Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ВЛИЯНИЕ ТЕХНИКИ И ТЕХНОЛОГИИ ЗАМОРАЖИВАНИЯ И ОТТАИВАНИЯ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И ПРИЖИВЛЯЕМОСТЬ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "ВЛИЯНИЕ ТЕХНИКИ И ТЕХНОЛОГИИ ЗАМОРАЖИВАНИЯ И ОТТАИВАНИЯ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И ПРИЖИВЛЯЕМОСТЬ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА"

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИ И ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА '

(ВИЖ)

На правах рукописи

МАЛЬЦЕВА Маргарита Виктором»

УДК 612.846.02

ВЛИЯНИЕ ТЕХНИКИ И ТЕХНОЛОГИИ ЗАМОРАЖИВАНИЯ И ОТТАИВАНИЯ. НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И ПРИЖИВЛЯЕМОСТЬ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.13 — ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п. Дубровнцы, Московск. обл. 1989 гад

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте животноводства и Московской ветеринарной академии имени К. И. Скрябина

Научные руководители — доктор биологических наук,

профессор Н, И. Сергеев

— кандидат ветеринарных наук Г. Г. Козлов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

И. Я. Шихов

кандидат биологически к наук Л. В. Совсткмн

Ведущее учреждение: 222160. Минская область, г. Жодино, \'д, Фрунзе, IК

Белорусский НИИ животноводства

. час. на заседании специализированного Собета Д. 020.16.02 по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук при Всесоюзном' научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012, Московская область, Подольский ' район, пос, Дубровицы \

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. Автореферат разослан ЛСШммЖ.

Ученый секретарь специализированного совета,, кандидат биологических наук

И. И. Шмыгин

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИК! РАБОТЫ

Разрабатываемые партией и правительством дрогрэдмн янтен-сификацни сельскохозяйственного производства вошющарт в себя последовательный курва вое бодав полное удовлетворение потребностей населения страны высококачественными продуктами питания, а дромышлвнвость необходимым сырьем.

В связи о этим в двенадцатой пятилетке предстоит довести производство мяса до 21 млн.тонн, молока до И36-ИО млн. тонн. Решение этих задач невозможно без использования всех резервов производства , создания высокопродуктивных пород, линий, отвечающих современным требованиям промышленной технология; - повышения уровня селекционной работы, совершенствования племенных и продуктивных качеств животных, широкого использования генетического фонда коров-рекордиоток, увеличения вос1фоазводотва высокопродуктивного скота. .

Одним из методов повышения воспроизводотва племенного скота является трансплантация эмбрионов.

Адпгальдостъ т'амц. В последние года ведутся обширные исследования но трансплантации зародышей крупного рогатого скота, методика которой постоянно совершенствуется. Если от одного донора можно получать зародыши 4-5 раз в год, то очевидна реальная возможность уже на современной этапе развития метода получать от высокопродуктивной яорош-рэкордастки от 10-12 до 30 и более телят.

Одним из главных путай перевода метода трансплантации на промышленную основу является криоконсервирование эмбрионов. Замораживание эмбрионов имеет большое значение как для практики сельского хозяйства, так- к для фундаментальных научных исследований. С помощью этого метода возможно создание генетических банков; накопление необходимого числа по возможности однородных зародышей дня молекулярно-баологических, биохимических л других исследований; сохранение генетического фонда редких и исчезающих видов кявотных, Криоконсервирование эмбрионов позволяет осуществлять транспортировку зародышей на дальние расстояния; подбирать спонтанных реципиентов, соответствутадих по половому циклу возрасту эмбрионов и проводить пересадку в условиях ферм, что значительно снижает стоимость программы трансплантадии, так как отпадает необходимость в содержании большого стада потении-

альяшс реципиентов.

Де^ ц залячй исследований. Основная пзль исследований заключалась в усовершенствования методов замораживания я оттаява-. ноя эмбрионов с использованием криопротектора глицерина в различных концентрациях» в изучении влияния условий гранения, транспортировки и некоторых других факторов на жизнеспособность и пригл вляемость эмбрионов при нехирургнческой пересадке.

В задачи исследований входило:

- определить влияние техники и технологии заыоражзвания и оттаивания на жизнеспособность эмбрионов;

- сопоставить в сравнительном аспекте методики опенки качества эмбрионов;

- установить оптимальные режимы замораживания зародышей;

- выяснять влияние времени хранения эмбрионов от получения до замораживания на их жизнеспособность;

- определить влияние на жизнеспособность эмбрионов разных концентраций криопротектора глицерина и контейнеров для размещения эмбрионов при замораживании;

- усовершенствовать технологи» криоеонсервирования эмбрионов в паеттах с сахарозой.

Поставленные задача решались путем проведения опытов на коровах и телках черно-пестрой порода.

Цау.^ззя иовдзна. Изучены факторы, влияющие на жизнеспособность и приживднемость эмбрионов крупного рогатого скота; определена зависимость жизнеспособности зародышей от применяемых режимов охлаждения, типов замораживателей, концентрации криопротектора. Установлено влияние времени от получения до замораживания эмбрионов на ах жизнеспособность посла оттаивания. Усовершенствована технология замора кивания зародышей в паеттах с сахарозой.

Практическая .значимость работц заключается в том, что применение ускоренного режима охлаждения эмбрионов дает возможность в два раза сократить цикл охлаядьния, а использование сахарозы позволяет уменьшить время подготовки эаро допей к пересадке после оттаивания в несколько раз. Использование полученных данных о влияния техники и технологии гаморахявания и оттаивания на жизнеспособность эмбрионов значотельно снизит трудоемкость процесса криоконсервирования и повысит производительность труда в два раза. Материалы могут быть применены в практической трансплантации для поЕкиения глзкессособ кости (95 эмбрионов после заморади-

вания и оттаивания и их приживляемости (55 %) при нехярургпческой пересадке.

Реаддаэащя результатов стплди^рряц^- Результаты исследований внедрены в ОIEC "Дубровины" (информационный лас той Jí 60-89 ) и еепользуются в учебном процессе кафедры акушерства я хирургии Горского с елъскохозяйст ее иного института (справка о внедрении в учебный процесс ШШ.

^щуИ^яд рзДотц. Результаты исследований докладывались на ежегодных научных конференциях ,ЖА, на конференция молодых ученых МВА и на конференции по биотехнологии (Харьков, 1988 год).

Объем работу. Диссертация изложена па 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 таблицей я 9 рисунками. Состоит из введения, обзора литература, материала и методов, результатов собственных исследований, выводов я практических предложений. Список использованной литературы включает 205 источников» в том числе 154 иностранных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДУ ШОЩРЗАШЙ

Исследования по оценке качества, культивированию и глубокому замораживанию эмбрионов крупного рогатого скота проведены в лаборатории техники трансплантации и криоконеервированяя эмбрионов сельскохозяйственных животных Ш1а в период с IS37 no 1589 гг. Эмбрионы получали от суперовулировавпшх самок крупного рогатого скота нехирургическим методом о использованием фосфатво-солево-го раствора Дюльбекко (®С).

Сгедеполученные и замороженно-оттаянные зародыши подвергали морфологической оценке с учетом стадии развития и качества под световым инвертированным микроскопом при ЮО-кратном увеличении. Часть эмбрионов после морфологической оценки сгавялп нэ культивирование (до 24 часов) с целью изучения его влияния на жизнеспособность зародышей. Также исследовалось влияние временя от получения до заморажяийния эмбрионов на их выживаемость.

Замораживание эмбрионов проводили на программном заморажн-ватела "УОП-I" Харьковского опытного производства я английском замораживателе "Планер Р-204". В качестве Рряопротекторов использовали глицерин в различных концентрациях С применением сахарозы. Для усовершенствования техники замораживании исштимли различные контейнеры (стеклянные пробирки и паетгы). Использовали ускоренный ролам охлаждения к за мора лишние 8 газообразном азоте.

Подученные цифровые данные подвергали статистической обработке по коэффициенту X2 (по Пирсону),

Схема исследований

Изучаемые вопросы Ск5ъем иос ледова -_нлй__

Морфологичесхая оценка качества ¡эмбрионов и определение стадии их развития 1114

Изучение влияния культ ивяро ван ия на живне-способность эмбрионов 125

Замораживание эмбрионов с использованием различных режимов я концентраций криопрогектора глицерина 742

Оттакваняе и оценка качества эмбрионов 742

Пересадка заморокенно-оттаянных эмбрионов 670

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛВДОВАНИЙ 3,1* Одеяла, .кд^еот^ ймбри^о*.-Иссдв,пйвания во морфологической оценке качества свехеподученвых эмбрионов показали» что из общего числа Ш4 зародошей 574 были нормальные (53,1^), 168 (15,2 %) - дегенерярованными а 372 (31,7 %) - неоплодотворенные яйцеклетки.

Установлено, что эмбрионов отличного качества на разных стадиях развития можно получить лишь незначительное количество (23,3 %). Меньше всего их на стадии ранней я поздней морулв 2,1 и 5,3 %. Процент их увеличивается на стадии ранней (13,7 %) и поздней бласгоииогы - 54,4 % (табл. I).

На стадии ранней морулы отмечен низкий процент эмбрионов хорошего качества (6,3 %). Более поздняя стадия развития характеризуется наличием большого числа отличных и хороших эмбрионов уменьшением числа удовлетворительных. Па стадии поздней блаогодаогы получен высокий процент эмбрионов отличного качества (54,4 /») и малое число удовлетворительных зародышей (7,4

Дополнительным тестом оценки качества эмбрионов является метод культивирования. Он позволяет дополнить макроскопический метод оценки жизнеспособности как свехеподученных, так я заморожен но-отт аянных эмбрионов. Нами вило прокультивировано 69 свеже-полученпгх и 56 замороженно-оттаяют.х эмбрионов. Из 23 свехепо-

лученных культивируемых эмбрионов разных стадий 21 (91,3 %) продолжили развитие, а 2 осталась интакгными. Одинаково успешно развиваюсь как позднее морудя, так и ранние бластодастьг.

Было проведено культивирование морфологически полноценных, с морфологическими отклонениями и дегенерированных эмбрионов (табл. 2).

Таблица I

Качество и стадия развитая эмбрионов крупного рогатого скота (п - %)

Качество эмбрионов

, Схадда дазвдгай

■■ШМЫ.

йластоииптч

ранние

поздние ' ранние

поздние

Общее количество

Исследовано эмбрионов Отличные Хорошие

Удовлетворительные

48 189 277 228 742

I-2,1 10-5,3 38-13,7 124-54,4 173-23,3 3-6,3 64-33,8 127-45,8 63-27,7 257-434,6

II-22,9 72-33,1 44-15,9 .17-7,4 144-19,4

Таблица 2

Развитие зародышей при культивировании

Показатель

Качество заросшей

морфологи-. чески полноценные

о морфологическими от-клоненаякя

дегенериро-ванные

Количество эмбрионов 19 15 12

Продолжительность культивирования 20-24 19-24 19-24

Количество развившихся

эмбрионов 13 12

Процент от числа культивированных 94,7 аод

Эмбрионы, получившие оценку морфологически полноценные, показали при культивировании высокую жонеспособность. Развитие их наблюдалось в 94,7 % случаев. При культивирования э;йрионов о иорСо логическими отклонения;«! дробление отмечалось у 80,1 % за-родгыек. На один из неполноценных зародашей на развивался.

В качестве лрполнительного теста при оценке качества замо-

роженно-оттаяннкх эмбрионов по мор^оло гическим признакам, также использовали .метод кратковременного культивирования в течение 1-2 часов.Бало поставлено на кратковременное культивирование 18 замороженно-оттаяшшх эмбрионов разного качества. Крагковршен-вое культивирование не влияло на жизнеспособность эмбрионов, оцененных как отличные я хорошие,

S,2.Влияние концентрация кряопротектора глицерина г контейнера ва жизнеспособность эмбрионов

При низкотемпературном замораживания эмбрионов необходима определенная защитная среда (криопротактор). Вид кркопротектора я его концентрация имеют особое значение дня выживаемости заро-. дошей.

Поэтому цель наших исследований заключалась в определении влияния концентрации криопротектора глицерина на жизнеспособность эмбрионов после замораживания» оттаивания я нехирургической пересадки юс телкам-реципиентам (табл. 3).

Таблица 3

Влияние концентрации глицерина ва жизнеспо собно сть эмбрионов после оттаивания и их приждвляемость ори нехирургнческой пересадке

Показатель Концентрация глицерина СМ)

1,0 ■ 1.4

Заморожено эмбрионов 135 399

Число эмбрионов, пркгодшх к 127 368

пересадке

Процент от числа замороженных 94,1 92,2

Число реципиентов 127 367

Стельных реципиентов .59 182.

Процент стельности 46,5е 49,а*

х Р -с С,ОБ.

Данные таблицы 3 показывают, что ялзнеепоеобность эцбрио-нов при заморажлвании юс с глицерином в 1,0М и 1,4'Л концентрации различалась незначительно - 94,1 и 52,2 Однако ярнжаэ-ляеьюсть зародгшей бела несколько ите (р -с 0,05) пря использования 1,4;.! глицерина (4о,5 к 49,3 % соответственно).

3 качестве конте^е^от: Ери заморативанял эмбрионов нсполь-

зова ли стеклянные пробирки и паетты. Влсаваемость зародышей, замороженных в пробирках иди паеттах различалась незначительно -87,5 и 81,3 % соответственно. Но оря замораживании в паеттах снижалось количество эмбрионоа отличного и хорошего качества с 20,0 и 30,0 % до 18,8 я 6,3 % соответственно, число эмбрионов удовлетворительного качества возрастало на 25 %, дегенерированных на 6,2 %, Процент стельности при пересадке эмбрионов, замороженных в пробирках был выше 46,4 и 41,6 % соответственно (р-с 0,05).

При замораживания зародышей в паеттах создаются более жесткие условия дая сохранения ях лжзнеспособности, но в них обесценивается более тщательное выполнение ручной искусственной кристаллизации. Паеттн, также, более практичны, так как после оттаивания эмбрионы сразу же можно использовать для пересадки,

3.3. Влияние режимов замораживания и типов эанора-жявагвлей на жизнеспособность эмбрионов

Применение в качестве крио про тек гора глицерина и так называемого быстрого метода замораживания дает возможность существенно упростить технологию криоконсервирования.

Целью наших исследований было установление влияния ускоренных режимов охлаждения и замораживания в газообразном азоте на жизнеспособность и цриживляемость эмбрионов (табл. 4).

Таблица 4

Жизнеспособность я приживляеиость эмбрионов при различных режимах охлаждения

_Ррдттд' отзргу^яЕд_

Показатель до -35 °С до -33 °С заморажи-

вание в газообразном

азоте

Количество заморо&енно-оттаянш'Х эмбрионов 45 19 18

Пригодных к пересадке поел« оттаивания 43 15 15

Дррценг от числа замороженных 82,о С4.2 33,3

Пересажено эмбрионов 42 16 16

Стельных рецнпяентов Й 6

Процент стельности 42, 37,9х 40,1

х p-cO.Oíi.

Сравнительные испытания различных способов замораживания показала, что после оттаивания было примерно равное число эмбрионов, пригодных дня пересадки (табл. 4). Приждвляеыосгь зародышей при использовании различных режимов охлаждения отличалась незначительно. При охлаждении до -35 °С она составила 42,8 %, до -38 °С - 37,9 %, а при замораживании в газообразном азоте -40,1 X.

Нами установлено, что замораживание в газообразной азоте не оказало отрицательного влияния на жизнеспособность а приживляемое«. эмбрионов (табл. 5).

Таблица 5

Жизнеспособность вибрионов, замороженных в газообразном азоте

Показатель _Мб ГОД З.ШОМДИВаКЯЯ-

стандартный, на в газообразном программном замо- азоте _раживатале_

Заморожено и оттаяно

эмбрионов 40 40

Число жизнеспособных (п - %) 34-35,0 35-87,5

Пересажено эмбрионов 34 35

Стельных реципиентов 13 14

Процент стельности 38,2 40,0

Замораживание эмбрионов, начиная о минусовых температур позволяет получать идентичные результаты сохранения жизнеспособности эмбрионов после оттаивания (84,2 %) и их приживляемости при нахярургической пересадке (37,5 % против 30,5 %) то сравнению с общепринятым методом охлаждения от +20 °С (табл. б). Применение этого метода обеспечивает сокращение затрат рабочего временя на 30-40 минут (на один пикл замораживания), что очень важно для практического внедрения трансплантации в практику животноводства.

Исследовали эффективность замораживания эмбрионов при использовании различных замораживающих устройств - УОП-1 (Харьковское опытное производство) я "Планер" Р-204 (Англия). Число жизнеспособных эмбрионов было одинаковым при ясгользоаэиди отечественного замора пявяиия УОП-1» я английского Г-204. Жизнеспособность зародышей достигала 86 я <Ю Отечествешшп заморажи-

ватель УОП-1 ш качеству охлаждения не уступал зарубежному "Планер" Р-204.

Таблица б

Влияние режима замораживания с минусовых температур на жизнеспособность эмбрионов

Показатель

Сдое об занпрджяиярдя

традиционный (общепринятый)

от -»30 °С

с минусовой температуры

(-5 °С)

Заморожено и оттаяно

эмбрионов 89 38 Число эмбрионов пригодных

к пересадке (п - ?), 78-87,6 32-84,2

Пересажено эмбрионов 78 32

Стельных реципиентов 30 12

Процент стельности 38,5 37,5

3.5. Транспортировка эмбрионов и продолжительность их хранения в жидком азоте

Транспорт вровка эмбрионов является важным звеном в программе трансплантация. Она позволяет осуществлять международный обмен эмбрионами. Снижается опасность распространения ряда инфекционных болезней.

Нами проведено исследование по дальней транспортировке замо-роженнюс эмбрионов, оттаиванию и пересадке их в условиях ферм. Всего выло транспортировано 591 эмбрион. После оттаивания пригодными для пересадки оказались 636 (90,7 Стельность составила 42,9 %, Транспортировка не оказала отряда тельного влияния на жизнеспособность эмбрионов. Выявлено, что пряживляемость их больше зависит от подготовка реципиентов я условий работы при пересадке. Не было выявлено связи в пряхиаляемости эмбрионов со сроком хранения их в жидком азоте (табл. 7),

Увеличение срока пребывания, эмбрионов в низкотемпературной среде не оказывает существенного влияния на прлжпвляемость эмбрионов. Глубокое замораживание позволяет сохранять, эмбрионы долгое время к восстанавливать их лизнеспособность после оттаивания до 5Ъ,5

Таблица 7

Результаты пересадки заморожекво-оттаянных эмбрионов в зависимости от срока их хранения

Показатель Срок хранения (месяцы)

I 2-3 4-7 7-12 12

Пересажено эмбрионов 84 18 25 10 21

Число реципиентов 75 15 18 8 17

Стельных реципиентов 33 6 10 4 8

Процент стельности 44,3 40,1 55,5 50,0 47,1

3.6. Влияние качества,стадии развития эмбрионов и некоторых других факторов на их жизнеспособность г приживляемо сть при нахирургичес-кой дересадке

Важной задачей криобиологии является увеличение выхода пригодных для трансплантации эмбрионов. В этом плане представляет интерес изучение взаимосвязи качества я стадии развития зароды-шеи до замораживания с их жизнеспособностью после оттаивания.

Било заморожено 189 поздних морул, 277 ранних и 228 поздних бластооасг (табл. 8).

Таблица 8

Жизнеспособность и пряживляемость замороженно-отгаянных эмбрионов в зависимости от стадия развития

Показатель

Ст^пяя -развития

морулы поздние блзетопиеты

ранние поздние

189 277 228

169 220 227

89,4 79,4** 99,Х3*

169 220 226

67 97 127

39,6 44,1х 56,2?

"Заморожено эмбрионов

Пригодных к пересадке после оттаивания

Процент от числа замороженных

Число реципиентов Стельных реципиентов Процент стельности

х р -с 0,001; хх р < 0,01.

Данные таблица 8 показыйшот, что самая высокая лизнеспособ-

л ость ('¿3,1$) л приживляемость (56,2?) можно получить при зада-раяавашщ поэднюс йдастоцаст. Приаивляемость поздних морул бала невысокой {39,6 %). Практически одинаково (р>-0,05) приживляются как поздние шрулы, так и ранние йластоцистн (31;,6 % а 44,1$).

Отмечено заметное различие в приливляемости эмбрионов при нехирургической пересадке в-завасшдоотя от их качества. У зародышей лучшего качества до замораживания а после оттаивания на-блкдалась более высокая приазвляемостъ (табл. 9).

Таблица 9

Влияние качества заморояенно-оттаянных эмбрионов на их дрийпвляемость посла нехярургической пересадки

Показатель отличные' хорошие

Переса.чено эмбрионов 28 390 252

Стельных рецшшентов 21 179 6G

Процент стельности 75,1х 46,8х 29,6

х р>0,01;

При пересадке эмбраоаоз отличного качества стельность составила 75,IS, хорошего качества пражнвляешсть их заметно снижалась. Отмечено значительное снижение стельности после пересадки удовлетворительных эмбрионов. Эмбрионы, оцененные как удовлетворительные нецелесообразно использовать для криохонсервирова-ная.

Нами изучена взаимосвязь времена хранения эмбрионов от вышивания до з^юралсивания на их пригавляеность после оттадванпя (табл. 10).

Сагоая высо-ая тлэксспособность C83,I £) получена йрн хранении зубрпонов от ;:звлечешш до замораживания менее 2-х часов (1-1,5 часа). Пр:: дальнейшем удаяненпи периода хранения эмбрионов ¡З—4 часа) наблвдалось залетное сншг.еняе их выживаемости '75 ;;). Аранеяае э;,1брг;оыов от полз'чония до залюрашигния сване 4-х часов нецелесообразно, так как это прлвадат к получению очень нлзко!- пх ;з:ззоспособности после оттаазанля.

целом, кр1:онэйсерБ^розание спадает качество эмбрионов и а:; ари'лмвляалость после кехарургкчесио:'. пересадки (табл. II).

Таблица 10

Влияние времени хранения эмбрионов ог получения до замораживания на их жязн ессо еобность

Показатель

Время хранения (часы)

1-1,5 1,5-3 3-4 4

Заморожено и оттаяно эмбрионов 37 41, 28 27

Число эмбрионов, пригодных к пересадке 32 34 19 П

Процент от числа замороженных 86,1 аз,4 75,0 52,1 Таблица II

Общие результаты пересадки замороженно-оттаянных эмбрионов

Показатель Число эыЗри- онов Б том числе

дорулы бластоцисты

Замороженных эмбрионов 742 23? 505

Пригодных к пересадке после оттаивания 670 193 477

Процент от числа замороженных 50,3 81,4 94,4

Пересажено эмбрионов 670 193 47,7

Стельных реципиентов 266 57 209

Процент стельности 42,0 32,4 45,7

3.7. Результаты замораживания эмбрионов в наеттах с применением сахарозы

Б последние года появилась сообщения о возможности упрощения процесса удаления криопрогектора путем использования раствора сахарозы 0,25-1,0Ы концентрации я сокращения этапов разбавления криопротектора с 6 до 1-2-х ступеней. После необходимой издержки э:,«Зрион перес аглваот реципиенту в этой .т.е пает-те.

В зала чу наигос исследований входало: разработать техполо-

гические приемы подготовки эмбрионов к пересадке после оттаивания путем разбавления криоцротектора в паетте в X этап раствором.сахарозы, что должно обеспечить сокращение затрат рабочего временя на подготовку зародышей к пересадке, определить влияние на качество я приживляемое» эмбрионов после оттаивания од-поэтапного я многоэтапного удаления кряопротектора с использованием О,ЭД раствора сахарозы.

Отобранные зародыши была разделены на 4 группы, в соответствие со способом подготовки их к оттаиванию:

1) 1.4М глицерин без сахарозы (4 этапа);

2) Г.4М глицерин -I- сахароза (3 этапа);

3) 1,4М глицерин -к сахароза (X этап);

4) 1,0М глицерин + сахароза (3 этапа).

Показатели жизнеспособности эмбрионов в зависимости от способа подготовки их после оттаивания представлены в таблице 12.

Таблица 12.

Жизнеспособность и приживляемое«, эмбрионов в зависимости от способа их подготовки после оттаивания

Показатель _Способ подготовка эмбрионов_

1,4М глице- 1,4М глине- 1,0М глнце- 1.4ГЛ ширин без са- рин + саха- рин +■ са- церин+са-харозы (4 роза (3 эта- хароэа хароза ^ _этапа)_• па)_(3 этапа) . (г этап)

Число замороженно-оттаянвкх эмбрионов

Пригодных к пересадка

Процент от числа за-мороженнкх

Число решшяентов

Стельных реципиентов

Процент стельности

ЭХ 120 35 26

21 107 29 20

ОТ,7 89,2 82,6 76,9

20 64 22 12

4 23 6 4

20,0 35,9х 27,3х- 33,3

X Р^0,01.

Данные таблицы 12 показывают, что лучшие результаты яязне-

способности (89,2 %) и приживляемоети (35,9 %) получены при использовании 1,4 молярного глицерина с О.Ш сахарозой при насыщении эмбрионов криопротектором в 3 этапа. Низкая выживаемость за-родашей (67,7 %) отмечалась при применении 1,4М глицерина без сахарозы, с удалением криопротектора в 4 этапа. Удаление криопротектора в.один этап с использованием 0,5-шяярной сахарозы обеспечивает почти равные результаты приживляемоеги эмбрионов -35,9 и 33,3 % соответственно.

ВЫВОДЫ

1. Результаты пересадки замороженных и оттаянных эмбрионов находятся о прямой зависимости от их качества и сгадди развития. При пересадке зародышей отличного качества (южно достичь стельности 75,1 хорошего - 46,3 удовлетворительного - 29,ô i Наиболее приемле?,;ымя для эаморакивакая являются эмбрионы на стадии ранней и экспандмрошнноЙ бласгоцисты (7-3 дней).

2. Методы кратковременного (до 1-2 часов) и длительного культивирования (до 24 часов) эмбрионов гарантируют поддержание юс жизнеспособности вне организма и могут бить дополнительном тестом, .v.opio ло гсче с кой оценки с веже полученных ц замороженпо-оттаяшшх эмбрионов.

3. Порчена одинаковой жязнеспособность эг.'бр:!оков после за-гюраливзния и оттаивания црк применении крио протектора глицерина в 1,0 и 1,4 молярной концентрации. Выживаемость эмбрионов замороженных в пробирках и паеттах различалась незначительно (87,5 и 31,3 £).

4. Ускоренны!.; режпм охлаздецяя с исво льз о ьа ниш программных установок, а такие замораживание э^ркопов в газообразном азоте не оказывает отрицательного влияния lia их жизнеспособность и дает во3ï,юность сократить цикл охлаздения с двух часов до

63 минут.

5. Исследования до дальней транспортировке замороженных эглбрионов я пересадке их в условиях <Т«рм в разных хозяйствах выявили зависимость результатов стельности от степени подготовки реципиентов и условий реботк с зароднкома при трансплантации. Не выявлено связи прнжгвляемоста жлбркэноп с rjtцельностью хранения их в .™идгхм азоте.

О. Введение сахарозу со!фа:зает нроаесс растгэрешш иргмпротектора с 50-СО мин до 10-15 мкн., п^о-йог подготовку ^.к1г>;юиов

к пересадке к повышает производительность труда в 2 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для снижения трудоемкости и затрат на проведение программы трансплантации проводить замораживание эмбрионов в ускоренном режиме и в газообразном азоте.

2. Цри оттаивании эмбрионов включать в постав среды сахарозный градиент, что позволяет проводить разбавление криовротек-тора в один этап л сокращает время подготовки зародышей в пересадке е 5 раз.

Список раЗот, опубликованных по теме диссертации:

1.' ГЛальцава ¡Л.В. Криоконсервирование эмбрионов в паеттах с 1 применением сахарозы // Зоотехния, 1938. - в 7. - С. 41-42.

2. Шльяеьа 11.В. Усовершенствование технологии кряоконсервирования эмбрионов в паеттах с применением сахароза // Республи-

' канская науч. конф.: Состояние и перспективы развития биотехно-

логии в ¡швотно водет в. Тезиса докладов. - Харьвов, 1988. - С. 8788.

Подписано в печать ,17.08.69. Л-32682. Заказ 86у. Объем 1,0п.л. Тираж 100 экз.

Типографии ВНИИТЭМР.