Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЗДАНИЯ И РАЗМНОЖЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ С НОВЫМИ ФЕНОТИПИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЗДАНИЯ И РАЗМНОЖЕНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ С НОВЫМИ ФЕНОТИПИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ"

/-¿дат

На правах рукописи

СУРАЕВА НАТАЛЬЯ МИХАЙЛОВНА

Эмбриологические и генетические аспекты создания и размножения сельскохозяйственных животных с новыми фенотипическими свойствами

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Дубровицы - 2005 г.

Работа выполнена в отделе Биотехцентр ГНУ научно-исследовательского института пушного звероводства и кролиководства им. В.А. Афанасьева

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор,

академик РАСХН Эрнст Лев Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Борис Савельевич Народникий

доктор биологических наук, профессор

Наталья Анатольевна Зиновьева

доктор биологических наук, профессор Виктор Иванович Мнташов

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии

Зашита состоится 17 мая 2005 г. в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д.006.013.01. при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, пос. Дубровицы, ВИЖ; факс: 65-11-01.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЖа Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь ^

диссертационного совета, / кандидат биологических н^ук

В.П. Губанова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В XX веке бурное развитие методов селекции привело к значительному улучшению многих хозяйственных признаков домашнего скота. Потенциал крупномасштабной селекции далеко не исчерпан и в наше время. Однако возникновение ti развитие биотехнологии на базе клеточной и генной инженерии открыли новые возможности в этой области.

Вначале искусственное осеменение, замораживание спермы, затем трансплантация ранних эмбрионов позволили значительно сократить период создания и размножения новых пород (Прокофьев М.И., 1983). На следующем этапе были разработаны методы получения, созревания и оплодотворения in vitro ооцитов, которые открыли новые перспективы для ускоренной селекции, путем более полного использования генетического материала самок.

Известно, что число ооцитов, овулирующих спонтанно во время эструса, составляет лишь незначительную часть от тысяч половых клеток в яичниках при рождении самок домашнего скота. Остальные дегенерируют внутри яичника, что обычно называют атреэией. Достижения эмбриологической науки в настоящее время обеспечивают возобновление мейотического созревания у большинства ооцитов, извлекаемых из антральных фолликулов, со стадии диакинеза до метафазы II, однако эффективность их развития после оплодотворения in vitro остается более низкой по сравнению с оплодотворенными in vivo. Прогресс в этом направлении требует накопления данных фундаментальных исследований о процессе созревания, оплодотворения ооцитов и культивирования ранних эмбрионов in vitro в сравнении с оплодотворением in vivo.

С другой стороны, развитие молекулярной генетики привело к разработке методов, открывающих животноводству возможность работы на генном уровне (выделение, копирование, рекомбинация и интеграция в геном организма отдельных генов). Цель таких исследований заключается в получении трансгенных особей, у которых введенные гены путем синтеза чужеродных белков оказывают влияние на определенные свойства животного или придают организму определенные качества. В случае передачи трансгека по наследству возможно создание трансгенных линий.

В последние годы введение чужеродных генов в геном мышей стала рутинной процедурой (Palmiter R.D. et al., 1983; Ward K.et a!., 1986; Peshon J.J. et al., 1987; Bowen R.A. et al., 1994). С помощью этой модели удалось достичь значительных успехов в изучении механизма интеграции, экспрессии и наследования введенных генов, и тем самым вплотную подойти к получению трансгенных сельскохозяйственных животных (Ernst L.K.. et al.,

(Hammer R.E., 1985). Известно, что соматотропин играет ключевую роль в обменных процессах. Так, при введении коровам гипофизарного гормона роста человека удается повысить уровень молочной продуктивности на 1015% (Machiin L.J., 1973). Помимо увеличения надоев, после инъекции гормона роста (гипофизарного или микробного происхождения) молодняку различных сельскохозяйственных животных их скорость роста и качество мясной продукции возрастали (Wagner Т.Е. et al., 1981, 1986; Armstrong D.G., 1985).

Еще одним успешным направлением трансгенеза является генетическая модификация сельскохозяйственных животных для производства рекомбинантных белков фармацевтического назначения с молоком кроликов, коз, коров и с белком яйца кур. В настоящее время получено более 60 таких белков с молоком трансгенных животных. Некоторые из них находятся уже на Ш фазе клинических испытаний. Использование трансгенных сельскохозяйственных животных в качестве живых биореакторов по сравнению с другими технологиями производства рекомбинантных белков обусловлены целым рядом преимуществ. Получение рекомбинантных белков с использованием генетически модифицированных микроорганизмов не. обеспечивает посттрансляционных модификаций/ таких как гликозилирование, фолдинг белка, что приводит к снижению стабильности и физиологической активности получаемого белка. Несмотря на то, что в культуре клеток млекопитающих происходят все необходимые посттрансляционные процессы в рекомбинантном белке, концентрация последнего очень низкая, а сам процесс культивирования дорогостоящий и требует высокого технологического оборудования.

Получение животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, является еще одним важным направлением в трансгенезе. За последние десятилетия существенно расширились представления о вирусной природе целого ряда заболеваний сельскохозяйственных животных. Подробно изучены механизмы репродукции некоторых вирусов. Генетическое регулирование активности вирусных генов может позволить выводить формы животных с повышенной, устойчивостью к вирусным заболеваниям. Большой интерес в этом отношении представляют антисмысловые РНК (асРНК).

Однако, несмотря на тот факт, что в настоящее время различные виды домашних животных (и растений) подверглись генетической модификации, а именно, насекомые, рыбы, птицы, свиньи, кролики, козы, крупный рогатый скот, применение трансгенеза в области животноводства пока не связано с большими успехами, однако уже сейчас можно прогнозировать, что в будущем традиционные методы разведения животных будут дополнены, а отчасти и заменены новыми технологиями.

Цель н задачи исследований. Целью работы являлось изучение молекулярно-клеточных механизмов эмбриогенеза домашних животных, разработка и усовершенствование биотехнологических методов их

размножения и генетической трансформации путем введения чужеродных генов.

Для выполнения поставленной цели считали необходимым решить следующие задачи:

1. Изучить особенности развития половых клеток и ранних эмбрионов сельскохозяйственных животных и усовершенствовать на этой основе методы созревания, оплодотворения ооцитов и дальнейшего культивирования вне организма эмбрионов крупного рогатого скота.

2. Изучить динамику белкового синтеза у ранних эмбрионов крупного рогатого скота, подвергшихся процедурам культивирования вне организма, замораживанию, а также инъекции чужеродными генами.

3. Разработать новые способы диагностики оплодотворяю шей способности спермы быков с использованием процедуры всплывания спермы ("swim-up") и метода оплодотворения вне организма.

4. Усовершенствовать методы инъекции чужеродных генов в оплодотворенные вне организма ооцнты крупного рогатого скота.

5. Усовершенствовать методы получения телят из полученных вне организма, замороженных эмбрионов, а также после трансплантации эмбрионов, полученных из инъецированных чужеродным геном зигот.

6. Получить трансгенных кроликов и изучить взаимосвязь между структурой

генных конструкций, эффективностью и характером их интеграции у кроликов, а также их потомков.

7. Усовершенствовать методы получения трансгенных химерных эмбрионов

КУР-

Научная новизна исследований.- Впервые нами показано, что для созревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro достаточно J 8 часов, а не 22-24 часа, как было установлено ранее.

На основании полученных данных о наличии аналогии в процессе продвижения живчиков быка по половым путям самки и их всплывал ни в процедуре «swim-up» было сделано предположение, что концентрация мужских гамет в шейке матки остается постоянной (пока они жизнеспособны) за счет той силы, которая поддерживает динамическое . равновесие между концентрированной малоподвижной (в цервнкалыюм канале) и подвижной разбавленной (в матке) спермой.

Впервые показано, что оценка качества спермы быков ,по числу подвижных сперматозоидов в процедуре «swim-up» может быть объективным критерием прогнозирования оплодотворяющей способности спермы.

Исходя из концепции процесса оплодотворения у ' млекопитающих, выдвинутой академиком В.К. Мнловановым, выявленное нами повышение эффективности развития эмбрионов крупного рогатого скота после 2-х кратного добавления спермы к ооцитам в условиях m vitro по сравнению с однократным, может быть результатом более эффективного освобождения яйцеклеток от клеток яйценосного бугорка, лучшей избирательностью

проникновения сперматозоидов в яйцеклетку и, как следствие, уменьшением вероятности возникновения эпнгннитических нарушений у эмбрионов.

Показана возможность успешного культивирования in vitro ранних эмбрионов крупного рогатого скота на монослое эпителиальных клеток и с сывороткой крови других видов животных, в частности, клеток яйцевода кролика и эстральной сывороткой северных оленей.

Выявлены существенные различия в биосинтезе белка между полученными in vitro и in vivo эмбрионами, свидетельствующие о задержке в переходе синтетической активности с материнской мРНК на мРНК собственного генома у полученных in vitro эмбрионов.

В результате проведенных экспериментов впервые в нашей стране получены трансгенные кролики с геном гормона роста человека, а также выявлена экспрессия этого, гена,

Получены впервые трансгенные животные (кролики) с геном асРНК против аденовируса человека. Показана возможность получения потомства от этих трансгенов и наследования введенного гена у потомков. Установлено, что линейная форма плазмиды по сравнению с кольцевой в пять раз более эффективно встраивается в геном кролика.

Определены оптимальные режимы скорости центрифугирования для визуализации пронуклеусов у зигот у крупного рогатого скота.

Процедура микроинъекции чужеродного гена в зиготу крупного рогатого скота после предварительного центрифугирования не останавливала развитие ранних эмбрионов, а также не влияла на уровень и качественный состав синтезируемых белков, как сразу же после инъекции, так и при последующем развитии.

Определены оптимальные концентрации чужеродного гена и плотность эмбриональных клеток кур (бластодермальных и гонадных первичных половых клеток (ППК)) в культуре с целью достижения с их помощью высокого уровня трансфекции эмбрионов.

Практическая значимость работы. Результаты исследований, полученные при изучении процесса созревания ооцитов крупной) рогатого скота в условиях культивирования вне организма, могут быть использованы при внедрении данной технологии в производство, а также в целях рационального использования рабочего времени при проведении научных экспериментов.

Использование предложенного способа культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro вместе с соматическими клетками и сывороткой крови от других видов (кролика и северного оленя, соответственно) исключает вероятность переноса инфекционных агентов с белковыми или клеточными компонентами от животных-доноров (авторское свидетельство № 1578859 от 15.03.1990).

Преложенный метод 2-х кратного добавления сперматозоидов в среду для оплодотворения с 2-х часовым интервалом повышает в три раза выход полученных вне организма бластоцист крупного рогатого скота.

Определены оптимальные соотношения между сроками в проявлении охоты у реципиента и возрастом эмбриона для проведения эффективной пересадки полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота, а именно, возраст эмбриона должен совпадать или опережать на один день стадию полового цикла реципиента.

Разработанный модифицированный способ отбора подвижных сперматозоидов быка позволяет примерно в пять раз повысить эффективность использования спермы быка при оплодотворен ИМ in vitro яйцеклеток крупного рогатого скота.

Предложенный метод диагностики оплодотворяющей способности спермы быков путем сравнительного изучения подвижности сперматозоидов от разных быков в условиях in vitro отличается простотой, дешевизной и быстротой исполнения (положительное решение о выделении патента на изобретение от 30.01И996 г.,заявка №95109519/15 (016259).

Отработана технология замораживания в азоте полученных вне организма эмбрионов . крупного рогатого скота с применением этилен гликоля.

Результаты исследований уровня биосинтеза белка в полученных in vitro эмбрионах крупного рогатого скота в сравнении с полученными in vivo эмбрионами, а также до и после их замораживания, могут быть использованы в качестве оценочного критерия при совершенствовании методов культивирования и криоконсервации ранних эмбрионов.

Установлено, что ППК гонад кур, выделенные на 7-е сутки инкубации, более удобный объект для получения как химер, в том числе и трансгенных, так и для создания долгосрочных культур с целью' их стабильной трансфекции чужеродным геном.

Результаты исследований, направленные на разработку оптимальных приемов микроинъекции чужеродных генов в зиготы кроликов и крупного рогатого скота, трансфекции куриных ППК могут быть нспользованы как в практической работе по получению трансгенных животных, так и в целях дальнейшего развития методов трансгенеза.

Основные положения, выносимые па защиту:

1. Незрелые ооциты крупного рогатого скота в условиях культивирования вне организма завершают стадию созревания через 18 часов и в течение последующих б часов сохраняют свои потенции к оплодотворению.

2. Модифицированный способ отбора подвижных сперматозоидов быка. позволяет примерно в пять раз повысить эффективность использования спермы при оплодотворении яйцеклеток крупного рогатого скота in vitro.

3. Новый метод диагностики оплодотворяющей способности спермы быков в условиях in vitro основан на измерении концентрации подвижных живчиков быка при проведении процедуры «swim-up».

4. Полноценное развитие полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты может поддерживаться сывороткой крови северных оленей или эпителиальными клетками яйцевода кролика.

s

Использование же биологической жидкости другого вида может в значительней степени ограничить перенос определенных инфекций.

5. Эффективность развития эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты после 2-х кратного добавления сперматозоидов более чем в три раза выше, чем после однократного.

6. Существуют значительные индивидуальные различия между коровами-донорами по эффективности оплодотворения in vitro ооцитов и дальнейшему развитию эмбрионов. Процент дробящихся зигот к числу осемененных ооцитов составил в среднем 36,7% с колебаниями от 22.2% до 72.7% у отдельных животных. Стадии морулы и бластоцисты достигали в среднем 2.4±1.8 эмбриона на корову с колебаниями от 0 до 5 эмбрионов.

7. Прижив л яемость эмбрионов крупного рогатого скота повышается при их трансплантации реципиентам в дни цикла, совпадающие с возрастом эмбриона (16.1%) или опережающие на один день (23.1%) по сравнению с отстающими на 1-2 дня (7.1-11.8%).

8. Белковый синтез у полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота имеет минимальную активность на стадии зиготы, вдвое возрастает к 8-ми клеточной стадии и втрое к стадии бластоцисты.

9. Эффективность получения трансгенных кроликов от числа рожденных потомков, в пронуклеусы зигот которых инъецирован ген гормона роста человека, составляет 10,9%. Установлена экспрессия гена гормона роста человека в сыворотке крови трансгенных кроликов.

10.Максимальная эффективность получения трансгенных кроликов от числа рожденных потомков продемонстрирована при инъекции гена асРНК против аденовируса человека и составила 35.7%. Линейная форма плазмиды PGMA с геном асРНК по сравнению с кольцевой более эффективно интегрируется в хромосомную ДНК зигот кроликов. Наследование чужеродного гена наблюдалось у 5 из 14 кроликов первого поколения.

11.Подобранные параметры позволяют трансфецировать бактериальным геном Р-галактозидазы около 30% эмбриональных клеток кур в культуре (бластодермальных и гонадных ППК). После инъекция суспензии трансфецированных клеток реципиентам была выявлена экспрессия чужеродного гена в тканях химерных эмбрионов.

Апробзнкя работы. Основные материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ежегодных отчетных сессиях Биотехцентра, НИИГОК н ВИЭВ в период с 1988 г. по 1997 г., а также на: международных конференциях (Харьков, 1988, Аскания - Нова, 1993, Санкт-Петербург, 1993, Киев, 1994, Дубровицы, 2003 г., Москва 2004 г.), международном симпозиуме (Санкт-Петербург, 1994), международном обществе по пересадке эмбрионов (Ницца, 1997), всероссийской научной школы-конференции в Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (1997).

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 30 печатных работах, в том числе В центральных журналах — 12, книгах — 2, в зарубежных изданиях - 2, получено 1 авторское свидетельство и 1 положительное решение о выдаче патента на изобретение и методических рекомендациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 270 страницах компьютерного текста, содержит 45 таблиц, 19 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных исследований, их результатов и обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Список литературы включает 437 источников, втом числе 419 иностранных авторов.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводили в период 1986*2004 г.г. на кроликах в "Горках Ленинских" (ЭНИБ "Горки Ленинские") и отделе Биотехцентр Всероссийского института пушного звероводства и кролиководства РАСХН (НИИПЗК) и Всероссийском институте экспериментальной ветеринарии РАСХН (ВИЭВ), на коровах и телках в хозяйствах Московской, Воронежской, Оренбурской и Нижегородской областей, а также оплодотворенных яйцах кур породы кросса «Пткчное» (племенной птицеводческий завод «Птичное», г. Наро-Фоминск, Московская область) в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦРАМН.

Яйцеклетки получали из яичников, доставленных с Московского и Подольского мясокомбинатов в течение 1.5-2 часов. Для оплодотворения вне организма использовали замороженную сперму быков с Центральной станции осеменения (п.Быково).

Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота проводилось в среде М-199 с различными биологическими добавками, а оплодотворение — в приготовленной в лабораторных условиях среде рег(-ТЛЬР, Культивирование вне организма эмбрионов кролика проводили в среде Хэма Р-10.

Цитологический анализ эмбрионов крупного рогатого скота и кроликов проводили под микроскопом после предварительной фиксации и окраской лакмоидом, а ППК кур окраской ШИК-реактивом.

Замораживание эмбрионов крупного рогатого скота осуществляли по стандартной программе на автоматическом приборе ЗЭМ-4 (г.Харьков). Для трансплантации зародышей крупного рогатого скота использовали различные модифицированные катетеры Кассу.

Метаболическое мечение общих белков исследовали методом встраивания радиоактивного по сере метионина в нагивные белки эмбрионов крупного рогатого скота, при 1.5 или 2.5 ч их совместной инкубации.

М и крои нъекци и чужеродных генов в пронуклеусы зигот кроликов и крупного рогатого скота проводили на микроманипуляторе КМ-2 с оптикой Намарского.

Наличие гормона роста человека в сыворотке крови трансгенных кроликов исследовали радиоиммунологическим методом с использованием китов фирмы «Сорин» (Франция).

Трансгенных кроликов идентифицировали с помощью блот-анализа по Саузерну, Хромосомную ДНК выделяли из ушной ткани и спермы, а затем проводили гибридизацию с мечеными зондами.

Трансфекция бластодермальных и гонадных примордиальных первичных клеток, а также эмбрионов кур, осуществляли бактериальным геном р-галактозидазы с помощью липофекции. Наличие чужеродного гена в химерных эмбрионах определяли методом ПЦР, а его экспрессию - окраской Х-Ёа!.

Статистическую обработку результатов проводили с применением биометрических методов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ СОЗРЕВАНИЯ ООЦИТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА. ИХ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ И РАННИХ СТАДИЙ РАЗВИТИЯ ЭМБРИОНОВ ВНЕ ОРГАНИЗМА

Практически невозможно внедрять технологии клеточной и генной инженерии в животноводство, не имея в своем распоряжении достаточного числа зигот. Высокая трудоемкость и дороговизна гормональных обработок доноров эмбрионов, их извлечение и широкая варнабильность в их оплодотворяемости послужили основанием для разработки технологии дозревания ооцитов, полученных при убое крупного рогатого скота на мясокомбинате путем аспирации фолликулов диаметром менее чем 7 мм. Использование метода оплодотворения вне организма открывает также большие возможности в преодолении многих форм бесплодия. Метод оплодотворения яйцеклеток вне организма'может быть также эффективно использован и для оценки оплодотворяющей способности сперматозоидов и яйцеклеток.

В течение последних трех десятилетий были достигнуты значительные успехи в разработке метода оплодотворения вне организма яйцеклеток кроликов, хомяков, мышей, овец, свиней и крупного рогатого скота. Интенсивно проводятся исследования по дальнейшему совершенствованию этого метода и в настоящее время.

3.1.!. Влияние сыворотки крови северных оленей на созревание ооцптов it дальнейшее культивирование in vitro эмбрионов крупного рогатого скота

Обычно для культивирования яйцеклеток и эмбрионов крупного рогатого скота используют инактивнрованную эстральную сыворотку коров. Однако биологическая жидкость, полученная от гомологичного вида, при культивировании эмбрионов in vitro может быть источником инфекции. Использование же биологической жидкости другого вида в значительней степени ограничило бы риск возникновения подобных ситуаций. В настоящем исследовании изучена возможность добавки в среду для культивирования ооцитов крупного рогатого скота сыворотки крови северных оленей вместо сыворотки крови эстральной коровы.

Как видно из данных таблицы 1, продемонстрирована успешная попытка культивирования ооцитов, а затем после оплодотворения и эмбрионов крупного рогатого скота с использованием инактивированной при 56"С сыворотки крови северных оленей в качестве белковой добавки к среде. После in vitro оплодотворения получено 57,4% дробящихся эмбрионов (в отдельных опытах 70%) от числа ооцитов, созревших в среде М-199 с сывороткой крови северных оленей, против 73,4% эмбрионов в той же среде с сывороткой крови эстральиых коров, но разница была статистически недостоверной.

При дальнейшем развитии эмбрионов: 16,2% эмбрионов из числа ооцитов, созревших в среде с добавлением сыворотки крови северных оленей, достигли стадии бластоцисты (в отдельных опытах 27% эмбрионов) и 24,8%, созревших в среде с добавлением сыворотки крови эстральиых коров (Р>0.05).

Таблица ], Созревание ооцитов и развитие ранних эмбрионов в среде с добавлением эстральной сыворотки коров и северных оленей

Показатели Тип сыворотки крови

эстральиых коров северных оленей

ооциты, п 192 439

дробящиеся эмбрионы п 141 " 252°

% 73.4 57.4

бластоцисты п 35* 41е

% 24.8 16.2

Р а,б > 0,05

Таким образом, нами продемонстрирована возможность использования сыворотки крови другого вида животного в качестве белковой добавки при культивировании ооцитов н ранних эмбрионов крупного рогатого скота вне организма.

3.1.2. Влияние продолжительности созревания ооцитов крупного рогатого скота в условиях in vitro на их дальнейшее развитие

Важным элементом в системе оплодотворения яйцеклеток in vitro является выявление оптимальных параметров продолжительности культивирования для эффективного созревания ооцитов. Определение этого параметра важно также и с точки зрения выбора удобного для исследователя время суток для проведения оплодотворения яйцеклеток in vitro после их созревания. По литературным данным интервал проведения этой процедуры варьирует от 22 до 26 часов.

Нами были оценены два периода созревания ооцитов крупного рогатого скота (18 и 24 часа), как по числу дробящихся яйцеклеток, так и по числу эмбрионов, достигших стадии бластоцисты. Не обнаружено достоверных различий в получении полноценных эмбрионов при созревании ооцитов в диапазоне от 18 до 24 часов как по числу дробящихся зародышей (70,9% и 75,9%), так и по их способности к дальнейшему развитию до стадии бластоцисты (25.6% и 24,2%, соответственно, Р>0.05). Этот научный факт имеет также и практическое значение, т. к. интервал использования созревших in vitro ооцитов для оплодотворения in vitro можно расширить еще на 4-е часа (т.е. процедуру оплодотворения можно проводить через 18-26 часов после процедуры созревания ооцитов), чтобы провести эту работу в более удобное для исследователя время суток,

3.1 Л Влияние продолжительности процедуры отбора подвижных сперматозоидов на эффективность оплодотворения яйцеклеток вне организма

Одним из этапов подготовки спермы к оплодотворению in vitro является процедура отбора подвижных гамет. Нами был выбран метод всплывания сперматозоидов, так называемая, «swim-up»- процедура (Lopata A. et al., 1976). Однако в научной литературе отсутствовали данные о временных параметрах всплывания сперматозоидов, не исследовалась возможность более эффективного использования одной дозы спермы для оплодотворения in vitro ооцитов.

В первой серии опытов исследовался временной фактор процедуры всплывания сперматозоидов быка, а именно, действительно ли инкубация в течение 45-60 минут, как это предложено авторами метода, является оптимальным для сбора максимального числа подвижных сперматозоидов. В результате проведенных экспериментов нами было показано, что после 5 мин инкубации концентрация подвижных сперматозоидов уже не увеличивается (таблица 2), Затем было изучено влияние продолжительности инкубации сперматозоидов на эффективность их оплодотворяющей способности в условиях in vitro. Оказалось, что при уменьшении срока инкубации спермы с 60 минут до 15 минут эффективность дробления зигот (52,1% против 65,0%, соответственно, Р>0,05) и дальнейшего развития до стадии морулы и

бластоцисты (24,0% против 21,0%, соответственно, Р>0.05) не снизилась. Таким образом, продолжительность всплывания сперматозоидов может быть сокращена с 60 минут до 15 минут без снижения результативности процесса оплодотворения.

Таблица 2. Эффективность отбора подвижных сперматозоидов в зависимости от времени инкубации

Время инкубации, мин Число

опытов сперматозоидов, млн. в 1 мл

5 5 3.30±0.4б

15 б 3.80±0.53

30 5 1.9010.75

45 5 2.80 ±0.72

60 6 3.00±0.01

В следующей сернн экспериментов исследовалась возможность повторного проведения процедуры отбора подвижных сперматозоидов с одной и той же дозы спермы. Смену среды и инкубацию (15 мин) проводили пять раз. Во второй смене среды число подвижных сперматозоидов/мл было примерно таким же (1,80x10* ±0,21x10*), как и во время первого отбора (2,10x10**0,21x10*). Более того, даже в том случае, когда среду над осадком сперматозоидов меняли пять раз, концентрация сперматозоидов/мл, оставалась приблизительно той же, что была обнаружена в первой порции среды (2,00х106±0,34x10* против 2,10х10*± 0,21x10*, соответственно).

Полноценность всплывших после 3»х кратной смены среды сперматозоидов определялась по их способности к оплодотворению in vitro яйцеклеток крупного рогатого скота. Как видно из данных таблицы 3, оплодотворяющая способность сперматозоидов, полученных после 3-х кратной замены среды, была несколько ниже, чем у первоначально полученных сперматозоидов (47,0% против 65,0% дробящихся эмбрионов, соответственно, Р<0,05). Однако по числу развившихся морул и бластоцисг между этими труппами не обнаружено статистически достоверной разницы (Р>0,05).

Таблица 3. Влияние смены Среды на оплодотворяющую способность спермы быка

Кратность Число ооцитов Число

смены среды дробящихся морул и

зародышей бластоцисг

п % п %

1 253 164 65.0* 34 21.0*

3 220 103 47.06 21 20.3'

Р а,б < 0.05, Рв,г> 0.05

Таким образом, благодаря приему многократных смен в процедуре «swim-up» можно в несколько раз увеличить эффективность использования одной дозы спермы, что особенно важно, когда применяют сперму от высокоценных быков-производителей.

3.1.4. Влияние процедуры 2-х кратного добавления спермы к ооцнтам в условиях in vitro на дальнейшее развитие до стадии бластоцисты

Как известно, эффективность in vitro оплодотворения определяется не только полноценностью созревания ооцктов, условиями капацитации сперматозоидов или составом культуральных сред на всех этих этапах, но, по-видимому, и целым рядом факторов, связанных непосредственно с процессом оплодотворения, а именно, со слиянием мужской и женской гамет.

Еще в 1962 году академик В.К. Милованов выдвинул концепцию о четырех этапах оплодотворения у млекопитающих, согласно которой на первом этапе происходит деполимеризация и растворение межклеточного вещества остаточных скоплений клеток яйценосного бугорка При помощи выделяемого сперматозондаими фермента гиалуронидазы, и необходимо достаточно большое число живчиков.

Опираясь на изложенное, нами было сделано предположение о том, что при процедуре оплодотворения in vitro, в отличие от in vivo, сперматозоиды большей частью гибнут на первом этапе, и для завершения последних этапов оплодотворения полноценных спермиев уже не хватает. Поэтому, возможно, при добавлении свежей порции гамет можно будет повлиять на результаты оплодотворения in vitro.

С этой целью нами в отличие от традиционного метода однократного введения сперматозоидов в среду с ооцитами при оплодотворении вне организма, было проведено 2-х кратное добавление (с интервалом в два часа). Вначале вносили к ооцнтам разбавленную сперму и инкубировали в течение 2-х часов (2-3х 106спермнев/мл), а затем заменяли на более концентрированную (1x107 слермиев/мл) и инкубировали еще в течение 1824 часов. Оказалось, что 2-х кратное добавление спермы не оказало влияния на эффективность дробления эмбрионов, в то время как выход бластоцист увеличился более чем в три раза.

Исходя из изложенной выше концепции процесса оплодотворения у млекопитающих, можно предположить, что увеличение в конечном итоге числа сперматозоидов при оплодотворении вне организма в опытной группе способствовало более быстрому освобождению яйцеклеток от клеток яйценосного бугорка и повышению избирательности проникновения сперматозоидов в яйцеклетку, что в свою очередь привело к более полноценному оплодотворению (возможно, к снижению вероятности возникновения эпигинитических нарушений) и, как следствие этого, развитию большего числа оплодотворенных яйцеклеток до более

продвинутых стадий.

ЗД.5. Культивирование полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота

Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота вне организма обычно проводится с использованием инакти в иро ванной сыворотки крупного рогатого скота, хотя в зарубежной литературе были сообщения об использовании неинактивированной сыворотки крови в качестве белковой добавки в среду для созревания и культивирования оплодотворенных вне организма ооцитов.

Нами был изучен вопрос, действительно ли инактивированная сыворотка благоприятно воздействует на развитие эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты по сравнении с не инакти вирован ной сывороткой, поскольку существует мнение о том, что при инактивации сыворотки биологически активные вещества (гормоны, ростовые факторы), содержащиеся в ней, частично разрушаются.

Созревание ооцитов крупного рогатого скота вне организма проводили как обычно в среде М-199 с добавлением 20%-оЙ инактивированной эстральной сыворотки коров. Однако культивирование эмбрионов крупного рогатого скота вне организма до стадии бластоцисты проводили в среде М-199 с добавлением 20%-ой инактивированной эстральной сыворотки коров (контроль) и в среде М-199 с добавлением 20%-ой неинактивированной эстральной сыворотки коров (опыт).

Анализ результатов показал (таблица 4), что число дробящихся эмбрионов в контрольной и опытной группах было различным. Так, в контрольной группе процент дробящихся эмбрионов составил 68,4% (13/19), а в опытной группе - 39,5% (15/38). На седьмой день после оплодотворения процент эмбрионов, достигших стадии бластоцисты, был также достоверно выше при культивировании эмбрионов с использованием инактивированной сыворотки и составил 23,1% по сравнению с использованием неинактивированной сыворотки, где процент бластоцист был равен 6,7% (Р< 0,05).

Таблица 4. Развитие in vitro эмбрионов крупного рогатого скота в зависимости от добавления инактивированной и неинактивированной сыворотки в среду культивирования

Тип сыворотки Число

ооцитов дробящихся эмбрионов бластоцист

л % п %

Инакти вированная 19 13' 68.4 3* 23.1

Ней и активированная 38 15* 39.5 1° 6.7

Ра,б < 0.05

Таким образом, проведенные нами эксперименты показали, что культивирование эмбрионов крупного рогатого скота вне организма лучше проводить с использованием инакгивированной сыворотки, которая очевидно не содержит биологически активных веществ, способных оказать негативное влияние на жизнеспособность эмбрионов.

Согласно литературным данным культивирование ранних эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты удалось провести с использованием яйцевода временного реципиента (Boland М., 1984; Imai К. et al., 1997), а также эпителиальных клеток яйцевода крупного рогатого скота (Fukui У. et а)., 1988). Однако использование временного реципиента представляет собой трудоемкий и дорогостоящий метод, тогда как при культивировании на монослое клеток возможна вероятность переноса инфекции клетками того же вида. В наших опытах показана возможность успешного культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота на монослое эпителиальных клеток другого вида животных. Нами были использованы эпителиальные клетки яйцевода кролика, полученные на второй день после овуляции (таблица 5).

Таблица 5. Эффективность развития in vitro эмбрионов крупного рогатого скота на монослое эпителиальных клеток яйцевода коров и кролика

Монослой клеток Число

ООЦИТОБ дробящихся эмбрионов бластоцист

п % п %

кролика 63 49* 77.8 8* 16.3

коровы 73 50" 68.5 12г 24.0

Раб.вг < 0.05

Оказалось, что эпителий яйцевода кролика способен поддерживать в культуре развитие эмбрионов крупного рогатого скота. Однако, процент развившихся бластоцист из числа дробящихся эмбрионов на 8% ниже при со культивировании с эпителиальными клетками яйцевода кролика по сравнению с эпителиальными клетками яйцевода коровы. Тем не менее, проведенные нами эксперименты убедительно показали, что эпителиальные клетки яйцевода кролика способны поддерживать развитие ранних эмбрионов крупного рогатого скота.

3.1.6. Изучение метаболизма белка в ранних эмбрионах крупного рогатого скота

Полноценность развития оплодотворенных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота в настоящее время оценивается только по эффективности достижения эмбрионами соответствующих стадий развития, то есть по их морфологическим признакам, и по результатам их трансплантации. Можно

полагать, что изучение динамики биосинтеза белка у ранних эмбрионов при их дальнейшем развитии определенно пролило бы свет на механизм молекулярных взаимодействий, имеющих место на данном этапе развития. На молекулярном уровне процессы, происходящие в эмбрионе в ходе его развития, изучены недостаточно. Не изучены также на биохимическом уровне те изменения на молекулярном уровне, которые неизбежно возникнут в эмбрионах после таких процедур, как замораживание, микроманнпуляции (получение трансгенных и клонированных животных) и других. В наших исследованиях мы попытались сделать первые шаги к решению этих вопросов на эмбрионах крупного рогатого скота.

Общую картину биосинтеза белка полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота можно охарактеризовать следующим образом: минимальный уровень включения метки наблюдался на стадии зиготы, возрастал вдвое к 8-ми клеточной стадии, и втрое - к стадии бластоцисты, причем на стадиях 16- и 32-клеток синтез белка практически не менялся.

Проведенные нами эксперименты по определению активности биосинтеза белка у полученных in vitro эмбрионов выявили как сходство с аналогичными процессами у полученных in vivo эмбрионов, так и некоторые различия. Так, у полученных in vitro эмбрионов, также как и у полученных в организме животного (Fríe R.E. et al., 1989), качественные изменения в биосинтезе белка наблюдались на 8-ми клеточной стадии и стадии бластоцисты. Идентичные процессы наблюдались в биосинтезе белка у полученных in vitro и in vivo эмбрионов при его количественной оценке: с 16 до 32-клеточной стадии уровень включения метки оставался постоянным, а затем возрастал значительно к стадии бластоцисты. Однако выявлены и существенные различия между полученными in vitro и in vivo эмбрионами. Так, у полученных in vitro эмбрионов интенсивность синтеза белка не только не уменьшалась от зиготы к 8-ми клеточной стадии, как это было показано для in vivo эмбрионов, а, наоборот, повышалась, К тому же, соотношение включения метки у in vivo полученных зигот по сравнению с бластоцистамн было 6:1, а у in vitro полученных зигот соответственно 3:1, что, очевидно, связано с пониженной метаболической активностью последних.

Считается, что качественные изменения у полученных in vivo эмбрионов крупного рогатого скота на 8-16 - клеточной стадии и минимум уровня синтеза белка на этой стадии связаны с переходом синтетической активности эмбриона с материнской мРНК на мРНК эмбрионального собственного генома (Lawjtts J.A. et al, 1991). Действительно, согласно нашим данным, у полученных in vitro эмбрионов хотя и наблюдались изменения в качественном составе синтезируемых белков на 8-ми клеточной стадии, но не такие значительные. Вероятно, у полученных in vitro эмбрионов синтез белка с материнской мРНК все еще продолжался до S-ми клеточной стадии, что и вызывало торможение процесса переключения биосинтеза белка на эмбриональную мРНК, а значит, и могло понизить их жизнеспособность. Последствия такого торможения, вероятно, отразились и на дальнейшем развитии эмбрионов в виде более низкой интенсивности биосинтеза белка у

in vitro полученных бластоцист по сравнению с полученными в организме.

Таким образом, при совершенствовании метода культивирования in vitro эмбрионов крупного рогатого скота, возможно, следует оценивать его эффективность путем сравнения биосинтетической активности у полученных in vitro и in vivo бластоцист.

Нами был изучен также метаболизм белка у эмбрионов крупного рогатого скота до и после хрпокоисервации. Было показано, что полученные in vivo бластоцисты крупного рогатого скота до замораживания в глицерине (эмбрионы были заморожены в хозяйстве «Петровское» по стандартной методики для замораживания эмбрионов, полученных in vivo) и после оттаивания ни количественно, ни качественно по биосинтезу белка не имели различий.

Аналогичный эксперимент был проведен с полученными in vitro бластоцистами, которые были заморожены в этиле и гликоле. Бластоцисты до замораживания показали идентичный профиль белков, а из числа бластоцнст после замораживания и оттаивания половина имели отличающийся белковый профиль в области - 80, 67,40, 37, 10 т.н.п. По количественному включению метки бластоцисты до замораживания также превосходили бластоцисты после оттай вания.

Таким образом, снижение жизнеспособности оттаянных полученных in vitro эмбрионов по сравнению с полученными in vivo эмбрионами крупного рогатого скота, связано, по крайней мере, с 2-мя факторами: количественным снижением уровня биосинтеза и качественными изменениями, так как эти явления, как было показано выше, не имеют место у in vivo полученных бластоцист.

3.2. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОПЛОДОТВОРЯЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ СПЕРМЫ БЫКА В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

Метод искусственного осеменения открыл широкую возможность для ведения эффективной племенной работы и получения неограниченного числа потомков от выдающихся производителей. Актуальность метода неоспорима и в вопросах дальнейшего размножения домашних животных, полученных генно-инженерными методами, при этом понятие об оценке семени является одним из ключевых моментов. Наиболее объективным методом определения оплодотворяющей способности спермы быка является прямой метод по результатам осеменения коров и телок. Однако этот "прямой" метод зависит от многих субъективных факторов, таких, как воспроизводительная способность осемененных самок, способа их осеменения, квалификация техника искусственного осеменения и других. Этот метод неудобен при оценке оплодотворяющей способности спермы молодых быков и совершенно непригоден для предварительного определения оплодотворяющей способности отдельных партий эякулятов, предназначенных для искусственного осеменения.

Поэтому многие годы делаются попытки разработать методы определения оплодотворяющей способности спермы быков в лабораторных условиях на основании таких свойств семени, как ее концентрация, а также морфологические и физиологические характеристики сперматозоидов. Был определен ряд тесных и достоверных соотношений мелзду отдельными показателями спермы. Однако большинство исследователей пришли к заключению о малой связи этих показателей с фактической оплодотворяющей способностью семени быка.

Разработка в 80-е годы способа оплодотворения ооцитов сельскохозяйственных животных вне организма, в том числе крупного рогатого скота, открыла возможность прямой оценка оплодотворяющей способности семени. Поэтому в одну из задач настоящего исследования входило изучение оплодотворяющей способности семени быков методом оплодотворения вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота.

3.2.1. Изучение индивидуальных различий в оплодотворяющей способности спермы быков в условиях in vitro

При разработке технологии in vitro оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота была рассмотрена идея использования данного метода для предварительной оценки оплодотворяющей способности спермы от разных быков, тем более что подобные предположения уже обсуждались (Wright R.W. et al., 1981). Так, к примеру, значительные положительные корреляции наблюдались между дроблением, формированием бластоцист in vitro с показателем отсутствия охоты у коров в течение 56 дней после искусственного осеменения семенем, которое было использовано для оплодотворения in vitro (Sírard М.А. et al-, 1988). Вместе с тем необходимо иметь в виду, что многие факторы, определяющие дробление и формирование бластоцист, зависят от условий культивирования эмбрионов (Northey D.L. et al., 1992).

Нами были сопоставлены данные по оплодотворяющей способности спермы четырех быков в условиях in vitro и результатами искусственного осеменения in vivo. По данным таблицы б процент дробящихся эмбрионов после оплодотворения вне организма семенем трех быков практически не различался (40,8-45,1%), несмотря на различную оплодотворяющую способность семени по результатам искусственного осеменения (55-76%). Более высокий процент дробящихся эмбрионов был получен после оплодотворения вне организма семенем быка Секрет (66,1%) по сравнению с семенем трех указанных выше быков, и эта разница была статистически достоверна (Р<0,05). Однако его оплодотворяющая способность по результатам искусственного осеменения (65 %) была ниже, чем у двух из трех упомянутых быков (Рислинг и Сантал, 72,0 и 76,0%, соответственно).

Таблица б. Индивидуальные данные быков-производителей по оплодотворяющей способности их спермы в условиях in vitro и по результатам искусственного осеменения

Кличка быка Результаты искусствен иого осеменен ия,% Число ооцитов Число дробящихся эмбрионов Из них достигли стадии

п % 4-х клеток Морулы и бластоцисты

п % п %

1 .Ананас 55.0 76 34" 44.7 21' 61.8 1' 2.9

2.Секрет 65.0 59 39* 66.1 24* 61.5 2 5.1

3. Рислинг 72.0 102 46° 45.1 2бг 56.5 4 8.7

4.Сантал 76.0 120 49" 40.8 25* 51.0 у Ж 14.3

Р аб,вг,дв,жз < 0.05

Однако через восемь суток культивирования эмбрионов была выявлена тенденция к прямой зависимости между процентом развившихся in vitro морул и бластоцист н показателями оплодотворяющей способности спермы быков по результатам искусственного осеменения. Так, после in vitro оплодотворения ооцитов семенем быков Ананас, Секрет, Рислинг и Сантал процент эмбрионов, достигших стадии морулы и бластоцисты, составил 2,9%, 5,1%, 8,7% и 14,3%, соответственно, а оплодотворяющая способность спермы этих быков по результатам искусственного осеменения - 55%, 65%, 72% и 76%, соответственно. При этом достоверность различия между быками (Р<0,05) по проценту полученных морул и бластоцист была только между быком Ананас, имеющим самую низкую оплодотворяющую способность по результатам искусственного осеменения (55%), и быком Сантал, имеющим наибольшую оплодотворяющую способность (76%), Что касается других быков, то такая зависимость также просматривалась, но вследствие небольших различий между быками по оплодотворяющей способности по результатам искусственного осеменения эти различия были недостоверны.

3.2.2. Изучение взаимосвязи между индивидуальным» показателями оплодотворяющей способности спермы быков по результатам искусственного осемеиення н числом всплывших сперм и ев в процедуре «swim-up»

Полученные нами результаты о свойствах подвижных сперматозоидов быка при проведении процедуры «swim-up» привели нас к мысли об изучении возможной корреляции между числом всплывших гамет от различных быков и оплодотворяющей способностью их спермы in vivo.

Оплодотворяющая способность спермы по числу подвижных гамет оценивалась у 5-и быков. Как видно .из данных таблицы 7, наблюдалась прямая зависимость между числом всплывших гамет и их способностью к оплодотворению по результатам искусственного осеменения, однако в трех группах (2,5,10) она была недостоверной.

В б-ти (86%) из 7-ми случаев, разница в оплодотворяющей способности спермы между быками по результатам искусственного осеменения была в пределах 10-17%, и концентрация всплывших гамет различалась на 0.94-1.40 млн/мл и была статистически достоверной. В одном случае (группа 2) несмотря на то, что разница в оплодотворяющей способности спермы между быками Сантал и Секрет была 11%, концентрация всплывших спермиев различалась лишь на 0.28 млн/мл, и эта разница была недостоверной. Недостоверность данных в последнем случае, возможно, связана с неоднозначностью результатов но искусственному осеменению, т.к. известно, что оплодотворяющая способность спермы в зависимости от хозяйства может варьировать от 10-15%.

Таблица 7. Эффективность отбора всплывших сперматозоидов от различных быков

№ группы Кличка быка Оплодотворяе-мость нн ВНВ0,% Разница в концентрации всплывших живчиков, млн/мл Р

К Сагггал 76 +0.20 <0.05

Рислинг 72

2. Сантал 76 +0.28 >0.05

Секрет 65

3. Сантал 76 +1.24 <0.01

Шкипер 56

4. Сантал 76 +1.40 <0.01

Ананас 55

5. Рислинг 72 +0.08 >0.05

Секрет 65

6. Рислинг 72 +1.04 <0.01

Шкипер 56

7. Рислинг 72 +1.20 <0.01

Ананас 55

8. Секрет 65 +0.94 <0.01

Шкипер 55

9. Секрет 65 +1.08 <0.01

Ананас 55

10. Шкипер 56 +0.16 >0.05

Ананас 55

Было проведено по 5 повторов для каждой группы экспериментов

В трех случаях (группы 1, 5, 10) разница в оплодотворяющей способности спермы между быками колебалась в пределах 1-7%, и разница в концентрации всплывших спермиев была низкой, 0.08-0.20 млн/мл.

Эти наблюдения дают основание заключить, что разница в концентрации всплывших спермиев в пределах 1 млн/мл и более может быть достаточно объективным показателем прогнозирования оплодотворяющей способности семени быков в условиях in vivo.

3.3. КГИОКОНСЕРВАЦИЯ И ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ ВНЕ ОРГАНИЗМА ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

3.3.1. Получение телят после пересадки полученных in vitro эмбрионов

К тому времени, когда были получены первые морулы и бластоцисты из оплодотворенных вне организма ооцитов крупного рогатого скота, техника трансплантации полученных in vivo эмбрионов уже успешно применялась на практике. Было установлено, что приживляемость эмбрионов после трансплантации зависит . от многих факторов. Например, наиболее эффективна пересадка эмбрионов в рог матки со стороны яичника с желтым телом и в верхушку рога матки по сравнению с ее основанием. Однако существенным фактором является и квалификация техника по пересадке эмбрионов. Стадия развития эмбрионов во время нехирургической пересадки также влияет на успех операции. Большинство авторов придерживаются мнения о том, что трансплантация эмбрионов более эффективна через 5-6 дней после начала охоты (Seidel G.F., 1981). Результаты пересадки эмбрионов в значительной мере зависят от синхронности в сроках проявления охоты у реципиента и возраста эмбриона. У крупного рогатого скота максимальное число стельностей получали после синхронной пересадки полученных in vivo эмбрионов.

Поэтому нами был использован весь арсенал знаний для разработки данной технологии в отношении эмбрионов, полученных вне организма. Результативность пересадки служила и показателем полноценности полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота с использованием предложенных нами приемов. Эмбрионы 7-8-дневного возраста на стадии поздней морулы и бластоцисты пересаживали в хозяйствах Московской области (Агрофирма "Ямская", "Барыбино") коровам и телкам-реципиентам на стадии полового цикла, соответствующей возрасту эмбриона (0 дней), на 1-2 суток (+1,+2 дня) раньше возраста эмбриона или на одни сутки (-1) позднее возраста эмбриона (таблица 8). Проведена 91 пересадка полученных in vitro эмбрионов, в том числе 21 эмбрион 7-дневного и 70 эмбрионов - 8-дневного возраста.

При этом наблюдали тенденцию повышения приживляемости эмбрионов, если трансплантация реципиенту была проведена на стадии полового цикла, которая совпадала с возрастом эмбриона (12.5 —17.4%) или

отставала на одни сутки (18.2-50.0%) по сравнению с пересадкой эмбрионов в возрасте, опережающем на 1-2 сутки стадию полового цикла (7,1-11,8%).

Таблица 8. Результативность трансплантации эмбрионов в зависимости от стадии полового цикла реципиента и возраста эмбриона

Возраст эмбриона по отношению к суткам полового цикла реципиента, сутки Число пересадок на сутки цикла Получено телят

7-е 8-е на 7-е сутки на 8-е сутки

л % п

+2 - 17 - - 2 11.8

+1 2 28 - - 2 7.1

0 8 23 1 12.5 4 17.4

-1 II 2 2 18.2 1 50.0

Этот факт, очевидно, связан с запаздыванием развития эмбриона в условиях in vitro, и как следствие, неспособностью его дальнейшего полноценного развития. Аналогичные предположения выдвигали и зарубежные исследователи (Lee C.N. et al., 1996).

3.3.2, Получение телят после пересадки заморожешго-оттаяиных полученных in vitro эмбрионов

С развитием метода трансплантации эмбрионов, а также способов синхронизации охоты необходимость содержания большого числа реципиентов на одной стадии полового цикла с донором потеряла свою актуальность в связи с необходимостью международного обмена эмбрионами, но при условии разработки эффективной технологии долгосрочно хранения эмбриологического материала. И технология глубоко замораживания решила эту задачу.

Согласно литературным данным не существует единого мнения по наиболее эффективному использованию определенного агента в качестве криопротектора для замораживания полученных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота. Поэтому нами было изучено влияние двух наиболее используемых крнопротекторо в • глицерина и этиленгликоля, на жизнеспособность эмбрионов после замораживания н оттаивания.

В опытах использовались 7-8-дневные бластоцисты крупного рогатого скота, которые после введения криопротектора подвергались замораживанию, а затем оттаиванию и культивированию вне организма на монослое эпителиальных клеток яйцевода коров. Использование в качестве криопротектора глицерина при замораживании не обеспечило сохранения жизнеспособности бластоцист крупного рогатого скота (в опытах было

использовано 30 эмбрионов). Применение того же режима замораживания с этиленгликолем обеспечило сохранение жизнеспособности у 41,0% бластоцист (43 из 111)- При дальнейшем культивировании замороженных и оттаянных бластоцист на монослое эпителиальных клеток яйцевода коровы 12,0% бластоцист вылупились.

Наиболее объективным критерием полноценности замороженно-оттаянных эмбрионов, полученных вне организма, является их приживляемость после пересадки реципиенту. В связи с тем, что существуют определенные трудности при трансплантации замороженных и оттаянных эмбрионов, полученных вне организма, нами было проведено ряд экспериментов по изучению этой возможности. Для трансплантации телкам-реципиентам были отобраны замороженные и оттаянные 7 и 8 - суточные бластоцисты. Из 21-го пересаженного замороженного и оттаянного восьмнсуточного эмбриона ни один не прижился, в то время как из 16-ти пересаженных семисуточных замороженных и оттаянных эмбрионов было получено два теленка (12,5%). Таким образом, замороженные и оттаянные полученные вне организма эмбрионы способны развиваться в организме реципиента, хотя эффективность приживляемости в этих первых экспериментах была еще низкой.

На следующем этапе было проведено четыре широкомасштабных эксперимента (таблица 9) по трансплантации эмбрионов в различных хозяйствах России замороженно-оттаянных семисуточных бластоцист, полученных из оплодотворенных вне организма ооцитов крупного рогатого скота.

Таблица 9. Эффективность трансплантации полученных вне организма замороженно-оттаянных эмбрионов крупного рогатого скота

Название хозяйства Число эмбрионов Число реципиентов Получено телят

п

11/3 «Масловский», Воронежская обл. 19 19 7 36.8

ОГ1Х Северо-Кулулдинской опытной станции 16 16 1 6.3

ОПХ «Чистое» Оренбургского института мясного скотоводства 26 26 5 19.2

ОПХ «Экспериментальное», Оренбургская обл. 26 26 3 11.5

Итого 87 87 16 18.4

В порядке совместных исследований, эмбрионы были заморожены и доставлены из Германии в жидком азоте. Как видно из таблицы 9,

эффективность трансплантации изменялась в пределах 6,3-36,8% в зависимости от того, в каком хозяйстве проводился эксперимент. Как и предполагалось, жизнеспособность замороженных полученных in vitro эмбрионов была ниже, чем у незамороженных, так как у последних эффективность приживляем ости в среднем составляла в это время 50%, Однако, результаты пересадок в племзаводе "Масловский" Воронежской области (36,8% стеяьностей) показали, что при наличии полноценных реципиентов возможна эффективная пересадка на коммерческой основе замороженно-отгаянных полученных вне организма эмбрионов, если учесть, что их стоимость в несколько раз меньше, чем полученных in vivo.

3.4. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ

3.4.1. Получение трансгенных кроликов, в геном которых интегрирован ген гормона роста человека

Трансгенные кролики были получены методом микрокнъекции клонированного гена гормона роста человека в пронуклеусы зигот. Ген соматотропина человека вводился в составе векторной конструкции pMTSV, содержащей промотор и энхансер гена МТ, а также участки сплайсинга и полиаденилировамия РНК из ранней области вируса SV 40. Хромосомную ДНК выделяли из образцов отдельных тканей у 44 родившихся после трансплантации животных и определяли в ней методом блот-гибридизацни по Саузерну наличие плазм иды с геном гормона роста человека. У трех кроликов была зафиксирована интеграция чужеродного гена - у двух только в печени и у одного только в сперме.

С целью проверки экспрессии введенного гена кровь 44 животных анализировалась радиоиммунологнческим методом на присутствие гормона роста человека. У пяти кроликов, в том числе и у всех с выявленной интеграцией, чужеродный белок присутствовал в сыворотке крови. Так как, интеграция рекомбинантной ДНК анализировалась не во всех органах животного, а только в печени, селезенке, сердце, кишечнике, ухе и сперме, то было выявлено еще два кролика, у которых был обнаружен чужеродный белок, секретируемый, очевидно, каким-то другим органом. Следовательно, учитывая данные по экспрессии гена гормона роста человека, можно заключить, что эффективность получения трансгенных кроликов составила 11,4% от числа родившихся потомков. Примерно такая же эффективность (12,8%) наблюдалась и у зарубежных исследователей при получении трансгенных кроликов (Hammer R.E. et al., 1985),

У кролика Jft 44 копии гена гормона роста человека соединялись при интеграции в виде тандема, ориентируясь по принципу "голова к хвосту". Такое же расположение копий этого и других интегрированных генов наблюдалось и у трансгенных мышей и свиней (Hammer R.E, et al,, 1984;

Pursei V.G. et al., 1987). Было определено, что у кролика Ks 44 встроилось 150-200 копий рекомбинантных генов на клетку, такое же число копий и даже больше по литературным данным, наблюдалось у трансгенных мышей, свиней, овец, кроликов (Hammer R.E. et al., 1985). У кроликов Ks 36 и Ка 45 были обнаружены множественные перестройки плазмидной ДНК, появившиеся при интеграции. Перестройки генных конструкций - явление нередкое при анализе трансгенов, они описаны у трансгенных мышей и овец (Stewart Т.А. et al., 1982).

Нами впервые была исследована динамика экспрессии гена гормона роста человека у трансгенных кроликов. На первом месяце жизни продукции чужеродного белка ни у одного из трансгенных животных обнаружить не удалось. Только на третьем месяце были зафиксированы определяемые уровни гормона роста человека у пяти кроликов (таблица 10).

У кролика Ка 36 уровень чужеродного белка оставался невысоким, хотя и увеличивался с возрастом, у кроликов Ks 41 и Ка 44 наблюдалась аналогичная картина, однако максимальная концентрация гормона достигала высокого уровня 37,8 нг/мкл И 29,1 нг/мкл, соответственно. У кроликов Ms 43 и Хв 45 до начала 4-го месяца жизни концентрация гормона роста человека возрастала, а к концу 4-го месяца вновь снизилась. Максимальная концентрация соматотропина человека в крови трансгенных животных была зафиксирована у кролика Ks 43 - 68,7 иг/мл. Аналогичные всплески уровней гормона роста человека наблюдались и у трансгенных свиней (Bolt D.J. et al., 1986).

Таблица 10. Динамика экспрессии гена гормона роста человека у транс генных кроликов

Номера кроликов Концентрация кроен гормона роста человека (нг/мл) в возрасте (дни) Число КОПИЙ гена гормона роста на геном

25-28 52-53 58-59 65-66 97-98 120

Збх 0 0.7* 1.1* 8.8* 0.2

41 0 1.0 0.9 1.1 37.8

43 0 0.2 0.2 0.6 68.7 5,1

44х 0 0.2 0.6 0.8 1.9 29,1 150-200

45 х 0 0.2 0.1 0.6 6.1 0.1 I

* - у кролика № 36 кровь анализировалась в возрасте 61,69 и 103 дня, соответственно х - кролики, у которых установлена интеграция

Плазмида, вводимая в пронуклеус зиготы кроликов, содержала промотор МТ гена мыши. Было показано, что этот промотор способствует экспрессии структурных генов при их совместном введении в хромосомную ДНК мышей (Вгш$1ег ЯХ. е1 а!., 1981). Более того, МТ промотор позволял осуществить регуляцию экспрессии чужеродных генов у трансгенных животных. Так, при добавлении солей кадмия в - крови трансгенных мышей значительно

повышался уровень чужеродного белка (Ра1тКег И.О. а)., 1983).

В целях повышения уровня экспрессии гена соматотропина опытным кроликам в возрасте около 2-х месяцев добавляли в питьевую воду в течение двух недель соли цинка. Пробы крови отбирали три раза, однако значительного повышения продукции гормона обнаружено не было, хотя в это время впервые были зафиксированы определяемые уровни гормона роста человека. Инъекции соли кадмия вызвали возрастание концентрации чужеродного белка только у одного (№44) из 3-х трансгенных кроликов. У этого животного интеграция генетического материала произошла без заметных перестроек, и, возможно, поэтому в ответ на введение тяжелых металлов наблюдалось возрастание уровня гормона роста человека в крови.

Несмотря на большие различия в аминокислотном составе гормон роста человека по сравнению с собственным гормоном роста вызывал у отдельных трансгенных мышей увеличение массы их тела почти в два раза, в то время как у трансгенных свиней подобного увеличения массы тела не наблюдалось (Риг$е1 УЛ. е1 а!., 1987). Следовательно, необходимо было установить, влияет ли гормон роста человека на скорость роста трансгенных кроликов. Оказалось, что ни одно из трансгенных животных не обладало повышенной массой по сравнению с кроликами, пронуклеусы которых также инъецировались плазмидной ДНК, но в их крови не было чужеродного белка. Отсутствие повышенной живой массы у трансгенных кроликов в отличие от трансгенных мышей, возможно, связано с тем обстоятельством, что в используемых линиях мышей не велась предварительная селекция по скорости роста, в то время как используемые в экспериментах кролики были отобраны из популяций, в которых уже в течение десятилетий велась селекция по оптимизации параметров роста.

3.4.2, Получение трансгенных кроликов из зигот, инъецированных кольцевыми формам» плазмид РвМА к рр8Г4БО с геном асРИК против аденовируса человека

В качестве объекта исследования был выбран хорошо изученный аденовирус человека (А<Ш5) и его Е1А область генома, выполняющая регуляторную роль в развитии вирусной инфекции, и имеющая значительную гомологию с Е1А областью аденовирусов крупного рогатого скота. Были созданы конструкции асРНК против Е1А области АсЩ5, векторами для экспрессии которых служили плазмиды ррЭЫЕО и РвМА. Первый вектор был сконструирован на основе дефектного вируса лейкоза мышей Молони, а второй генно-инженерным путем с регулируемым промотором МТ гена мыши.

В результате проведенных экспериментов было получено три трансгенных кролика - один при введении плазмиды РбМЛ (таблица И) и два - с плазмидой рр$НЕО. Число трансгенных потомков с кольцевыми формами плазмид РвМА и ррЗКЕО было невысоким, н составило,

соответственно, 6,7% и 10,0% от числа рожденных потомков, соответственно.

Таблица II. Получение трансгенного потомства из знгот кролика, инъецированных плазмидой РОМА кольцевой формы

Показатели Общее число Процент от числа

инъецированных зигот трансплантированных эмбрионов реципиентов потомков

Трансплантировано 194 81.9 100.0

Использовано реципиентов 15 100.0

Получено окролов 7 48.0

Получено крольчат 15 6.3 12.9 100.0

в том числе: развились нормально 6 2.5 3.1 40.0

погибли сразу после рождения 9 3.8 4.6 60.0

из них с интеграцией 1 0.4 0.5 6.7

Плазмидная ДНК, вводимая в виде кольцевой формы, была обнаружена во всех анализируемых тканях трансгенных животных - в ушах, печени, почках и селезенке. Следовательно, интеграция гена, скорее всего, произошла на ранних стадиях, развития. Хотя не исключено, что на более поздних стадиях развития также происходило встраивание, так как число участков интеграции не менее 3-х, а число и размер фрагментов с интегрированной ДНК не совпадало в клетках внутренних органов и уха. У всех трех трансгенных кроликов плазмидная ДНК имела множественные перестройки, что, вероятно, также могло быть связано с кольцевой формой вводимой плазмиды.

3.4.3. Получение трансгенных кроликов из знгот, инъецированных линейной формой плазмиды РвМА

В дальнейших экспериментах одна из плазм ид (РОМА) была лианезирована с помощью рестри1сгазы Ват Н1, так как по сообщению зарубежных исследователей такое изменение формы плазмиды приводило к увеличению в пять раз частоты получения трансгенных мышей (Вппйег 11.1,. е1а1., 1985).

Действительно, после микроинъекции в пронуклеусы зигот кроликов плазмиды РвМА линейной формы было выявлено пять трансгенных потомков (из 14), что составило 35,7% от числа рожденных кроликов (таблица 12). Таким образом, как и в случае с мышами, изменение формы плазмиды оказало значительное влияние на эффективность интеграции чужеродной ДНК. При этом также более, чем в пять раз увеличилось число

трансгенных кроликов при замене кольцевой формы плазмиды на линейную (Р<0,1). Пока трудно дать точное объяснение этому факту. Вероятно, свободные концы вводимых линейных молекул ДНК являются специфическими сигналами, воздействующими на репарационные ферменты. Ферменты узнают нуклеиновые кислоты на концах плазмидной последовательности и сшивают их с хромосомной ДНК в месте ее случайного разрыва ^аепЬсЬ Я. Е. а)., 1983).

Ожидалось, что при введении линейной молекулы вероятность генетических перестроек должна уменьшаться, так как такая форма плазмидной ДНК уже готова к интеграции, а разрыв сделан самими исследователями таким образом, чтобы не повредить структурный ген. Действительно, у трех трансгенных кроликов (из 5) при введении линейных молекул плазмиды РСМД была отмечена интактность интегрированного генетического материала.

Таблица 12. Получение трансгенного потомства из зигот кролика, инъецированных плазмидой РСМД линейной формы

Показатели Общее число Процент от числа

инъецированных зигот трансплантированных эмбрионов рецнпн-ентов ПОТОМКОВ

Трансплантировано 135 87.7 100.0

Использовано реципиентов 9 100.0

Получено окролов 3 33.3

Получено крольчат 14 9.1 10.4 100.0

В том числе:

развились нормально 8 5.2 5.9 57.1

погибли сразу после рождения б 3.9 4.4 42.9

из них с интеграцией 5 3.2 3.7 35.7

На следующем этапе нашей работы было необходимо установить, передается ли интегрированный ген по наследству, для чего две трансгейные самки (№ 17 и Кг 18) были спарены с контрольными самцам. Оказалось, что крольчихи способны к размножению и принесли полноценное потомство, одна (Ка 17) -12 крольчат, а другая (■№> 18) - 22 крольчонка (таблица 13). Самки вскармливали своих крольчат, однако в первый месяц наблюдалась высокая гибель молодняка, что, очевидно, связано с большим числом крольчат в этих двух пометах, особенно у крольчихи № 18. В связи с тем, что трансгенные самки были еще молодыми (около 5 месяцев) и имели первую беременность, у них была вызвана суперовуляция с помощью половых гормонов (СЖК и ХГ), что и привело к рождению такого большого числа

потомков.

Таблица 13. Получение первого поколения трансгенных потомков от трансгенных самок

Номер Получено Число проанализированных из них

самки потомков потомков трансгенных

п % от полученных п %

17 12 8 66.7 4 50.0

18 22 б 27.3 1 16.7

всего 34 14 41.2 5 35.7

Обе трансгенные самки передали плазмидную ДНК своим потомкам: крольчиха Лз 17 - 4 крольчатам из 8 живых, а № 18-одному крольчонку изб живых, у погибших животных хромосомная ДНК не анализировалась.

Важно отметить, что у трансгенных крольчат от самки № 17 сохранилась интактность плазмидной ДНК, также как у их матери, а самка № 18, у которой имелись значительные перестройки чужеродного гена, передала единственному трансгенному потомку также измененную плазмидную ДНК.

3,5. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИНЪЕКЦИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В ОПЛОДОТВОРЕННЫЕ ВНЕ ОРГАНИЗМА ООЦИТЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

Получение трансгенного крупного рогатого скота открывает возможности решения целого ряда научных и практических вопросов, а именно, изучение роли различных генов в организме данных животных, получение особей с повышенной продуктивностью, наследственной устойчивостью к разным заболеваниям, а также живых биореакторов, продуцирующих с молоком фармацевтически важные для человека продукты.

Изучению данных вопросов был посвящен следующий раздел нашей работы. Что касается эмбриологического материала, то были использованы оплодотворенные вне организма ооциты крупного рогатого скота, методы получения которых были уже нами отработаны. Известно, что пронуклеусы в зиготе крупного рогатого скота в отличие от мышей и кроликов не видны из-за белково-липидиых гранул. Однако уже были предложены способы визуализации пронуклеусов коров и свиней путем центрифугирования или прижизненного окрашивания (BremG. etal., 1985; Hammer R.E. et at., 1985).

Перед нами была поставлена задача разработки метода эффективной инъекции различных генов, развития инъецированных эмбрионов до стадии

морулы и бластоцисты и пересадки реципиентам с последующим определением интеграции в тканях телят.

3.5.1. Влияние маинпуляцнонных воздействий на развитие вне организма микроинъецированных чужеродным геном зигот крупного рогатого скота до стадии морулы и бластоцисты

Подготовка оплодотворенных вне организма ооцитов крупного рогатого скота к манипуляциям по инъекции экзогенного гена прежде всего связана с подбором режимов их центрифугирования для освобождения от белково-липидных гранул цитоплазмы эмбриона.

Целью нашей работы явилось более точное установление интервалов режима центрифугирования, а также влияние этой процедуры на развитие эмбрионов.

В результате исследований было выявлено, что после центрифугирования при 7000g у 77 оплодотворенных вне организма яйцеклеток крупного рогатого скота из 111 (69,4%) было отмечено освобождение 2/3 объема цитоплазмы от белково-липидных гранул, при SOOOg у 45 (75,0%) из 60, при 9000g - у 90 (80,4%) из 112. При оценке дальнейшего развития у 54 (48,6%) из 111 зигот было отмечено дробление после центрифугирования при 7000g, у 31 (51,7%) из 60 при 8000g, у 63 (56,2%) из 112 при 9000g.

На основании полученных результатов были проведены исследования по микроинъекции рекомбинантиой ДНК (плазмиды рМТ IFN|JI с геном (И-интерферона человека) в пронуклеус зигот крупного рогатого скота, полученных вне организма, и дальнейшему культивированию этих эмбрионов.

В опытах использовали оплодотворенные in vitro яйцеклетки (п =249, 100%, через 15-16 часов после оплодотворения), подвергшиеся обработке ферментом (гиалуроиидазой) и центрифугированию при 9000g, После удаления клеток, имеющих картину дегенерации (п=60, 24,1%), оплодотворенные яйцеклетки помещали в специальную камеру и с помощью микроманипулятора в один из визуализированных пронуклеусов (1-ая группа, п=119, 47,8%) вводили 1-2 пкл буферного раствора с геном pi-интерферона человека (таблица 14). Оплодотворенные ооциты, в которых не удалось визуализировать пронуклеусы и провести микроннъекцию, культивировались отдельно (2-ая группа, п*70,28,1% ).

Результаты экспериментов показали, что эффективность развития in vitro эмбрионов до морулы и бластоцисты после манипуляционных процедур по сравнению с контролем примерно одинаковая (15.1 и 14,0%, соответственно), однако если учесть то обстоятельство, что в 1-ю группу были отобраны зиготы с видимыми пронуклеусами (119 из 249), то негативное влияние на жизнеспособность эмбрионов указанных процедур очевидно.

Таблица 14, Культивирование in vitro зигот крупного рогатого скота, микроинъекцированных плазмидой с геном pi-интерферона человека

Группы Число оплодотворенн ых ооцнтов нз них развились до морулы+ бластоцисты:

п %

] 119 18 15.1

2 70 - -

Контроль 200 28 14.0

Наряду с экспериментом по микроинъекцин гена {31 -интерферона человека в пронуклеус зигот крупного рогатого скота и культивированию эмбрионов до стадии морулы и бластоцисты были проведены опыты по введению гена асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (БЛВ). Исследования проводились по аналогичной схеме (таблица 15).

Таблица 15, Культивирование in vitro зигот крупного рогатого скота, ми крои иъекциро ванных плазмидой с геном ас РНК к вирусу БЛВ

Группы Число оплодотворенных ооцитов из них развились до морулы-t-бластоцнсты:

п %

t группа 220 31 14.1

2 группа 373 . 25 6.7

Контроль 699 102 14.6

По данным Г, Брема с соавторами 14,5% (45/311) яйцеклеток крупного рогатого скота, созревших н оплодотворенных in vitro после микроинъекции, развивались до стадии морулы и бластоцисты. По данным других исследователей (Leopold P. et al., 1987) из числа мнкроинъецированных оплодотворенных in vitro яйцеклеток крупного рогатого скота только 6% (49/858) развивались до стадии морулы и бластоцисты. Как видно из приведенных данных, результаты наших экспериментов по эффективности развития микроинъецированных оплодотворенных in vitro ооцитов крупного рогатого скота соответствовали уровню или даже чуть превышали достижения зарубежных исследователей.

Немалый интерес представляют собой исследования по изучению синтеза белка в отдельных эмбрионах после микроинъекции чужеродной ДНК, Для сравнения были отобраны шесть одноклеточных микроинъецированных эмбрионов, которым вводился ген pi-интерферона, и четыре одноклеточных интактных эмбриона. Их белковые профили оказались очень похожими, приблизительно одинаковым был и уровень включения метки. Итак, наши эксперименты подтвердили теперь уже на

биохимическом уровне, что зиготы крупного рогатого скота устойчивы к таким воздействиям, как микроинъекция.

3.5,2. Изучение прнжнвляемости полученных in vitro и микроинъецированных эмбрионов крупного рогатого скота геном асРИК против БЛВ после пересадки рецнппеитам

В предыдущих исследованиях была продемонстрирована возможность развития полученных in vitro и микроинъецированных чужеродными генами зигот крупного рогатого скота до морулы и бластоцисты вне организма, т.е. до стадии развития, пригодной для трансплантации.

Следующим этапом в определении полноценности и жизнеспособности полученных in vitro и микроинъецированных эмбрионов стало изучение эффективности их прнжнвляемости после пересадки реципиентам.

С этой целью инъецировали геном асРНК против БЛВ оплодотворенные in vitro ооциты крупного рогатого скота и трансплантировали реципиентам. В результате трансплантации 12 морул и бластоцист (по одному эмбриону каждому реципиенту) получено две беременных телки и два живых теленка -бычок и телочка. При этом после пересадки трех эмбрионов на стадии морулы беременность наступила у одной телки, т.е. в 33,3% случаев, а после пересадки 9 бластоцист беременность наблюдалась также только в одном случае, что составило 11,1%. Разницу в приживляемости эмбрионов, пересаженных на стадии морулы и бластоцисты трудно интерпритировать, ввиду малого числа животных в эксперименте.

Несмотря на низкий процент приживляемости (16,6%) после пересадки полученных in vitro микроинъецированных эмбрионов крупного рогатого скота, можно с полной определенностью заключить, что проведенный комплекс микроманипуляций с эмбрионами крупного рогатого скота, а именно, дозревание и оплодотворение ооцитов вне организма, микроинъекция генной конструкции, культивирование

микроинъецированных зигот до стадии морулы и бластоцисты, получение приплода после нехирургической пересадки этих эмбрионов, позволил вплотную подойти к проблеме получения трансгенного крупного рогатого скота. Хота по результатам анализа в тканях двух новорожденных телят интеграции гена асРНК против БЛВ обнаружить не удалось.

3.6. РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИНЪЕКЦИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В ПЕРВИЧНЫЕ ПОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КУР

Не менее интересным объектом для использования в качестве трансгена является курица. Рекомбинантные белки с яйцом кур могут быть получены значительно быстрее и с меньшими затратами, чем с молоком коз или коров. Короткий генеративный период у кур позволяет получать продуктивных птиц уже через 7 месяцев от момента оплодотворения яйца до

снесения его потомком. По расчетным данным производство 1 грамма рекомбинантного белка в молочной железе оценивается в сумме около 100 долларов, а использование для этих целей куриных яйц позволяет снизить затраты до 10-25 центов.

В связи с тем, что традиционные методы введения чужеродных генов путем микроинъекции гена в пронуклеус зиготы кур мало эффективны и крайне трудоемки, получение трансгенной птицы связано с разработкой технологии выделения бластодермальных и ППК из гонад ранних эмбрионов и манипуляций с этими клетками.

В наших исследованиях изучались методы введения генных конструкций в эмбрионы кур путем инъекции последних в зародышевой диск, кровяное русло зародыша, а также переноса трасфецированных бластодермальных клетокв зародышевый диск реципиента или гонадных трасфецнрованных ППК в кровяное русло зародыша.

3.6.1. Изучение оптимальной стадии развития эмбрионов кур для эффективной трансфекцнн ППК чужеродным геном

Известно, что ППК кур, выделенные из гонад на б-е сутки инкубации, морфологически отличны от окружающих соматических клеток благодаря наличию более крупных размеров и хорошо различимых в инвертированном микроскопе блестящих гранул гликогена и желтка (¿ассапапй Б, е1 а1., 1990). Эти клетки также относят по их характеристикам к эмбриональным стволовым (ЕЭ) и половым (НО) клеткам (Нап е1 а1,2002).

С целью выявления наиболее удобной стадии развития эмбриона кур для эффективной трансфекции ППК чужеродными генами впервые были проведены исследования по подсчету н идентификации гонадных ППК с 6-го по 9-ый дни инкубации эмбрионов. Нами было показано, что ППК, выделенные из эмбрионов на 7-ой и 8-ой дни инкубации, сохраняли морфологические и гистохимические (ШИК-реакция на гликоген) особенности ППК, выделенных на 6-е сутки. Число ППК на эмбрион возрастало в зависимости от стадии развития и составляло 1200 клеток на 6-е сутки инкубации; 3380 на 7-е сутки инкубации, 1120 у самок и 2010 у самцов на 8-е сутки инкубации (таблица 16). Доля ППК по отношению к соматическим клеткам на 7-ой день инкубации также была больше, чем на 6-ой день инкубации (2.5 и 4%, соответственно). Уменьшение числа ППК на 8-е сутки инкубации, очевидно, связано с потерей гоноцитами гранул гликогена, а значит, и с невозможностью их морфологической и де нтифи каци и.

В соответствии с нашими наблюдениями (таблица 17) значительное снижение содержания гликогена в ППК происходило на 8-ой день инкубации. Так, доля ШИК-положительных клеток составляла 2.3% на 7-ой

Таблица 16. Динамика соотношения числа ППК в гонадах на 6-8 дни инкубации эмбрионов кур

Сроки инкубации, сутки Число гонадных клеток на эмбрион Число ППК на эмбрион % ППК в клеточной суспензии

6 4.8x10 "±0,72xt0 "(5) 1200± 162^5) 2.5

7 8.5x10 "±1.22x10 *(5) 3380±281(5> 4.0

8 Самец-10.5x10 *±1.45x10 *(3) Самка-5.2х 10 4±0.81х10\3) 2010±215(3) 1120±150(3) 1.9 2.2

В скобках указало количество эмбрионов

день инкубации, а к 8-му дню уменьшалась почти в четыре раза до 0.6% (р<0.05). Уменьшение запасов гликогена может быть связано с подготовкой гоноцитов к активной пролиферации, которая наступает на 8-11 день развития эмбриона (Romanoff А., 1960). Если предположить, что содержание гликогена может служить показателем способности этих клеток к миграции, то, скорее всего, следует использовать данные клетки в качестве донорских для получения химер не позднее 7-го дня инкубации эмбрионов.

Таблица 17. Динамика распределения ШИК-положительных ППК в зависимости от сроков инкубации куриных эмбрионов

Сроки инкубации, сутки Число обследованных гонадных клеток после окрашивания Доля ШИК-положительных клеток от общего количества гонадных клеток, (%)

всего ШИК-положнтельиых

б 2280 (8) 36 1.6'

7 1610(7) 34 2.3 *

8 1170 (5) S 0.6'

9 1180(5) 7 0.5

В скобках указано количество эмбрионов

Ри<01

Ры<0.05

При культивировании in vitro ППК, выделенные из эмбрионов на 7-е сутки инкубации, уже через неделю образовывали колонии ш 5-8-ми сравнительно однородных клеток, тогда как колонии ППК, выделенные из эмбрионов на 6-е сутки инкубации, содержали всего 3-4 клетки, часть из которых имела тенденцию к перерождению. После 7-ми суточного культивирования ППК, выделенные из 7-ми дневных эмбрионов, также оказались ШИК-положительными. Таким образом, можно предположить, что ППК гонад куриц на 7-е сутки инкубации более удобный объект для получения как химер, в том числе и трансгенных, так и для создания

долгосрочных культур с целью их стабильной трансфекции чужеродным геном.

Далее была изучена эффективность трансфекции с помощью липофекции геном бактериальной р-галактоэидазы под CMV промотором культуры гонадных клеток. Согласно нашим данным эффективность такой трансфекции составила 30% от общего числа клеток, включая и стромальные, при этом из четырех лроиньецнрованных 2.5-дневных эмбрионов суспензией трансфецированных гонадных клеток после 3-х суток инкубации у одного эмбриона (в одной из гонад) была обнаружена экспрессия встроенного гена в виде 10-12 окрашенных кластеров клеток.

3.6.2. Трансфекции in vitro культуры бластодерма л ьных клеток и инъекция трансфецированных клеток реципиенту

Были изучены параметры трансфекции геном бактериальной р-гапактозидазы под CMV промотором культуры бластодермальных клеток, которые также, как и 111IK, относят к предшественникам половых клеток кур. Выделенные из зародышевого диска клетки были диссоциированы в трипсине и обработаны плазмидой, содержащей ген бактериальной (J-галактозидззы (0,4-0,5 мкг гена на лунку) с использованием набора для липофекции UNIFECTIN-56™. Затем клетки культивировали в 96-луночном планшете в течение суток.

Согласно данным таблицы 18 наибольший процент (5,4-7.1%) трансфекции был получен при использовании от 2700 до 5400 клеток на лунку. Для изучения влияния концентрации гена на эффективность трансфекции бластодермальные клетки инкубировали с 0,2; 0.5 и 1,0 мкг гена на лунку при оптимальной плотности от 2500 до 5400 клеток. Оказалось, что концентрация гена влияет на эффективность трансфекции. Так при концентрация гена 0,2 и 0,5 мкг на лунку, процент трансфекции составлял 3,9-4,9%, тогда как при концентрации ДНК 1 мкг на лунку эффективность трансфекции снижалась и составляла 1,1-3,1%.

Таблица 18. Эффективность трансфекции бластодерм альных клеток в зависимости от их концентрации

Число клеток на лунку Число экспрессирующих клеток на лунку Соотношение экспрессирующих клеток к общему количеству клеток в лунке Эффективность трансфекции, (%)

1300 0;14 1 93 1,1

2700 141:183 1 19;1:15 6,0

3000 204;207;213;232 1 15;1:14;1:14;1:13 7,1

4000 186:246 1 22;1:16 5,4

5400 249;39б 1 22;1:14 6,0

7000 53;154 1 132; 1:45 1,5

В связи с тем обстоятельством, что при выделении бластодермальных клеток желток яйца не удается удалить полностью, было проверено влияние желтка на эффективность трансфекции клеток. Оказалось, что при оптимальной концентрации гена 0,5 мкг и плотности клеток 3700 клеток на лунку эффективность трансфекции бластодермальных клеток с добавлением желтка уменьшалась в 2,5 раза, т.е. желток снижал показатели трансфекции.

С целью выяснения вопроса о влиянии на эффективность трансфекции соотношения липофектанта к гену были выбраны, соответственно, следующие соотношения: 2:1; 3:1; 5:1. При выделении бластодермальные клетки были тщательно отмыты от желтка. Как видно из таблицы 19 эффективность трансфекции при использовании данных соотношений примерно одинаковая и составляет 20-24%, хотя наблюдается тенденция к увеличению эффективности трансфекции при использовании соотношения 3:1.

Таблица 19. Влияние соотношения гена к липофектаиту на эффективность трансфекции бластодермальных клеток

Число клеток на лунку Концентрация гена Соотношение липофектанта к гену Число экснрессируемых клеток Соотношение экспрессирующих клеток к общему числу Эффективность трансфекции

2000 ОД 5:1 411 ;464 1:4,9; 1:4,3 22,1

2400 0,5 2:1 404;583 1:5,9; 1:4,1 20,6

3:1 5б0;6!б 1:4,3; 1:3,9 24,5

5:1 547;549 1:4,4 22,9

Далее в бластодиск эмбрионоа-реципиентов (стадия X) были инъецированы трансфецированные в культуре бластодермальные клетки. Каждому эмбриону вводили по 4-6 мкл суспензии (400-800 бластодермальных клеток). Перед инъекцией реципиентов стерилизовали. Было проведено два вида стерилизации УФ и радиоактивное облучение (X-гау, 600 рад) при различной продолжительности экспозиции. Эмбрионы извлекали из яйца на 3-й день и оценивали стадию развития. От 50 до 80% эмбрионов достигали к этому сроку 14-16 стадий развития, остальные останавливались в развитии, тогда как в контроле 100% эмбрионов находились на этих стадиях. Как видно из таблицы 20, из развившихся проинъецнрованных эмбрионов, облученных УФ в течение 75 мин, 180 мин, 210 мин у 2,3 и 2 эмбрионов наблюдалась экспрессия бактериального гена р-галактозндазы, соответственно. В эмбрионах большинство клеток, экспрессирующих ген р-галактозидазы, находились во внеэмбриональной ткани, в области над головой, кровеносных сосудах, а также в теле эмбриона и в хвостовой части.

При экспозиции реципиентов в УФ-лучах в течение 240 мин, а также при радиоактивном облучении, экспрессия гена не была обнаружена, тогда

как процент продолживших свое развитие эмбрионов (67-80%, соответственно) практически не отличался от такового при более короткой экспозиции в УФ.

Таблица 20. Экспрессия гена (3-галактозидазы в 3-х дневных эмбрионах кур

Стерилизация Число эмбрионов Число эмбрионов с экспрессией гена Эффективность трансакции [%]

всего из них развилось до стадии 14-16

тип время, мин п %

УФ 75 10 5 50 2 40

УФ 180 15 10 67 3 30

УФ 210 8 4 50 2 25

УФ 240 6 4 67 - -

Х-гау бООрад 7 16 13 81,3 - -

Контроль - 7 7 100 - -

3.6.3, Экспрессии гена Р-галактозндазы а 3,5-х и б,5-дневных эмбрионах после инъекции in vivo ДНК:лнпосомалъного комплекса

Трансфекция ППК in vivo проводилась путем инъекции комплекса ДНК:липофектакт в аорту 2,5-дневным эмбрионам. В наших экспериментах был проинъецирован ген бактериальной Р-галактозидазы с липофектантом в дорзальную аорту 2.5-дневным эмбрионам. На следующий день после инъекции из 4-х эмбрионов, инъецированных раствором комплекса с липофектантом в соотношении t:1.6, развилось 3 (75%), и у всех 3-х эмбрионов после вскрытия проявлялась экспрессия гена Р-галактозндазы. При инъекции комплекса в соотношении гена к липофектанту 1:3, соответственно, у 4-х из 5-ти эмбрионов наблюдалась экспрессия гена (80%). Экспрессирутощие кластеры клеток располагались в области сердца и кровеносных сосудов.

При вскрытии яиц, инкубированных в течение 3-х суток после инъекции, наблюдался высокий процент остановившихся в развитии эмбрионов (80-100%), поэтому окраске X-gal подвергались как продолжившие развитие эмбрионы, так и остановившиеся. При инъекции 5-ти реципиентам раствора ДНК:липосомального комлекса в соотношении 1:1.6 развился один эмбрион (20%), а экспрессия наблюдалась только у 2-х остановившихся эмбрионов (50%). Из 4-х эмбрионов, инъецированных раствором комплекса гена к липофектанту в соотношении 1:3, у всех наблюдалась экспрессия (100%), однако эти эмбрионы остановились в развитии. Полагаем, что данный метод имеет перспективы, но при условии подбора соответствующего промотора и повышения процента выживаемости

эмбрионов после процедуры инъекции.

Дальнейшие исследования в данном направлении могут быть направлены на получение потомства после инъекции гена и изучение характера наследования чужеродного гена в потомстве, а также на повышение эффективности трансфекции, что может быть достигнуто за счет подбора регуляторных частей генных конструкций и предварительной селекции трансфецнрованных клеток в культуре.

б. ВЫВОДЫ

1. Незрелые ооциты крупного рогатого скота в условиях культивирования вне организма завершают стадию созревания через 18 часов и в течение последующих 6 часов сохраняют свои потенции к in vitro оплодотворен иго, что подтверждается результатами их дробления и дальнейшего развития до стадии бластоцисты (70.9% и 75.9% дробящихся зародышей, 25.6% и 24.2% бластоцист от числа ооцитов, созревших в течение 18 и 24 часов, соответственно).

2. При проведении процедуры swim-up концентрация всплывших сперматозоидов быка не меняется после 5 минут инкубации. При смене сред (среда меняется пять раз над одной и той же дозой спермы) число всплывших живчиков также не меняется. При этом мужские гаметы из каждой порции среды способны к полноценному оплодотворению ооцитов крупного рогатого скота in vitro.

3. Модифицированный способ проведения процедуры swim-up позволяет примерно в 5 раз повысить эффективность использования спермы быка при оплодотворении яйцеклеток крупного рогатого скота in vitro.

4. Концентрация всплывших подвижных сперматозоидов быка при процедуре swim-up коррелирует с оплодотворяющей способностью спермы быка по результатам искусственного осеменения. Поэтому определение концентрации всплывших подвижных сперматозоидов быка в условиях in vitro при сравнении с образцом спермы быка с известной оплодотворяющей способностью по результатам искусственного осеменения обеспечивает прогнозирование оплодотворяющей способности спермы быков.

5. Двух кратное введение сперматозоидов в среду дяя оплодотворения с 2-х часовым интервалом увеличивает способность развития эмбрионов до стадии бластоцисты более чем в три раза по сравнению с контролем.

6. Ранние эмбрионы крупного рогатого скота характеризуется способностью утилизовать из среды культивирования метаболические компоненты соматических клеток и сыворотки крови других видов. До стадии бластоцисты полноценное развитие может поддерживаться сывороткой крови северных оленей или эпителиальными клетками яйцевода кролика, что свидетельствует об отсутствии реакции видоспецифичности на указанные компоненты среды.

7. Эмбрионы крупного рогатого скота развиваются in vitro до стадии бластоцисты при добавлении в среду культивирования (M-Í99) инактивированной сыворотки крупного рогатого скота примерно в 4 раза более эффективно, чем неннактивированной (23.1% против 6.7%).

8. Наблюдаются значительные индивидуальные различия между коровами-донорами по эффективности оплодотворения ооцитов in vitro и дальнейшему развитию эмбрионов. Процент дробящихся яйцеклеток к числу осемененных ооцитов составляет в среднем 36.7% с колебаниями от 22.2% до 72.7% у отдельных животных. Стадии морулы и бластоцисты достигают в среднем 2.4±1.8 эмбрионов на корову с колебаниями от 0 до 5 эмбрионов (38.0 % от числа дробящихся эмбрионов),

9. Полноценность полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота с использованием предложенных нами приемов подтверждена получением потомства после их нехирургической пересадки: при этом отмечена тенденция повышения приживляем ости эмбрионов, пересаженных реципиентам в дни цикла, совпадающих с возрастом эмбриона (16.1%) или отстающих на один день (23.1%) по сравнению с пересадкой эмбрионов в возрасте, опережающем на 1-2 дня стадию полового цикла (7.1-11.8%).

10. Качественные изменения в биосинтезе белка у полученных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота, также как и у полученных in vivo, происходят на 8-ми клеточной стадии и стадии бластоцисты. Интенсивность синтеза белка у полученных in vitro эмбрионов, в отличие от полученных in vivo, не уменьшается от стадии зиготы к 8-ми клеточной стадии. Соотношение включения метки у полученных in vitro зигот по сравнению с бластоцистами составляет 3:1, а у полученных in vivo - 6:1.

11. Прижпвляемость эмбрионов кроликов с инъецированными генами гормона роста человека составила 12.3%, а с генами асРНК против аденовируса человека — 12.9%-18.7%. Линейная форма плазмиды PGMA с геном асРНК против аденовируса человека более эффективно интегрируется в хромосомную ДНК зигот кроликов по сравнению с кольцевой: у 35.7% животных от числа родившихся потомков при инъекции линейной формы плазмиды был обнаружен чужеродный ген против 6.7% животных при инъекции кольцевой формы (Р<0.1). В результате спаривания трансгенных самок С геном асРНК против аденовируса человека с нетрансгенными самцами в первом поколении наследование чужеродного гена наблюдалось в среднем у 35.7% потомков.

12. Концентрация соматотропииа человека в крови трансгенных кроликов различается у разных животных и зависит от их возраста.

13. Развитие оплодотворенных in vitro инъецированных чужеродными генами (pi-интерферона человека и асРНК к вирусу лейкоза крупного рогатого скота) ооцитов крупного рогатого скота при дальнейшем

культивировании in vitro до стадии морулы н бластоцисты составляет 15.1 и 14.1%, соответственно. Полноценность микроинъецированных эмбрионов подтверждена получением потомства после их нехирургической пересадки.

14. Наиболее оптимальным сроком сбора гонадных ППК в качестве донорских клеток для получения химер и трансгенных кур является 7-ой день инкубации. Это обусловлено наибольшим числом клеток на эмбрион (3380 клеток) на 7-оЙ день инкубации по сравнению с б-м (1200 клеток) и с 8-м (1120 клеток), максимальным содержанием гликогена в клетках по сравнению со значительным его снижением на 8-ой день инкубации, что служит показателем подготовки их к миграции, и лучшей способностью образовывать колонии при культивировании in vitro по сравнению с б-м днем инкубации.

15. Определены параметры для эффективной трансфекции бластодермапьных клеток кур чужеродным геном in vitro, включая число клеток на лунку, концентрация гена, соотношение липофектанта к гену. Достигнута высокая эффективность трансфекции ППК после инъекции комплекса ДНК:липофектант в аорту 2.5-дневных эмбрионов. Однако высокий процент остановившихся в развитии эмбрионов на 3-й день инкубации после инъекции требует дальнейшей разработки метода,

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В целях рационального использования рабочего времени исследователя проводить процедуру созревания ооцитов крупного рогатого скота в условиях культивирования вне организма в течение 18-24 часов. При этом выход эмбрионов на стадии бластоцисты составляет около 25%.

2. Использовать в системе культивирования эмбрионов крупного рогатого скота in vitro соматические клетки и сыворотку крови других видов, например, кролика или северного оленя, чтобы предотвратить вероятность переноса вирусов с белковыми или клеточными компонентами от животных гомологичного вида.

3. Для повышения эффективности оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота вне организма использовать метод 2-х кратного введения сперматозоидов в среду для оплодотворения с 2-х часовым интервалом.

4. Осуществлять пересадку оплодотворенных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота реципиентам, дни цикла которых совпадают или отстают на один день от возраста эмбриона.

5. Для увеличения эффективности использования спермы быка при оплодотворении яйцеклеток крупного рогатого скота in vitro использовать разработанный нами модифицированный способ отбора подвижных сперматозоидов.

6. Использовать метод диагностики оллодотворяющей способности спермы быков путем сравнительного изучения всплывания подвижных сперматозоидов от разных быков в условиях in vitro.

7. Замораживание в азоте оплодотворенных вне организма эмбрионов крупного рогатого скота проводить с применением этиленгликоля,

8. Для создания химер, в том числе и трансгенных, и получения долгосрочных культур с целью их стабильной трансфекции чужеродным геном использовать ППК гонад куриц на 7-е сутки инкубации.

9. При трансфекции бластодермальных клеток с помощью липофекции придерживаться следующих параметров: 2500-5700 клеток на лунку 96-луночной плашки, 0,2-0,5 мкг гена на лунку, соотношение гена к липофектанту: 1:2, 1:3 или 1:5. В данной системе эффективность трансфекции составляет 20-24%.

Содержание диссертации опубликовано в 30 научных работах, основными из них являются:

1. Ениколопов Г.Н., Захарченко В.И., Гращук М.А., Сураева Н.М., Георгиев Г.П., Тинаева Е.А., Рубцов П.М., Скрябин К.Г., Баев А.А., Эрнст Л.К. Получение трансгенных кроликов, содержащих и экспрессирующих ген соматотропина человека // Доклады Академии Наук СССР.- 1988.- Т. 299, №5.-С. 1246-1249.

2. Эрнст Л.К., Тихоненко Т.И., Сураева Н.М., Мирошниченко О.И. Получение трансгенного потомства от кроликов с геном антисмысловой РНК против Е1А области ДНК аденовируса AdH5 // Доклады ВАСХНИЛ.-1989.-№ 6,- С. 40-42,

3. Осидзе Д.Ф., Эрнст Л.К., Советкин С.В., Прокофьева Е.С., Сураева Н.М. Основа питательных сред для вымывания, культивирования и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных // Авторское свидетельство №1578859 от 15.03.1990.

4. Ernst L.K., Zakcharhenko V.I., Suraeva N.M. Transgenic rabbits with antisense RNA gene targered at adenovirus H5 // Theriogenology.- 1991,-V.35(5).-P. 1257-1271.

5. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Сураева H.M., Лагутина И.С., Кесян А.З. Удавленникова Н.Н., Долгохатский А.И., Краснов А.В., Майер П.К. Созревание ооцитов, оплодотворение и дальнейшее развитие эмбрионов крупного рогатого скота вне организма после пересадки реципиентам // Вестник сельскохозяйственных наук.- 1992.- №5-6.-С. 99-104.

6. Prokofiev M.I., Ernst L.K., Suraeva N.M., Lagutina I.S., Udavlennikova N.N., Kesyan A.Z., Dolgohatskiy A.I. Bovine oocyte maturation, fertilization and further development in vitro and after transfer into recipient //Theriogenology.-1992.-V. 38.-P. 461-469.

7. Сураева Н.М., Кесян А.З., Прокофьев М.И. Оптимальные приемы капацитации спермы быков для оплодотворения яйцеклеток // Бестник РАСХН.- 1993.- №4.-С.49-51.

8. Дагданова A.B., Сураева Н.М., Лагутина И.С., Захарченко В.И. Оптимальные приемы визуализации пронуклеусов у оплодотворенных ин витро зигот крупного рогатого скота // Вестник РАСХН,- 1994.- Х®б.-С.53-55.

9. Сураева Н.М., Кесян А.З., Воронина И.М., Удавлениикова H.H., Пономарева М.С., Прокофьев М.И., Суханов В.А. Особенности биосинтеза белка у оплодотворенных ин витро эмбрионов крупного рогатого скота// Вестник РАСХН.- 1994. I .-С. 55-58.

Ю.Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Дьяконов Л.П., Дагданова A.B., Сураева Н.М., Захарченко В.И., Лагутина VI.С. Микроинъекция чужеродных генов, ответственных за устойчивость организма к инфекционным заболеваниям// Вестник РАСХН,- 1995.-№1.-С.5 6-58.

11.Сураева Н.М. и Трухан P.C. Некоторые методологические приемы введения чужеродного гена в зиготы животных // Генноннженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов,- 1995,- №1,- С. 227-244.

12,Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Захарченко В.И., Сураева Н.М., Мирошниченко С.И., Бондарук В.В., Лагутина И.С., Мезина М.Н.. Получение трансгенных кроликов инъекцией генов в зиготы// Генноннженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов,- 1995,-№1,-С. 111-127.

13,Сураева Н.М., Прокофьев М.И,, Тарабрина C.B. Способ экспресс-диагностики оплодотворяющей способности спермы быков// Положительное решение о выделении патента на изобретение от 30.01.1996 г., заявка №95109519/15 (016259). Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знаком. 1997, №20,

М.Сураева Н.М. О получении телят из дозревших и оплодотворенных in vitro микроинъецированных зигот с геном ас РНК против вируса лейкоза крупного рогатого скота // Сельскохозяйственная биология,- 1997.- №4,-С.85-88.

15,Сураева Н.М., Удавлениикова H.H., Газина C.B., Лагутина И.С., Трошко Д.В., Прокофьев М.И, Оплодотворяемость спермы различных быков // Зоотехния,-1997.- № 7.-С.26-28.

16,Сураева Н.М. Развитие эмбрионов крупного рогатого скота до стадии бластоцисты при их двухразовом оплодотворении вне организма // Аграрная наука, -1997.- №5.-С. 28-29.

17,Сураева H. М,, Толмазова А.Г, Выделение и характеристика первичных половых клеток из гонад 6-9- дневных эмбрионов кур с целью совершенствования метода получения траисгенной птицы // Доклады РАСХН,- 2004,- Xa2.-C.29-32.

!В. Сураева Н. М. Современные подходы к проблеме введения чужеродных генов в половые клетки животных I! Российский биотеравпевтический журнал,- 2004.- №4,-0.29-38.

Сяужба миожитоциоП текинки ГУ ГОНЦнн. П.Н. Бяахнна РАМИ Подписано в печать 18 . 03 . 05 Заки № 168 Тираж КЮэм