Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Жизнеспособность эмбрионов крупного рогатого скота после криоконсервирования, оттаивания и пересадки

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Жизнеспособность эмбрионов крупного рогатого скота после криоконсервирования, оттаивания и пересадки"

Л' шъ

На правах рукописи

Асланов Антон Филиппович

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ, ОТТАИВАНИЯ И ПЕРЕСАДКИ

03.00.13 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Дубровины- 2003 г.

Работа выполнена во Всероссийском государственном научно-псследоватсльском институте животноводства

Научный руководитель - доктор биолоптссски* наук Дснреталы Мудагшфо&ич Чомаев

Научный консультант • доктор биологических наук,

профессор Николай Иванович Сергеев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Нурбнй Сафарбневич Марзанов;

............кандидат биологических наук Татьяна Егоровна Тарадайлнк---

Ведущееучремедение; Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнолоти им, К.И. Скрябина

Защита состоится « Ж&А 2003 года, в 10 часов, на заседании дисссртщщонного совета Д 006,013.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142132, н. Дубровины I юдольского района Московской области С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГШШЖ

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических на;

В.11. IV •• •

1.Общая характеристика работы

Актуальность темы. Отечественная экономика диктует необходимость интенсификации селекционной работы с целью ускоренного создания пород, линий, семейств животных, для формирования оптимальной структуры совокупного стада крупного рогатого скота, отвечающей потребностям постоянно меняющейся конъюнктуры рынка. В этих условиях придают большое значение мероприятиям по организации процесса воспроизводства на основе биотехнических методов, позволяющих реально планировать биологические процессы с учётом организационных, технических, морально-экономических и других обстоятельств. Без продолжения исследований в области эмбрнотрансплантации и одновременной реализации достижений в практике селекционной работы решить проблему не представляется возможным (Д.Л. Левактик, 2000).

Эта точка зрения нашла отражение в концепции развития животноводства страны до 2010 года, одобренной коллегией Минсельхозэ РФ в 2001 г. (Н.И. Стрекозой и др., 2001).

Наибольшие успехи в области создания высокопродуктивного молочного скота достигнуты в США и Канаде, которые удерживают в этой области лидерство благодаря внедрению в производство метода трансплантации эмбрионов, В странах Европы н Северной Америки около 70% быков-цроизводителей, используемых для искусственного - осеменения, получены методом трансплантации эмбрионов, и доля их продолжает увеличиваться.

Низкотемпературное консервирование эмбрионов сельскохозяйственных животных является важнейшим элементом технологии трансплантации эмбрионов и имеет большое практическое значение, так как позволяет обходиться без содержания большого стада потенциальных реципиентов, необходимых для пересадок свежен олуч с иных эмбрионов и значительно упрощает экспорт и импорт эмбрионов.

Использование крнокоисервирования дзёт возможность сохранять эмбрионы от выдающихся животных, а также накапливать генофонд локальных, исчезающих пород. В исторической перспективе это может быть использовано для восстановления некоторых качеств, неизбежно теряющихся породами в процессе интенсивной селекции. Кроме того, применение данного элемента технологии позволяет решать вопросы акклиматизации пород и получения гибридов для создания адаптированных популяций в регионах с экстремальными климатическими условиями.

Однако, несмотря на достаточно высокий уровень разработанности технологии криоконсервирования, многие её элементы требуют дальнейшего совершенствования. Прнживляемость эмбрионов оттаянных и трансплантированных после криоконсервирования снижается на 25-50% по сравнению с результатами пересадок свежсполученных эмбрионов. Снижение результативности является следствием мно!~охратных температурных перепадов.

ЦНБМСХА <" 7РЫ

сопровождающих процесс подготовки зародышей к замораживанию и последующему оттаиванию и других выясненных и невыясненных факторов. Производство нуждается в менее трудоёмких сноообах. Необходим поиск новых криопротекторов и питательных сред.

Целью работы явились исследования жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после криоконсервирования, оттаивания и пересадки. Для этого были определены следующие задачи:

- в сравнительном аспекте определить характерные особенности эмбрионов, получаемых от здоровых и проблемных коров-доноров;

- определить эффективность различных способов криоконсерв нровш i ия эмбрионов, полученных от коров-доноров с различными уровнями продуктивности;

- испытать оценку жизнеспособности эмбрионов после оттаивания по морфологическим признакам и методом культивирования;

- исследовать жизнеспособность оттаянных эмбрионов после пересадки;

- на основе анализа полученных данных сформулировать выводы и дать предложения для практики.

Научная новизна работы заключается в том, что дана дифференциальная характеристика эмбрионов, получаемых от здоровых коров-доноров с продуктивностью до 5000 кг молока и свыше 5000 кг молока за лактацию н проблемных коров-доноров. Данный аспект определяет степень эффективности различных методов криоконсервирования эмбрионов, а также способов оттаивания и оценку жизнеспособности эмбрионов после оттаивания. Определены факторы, влияющие на течение эмбриогенеза после пересадки и пути снижения эмбриональной смертности. Приоритет исследований подтверждён A.C. №1739987 СССР, А61 В 19/02, 1990 {Патент №2078549. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10 мая 1997 г.).

Практическая значимость. Рекомендуемые методы криоконсервирования эмбрионов и определение их качества после оттаивания, получаемых от высокопродуктивных здоровых и выбракованных коров, гарантируют повышение жизнеспособности эмбрионов, пригодных для трансплантации. Найдены пути снижения эмбриональной смертности. Данные факторы обеспечивают повышение эффективности технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в целом, что, в свою очередь, позволяет существенно повысить эффективность реализации селекционно-генетического потенциала высокопродуктивных коров

Основные положения, выносимые на защиту:

-влияние продуктивности коров-доноров на эффективность и результаты криоконсервирования эмбрионов;

-пути повышения жизнеспособности эмбрионов после пересадок.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и одобрены на международных, союзных, республиканских и зональных конференциях (Москва, Львов, Харьков, Киров, Санкт-Петербург, Боровск, Брест, Минск, 1989-2002 гг.). Научно-теоретические положения и практические рекомендации сформулированные в диссертации используются в учебном процессе НГСХА.

Публикации. Результаты научных исследований опубликованы в 4 печатных работах.

Объем и структура. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, 1 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, материалов н методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений.

Список литературы включает 122 источника, в т.ч. 97 иностранных.

Рис. I. Схема исследований

2. Материал и методика

Исследования (рис.1) проведены на протяжении 1985-2003 гг. в Центре трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных (ВГНИИЖ) на эмбрионах, полученных от коров-доноров в опытных хозяйствах ВГНИИЖ, а также ряда хозяйств Московской, Тульской, Вологодской и Нижегородской областей.

В качестве доноров служили проблемные, выбракованные и нормальные коровы со средней к высокой молочной продуктивностью—до 5000 и выше 5000 кг молока в год, соответственно. Подготовку коров для использования как доноров эмбрионов и тёлок как реципиентов, индуцирование суперовуляцин, осеменение, извлечение и пересадку эмбрионов проводили по методикам н инструкциям ВГНИИЖ.

Кормление коров-доноров и тЕпок-рециписнтов осуществляли по нормам, разработанным ВГНИИЖ.

Морфологическую оценку эмбрионов, полученных после извлечения, проводили на малых часовых стёклах в 1 мл питательной среды при увеличении в 100 раз по ттятибальной шкале ВГНИИЖ; выявляли неоплодотворённые яйцеклетки, эмбрионы без признаков развития и с дегенеративными изменениями оболочки и цитоплазмы.

Часть эмбрионов после морфологической оценки ставили на культивирование до 24 часов с целью подтверждения морфолога ческой оценки и изучения влияния культивирования на жизнеспособность зародышей.

Для криоконсервирования использовали те эмбрионы, которые оценивали только на хорошо и отлично.

Растворы готовили на модифицированной среде Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки телёнка и 10000 ед/л калиевой соли пенициллина. Среда для промежуточного хранения эмбрионов использовалась как исходная для приготовления растворов глицерина и сахарозы.

Исследовали эффективность разных способов насыщения эмбрионов криопротектором: одно- и многоступенчатых. Контроль за проводкой эмбрионов до и после замораживания выполняли в стерильном боксе при комнатной температуре (20°С).

Эмбрионы замораживали с помощью специальных программных замораживателей, принцип работы которых основан на постепенном охлаждении эмбрионов в автоматическом режиме УОП-1 и «Планер». Замораживание зародышей проводили также в газообразном азоте методом нитрификации. Комплект оборудования для такого способа включает: широкогорлый сосуд Дюара СДП-2, камеру с гнёздами для соломннок из фторопласта и универсальный штатив с держателем. Режим охлаждения фиксировался прибором КСП-4. Для возникновения кристаллизации среды в пробирках или соломинках использовали специальные обжимки и пинцеты.

Оттаянные эмбрионы оценивали по 5-бальной шкале ВГНИИЖ под инвертированным микроскопом МБИ-30 при увеличении в 100 раз. Для точного определения биологи1ческой полноценности эмбрионов проводили оценку эмбрионов методом культивирования. Исследования проводили на эмбрионах, оцененных положительно на основании морфологических признаков. В качестве питательной среды использовали солевой раствор Дюльбекко с добавлением 30% фстальной сыворотки телёнка.

Трансплантацию эмбрионов провозили нехирургическим (трансцсрв и кал ьным) методом в рог матки, нпсилатсральный яичнику с жёлтым телом,

В опытах по снижению эмбриональной смертности после пересадок испытывали эффективность введений прогестерона, оурфагона и ХГЧ в общепринятых дозах.

В работе использовали материалы ветеринарного и зоотехнического учёта хозяйств, племенные записи.

Статистическую обработку проводили по Е.К. Меркурьевой (1970).

ЗЛ'езультаты собственных исследований

3.1. Характеристика эмбрионов, получаемых от здоровых и проблемных коров-доноров с разным уровнем молочной продуктивности

Анализ результатов собственной работы в области трансплантации эмбрионов и данных литературы показывает высокую вариабельность показателей приживляемое™ трансплантированных эмбрионов после криоконсервирования всеми известными методами. В ряде случаев, жизнеспособность оттаянных эмбрионов может достигать величины показателей, получаемых после пересадки свежеполученных эмбрионов, т.е. до 67,0% приживлясмостн, но может не превышать 10,0-17,0%. В процессе проведения исследований было выявлено, что оттаянные после замораживания эмбрионы, получаемые как от здоровых, так и от проблемных высокопродуктивных коров имеют характерную особенность— низкий процент приживаемости, даже в том случае, если после извлечения они были оценены по морфологическим признакам как хорошие и отличные.

В этой связи исключительное значение имеет выяснение факторов, влияющих на жизнеспособность эмбрионов, получаемых от доноров с разным уровнем продуктивности и физиологическим статусом.

В рамках затрагиваемой проблематики мы провели исследования по определению влияния осеменения коров-доноров спермой, оттаянной двумя способам», на оплодотворяемость и эффективность выхода эмбрионов, пригодных для криокоиеервации, а также влияния на эти показатели типа гонадотропина, применяемого для вызывания суперовуляции.

В опыте коров-доноров с индуцированной суперовуляцией осеменяли спермой одного и того же быка-производителя, опаянной с применением лимоннокислого натрия и без пего. Примените второго способа определяла

задача испытания метода, повышающего эффективность оттаивания замороженной в гранулах спермы быков-производителей, а также других биологических объектов, исключающего применение дефицитного лимоннокислого натрия и стеклянных флаконов или ампул.

Полученные данные показали, что оплодогворяемость при осеменении коров-доноров спермой, оттаянной без лимоннокислого натрия в полимерных пробирках, практически не отличалась от результативности осеменения спермой производителей, оттаянной в растворе лимоннокислого натрня в стеклянных ампулах (табл. 1).

ТаблкМ 1

Влияние на оплодотворяемость осеменения коров-доноров спермой, оттаянной с применением лимоннокислого натрия и без него

Способ оттаивания семени Осеменено коров-доноров Оплодотворяемость

Число оплодотворенных яйцеклеток Доля по отношению к т&яечёиным зародышам, %

Без лимоннокислого натр!« в полимерных пробирках (ковый) 144 1008* 91,7

С лимоннокислым натрием в ампулах с цитратом натри» (известный) 132 858** 90,1

* В среднем на одного донора 7,0±0,1 (Р<0,01) В среднем на одного донора 6,51:0,1 (Р<0,01)

В исследованиях по определению сравнительной эффективности гипофизарных и сывороточных гоиадотропинов суперовуляцию вызывали 1:5Н-Р-Р^а по 4-х дневной схеме и ГСЖК-Р^а по 2-х дневной схеме, т.е. по схемам, которые называются классическими. В первой и второй частях опыта осеменение коров-доноров проводили спермой оттаянной с использованием и без использования раствора лимоннокислого натрия. Исследования показали, что эффективность ГСЖК несколько ниже относительно количественных показателей суперовуляторной реакции, вызываемой РЗН-Р (табл. 2).

Очевидно значительное влияние физиологического состояния коров-доноров на качество эмбриопродуктив ности. Количество эмбрионов, пригодных для консервирования было получено больше от здоровых коров со средней маточной продуктивностью, в то время как от высокопродуктивных коров эмбрионов отличного и хорошего качества было получено значительно меньше, что подтверждает отрицательное влияние как высокой продуктивности, так и отклонений в состоянии здоровья на жизнеспособность эмбрионов.

Таблица 2

Эффективность гонадотропинов и методов оттаивания спермы относительно оплодотворяемости и получения

пригодных для крноко не ервнро ванн я эмбрионов в зависимости от физиологического состояния коров-доноров

Показатели Тип гонадотропинов

ГЯН-Р гсжк

Характеристика коров-доноров

Здоровые Здоровые

Средняя Высокая Проблемные Средняя Высокая Проблемные

продуктив- продуктив- продуктив- продуктив-

ность ность ность ность

ЧАСТЬ I

Количество доноров, п 46 36 99 76 67 69

Опл одотв оряе мость, % 92,0 79,9 73,9 86,6 69,9 69,9

Эмбрионы отл. качества,% 49,1 9,7 8,9 47,7 6,1 6,6

Эмбрионы хор. качества,% _. 9,9 20,1 18,9 7,3 6,1 8,7

ЧАСТЬ 2

Количество доноров, п 94 26 62 38 67 40

Оплодотворяем ость, % 94,9 60 л 73,9 90,0 70,1 70,3

Эмбрионы отл.качества.% 49,1 7,9 10,8 50,0 16,9 6,6

Эмбрионы хор. качества,% 11,1 19,1 13,9 7,3 8,8 7,8

При извлечении эмбрионов от здоровых коров-доноров со средней продуктивностью более половины интактных эмбрионов находилось на стадиях поздней морулы и ранней бластоцисты (табл. 3). Па стадиях экспандированной бластоцисты и ранней морулы было до 32,1% эмбрионов. Доля отставших в развитии эмбрионов составила в целом 4,3%. Доля отставших в развитии эмбрионов от высокопродуктивных и проблемных коров составила до 13,7 и 14,2%, соответственно. Причём четко прослеживается тенденция отставания в скорости развития как для ранних и поздних морул, так и бластоцист.

Таблиц» 3

Процентное соотношение численности извлекаемых эмбрионов на разных стадиях развития*

Стадии развития эмбрионов Здоровые коровы-доноры Проблемные коровы-доноры**

Среднепродук-тиеные** Высокопродуктивные**

2-клеточные 0,6-1,0 3,9-5,3 4,0-7,6

4-клеточные 0,4-1,1 3,9-4,4 2,4-4,5

8-клеточные 0,4-1,0 1,9-2,5 1,9-2,0

16-клеточные 0,3-1,2 1,М>5 0,9-3,9

Ранняя морула 13,7-16,0 20,6-36,4 40,8-1,8

Поздняя морула 37,6-40,0 19,9-32,9 28,0-29,9

Ранняя бластоциста 19,1-22,7 9,Ы5,1 5,1-10,1

Эксп андирован ная бластоциста 12,1-16,1 0,9-1,1 0,8-1,0

* Все извлечения проведены на 7-ой день после первого осеменения.

Всего исследовано 9487 эмбрионов, в т.ч. 3733 от Средне продуктивных, 2825 и 2929 высокопродуктивных к проблемных коров, соответственно ** Колебания средних показателей выхода интактных. эмбрионов в различных опытах составляли 6,1±0,1—7,9*0,2; 5,3±0,3—7,6±0,1; 4,3*0,01—6,9*0,2 (Р<0,01) дая сред непродуктивных, высокопродуктивных и проблемных коров, соответственно.

Таким образом, характерная особенность эмбриогенеза у проблемных н здоровых высокопродуктивных коров заключается в снижении скорости развития эмбрионов.

3.2.Эффектнвность различных способов криоконсервировання эмбрионов

Одним из методов определения биологической полноценности эмбрионов является их культивирование. В исследованиях, используя фосфата о-солевой буфер Дюльбекко с добавлением 20% фетальной сыворотки, проводили культивирование эмбрионов для уточнения морфологической оценки качества. Культивировали эмбрионы, пригодные для криоконсервирования, полученные от здоровых и проблемных коров-доноров.

Как показал опыт (культивирование продолжалось 24 часа), наименьший процент продолжавших развитие эмбрионов во всех случаях был при культивировании ранних морул. По мере увеличения возраста эмбрионов, возрастала их жизнеспособность (табл.4).

Таблица 4

Оценка качества эмбрионов при культивировании

Стадия развития

Mot Mo II BII Bill Всего

Фюиологичес Я V 1 -e я х а :-X * : i s ; X л ч в. Б 41 а <» I s Ï I ■ * X « X if 4 в. X V • « s в X* к в X • К V \ 1 ® ш г а xï? ч с. X 41

кое состояние корос-доноро* ■ « к X Я Ê S-c ч к е я ч ■ й f а. я С е. " и. 5 = ■ ■ в я " 5 и — S Ï, Е я ■ Ч (Б X Я a в ^ & л С в, " 1. s * л в = 5 « F, С ï = 4 1e X Ч ш. s <Б. 4t С В. I * a в a X * ; t iS »» E i s 4 19 X Я ш « -> а. а 5 е. * * * л « х S« Ê ï = с; N * X ч в Ö гч Z- a Е a

Здоровые, со средней мо- 50 47- 86 83- 47 46- 52 52- 235 228-

лочной про- 94,0 96,5 97,S 100, 97,0

дуктивностью 0

Здоровые, высоко продув 68 34-S0,0 25 1768,0 47 3370,2 30 25-83)3 170 10964,0

тивные

Проблемные so 4050 80 5568,8 64 4570,3 51 4282,3 275 18266,1

Следует обратить внимание на важное обстоятельство—если морфологическая оценка жизнеспособности эмбрионов, полученных от здоровых коров со средней молочной продуктивностью практически совпадала с оценкой жизнеспособности методом культивирования, то этого нельзя сказать относительно морфологической оценки эмбрионов, полученных от коров с высокой молочной продуктивностью (5000 кг молока за лактацию и выше) как здоровых, так и проблемных. Лишь от 64,0 до 66,1% эмбрионов от таких коров с оценкой по морфологическим признакам как отличные и хорошие продолжили своё развитие in vitro, т.е. оказались жизнеспособными.

Таким образом, отмеченное для эмбрионов, получаемых от высокопродуктивных коров-допоров, характерное отставание в развитии

Таблица 5

Эффективность различных технологических элементов криоконсервнровання эмбрионов с учётом __физиологического состояния коров-доноров _

Показатели Криопротекторы Охлаждение Начало охлаждения Заморами ваниев газообраз-пом азоте Заморажиеатели и скорость охлаждения

Глицерин Этилен-гликоль (метод витрифи нации) УскО' ренное-до -3?С Удлинённое-до-38?С от +20РС от - Медленное охлаждение Ускоренное охлаждение

1.0 м 1,4 М УОЛ-1 Р-204 УОП-1 Р-204

Я & 1 1 1 1> 3 ее 1 и 5 1 Р Е 11 и Й Заморожено эмбрионов, п 200 200 299 210 210 125 125 315 100 100 100 100

Пригодные к пересадке, п 190 187 288 169 180 114 107 257 85 86 79 80

Процент от числа замороженных 95,0 93,5 96,7 80,4 85,7 91,5 85,6 81,6 85,0 86,0 79,0 80,0

Высокая продуктивность Заморожено эмбрионов, п 78 91 37 28 30 71 47 30 25 25 25 25

Пригодные к пересадке, п 62 49 27 14 23 53 21 15 18 18 И 11

Процент от числа замороженных 53,8 79,4 52,9 50,0 76,7 74,6 44,7 50,0 72,0 72,0 44,0 44,0

Проблемные коровы-доноры Заморожено эмбрионов, п 400 390 290 220 390 260 200 400 ■ 216 330 190 210

Пригодные к пересадке, и 300 175 201 95 280 187 80 160 155 231 76 91

Процент от числа замороженные 44,9 75,0 40,3 43,2 71,8 71,9 40,0 40,0 71,8 70,0 40,0 43,3

обусловливает обстоятельство, что в более чем 1/3 случаев положительная оценка по морфологическим признакам не гарантирует способности эмбрионов к дальнейшему развитию, лаже ссли эмбрионы оценены по морфологическим признакам как отличные.

Аналогичная зависимость была зафиксирована нами в исследованиях жизнеспособности эмбрионов оттаянных после замораживания.

Испытание эффективности различных технологических режимов криоконсервированкя эмбрионов с учётом физиологического состояния коров-доноров показало, что повышенная функциональная активность организма, обусловленная продуктивностью определяет снижение устойчивости ультраструктур эмбрионов к жестким условиям, которым они могут быть подвержены при определённых условиях замораживания (табл.5).

Если эмбрионы от доноров со средней продуктивностью демонстрируют практически одинаковую устойчивость при всех применяемых технологических режимах, определяя их приемлемую и равную эффективность, что имеет большое практическое значение для упрощенных методов криоконссрвирования, то относительно эмбрионов от высокопродуктивных как здоровых, так и проблемных коров картина совершенно другая. Жёсткие режимы здесь не приемлемы, т.к. они ведут к потере от 10 до 30% эмбрионов. В этом случае высокую эффективность определяет традиционная технология, обеспечивающая щадящие режимы,

3.3. Оценка жизнеспособности эмбрионов после оттаивания

Нами проанализировано распределение эмбрионов по стадиям развития и качеству до замораживания и после оттаивания (табл.6).

Таблиц* 6

Качество эмбрионов до замораживания н после оттаивания (традиционный

метод замораживания)

Стадия развития Исследовано эмбрионов (всего) В т.ч. с оценкой эмбрионов В балл»!

5 4

До 'замораживания (п-%):

Морулы поздние т 37-19,4 153-80,5 -

Бласто цисты:

ранние 200 24-12,0 176-88,0 - •

поздние 198 11,5-58,1 83-46,9 - -

После оттаивания (п-%):

Морулы поздние 190 2-1.[ 70-36,8 80-42,1 38-20,0

Бласто цисты:

ранние 200 25-12,3 120-60,0 30-15,0 25-12,5

поэднне 198 17-8.5 112-56,6 40-20,2 29-14,6

После оттаивания уменьшается число эмбрионов отличного и хорошего качества и увеличивался процент эмбрионов удовлетворительного качества и непригодных для переездки. Картина общая для всех стадий развития. Однако в этой обшей картине наибольшая сохранность качества более свойственна для бластоцист, что подтверждает известный факт о высокой эффективности криоконсервирования ранних бластоцист отличного и хорошего качества.

Приведённые данные свидетельствуют о том, что для трансплантации и криоконсервирования эмбрионов лучше использовать ранние и поздние бластоцисты. Такие различия в качестве эмбрионов, возможно, связаны с влиянием маточной среды, которая контролирует и обеспечивает естественный отбор эмбрионов по их жизнеспособности в конкретных условиях.

3.4. Жизнеспособность оттаянных эмбрионов после трансплантации

Уровень приживляемости оттаянных эмбрионов зависит от их качества перед пересадкой. При пересадке эмбрионов отличного и хорошего качества, создании оптимальных условий работы с эмбрионами и хорошей подготовкой реципиентов можно получить высокую прнживляемость оттаянных эмбрионов. Пересадка эмбрионов удовлетворительного качества сопровождается низкой их приживляемостью (табл.7). В то же время, стадия развития эмбрионов не является критическим фактором при соответствии возраста эмбриона и астрального цикла реципиента. Несоблюдение этого требования сопровождается высоким процентом (до 80%) гибели эмбрионов в матке реципиента.

Таблица 7

Влияние качества замороженных, а затем оттаянных эмбрионов перед пересадкой на их прнжи вляемость

Показатель Качество эмб тонов

отличное хорошее удовлетворительное

Количество пересаженных эмбрионов 28 390 252

Количество реципиентов 28 389 250

Количество стельных реципиентов 21 185 69

Процент стельности 75.1 47,6 27,6

Таблица 8

Прнжнвляемость свежеполученных и оттаянных после замораживания

эмбрионов

Показатель Эмбрионы (п-%)

Сеежепвлучешые Оттаянные после -заморажтания

Морфологическая оценка жи) и (способности Опенка жизнеспособности методом культивирования Морфологическая оценка жизнеспособности Оценка жизнеспособности методом культивировании

Процент эмбриональной смертности эмбрнснюг, полученных от доноров с разным уровнем продуктивности

здоровые коровы: средняя продуктивность высокая продуктивность

39,0 38,9 42,6 44,1

55,1 59,8 64,1 52,3

проблемные коровы 56,8 62,7 64,9 52,3

Анализом приживляемости свежеполученных и оттаянных эмбрионов после замораживания был подтверждён известный факт о том, что прнживляемость свежеполученных эмбрионов выше (табл. 8). Но следует обратить внимание, во-первых, па более контрастную разницу показателей относится ьн о среднепродукгивных и высокопродуктивных и выбракованных коров, во-вторых, на то, что морфологическая оценка не всегда оценивает реальную жизнеспособность, что в значительной мере возрастает для эмбрионов высокопродуктивных и проблемных коров. Данное обстоятельство рекомендует качество подобных эмбрионов подтверждать методом культивирования.

В данной части исследований мы изучали возможность повышения результативности пересадок оттаянных эмбрионов путём обеспечения гестаренной поддержки эмбриогенеза введением прогестерона, сурфагоиа или ХГЧ. В этом отношении наиболее эффективными оказались прогестерон и сурфагон (табл. 9).

Таблица 9

Снижение эмбриональной смертности

Препарат Процент стельности от Переса полученных от dono док эмбрионов, рое

средняя продуктивность высокая продуктивность проблемные

Контроль 50,9 33,3 35,3

Прогестерон (1%-10,0) 62,1 42Д 41,1

Сурфагон (5,0 мл) 56,6 43,3 43,3

ХГЧ (1000ИЕ) 51,1 33,9 35,6

В первом случае положительный эффект обусловлен пролонгированным сохранением оптимальной концентрации прогестерона в крови реципиентов, во втором—благодаря потенцированию функциональной активности жёлтого тела.

Выводы:

1. Качественные характеристики эмбрионов определяет в первую очередь -физиологический статус коров-доноров, а во вторую - методы стимулирования суперовуляции и криоконсервирования.

2. Особенностью эмбрионов, получаемых от проблемных и высокопродуктивных коров-доноров, является отставание в развитии, что определяет снижение их жизнеспособности под влиянием контрастных изменений физико-химических параметров окружающей среды.

3. Приемлемую жизнеспособность эмбрионов от высокопродуктивных и проблемных коров-доноров после оттаивания обеспечивает традиционная технология криоконсервировання: многоступенчатое насыщение 1,4 М концентрации глицерином, начало охлаждения от +20°С до —38ЙС, соответствующая проводка при оттаивании с добавлением к криопротектору сахарозы.

4. Для криоконсервировання эмбрионов от высокопродуктивных коров-доноров следует использовать ранние бластоцисты отличного и хорошего качества.

5. Морфологическую оценку эмбрионов, получаемых от высокопродуктивных коров до- и после замораживания и оттаивания необходимо подтверждать методом культивирования.

6. Для снижения эмбриональной смертности после пересадок с равной долей успеха можно применять инъекции прогестерона и сурфагона.

Практические предложения:

1,Для обеспечения приемлемой жизнеспособности эмбрионов от высокой родукти вных и проблемных коров-доноров после оттаивания рекомендуется использование традиционной технологии криоконсервировакия: многоступенчатое насыщение 1,4 М концентрации глицерином, начато охлаждения от +20°С до -38аС, соответствующая проводка при оттаивании с включением сахарозы.

2.С целью повышения эффективности пересадок морфологическую оценку эмбрионов после замораживания и оттаивания в сомнительных случаях необходимо подтверждать методом культивирования. Для снижения эмбриональной смертности после пересадок рекомендуем использовать гестагеиную поддержку путём инъекций прогестерона или сурфагона в общепринятых дозах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

I .Асланов А.Ф. Получение и криоконсервация эмбрионов крупного рогатого скота/ О мерах по повышению эффективности и улучшению организации более широкого использования биотехнологии в племенном животноводстве: Материалы II республиканской научно-производственной конференции.-Львов.-1988.-С.2.

2.Ссргеен H.H., Асланов А.Ф.» Плаксссв A.A. Практические результаты криоконсервирования и пересадки замороженнекптаянных эмбрионов/ Трансплантация эмбрионов в молочном скотоводстве и овцеводстве. Бюллетень научных работ.- ВИЖ,.- Дубровицы.-1985,- Выпуск 77.-С.51-52.

3. A.c. №1739987 СССР, А61 В 19/02,1990. Способ оттаивания замороженных в гранулах биологических объектов и устройство для его осуществления/ В.Ф. Турбин, В.И, Титов, В.Г. Ших, А.Ф. Асланов, П.А. Миллер. Приоритет 10.03.95.

4. Зейналов O.A., БалковоЙ И.И., Асланов А.Ф. Нормализация репродуктивной активности проблемных коров /Мат. 5-й Международной науч.-практ. конф. по квантовой терапии. М. 2002. -C.I10-111.

Издательство РУЦЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, п. Дубровины Тел. (К - 27) 65-14-24, (8 - 27) 65-14-07

Сдано в набор 23.04.2003. Подписано в печать 24.04.2003 _Заказ №11. Печ.л. 1,0. Тираж 120 экз._

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Асланов, Антон Филиппович

ВВЕДЕНИЕ

1. Обзор литературы

1.1. Морфологическая и функциональная характеристика эмбрионов

1.1.1. Морфологические особенности эмбрионов, извлекаемых от проблемных коров-доноров

1.1.2. Влияние различных факторов процесса фолликулогенеза, созревания яйцеклеток, оплодотворения и раннего эмбриогенеза на жизнеспособность эмбрионов

1.1.3. Эмбриональная смертность

1.2. Технология криоконсервирования эмбрионов крупного рогатого скота

1.2.1. Физико-химические принципы криоконсервирования и процесса оттаивания эмбрионов

1.2.2. Криопротекторы

1.2.3. Подготовка эмбрионов к замораживанию

1.2.3.1. Оценка жизнеспособности эмбрионов

1.2.3.2. Кратковременное хранение эмбрионов

1.2.4. Криотехника

1.2.5. Режимы замораживания и оттаивания эмбрионов

1.2.6. Оценка жизнеспособности эмбрионов после криоконсервирования

1.2.6.1. Культивирование эмбрионов

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методика

2.2. Результаты собственных исследований

2.2.1. Сравнительная характеристика эмбрионов, получаемых от здоровых и проблемных коров-доноров с разным уровнем молочной продуктивности

2.2.2. Эффективность различных способов криоконсервирования эмбрионов

2.2.2.1. Жизнеспособность эмбрионов при криоконсервировании в зависимости от продолжительности промежуточного хранения, типа и концентрации криопротектора

2.2.2.2. Влияние различных режимов замораживания на качество эмбрионов

2.2.2.3. Эффективность технологических элементов криоконсервирования эмбрионов, полученных от коров с различным физиологическим статусом

2.2.3. Оценка жизнеспособности эмбрионов после оттаивания

2.2.4. Жизнеспособность оттаянных эмбрионов после трансплантации и пути её повышения

3.Обсуждение

Выводы

Практические предложения

Введение Диссертация по биологии, на тему "Жизнеспособность эмбрионов крупного рогатого скота после криоконсервирования, оттаивания и пересадки"

Актуальной проблемой современного животноводства является увеличение производства молока и мяса как наиболее полноценных продуктов питания. В то же время молочное скотоводство характеризуют как сокращением общего поголовья, так и негативными структурными изменениями, которые не только снижают возможности увеличения производства молока, но и сохранения его на прежнем уровне. Поэтому отечественная экономика диктует необходимость интенсификации селекционной работы с целью ускоренного создания пород, линий, семейств животных для формирования оптимальной структуры совокупного стада крупного рогатого скота, отвечающей потребностям постоянно меняющейся конъюнктуры рынка. В этих условиях придают большое значение мероприятиям по организации процесса воспроизводства поголовья на основе биотехнических методов, позволяющих реально планировать биологические процессы с учётом организационных, технических, морально-экономических и других обстоятельств (47, 22). Без продолжения исследований в области технологии эмбриотрансплантации, которая дополняет метод искусственного осеменения и одновременной реализации достижений в практике селекционной работы решить проблему не представляется возможным (49, 50,12).

Эта точка зрения нашла отражение в концепции развития животноводства страны до 2010 года, одобренной коллегией Минсельхоза РФ в 2001 г. (56).

Наибольшие успехи в области создания оптимальной структуры стада высокопродуктивного молочного скота достигнуты в США и Канаде и лидерство они удерживают в этой области благодаря внедрению в производство метода трансплантации эмбрионов. В странах Европы и Северной Америки около 70% быков-производителей, используемых для искусственного осеменения, получены методом трансплантации эмбрионов, и доля их продолжает увеличиваться. Из 50-ти лучших быков чёрно-пёстрой породы в США, 64% получены методом трансплантации. Аналогичная картина характерна для Германии и ряда других стран (50,12).

Низкотемпературное консервирование эмбрионов сельскохозяйственных животных является важнейшим элементом технологии трансплантации эмбрионов и имеет большое практическое значение, так как позволяет обходиться без содержания большого стада потенциальных реципиентов, необходимых для пересадок свежеполученных эмбрионов, значительно упрощает экспорт и импорт эмбрионов (10).

Использование криоконсервирования даёт возможность сохранять эмбрионы от выдающихся животных, а также накапливать генофонд локальных, исчезающих пород. В исторической перспективе это может быть использовано для восстановления некоторых качеств, неизбежно теряющихся породами в процессе интенсивной селекции. Кроме того, применение данного элемента технологии позволяет решать вопросы акклиматизации пород и получения гибридов для создания адаптированных популяций в регионах с экстремальными климатическими условиями (43).

Исследования по экспериментальной эмбриологии млекопитающих вызывают не только практический, но и научный интерес (18). Репродуктивная физиология и патофизиология являются фундаментальным разделом современной биологии. В этом смысле исследования, проводимые по совершенствованию новейших биотехнических методов управления воспроизводительной функцией, относящихся к методу трансплантации эмбрионов, представляют уникальную возможность познания закономерностей сложнейших биологических процессов. Без дальнейшего углубления исследований в области технологических элементов эмбриотрансплантации не возможна реализация в практике скотоводства результатов таких перспективных направлений как клонирование, получение тотипотентных эмбриональных стволовых клеток с генными конструкциями для создания множественных линий с генетическим разнообразием, получение трансгенных животных, элиминации нежелательных генов, решения проблем эмбриональной смертности и др.

В этих условиях современные исследования в области технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота приобретают ещё большую актуальность и значимость.

Однако, несмотря на достаточно высокий уровень разработанности технологии трансплантации эмбрионов в целом, многие её элементы требуют дальнейшего совершенствования. Определённые издержки не преодолены в таком элементе, как криоконсервирование и долгосрочное хранение эмбрионов. Приживляемость эмбрионов, оттаянных и трансплантированных после криоконсервирования снижается на 25-50% по сравнению с результатами пересадок свежеполученных эмбрионов. Снижение результативности является следствием многократных температурных перепадов, сопровождающих процесс подготовки зародышей к замораживанию и последующему оттаиванию и других выясненных и невыясненных факторов. Производство нуждается в менее трудоёмких способах. Необходим поиск новых криопротекторов и питательных сред (52).

Целью работы явились исследования жизнеспособности эмбрионов крупного рогатого скота после криоконсервирования, оттаивания и пересадки.

Для этого были определены следующие задачи:

- в сравнительном аспекте определить характерные особенности эмбрионов, получаемых от здоровых и проблемных коров-доноров;

- определить эффективность различных способов криоконсервирования эмбрионов, полученных от коров-доноров с различными уровнями продуктивности;

- испытать оценку жизнеспособности эмбрионов после оттаивания по морфологическим признакам и методом культивирования;

- исследовать жизнеспособность оттаянных эмбрионов после пересадки;

- на основе анализа полученных данных сформулировать выводы и дать предложения для практики.

Научная новизна работы заключается в том, что дана дифференциальная характеристика эмбрионов, получаемых от здоровых коров-доноров с продуктивностью до 5000 кг молока и свыше 5000 кг молока за лактацию и проблемных коров-доноров. Данный аспект определяет степень эффективности различных методов криоконсервирования эмбрионов, а также способов оттаивания и оценку жизнеспособности эмбрионов после оттаивания. Определены факторы, влияющие на течение эмбриогенеза после пересадки и пути снижения эмбриональной смертности. Приоритет исследований подтверждён А.С. №1739987 СССР, А61 В 19/02, 1990 (Патент №2078549. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений 10 мая 1997 г.).

Практическая значимость. Рекомендуемые методы криоконсервирования эмбрионов и определение их качества после оттаивания, получаемых от высокопродуктивных здоровых и выбракованных коров, гарантируют повышение жизнеспособности эмбрионов, пригодных для трансплантации. Найдены пути снижения эмбриональной смертности. Данные факторы обеспечивают повышение эффективности технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в целом, что, в свою очередь, позволяет существенно повысить эффективность реализации селекционно-генетического потенциала высокопродуктивных коров.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и одобрены на международных, союзных, республиканских и зональных конференциях (Москва, Львов, Харьков, Киров, Санкт-Петербург, Боровск, Брест, Минск, 1989-2002 гг.). Научно-теоретические положения и практические рекомендации сформулированные в диссертации используются в учебном процессе НГСХА. Результаты научных исследований опубликованы в 4 печатных работах.

Объем и структура.

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, 1 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и практических предложений.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Асланов, Антон Филиппович

Выводы:

1 .Качественные характеристики эмбрионов определяет в первую очередь—физиологический статус коров-доноров, а во вторую—методы стимулирования суперовуляции и криоконсервирования.

2.Особенностью эмбрионов, получаемых от проблемных и высокопродуктивных коров-доноров, является отставание в развитии, что определяет снижение их жизнеспособности под влиянием контрастных изменений физико-химических параметров окружающей среды.

3.Приемлемую жизнеспособность эмбрионов от высокопродуктивных и проблемных коров-доноров после оттаивания обеспечивает традиционная технология криоконсервирования: многоступенчатое насыщение 1,4 М концентрации глицерином, начало охлаждения от +20°С до -38°С, соответствующая проводка при оттаивании с добавлением к криопротектору сахарозы.

4.Для криоконсервирования эмбрионов от высокопродуктивных коров-доноров следует использовать ранние бластоцисты отличного и хорошего качества.

5.Морфологическую оценку эмбрионов, получаемых от высокопродуктивных коров до- и после замораживания и оттаивания необходимо подтверждать методом культивирования;

6.Для снижения эмбриональной смертности после пересадок с равной долей успеха можно применять инъекции прогестерона и сурфагона.

Практические предложения:

1 .Для обеспечения приемлемой жизнеспособности эмбрионов от высокопродуктивных и проблемных коров-доноров после оттаивания рекомендуется использование традиционной технологии криоконсервирования: многоступенчатое насыщение 1,4 М концентрации глицерином, начало охлаждения от +20°С до -38°С, соответствующая проводка при оттаивании с включением сахарозы.

2.С целью повышения эффективности пересадок морфологическую оценку эмбрионов после замораживания и оттаивания в сомнительных случаях необходимо подтверждать методом культивирования. Для снижения эмбриональной смертности после пересадок рекомендуем использовать гестагенную поддержку путём инъекций прогестерона или сурфагона в общепринятых дозах.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Асланов, Антон Филиппович, п. Дубровицы

1. Белоус A.M., Шраго М.И., Пушкарь Н.С. Криоконсерванты.-Киев: Наукова думка, 1979.-198 с.

2. Белоус A.M., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении.-Киев: Наукова думка,1982.-255 с.

3. Белоус A.M., Грищенко В.И., Пращук Ю.С. Криоконсервация репродуктивных клеток. Киев: Наукова думка, 1986.-208 с.

4. Букарова В., Плаксеев А., Ефремова М. Глубокое замораживание эмбрионов крупного рогатого скота //Сб науч. тр. Т.44-Дубровицы,1983.-С.59-62.

5. Букарова В.И. Влияние качества эмбрионов до замораживания на жизнеспособность после оттаивания и приживляемость при нехирургической пересадке //Бюллетень научных работ ВИЖ.-Дубровицы, 1985.-Вып. 77.-С.48-50.

6. Букаров И.В. Оценка качества зародышей крупного рогатого скота в связи с трансплантацией // Матер. Рес. конф., Тарту. 1986.-С. 182184.

7. Воронцова П., Тарадайник Т., Дронин А. Опыт трансплантации эмбрионов //Молочное и мясное скотоводство.-1988.-№3.-С. 19-20.

8. ГОСТ 28424-90. Эмбрионы крупного рогатого скота. Технические условия.-М.:Издательство стандартов, 1990.-16 с.

9. Дахно Ф.В., Грошевой М.И., Спурников А.С., Тельнюк В.Н. Современная аппаратура для криоконсервации эмбрионов млекопитающих //Проблемы криобиологии.-Киев; Наукова думка, 1991.-№1.-С. 50-54.

10. Ельчанинов В.В., Сахно В.Ф., Баранов В.И. Синхронизация охоты у коров.-М. :ВНИИТЭИ, 1969.-80 с.

11. Завертяев Б.П. Повышение многоплодия в скотоводстве.-М.: Россельхозиздат, 1987.-190 с.

12. Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Н.И. Сергеев, B.JI. Мадисон, O.K. Смирнов. М.,1984.136с.

13. Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота/ Подг. ВИЖ, ВНПО по племделу, ВГНКИ ветпрепаратов, НИИЖЛ и П, Утверждены Госагропромом СССР 5.06.876 г.-М., 1987.-92 с.

14. Инструкция по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота. Росагропром СССР. ВАСХНИЛ, М., 1987. 96 с.

15. Каганская В.В, Свиридов Б.Е. Культивирование ооцитов коров с фолликулярными клетками //Проблемы развития биотехнологии в животноводстве. Тезисы докладов, Дубровицы, 1990-С. 14.

16. Кауффольд П., Тамм И., Шихов И .Я. и др. Оценка качества эмбрионов крупного рогатого скота.- М.: Агропромиздат. 1990.-56 с.

17. Кривохарченко А.С., Вильякович Л.И. Хранение яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих при положительных и околонулевых температурах //Онтогенез.-1995.-Т.26.-№1.-С.38-45.

18. Кузьмина Г.И., Завертяев В.П., Джаббур З.И. Сезонные изменения оплодотворяемости ооцитов коров при их культивировании вне организма //Бюл. ВНИИ по разведен, и генет. с.-х. животных.-1989.-№115.-С.25-26.

19. Курилов Н.Н. Достижения в области физиологии и биохимии пищеварения жвачных//Физиолого-биохимические основы высокойпродуктивности сельскохозяйственных животных. -Ленинград: Наука. 1983.-С.25-34.

20. Лебедев В.И., Сергеев Н.И., Гапеев Д.В. Синхронизация охоты и стимуляция полиовуляции у коров-доноров и телок-реципиентов // Зоотехния. -2001. -№4. -С.28-30.

21. Левантин Д. Структурные изменения по использованию пород в скотоводстве // Молочное и мясное скотоводство. -2001. -№1. -С.2-6.

22. Мадисон В.В., Мадисон В.Л. Трансплантация эмбрионов в практике разведения молочного скота. -М.: ВО Агропромиздат. 1988. -128с.

23. Мадисон В.Л. Результаты исследований по трансплантации эмбрионов и внедрение метода в практику воспроизводства высокопродуктивного молочного скота: Бюл. науч. работ ВИЖ. -Дубровицы, 1991. -вып. 104.-С.7-9.

24. Малиновская В.А. Физико-химические аспекты криоконсервации эмбрионов крупного рогатого скота //Сельскохозяйственная биология.-1991 .-№2.-С.З-15.

25. Малиновский A.M. Влияние на приживляемость эмбрионов времени от извлечения до замораживания и пути его сокращения. //Сб. трудов ВНИИплем «Биология воспроизведения и биотехнологические методы разведения».-М., 1992.-С.43-46.

26. Мальцева М.В. Криоконсервирование эмбрионов в паеттах с применением сахарозы//Животноводство. 1989.-№7.-С. 41.

27. Меркурьева Е.К. Шангин-Березовский. Генетика с основами биометрии. Учебное пособие.-М.:Колос,-1983.-400 с.

28. Методические рекомендации по повышению полноценности кормления высокопродуктивных коров.-Ленинград: 1980.-С.34-37.

29. Методические рекомендации по оценке качества эмбрионов крупного рогатого скота при трансплантации.-Дубровицы, 1984.-32 с.

30. Методические указания по использованию французской технологии трансплантации эмбрионов.-М., 1986.-32 с.

31. Методические рекомендации по криоконсервированию эмбрионов крупного рогатого скота, овец и кроликов.-Дубровицы,-1987.-24 с.

32. Методические рекомендации по использованию технологии трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота в племенных хозяйствах: Одобрены Уч. Советом ВНИИплем. 15.11.88.г., протокол №7.-М., 1988.-36 с.

33. Милованов В.К. Об основных направлениях исследований по биологии воспроизведения и искусственному осеменению сельскохозяйственных животных //Животноводство. 1966.-№2.-С.20-26.

34. Муртазин Б., Пулатов Г. Эмбриональная смертность у крупного рогатого скота //Ветеринария.-1984.-№8.-С. 43-45.

35. Нетеча В.И., Ефремова М.Н., Букарова В.И. Прижизненная окраска витальными красителями эмбрионов животных для быстрой оценки их жизнеспособности / Бюллетень научных работ ВИЖ.-Дубровицы, 1985.-вып. 11.-С. 31-33.

36. Песоцкий В.В. Быстрое охлаждение до 0°С для долгосрочного хранения эмбрионов //Состояние и перспективы развития биотехнол. в животноводстве: Тезисы докл. 21-22 сентября 1988 г.Харьков, 1988.-С. 34-35.

37. Петров Г.Е. Критические стадии в развитии зародышей у коров // Зоотехния.-1997.-№7.-С. 17-18.

38. Плаксеев А.А. Оборудование и техника криоконсервирования эмбрионов сельскохозяйственных животных / Бюллетень научных работ ВИЖ.-Дубровицы, 1985.-вып. 77.-С.43-47.

39. Протасов Б.И., Землякова Н.А., Николаева М.М., Руткис З.А. Хранение эмбрионов сельскохозяйственных животных в связи с трансплантацией //Криоконсервирование гамет и эмбрионов с.-х. животных.-Л., 1983.-С.61-72.

40. Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус A.M., Калугин Ю.В. Криопротекторы. Киев: Наукова думка, 1978.-204 с.

41. Руткис З.А., Левченко Э.Н., Протасов В.И. Экспонирование в разных криопротекторах, замораживание, культивирование и витальное окрашивание зародышей и бластомеров //Сельскохозяйственная биология.-1985.-№3.-С. 101-105.

42. Сальникова И.М., Мадисон В.Л. Качество эмбрионов от коров разного возраста и продуктивности и результаты их пересадки /Бюллетень нач. работ ВИЖ.-Дубровицы, 1985.-вып.77.-с. 29-30.

43. Самоделкин А.Г., Гавриков A.M., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов в мясном скотоводстве. М.:АОЗТ «Зоосалон», 1996.-96 с.

44. Сергеев Н.И., Шихов И.Я. Вестник с.-х. науки.-1980.-№7.-С.105-109.

45. Сергеев Н.И., Смирнов O.K., Шихов И.Я.Использование метода трансплантации эмбрионов для ускорения селекции крупного рогатого скота //Генетические исследования в селекции животных: Бюлл. научн. работ.-Дубровицы, 1982.-Вып.65.-С.24-27.

46. Сергеев Н.И. Применение трансплантации эмбрионов в программах разведения и селекции крупного рогатого скота // Применение метода трансплантации эмбрионов в селекции сельскохозяйственных животных: Бюлл. научн. работ.-Дубровицы, 1988.-Вып.89.-С.3-6.

47. Сергеев Н.И. Биотехнологические приемы в технологии трансплантации эмбрионов // Бюл. науч. работ ВИЖ. -Дубровицы, 1991.-Вып. 104. -С.З.

48. Смирнов O.K., Сергеев Н.И. Состояние и перспективы иследований по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота / Бюл. науч. работ ВИЖ. -Дубровицы, 1985. -Вып.77. -С.3-6.

49. Смыслова Н.И. Влияние возраста скота, сезона года на уровень суперовуляции и качество эмбрионов/ Бюл. науч. работ ВИЖ. -Дубровицы, 1985. -Вып.77. -С. 13-15.

50. Соколовская И.И. Проблемы оплодотворения с.-х. животных. -М.: Советская наука, 1957. -С.220-229.

51. Соколовская И.И. Иммунная система—регулятор воспроизведения // Зоотехния,-1994.-№ 1 .-С.24-26.

52. Стрекозов Н.И., Комаров Л.Л. Развитие рынка молока и молочных продуктов в России // Зоотехния. -2001. -№2. -С.2-5.

53. Тельцов J1.П. Критические фазы развития крупного рогатого скота в эмбриогенезе // Сельскохозяйственная биология. -1999. -№2. -С.71-76.

54. Федосова Н.Х., Былицкий Н.М., Левушев В.И., Шаурко Т.А., Алынальди Л.С. Культивирование эмбрионов перед трансплантацией// Генетич. инженерия и биотехнол.: Тез. докл. научн. конф. Минск, 29-30 марта 1994,-Минск, 1994.-С.65.

55. Харламов Е.Ю., Чомаев A.M., Сануси М. Роль биологически активных препаратов в снижении пренатальных потерь у коров //Тез. докл. / ВНИИБиП с.-х. животных. -Боровск, 2000. -С.363-364.

56. Чомаев A.M., Клинский Ю.Д., Харламов Ю.Е. Влияние лютеостабила на эмбриональную смертность у коров//Тез. докл. ВГНИИЖ.-Дубровицы, 1997. -С.47-48.

57. Шеховцов С.Ю. Использование коров-доноров в опытном хозяйстве «Украина»/ Трансплантация эмбрионов с.-х. животных: Сб науч. трудов/ГСГЦ.-М., 1988.-С.41.

58. Эрнст Л.К., Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельскохозяйственных животных.-М.:ВО «Агропромиздат», 1989.304 с.

59. Abecia J., Rhind S., Goddard P. Jugular and ovarian venous profiles of progesterone and associated endometrial progesterone concentrations in pregnant and non-pregnant ewes // Animal Science. 1996. - V. 63. - P. 229-234.

60. Abecia J., Lozano J., Forcada F. Effect of level of dietary energy and protein on embryo survival and progesterone production on day eight of pregnancy in Rasa Aragonesa ewes // Animal Reproduction Science. -1997.-V. 48.-P. 209-218.

61. Aylon N. A rewiev of embryonic mortality in cattle// J. Reprod. Fertil.-1978.-V.54.-P.483-497.

62. Biggers В., Geisert R., Wetterman R. et. al. Effect of heat stress on early embryonic development in the beef cow // J. Anim. Sci.-1987.-V.64.-№5.-P.1512-1518.

63. Blanchard Т., Ferguson J., Love L., Takeda T. Et al. Effect of dietary crude-protein type on fertilization and embryio quality in dairy // Americal Journal of Veterinary Research.-1998.-V.51.-P.905-908.

64. Britt J. Influence of nutrition and weight loss on reproduction and early embryonic death in cattle // Proc. XVII World Buiatrics Congr.- 1992.-V.2.-P. 143-149.

65. Butler W., Smith R. Interelationships between energy balance and postpartum reproductive function in dairy cows // J. Dairy Sci.- 1989.-V.72.-P. 767-783.

66. Butler W. Review: Effect of protein nutrition on ovarian and uterine physiology in dairy cattle // Dairy Sci.- 1998,- V.81.-P. 2533-2539.

67. Butler W. Nutritional interactions with reproductive performance in dairy cattle // Animal Reproduction Science.-2000.-V.60-61.- P.449-457.

68. Caput P., Posavi M., Kaps M. Parametri produosti stada robuih proizvodaca mlijekaf// Stocurstvo.1989.-V.43. №l/2.-P.3-8.

69. Creed J., Me Evoy Т., Robinson J. The effect of preovulatory nutrition on the subsequent development of superovulated sheep ova in and in vitro culture system // Animal Production.-1994- V.58 . P. 137 .

70. Darwash A., Lamming G., Wooliams J. The potential for identifying heritable endocrine parameters associated with fertility in post-partum dairy cows.// Anim. Sci.- 1999.- V. 68.-P. 317-333.

71. Dunne L., Diskin M., Boland M. Nutrition and early embryo survival in cattle // Irish Journal of Agricultural and Food Research.-1997.- V. 36.-N95.-P.363.

72. Einer-Jensen N., McCracken J. The transfer of progesterone in the ovarian vascular pedicle of the sheep.// Endocrinology.- 1981.- V. 109.-P. 685-690.

73. Evolucion de la mortalidad embrionaria en vacas repitidorus de celos, a traves de su produccion embrionaria/ J. Fuentem, A. Monge, M. Cjcero, C. Barragan // Juvest. Agr. Prod, у Sanid. anim.-1988.-V.3.-№2-3.-P.183-193.

74. Furnus C., deMatos D., Martinez A. Glucose and embryo quality // Proceedings of Techniques for gamete manipulation and storage, June 22-23, 1996. Hamilton, New Zealand. 20 Abst.

75. Gath V., Fahey J., Snijders S. Effect of plasma urea concentration at the time of insemination or embryo transfer on subsequent pregnancy in cattle/ Proceedings of Fertility in the High-Producing Dairy Cow // Animal Science. -1990.-V.3-№3.-P.193-213.

76. Gath V., Lonergan P., Boland M. Effects of diet tyupe on establishment of pregnancy and embryo development in beef heifers // Theriogenology.-1999.- Y.51.-P. 224.

77. Gustafsson H. Characteristics of embryos from repeat breeder and Virgin heifers // Theriogenology.-1985.-№3-P.487-489.

78. Hasler J. Current status and potential of embryo transfer and reproduction technology in dairy cattle// J. Dairy Sci.-1992.-V.75.-P.2857-2879.

79. Jordan E., Swanson L. Serum progesterone and luteinizing hormone in dairy cattle fed varying levels of crude protein // Journal of Animal Science.- 1979,- V. 48,- P. 1154-1158.

80. Jordan E., Swanson L. Effect of crude protein on reproductive efficiency, serum total protein and albumin in the high-producing dairy cow // Journal of Dairy Science.- 1979.- V. 62.- P. 58-63.

81. Larson S., Butler W., Currie W. Reduced fertility associated with low progesterone postbreeding and increased milk urea nitrogen in lactating cows // Journal of Dairy Science.- 1997.- V. 80.- P. 1288-1295.

82. Linares T. Embryonic development in repeat breeder and virgin heifers seven days after insemination // Anim. Reprod. Sci.-1982.-V.4.-№3.-P.189-198.

83. Lozano J., Abecia J., Forcada F. Effect of undernutrition on the distribution of progesterone in the uterus of ewes during the luteal phase of the estrous cycle // Theriogenology.- 1998,- V.49.- P.539-546.

84. Mann G., Mann S., Lamming G. The inter-relatiotionship between maternal hormone environment and the embryo during early stages of pregnancy in the cow//J. Reprod. Fertl.- 1996.- V.17.- P. 21.

85. Mann G., Lamming G., Fisher P. Progesterone control of embryonic interferon tau production during early pregnancy in the cow // J. Reprod. Fertil.- 1998.- V. 21.- P. 37.

86. Mazur P., Zeibo S., Chu E. A two factors hipothesis of freezing injury (Evidence from Chinese Hamster tissue-cultural cells) // Exper. Cell. Res.-1972.-№71.-P.345-355.

87. McCann J., Hansel W. Relationship between insulin and glucose metabolism and pituitary-ovarian functions in fasted heifers // Biology of Reproduction.- 1986.-V.34.-P. 630-641.

88. McEvoy Т., Sinclair K., Staines M. In-vitro blastocyst production in relation to energy and protein intake prior to oocyte collection // Journal of Reproduction and Fertility Abstract Series.- 1997.- V. 19.- P. 51.

89. McEvoy Т., Robinson J., Aitken R. Et al. Dietary excesses of urea influence the viability and metabolism of preimplantation sheep embryos and may affect fetal growth among survivors // Animal Reproduction Science.- 1997.- V. 47.- P. 71-90.

90. Monty D., Racowsky G. In vitro evaluation of furly embryo viasiliti and development in summer heat-stressed, superovulated dairy cows //Theriogenology.-1987.-V.28.-№4.-P451-465.

91. Nolan R., Duffy P., Wade M. Et al. Effect of quantity and type of diet and frequency of trans-vaginal ovum aspiration on in vitro embryo development if heifers // Theriogenology.- 1998.- V.49.- N 1.- P. 402.

92. Nolan R., O'Callaghan D., Duby R. Et al. The influence of short-term nutrient changes on follicle growth and embryo production following superovulation in beef heifers // Theriogenology.- 1998.- V. 50.- P. 12631274.

93. Parr R., Davis I., Fairclough R. et al. Overfeeding during early pregnancy reduces peripheral progesterone concentration and pregnancy rate in sheep // J. Reprod. Fertil.- 1987.- V. 80.- P. 317- 320.

94. Parr R., Davis I., Miles M. Liver blood flow and metaboloc clearance rate of progesterone in sheep // Research in Veterinary Science.- 1993.-V. 55.- P. 311-316.

95. Pickett B. Principles of cryopreservation // A short course of techniqes for freezing mamunalian embryos.-1983.-P. 1-7.

96. Polge C. and Rowson L.E.A. Fertilizing capacity of bull spermatozoa after freezing at-7°C//. Natural.-1952.-V.169.-P.626-627.

97. Riha J., Polaser M., Banas P. Vliv veku, plemenne prislusnosti dazkyne a rocniho obdoli na ovarialni oderzvu po aplikaci PMCG u krav //Zivocina Vyroda.-1985.-V.30.-№3.-P.217-225.

98. Schiewe M.C., Schmidt P.M., Rail W., Wildt D.E. Influence of cryoprotectant and plunge temperature of post-thew viability of ovine embryos // Biol. Reprod.-1985.-V.33.-P.98.

99. Schiewe M.C., Rail W., Stuart L.D., Wildt D.E. In situ straw dilution of ovine embryos cryopreserved by conventional freezing or vitrification//Theriogenology.-1990.-V.33.-P.321.

100. Snijders S., Dillon P., Sreenan J. et al. Effect of genotype on follicular dynamics and subsequent reproductive performance // Irish Journal of Agricultural and Food Research.- 1997.- V.36.- P. 96.

101. Snijders S., Dillon P., O'Callaghan D. Effect of genetic merit, milk yield, body condition and lactation number on in-vivo oocyte development in dairy cows // Theriogenology.- 2000.- V. 53.- P. 981989.

102. Spitzer J., Niswender G., Seidel G. Fertilization and blood levels of progesterone and LH in beef heifers on a restricted energy diet // Journal of Animal Science.- 1975.- V. 46.- P. 1071-1077.

103. Thatcher W., Meyer M., Danet-Desnoyers G. Maternal regnition of pregnancy//J. Reprod. Fertil.-1995.-V.49.-P. 15-28.

104. Villa-Godoy A., Hughes Т., Emery R. et al. Energy balance and body condition influence luteal function in Holstein heifers // Domestic Animal Endocrinology.- 1990,- V. 7. P. 135-148.

105. Westwood C., Lean I., Kellaway R. Indications and implications for testing of milk urea in dairy cattle: a quantitative review Part 2. Effect of dietary protein on reproductive performance // N. Z. Vet. J.- 1998.- V. 46,- P. 123-140.

106. Whittingham D.G. Survival of mouse embryos after freezing and thawing// Natural.-1971 .-V.233.-P. 125-126.

107. Wilmut I., Rowson L.E.A. Experiments on the low-temperature preservation of cow embryos// Vet. Rec.-1973.-V.92.-P.686-690.

108. Wittwer F., Gallardo P., Reyes J. Bulk milk urea concentrations and their relationship with cow fertility in grazing dairy herds in southern Chile // Prev. Vet. Med.- 1999.- V. 38,- P. 159- 166.

109. Yaakub H., O'Callaghan D., Duffy P. et al. Effect of concentrate type and quantity on superovulation in cattle / Proceedings of Techniques forgamete manipulation and storage, June 22-23, 1996. Hamilton, New Zealand. 37 Abst.

110. Yaakub H., O'Callaghan D., O'Doherty J. Effect of dietary intake on follicle numbers and oocyte morphology in unsuperovulated and superovulated ewes // Theriogenology.- 1997.- V. 47.- N 1.- P. 182.

111. Yaakub H., Williams S., O'Callaghan D. Et al. Effect of dietary intake and glucose infusion on ovulation rate and embryo quality in superovulated ewes // Journal of Reproduction and Fertility Abstract Series.- 1997.-V. 19.-P. 151.