлено, что, при культивировании реконструированных эмбрионов в среде БМЕМ под газовой фазой 5% С02 в воздухе развитие основной массы эмбрионов останавливалось на стадии 8-16-ти бластомеров и только небольшая часть их (5,3%) достигала стадии морулы. Однако при культивировании реконструированных клеток в той же газовой фазе, но на фидерном слое, состоящем из клеток кумулюса, 71,9% реконструированных эмбрионов развивалось до стадии 2-4-х бластомеров, стадии 8-16-ти бластомеров достигали 60,9% эмбрионов, и 40,6% - достигли стадий морулы, 20,3% - стадии бластоцисты.

Улучшение условий культивирования за счёт использования фидерного слоя из клеток кумулюса обусловлено тем, что многие клеточные линии при своём размножении выделяют цитокины, такие как фактор роста фибробластов и фактор ингибирования лейкемии, которые оказывают благоприятное влияние на развитие эмбрионов.

При использовании фидерного слоя (II гр.) более чем 50% реконструированных эмбрионов проходят 8-16-клеточный блок. Большая часть 8-16-клеточных эмбрионов достигает стадии морулы. Однако дальнейшее развитие реконструированных клеток до стадии

бластоцисты существенно тормозится. Вероятно, такая остановка в развитии эмбрионов связана с недостатком некоторых субстратов, которые для своего питания используют и клетки фидерного слоя.

Таким образом, проведенные исследования показали, что цитопласты, полученные путём энуклеации ооцитов крупного рогатого скота, дозревавших in vitro, способны репро-граммировать кариопласты соматических клеток и обеспечивать их развитие, по крайней мере, до стадии морулы/бластоцисты. Использование фидерного слоя из клеток кумулюса позволяет культивировать реконструированные клетки до стадии морулы/бластоцисты в атмосфере воздуха с 5% С02.

Однако, хотя система культивирования реконструированных эмбрионов на фидерном слое, состоящем из клеток кумулюса, и позволяет получать удовлетворительные результаты, условия культивирования, создаваемые в данной системе, слишком вариабельны и не стабильны из-за невозможности получения одинакового фидерного слоя в разных экспериментах. Кроме того, для поддержания жизнедеятельности клеток фидерного слоя концентрация глюкозы в культуральной среде необходима в пределах 5 г\л, тогда как для развития эмбрионов — 1г/литр. Это различие в потребности глюкозы необходимо постоянно учитывать и каким-либо образом нивелировать, т.к. повышенное содержание глюкозы отрицательно влияет на развитие эмбриона на ранних стадиях (от зиготы до 8-16-кл. стадии). Поэтом}' наиболее технологичными признаются культуральные системы, без использования фидерного слоя.

При культивировании in vitro обычных эмбрионов крупного рогатого скота, в отличие от мышиных, используются системы культивирования под газовой фазой - 5% С02, 5% 02 , 90% N2, содержащей низкую концентрацию 02. Кроме того, в предыдущих экспериментах нами были получены обнадеживающие результаты при культивировании реконструированных мышиных эмбрионов в среде KSOM под газовой фазой- 5% С02 в воздухе. Исходя из этого, нами была предпринята попытка создать систему для культивирования реконструированных и партеногенетически активированных эмбрионов крупного рогатого скота, основанную на использовании среды KSOM под газовой фазой - 5% С02, 5% 02, 90% N2.

Среда KSOM представляет собой оптимизированную синтетическую среду яйцевода мышей. Особенностью этой среды является оптимизированное соотношение солей металлов (в частности калия и магния), энергетических компонентов (соотношение лактат / пируват = 50) и наличие EDTA, для связывания следовых количеств тяжелых металлов в среде.

В первой серии экспериментов в качестве контрольной модели для испытания новой культуральной системы были использованы ооциты крупного рогатого скота, активированные к партено генетическому развитию.

Культивирование партеногенетических эмбрионов крупного рогатого скота проводили по следующей схеме:

I гр. - в среде KSOM +10% ЭТС под газовой фазой- 5% С02, 5% 02, 90% N2;

II гр. - в среде KSOM/AA+10% ЭТС (с добавлением заменимых и незаменимых аминокислот по прописи для среды MEM), под газовой фазой- 5% С02, 5% 02, 90% N2.

При культивировании яйцеклеток крупного рогатого скота, активированных к парте-ногенетическому развитию, в среде KSOM под газовой фазой- 5% С02, 5% 02, 90% N2 в деление дробления вступило 53,3% яйцеклеток, до стадии морулы развилось 20,0% партеногенетических эмбрионов и только 6,7% достигло стадии бластоцисты. Однако когда в среду KSOM были добавлены заменимые и незаменимые аминокислоты, в концентрациях по прописи для среды MEM, количество партеногенетических эмбрионов, развившихся до стадии бластоцисты, увеличилось до 22,3% (табл. 10).

Этот факт даёт основание считать, что обогащение среды КЭОМ заменимыми и незаменимыми аминокислотами улучшает условия культивирования яйцеклеток крупного рогатого скота, активированных к партеногенетическому развитию.

Таблица 10

Развитие партеногенетических эмбрионов крупного рогатого скота в средах КБОМ и КЗОМ/АА под газовой фазой 5% С02, 5% 02,90%

№№ гр. Кол-во ооцитов Развитие партеногенетических эмбрионов до стадии:

2-4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

п % п % п % п %

I 15 8 53,3 5 33,3 3 20,0 1 6,7

II 130 63 48,5 48 36,9 35 26,9 29 22,3

На основании результатов исследований первой серии экспериментов была проведена вторая серия экспериментов, в которой реконструированные эмбрионы культивировали по схеме, использованной для партеногенетических эмбрионов (первая серия).

Анализ результатов этой серии экспериментов показал (табл. 11), что практически одинаковый процент реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота достигал стадии бластоцисты как в I, так и во II группе (22,2 и 23,7%, соответственно). Из результатов этого эксперимента следует, что добавление к среде К80М заменимых и незаменимых аминокислот не оказало видимого влияние на развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты в отличие от партеногенетических эмбрионов, которые хуже развивались в среде без аминокислот (табл. 10). Этот факт, по-видимому, свидетельствует о том, что для развития яйцеклеток активированных к партеногенетическому развитию требуются культуральные условия более высокого уровня.

Таблица 11

Развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота в средах КЭОМ и КЭОМ/АА под газовой фазой 5% С02, 5% 02, 90% И2

№№ гр. Количество комплексов цитопласт-кариопласт Эффективность слияния Развитие реконструированных эмбрионов до стадии:

2-4-кл. 8-16-кл. морулы бластоцисты

п % п % п % п % п %

I 28 9 32,1±5,9 4 44,4±5,0 4 44,4±5,0 4 44,4±5,0 2 22,2±2,5

II 82 38 46,3±2,6 19 50,0±4,7 13 34,2±2,7 10 26,3±9,1 9 23,7±9,8

В данном эксперименте нами не было обнаружено разницы в развитии реконструированных эмбрионов при культивировании их в среде без аминокислот и с добавлением аминокислот (22,2 и 23,7%, соответственно). По-видимому, этот факт можно объяснить тем, что в этом эксперименте по технологическим причинам результаты исследований

оценивались только по развитию реконструированных эмбрионов до стадии ранней бластоцисты, и не исследовалось качество этих бластоцист, их способность к дальнейшему развитию и выходу из блестящей оболочки.

Таким образом, результаты этого эксперимента показали, что в культуральной системе, основанной на использовании среды KSOM и KSOM/AA под газовой фазой 5% С02, 5% 02, 90% N2, развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота происходит с такой же эффективностью, как и на фидерном слое, состоящем из клеток кумулю-са. Однако культуральная система без использования фидерного слоя более технологична и наиболее стабильна, т.к. лишена такого вариабельного фактора, как монослой клеток кумулюса.

4. ВЫВОДЫ

1. В мышином ооците на стадии метафазы II, не подвергавшемся сильным механическим воздействиям, в течение первых 3-4 часов после первого мейотического деления, не происходит существенной миграции ни метафазной пластинки относительно I полярного тельца, ни I полярного тельца относительно метафазной пластинки. Причиной миграции I полярного тельца относительно метафазной пластинки в ооцитах мыши на стадии Mil, полученных методом вымывания ооцит-кумулюсных комплексов из яйцеводов мышей, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса и различными перемещениями ооцита.

2. В ооцитах МП крупного рогатого скота, дозревших in vitro, через 20-23 часа после постановки их на дозревание метафазная пластинка располагается прямо под I полярным тельцем либо близко в стороне от полярного тельца в 96,6 - 100% случаев. Механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса с ооцита не оказывают существенного влияния на смещение полярного тельца относительно метафазной пластинки.

3. При активации мышиных клеток, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер свежеполученных клеток кумулюса, только электрическим током в процессе электрослияния, не наблюдается развития реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты. При дополнительной активации 7% этанолом сразу после электрослияния определённая часть (3,7%) реконструированных эмбрионов развивается до стадии бластоцисты.

4. Активация яйцеклеток мыши к партеногенетическому развитию ионофором-Са++ с последующим трех часовым культивированием в среде содержащей 6-DMAP, приводит к значительному повышению доли развития эмбрионов до стадии бластоцисты, по сравнению с активацией электрическим током и 7% этанолом. Уменьшение времени экспозиции мышиных яйцеклеток в ионофоре-Са++ с 5 минут до 1 минуты существенно не сказывается на эффективности активации, однако позволяет увеличить долю развития партеногенетически активированных эмбрионов до стадии бластоцисты (87,8% против 77,6%, соответственно).

5. Для культивирования партеногенетически активированных мышиных эмбрионов до стадии бластоцисты наиболее подходящими являются среды KSOM (88,9% от числа активированных эмбрионов) и CZB (84,2%). В меньшей степени для этого подходит среда М16 (55,0%).

6. При реконструировании мышиных эмбрионов в качестве источников кариопластов могут быть использованы как клетки находящиеся в фазах G0-G1, так и в фазах G2-М с одинаковой эффективностью развития реконструированных эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты.

7. Цитопласты, полученные путём энуклеации ооцитов крупного рогатого скота, дозревавших in vitro до стадии метафазы II в течение 20 часов, способны репрограмми-ровать кариопласты соматических клеток и обеспечивать их развитие, по крайней мере, до стадии бластоцисты.

8. Использование фидерного слоя из клеток кумулюса коровы позволяет культивировать реконструированные эмбрионы крупного рогатого скота до стадии бластоцисты в среде DMEM под газовой фазой - 5% С02 в воздухе. Для культивирования реконструированных и партеногенетически активированных эмбрионов крупного рогатого скота без фидерного слоя может быть использована среда KSOM, обогащенная незаменимыми и заменимыми аминокислотами, под газовой фазой- 5% С02, 5% 02, 90% N2.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Удаление клеток кумулюса с мышиных ооцитов Mil, предназначенных для получения цитопластов, необходимо проводить преимущественно с помощью 0,1% раствора гиалуронидазы и в меньшей степени с использованием пипетирования и особенно обработки на вортексе.

2. Энуклеацию мышиных яйцеклеток МП необходимо проводить по положению мета-фазной пластинки, которая визуализируется в виде просветленной зоны, а не по расположению I полярного тельца.

3. В работах по клонированию крупного рогатого скота энуклеацию ооцитов МП, дозревавших in vitro, целесообразно проводить «вслепую», через 20-23 часа после постановки на дозревание, путем удаления первого полярного тельца и части прилегающей к нему цитоплазмы.

4. Для активации реконструированных клеток к митотическому делению и дальнейшему развитию эмбрионов целесообразно обрабатывать их ионофором-Са++ (10 мкМ) в течение 3 минут для клеток крупного рогатого скота и в течение 1 минуты — для мышиных, с последующим культивированием в течение 3 часов в среде содержащей 6-DMAP (2 мМ).

5. В работах по клонированию крупного рогатого скота для культивирования реконструированных эмбрионов целесообразно использовать среду KSOM/AA без фидерного слоя или DMEM в сочетании с фидерным слоем.

СПИСОК

работ опубликованных по теме диссертации

1. Кириенко К.В., Логинов А.Г., Алгулян A.C., Рябых В.П. Развитие партено-генетических и реконструированных мышиных эмбрионов при разных вариантах активации. // Материалы Международной научно практической интернет-конференции «Управление функциональными системами организма», Аргус, 2006, с. 28-31.

2. Кириенко К.В., Логинов А.Г., Сметанина И.Г., Татаринова Л.В., Алгулян A.C., Рябых В.П. Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота при использовании в качестве цитопластов ооцитов, дозревавших in vitro. II Материалы IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006, с. 240-242.

3. Кириенко К.В., Логинов А.Г., Алгулян A.C., Рябых В.П. Развитие партено-генетических и реконструированных мышиных эмбрионов в зависимости от способа их активации. // Материалы IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве», Боровск, 2006, с. 242-243.

4. Кириенко К.В., Логинов А.Г., Алгулян A.C., Рябых В.П. Развитие партеногенетических и реконструированных мышиных эмбрионов в зависимости от режима активации. // Материалы VI Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубро-вицы, 2006, с. 70-73.

5. Логинов А.Г., Кириенко К.В., Сметанина И.Г., Татаринова Л.В., Алгулян A.C., Рябых В.П. Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота при использовании в качестве кариопластов соматических клеток. // Материалы VI международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Дубровицы, 2006, с. 133-135.

6. Кириенко К.В. Влияние способа активации на развитие партеногенетических и реконструированных мышиных эмбрионов. И Материалы IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, 2006, с. 98-99.

7. Логинов А.Г., Кириенко К.В., Сметанина И.Г., Татаринова Л.В., Алгулян A.C., Рябых В.П. Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота при использовании в качестве цитопластов ооцитов, дозревавших in vitro. II Материалы IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, 2006, с. 138-139.

8. К.В. Кириенко, А.Г. Логинов, A.C. Алгулян, И.Г. Сметанина, Л.В. Татаринова, В.П. Рябых. Получение клонированных эмбрионов крупного рогатого скота путем трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные ооциты, дозревавшие in vitro. II Сельскохозяйственная биология, 2007, № 4. с. 53 -61.

Издательство ВНИИФБиП с/х животных Лицензия ИД № 03641 Тираж 100 экз. 249013. г. Боровск. Калужская обл., пос. ВНИИФБиП

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кириенко, Константин Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методические приемы клонирования.

1.2. Активация.

1.3. Влияние типа клеток-доноров и их генотипа на результативность технологии клонирования.

1.4. Влияние фазы клеточного цикла ядра донора на эффективность клонирования.

1.5. Влияние условий культивирования in vitro на развитие эмбрионов млекопитающих.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

II. Объекты и методы исследований.

2.1. Получение клеток источников цитопластов.

2.2. Получение клеток источников кариопластов.

2.3. Реконструирование клеток.

2.4. Слияние кариопластов с цитопластами.

2.5. Активация цитопластов.

2.6. Культивирование реконструированных и партеногенетически активированных клеток.

2.7. Трансплантация реконструированных эмбрионов самкам реципиентам.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Изучение факторов, влияющих на изменение местоположения метафазной пластинки и полярного тельца в ооцитах крупного рогатого скота и мышей.

3.2. Определение оптимальных режимов электрослияния кариопластов и цитопластов различного происхождения.

3.3. Анализ факторов влияющих на активацию реконструированных и партеногенетических эмбрионов.

3.4. Влияние различных сред для культивирования in vitro на развитие партеногенетически активированных мышиных эмбрионов.

3.6. Изучение влияния различных культуральных систем на развитие реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro.

3.7. Развитие партеногенетических и реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота в средах KSOM и KSOM/AA под газовой фазой (5% С02; 5% 02; 90% N2).

ВЫВОДЫ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота и мышей in vitro, в зависимости от условий их реконструирования и культивирования"

Актуальность исследований.

Исследования по разработке технологии клонирования наиболее интенсивно стали развиваться с 1997 года - после получения овечки Долли, когда было показано, что в организме взрослых животных имеются недифференцированные клетки, обладающие тотипотентными свойствами, которые могут быть использованы в качестве источников кариопластов для реконструирования клеток с целью клонирования животных (Wilmut I. et al.,

1997). В настоящее время в мире получено потомство многих видов животных из клеток, реконструированных при использовании в качестве кариопластов ядер клеток взрослых животных (Wakayama Т, Yanagimachi R. , 1998; Wells D. et al., 1997,1999; Kubota K. et al., 2000). Однако, несмотря на то, что за последние годы в области клонирования животных достигнуты определенные успехи, они пока в большей степени носят эмпирический характер, поэтому положительные результаты сильно варьируют от эксперимента к эксперименту. Основной причиной такой нестабильности результатов является недостаточность фундаментальных знаний о глубинных механизмах, обусловливающих процесс репрограммирования кариопластов цитопластами, и факторов, влияющих на этот процесс.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что в лучших экспериментах, при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток взрослых животных, у некоторых видов млекопитающих удается получить определенный процент бластоцист (20%-у овец: Schnieke A. et al., 1997; Wilmut I. et al., 1997; до 40%- у мышей: Wakayama Т. et al., 1998; до 20%- у крупного рогатого скота: Kato Y. et al.,

1998). Однако средние показатели получения живого потомства у этих видов варьируют от 1 до 3% от числа пересаженных эмбрионов (Wilmut I. et al., 1997; Wakayama Т. et al., 1998). Такие низкие показатели получения клонированного живого потомства большинство исследователей объясняет следствием ненадлежащего репрограммирования кариопласта цитопластом, что приводит ко многим аномалиям эмбрионального развития.

Успешное получение потомства в результате пересадки ядер достигается только при благоприятном взаимодействии сложнейших биологических процессов и регулирующих их факторов, многие из которых в настоящее время еще плохо изучены.

От момента получения клеток источников цитопластов и клеток-доноров кариопластов до получения живого потомства стоит целый ряд экспериментальных манипуляций и большое количество малоизученных механизмов, препятствующих развитию реконструированных клеток. Поэтому, в настоящее время проводится более глубокое исследование каждого этапа технологии клонирования. Начиная от исследований влияния полноты энуклеации яйцеклеток при получении цитопластов и заканчивая исследованиями влияния стадий клеточного цикла кариопласта на дальнейшее развитие реконструированного эмбриона.

Уже первые результаты этих исследований показали, что некоторые методические приемы, используемые ранее при реконструировании клеток, оказывают существенное отрицательное влияние на развитие, как эмбриона, так и плода.

В связи с широким использованием ядер соматических клеток взрослых животных в качестве кариопластов при реконструировании клеток, возникли проблемы с электрослиянием из-за уменьшения площади контакта между цитопластом и кариопластом значительно меньшего размера. Чтобы повысить процент слияния исследователи вынуждены повышать напряжение электрического импульса, что приводит к длительной дестабилизации цитоплазматической мембраны цитопласта и снижению жизнеспособности реконструированных клеток. Кроме того, из-за различий между типами клеток по биохимическим свойствам липидов клеточных мембран необходимо оптимизировать параметры и условия электрослияния для каждой клеточной линии.

Для того чтобы происходило дальнейшее развитие реконструированных клеток, необходимо активировать цитопласт, то есть индуцировать в нем программу развития, первоначально контролируемую цитоплазматическими факторами ооцита, освобождая его от мейотической задержки. После пересадки ядра нормальное развитие реконструированной клетки будет зависеть от способности цитопласта ремоделировать структуру хроматина и соответствующим образом репрограммировать характер экспрессии генов кариопласта. Зрелый цитопласт содержит материнские транскрипты РНК и белки, которые направляют развитие дробящегося эмбриона до нормального времени активации собственного генома эмбриона, когда эмбриональные ядра начинают синтез своей собственной РНК, направляющей эмбриогенез.

Установлено, что у млекопитающих активация яйцеклеток, индуцированная сперматозоидом в процессе оплодотворения, сопровождается серией повторных повышений концентраций внутриклеточного свободного кальция, которые продолжаются несколько часов. В последнее время предпринимаются многочисленные попытки искусственно активировать яйцеклетки с помощью физических и химических агентов, однако проблема остается еще далеко не решенной.

Некоторые успехи в получении живого потомства при использовании в качестве кариопластов ядер соматических клеток взрослых животных достигнуты благодаря исследованиям влияния стадий клеточного цикла донорского ядра и цитопласта-реципиента на развитие реконструированных клеток (Campbell К. et al., 1996). Эти первые немногочисленные исследования показали, что для нормального развития реконструированных клеток необходима координация клеточных циклов кариопласта и цитопласта, чтобы обеспечить в реконструированной клетке диплоидный набор хромосом после первого деления дробления.

При помощи технологии клонирования становится возможным получение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) из внутренней клеточной массы клонированных предъимплантационных бластоцист человека. Причем, такие ЭСК не будут вызывать иммунного ответа со стороны организма, от которого были получены клетки-доноры кариопластов.

Изучение ЭСК открывает принципиально новый уровень развития науки в целом, позволяет познать сложнейшие процессы, происходящие в клетках в период эмбриогенеза и предоставляет возможность не только обосновать, но и внедрить в жизнь особую отрасль медицины — регенеративно-пластическую терапию (лечение заболеваний системы крови, врожденных иммунодефицитных состояний, генетических заболеваний человека, дегенеративных заболеваний нервной ткани, поражений кожи, слизистых оболочек, хрящей). Исследования в данной области позволят в будущем разработать новые методы терапии широкого спектра заболеваний, ряд из которых до последнего времени считались неизлечимыми.

Цель и задачи исследований.

- определить местоположение метафазной пластинки относительно I полярного тельца в яйцеклетках разных видов млекопитающих и выявить факторы, влияющие на его изменение, в связи с энуклеацией;

- определить оптимальные режимы электрослияния кариопласта с цитопластом при реконструировании клеток разных видов млекопитающих;

- изучить влияние условий активации цитопластов на репрограммирование кариопластов;

- изучить развитие эмбрионов, реконструированных с использованием кариопластов, находящихся в разных фазах клеточного цикла;

- найти оптимальные системы культивирования реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота и мышей.

Научная новизна исследований.

Установлено, что цитопласты, полученные путём энуклеации ооцитов крупного рогатого скота, дозревавших in vitro в течение 20-23 часов, способны репрограммировать ядра соматических клеток взрослых животных и обеспечивать развитие реконструированных эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты.

Установлено, что воздействие фактором, ингибирующим фосфорилирование белков - 6-диметиламинопурином (6-DMAP), на реконструированные клетки крупного рогатого скота и мышей сразу после активации их ионофором-Са++ препятствует переходу этих клеток в метафазу III, и способствует их дальнейшему развитию до стадии бластоцисты.

Впервые показано, что эмбрионы крупного рогатого скота, реконструированные путём трансплантации ядер клеток кумулюса взрослых животных в энуклеированные ооциты, дозревавшие in vitro, развиваются до стадии бластоцисты в простой синтетической среде яйцевода мышей с оптимизированным содержанием калия (KSOM), под газовой фазой - 5% С02, 5%02,90%N2.

Практическая значимость.

Система культивирования в среде DMEM на фидерном слое под газовой фазой 5% С02 в воздухе, а также в среде KSOM и KSOM с добавлением заменимых и незаменимых аминокислот (KSOM/AA) под газовой фазой 5% С02, 5% 02, 90% N2, может быть использована для культивирования естественно оплодотворенных, партеногенетически активированных и реконструированных эмбрионов крупного рогатого скота.

Положения выносимые па защиту.

1. В мышином ооците, находящемся на стадии метафазы II, в течение первых 3-4 часов после первого мейотического деления не происходит существенной миграции ни метафазной пластинки относительно I полярного тельца, ни I полярного тельца относительно метафазной пластинки. Причиной интенсивной миграции I полярного тельца в перивителлиновом пространстве относительно метафазной пластинки, наблюдаемой в мышиных ооцитах при энуклеации, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса.

3. Воздействие фактором, ингибирующим фосфорилирование белков, на реконструированные клетки крупного рогатого скота и мышей сразу после активации их ионофором-Са++, препятствует переходу этих клеток в стадию метафазы III.

Апробация работы.

Международной научно практической интернет-конференции «Управление функциональными системами организма» (г. Ставрополь, 2006 г.)

- IV Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (г. Боровск, 5-7 сентября 2006 г.)

- IV съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (г. Пущино, 6-7 декабря 2006 г.)

I, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Клон (от греч. kion — ветвь, отпрыск) - популяция клеток или организмов, происшедших от общего предка путем бесполого размножения.

Клонирование животных - искусственное получение генетически идентичных организмов с помощью экспериментальных манипуляций с яйцеклетками (ооцитами) и ядрами соматических клеток животных in vitro и in vivo.

Клонирование животных достигается в результате переноса ядра из дифференцированной клетки в яйцеклетку, у которой удалено собственное ядро (энуклеированная яйцеклетка), с последующей пересадкой реконструированного эмбриона в половые пути приемной матери. Первые успешные опыты по клонированию животных (50-е годы XX века) показали, что техника трансплантации ядер из соматических клеток взрослых организмов в энуклеированные ооциты позволяет получать генетические копии организма, послужившего донором ядер дифференцированных клеток, и стало основанием для вывода об обратимости эмбриональной дифференцировки генома.

Появление технологии клонирования животных вызвало не только большой научный интерес, но и привлекло внимание крупных компаний и финансового бизнеса во многих странах. Использование технологии клонирования предоставляет уникальную возможность получать фенотипически и генетически идентичных животных, которые могут быть использованы для решения различных теоретических и практических задач, стоящих перед биомедициной и сельским хозяйством. В частности, использование клонирования животных должно способствовать изучению проблемы тотипотентности дифференцированных клеток, развития и старения организмов, злокачественного перерождения клеток. Благодаря технологии клонирования появилась возможность ускоренной генетической селекции и тиражирования животных с рекордными производственными показателями. В сочетании с трансгенозом клонирование животных открывает дополнительные возможности для производства ценных биологически активных веществ (белков), используемых для лечения различных заболеваний человека. Клонирование животных позволит проводить испытания медицинских препаратов на идентичных животных. В медицине представляется перспективной клеточная терапия на базе использования клонированных клеток. Такие клетки должны компенсировать недостаток или дефект собственных клеток организма и, главное, не будут отторгаться при трансплантации. Технология клонирования животных позволит, по-видимому, осуществлять и широкомасштабную ксенотрансплантацию органов, т. е. замену отдельных органов человека на соответствующие органы клонированных животных.

В вопросе клонирования человека в настоящее время существует как техническая, так и большая этическая проблемы. В большом числе стран использование данной технологии применительно к человеку официально запрещено и преследуется по закону (США, Франция, Германия, Япония). Это, однако, не исключает окончательно возможность ее использования в будущем, после детального изучения молекулярных механизмов взаимодействия цитоплазмы ооцита-реципиента и ядра соматической клетки-донора, а также совершенствования самой техники клонирования животных.

Принципиальная возможность клонирования позвоночных животных была установлена в начале 50-х годов после успешных опытов американских исследователей Бриггса и Кинга по трансплантации ядер клеток зародышей в энуклеированные яйцеклетки лягушек (Briggs R., King F., 1952). Эти авторы показали, что ядра клеток зародышей Rana pipiens на стадии поздней бластулы и ранней гаструлы обладают тотипотентными свойствами, поскольку способны обеспечивать нормальное развитие.

Клонирование млекопитающих представляет более сложную задачу по сравнению с клонированием амфибий, что связано в первую очередь с очень малыми размерами яйцеклеток млекопитающих. Небольшой объем яйцеклетки млекопитающих лимитирует количество вводимого материала и увеличивает ее ранимость при трансплантации ядра.

В 1983 году появились сообщения (McGrath J., Solter D., 1983 а,б) об успешной ядерной пересадке у мышей с использованием двух методов микрохирургического удаления пронуклеусов из оплодотворенной яйцеклетки и трансплантации под прозрачную оболочку чужеродных пронуклеусов, а также ядер бластомеров 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов и слияния кариопласта с цитопластом инактивированным вирусом Сендай.

При пересадке пронуклеусов развитие проходило столь же успешно, как и развитие интактных эмбрионов: соответственно 96% и 100% эмбрионов развивалось до предимплантационной стадии, и 16% и 15% после имплантации.

McGrath J. и Solter D. (1983 а,б; 1984) удаляли пронуклеусы без прокалывания плазматической мембраны зиготы, медленным всасыванием в пипетку пронуклеусов с частью цитоплазмы, окруженной плазматической мембраной.

После выведения такого комплекса за пределы прозрачной оболочки происходило перешнуровывание образующегося цитоплазматического мостика и плазматическая мембрана зиготы оставалась почти неповрежденной. Донорские пронуклеусы вместе с суспензией инактивированного вируса Сендай вводили под zona pellucida энуклеированной зиготы. В течение первого часа культивирования происходило включение пронуклеусов в цитоплазму зиготы. Этот же метод был использован для пересадки ядер бластомеров 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов в энуклеированную зиготу мыши (McGrath J., Solter D., 1983 a).

В опытах McGrath J., Solter D. (1983) яйцеклетки были впервые обработаны цитохалазином, который является цитоскелетным ингибитором деполимеризующим актин и демекольцином, который препятствует полимеризации тубулина, при этом яйцеклетки становились пластичными и устойчивыми к повреждению при манипуляциях.

Развитию метода трансплантации ядер и получения клонированных животных посвящено несколько отечественных обзоров (Васецкий С.Г., 1986; Конюхов Б.В, 1997; Лагутина И.С., Галат В.В., 2001; Ротт Н.Н., 1987; Струнников В.А., 1998; Захарченко В.И. с соавт., 1990-1994).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кириенко, Константин Владимирович

выводы

В мышином ооците на стадии метафазы II, не подвергавшемся сильным механическим воздействиям, в течение первых 3-4 часов после первого мейотического деления, не происходит существенной миграции ни метафазной пластинки относительно I полярного тельца, ни I полярного тельца относительно метафазной пластинки. Причиной миграции I полярного тельца относительно метафазной пластинки в ооцитах мыши на стадии МП, полученных методом вымывания ооцит-кумулюсных комплексов из яйцеводов мышей, являются механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса и различными перемещениями ооцита.

В ооцитах Mil крупного рогатого скота, дозревших in vitro, через 20-23 часа после постановки их на дозревание метафазная пластинка располагается прямо под I полярным тельцем либо близко в стороне от полярного тельца в 96,6 - 100% случаев. Механические воздействия, связанные с удалением клеток кумулюса с ооцита не оказывают существенного влияния на смещение полярного тельца относительно метафазной пластинки.

При активации мышиных клеток, реконструированных с использованием в качестве кариопластов ядер свежеполученных клеток кумулюса, только электрическим током в процессе электрослияния, не наблюдается развития реконструированных эмбрионов до стадии бластоцисты. При дополнительной активации 7% этанолом сразу после электрослияния определённая часть (3,7%) реконструированных эмбрионов развивается до стадии бластоцисты.

Активация яйцеклеток мыши к партеногенетическому развитию ионофором-Са++ с последующим трех часовым культивированием в среде содержащей 6-DMAP, приводит к значительному повышению доли развития эмбрионов до стадии бластоцисты, по сравнению с активацией электрическим током и 7% этанолом. Уменьшение времени экспозиции мышиных яйцеклеток в ионофоре-Са^ с 5 минут до 1 минуты существенно не сказывается на эффективности активации, однако позволяет увеличить долю развития партеногенетически активированных эмбрионов до стадии бластоцисты (87,8% против 71,6%, соответственно).

6. При реконструировании мышиных эмбрионов в качестве источников кариопластов могут быть использованы как клетки находящиеся в фазах G0-G1, так и в фазах G2-M с одинаковой эффективностью развития реконструированных эмбрионов in vitro до стадии бластоцисты.

7. Цитопласты, полученные путём энуклеации ооцитов крупного рогатого скота, дозревавших in vitro до стадии метафазы II в течение 20 часов, способны репрограммировать кариопласты соматических клеток и обеспечивать их развитие, по крайней мере, до стадии бластоцисты.

8. Использование фидерного слоя из клеток кумулюса коровы позволяет культивировать реконструированные эмбрионы крупного рогатого скота до стадии бластоцисты в среде DMEM под газовой фазой - 5% СОг в воздухе. Для культивирования реконструированных и партеногенетически активированных эмбрионов крупного рогатого скота без фидерного слоя может быть использована среда KSOM, обогащенная незаменимыми и заменимыми аминокислотами, под газовой фазой- 5% С02, 5% 02, 90% N2.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Удаление клеток кумулюса с мышиных ооцитов МП, предназначенных для получения цитопластов, необходимо проводить преимущественно с помощью 0,1% раствора гиалуронидазы и в меньшей степени с использованием пипетирования и особенно обработки на вортексе.

2. Энуклеацию мышиных яйцеклеток МП необходимо проводить по положению метафазной пластинки, которая визуализируется в виде просветленной зоны, а не по расположению I полярного тельца.

4. Для активации реконструированных клеток к митотическому делению и дальнейшему развитию эмбрионов целесообразно обрабатывать их ионофором-Са++ (10 мкМ) в течение 3 минут для клеток крупного рогатого скота и в течение 1 минуты - для мышиных, с последующим культивированием в течение 3 часов в среде содержащей 6-DMAP (2 мМ).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кириенко, Константин Владимирович, Боровск

1. Васецкий С.Г. Пересадка ядер в яйцеклетки млекопитающих // Онтогенез, 1986. Т.17. № 3. с.229-233.

2. Беликов В.Ю. Влияние условий созревания ооцитов мышей in vitro на их способность к партеногенетической активации под действием циклогексимида и этанола // Онтогенез, 1986. Т.17. № 1. с.93-97.

3. Дабан А.П., Нониашвили Е.М. Изучение факторов, определяющих частоту и пути партеногенетического развития яйцеклеток мыши, активированных этанолом // Онтогенез, 1986. Т.17. № 2. с.165-175.

4. Захарченко В.И., Прокофьев М.И. О методах клеточной инженерии ранних зародышей с.-х. животных // Сельскохозяйственная Биология. 1990. №2. с. 51-53.

5. Захарченко В.И., Лагутина И.С., Прокофьев М.И., Эрнст JI.K. Трансплантация ядер в созревшие ооциты крупного рогатого скота // Вестник РАСХН. 1993. №4. с. 51-52.

6. Захарченко В.И., Лагутина И.С., Захаров А.В., Прокофьев М.И. Исследование влияния некоторых факторов на развитие клонированных эмбрионов кролика // Доклады РАСХН. 1993. № 5. с. 26-29.

7. Захарченко В.И., Лагутина И.С., Прокофьев М.И. Эмбрионы кролика с трансплантированными ядрами // Аграрная наука. 1994. № 1. с. 35.

8. Ротт Н.Н. Новые данные о пересадке ядер у млекопитающих // Онтогенез, 1987. Т.18. № 4. с.341-344.

9. Конюхов Б.В. Клонирование позвоночных: успех и проблемы // Генетика 1997. Т.ЗЗ. №1. с. 1605-1620.

10. Струнников В.А. Клонирование животных: теория и практика // Природа 1998. №7. с. 3-9.

11. Лагутина И.С., Галат В.В. Клонирование млекопитающих // Онтогенез, 2001. Т.32. № 3. с.180-195.

12. Никитин В.А. Техника изготовления микроинструментов для исследования клеток под микроскопом // Пущино. ОНТИ НЦБИ АН СССР. 1986. 123 с.

13. Фонбрюн П. Методы микроманипуляций // М. Издательство иностранной литературы. 1951.175 с.

14. Хаймэн Д., Полдинг А. Культивирование фибробластов человека для исследования хромосом // Новые методы культуры животных тканей. 1976. с. 197-221.

15. Хамидов Д.Х., Коваль Т.Ю., Шаюнусова Д., Гончарова Е. Партеногенетическая активация созревших in vivo ооцитов мыши под действием циклогексимида// Онтогенез, 1990. Т.21. №4. с.432-434.

16. Adenot PG, Szollosi MS, Chesne P, Chastant S, Renard J-P. In vivo aging of oocytes influences the behavior of nuclei transferred to enucleated rabbit oocytes. Mol Reprod Dev 1997; 46:325-336.

17. Aoki F, Worrad DM, Schultz RM. Regulation of transcriptional activity during the first and second cell cycle in the preimplantation mouse embryo. Dev Biol 1997; 181:296-307.

18. Avery, В., Brandenhoff, H.R. and Greve, T. Development of in vitro matured and fertilized bovine embryos, cultured from days 1-5 post insemination in either Menezo-B2 medium or in HECM-6 medium. Theriogenology 1995; 44, 935-945.

19. Baguisi A, Behboodi E, Melican D T, Pollock J S, Destrempes M M, Cammuso C, Williams J L, Nims S D, Porter С A, Midura P, et al. Nat Biotech 1999; 17:456-461.

20. Baguisi A, Overstrom EW. Induced enucleation in nuclear transfer procedures to produce cloned animals. Theriogenology 2000 54:209 (abstract).

21. Barnes, F.L., Crombie, A., Gardner, D.K. et al. Blastocyst development and birth after in-vitro maturation of human primary oocytes, intracytoplasmic sperm injection and assisted hatching. Hum, Reprod., (1995) 10, 3243-3247.

22. Barnes F.L., Robl J., First N. Nuclear transplantation in mouse embryos: assesment of nuclear function. Biol. Reprod. 1987. V. 3

23. Basyuk E, Cross JC, Corbin J, Nakayama H, Hunter P, Nait-Oumesmar B, Lazzarini RA. Murine Gcml gene is expressed in a subset of placental trophoblast cells. Dev Dyn 1999; 214:303-311.

24. Bavister, B.D. Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts. Hum, Reprod, Update (1995); 1, 91-148.

25. Bavister B.D., Leibfried M.L., Zieberman G. Development of preimplantation embryos of the golden hamster in a defined culture medium. Biol. Reprod. 1983; 28:235-247.

26. Behr, В., Pool, T.B., Milki, A.A. et al. Preliminary clinical experience with human blastocyst development in vitro without coculture. Hum, Reprod., 1999; 14,454-457.

27. Behr B, Wang H. Effects of culture conditions on IVF outcome. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2004; 115(Suppl):S72-S76

28. Benirsvhke K. Placenta: implantation and development. In: Knobil E, Neill JD (eds.), Encyclopedia of Reproduction, vol. 3. New York: Academic Press; 1999: 848-863.

29. Bondioli K.R., Weshusin M.E., Looney R. Production of identiflcal bovine offspring by nuclear transfer. Theriogenology. 1990. V. 33. N 1. P. 165174.

30. Bordignon V, Smith LC. Telophase enucleation: an improved method to prepare recipient cytoplasts for use in bovine nuclear transfer. Mol Reprod Dev 1998; 49:29-36.

31. Bradley A, Evans M J, Kaufman M H, Robertson E. Nature (London) 1984;309:255-256.

32. Briggs R., King F. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1952. V. 38. P. 455-463.

33. Brinster RL. Embryo development. J Anim Sci 1974; 38:1003-1012.

34. Brinster RL. Studies on the development of mouse embryos in vitro. II. The effect of energy source. J Exp Zool 1965; 158:59-68.

35. Brison DR, Leese HJ. Blastocoel cavity formation by preimplantation rat embryos in the presence of cyanide and other inhibitors of oxidative phosphorylation. J Reprod Fertil 1994; 101:305-309.

36. Camous S, Kopecny V, Flechon JE. Autoradiographic detection of the earliest stage of 3H.-uridine incorporation into the cow embryo. Biol Cell 1986;58:195-200

37. Campbell KHS, Loi P, Cappai P, Wilmut I. Improved development to blastocyst of ovine nuclear transfer embryos reconstructed during the presumptive S-phase of enucleated activated oocytes. Biol Reprod 1994; 50:1385-1393.

38. Campbell K.H.S., McWhir J., Ritchie W.A. et al. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature. 1996. V.380. P. 64-66.

39. Capecchi M R. Science 1989;244:1288-1292.

40. Carlson D, Black DL, Howe OR. Oviduct secretion in the cow. J Reprod Fertil 1970; 22:549-552.

41. Chatot, C.L., Lewis-Williams, J., Torres, I. et al. One-minute exposure of 4-cell mouse embryos to glucose overcomes morula block in CZB medium. Mol, Reprod, Dev., 1994; 37, 407-412.

42. Chatot CL, Lewis JL, Torres I, Ziomek CA. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol Reprod 1990; 42:432440.

43. Chatot, C.L., Ziomek, C.A., Bavister, B.D. et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J, Reprod, Fertil., 1989; 86, 679-688.us

44. Cheong НТ, Takahashi Y, Kanagawa H. Birth of mice after traftsplantation of early cell-cycle-stage embryonic nuclei into enucleated oocytes. Biol Reprod 1993; 48:958-963.

45. Cibelli JB, Stice SL, Golueke P, Kane JJ, Jerry J, Blackwell C, Ponce de Leon FA, Robl JM. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 1998; 280:1256-1261.

46. Collas P, Pinto-Correia C, Ponce de Leon FA, Robl JM. Effect of donor cell cycle stage on chromatin and spindle morphology in nuclear transplant rabbit embryos. Biol Reprod 1992; 46:501-511.

47. Collas P., Robi J.M. Factors affecting the efficiency of nuclear transplantation in the rabbit embryo. Biol. Reprod. 1990. V. 43. P. 877884.

48. Collas P, Sullivan EJ, Barnes FL. Histone HI kinase activity in bovin oocytes following calcium stimulation. Mol Reprod Dev 1993; 34 224-231.

49. Conaghan, J., Handyside, A.H., Winston, R.M. et al. Effects of pyruvate and glucose on the development of human preimplantation embryos in vitro. J, Reprod, Fertil., 1993; 99, 87-95.

50. Critser ES, First NL. Use of a fluorescent stain for visualization of nuclear material in living oocytes and early embryos. Stain Technol 1986; 61:1-5.

51. Dean W, Bowden L, Aitchison A, Klose J, Moore T, Meneses J J, Reik W, Feil R. Development (Cambridge, UK) 1998;125:2273-2282.

52. Devreker, F., Van den Bergh, M., Biramane, J. et al. Effects of taurine on human embryo development in vitro. Hum, Reprod., 1999; 14, 2350-2356.

53. Dinnyes A, King T, Wilmut I, De Sousa PA. Sheep somatic cell nuclear transfer: effect of breed and culture system on embryonic and fetal development. Theriogenology 2001; 55:264.

54. Doree M, Galas S. The cyclin-dependent protein kinases and the control of cell division. FASEB J 1994; 8:1114-1121

55. Dumoulin, J.C.M., Evers, J.L.H., Bras, M. et al. Positive effect of taurine on preimplantation mouse embryos in vitro. J, Reprod, Fertil., 1992; 94, 373380.

56. Ecker D, Stein P, Xu Z, Williams C, Kopf G, Bilker W, Abel T, Schultz R. Long-term effects of culture of preimplantation mouse embryos on behavior. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101:1595-1600

57. Elsheikh AS, Takahashi Y, Hishinuma M, Kanagawa H. Developmental ability of mouse late 2-cell stage blastomeres fused to chemically enucleated oocytes in vitro. J Vet Med Sci 1997 59:107-113.

58. Elsheikh AS, Takahashi Y, Katagiri S, Kanagawa H. Functional enucleation of mouse metaphase II oocytes with etoposide. Jpn J Vet Res 1998, 45:217220.

59. Epstein С J. The Consequences of Chromosome Imbalance. Cambridge: Cambridge Univ. Press; 1986.

60. Escriba MJ, Garcia-Ximenez FG. Electroactivation of rabbit oocytes in a hypotonic pulsing medium and parthenogenetic in vitro development without cytochalasin B-diploidizing prelreatment. Therioge-nology 1999; 51:963-973.

61. Evans MJ, Kaufman M H. Nature (London) 1981;292:154-156.

62. Eusebi F, Siracusa D. An electrophysiological study of parthenogenetic activation in mammalian oocytes. Dev Biol 1983; 96:386-395.

63. First NL, Leibfried-Rutledge ML, Northey DL, Nuttleman PR. Use о in vitro matured oocytes 24 h of age in bovine nuclear transfer. Theriogenology 1992; 37:211 (abstract)

64. Fissore RA, Robl JM. Intracellular Ca2+ response of rabbit oocytes to electrical stimulation. Mol Reprod Dev 1992; 32:9-16

65. Fleming T, Kwong W, Porter R, Ursell E, Fesenko I, Wilkins A, Miller D, Watkins A, Eckert J 2004 The embryo and its future. Biol Reprod 71:1046— 1054

66. Fong, C.Y. and Bongso, A. Comparison of human blastulation rates and total cell number in sequential culture media with and without co-culture. Hum, Reprod., 1999; 14, 774-781.

67. Fulka J Jr, Moor RM. Noninvasive chemical enucleation of mouse oocytes. Mol Reprod Dev 1993, 34:427-430

68. Funatushi, H., Mclntush. E.W., Smith, M.F, &. Day, B.N. (1999) J, Reprod, Dev. 45,265-271.

69. Gao S, McGarry M, Ferrier T, Pallante B, Gasparrini B, Fletcher J, Harkness L, De Sousa P, McWhir J, Wilmut I. Effect of cell confluence on production of cloned mice using an inbred embryonic stem cell line. Biol Reprod 2003; 68:595-603.

70. Gandhi A.P., Lane M., Gardner D.K., Krisher R.L. A single medium supports development of bovine embryos throughout maturation, fertilization and culture. Human Reproduction, February 2000, Vol. 15, No. 2,395-401.

71. Gardner DK, Lane M. Alleviation of the "2-cell block" and development tothe blastocyst of CF1 mouse embryos: role of amino acids, EDTA and physical parameters. Hum Reprod 1996; 11:2703-2712.

72. Gardner, D.K., Lane, M., Calderon, I. et al. Environment of the preimplantation human embryo in vivo: metabolite analysis of oviduct and uterine fluids and metabolism of cumulus cells see comments. Fertil, Steril., 1996; 65, 349-353.

73. Gardner D, Lane M. Culture of viable human blastocysts in defined sequential serum free media. Hum Reprod 1998; 13:148-160

74. Gardner, D.K., Lane, M.W. and Lane, M. Bovine blastocyst cell number is increased by culture with EDTA for the first 72 h of development from the zygote. Theriogenology, 1997; 47, 278.

75. Gardner DK, Leese HJ. Concentrations of nutrients in mouse oviduct fluid and their effects on embryo development and metabolism in vitro. J Reprod Fertil 1990; 88:361-368.

76. Gardner, D.K., Schoolcraft, W.B., Wagley, L. et al. A prospective randomized trial of blastocyst culture and transfer in in-vitro fertilization. Hum, Reprod., 1998; 13,3434-3440.

77. Glotzer M, Murray AW, Kirschner MW. Cyclin is degraded by th ubiquitin pathway. Nature 1991; 349:132-138

78. Goto Y, Kaneyama K, Kobayashi S, Imai K, Shin-noh M, Tsujino T,Nakano T, Matsuda S, Nakane S, Kojima T. Birth of cloned calves derived from cultured oviductal epithelial cells of a dairy cow. Anim Sci J 1999; 70:243245.

79. Guerin, P. and Menezo, Y. Hypotaurine and taurine in gamete and embryo environments: de novo synthesis via the cysteine sulfinic acid pathway in oviduct cells. Zygote, 1995; 3, 333-343.

80. Guillemot F, Caspaiy T, Tilghman SM, Copeland NG, Gilbert DJ, Jenkins NA, Anderson DJ, Joyner AL, Rossant J, Nagy A. Genomic imprinting of Mash2, a mouse gene required for trophoblast development. Nat Genet 1995; 9:235-242.

81. Gurdon JB. The effects of ultraviolet irradiation on uncleaved eggs of Xenopus laevis. Q J Microsc Sci 1960; 101:299-311.

82. Hill JR, Winger QA, Long CR, Looney, CR, Thompson, JA, Westhusin, ME. Development rates of male bovine nuclear transfer embryos derived from adult and fetal cells. Biol Reprod 2000; 62:1135-1140.

83. Hil J.R., Winger QA, Burghardt R., Westhusin M. Bovine nuclear transfer embryo development using cells derived from a cloned fetus. Animal Reproduction Science 2001; 67: 17-26.

84. Hochedlinger K, Jaenisch R. Nuclear transplantation: lessons from frogs and mice. Curr Opin Cell Biol. 2002; 14:741-748.

85. Hogan, В.; Beddington, R.; Costantini, F.; Lacy, E. Manipulating the Mouse Embryo. 2nd Ed. Plainview, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press; 1994. p. 173-181.

86. Hoppe RW, Bavister BD. Evaluation of the fluorescein diacetate (PDA) vital dye viability test with hamster and bovine embryos. Anim Reprod Sci 1984; 6:323-335.

87. Hooper M, Hardy K, Handyside A, Hunter S, Monk M. Nature (London) 1987;326:292-295.

88. Houghton FD, Thompson JG, Kennedy CJ, Leese HJ. Oxygen consumption and energy metabolism of the early mouse embryo. Mol Reprod Dev 1996; 44:476-485.

89. Hunter PJ, Swanson BJ, Haendel MA, Lyons GE, Cross JC. Mrj encodes a DnaJ-related co-chaperone that is essential for murine placental development. Development 1999; 126:1247-1258.

90. Kane, M.T. The effects of water soluble vitamins on the expansion of rabbit blastocysts in vitro. J, Exp, Zool., 1988; 245, 220-223.

91. Kane, M.T. and Bavister, B.D. Vitamin requirements for development of eight-cell hamster embryos to hatching blastocysts in vitro. Biol, Reprod., 1988; 39,1137-1143.

92. Kane, M.T., Carney, E.W. and Bavister, B.D. Vitamins and amino acids stimulate hamster blastocysts to hatch in vitro. J, Exp, Zool., 1986; 239, 429-432.

93. Karnikova L, Horska M, Tomanek M, Kanka J, Urban F, Moor R, Fulka J Jr. Chemically enucleated mouse oocytes: ultrastructure and kinetics of histone HI kinase activity. Reprod Nutr Dev 1998 38:643-651

94. Kato Y, Tani T, Sotomaru Y, Kurokawa K, Kato J, Doguchi H, Yasue H, Tsunoda Y. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science 282:2095-2098,1998.

95. Kato Y, Tani T, Tsunoda Y. Cloning of calves from various somatic cell types of male and female adult, newborn and fetal cows. J Reprod Fertil 2000; 120:231-237.

96. Katz J, Wood HG. The use of CI402 yields from glucose-1 and -6-C14 for the evaluation of the pathways of glucose metabolism. J Biol Chem 1963; 238:517-523.

97. Kawase E, Suemori H, Takahashi N, Okazaki K, Hashimoto K, Nakatsuji N. Strain difference in establishment of mouse embryonic stem (ES) cell lines. Int J Dev Biol 1994; 38:385-390.

98. Keskintepe, L. and Brackett, B.G. In vitro developmental competence of in vitro-matured bovine oocytes fertilized and cultured in completely defined media. Biol, Reprod., 1996; 55, 333-339.

99. Keskintepe, L., Burnley, C.A. and Brackett, B.G. Production of viable bovine blastocysts in defined in vitro conditions. Biol, Reprod., 1995; 52, 1410-1417.

100. Kim, J.H., Funahashi, H., Niwa, K. et al. Glucose requirement at different developmental stages of in vitro fertilized bovine embryos cultured in semi-defined medium. Theriogenology, 1993; 39, 875-886.

101. Kimiko I., Narumi O., Keiji M., Yoshie Y., Kaoru Т., Takashi K., Fumitoshi I., Atsuo O. Effects of Donor Cell Type and Genotype on the Efficiency of Mouse Somatic Cell Cloning. Biol Reprod 69, 1394-1400 (2003).

102. Kono T, Kwon OY, Nakahara T. Development of enucleated mouse oocytes reconstituted with embryonic nuclei. J Reprod Fertil 1991; 93:165-172

103. Kono T, Kwon OY, Watanabe T, Nakahara T, Development of mouse enucleated oocytes receiving a nucleus from different stages of second cell cycle. J Reprod Fertil 1992; 94:481-487

104. Kono T, Ogawa M, Nakahara T. J Reprod Dev 1993;39:301-307.

105. Kono T. Nuclear transfer and reprogramming. Rev Reprod 1997; 2:74-80.

106. H.Kubiak JZ, Prather RS, Maul GG, Schatten G. Cytoplasmic modification of the nuclear lamina during pronuclear-like transformation of mouse blastomere nuclei. Mech Dev 1991; 35:103-111.

107. Kubiak JZ, Weber M, Geraud G, Maro B. Cell cycle modification during the transitions between meiotic M-phases in mouse oocytes. Cell Sci 1992; 102:457-467

108. Kubota C, Yamakuchi H, Todoroki J, Mizoshita K, Tabara N, Barber M, Yang X. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture. Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97:990-995.

109. Kurebayashi S., Miyake, M., & Kalo, S. (2000) Theriogenology.

110. Kwon O.Y., Kono T. Production of identical sextuplet mice by transferring metaphase from four- cell embryos. Devel. Biol. 1996. V. 93. P. 1301013013.

111. Kwon О, Копо Т, Nakahara Т. Production of live young by serial nuclear transfer with mitotic stages of donor nuclei in mice. J Reprod Dev 1997; 43:25-31.

112. Larson M, Kimura K, Kubisch H, Roberts R. Sexual dimorphism among bovine embryos in their ability to make the transition to expanded blastocysts and in the expression of the signaling molecule. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:9677-9682

113. Leese HJ. Metabolism of the preimplantation mammalian embryo. Oxf Rev Reprod Biol 1991; 13:35-72.

114. Leese H. The formation and function of oviduct fluid. J Reprod Fertil 1988; 82:843-856.

115. Lighten, A.D., Moore, G.E., Winston, R.M. and Hardy, K. Routine addition of human insulin-like growth factor-I ligand could benefit clinical in-vitro fertilization culture. Hum, Reprod., 1998; 13, 3144-3150.

116. Li, J., Foote, R.H. and Simkin, M. Development of rabbit zygotes cultured in protein-free medium with catalase, taurine, or superoxide dismutase. Biol, Reprod., 1993; 48, 33-37.

117. Lippes J, Enders RG, Pragay DA, Bartholomew WR. The collection and analysis of human fallopian tubal fluid. Contraception 1972; 5: 85-103.

118. Liu, Z. and Foote, R.M. Development of bovine embryos in KSOM with added superoxide dismutase and taurine and with five and twenty percent 02. Biol, Reprod., 1995; 53, 786-790.

119. Liu L, Ju JC, Yang X. Differential inactivation of maturation-prmoting factor and mitogen-activated protein kinase following parthenogenetic activation of bovine oocytes. Biol Reprod 1998; 59:537-545. (a)

120. Liu L, Ju JC, Yang X. Parthenogenetic development and protein patterns of newly matured bovine oocytes after chemical activation. Mol Reprod Dev 1998 49:298-307. (6)

121. Liu L, Ju JC, Yang X. Parthenogenetic development and protein patterns of newly matured bovine oocytes after chemical activation. Mo Reprod Dev 1998;49:298-307. (в)

122. Liu L, Yang X. Interplay of maturation-promoting factor and mitogenactivated protein kinase inactivation during metaphase-to-interphas transition of activated bovine oocytes. Biol Reprod 1999; 61:1-7

123. Lonergan, P., Carolan, C. and Mermillod, P. Development of bovine embryos in vitro following oocyte maturation under defined conditions. Reprod, Nutr, Dev., 1994; 34, 329-339.

124. Lonergan P, Rizos D, Gutierrez-Adan A, Fair T, Boland M. Oocyte and embryo quality: effect of origin, culture conditions and gene expression patterns. Reprod Dom Anim 2003; 38:259-267

125. Lonergan P, Khatir H, Carolan C, Mermillod P. Bovine blastocyst production in vitro after inhibition of oocyte meiotic resumption for 24 h. J Reprod Fertil 1997; 109:355-365

126. Lorca T, Cruzalegui FH, Fesquet D, Cavadore JC, Mery J, Means ADoree M. Calmodulin-dependent protein kinase mediates inactivation of MPF and CSF upon fertilization of Xenopus eggs. Naturl993; 366:270-273

127. Ludwig ТЕ, Lane M, Bavister BD. Differential Effect of Hexoses on Hamster Embryo Development in Culture. Biol Reprod 2001; 64: 13661374.

128. Ludwig, Т.Е., Lane, M, Bavister B.D. Increased fetal development after transfer of hamster embryos cultured with glucose. Biol, Reprod., 1998; 58, 167, abstr. 306.

129. Mann M, Lee S, Doherty A, Verona R, Nolen L, Schultz R, Bartolomei M. Selective loss of imprinting in the placenta following preimplantation development in culture. Development 2004; 131:3727-3735

130. Marriam RW. Movement of cytoplasmic proteins into nuclei induced to enlarge and initiate DNA and RNA synthesis. J Cell Sci 1969; 5:333-349.

131. Martin G R. Proc Natl Acad Sci USA 1981;78:7634-7638.

132. Matsui Y, Markert CL. Cytoplasmic control of nuclear behaviour during meiotic maturation of frog oocytes. J Exp Zool 1971; 177:129-145.

133. Matsui Y. The elusive cytostatic factor in the animal egg. Nat Rev Mol Cell Biol 2000; 1:228-232.

134. Matsuyama, K., Miyakoshi, H. and Fukui, Y. Effect of glucose levels during the in vitro culture in synthetic oviductal fluid medium on in vitro development of bovine oocytes matured and fertilized in vitro. Theriogenology, 1993; 40, 595-605.

135. McGrath J., Solter D. Nuclear transplantation in the mouse by microsurgery and cell fusion. Science. 1983. V. 220. P. 1300-1302. (a.)

136. McGrath J., Solter D. Nuclear transplantation in the mouse embryos. J. Exp. Zool. 1983. V. 228. P. 355-362. (6.)

137. McGrath J., Solter D. Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro. Science. 1984. V. 226. P. 1317-1319.

138. McKiernan, S.H., Clayton, M.K. and Bavister, B.D. Analysis of stimulatory and inhibitory amino acids for development of hamster one-cell embryos in vitro. Mol, Reprod, Dev., 1995; 42, 188-199.

139. Mc Laughlin R., Davis M., Seamark J. In vitro culture in the production of identiflcal Merino lambs by nuclear transplantation. J. Reprod. Fert. Devel. 1990. V. 2. N6. P. 619-622.

140. Miller, J.G.O. and Schultz, G.A. Amino acid content of preimplantation embryos and fluids of the reproductive tract. Biol, Reprod., 1987; 36, 125— 129.

141. Mitalipov SM, White KL, Farrar VR, Morrey J, Reed WA. Development of nuclear transfer and parthenogenetic rabbit embryos activated with inositol 1,4,5-trisphosphate. Biol Reprod 1999; 60:821-827.

142. Modlinski JA, Smorag Z. Preimplantation development of rabbit embryos after transfer of embryonic nuclei into different cytoplasmic environment. Mol Reprod Dev 1991; 28:361-372.

143. Moore T, Haig D. Genomic imprinting in mammalian development: a parental tug-of-war. Trends Genet 1991; 7:45-49.

144. Moore T, Reik W. Genetic conflict in early development: parental imprinting in normal and abnormal growth. Rev Reprod 1995; 1:73-77.

145. Moos J, Xu Z, Schultz RM, Kopf GS. Regulation of nuclear envelop assembly/disassembly by MAP kinase. Dev Biol 1996; 175:358-361

146. Motlik J., Pavlok, A., Kubelka, M., Kalous J., и Kalab, P. (1998) Theriogenology 49:461 -469.

147. Murray, A.; Hunt, T. The Cell Cycle. Oxford: Oxford Univ. Press; 1993. p. 28-41.

148. Nagy A, Gocza E, Diaz E M, Prideaux V R, Ivanyi E, Markkula M, Rossant J. Development (Cambridge, UK) 1990;110:815-821.

149. Nagy A, Rossant J, Nagy R, Abramow-Newerly W, Roder J C. Proc Natl Acad Sci USA 1993;90:8424-8428.

150. Nagy F. Cell division kinetics and DNA synthesis in the immature Sertoli cells of the rat testis. J Reprod Fertil 1972; 28:389-395.

151. Nichol, R., Hunter, R.H., Gardner, D.K. et al. Concentrations of energy substrates in oviductal fluid and blood plasma of pigs during the peri-ovulatory period. J, Reprod, Fertil., 1992; 96, 699-707.

152. Onishi A, Iwamoto M, Akila T, Mikawa S, Takeda K, Awata T, Hanada H, Perry AC. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science 2000;289:1188-1190.

153. Ono Y., Shimozawa N., Ito M., Kono T. Cloned Mice from Fetal Fibroblast Cells Arrested at Metaphase by a Serial Nuclear Transfer. Biol Reprod 2001; 64: 44-50.168.0verstrom, E.W. In vitro assessment of embryo viability. Theriogenology, 1996; 45, 3-16.

154. Ozil JP, Modlinski JA. Effects of electric field on fusion rate and survival of 2-cell rabbit embryo. J Embryol Exp Morphol 1986; 96: 211-228

155. Ozil JP. The parthenogenetic development of rabbit oocytes after repetitive pulsatile electrical stimulation. Development 1990; 109:117-128.

156. Paria B, Dey S. Preimplantation embryo development in vitro: cooperative interactions among embryos and role of growth factors. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87:4756-4760

157. Petters, R.M. and Wells, K.D. Culture of pig embryos. J, Reprod, Fertil., 1993; 48 (Suppl.), 61-73.

158. Peura TT, Lewis IM, Trounson AO. The effect of recipient oocyte volume on nuclear transfer in cattle. Mol Reprod Dev 1998; 50:185-191.

159. Pinyopummintr, T. and Bavister, B.D. Energy substrate requirements for in vitro development of early cleavage-stage bovine embryos. Mol, Reprod, Dev., 1996; 44,193-199.

160. Polejaeva IA, Chen SH, Vaught TD, Page RL, Mullins J, Ball S, Dai Y, Boone J, Walker S, Ayares DL, Colman A, Campbell KH. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature 407:86-90, 2000.

161. Prather RS, Rickords LF. Developmental regulation of a snRNP core protein epitope during pig embryogenesis and after nuclear transfer for cloning. Mol Reprod Dev 1992; 33:119-123.

162. Prather RS, Sims MM, First NL. Nuclear transplantation in early pig embryos. Biol Reprod 1989; 41:414-418.

163. Presicce GA, Yang X. Nuclear dynamics of parthenogenesis of bovin oocytes matured in vitro for 20 and 40 hours and activated with combined ethanol and cycloheximide treatment. Mol Reprod Dev 1994 37:61-68

164. Quinn P. Enhanced results in mouse and human embryo culture using a modified human tuba! fluid medium lacking glucose and phosphate. J Assist Reprod Genet, 1995; 12:97-105.

165. Quinn, P., Moinipanah, R., Steinberg, J.M. et al. Successful human in vitro fertilization using a modified human tubal fluid medium lacking glucose and phosphate ions. Fertil, Steril., 1995; 63, 922-924.

166. Ramirez-Solis R, Davis A C, Bradley A. Methods Enzymol 1993; 225:855878.

167. Reed, M.L., Illera, M.J. and Petters, R.M. In vitro culture of pig embryos. Theriogenology, 1992; 37, 95-109.

168. Reik W, Romer I, Barton SC, Surani MA, Howlett SK, Klose J. Adult phenotype in the mouse can be affected by epigenetic events in the early embryo. Development 1993; 119:933-942.

169. Renard JP, Chastant S, Chesne P, Richard C, Marchal J, Cordonnier N, Chavatte P, Vignon X. Lymphoid hypoplasia and somatic cloning. Lancet 353:1489-1491,1999.

170. Rieder С L, Alexander S P. J Cell Biol 1990;110:81-95.

171. Riley P, Anson-Cartwright L, Cross JC. The Handl bHLH transcription factor is essential for placentation and cardiac morphogenesis. Nat Genet 1998; 18:271-275.

172. Rinaudo P, Schultz R. Effects of embryo culture on global pattern of gene expression in preimplantation mouse embryos. Reproduction 2004; 128:301-311

173. Roberts R, Xie S, Mathialagan N. Maternal recognition of pregnancy. Biol Reprod 1996; 54:294-302

174. Robl J.M., Gilligan В., Critser E.S., First N.L. Nuclear transplantation in mouse embryos: assessment of recipient cell stage. Biol, Reprod. 1986. V. 34. P. 733-739.

175. Rogers PA, Gannon BJ. The vascular and microvascular anatomy of the rat uterus during the oestrous cycle. Aust J Exp Biol Med Sci 1981; 59:667-679.

176. Rosenkrans, C.F., Jr and First, N.L. Effect of free amino acids and vitamins on cleavage and developmental rate of bovine zygotes in vitro. J, Anim, Sci., 1994; 72, 434-437.

177. Schieve L, Rasmussen S, Buck G, Schendel D, Reynolds M, Wright V. Are children born after assisted reproductive technology at increased risk for adverse health outcomes? Obstet Gynecol 2004; 103:1154-1163

178. Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, Mycock K, Scott AR, Ritchie M, Wilmut I, Colman A, Campbell KH. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts. Science 1997;278:2130-2133.

179. Schini, S.A. and Bavister, B.D. Two-cell block to development of cultured hamster embryos is caused by phosphate and glucose. Biol, Reprod., 1988; 39, 1183-1192.

180. Schuetz AW, Whittingham DG, Snowden R. Alterations in the cell cycle of mouse cumulus granulosa cells during expansion and muciflcation in vivo and in vitro. Reprod Fertil Dev 1996; 8:935-943.

181. Schultz, G., Kaye, P.L., McCoy, D.J. et al. Endogenous amino acid pool sizes in mouse eggs and preimplantation embryos. J, Reprod, Fertil., 1981; 61,387-393.

182. Seshagiri PB, Bavister BD. Glucose and phosphate inhibit respiration and oxidative metabolism in cultured hamster eight-cell embryos: evidence forthe "Crabtree effect." Mol Reprod Dev 1991; 30:105-111.

183. Seshagiri, P.B. and Bavister, B.D. Glucose inhibits development of hamster 8-cell embryos in vitro. Biol, Reprod., 1989; 40,599-606.

184. Sjoblom C, Roberts C, Wilkland M, Robertson S. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor alleviates adverse consequences of embryo culture on fetal growth trajectory and placental morphogenesis. Endocrinology 2005; 146:2142-2153

185. Shiga K, Fujita T, Hirose K, Sasae Y, Nagai T. Production of calves by transfer of nuclei from cultured somatic cells obtained from Jap anese black bulls. Theriogenology 1999; 52:527-535.

186. Smith LC. Membrane and intracellular effects of ultraviolet irradiation with Hoechst 33342 on bovine secondary oocytes matured in vitro. J Reprod Fertil 1993; 99:39-44.

187. Smith L.C., Wilmut I., Hunter R.H.F. Influence of cell cycle stage at nuclear transplantation on the development in vitro of mouse embryos. J. Reprod. Fert. 1988. V. 84. P. 619-624.

188. Smith L.C., Wilmut I. Influence of nuclear and cytoplasmic activaty on the development in vivo of sheep embryos after nuclear transplantation. Biol. Reprod. 1989. V. 40. P. 1027-1035.

189. Soloy E, Kanka J, Viuff D, Smith SD, Callesen H, Greve T. Tim course of pronuclear deoxyribonucleic acid synthesis in parthenogenetically activated bovine oocytes. Biol Reprod 1997; 57:27-35

190. Spindle, A. Beneficial effects of taurine on mouse zygotes developing in protein-free culture medium. Theriogenology, 1995; 44, 761-772.

191. Stewart-Savage, J. and Bavister, B.D. Deterioration of stored culture media as monitored by a sperm motility bioassay. J, In Vitro Fertil, Embryo Transfer, 1988; 5, 76-80.

192. Stice SL, Robl JM. Nuclear reprogramming in nuclear transfer rabbit embryos. Biol Reprod 1988; 39:657-664.

193. Stice S.L., Keefer C.L. Multiple generation bovine embryo cloning. Biol. Reprod. 1993. V.48. P. 715-719.

194. Stryer L. Biochemistry. New York: WH Freeman and Co.; 1995.

195. Summers MC, Bhatnagar PR, Lawitts JA, Biggers JD. Fertilization in vitro of mouse ova from inbred and outbred strains: complete preimplantation embryo development in glucose-supplemented KSOM. Biol Reprod 1995; 53:431-437.

196. Summers M, Biggers JD. Chemically defined media and the culture of mammalian preimplantation embryos: historical perspective and current issues. Human Reprod Update 2003; 9:557-582

197. Susko-Parrish JL, Leibfried-Rutledge ML, Northey DL, Schutzkus V First NL. Inhibition of protein kinases after an induced calcium transient causes transition of bovine oocytes to embryonic cycles withou meiotic completion. Dev Biol 1994; 166:729-739

198. Takahashi, Y. and First, N.L. In vitro development of bovine one cell embryos: influence of glucose, lactate, pyruvate, amino acids and vitamins. Theriogenology, 1992; 37, 963-978.

199. Takano H, Koyama K, Kozai C, Shimizu S, Kato Y, Tsunoda Y. Effects of cell cycle stage of donor nuclei on the development of bovine nuclear transferred embryos. J Reprod Dev 1996; 42:61-65.

200. Takano H, Kozai C, Shimizu S, Kato Y, Tsunoda Y. Cloning of bovine embryos by multiple nuclear transfer. Theriogenology 1997; 47:1365-1373.

201. Tervit, H.R., Whittingham, D.G. and Rowson, L.E.A. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J, Reprod, Fertil., 1972; 30,493-497.

202. Thompson, J.G. Defining the requirements for bovine embryo culture. Theriogenology, 1996; 45,27-40.

203. Thompson, J.G., Allen, N.W., McGowan, L.T. et al. Effect of delayed supplementation of fetal calf serum to culture medium on bovine embryo development in vitro and following transfer. Theriogenology, 1998; 49, 1239-1249.

204. Thompson JG, Simpson AC, Pugh PA, Tervit HR. Requirement for glucose during in vitro culture of sheep preimplantaion embryos. Mol Reprod Dev 1992;31:253-257.

205. Traxinger RR, Marshall S. Coordinated regulation of glutamine:fruc- tose-6-phosphate amidotransferase activity by insulin, glucose and glutamine: role of hexosamine biosynthesis in enzyme regulation. J Biol Chem 1991; 266:10148-10154.

206. Tsunoda Y., Uchida U. et al. Full term development of mouse blastomere nuclei transplanted into enucleated two- cell embryos. J. Exp. Zool. 1987. V. 242. N2. P. 147-151.

207. Tsunoda Y., Kato Y. Full-term development after transfer of nuclei from 4-cell and compacted morula stage embryos to enucleated oocytes in the mouse. Journal of experimental zoology 1997, Vol 278, Iss 4, p 250-254. (a)

208. Tsunoda Y., Kato Y. Not only inner cell mass cell nuclei but also trophectoderm nuclei of mouse blastocysts have a developmental totipotency. Developmental biology 1997; 186, Iss 2, p A258-A258. (6)

209. Urakawa M, Uruno K, Ideta A, Aoyagi Y. Effect of the development of bovine embryos by nuclear transfer using different culture days of fetal fibroblast. Theriogenology 2001; 55:294.

210. Verlhac MH, Kubiak JZ, Clarke HJ, Maro B. Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes. Development 1994; 120:1017-1025

211. Virgon X, Chesne P, Bourhis DL, Flechon JE, Heyman Y, Renard J. Developmental potential of bovine embryos reconstituted from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells. Sciences de la Vie 1998; 321:735-745.

212. Wakayama T, Yanagimachi R. Biol Reprod 1998;59:100-104.

213. Wakayama Т., Perry A., Zuccotti M., Johnson KR., Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 1998; 394:369-374.

214. Wakayama T, Mombaerts P, Rodriguez I, Perry ACF, Yanagimachi R. Mice cloned from embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:14984-14989.

215. Wakayama T, Yanagimachi R. Cloning of male mice from adult tailtip cells. Nat Genet 1999; 22:127-128.

216. Wakayama T, Tateno H, Mombaerts P, Yanagimachi R. Nuclear transfer into mouse zygotes. Nat Genet 2000; 24:108-109.

217. Wakayama T, Shinkai Y, Tamashiro Kb, Niida H, Blanchard DC, Blanchard RJ, Ogura A, Tanemura K, Tachibana M, Perry AC, Colgan DF. Mombaerts P, Yanagimachi R. Cloning of mice to six generations. Nature 2000; 407:318-319.

218. Wakayama T, Yanagimachi R. Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type. Mol Reprod Dev 2001; 58:376-383.

219. Wakayama T, Perry ACF, Zuccotti M, Johnson KR, Yanagimachi R. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 1998; 394:369-374.

220. Wakayama T, Perry ACF Cloning of mice. In: Cibelli JB, Lanza R, Campbell K, West MD (eds.), Principles of Cloning. San Diego: Ac ademic Press; 2002:301-341.

221. Wales RG. Maturation of the mammalian embryo: biochemical aspects. Biol Reprod 1975; 12:66-81.

222. Wales RG. The uterus of the ewe. II. Chemical analysis of the uterine fluid collected by cannulation. Aust J Biol Sci 1973; 26:947-959.

223. Wells ND, Misica PM, Day AM, Tervit HR. Production of cloned lambs from an established embryonic cell line: a comparison between in vivo- and in vitro-matured cytoplasts. Biol Reprod 1997; 57:385-393.

224. Wells D N, Misica P M, Tervit H R. Production of cloned calves following nuclear transfer with cultured adult mural granulose cells. Biol Reprod 1999;60:996-1005.

225. Wells ND, Pavla MM, Tervit HR. Production of clone calves following nuclear transfer with culture adult mural granulosa cells. Biol Reprod 1999; 60:996-1005.

226. Westhusin MW, Levanduski MJ, Scarborough R, Looney CR, Bondioli KR. Viable embryos and normal calves after nuclear transfer into Hoechst stained enucleated demi-oocytes of cows. J Reprod Fertil 1992; 95:475-480.

227. Whitten WK. Culture of tubal ova. Nature 1957; 179:1081-1082.

228. Willadsen S.M. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature. Lond. 1986. V. 302. P. 63-65.

229. Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, Kind AJ, Campbell KHS. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature 1997; 385:810-813.

230. Wolffe AP, Khochbin S, Dimitrov S. What do linker histones do in chromatin. Bioessays 1997; 19:249-255.

231. Yang X, Jiang S, Kovacs A, Foote RH. Nuclear totipotency of cultured rabbit morulae to support full-term development following nuclear transfer. Biol Reprod 1992;47:636-643.

232. Yin XJ, Choi CY, Kong IK, Choe SY, Park CS, Lee HJ. Production of second generation rabbit embryos by nuclear transfer. Therioge-nology 1998; 49:331.

233. Yin XJ, Kato Y, Tsunoda Y. Effect of enucleation procedures and maturation conditions on the development of nuclear-transferred rabbit oocytes receiving male fibroblast cells. Reproduction 2002; 124:41-47.

234. Yin XJ, Tani T, Yonemura I, Kawakami M, Miyamoto K, Hasegawa R, Kato Y, Tsunoda Y. Production of cloned pigs from adult somatic cells by chemically assisted removal of maternal chromosomes. Biol Reprod 2002; 67:442-446.

235. Yong Z, Yuqiang L. Nuclear-cytoplasmic interaction and development of goat embryos reconstructed by nuclear transplantation: production of goats by serially cloning embryos. Biol Reprod 1998; 58:266-269.

236. Zakhartchenko V, Stojkovic M, Palma G, Wolf E, Brem G. Enucleation of bovine oocytes with minimal cytoplasmic volume: effect on development of nuclear transfer embryos. Theriogenology 1997; 47:238.

237. Zang Z, Kiefer F, Urbanek P, Wagner E F. Mech Dev 1997;62:137-145.

238. Zimmerman V. et al. Electric frild induced cell to cell fusion // J. Membrane Biol. 1982. V. 67. P. 165-182.

Информация о работе

Кириенко, Константин Владимирович
кандидата биологических наук
Боровск, 2007
ВАК 03.00.23

Диссертация

Развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота и мышей in vitro, в зависимости от условий их реконструирования и культивирования - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы