Роль факторов, определяющих результативность получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro

Овчинников, Александр Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль факторов, определяющих результативность получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Роль факторов, определяющих результативность получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro"

На правах рукописи

ОВЧИННИКОВ Александр Александрович

РОЛЬ ФАКТОРОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ РЕЗУЛЬТАТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕНИЯ КЛОНИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА IN VITRO

03.01.06 - Биотехнология 03.03.01 - Физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005009315

2 ОЕВ 20¡2

Дубровицы - 2012

005009315

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

член - корреспондент РАСХН Зиновьева Наталия Анатольевна; кандидат биологических наук Сингина Галина Николаевна.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шихов Игорь Яковлевич доктор биологических наук Лебедев Виктор Иванович.

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Защита диссертации состоится г. в «Ш» часов, на

заседании диссертационного совета Д 006.013.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

Адрес института: 142132 Московская обл. Подольский р-н п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ РАСХН, ТелУфакс: 8(4967) 65-11-01.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института и на сайте института www.vij.ru

Автореферат разослан «Р» января 2012 года

Ученый секретарь совета Д 006.013.01 /?

доктор биологических наук М/ /"сЪ. Воробьева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Технология клонирования в большинстве развитых стран мира открывает существенные возможности животноводству, биотехнологии, фармацевтической промышленности, производству трансгенных животных, сохранению исчезающих видов животных, медицине человека (Niemann et al. 2005, Campbell et al. 2007, Robl et al 2007, Duszewska et al 2010).

В животноводстве технология клонирования может быть направлена на размножение уникальных, высокоценных и выдающихся животных в целях улучшения селекционного процесса, быстрого получения оптимизированных генотипов, а также для сохранения исчезающих пород домашних и диких животных. Не менее важно создание трансгенных животных с измененным обменом веществ в направлении повышения качества и эффективности продукции, животных-продуцентов биологически активных веществ лекарственного назначения, а также животных, генетически устойчивых к ряду инфекционных заболеваний.

Метод межвидового клонирования, в частности пересадка ядер соматических клеток человека в энуклеированные яйцеклетки крупного рогатого скота открывает возможности получения культуры стволовых плюрипотентных эмбриональных клеток и является наиболее перспективным направлением в репаративной медицине.

Несмотря на то, что в последние годы в области клонирования животных достигнуты определенные успехи, эффективность технологии получения клонированных зародышей крупного рогатого скота, равно как и других домашних животных остается крайне низкой, часты случаи аномального эмбрионального развития, а рожденное потомство менее жизнеспособно.

Причиной такого положения является то, что от момента получения клеток источников цитопластов и клеток-доноров кариопластов до получения зародышей и живого потомства стоит целый ряд экспериментальных манипуляций и большое количество непонятых механизмов, которые влияют на развитие реконструированных зародышей. Кроме того техника переноса ядер соматических клеток с использованием в качестве цитопластов ооцитов крупного рогатого скота с самого начала базировалась на методических приемах оплодотворения in vitro. Однако в связи с тем, что отдельные принципиальные положения клонирования не прошли испытания временем, ученые занятые данной проблемой, вынуждены возвращаться к изучению каждого этапа клонирования вновь.

Более того, в мировой литературе есть сведения о получении • клонированных зародышей и потомства крупного рогатого скота (Cibelli et al, 1998; Kato et al, 1998), однако, механизмы позволяющие воспроизвести подобные технологии, полностью не раскрываются. Особенно это касается условий подготовки цитопластов, способов их реконструирования, параметров слияния цитопласта и кариопласта, режимов и условий

активации, а также приемов синхронизации клеточного цикла соматических клеток.

Цель исследований. На основе изучения факторов, влияющих на результативность отдельных этапов клонирования, моделировать технологию получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro методом переноса ядер соматических клеток в энуклеированные ооциты.

В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:

- определить параметры синхронизации бычьих эмбриональных фибробластов в фазе G0/G1, с целью их последующего использования в качестве кариопластов;

- определить эффективность «слепой энуклеации» ооцитов, в зависимости от расположения первого направительного тельца относительно хромосом на стадии метафазы второго деления мейоза и времени созревания ооцит-кумулюсных комплексов;

- исследовать влияние времени культивирования in vitro и гормона пролактина на созревание ооцит-кумулюсных комплексов и положение первого полярного тельца относительно метафазной пластины в ооцитах коров;

- изучить влияние цитохалазина Б на реконструирование ооцитов методом переноса ядер соматических клеток крупного рогатого скота;

- установить оптимальные параметры электрослияния цитопласта и кариопласта с использованием мультипоратора фирмы Eppendorf (Германия);

- изучить влияние пролактина на развитие партеногенетических и клонированных эмбрионов крупного рогатого скота.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние бычьего пролактина на выделение и миграцию первого полярного тельца относительно метафазы II, на эффективность «слепой энуклеации», а также на развитие клонированных эмбрионов в зависимости от продолжительности созревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro. Впервые показано отрицательное действие цитохалазина Б на устойчивость к микроманипуляциям ооцитов, созревших в среде, содержащей пролактин и определены параметры элекгрослияния эмбриональных фибробластов и энуклеированных ооцитов с использованием мультипоратора фирмы Eppendorff.

Практическая значимость. Вследствие усовершенствования способа синхронизации клеточного цикла эмбриональных фибробластов на стадии G0/G1 и созревания ооцит-кумулюсных комплексов, а также методов «слепой энуклеации» и электрослияния цитопластов и кариопластов повышена эффективность технологии получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота.

а также на научных конференциях: 8-я Международная научная конференция-школа ВИЖ "Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных" (Дубровицы, 2009), региональная конференция молодых ученых Курганской ГСХА: "Молодежный научный потенциал в инновационном развитии уральского региона" (Курган, 2009), Международная научно-практическая конференция Уральской государственной академии ветеринарной медицины: «Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии» (Троицк, 2011), I Всероссийская конференция "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет" (Санкт-Петербург, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей, из них 3 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 130 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений и списка использованной литературы, который включает в себя 276 источников, в том числе 267 иностранных авторов. Работа содержит 7 таблиц, 18 рисунков.

Положения, выносимые на защиту:

- эффективность «слепой энуклеации» ооцитов зависит от расположения первого полярного тельца относительно метафазы II. Отклонение более чем на 5 градусов снижает эффективность удаления хромосом;

- на выделение и расположение первого полярного тельца влияет время культивирования и присутствие в среде пролактина. Наибольшая доля ооцитов с ППТ наблюдается в период с 20 до 26 часов. Миграция первого полярного тельца начинается после 20 часов созревания. Пролактин не изменяет динамику выделения, но замедляет процесс миграции первого полярного тельца на 2 часа;

- слияние цитоплазм эмбрионального фибробласта и энуклеированного ооцита крупного рогатого скота с целью образования цитогибрида и его последующее эмбриональное развитие зависит от силы, продолжительности и кратности электроимпульса. Наиболее эффективным является режим: два последовательных импульса силой 30 Вт продолжительностью 15 мкс;

цитохалазин Б не влияет на эффективность реконструирования ооцитов, созревающих в среде без пролактина и снижает долю комплексов цитопласт/кариопласт в случае использования яйцеклеток, созревающих в его присутствии;

- культивирование эмбриональных фибробластов в течение двух дней в ' среде содержащей 5% сыворотки является высокоэффективным способом синхронизации клеточного цикла в фазе С0/С1;

созревающих в течение 18-22 часов. Положительный эффект пролактина в исследуемой системе культивирования на развитие искусственно активированных ооцитов выше, чем реконструированных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в период с 2008 по 2011 год. Экспериментальные исследования проводились в центре биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии по схеме, представленной на рисунке 1.

Объектом исследования служили ооцит-кумулюсные комплексы, выделенные из яичников убитых на мясокомбинате коров, созревшие ооциты на стадии метафазы П, цитопласт, эмбрионы, эмбриональные фибробласты, комплексы цитопласт/кариопласт.

Все манипуляции с ооцитами, цитопластами и комплексами цитопласт/кариопласт проходили в среде ТС-199, содержащей ЮмМ HEPES, 10% к объему фетальной сыворотки плода коров и 50 мкг/мл гентамицина (ТС-199М).

Яичники крупного рогатого скота доставляли с мясокомбината в термосе с физиологическим раствором при температуре 30-35°С в течение 36 часов. Выделенные путем рассечения видимых фолликулов яичников, ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) культивировали в 4-луночных чашках Nunc группами по 30-40 штук в 500 мкл среды, покрытой минеральным маслом, при температуре 38,5°С в атмосфере с 5% С02 и 90%-ной влажности. Время инкубации составляло 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 часов. В качестве контроля использовали среду ТС-199, содержащую 10% ФБС, 1 мМ Na-пирувата, 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 0,5 мкг/мл ФСГ и 0,5 мкг/мл ЛГ, 50 мкг/мл гентамицин-сульфата. В опытных группах в среду вносили бычий пролактин (50 нг/мл). Перед процедурой энуклеации созревшие ооциты освобождали от окружающих кумулюсных клеток в среде ТС-199М, содержащей 0,1% гиалуронидазы. Для манипуляций отбирали только ооциты с первым полярным тельцем.

Источником кариопластов служили эмбриональные фибробласты крупного рогатого скота, выделенные из 50 дневного плода животного. Для работы с соматическими клетками использовалась среда ДМЕМ, с высоким содержанием глюкозы (4,5 г/л), дополненной 2 мМ глутамина,1 мМ пирувата натрия, 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% несущественных аминокислот, 0,1 мМ 2-меркаптоэтанола и 50 мкг/мл гентамицина.

Проведение процедуры энуклеации ооцитов и переноса соматических клеток в цитопласт осуществляли методом прямого прокола зоны пеллюцвда при помощи манипулятора TransferMan NK2 и масляно-гидравлического микроинъектора Cell Tram Oil.

Комплекс цитопласт и кариопласт объединяли методом электрослияния в микрокамере с использованием мультипоратора фирмы Eppendorf при температуре 37°С. Непосредственно перед переносом комплексов

пространство между электродами заполнялось модифицированным буфером для электрослияния.

Выделение ОКК

Культивирование

Культивирование ОКК 16,18, 20, 22 ,24 26 часов

+ пролакгин

- пролактин

Освобождение ооцитов от клеток ку мул юса

Оценка количества ооцитов с ППТ

Оценка миграции ППТ

Эффективность реконструирования

Эффективность энуклеации

Создание банка фибробластов

Заморозка

Разморозка

Пересев

Синхронизация

Снятие с субстрата и подготовка в виде суспензии

Контактное ингибиро ванне 1-6 дней при 5 и 10% ФБС

Энуклеация ППТ и пересадка соматической клетки

I 4

+ цитохалазин Б - цито хал аз и н Б

- 1

Химическая активация цитогибридов

Культивирование эмбрионов до стадии бласто циста

Длительность 15 -30 мке

Оценка доли бластоцисг и их качества

Рис.1. Схема исследований

Активацию полученных цитогибридов проводили химическим методом путем инкубации при 38,5°С в среде ТС-199М, содержащей 5 мкм иономицина в течение 5 минут и культивировали в среде CRlaa, содержащей 2 мМ 6-DMAP. Через 3 часа их вновь переносили в среду CRlaa и культивировали в течение 7 дней до стадии бластоцисты. На пятый день культивирования к среде добавляли 10% ФБС.

Для цитогенетического исследования ядерного материала эмбрионов готовили суховоздушные препараты по методу Тарковского и подсчитывали число ядер для подтверждения стадии их развития.

Для определения стадии клеточного цикла проводили окраску клеток на ДНК с использованием двух методов: гистохимического (по Фельгену) и с применением красителя Hoechst 33342. Относительное количество ДНК ядер клеток определяли с использованием камеры и компьютерной программы Image Scope по методике Шихова (Москва, ООО «Системы для микроскопии и анализа»).

Данные обрабатывали методом х2 или двухфакторным дисперсионным анализом при помощи компьютерной программы Sigma Stat. Достоверность различия сравниваемых значений оценивали с использованием критерия х2 или Тьюки, при этом был принят уровень значимости Р < 0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Моделирование условий культивирования бычьих эмбриональных фибробластов с целью синхронизации клеточного цикла на стадии G0/G1.

Одним из показателей характеризующих стадию клеточного цикла является количество ДНК в ядре. Нами была исследована степень синхронизации клеточного цикла на стадии G0/G1 в зависимости от продолжительности культивирования бычьих эмбриональных фибробластов и содержания в среде ФБС. Для этого бычьи эмбриональные фибробласты с момента формирования ими 100% монослоя культивировали в среде, содержащей 5 или 10% ФБС в течение 1,2, 3,4, 5 и 6 дней.

При применении обоих методов наблюдалась одинаковая тенденция в характере изменения содержания ДНК в ядрах при использовании сред с различным содержанием ФБС. С точки зрения эффективности синхронизации клеток в фазе G0/G1, характеризующейся снижением количества ДНК в ядрах, наиболее результативным оказалось использование ростовой среды, содержащей 5% ФБС. Максимальное число клеток на данной стадии клеточного цикла (с низким содержанием ДНК) было установлено на второй день культивирования - 95-96%. Начиная с четверного дня культивирования наблюдалась деградация клеток. При использовании ростовой среды, содержащей 10% ФБС, данные изменения в морфологии клеток были менее выраженными. Число клеток в фазе G0/G1 было значительно ниже, чем при применении 5% сыворотки.

Влияние пролактина на эффективность «слепой энуклеации» ооцитов коров в зависимости от расположения первого направительного тельца относительно хромосом на метафазе II.

Одним из элементов технологии клонирования является получение цитопласта. Чаще всего для этого проводят полную энуклеацию хромосом ооцита на стадии метафазы второго деления мейоза. С точки зрения сохранения полноценности и способности к последующему эмбриональному развитию «слепой» метод энуклеации рассматривается как наиболее эффективный (Hua et al., 2007). Однако по мере старения яйцеклетки связь между хромосомами и направительным тельцем разрушается и последний начинает мигрировать в перевителлиновом пространстве.

Нами было исследовано влияние места локализации ППТ относительно хромосом ооцита, на эффективность энуклеации ооцитов коров, созревающих in vitro в присутствии пролактина. Контролем служили ооциты, разделенные на аналогичные группы, созревающие в среде без пролактина. Для этого оголенные ооциты с ППТ окрашивали в среде ТС 199М, содержащей 10 мкг/мл красителя Hoechst 33342 в течение 5 минут и разделяли на группы: 1 группа - ориентированные - ооциты, у которых хромосомы расположены рядом с ППТ; 2 группа - ооциты, в которых наблюдается отклонение ППТ не более чем на 5°; и 3, 4, 5 группы - ооциты, с отклонением ППТ в диапазоне от 6 до 10°, от 11 до 30° и от 31 до 90° соответственно. Локализацию ППТ определяли на флуоресцентном микроскопе путем измерения угла между линиями, соединяющими центр ооцита с первым полярным тельцем и с метафазной пластинкой. После процедуры слепой энуклеации ооциты повторно окрашивали Hoechst 33342, с последующей оценкой эффективности удаления их собственного генетического материала.

Таблица 1.

Влияние пролактина на эффективность «слепой энуклеации» в зависимости от расположения ППТ в ооцитах коров_

Группа Контроль Опыт

Ооцитов, Получено Ооцитов, Получено

п цитопластов, (п) % п цитопластов, (п) %

0° 74 (44) 100,0±0,0 51 (51) 100,0±0,0

4-5° 36 (35) 97,2±2,2 32 (31) 96,9±2,4

6-10° 28 (23) 82,1±3,4 34 (26) 76,5±3,3

11-30° 29 (18) 62,1±4,3 28 (16) 57,1±4,2

31-90° 25 (7) 28,0±3,3 22 (7) 31,8±3,7

В результате экспериментов установлено, что эффективность слепой энуклеации снижалась с увеличением угла отклонения ППТ от места расположения хромосом. Наибольший процент цитопластов был получен из ооцитов 1 группы, у которых хромосомы были расположены рядом с ППТ. Отклонение ППТ до 5° практически не снижало данный показатель. В

случае, когда ППТ откланялось от места локализации метафазы II на 6 и более градусов, эффективность энуклеации достоверно снижалась. Так в контроле в 3,4 и 5 группах доля энуклеации была меньше, чем в 1 группе на 17,9 (Р<0,05); 37,9 и 72,0% (Р<0,001), а в опыте на 29,5; 42,9 и 68,2% соответственно (табл.1).

Влияние продолжительности созревания и пролактина на выделение первого полярного тельца в ооцитах коров in vitro.

Повысить эффективность метода «слепой энуклеации» возможно за счет изучения факторов, влияющих на выделение и миграцию первого полярного тельца в ооцитах коров in vitro. Нами было исследовано влияние продолжительности созревания на выделение ППТ в ооцитах коров, созревающих in vitro в присутствии пролактина (опыт) и его отсутствии (контроль).

Установлено, что в опытных группах через 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 часов созревания доля ооцитов с ППТ составила 47,6±3,6; 56,6±2,9-77,3±6,2; 81,1±4,3; 86,8±2,8; 84,7±2,8; 78,5±3,8; 72,6±3,7% соответственно. В контрольных группах она была соответственно 57,4±2,7; 68,3±1,7; 77,5±2,5; 79,5±0,9; 83,4±2,9; 80,1±2,4; 77,2±2,6; 71,5±2,4%. И в опыте и в контроле данный показатель линейно нарастал и имел наибольшее значение через 24 созревания, затем тенденция менялась в обратную сторону.

16 1S 20 22 24 2<5 28 30 It рем н со'февашга ОКК, ч

Рис. 2. Динамика выделения ППТ в зависимости от продолжительности созревания ОКК in vitro (повторов-3, количество ооцитов в группах 86-114)

Достоверно низкой (Р<0,001) по сравнению с другими группами была доля ооцитов с ППТ через 16 и 18 часов культивирования. Несущественно отличалась от пикового значения степень выделения ППТ через 20, 22, 26 и 28 часов созревания (в контроле ниже на 5,9; 3,9; 3,3 и 6,2%, а в опыте на 9,5; 5,7; 2,1 и 8,3% соответственно). В ооцитах, созревающих в течение 30 часов наблюдалось снижение доли ооцитов с ППТ в контроле на 11,9 (Р<0,01) и в опыте на 14,2% (Р<0,01) соответственно, по сравнению с 24 часами.

При добавлении 50 нг/мл пролактина через 16 и 18 часов культивирования наблюдалось достоверное снижение доли ооцитов с ППТ, по сравнению с аналогичными группами в контроле на 9,8 (Р<0,05) и 11,7% (Р<0,05) соответственно. При увеличении продолжительности культивирования до 20 часов наблюдалось резкое возрастание данного показателя с последующим несущественным превышением над контрольной группой в период с 20 до 30 часов созревания.

Таким образом, выделение первого полярного тельца зависит от продолжительности созревания. Наибольшая доля ооцитов с ППТ наблюдается в период с 20 до 26 часов. Добавление пролактина не изменяет динамику, однако приводит к снижению доли ооцитов с ППТ в период с 16 до 18 часов созревания.

Влияние продолжительности созревания и пролактина на миграцию направительного тельца относительно хромосом на стадии метафазы II.

Наибольшая доля ооцитов, в которых ППТ оставалось ориентировано около метафазы II (0% миграции), наблюдалась через 16 часов созревания и составила в контрольной и опытной группах соответственно 89,4±1,2% и 85,5±2,8%. С увеличением продолжительности культивирования до 18, 20, 22, 24 и 26 часов наблюдалось постепенное снижение данного показателя на 8,0 (Р>0,05); 19,8; 25,3; 42,8 и 49,9% (Р<0,001) соответственно. Доля ооцитов, в которых ППТ отклонялось от метафазы II не более чем на 5° составляло 100% только при созревании в течение 16 и 18 часов. Через 20, 22, 24, 26 часов культивирования данный показатель составлял 93,7; 78,7; 54,5 и 37,3% и снижался на 6,3 (Р>0,05); 21,0; 55,2 и 62,5% (Р<0,001) соответственно. То есть массовая миграция ППТ, когда оно отклонялось от места локализации метафазы II более чем на 5° начиналась в контроле с 22 часов культивирования.

Добавление к среде созревания 50 нг/мл бычьего пролактина меняло динамику миграции ППТ. С увеличением продолжительности культивирования до 18, 20, 22, 24 и 26 часов доля ооцитов, в которых ППТ оставалось ориентировано около метафазы II (0% миграции) составила 83,6±2,7; 74,6±3,2; 71,4±1,1; 56,0±1,2 и 39,5% и уменьшалась по сравнению с 16 часами на 1,9; 10,9; 14,1; 29,5 и 46,0% соответственно. С достоверным различием только в группах 24 и 26 часов (Р<0,001).

Доля ооцитов, в которых ППТ отклонялось от метафазы П не более чем на 5 , составляла 100% не только при созревании в течение 16 и 18 часов, но и при созревании в течение 20 часов, с последующим снижением на 10,0 (Р>0,05); 33,2 и 52,0% (Р<0,001) через 22,24 и 26 часов культивирования. То есть массовая миграция ППТ, когда оно отклонялось от места локализации метафазы П более чем на 5°, начиналась в опыте с 24 часов культивирования.

Таким образом, миграция первого полярного тельца в ооцитах коров зависит от продолжительности созревания. Оптимальным временем для

проведения «слепой энуклеации» является период с 16 до 18 часов. Добавление пролакгина замедляет процесс миграции и удлиняет данный промежуток до 20 часов.

100

е = „ — ° «

е. Е- — ° В 3 § В 5 н - -9-

а) опыт

18 20 22 24

Время созревания ОКК. ч

Й ° 1—1'

° С 3 т с: ~

II I

ш 0° Ш1-5° 0 6-10°

л рХ I ■ 11-30° ■ 31 -ЭО°

1 . I1! 14 ,

20 22 24

Время софевашпт ОКК, ч

б) контроль

Рис. 3. Миграция ППТ относительно хромосом на стадии метафазы II. (повторов-3, количество ооцитов в группах 32-47)

Влияние цитохалазина Б на эффективность реконструирования ооцитов коров методом переноса ядер соматических клеток.

С целью дальнейшего моделирования способа реконструирования яйцеклеток мы исследовали влияние цитохалазина Б на получение полноценных цитогибридов после энуклеации и переноса ядер эмбриональных фибробластов в энуклеированные ооциты коров, созревших в присутствии или отсутствии бычьего пролактина.

Ооцит-кумулюсные комплексы в опытной группе культивировали в среде ТС-199 с добавлением пролактина (ПРЛ). В контрольную группу ПРЛ не добавляли. Перед проведением микроманипуляций часть контрольных и опытных ооцитов с ППТ культивировали в течение 15 минут в среде ТС 199, содержащей 7,5 мкг/мл цитохалазина Б. Другая часть ооцитов обработке цитохалозином Б не подвергалась. Норму реконструирования ооцитов определяли в 6 независимых экспериментах, как отношение числа морфологически полноценных ооцитов к общему числу ооцитов, подвергнутых процедуре энуклеации/пересадки.

Полученные результаты свидетельствуют, что обработка ооцитов в течение 15 минут в среде содержащей цитохалазин Б перед проведением процедуры энуклеации и пересадки в перивителлиновое пространство эмбриональных фибробластов не влияла на эффективность их реконструирования (табл. 2).

Доля морфологически нормальных комплексов цитопласт/кариопласт при проведении манипуляций без обработки ооцитов цитохалазином Б составила 81,2%, что было выше по сравнению с группой ооцитов, предварительно обработанных цитохалазином Б лишь на 1,2% .

Таблица 2.

Влияние цитохалазина Б и пролактина на эффективность реконструирования ооцитов коров методом «слепой энуклеации» и переноса __соматической клетки

Показатель Опыт (пролактин) Контроль

Цитохалазин Б(+) Цитохалазин Б(-) Цитохалазин Б(+) Цитохалазин Б(-)

Количество ооцитов, п 135 127 116 126

Доля реконструированных ооцитов, (п) % 54 (54,5%) 103 (81,1%) 84 (80,0%) 95 (81,2%)

Действие цитохалазина Б в опытных группах существенно отличалось от контрольных групп. Добавление пролактина в среду созревания меняло устойчивость ооцитов к микроманипуляциям. Доля реконструированных ооцитов коров без обработки цитохалазином Б составила 81,1%. Предварительная преинкубация ооцитов с цитохалазином Б перед проведением микроманипуляций снижала эффективность реконструирования на 26,6% (Р<0,001). Данный показатель также был ниже на 25,5% по сравнению с контрольной группой, в которой применялся цитохалазина Б (Р<0,001) и на 26,7% с контрольной группой без использования цитохалазина Б (Р<0,001).

Определение параметров слияния цитопласта (энуклеированный ооцит коров) и кариопласта (эмбриональный фибробласт).

С целью определения параметров электрослияния было проведено два эксперимента. В первом эксперименте ооциты подвергали воздействию слабых импульсов напряжением 3 и 5 Вт продолжительностью 5, 10, 15,20 и 25 секунд и оценивали расхождение ооцитов к электродам, их выравнивание и качество. Во втором эксперименте после предварительного воздействия, параметры которого были определены в первом эксперименте, ооциты подвергались действию 1 и 2 последовательных импульсов напряжением 20, 25, 30,35, 40, 45 и 50 кВ продолжительностью 15 и 30 сек. После окончания процедуры оценивали качество ооцитов. И в первом и во втором экспериментах качество ооцитов определяли по наличию или отсутствию дегенеративных изменений, таких как сжатие и/или лизис их внутреннего содержимого.

Полученные в первом эксперименте данные показали, что наилучшие параметры предварительного периода с точки зрения расхождения ооцитов к электродам и их качества наблюдались при использовании в предварительном периоде импульса напряжением 5 Вт продолжительностью 10 сек. Удлинение периода воздействия приводило к появлению дегенеративных изменений в ооцитах. Напряжение в 3 Вт было не эффективным для этих целей.

Полученные результаты второго эксперимента (рис. 4) показали, что наибольшая доля образования цитопластов наблюдалась при использовании двух последовательных импульсов силой 30 Вт продолжительностью 15 мкс. Дальнейшее повышение силы импульса до 35 Вт не привело к положительным результатам и доля слияния циопластов с кариопластами уменьшилась на 14,5% и была на уровне 68,8% (рис. 4Б).

При удлинении продолжительности двух последовательных импульсов (рис. 4Г) наблюдалось снижение эффективности слияния цитопласта и кариопласта и плавное увеличение доли цитогибридов с дегенеративными изменениями, с увеличением силы импульса от 25 до 40 Вт с 16,6% до 80,0%.

Малоэффективным с точки зрения образования цитогибридов оказалось использование однократного электрического воздействия продолжительностью 15 мкс (рис. 4А). Его воздействие, но продолжительностью 30 мкс (рис. 4В) при использовании импульсов силой 25, 30 и 35 Вт примерно в равной степени повышало долю слияния по сравнению с 20 Вт на 47,5; 44,4 и 57,4% соответственно (Р<0,001).

Необходимо отметить, что несмотря на повышение доли слияние при удлиннении продолжительности воздействия однократного электрического импульса (рис. 4В) его эффект по сравнению с двумя последовательными импульсами, но меньшей продолжительности (рис. 4Б) был ниже. Наиболее оптимальная группа 25 Вт продолжительностью 30 мкс, позволяла получать на 35,8 (Р<0,001) и 21,3% (Р<0,001) меньше цитогибридов, чем группа 30 и 35 Вт продолжительностью 15 мкс.

Ё 60

а<

«40 С

29.6

34.5

100 - 80

i 60 &

2 40

ft 5.6 В

20 0

23.0

га

28.6

83.3

20 25 30 35 Сила импульса, Вт

1 ИМПУЛЬС МКР.

30 35 40 Сила нмп}'.па>са, Вт

2 импульса 15 мкс.

20 25 30 35 40 Сила импульса, Вт

1 импульс 30 мкс.

30 35 40 Сила импульса, Вт

2 импульса 30 мкс.

Рис. 4. Эффективность слияния цитопласта и кариопласта в зависимости от силы, числа и продолжительности элеюроимпульса (повторов-3, количество ооцитов в группах 24-34) Увеличение кратности импульса повышало долю образования цитогибридов в независимости от силы электрического импульса. Так в группах, на которые воздействовали импульсом в 20, 25, 30, 35 и 40 Вт в случае использования двух последовательных импульсов, по сравнению с анологичными группами, но при однократном воздействии, наблюдалось повышение доли слияния на 23,0; 10,1; 53,7 (Р<0,001); 34,3 (Р<0,001) и 9,3% соответственно.

Развитие бычьих клонированных эмбрионов в зависимости от силы, продолжительности и количества электроимпульса.

Нами были исследованы три различных режима слияния, эффективность которых была показана в случае получения цитогибридов при электрослиянии эмбриональных фибробластов и эуклеированных ооцитов коров (рис.4) на развитие клонированных эмбрионов in vitro.

Полученные данные (табл. 3) показали, что наибольшая доля дробления и развития бластоцист наблюдается при использовании для получения цитогибридов двух последовательных импульсов силой 30 Вт продолжительностью 15 мкс (вторая группа). В данной группе первое

деление дробления завершали 74,4% цитогибридов, а полученные двуклеточные эмбрионы развивались до стадии бластоцисты в 22% случаев.

Таблица 3.

Развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота в _зависимости от режимов электрослияния _

Сила, продолжительность, кратность импульса Количество цитогибридов, п Число повторов, п Доля дробления, % Доля бластоцист, %

25 Вт, 30 мкс, 2 импульса 158 7 55,6 ±1,9 13,4 ±1,3

30 Вт, 15мкс, 2 импульса 122 6 74,4 ± 1,8 22,0 ±0,7

35 Вт, 15 мкс, 2 импульса 98 5 49,5 ± 1,9 12,5 ± 1,1

Повышение силы импульса до 35 Вт (третья группа) приводило к понижению доли дробления цитогибридов на 24,9% (Р<0,001) и доли последующего развития бластоцист на 9,5% (Р<0,001) по сравнению со второй группой, в которой использовался импульс силой 30 Вт.

При удлинении продолжительности импульса до 30 мкс и уменьшении его силы до 25 Вт, также наблюдалось снижение эффективности эмбрионального развития полученных цитогибридов. Доля дробления в данной группе составила 55,6%, что было на 18,8% меньше, чем во второй группе (Р<0,001). Наблюдалось также снижение доли развития цитогибридов до стадии бластоцисты на 8,6% (Р<0,001).

Влияние пролактина на получение клонированных и партеногенетических эмбрионов крупного рогатого скота.

Было исследовано влияние продолжительности созревания ооцит-кумулюсных комплексов на развитие цитогибридов до стадии бластоцисты в присутствии пролактина (опыт) и его отсутствии (контроль). В обоих случаях в качестве цитопластов были использованы ооциты, созревающие in vitro в течение 16, 18, 20, 22 и 24 часов. Дополнительно было исследовано влияние пролактина и времени созревания на партеногенетическое развитие ооцитов коров in vitro. Для этого ооциты искусственно активировали через 24 и 26 часов созревания.

Наивысший процент развития бластоцист в контроле был получен при использовании в качестве цитопласта ооцитов, созревающих в период с 22 до 24 часов (17,2 и 14,9% соответственно). В группе 22 часа он был больше по сравнению с 16, 18 и 20 часов на 13,8; 12,1 и 6,5% соответственно (Р<0,001). Добавление в среду созревания 50 нг/мл пролактина положительно влияло на жизнеспособность эмбрионов (рис. 5). Доля развития бластоцист в группах 16, 18, 20 и 22 часа была на 3,8; 10,7 (Р<0,001); 6,4 (Р<0,001) и 2,7% соответственно больше чем в контроле.

16 18 20 22 24

Время созревания ОКК, п

Рис. 5. Развитие клонированных цитогибридов в зависимости от продолжительности созревания ОКК коров in vitro (число экспериментов: п=3-4, количество цитогибридов в группах 12-25)

Цитологический анализ суховоздушных препаратов показал, что на 7-8 день после искусственной активации цитогибридов в клонированных эмбрионах находится от 62 до 150 ядер (рис. 6а,б), что свидетельствует о их биологической полноценности.

Рис. 6. Поздние стадии развития клонированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro Увеличение 160х (А - бластоциста (62 ядра); Б -экспандированная бластоциста (150 ядер)

Положительное влияние пролактина на партеногенетические эмбрионы было более выражено и не зависело от продолжительности созревания ооцит-кумулюсных комплексов (табл.4). Развитие искусственно активированных через 24 и 26 часов созревания ооцитов коров до стадии бластоцисты в опытной группе было 20 и 25,3% соответственно больше по сравнению с аналогичными группами в контроле (Р<0,05).

Таблица 4.

Влияние пролактина на развитие партеногенетических эмбрионов _крупного рогатого скота in vitro_

Показатель 24 часа созревания 26 часов созревания

опыт контроль опыт контроль

Количество ооцитов с ППТ, п 96 85 92 83

Количество бластоцист, п 35 14 40 15

Доля развития бластоцист, % 36,5±1,4 16,5±1,7 43,4±1,2 18,1±1,3

4. ВЫВОДЫ

1.Для эффективного удаления хромосом ооцита первое полярное тельце, служащее ориентиром их расположения при «слепой энуклеации», не должно отклоняться от места локализации метафазы II более чем на 5 градусов.

2. Выделение первого полярного тельца зависит от продолжительности созревания ооцитов крупного рогатого скота. Наибольшая доля ооцитов с первым полярным тельцем наблюдалась в период с 20 до 26 часов созревания, с максимальным количеством - в 24 часа.

3. Добавление к среде созревания 50 нг/мл бычьего пролактина не влияет на созревание ооцитов, но замедляет процесс миграции первого полярного тельца относительно метафазы П. Отклонение ППТ от места локализации метафазы П более чем на 5 градусов происходит после 22 часов созревания ооцит-кумулюсных комплексов, что на 2 часа позднее, чем в его отсутствии.

4. Нецелесообразно проводить обработку ооцитов коров цитохалазином Б перед проведением процедуры «слепой энуклеации» и переносом соматической клетки, так как это не влияет на эффективность реконструирования ооцитов, культивируемых без пролактина и снижает долю комплексов цитопласт/кариопласт на 26,6% (Р<0,001) в случае использования ооцитов, созревающих в его присутствии.

5. Слияние цитоплазм эмбрионального фибробласта и энуклеированного ооцита крупного рогатого скота с целью образования цитогибрида и его последующее эмбриональное развитие зависит от силы, продолжительности и кратности электроимпульса. При использовании для этих целей Мультипоратора фирмы Eppendorf оптимальными являются два последовательных импульса силой 30 Вт продолжительностью 15 мкс, которые позволяют получать 83,3% цитогибридов.

6. Развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота зависит от продолжительности созревания ооцит-кумулюсных комплексов, которое составляет 22 часа. Введение пролактина в среду приводит к сокращению времени, необходимого для приобретения ооцитами способности к эмбриональному развитию до 18 часов, повышая при этом долю развития бластоцист на 10,7% (Р<0,001).

7. Добавление в среду созревания пролактина повышает долю развития искусственно активированных ооцитов крупного рогатого скота более чем в два раза.

8. Культивирование 100% монослоя эмбриональных фибробластов в среде содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки позволяет синхронизировать клеточный цикл на стадии G0/G1 в 95-96% случаев

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

С целью повышения эффективности технологии получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота необходимо модифицировать систему культивирования ОКК за счет введения в среду 50 нг/мл бычьего пролактина; проводить процедуру «слепой энуклеации» в период с 18 до 22 часов с момента постановки ооцитов на созревание без предварительной обработки цитохалазином Б; для электрослияния цитопласта с кариопластом на мультипораторе фирмы Eppendorff использовать два последовательных импульса силой 30 Вт продолжительностью 15 сек. двумя импульсами; синхронизацию эмбриональных фибробластов в фазе G0/G1 проводить путем двухдневного культивирования 100% монослоя в среде содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

В рецензируемых изданиях:

1. Овчинников, A.A. Влияние цитохалазина Б на реконструирование ооцитов методом переноса ядер соматических клеток крупного рогатого скота / A.A. Овчинников, Г.Н. Сингина // Аграрный вестник Урала 2011 №9 (88). С.17-18. '

2. Сингина, Г.Н. Факторы, влияющие на развитие клонированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro / Г.Н. Сингина, A.A. Овчинников, Т.Е. Тарадайник, H.A. Зиновьева, A.B. Лопухов // Аграрный вестник Урала. 2011. № 11 (90). С.9-11.

3. Лебедева И.Ю. Характеристика внутриклеточного пути, вовлеченного в реализацию индуцирующего влияния пролактина на мейоз ооцитов коров / И.Ю. Лебедева, Г.Н. Сингина, Т.Е, Тарадайник, A.A. Овчинников // Цитология 2011. № 9 (53). С. 710.

В других изданиях:

4. Овчинников, A.A. Состояние и перспективы развития метода клонирования крупного рогатого скота / A.A. Овчинников // Мат. региональной конф. молодых ученых Курганской ГСХА: Молодежный научный потенциал в инновационном развитии Уральского региона -Курган. 2009. С.139-140.

5. Овчинников, A.A. Особенности технологии получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота методом in vitro / A.A. Овчинников // Мат. Междунар. научно-практич. конф. УГАВМ: Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии. - Троицк 2011. С.149-154. Р

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (8-4967) 65-13-18 (8-4967) 65-15-97

Сдано в набор 18.01.2012. Подписано в печать 19.01.2012 _Заказ № 5. Печ. л. 1,0. Тиражей экз._

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Овчинников, Александр Александрович, п. Дубровицы

61 12-3/4-*2

ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ЖИВОТНОВОДСТВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫX НАУК

На правах рукрписи^ Овчинников Александр Александрович

Роль факторов, определяющих результативность получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro

03.01.06- Биотехнология 03.03.01 - Физиология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор, член - корреспондент РАСХН

Зиновьева H.A.

кандидат биологических наук Сингина Г.Н.

Дубровицы - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..............................................................5

ВВЕДЕНИЕ .................................................................................7

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................14

1.1. История клонирования..........................................................14

1.2. Этапы клонирования и факторы, влияющие на их эффективность...................................................................17

1.2.1. Подготовка цитопластов ...........................................................17

1.2.2. Подготовка кариопласта .......................................................22

1.2.2.1. Типы соматических клеток, используемые для получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота...................22

1.2.2.2. Способы синхронизации соматических клеток...........................24

1.3. Реконструирование ооцитов .................................................25

1.4. Слияние кариопласта с цитопластом........................................29

1.5. Активация цитогибридов и постактивационное культивирование... 32

1.6. Метилирование в клонированных формах ...............................39

1.7. Заключение по обзору литературы .........................................41

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...................... 45

2.1.1. Объект исследований......................................................... 46

2.1.2. Реактивы .........................................................................46

2.1.3. Оборудование ...................................................................48

2.1.4. Культуральная посуда .........................................................49

2.1.5. Специальные среды и растворы .............................................49

2.2. Методы исследований .........................................................50

2.2.1. Транспортировка яичников, выделение и созревание ооцитов коров ..............................................................................50

2.2.2. Выделение, культивирование и хранение эмбриональных фибробластов крупного рогатого скота .................................52

2.2.3. Получение цитопласта (энуклеация ооцита) и комплекса цитопласт/кариопласт (пересадка соматической клетки) ................55

2.2.4. Слияние кариопласта и цитопласта ........................................59

2.2.5. Активация цитопластов и постактивационное культивирование.....59

2.2.6. Цитологический анализ эмбрионов ........................................59

2.2.7. Гистохимический анализ культуры соматических клеток .............60

2.2.8. Статистическая обработка результатов экспериментов .................61

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..............62

3.1. Моделирование условий культивирования бычьих эмбриональных фибробластов с целью синхронизации клеточного цикла на стадии G0/G1................................................................................62

3.2. Влияние различных факторов на эффективность «слепой энуклеации» ооцитов коров созревших in vitro ....................................67

3.2.1. Влияние пролактина на эффективность «слепой энуклеации» ооцитов коров в зависимости от расположения первого направительного тельца относительно хромосом на стадии метафазы второго деления мейоза ...........................................68

3.2.2. Влияние продолжительности созревания и пролактина на выделение первого полярного тельца в ооцитах коров in vitro .............71

3.2.3. Влияние продолжительности созревания и пролактина на миграцию направительного тельца относительно хромосом на стадии метафазы II ......................................................................72

3.3. Влияние цитохалазина Б на эффективность реконструирования ооцитов коров методом переноса ядер соматических клеток .........75

3.4. Определение параметров слияния цитопласта и кариопласта ........78

3.5. Развитие бычьих клонированных эмбрионов в зависимости от

силы, продолжительности и количества электроимпульса ...........86

3.6. Влияние пролактина на получение клонированных

и партеногенетических эмбрионов крупного рогатого скота ..........88

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ .........................................................93

ВЫВОДЫ........................................................................101

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.................................102

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...................103

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА ................................................. бычий сывороточный альбумин

КК..................................................................... кумулюсные клетки

КРС ............................................................... крупный рогатый скот

ЛГ............................................................ лютиенизирующий гормон

МП................................................................ метафазная пластинка

ППТ..............................................................первое полярное тельце

ПРЛ .............................................................................. пролактин

ПЯСК ........................................... перенос ядер соматических клеток

CHX ........................................................................ циклогексимид

ФСГ............................................... фолликулостимулирующий гормон

ЭСК ....................................................... эстральная сыворотка коров

6-DMAP ......................................................... 6-диметиламинопурин

CSF............................................................. цитостатический фактор

DMEM.....................среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко

ECS ................................ инактивированная эстральная сыворотка коров

EDTA ......................................... этилендиаминтетрауксусная кислота

EGF ...................................................... эпидермальный фактор роста

FBS ................................................ эмбриональная телячья сыворотка

FCS ...................................................эмбриональная бычья сыворотка

GVBD ......................................... разрушение зародышевого пузырька

IGF ................................................ инсулиноподобный фактор роста

IGF-I ............................................. инсулиноподобный фактор роста 1

МАРК.................................митоген-активизированная протеин киназа

МП..............................................................................метефаза II

MPF ............... фактор, способствующий созреванию, мейозу или митозу

NT........................................................................ ядерная передача

Oct-4 ...................................................... транскрипционный фактор

PBS .......................................................... фосфатно-солевой раствор

внутренняя клеточная масса фетальная бычья сыворотка

Введение

Актуальность темы. Технология клонирования в большинстве развитых стран мира открывает существенные возможности животноводству (Revermann et al, 2000), биотехнологии (Baguisi et al., 1999), фармацевтической промышленности (Robl et al., 2007), производству трансгенных животных, сохранению исчезающих видов животных (Lanza et al, 2000; Loi et al., 2001), медицине человека (Niemann et al., 2005; Campbell et al., 2007; Robl et al., 2007; Duszewska et al., 2010).

В середине 1990-х годов индустрия клонирования базировалась на успешных исследованиях Wilmut (1997), под руководством которого впервые было получено первое клонированное животное - овца, продемонстрировав всему миру, что данная технология возможна, хотя и является весьма затратной и очень трудоемкой.

В след за ним в разных странах мира отмечались случаи рождения клонированных животных с использованием усовершенствованных и более эффективных методик, позволяющих получать больший процент развития реконструированных эмбрионов и рождения живого потомства.

Для технологии переноса ядра в энуклеированный ооцит, чтобы достигнуть ее самого полного потенциала, важно понять, может ли процедура клонирования полностью изменить клеточное старение и произвести клоны с нормальным генетическим и физиологическим возрастом, как при естественном воспроизводстве, или нет (Zhong et al., 2000). При этом немаловажным остается тот факт, что в процессе развития реконструированного эмбриона тысячи генов должны быть правильно экспрессированы (Humpherys étal, 2001).

Техника переноса ядер соматических клеток, с использованием в качестве цитопластов ооциты крупного рогатого скота, базировалась в свое время на методических приемах оплодотворения in vitro.

Разработанная в нашей стране к настоящему времени технология культивирования и оплодотворения in vitro ооцитов крупного рогатого скота

позволяет получать 39,2% бластоцист с рождением живого потомства 27,3% (Сингина и др., 2011).

Что же касается использования ядерной пересадки в процессе клонирования, то следует отметить, что все ядра в организме содержат одинаковый набор генов (Wilmut et al, 1997; Kato et al, 1998, 1999; Wakayama et al, 1998, 1999; Zakhartchenko et al, 1999 a,b). В основном используют эмбриональные фибробласты, так как они имеют большую способность к репрограммированию и дальнейшему развитию (Cibelli et al, 1998).

В отличие от них взрослые соматические клетки успешно использовались Wilmut с соавторами (1997) для получения клонированного потомства. К тому же Kubota с соавторами (2000) показали возможность взрослых соматических клеток оставаться тотипотентными в течение долгого культивирования, что позволяло получать клонированные эмбрионы и живое потомство при многочисленном пассировании донорских клеток-кариопластов, хотя они и имеют меньшую потенцию к развитию по сравнению с эмбриональными клетками. Привлекательность взрослых соматических клеток для получения клонированного потомства связана с возможностью проведения фенотипического и генотипического анализа, а также получением большего количества потенциальных источников ядер (Arat etal., 2001).

Используя технологию клонирования в животноводстве можно получать уникальных, высокоценных и выдающихся животных в целях улучшения селекционного процесса, быстрого получения

оптимизированных генотипов, а также для сохранения исчезающих пород домашних и диких животных. Не менее важно создание трансгенных животных с измененным обменом веществ в направлении повышения качества продукции (Эрнст, Зиновьева, 2008), животных-продуцентов биологически активных веществ (рекомбинантных белков человека), лекарственного назначения, а также животных, генетически устойчивых к

ряду инфекционных заболеваний.

Метод межвидового клонирования, в частности пересадка ядер соматических клеток человека в энуклеированные яйцеклетки крупного рогатого скота, открывает возможности получения культуры стволовых плюрипотентных эмбриональных клеток и является наиболее перспективным направлением в репаративной медицине.

В мировой литературе имеются сведения о получении клонированных зародышей и потомства крупного рогатого скота (СПэеШ а!., 1998; Ка1;о et а!., 1998), однако механизмы, позволяющие воспроизвести подобные технологии, полностью не раскрываются. Это касается параметров слияния цитопласта и кариопласта, их активации, а также методов синхронизации клеточного цикла соматических клеток. Вследствие чего данная технология, в основном, носит эмпирический характер, имея низкую повторяемость результатов с уровнем получения клонированного потомства около 1- 4% ^Пти^я/., 1997; 1№акауата 1998; М1уо$Ы ег а!., 2001).

Причиной такого положения является с одной стороны то, что получение клонированных форм предусматривает целый ряд сложных манипуляций, а с другой стороны имеет место большое количество непонятных механизмов, которые влияют на развитие реконструированных зародышей. Многие эмбрионы, созданные путем реконструирования, нередко погибают незадолго до или после рождения. Тем не менее, выжившие животные часто имеют пороки, которые препятствуют их развитию или пагубно сказываются на их постнатальном развитии. На сегодняшний день ученые еще не знают в деталях причины, которые способствуют данным событиям. Кроме того, остается открытым вопрос о степени различий между природными процессами развития и искусственными, которые происходят после ядерной передачи в ооцитах крупного рогатого скота (Кеуегшапп а1, 2000).

Считается, что одной из главных причин неудачных попыток получения клонированных эмбрионов являются нарушения в экспрессии генов. Кроме

того, значительная доля реконструированных бластоцист, наряду с меньшим количеством ВКМ (Коо et al., 2002) имеет ненормальное клеточное расположение (Chesne et al, 2002; Коо et al., 2002; Boiani et al., 2003), апоптоз (Levy et al, 2001), и как следствие дефекты эмбрионального развития (Chesne et al., 2002). Две формы клеточной смерти известны и могут быть выделены на основе морфологических и молекулярных критериев (Savill, 1994). Это некроз, который характеризуется ядерным распадом с разрывом внутренних и внешних мембран и апоптоз, который включает в себя разрушение цитоплазмы, конденсацию хроматина, фрагментацию ДНК с распадом ядра (Otti et al., 1999; Fahrudin et al., 2002; Neuber et al, 2002; Pomar et al, 2004).

В соответствии с вышеуказанной целью были поставлены следующие задачи:

Научная новизна. Впервые исследовано влияние бычьего пролактина на выделение и миграцию первого полярного тельца относительно метафазы II, на эффективность «слепой энуклеации», а также на развитие клонированных эмбрионов в зависимости от продолжительности созревания ооцитов крупного рогатого скота in vitro. Впервые показано отрицательное действие цитохалазина Б на устойчивость к микроманипуляциям ооцитов, созревших в среде, содержащей пролактин и определены параметры электрослияния эмбриональных фибробластов и энуклеированных ооцитов с использованием мультипоратора фирмы Eppendorf.

Положения, выносимые на защиту:

- эффективность «слепой энуклеации» ооцитов зависит от расположения первого полярного тельца относительно метафазы II. Отклонение его более чем на 5 градусов снижает эффективность удаления хромосом;

полярного тельца начинается после 20 часов созревания. Пролактин не изменяет динамику выделения, но замедляет процесс миграции первого полярного тельца на 2 часа;

- цитохалазин Б не влияет на эффективность реконструирования ооцитов, созревающих в среде без пролактина и снижает долю комплексов цитопласт/кариопласт в случае использования яйцеклеток, созревающих в его присутствии;

- культивирование эмбриональных фибробластов в течение двух дней в среде содержащей 5% сыворотки является высокоэффективным способом синхронизации клеточного цикла в фазе 00/01;

- пролактин улучшает развитие клонированных и партеногенетических эмбрионов крупного рогатого скота. Наибольший процент развития клонированных бластоцист получается при «слепой энуклеации» ооцитов, созревающих в течение 18-22 часов. Положительный эффект пролактина в исследуемой системе культивирования на развитие искусственно активированных ооцитов выше, чем реконструированных.

Апробация результатов диссертации. Основные материалы диссертации доложены на научных конференциях Цента биотехнологии и молекулярной диагностики животных ГНУ ВИЖ в период с 2009 по 2011 гг., а также на научных конференциях: 8-я Международная научная конференция-школа ВИЖ "Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных" (Дубровицы, 2009), региональная конференция молодых ученых Курганской ГСХА: "Молодежный научн�

Информация о работе

Овчинников, Александр Александрович
кандидата биологических наук
п. Дубровицы, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Роль факторов, определяющих результативность получения клонированных эмбрионов крупного рогатого скота in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы