Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие доимплатационных эмбрионов млекопитающих после экспериментальных воздействий

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Развитие доимплатационных эмбрионов млекопитающих после экспериментальных воздействий"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ БИОХИМИИ И ПИТАНИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

г-'- ОД

на правах рукописи

2 2 АПР 1996

КРИВОХАРЧЕНКО АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ

УДК 591

РАЗВИТИЕ ДОИМПЛАНТАЦИОННЫХ ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПОСЛЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ

03.00.11 - эмбриология. ГИСТОЛОГИЯ и цитология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Боровск, 1996

Работа выполнена в Республиканской биотехнологической лаборатории республики Армения и во Всероссийском научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, с.н.с.

В. П.Рябых

Научный консультант: кандидат биологических наук,

А.К.Шахбазян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, с.и.е.,

Н.Н.Ротт

кандидат биологических наук, Л.Е.Андреева

Ведущее учреждение: Институт биологии развития

им. Н.К.Кольцова. РАН

Защита диссертации состоится г. в

часов на заседании специализированного совета Д 053.05.68 в Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва. Воробьевы горы. Биологический факультет МГУ. Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 1996 г

Ученый секретарь совета кандидат биологических наук

Е.Н.Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние десятилетия достигнуты значительные успехи в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих. Стали возможными извлечение и пересадка доимплантационных зародышей, культивирование их вне организма, криокоисервация. а также другие манипуляции с эмбрионами. Эти достижения все шире используются для решения практических задач. Осуществление такого рода исследовательских и практических работ связано с тем. что доимплантационные эмбрионы подвергаются целому ряду экспериментальных воздействий. Поэтому изучение способности эмбрионов к дальнейшему развитию (жизнеспособности) после таких воздействий является важнейшей задачей, успешное решение которой позволит лучше понять закономерности нормального эмбриогенеза и особенности развития доимплантационных эмбрионов млекопитающих вне организма. Вместе с тем. полученные результаты будут способствовать повышению эффективности новых биотехнологий, применяемых при проведении практических работ с эмбрионами человека и домашних животных.

Для эмбриологических экспериментов на млекопитающих и разработки новых прогрессивных технологий основной модельной системой служат, как правило, эмбрионы лабораторных животных. Однако результаты исследований привели к важному выводу о существенных видовых отличиях реакциии зародышей млекопитающих на различные экспериментальные воздействия. Так, не все виды манипуляций, успешно проводимые на лабораторных животных, достаточно эффективно воспроизводятся на сельскохозяйственных и наоборот. В связи с этим необходимы новые сравнительные исследования влияния манипуляций in vitro на доимплантационные эмбрионы млекопитающих разных видов.

Целью настоящей работы было изучение влияния некоторых экспериментальных воздействий, таких как микрохирургическое разделение эмбрионов, хранение при положительных околонулевых температурах и криокоисервация сверхбыстрым методом на жизнеспособность доимплантационных эмбрионов мышей и крупного рогатого скота (к.р.е.).

- 2 -

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. изучить хронологию развития доимплантационных эмбрионов и выявить связь между изменением числа клеток и морфологическими преобразованиями у зародышей к.р.с., а также определить наиболее ранние возможные сроки нехирургического извлечения зародышей У к.р.с.;

2. выяснить способность к развитию in vitro и in vivo половинок эмбрионов к.р.с.. полученных путем разделения доимплантационных зародышей;

3. исследовать влияние на жизнеспособность положительных околонулевых температур и возможность гипотермического хранения эмбрионов мышей и к.р.с.;

4. изучить жизнеспособность эмбрионов мышей после замораживания путем прямого погружения в жидкий азот (сверхбыстрый метод) и определить оптимальные условия для такой криоконсервации: подбор наиболее эффективных криопротекторов. их оптимальных концентраций и времени эквилибрации. а также способа оттаивания;

5. сравнить выживаемость зародышей мышей различных аутбред-ных и инбредных линий после криоконсервации сверхбыстрым методом и выявить наличие или отсутствие генетических различий в криоре-зистентности эмбрионов.

6. изучить жизнеспособность эмбрионов мышей при последовательном воздействии гипотермии и глубокого замораживания сверхбыстрым методом;

Научная новизна работы. Впервые установлена отчетливая корреляция между изменением числа клеток у доимплантационных зародышах и прогрессивными морфологическими преобразованиями в ходе эмбрионального развития к.р.с., а также определены наиболее ранние сроки их нехирургического извлечения. Показано, что половинки, полученные при разделении эмбрионов к.р.с. на стадии компактно! морулы-ранней бластоцисты сохраняют высокую жизнеспособность i) vivo без заключения их в zona pellucida. Выявлена зависимость выживаемости половинок в условиях in vitro от стадии развита: исходного эмбриона. Получены гомозиготные телята-близнецы пути разделения эмбрионов без использования микроманипулятора. Уста новлена высокая резистентность эмбрионов мышей и к.р.с. к гипотермическому воздействию и показана возможность их

хранения при положительных околонулевых температурах без снижения жизнеспособности. Определены оптимальные условия для сверхбыстрого замораживания эмбрионов мышей без снижения жизнеспособности как в опытах in vitro, так и после пересадки реципиентам. Впервые показано сохранение жизнеспособности у эмбрионов, оттаянных на воздухе после сверхбыстрого замораживания. Впервые установлена возможность последовательного сочетания гипотермического хранения эмбрионов и криоконсервации сверхбыстрым методом. Впервые осуществлена криоконсервация сверхбыстрым методом эмбрионов мышей различных аутбредных и инбредных линий без снижения их выжива-мости.

Практическая значимость работы. Данные по развитию доимплан-тационных эмбрионов к.р. с. и связи изменения числа клеток в зародышах с морфологическими преобразованиями могут быть использованы в лекционных курсах биологических и сельскохозяйственных учебных заведений. Метод получения гомозиготных близнецов без использования сложной микроманипуляционной техники пригоден для практического использования при проведении производственных трансплантаций эмбрионов сельскохозяйственных животных. Этот метод также можно применять для взятия биопсии у поздних доимплантационных эмбрионов с целью проведения различного рода анализов. Гипотерми-ческое хранение эмбрионов млекопитающих и их криоконсервация сверхбыстрым методом могут найти примененние как при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих. так и в практической деятельности, особенно при работе с зародышами редких и исчезающих пород и видов млекопитающих с цель» создания генетических банков и консервации генетических ресурсов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на i'iQ страницах машинописного текста и содержит 13 таблиц и 3 иллюстраций. Список литературы включает 193 работы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Международной конференции "Биологические основы высокой продук-

тивности " (Боровск. 1990); I Республиканской конференции "Биотехнологические исследования и перспективы их развития" (Львов. 1990); Научной конференции "Биотехнология и воспроизводство" (Горки. 1991): Рабочем совещании по консервации генетических ресурсов (Пушимо. 1993); II Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 1995). а также на заседаниях отдела биотехнологии ВНИИФБиП и кафедры эмбриологии МГУ им. М.В.Ломоносова.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение и пересадка эмбрионов к.р.с. Работу проводили на половозрелых телках и коровах кавказской бурой и черно-пестрой пород. Суперовуляцию вызывали введением гонадотропных препаратов фоллигона или фоллюсулостимулирующего гормона. Для вызывания охоты у доноров и реципиентов использовали простагландин F^. Доноров осеменяли искусственно. Эмбрионы извлекали и трансплантировали нехирургическим способом.

Получение доимплантационных эмбрионов мышей. В работе использовали инбредных мышей линий С57В1 и DBA, аутбредных NMRI и гибридов (СВА х C57BDF1. Самок подсаживали к самцам той же линии на ночь и утром проверяли наличие копуляционных пробок. День обнаружения пробки считали первым днем беременности. Эмбрионы на стадии восьми клеток извлекали утром третьего дня путем промывания яйцеводов фосфатно-солевым раствором Дюльбекко.

Определение стадии развития и оценка качества эмбрионов к.р.с. Определение стадии развития и оценку качества эмбрионов КРС проводили под инвертированным микроскопом ("Opton", Германия). Стадии развития определяли по общепринятой классификации (Lindner. Wright. 1983). Для оценки качества эмбрионов использовали трехбалльную шкалу, в работе использовали только эмбрионы, оцененные как хорошие и удовлетворительные.

Приготовление гистологических суховоздушных препаратов эмбрионов к.р.с. Эмбрионы без обработки колхицином помещали в гипотонический 0,9 % раствор цитрата натрия на 10-20 мин в зависимости от стадии развития. Затем эмбрионы по одному переносили в минимальном объеме жидкости на предметное стекло и сверху капали 2-3 капли фиксатора, состоящего из 1 части ледяной уксусной кислоты и 3 частей метилового или этилового спирта (Tarkowski. 1966). После высушивания препараты окрашивали ацеторсеином и под-

считывали число ядер и митозов в эмбрионах. Митотический индекс определяли отношением числа всех митозов к общему числу клеток.

Разделение эмбрионов к.р.с. Зародыши переносили в стеклянную чашку Петри, заполненную средой Дюльбекко с 20 % фетальной коровьей сыворотки (ФКС) ("Flow". Англия). Дно чашки было обрабо-танно абразивным порошком для создания шероховатой поверхности, обеспечивающей достаточно надежную фиксацию эмбриона. Разрезание осуществляли стальным микроскальпелем. Эмбрионы разрезали "вручную". без использования микроманипулятора. После разделения эмбрионы оставляли в чашке на 20-30 минут до их компактизации, после чего трансплантировали синхронизированным реципиентам или помечали в термостат для культивирования.

Гипотермическое хранение и культивирование in vitro эмбрионов мышей и к.р.с. Эмбрионы мышей помещали в стеклянные капилляры, а эмбрионы к.р.с. в пластиковые трубочки, которые опускали в сосуд с водой. Сосуд хранили в холодильнике при 4-5°С в течение 24 ч. После хранения эмбрионы переносили в свежую среду для культивирования или пересадки реципиентам. Культивирование проводили в стеклянных капиллярах под слоем парафинового масла при температуре 37" С. Для культивирования использовали среду Хэмз F-10 ("Serva", Германия) с 20 % ФКС в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси или среду Дюльбекко с 20 % ФКС на воздухе.

Замораживание эмбрионов мышей на программном за.мрражиг?ателд. Эмбриоиы переносили в 10 % раствор глицерина ("Serva", Германия), приготовленный на среде Дюльбекко с 20 % СКС. и выдерживали в нем 20 мин при комнатной температуре. Затем эмбрионы в этом растворе помещали в пластиковые трубочки CIMV", Франция) и охлаждали на программном замораживателе "Multi-Cool" (FTS Systems. Inc.. США) со скоростью Iе С/мин до - 7"С. вызывали кристаллизацию и затем охлаждали со скоростью 0.3е С/мин до температуры - 37°С, после чего переносили в жидкий азот.

Сверхбыстрое замораживание и витрификация эмбрионов мышей.

Эмбрионы помещали в 10 % раствор глицерина и выдерживали при комнатной температуре 10 мин. Пластиковую трубочку заранее заполняли смесью криопротекторов. состоящей из 30 X глицерина и 70 % 1 М сахарозы ("Serva", Германия). Объем смеси составлял 50 мкл. Тонкой пипеткой в трубочку переносили эмбрионы, выдерживали при комнатной температуре различное время и сразу погружали в жидкий азот. В качестве проникающего криопротектора применяли также эти-

- б -

ленгликоль ("Merk". Германия) или 1.2-проланднол ("Sigma". США). Замораживание эмбрионов мьппей путем внтрнфикации осуществляли по общепринятому истоду-(Schefieh et al.. 1986 ). Эмбрионы эквилиб-рнровали в течение 10 мин при комнатной температуре в растворе., содержащем 10 X глицерина и 20 X пропалдиола. затем переносили в пластиковую трубочку, заполненную раствором, содержащем 25 X глицерина и 25 X пропандиола. и немедленно погружали в жидкий азот.

Оттаивание закорогенных эмбрионов шярй. Пластиковые трубо^-ки с замороженными эмбрионами оттаивали либо в водяной бане при температуре 20 или 37е С. либо на воздухе в диапазоне температур 18-22"С. При сверхбыстром замораживании или замораживании на программном заморахнвателе эмбрионы сразу после оттаивания поме-пали в 0.5 И сахарозу на 10 млн. После замораживания путем внтри-фикацнй эмбрионы оттаивали в водяной бане при 20°С и выдерживали в 1 К растворе сахарозы 5 мзш. Зародыши отмывали от сахарозы в четырех сменах раствора Дюльбекко с СКС и культивировали. Разви-вавашнея считали только эмбрионы, достигшие стадии поздней, вылупляющейся или вылупившейся бластоцисты.

/рпнеп.'пнгпиня аибриоков мппей. Псевдобеременных реципиентов получали путем спаривания салок с вазэктомнровашшми самцами. Эмбрионы трансплантировали на первый или второй день лсевдоберемен-кости по 5-7 штук в каждой или только в один яйцевод. Реципиентов забивали на 14-17 дам беременности и подсчитывали число мест имплантации и количество морфологически нормальных плодов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Хронология развития н клеточный состав доимплантаиионных эмг брионов к.р.с. кавказской бурой породы. Темпы индивидуального развития млекопитающих одного вида могут варьировать в определенных пределах. Данные по хронологии доимплантационного развития к.р. с. кавказской бурой породы отсутствуют. В наших опытах на 5-е сутки после осеменения извлекали в оскозном 16-клеточные гкбрконы и реже ранние морулы. На 6-е сутки, в основном - ранние ш асомпактше морулы, а на 7-е. в основном - компактные морулы. ранние и средние бластоцисты. На 8-е сутки наблюдалась наибольшая вариабельность стадий развития зародышей, извлеченных у разных шзотных: хотя основную часть извлеченных эмбрионов составляли

средние и поздние бластоцисты. встречались также компактные мору-лы. ранние и вылупившиеся бластоцисты. В более поздние сроки извлекали только вылупившиеся бластоцисты. При сопоставлении с данными литературы расхождения с другими породами наблюдались только на пятые сутки после осеменения, когда другие исследователи извлекали в основном ранние и компактные морулы. По остальным же дням результаты в целом совпадали (Lindner. Wright, 1983: Ка-уффольд и др.. 1990). Отметим, что при нехирургическом вымывании на 5-й день удавалось извлечь только около 70 % эмбрионов, а с 6-го дня эффективность извлечения зародышей достигала 90 %.

На лабораторных животных, в частности на мышах, четко показано. что каждой стадии развития соответствует определенное число клеток. В связи с этим нам представлялось целесообразным установить связь между числом клеток и морфологическими преобразованиями в процессе доимплантационного развития эмбрионов к.р.с. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Количество клеток в эмбрионах коров кавказской бурой породы в зависимости от стадии развития и времени извлечения.

Стадия развития Всего Число клеток на Среднее Митотический и время эмбрионов один эмбрион число индекс

извлечения (от - до) клеток в

эмбрионах

Стадия 16-клеток 14 (пятые сутки)

10 - 21

15.79+0.78 0.009

Ранняя морула 10 (пятые сутки)

21 - 45

30.10 ♦ 2,24 0.020

Ранняя морула 7 (шестые сутки)

31 - 56

41.14 ± 3.29 0.024

Компактная морула 21 (шестые сутки)

42 - 100 64.90 ± 3.43 0.022

Компактная морула 9 (седьмые сутки)

66-120 96.56 ± 5.19 0.027

Ранняя бластоциста в (седьмые сутки)

93 - 146 116,25 + 5.75 0.020

Наиболее ранние зародыши, извлеченные на 5-й день, содержали в среднем около 16 бластомеров. Процесс компактизацни морул у к.p.c.. в отличие от мышей, растянут во.времени, он происходит после достижения зародышами стадии 32-бластомеров и завершается при достижении 64-клеточной стадии. Образование полости бласто-цисты происходит при увеличении числа клеток в эмбрионах примерно до 100. При развитии 16-клеточного эмбриона до стадии ранней бластоцисты митотичесхий индекс увеличивается от 0.009 до 0,2.

Изучение способности к развитию половинок эмбрионов, полученных при микрохирургическом разделении доимплантационных зародышей к.р.с. Проведенные ранее опыты по разделению морул и бластоцист к.р.с. показывают, что даже при уменьшении числа клеток вдвое доимплантационные эмбрионы способны развиваться в полноценных взрослых особей. Но почти во всех работах для разделения использовали сложную микроманипуляционную технику, а полученные половинки помещали в пустую zona pellucida. и уж затем трансплантировали реципиентам. В нашу задачу входило изучение способности к развитию половинок, полученных разрезанием эмбрионов "вручную", без использования микроманипулятора, и пересаженных реципиентам без заключения в zona pellucida.

В первой серии опытов обе половинки каждого эмбриона трансплантировали одному реципиенту в один рог. Всего использовали 10 эмбрионов: 6 компактных морул и 4 ранние бластоцисты. Было получено 20 половинок этих эмбрионов, в результате пересадки которых родилось 6 телят, в том числе две пары гомозиготных близнецов. Прижнвляемость в расчете на исходное число (неразрезанных) эмбрионов составила 60 % .В последующих опытах каждую половинку эмбриона трансплантировали одному реципиенту. Для разрезания использовали 6 эмбрионов: 5 компактных морул, извлеченных на 6-е сутки беременности и 1 компактную морулу. извлеченную на 7-е сутки. После разрезания все 12 половинок были пересажены 12 реципиентам, 5 (41.6 %) из которых стали стельными. Прижнвляемость в расчете на исходное число (неразрезанных) эмбрионов составила 83%. Контролем служили интактные эмбрионы, которых трансплантировали по одному на реципиента в тех же условиях, но без каких-либо манипуляций. Всего было использовано 38 контрольных эмбрионов, пересаженных 38 реципиентам. В результате было получено 11 телят, что составило 28 % от числа трансплантированных эмбрионов.

Прижипляемость половинок достоверно не отличалась от прижив-ляемости целых эмбрионов. Телята, родившиеся от пересадки половинок. были по всем показателям нормальными. Следовательно, разделение зародышей "вручную" и пересадка их без zona pel lucida не влияла на приживляемость половинок и их способность развиваться до рождения. Эти выводы нашли подтверждение в работе, появившейся после публикации наших данных (Тао et al.. 1991).

Нами также изучалась способность половинок эмбрионов к развитию in vitro. Половинки зародышей, полученные при разрезании ранних бластоцист. плохо развивались при культивировании in vitro. Только 14.3 X (4/28) из них сформировали нормальные бластоцисты. Лучше развивались вне организма половинки эмбрионов, полученные при разделении вылупившихся из блестящей оболочки в результате культивирования поздних бластоцист. Однако и из них выжило лишь 35.7 % (5/14). В то же время половинки свежеизвлечен-ных вылупившихся 10-12-дневных бластоцист обладали высокой жизнеспособностью. При культивировании in vitro в течение 24 ч 92.6 % (54/58) из них сформировало нормальные бластоцисты. Таким образом, способность половинок эмбрионов к развитию вне организма зависит от стадии- развития исходного зародыша. К такому же выводу приходят и авторы работы, появившейся одновременно с нашей публикацией (Захарченко. Прокофьев. 1990).

Влияние плюсовых околонулевых температур на жизнеспособность доимплантационных эмбрионов мышей и к.р.с. Известно, что извлеченные из организма доимплантацнонные эмбрионы млекопитающих гибнут через несколько часов пребывания при комнатной температуре. Зародыши способны переносить воздействие положительных околонулевых темепратур. при этом выживаемость зависит от вида животного, стадии развития зародышей и используемых для хранения сред. В первой серии опытов изучалось влияние гипотермии на 8-клеточные эмбрионы мышей (CBAxC57Bl)Fl. а также пригодность различных куль-туральных сред для хранения этих эмбрионов при 4еС в течение 24 ч, результаты представлены в таблице 2. Эти результаты показывают, что 8-клеточные мышиные эмбрионы можно хранить и культивировать в фосфатном буферном растворе на воздухе. При этом хранение при 4е С в течение Г 4 ч не влияло на развитие эмбрионов при их последующем культивировании. Использование для хранения эмбрионов

этой стадии развития сложной, содержащей бикарбонат среды Хэма F-10 и трехкомпонентной газовой смеси не дает преимуществ в опытах in vitro.

Таблица 2. Результаты культивирования 8-клеточных эмбрионов мышей после хранения в различных культуральных средах при 4е С в течение 24 ч.

Группа

Количество Процент эмбрионов

эмбрионов развившихся I вышедших из

до бластоцисты I zona pellueida

Культивирование в среде 85 Хэма F-10 + 20% ФКС

98.8 % (84/85) 72.9 % (62/85)

Хранение и последующее культивирование в среде Хэма F-10 + 20% ФКС

62

95,2 % (59/62) 61.3 % (38/62)

Культивирование в раство- 67 ре Дюльбекко + 20% ФКС

98.5 % (66/67) 79.1 % (43/58)

Хранение и последующее культивирование в раство- 58 ре Дюльбекко + 20% ФКС

100 % (58/58) 74.1 % (43/58)

Нами также изучалось влияние гипотермического воздействия на способность к развитию in vivo компактных морул-поздних бласто-цист к.р.с. кавказской бурой породы. Вопрос этот представляет интерес еще и потому, что имеются сообщения о значительных породных отличиях в чувствительности эмбрионов к.р.с. к гипотермии (BonDurant et al.. 1982). С учетом полученных данных, для хранения зародышей к.р.с. использовали раствор Дюльбекко с ФКС. Эмбрионы после хранения в холодильнике в течение суток трансплантировали нехирургическим способом телкам-реципиентам, при этом реципиентов готовили таким образом, чтобы они приходили в охоту на 24 часа позже, чем доноры. В контрольной группе эмбрионы сразу после извлечения пересаживали реципиентам, пришедшим в охоту од-

повременно с донорами. Ввиду недостаточного количества реципиентов в некоторых случаях пересаживали по два эмбриона в один рог матки. Процент стельных животных в подопытной группе был несколько выше, чем в контрольной, соответственно 46,7 % (7/15) и 33.9 % (21/62). однако различия были статистически недостоверны. Приживляемость. определяемая по проценту родившихся телят от общего числа трансплантированных эмбрионов, также достоверно не различалась в подопытной и контрольной группах, соответственно 33.3 % (8/24) и 27.8 % (23/82). Родившиеся телята были полностью нормальными по всем фенотипическим признакам и ничем не отличались от обычных телят. Таким образом, хранение доимплантационных эмбрионов к.р.с. кавказской бурой породы при 5°С в течение 24 ч не оказывало отрицательного влияния на способность этих эмбрионов развиваться в нормальных телят после трансплантации животным-реципиентам.

Развитие эмбрионов мышей после сверхбыстрого замораживания разными способами с использованием различных криопротекторов. В последнее время интенсивно разрабатываются принципиально новые подходы для замораживания доимплантационных эмбрионов млекопитающих путем их прямого погружения в жидкий азот (сверхбыстрое замораживание и витрифгасация) без использования специальных программных замораживателей. Однако пока не существует каких-то общепринятых схем замораживания. Продолжается интенсивный поиск наиболее эффективных криопротекторов. определение их оптимальных концентраций, условий эквилибрации и т.д. Целью данного раздела работы было изучение влияния разных вариантов сверхбыстрого замораживания и различных криопротекторов на выживаемость 8-клеточных эмбрионов мышей (CBAxC57Bl)Fl in vitro. Результаты представлены в таблице 3. Как видно из таблицы. 8-клеточные мышиные эмбрионы плохо переносили сверхбыстрое замораживание без предварительной эквилибрации в 10 Ж глицерине. Только 20 % зародышей из I группы выжило после оттаивания. Увеличение времени пребывания в смеси глицерина и сахарозы до 3-х мин не оказывало достоверного влияния на выживаемость. Лишь 30,4 % эмбрионов из II группы достигли стадии бластоцисты после оттаивания. В то же время 90.7 % эмбрионов, замороженных сверхбыстрым методом после эквилибрации и пребывания в растворе для замораживания 1.5 мин (III группа) развивалось до стадии бластоцисты при последующем культивировании. Это достовер-

но не отличалось от развития зародышей в контроле - 98 %. Вместе с тем увеличение срока пребывания эмбрионов в конечном растворе до 3-х слн (IY группа) достоверно снижало жизнеспособность зародышей - 57.1 % (Р<0.01). Таким образом, можно сделать вывод о том, что при сверхбыстром замораживании 8-клеточных эмбрионов мышей по наиболее эффективной из опробованных схем их жизнеспособность in vitro практически не снижается.

Таблица 3. Развитие in vitro 8-клеточных мышиных эмбрионов после сверхбыстрого замораживания различными методами и витрификации.

Группа и метод Эквилибрация в Время в замораживания криопротекторе конечном

растворе мин

Количество Процент эмбрионов эмбрионов развившихся до бластоцисты

I Сверхбыстрый

II Сверхбыстрый

без 1.5

эквилибрации

без 3

эквилибрации III Сверхбыстрый 10 % глицерин 1.5 10 минут

IY Сверхбыстрый 10 X глицерин 3

V Витрификация

Контроль

10 минут 10% глицерин + 20 % пропандиол 10 минут

20 23 54 28 79

51

20. 0% (4/20)

30.4% (7/23)

90.7% (49/54)

57.1% (15/28)

3.8% (3/79)

98.0% (50/51)

Эта схема отличается от уже известных пониженной концентрацией глицерина при предварительной эквилибрации и уменьшением времени пребывания эмбрионов в конечном растворе. Тем самым уменьшается вероятность токсического действия криопротекторов на эмбрионы.

Попытки замораживания 8-клеточных мышиных эмбрионов путем витрификации оказались неудачными, почти все они погибали и только 3.8 % зародышей продолжили развитие после оттаивания.

Изучалась также возможность сверхбыстрого замораживания мы-

шиных эмбрионов с другими проникающими криопротекторами в смеси с сахарозой. При этом применялась схема замораживания, оказавшаяся наиболее эффективной в предыдущей серии опытов. В результате экспериментов не выявлено достоверных различий в выживаемости эмбрионов после сверхбыстрого замораживания с использованием глицерина или этиленгликоля, соответственно 87.9 % (51/58) и 80 X (40/50). В то же время 1.2- пропандиол не оказывал криозащитного действия при использовании данной схемы сверхбыстрого замораживания 8-клеточных зародышей мышей. Ни один из замороженных эмбрионов не выжил после замораживания с этим криопротектором.

Влияние способа оттаивания эмбрионов мышей, замороженных сверхбыстрым методом или на программном замораживателе. на их жизнеспособность. Выживаемость зародышей после криоконсервации зависит не только от способа замораживания, но и от режима оттаивания. Обычно используемый для замороженных эмбрионов млекопитающих способ оттаивания в воде зачастую приводит к нарушению целостности zona pelluclda. В этом разделе работы мы сравнивали эффективность обычного способа оттаивания с использованием водяной бани и способа оттаивания на воздухе для мышиных эмбрионов, замороженных как на программном замораживателе, так и сверхбыстрым методом. Контролем служили эмбрионы, помещенные в культуру без замораживания. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Развитие in vitro 8-клеточных эмбрионов мышей, замороженных сверхбыстрым методом или на программном замораживателе. после оттаивания различными способами.

Метод Способ Процент эмбрионов

замораживания оттаивания с поврежденной I развившихся до

zona pellucida I бластоцисты

Замораживатель

Замораживатель

Замораживатель

Сверхбыстрое

Сверхбыстрое

Контроль

вода 37е С вода 20°С воздух вода 37°С воздух

14.9 % (7/47)

18.9 % (7/37)

О % (0/50)

3.5 % (2/58)

1.6 % (1/63)

85.1 % (40/47)

78.4 % (29/37)

84.0 % (42/50)

87.9 % (51/58)

88.9 % (56/63)

98,0 % (50/51)

В результате экспериментов не было выявлено достоверных различий в жизнеспособности замороженных на программном заморажива-теле 8-клеточных мышиных эмбрионов после оттаивания на воздухе и в водяной бане при температуре 37 или 20°С. Однако при оттаивании на воздухе не наблюдалось нарушений целостности zona pellucida, в то время как оттаивание в воде приводило к ее повреждению у части эмбрионов. Вместе с тем оказалось, что для оттаивания эмбрионов, замороженных сверхбыстрым методом, необязательно использовать водяную баню при 37°С, как это делалось во всех опубликованных до сих пор работах. Оттаивание на воздухе (18-22°С) не снижало выживаемость зародышей. Отметим, что у эмбрионов, замороженных сверхбыстрым методом, независимо от способа оттаивания, повреждения zona pellucida встречались крайне редко;

Сверхбыстрое замораживание эмбрионов аутбредных и инбредных мышей. Известно, что выживаемость эмбрионов мышей после крио-консервации традиционным методом с использованием программного заморажнвателя зависит от их генотипа. Однако до последнего времени практически отсутствуют работы по сверхбыстрому замораживанию эмбрионов мышей инбредных линий, а также по изучению криоре-зистентности зародышей с различным генотипом при замораживании прямым погружением в жидкий азот. Результаты наших экспериментов по сравнению способности к развитию In vitro после сверхбыстрого замораживания эмбрионов мышей инбредных линий C75BL и DBA, а также аутбредной линии NMRI представлены в таблице 5. Практически все эмбрионы выглядели после криоконсервации морфологически нормальными. лишь у единичных зародышей разрушилась часть бластоме-ров. Выживаемость эмбрионов, оцениваемая по способности развиваться до стадии бластоцисты, для мышей каждой из использованных линий достоверно не различалась в опыте и контроле. Таким образом криоконсервация сверхбыстрым методом не снижала жизнеспособности in vitro эмбрионов мышей изученных линий. Также не было обнаружено достоверных различий в криорезистентности зародышей этих линий при сверхбыстром замораживании.

Вместе с тем отметим, что способность к развитию in vitro до стадии бластоцисты в используемой нами культуральной системе была достоверно ниже (Р<0.01) у 8-клеточных эмбрионов мышей DBA. по сравнению с зародышами мышей C57BL.

Таблица 5. Выживаемость 8-клеточних эмбрионов мышей разных-линий in vitro после сверхбыстрого замораживания.

Линия Процент Процент эмбрионов Процент эмбрионов

мьааей эмбрионов развившихся до развившихся до

разрушившихся бластоцисты после бластоцисты

после замораживания в контроле

замораживания

HMRI 2.0 X (1/51) 80.4 X (41/51) 80.7 X (46/57)

С57В1 1.5 X (1/65) 89.2 X (58/65) 88.3 X (53/60)

DBA 1.7 X (1/59) 59.3 X (35/59) 66.7 X (46/69)

Для изучения способности развиваться in vivo после сверхбыстрого замораживания эмбрионы мышей лшти NMRI сразу после оттаивания н отмывания от кркопротектора без какого-либо отбора трансплантировали псеодобеременныч реципиентам. Из 10 реципиентов опытной группы забеременели 9. а в контрольной группе из 3 реципиентов забеременели 5. При определении процента имплантировавшихся эмбрионов, а также процента нормальных плодов учитывали только зародили. пересаженные забеременевсим реципиентам. В результате пересадки эмбрионов -после сверхбыстрого заиорахивалня имплантировалось 40.6 X (39/96), что достоверно не отличалось от процента имплантаций в контрольной группе - 48.7 X (19/39). Не било выявлено достоверных различий и в способности развиваться после трансплантации в морфологически нормальные жизнеспособные плоды у эмбрионов после криоконсервации - 34,4 % (33/96). по сравнению с контролем - 33.3 X (13/39). Следовательно сверхбыстрое замораживание не снижало способности эмбрионов к дальнейшему развитию in vivo.

Сверхбыстрое замораживание мышних эмбрионов, хту>ннргуну:ся при 4*С в течение суток. Как в исследовательской практике, так и для производственных работ часто возникает необходимость последовательного сочетания гипотермии н криохонсервацда. в частности сверхбыстрым методом. Однако вопрос о способности эмбрионов мле-копитакхцих выдерживать такие воздействия изучен недостаточно. В • данном разделе работы изучалось сочетанное воздействие плюсовых

околонулевых температур и последующего глубокого замораживания сверхбыстрым методом на развитие in vitro 8-клеточных эмбрионов мышей (CBAxC57Bl)Fl. Эмбрионы хранили при 4°С в течение 24 ч. а затем сразу, без промежуточного культивирования, замораживали описанным выше оптимальным сверхбыстрым методом. После оттаивания эмбрионы культивировали в термостате при 37° С и через 48 ч подсчитывали число поздних бластоцист. В этой группе стадии бластоцисты достигло 94.6 % (52/56) эмбрионов. Выживаемость в контрольной группе, в которой эмбрионы замораживали сверхбыстрым методом сразу после извлечения из яйцеводов, составила 87.9 % (51/58). различия недостоверны. Таким образом предварительное ги-потермическое хранение 8-клеточных мышиных эмбрионов не влияло на их жизнеспособность после сверхбыстрого замораживания.

ВЫВОДЫ

1. Изучена хронология развития эмбрионов коров кавказской бурой породы с вызванной суперовуляцией. Наиболее ранние эмбрионы. извлеченные на 5-ые сутки после осеменения, насчитывают в среднем около 16-бластомеров. На 8-е сутки наблюдается наибольшая вариабельность стадий развития зародышей, извлеченных у разных животных.

2. У крупного рогатого скота процесс компактизации морул происходит после достижения ими стадии 32 бластомеров и завершается при достижении 64-клеточной стадии. Образование полости бластоцисты происходит при увеличении числа бластомеров в среднем до 116. При развитии 16-клеточного эмбриона до стадии ранней бластоцисты митотический индекс увеличивается от 0.009 до 0.2.

3. Разделение компактных морулы и ранних бластоцист коров на половинки без использования микроманипулятора и пересадка таких половинок реципиентам без zona pellucida не отражается на их способности развиваться вплоть до рождения.

4. Способность половинок эмбрионов к развитию вне организма зависит от стадии исходного зародыша: около 90 % половинок, полученных из вылупившихся бластоцист. восстанавливаются в морфологически нормальные эмбрионы. Значительно хуже развиваются in vitro половинки зародышей более ранних стадий.

5. Доимплантационные эмбрионы мышей на 8-клеточной стадии и крупного рогатого скота, начиная со стадии компактной морулы, обладают высокой устойчивостью к длительному воздействию положительных околонулевых температур. Пребывание зародышей при температуре 4-5° С в течение суток не отражается на их способности к дальнейшему развитию. Не выявлено достоверных различий при гипо-термическом хранении и культивировании мышиных зародышей в фосфатно-солевом растворе Дюльбеюсо с 20 % ФКС на воздухе или в среде Хэма F-10 с 20 % ФКС в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси.

6. Мышиные эмбрионы на стадии 8-клеток способны переносить глубокое замораживание прямым погружением в жидкий азот по оптимальной схеме в смеси проникающего (глицерин или этиленгликоль) и непроникающего (сахароза) криопротекторов практически без снижения жизнеспособности как в опытах in vitro, так и после пересадки реципиентам.

7. Замороженные таким сверхбыстрым методом эмбрионы мышей могут быть оттаяны на воздухе (18-22°С) без снижения жизнеспособности. Выживаемость эмбрионов, замороженных на программном замо-раживателе. не различается после оттаивания на воздухе или в водяной бане, однако при оттаивании на воздухе лучше сохраняется zona pellucida.

8. Не выявлено различий в криорезистентности 8-клеточных эмбрионов инбредных мышей линий С57В1 и DBA. аутбредных мышей HMRI и гибридов (CBAxC57Bl)Fl при сверхбыстром замораживании.

9. Последовательное сочетание гипотермического воздействия в течение суток и сверхбыстрого замораживания не отражается на способности 8-клеточных эмбрионов мышей к дальнейшему развитию.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Шахбазян А.К., Кривохарченко A.C.. Серобян Г.А.. Овсепян A.A.. Мнацаканян В.Б.. Газарян К.Г. Получение монозиготных близнецов крупного рогатого скота путем разрезания эмбрионов на половинки. "Доклады ВАСХНИЛ" 1989. N 1. стр. 25-27.

2. Шахбазян А.К., Кривохарченко A.C.. Серобян Г.А.. Газарян К.Г. О трансплантации эмбрионов крупного рогатого после длительного хранения при температуре +5°С. "Сельскохозяйственная биология" 1989. Н 4. " стр. 28-29.

3. Шахбазян А.К., Кривохарченко A.C., Хачатурова Е.А.. А.А.Овсе-пян. Мнацаканян В.Б.. Газарян К.Г. Оценка числа клеток и митозов в эмбрионах крупного рогатого скота на предимплантаци-онных стадиях развития. "Сельскохозяйственная биология", 1990. N 2. стр. 65-69.

4. Кривохарченко A.C.. Бахитов К.И.. Татаринова Л.В.. Титкова В.В. Развитие вне организма "полуэмбрионов", полученных при разделении эмбрионов крупного рогатого скота разных стадий развития. Тез. докл. Международной конференции "Биологические основы высокой продуктивности", Боровск, 3-7 сентября

1990, Боровск. 1990. часть II, стр. 122-123.

5. Грищенко В.И.. Осташко Ф.И.. Исаченко В.В.. Исаченко Е.Ф.. Кривохарченко А.С.. Рябых В.П.. Сушко А.Б.. Федотова H.A. Витрификация, сверхбыстрое замораживание мышиных, крысиных и коровьих эмбрионов. "Проблемы криобиологии". 1992. N 1. стр. 35-40.

6. Кривохарченко A.C., Бахитов К.И., Рябых В.П. Влияние способа оттаивания эмбрионов мышей, замороженных сверхбыстрым методом или на программном замораживателе на их жизнеспособность. "Онтогенез". 1992. т. 23, N 1, стр. 76-79.

7. Кривохарченко А.С., Вильянович Л.И., Рябых В.П. Сверхбыстрое замораживание мышиных эмбрионов, хранившихся при 4е С в течение суток. "Онтогенез". 1992. т. 23, N 2, стр. 67-70.

8. Кривохарченко A.C.. Вильянович Л.И. Хранение яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих при положительных околонулевых температурах. I Влияние гипотермии на яйцеклетки и эмбрионы разных стадий развития и различных видов млекопитающих. "Онтогенез". 1995. Т. 26. N 1. стр. 38-47.

9. Кривохарченко А.С.. Вильянович Л.И. Хранение яйцеклеток и эмбрионов млекопитающих при положительных околонулевых температурах. II Общие закономерности и механизмы гипотермического воздействия. "Онтогенез". 1995. т. 26. N 2, стр. 99-107.

10. Кривохарченко A.C.. Вильянович Л.И.. Серобян Г.А.. Рябых В.П.. Шахбазян А.К., Садовников В.Б. Выживаемость эмбрионов мышей после сверхбыстрого замораживания разными способами с использованием различных криопротекторов. "Проблемы репродукции". 1995. N 4. стр. 13-18.