Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование технологических приемов криоконсервирования эмбрионов коров молочных и мясных пород

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование технологических приемов криоконсервирования эмбрионов коров молочных и мясных пород"

РГ8- ОД

ВСЕРОССИЙСКИ.! НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ о ....... - - : 1ИВОГНОВОДСТВА /ВИ1/

На правах рукописи

ТАБЛАДА Иариикина Густаво

УСОБЕРВЕНСГВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЕМОВ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭМБРИОНОВ КОРОВ МОЛОЧНЫХ И МЯСНЫХ ПОРОД

03.00.13. Физиология человека и животнцх

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

п.Дубровицы, Московской области 1995 г.

Работа выполнена в центре по трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследо-г вательского института яивотноводства.

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор Н.И.Сергеев.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Б.П.Кононов;

кандидат биологических наук А.Н.Новгородов.

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, сиохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Защита диссертации состоится " " декабря 1Э35 г., в 10 часов, на заседании диссертационного совета Д 020.16.02 при Всероссийском научно-исследовательском институте кивотноводства.

Адрес института: 142012, Московская область. Подольски!»

район, пос. Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке £Ша.

Автореферат разослан " ¡^ " ноября 1995 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биол.наук

П.А.Науменко

I. ОБЩАЯ ШМТШЮТИКА PAEOTU

Актуальность темп. Повшоние продуктивности скота» увеличение производства молока и мяса - продушат, лодзлошю необходимой для человека - актуальная проблема животноводства. Одна из отраслей пауки, способной решать подобные задачи является биотехнология л её основное направление - трансплантация эмбрионов.

Одним из главных путей перевода глетода трансплантации на промышленную основу является криоконсервирование эмбрионов. Замо-рашшание эмбрионов имеет большое значение Kaie для практики сельского хозяйства, так а для фундаментальных научных исследований. С помощью этого метода возшяно создание генетических банков» накопление необходимого числа однородных зародше'л для молекулярно-биологических, биохимических я других исследований» сохранение генетического фонда редких п исчезавших видов лсивотикх. Криокон-сервпрование эмбрионов позволяет осуществлять транспортировку зародышей на дальние расстояния, подбирать спонтанных реципиентов, соответствующих по половой цдклике возрасту эмбрионов и проводить пересадку в условиях форм, что значительно снижает стои-t.ii)«'i'i> программы трансплантации, так как отпадает необходимость в содер.тании болызого стада потенциальных реципиентов.

В России метод трансплантации эмбрионов получил большое распространение в молочном скотоводстве. Его развитие и внедрение в практику ведения гкивотноводства позволяет увеличивать коэ;М>пце-ент размножения высокопродуктивных яивотшх в 2,5 раза и повышать селекционный эффект на 2Ь% (Николаев A.C., 1989; Сергеев Н.И., Смирнов O.K., Шихов Ii.Я. ,1982; Сергеев Н.И., 1489). В мясном скотоводстве метод трансплантации находится похса на стадии изучения и внедрения. При проведении работ в данном направлении необходимо обращать внимание ка приеш криоконсервярования омйр:-онов коров и способы их усовершенствования» чему и посвящена настоящая диссертация.

Цель и задачи научной работа. Основная цель псследрваипД заключалась в усовершенствовании технологических приемов крио-консорвирования эмбрионов крупного рогатого скота.

Для этого решали следущие задача:

- Определить оптимальные реяиш з&морагшвакия зародышей;

- Выяснить влшнке биологических, физических и механических факторов на жизнеспособность и прижвляеность зародыше::;

- Определить влияние ка жизнеспособность эмбрионов разных концентраций криодрогектора глицерина с использованием сахарозы;

- Усовершенствовать технологию криоконсервировения эмбрионов культивированных ин витро.

Поставленные задачи решались путем проведения опытов на коровах и телках молочных и мясных пород.

Научная нов;;зна. Изучены йгкторы, влияющие на яизкеспособ-ность и прикивляемость эмбрионов крупного рогатого скота; определена зависимость яиэлеспособности л пркяявляеыостя зародыше;]: от количества эмбрионов, полученных от донора при одном вымывании; от примененных режимов охлаждения, типов заморгишвателеК; концентрации криопротектора. Установлено влияние времени хранения эмбрионов в жидком азоте на юс жизнеспособность посла оттаивания. Доказана неустойчивость к кряоконсервированиа культивированных пн'витро эмбрионов коров мясного направления.

Практическая значимость работы. Заключается в определения эффективности замораживания эмбрионов на мобилышх заморажявате-лях, что позволило использовать эти установки в условиях ферм с одинаковыми результата,® жизнеспособности и прижнвляшоств после оттаивания как при замораживании их на стационарных замо-раживателях. Использование полученных данных о влиянии техники и технологии замораживания и оттаивания на жизнеспособность эмбрионов значительно снизит трудоемкость процесса криоконсервиро-вания и повысит производительность труда в несколько раз. Материалы могут быть применены Ь практической трансплантации для повышения жизнеспособности эмбрионов после зачораживания и оттаивания и их прижявляемости при нехирургической пересадке.

Апообашш работы. Материалы диссертации представлены в отчете центра по трансплантации эмбрлонов с.-х. животных за 19СЗ-1994 гг. Докладывались на 2-й международной конференции по биотехнологии, г. Харьков, 1994 г., Первой межгосударственной ка-

cxe;.ia иссущоат!

Таблица I

Качество и стадия разнится эмбрионов коров па 7-й день извлечения

Стадия развития

Показатель

морулн

бластоцисты

ранняя поздняя ранняя поздняя

' I8-275"" I0?-3l70*"lü2^32,2 Ти^зТг"

101-45,7 102-46,2 10-4,5 45-44,5 41-40,2 1-10,0 18-17,8 58-56,9 9-90,0 38-37,6 3- 2,0 -6- 5,6

Иослодовано эмбрионов 317 В т.ч. нормальных 221-69,8 Из них: хороша отличных

удовлетворительных дегенерированяых

8-3,0 89-40,3 2-25,0 88-39,8 3-37,5 44-19,0 3-37,5 96-30,2 10-55,5

Меньше всего отличных эмбрионов на стадии ранней в поздней морулы (37,5 и 17,8/0. Процент юс увеличивается на стадии ранней (56,9$) я поздней бластоцисты (90/0.

На стадии ранней морулн отмечен низкий процент эмбрионов хорошего качоства {25%) и относительно высоки?, процент удовлетворительнее (37,5$). Более поздние стадии разлития характеризуются наличием высокого числа хороших эмбрионов (44°,5% и 40,2$).

Стадия ранней бластоцисти от поздней морулы отличается меньшим числом эмбрионов удовлетворительного качества (2,9. против 37,6%) и равнкм процентом хороших эмбрионов (40,2^ и 44,5$), со-ответствешю.' Для поздних бластоцист характерно наличие впеокого процента эмбрионов отличного и хорошего качоства при отсутствия удовлетворительных и дегенерированннх.

Наблвдаегся некоторая разница в качестве одновозрастгапс эмбрионов у коров-доноров молочных и шенкх пород, подвергшихся замораживанию и оттаиванию (табл. 2).

Количество эмбрионов отличного и хорошего качоства от коров-доноров молочных пород составило 88,9$, тогда как от'коров-доноров мясных пород - 95,9$. Достоверные отличия наблюдались и по стадиям развития. Так, 84,4$ эмбрионов от коров молочягх пород находились на стад»! поздно^ морулк, toi да как омбрпоки гллепкх

- а -

пород были в большинстве своем {12,2%) ца стадии ранней бластоцас-тн (табл. 3).

Таблица 2

Качество эмбрионов поело зшораяшзания и оттаивания

'Качество эмбрионов

Количество эмбрионов

Борода, п -

молочные

мясные

Огличннэ

Хорошие

Удовлетворительные

Итого

' 50 59

8

117

12 - 26,7 28 - 62,2

5 - п.! 45

38 - 52,8 31 - 43,1

3 - 4,1 72

Таблица 3

Зависимость стадий развития 7-и дневных эмбрионов от породной принадлежности коров-доноров

Стадия развития

Количество эмбрионов

Порода, а - %

молочная

мясная

Морула поздняя 57 33.- 84,4 19 - 26,4

Бластоциста ранняя 54 2 - 4,4 52 - 72,2

Бластоциста поздняя С 5-11,1 1-1,4

Итого 117 45 72

Приведенные результаты по стадиям развития одновозрастних эмбрионов ыолочцих и мясних коров согласуются с даншгми других исследователей. Показатели морфологической оценки эмбрионов, применяете для иолочних коров, с успохом мохно использовать и для оценки эмбрионов цяешх коров.

3.2. Биологические факторы, влияющие на кизне-слособность з.мбрионов при замора-шваяии а оттаивании

Вакнои задачей криобиологии является увеличиение выхода пригодных для трансплантации эмбрионов. Представляет интерес изучс1ше взаимосвязи качества эмбрионов до замораяиваяия с их глзяеспособностьв после замораживания и оттаивания и влияние глубокого загдорагавания и времени хранения на вшиваемость и црплснвлпемость эмбрионов на стадии развития морули и бластоцис-?ц (табл. 4).

Таблица 4

Качество эмбрионов до и после зашракивания и оттаивания (п - %)

Стадия развития омбппонои

Качество эмбрионов

До замораживания

После оттаивания

Поздние 1/.орули

блаотоцпс.'ц

0ТЛЛЧНК'

хороаие

удовлетворительнее

условного душе

отличимо

Хороге

удовлетворительнее

условного;;::^

Погодине

13 - 43,4 10 - 33,3

7 - 23 ,3

10 - 66,7 4-26,7

I - 6,6

14 - 46,7 Э - 30,0 3 - 10,0

II - 73,3

2 - 13,3

I - 6,7 I - 6,7

Го;:;: до й^ср&чиг^шня 43, морул и 66, бластоцпст были с-£Л5«и:сго после еттапв^.пл отлпчккх уг.е не было. За-

50 лопймзеь и иоюдпно до: л ере садки эмбрионы -

Для успешного получения стельности от пересадки эмбрионов важную роль играет стадия развития и качество замороженно-отта-яннкх эмбрионов (табл. 5).

Таблица 5

жизнеспособность и приживляемость замороженно-рттаяляых эмбрионов в зависимости от стадии развития

Стадия развития Показатель Морулн Бластоцисты

поздн::о ранние поздние

Заморожено и оттаяно

эмбрионов 79 81 36

Пригодных к пересадке 72 75 65

Процент от числа 91,Г<х

замороженных 93,8 98,5

Количество пересадок 70 60 62

Стельных реципиентов 24 22 28

Процент стельности 34,2х 36,6 45,Г

х) - Р < 0,001; хх) - Р < 0,01

Из таблицы 5 следует, ч?:> приживляемость эмбрионов у реципиента возрастает с ув&дячиенпем возраста эмбриона. Так стельность в 34,2/3 случаев была обнаружена при пересадке поздних мо-рул и увеличивалась до 35,6/5 и 45,1/5 при пересадке ранних и поздних йластоцист, соответственно.

Продолжительность хранения эмбрионов в жидком азоте несколько сказывается на их жизнеспособности и лрп'свляемэстп. После оттаивания л пересадки стельность рецил:гентоз составила 40^ при хранении эмбрионов з жид::ом азоте не более 7 месяцев. С уголича-нием продолжительности храпения эмбрионов сн:г:г::зсь их пр::л:шлг-емость после порзсадкп. Таким образом, пз й'_:!сс1:я.;аш:ого следует, что хранение эмбрионов в жидком азоте более одного года нецелесообразно (таб.-:. С).

Таблица 6

Влияние времени хранения эмбрионов в эдком азоте на их приянвляемость и гизнеспособяость

Продолжительность хранения

Показатель

месяцы

года

7

1,5 3

4

Заморожено и оттаяно

эмбрионов 19

Жизнеспособных

эмбрионов 19

Процент от числа

оттаянных ILO,О

Пересажено эмбрионов 19

Стельных реципиентов 7

Процент стельности 36,8

40 39

8 8

31 31

3

55 53

97,5 100,0 100,0 100,0 96,4 39 8 31 3 53 16 2 8 I 12 40,0* 25,0' 25,8 33,3 32,1"

Р < 0,001

3

В совершенствовании метода трансплантации большое внимание уделяется изысканию ковкх и усовершенствованию существующих схем обработок коров-доноров. В наших исследованиях пепользозали препарат ФСГ - ([оллитроппн и вводили его в течение 4-х дне Г: в разноМ дозе утром и вечером и убшзанцеЯ. Обцая доза препарата в обоих случаях составила 1200 ИЕ (табл. 7).

Введение препарата С-СГ по убшавдей схо;.:о способствовало увеличении числа овуляций на 9,1$, нормальных эмбрионов яа 13$ и оплодотворяемости я'щеклето:; на 7,6$.

Интересные результаты была получены при изучении влияния количества эмбрионов, полученных от донора при одном вымывании, яа их пр.:дивляе.мость (табл. Б).

Даяние таблицы 8 показывает, что наивнее?.:: процент пр:ливля-емости эмбрионов бил получен от коров, которые дшя от 5-ти до Ю-тк оплодотворенных яГдеклеток ка одно вымзакие. Менк^и" процент 35,3$ и 32,1$ приггивляемости после пересадки был получен

от коров-доноров, которые при вымывании давани до 2-х или более 10 эмбрионов, соответственно.

Таблица 7

Результата гормонально?! обработки коров-доноров с использованием 2-х схем введения препарата ФСГ

Показатель

Схема

стандартная 40

32 - 80,0 8,7 + 1,6 5,7 1 1,1 3,2 1 0,8 '1.0 1,2

убывающая 60

50 - 84,2 9,5 1 1,4 6,2 1 1,2 4,3 + 0,8 1,1 0,8

Обработано животшас Реагид^иало суперовуляцией

Число овуляций па донора Получоно зародшей на донора В т.ч. нормальных дегенорированкнх неоплодотвореняых яйцеклеток

Таблица 8

Влнянио количества эмбрионов, подученных от донора при одном вымывании, на их прижавляемость

Показатель

Количество эмбрионов на одно ■ вымывание

до 2 до 5 до 10 более 10

Получено эмбрионов 17 32 77 30

Пригодных к пересадке 17 32 77 28

Процент от числа полученных 100,0 100,0 100,0 93,3

Количество пересадок 17 32 77 28

Стельных реципиентов 6 12 32 9

Процент стельности 35,3х 37,5 41,6х 32,1

х) - Р > 0,01

Исходя из полученных данных целесообразно получать овуляций в пределах от 5 до 10, т.к. в этих пределах обнаружен наивысший процент приживляемости.

Основным направлением исследований в области криоконсерви-ровшшя является поиск наиболее простых и экяномичннх, но в то же время эффективных методов замораживания и оттаивания зародышей, позволяющих максимально сохранить их жизнеспособность. В последние годы появились сообщения о возможности упрощения технологии криоконсервирования эмбрионов путем использования ускоренного режима охлаждения.

Проведенные испытания разных заыоражувателей показали, что жизнеспособность в группах после оттаивания была практически одинаковой. Так, при замораживании на ЗЭГЛ—4 жизнеспособность эмбрионов составила 82,2$, на ЗЭ.М-1 - 80,0^ и в газообразном азоте - 79,4/2 (табл. 9). Стельность после пересадки заморожекно-оттаяннкх эмбрионов составила 39,1; 37,5 и 30,0^, соответственно.

3.3. Воздействие физико-химических процессов на криокоясервирование эмбрионов крупного рогатого скота

Таблица 9

Влияние способа заморатлвания на жизнеспособность и пряживляемость эмбрионов

Замор&хпватели

Показатели

газообразный азот

ЗЭМ-4 ЗЭГ.1-Х .

Заморожено и оттаяно эмбрионов

Кпзнеспособнгх эмбрионов Процент от числа оттаянных Пересажено эмбрионов Стилъпи;; реципиентов Процент стельности

90 80

74 64

82,2 80,0

74 64

29 24

63

50

79,4

50 19 36,0

х' - р < 0,001

Результата испытаний показали, что лтэбое по этих устройств может бить использовано в криобиологической практике в равной степени, а икездиеся незначительные различия связаны скорое всего с качеством эмбрионов перед заморагдвапием.

Существенный интерес представляет влияние скоростей охлаждения эмбрионов на их дальнейоую жизнеспособность после оттаивания и прютвляемость после поресадки. Эксперименты по усоверпен-ствованию обдей технологии криоконсервирозашш проведены на 112 эмбрионах, охлаждение которых проводили от +-20°С до -7°С со скоростью 1°С/;.шн, при -7°С искусственная кристаллизация, от -7°С до -35°С со скоростью 0,5°С/мин. Стабилизация в точение 10 минут л погружение в жидкий азот. Б качество контроля бил использован общепринятый способ замораживания эмбрионов (табл. 10).

Таблица 10

Влияние скоростой охлаждения на жизнеспособность эмбрионов

Общепринятый Охла-аденло

Показатель релшм охлачс- со скоростью

дения 0,3 С/мин 0,5 С/мин

Заморсгаено эмбрионов 176 112

Оттаяно эмбрионов 136 112

Япзкеспособных эмбрионов 126 94

Процент от числа оттаянных 92,6 83,0

Пересажено эмбрионов 112 94

Стельных реципиентов 42 36

Процент стельности 37,5х 38,3х

х) - Р> 0,01

Данные таблицы 10 показывают, что увеличение скорости охлаждения на 0,2°СДшн после кристаллизации не оказывает отрицательного влияния на яизнеспособность эмбрионов после оттаивания, которая составила при общепринятом методе заморозки 92,6$, а при охлаждении со скоростью 0,5°С/мш - 83,9)5.

В последние года появились сообщения о возможности упрощения процесса удаления криопротекгора путем использования раствора сахародн 0,5; 1,0 и 1,4ГД концентрации и сокращения этапов разбавления криопротекгора с 6 до 1-2 ступеней. После необходимой выдержи эмбрионы пересаживают реципиенту в той же паете.

Состав среды для замораживания варьировал в зависимости от концентраций применяемого глицерина и наличия сахарозы (табл. II).

Таблица II

Жизнеспособность и приживляемость эмбрионов в зависимости от способа их подготовки перед замораживанием и после оттаивания

Способ насыщения эмбрионов

4 этапа 3 этапа I этап Показатель -

концентрация глицерина

1,4М без 1,01,1 + саха- 1,41Л I са-сахарозы роза хароза

Заморожено и оттаяно эмбрионов

Пригодных к пересадке

Процент от числа оттаянных

Число реципиентов

Стельных реципиентов

Процент стеьности

65 32 28

53 28 24

81,5 87,5 85,7

50 25 20

12 7 6

24,0х 28,0 30,0х

х) - Р < 0,001

Охладение проводили но общепринято!! схеме. Применение сахарозы для разбавления криоиротектора упрощает подготовку эмбрионов к пересадке и позволяет значительно ускорить технологию трансплантация эмбрионов, что имеет большое значение для практики, особенно в условиях £ерм.

3.4. Результаты заморахнвачпя эмбрионов, полученных методом культивирования к оплодотворения пн ьитро ооцнто из ялчянков норов

Успехи в области генетической я клеточной пнясенерпл позволяют надеяться, что на основе нетрадиционных методов создания яя-вотннх возмо.тао позиаеияе эффективности ях генетического совершенствования. Главный препятствие:.!, стоящим на пути решения этой проблемы, является стабильное получение достаточного количества зигот сельскохозяйственных азотных. Клюевым моментом в решения этой проблем :.;о;лет стать смоделированный пн зитр" процосс созревания, оплодотворэ.чия, культивирования ооцитов и замораживание эмбрионов с последугцой пересадкой.

Исследования по замора-хааашв-оттаяванию, определению дизно-способностп и птаззсявляемостд эмбрионов яоело пересадки проведены совместно со специалистами из ОРТ (Ташозор). Подготовку эмбрионов к зэморатавачиа п оттаиванию осуцосгзляли по методике, разработанной ФРГ (проф. И.Хан). Таких эмбрионов (п=66) было пересажено в госсельхозпредприятип "Тол.алегю" Нижегородской области 60-та реципиентам и 25 - в опытном хозяйстве КШа "Иапово" 21 реципиенту. Результаты перзсадая приведены в таблице 12.

Таблица 12

Приживляемость культивированных заморояенно-оттаянных эмбрионов после нехпрургпческоЛ пересадки

Хозяйства

Показатель -

"Холмачево" "Щапово"

Оттаяно п пересажено эмбрионов 66 25

Число реципиентов 60 21

Стельных реципиентов 5 4

Процент стельности 8,3 19,0

Получено телят 6 4

Процент от числа эмбрионов 9,0 16,0

Данине таблицы 12 показывают, что приживляемость культиви-руе.мих ин витро и заморояенно-оттаяшшх эмбрионов очень низкая. По хозяйствам она в А"Ь "Толмачево" 8 35« от числа реципиентов и 9,0$ от числа пересаженных эмбрионов , в ОПХ "Щапово" - 19 и 16$, соответствешю.

Из вышесказанного следует, что ранние культивированные зародыши неустойчивы к крпоконсервированшо и длительному хранению без смены культуральной среды.

Вероятно, для получения более высоких показателей ирнживляе-мости эмбрионов необходимо перед пересадко!! вести селекцию по их качеству. Исключение звена оценки качества замороженио-оттаяшшх эмбрионов перед пересадкой на наш взгляд, является прездевремен-ным. Цель упрацения технологии пересадки эмбрионов оказалась не достигнутой.

швода

1. Результаты пересадки све::шх и замороаенно-оттаяняых эмбрионов находятся в прямой зависимости от их качества и стадии развития. При пересадке зародышей .отличного качества »¡окно достигнуть 75,0%' стельности, хорошего - 39,4;?; удовлетворительного -25,5^. Наиболее устойчивые и приемлемые для замораживания являются эмбрионы ца стадии ранней и экспандированной бластоцисты.

2. При пересадке эмбрионов на стадии поздней ыорулы, ранней и поздней бластоцпсти можно получить 34,2; 30,6 и 45,15? стельнос-тей у реципиентов, соответствешю. На 7—11 день извлечения эмбрионов коров мясных пород они в основном находятся на стадии поздней морулы и ранней бластоцисты (26,4 я.72,2Й).

3. Охлаждение на мобильных зашражавателях и в газообразном азоте не оказывают отрицательного влияния на низнеспособность эмбрионов и дает возможность проводить заморачшвание в условиях ферм даже при отсутствии электроэнергии,

4. Использование глицерина в качестве криопротектора в I ,о:л и 1,41,1 концентрации с добавлением сахарози при трехступенчатом

и одноступенчатом введении и выведении обеспечивает сохранение жизнеспособности эмбрионов после заморазшанкя и оттаивания до 05,7 и 67,5^.

5. При дальней транспортировке замороженных эмбрионов и пересадке их в условиях ферм в разных хозяйствах установлена зависимость результатов стельности от подготовки реципиентов, условий хранения и работы с зародыиаш при трансплантации. Выявлена связь пршсивляемостп эмбрионов с длительностью их хранения в жидком азоте,

6. Заморозка культивированных п оплодотворенных ин витро ооцитов коров без смены культуральной среда п их пересадка, минуя звено оценки качества (с целью упрощения метода трансплантации) не дало ожидаемых результатов, при которых была получена стельность только в 8,3 а 19,случаях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПЛЗДЯОШШ

Дги трансплантации рекомендуется использовать замораживание эмбрионов на мобильных заморажлвателях и в газообразном азоте с использованием в качестве криопротектора I,4М глицерин в сочетании о сахарозой пря одноэтапном насыщении я выведении, что дает возможность сократить процесс крнокоясервирования и использовать метод в условиях ферм а хозяйств, где проблематична подача электроэнергии.

Основное содержание диссертации опубликовано в статье Таб--лада Мариящшсх Густаво Ернесто Факторы, влияндие на жизнеспособность эмбрионов при замораживании я оттаивании // Зоотехния, 1995, В 9

Иогоггс&по к почрп 3.1Г.ТЭЭ5Г.

"ом 1,2 Яакг-з 139

'■""гт'Рж 100 эг:з.

у: -г о к о-о - л "?яе кг» '

ПО 7П1ГПЯ