Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АНАЛИЗ НАРУШЕНИЙ РАННЕГО ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ И ИХ КОРРЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ АНТИСМЫСЛОВЫХ ОЛИГОДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОВ

ВАК РФ 03.00.30, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "АНАЛИЗ НАРУШЕНИЙ РАННЕГО ЭМБРИОНАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ И ИХ КОРРЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ АНТИСМЫСЛОВЫХ ОЛИГОДЕЗОКСИНУКЛЕОТИДОВ"

На правах рукописи УДК 591.3:577.113

КОШЕЛЕВА НАСТАСЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

анализ нарушений раннего эмбрионального

развития и их коррекция с помощью антисмысловых олигодезоксинуклеотидов

03.00.30 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -2007-

Работа выполнена на кафедре эмбриологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (заведующий кафедрой — профессор В,А. Голиченков)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Мария Львовна Семенова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Татьяна Клеониковна Дубовая

кандидат биологических наук Дмитрий Александрович Исаев

Ведущая организация:

Институт Биологии Развития РАН

Защита диссертации состоится 17 апреля 2007 года в 15 часов 30 минут на заседании Диссертационного Совета Д.501.001.52 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, д.1, корпус 12, Биологический факультет, аудитория М-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им М.В. Ломоносова

Автореферат разослан " 16 " марта 2007 года

Ученый секретарь

Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Закономерности раннего эмбрионального развития активно изучают, начиная с 60-ых годов прошлого столетия, когда была разработана методика культивирования ранних эмбрионов in vitro [Btggers ее al., 1965]. Высокая исследовательская активность в изучении доим плантационного периода развития млекопитающих связана не только с изучением фундаментальных закономерностей и познавательным интересом, но имеет большое медико-биологическое и социальное значение. Практические задачи этого направления исследований связаны с усовершенствованием методов искусственного оплодотворения, сохранением биоразнообразия и генофонда, племенным разведением сельскохозяйственных животных [Pope, 2000; Solti et al., 2000; Allen, 2005]. Проблема лечения бесплодия человека в настоящее время приобретает не только медицинское, социально-демографическое, но и экономическое значение. Результативность лечения бесплодия методами экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) во многом зависит от способности полученных ооцитов к оплодотворению in vitro и последующему развитию. Одним из отягчающих факторов при лечении бесплодия является возраст пациенток - после 30 лет резко снижается жизнеспособность эмбрионов и частота рождения детей после программы ЭКО [Templeton et al, 1996: Боярский, Василевская, 1998].

Жизнеспособность ранних эмбрионов обусловлена многими факторами, в том числе, зрелостью и генетическим статусом гамет, активацией эмбрионального генома, стадиоспецифичной экспрессией генов, межклеточными взаимодействиями. У всех млекопитающих некоторая часть эмбрионов погибает на доимплантационных стадиях развития. При культивировании эмбрионов in vitro нарушения могут быть вызваны как генетическим статусом развивающегося зародыша, так и влиянием ряда внешних факторов (например, нехваткой факторов роста, увеличением количества токсичных метаболитов, окислительным стрессом) [O'Neill, 1998; Agarwal et al., 2005]. Эмбрионы млекопитающих до компактизации обладают наибольшей чувствительностью к изменениям микроокружения и внешним воздействиям [Ribas et al., 2006; Zander et al., 2006]. Культивирование in vitro замедляет темпы развития [Fischer, I$37T~2001], изменяет уровень экспрессии ряда ре£улят«(доод 4?i£ro90ir'£¿W et al., 2001;

ЦНБнмепн Н и жРЯЗ"а

Zheng et ai, 2005; Chandrakanthan et ai, 2006], нарушает экспрессию импринтированных генов [Gardner, Lane, 2005: Исаев и др., 2005], снижает количество жизнеспособных и увеличивает число гибнущих и фрагментарованных клеток в эмбрионах [Hardy, ¡999]. Но в условиях культивирования in vitro трудно разграничить аномалии, вызванные условиями культивирования, и нарушения, связанные с генетикой объекта. Поэтому представляется актуальным исследование нарушений раннего развития, обусловленных генетикой объекта.

Качество развивающихся эмбрионов оценивают по ряду морфологических признаков, учитывающих степень фрагментации, форму и размеры бластомеров. Многие исследователи связывают нарушения раннего развития с апоптотической гибелью клеток в эмбрионах [Exley et al., 1999; Van Blerkom et ai, 200!; Jurlsicova et al., 2003], поэтому перспективным представляется изучение возможности коррекции спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития путем воздействия на лроапоптотические факторы. В последнее время для специфического блокирования экспрессии генов все чаще применяют антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (АсОДН), представляющие собой короткие дезоксирибонуклеотидные последовательности. АсОДН присоединяются к специфической мРНК, препятствуют трансляции и, следовательно, выработке белка (рис. 1). Эта технология дает возможность временно и направленно воздействовать практически на любой процесс в клетке С высочайшей специфичностью, не затрагивая целостность генома. Создание препаратов на основе антнемыеловых о;шгонуклеотялов - одно из новейших направлений лекарственных разработок для лечения ряда заболеваний, например в онкологии [Mutten et at., 2004], для лечения гипертонической болезни [Phillips et ai, 2005], аллергических расстройств [Ball et ai., 2004], некоторых вирусных и бактериальных инфекций [Geller, 2005].

В связи с этим, изучение генетически обусловленных и индуцированных нарушений раннего развития эмбрионов млекопитающих и возможность их коррекции посредством обратимых воздействий является актуальным вопросом, как биологии развития, так и практической репродуктивной медицины.

Рис А Принцип действия аитисм меловых

олигодезоксинуклеотидов (АсОДН) Существует два основных механизма действия АсОДН. Первый, приводящий к деградации .»РНК, связан с активацией РНК-азы Н, расщепляющей РНК в месте образования гетеродуплекса ДНК-РНК (РНК-аза Н присутствует в цитопляжие и в ядре клеток и в норме принимает участие в репликации ДНК}. Второй механизм действия АсОДН останавливает транслщию белка с молекулы мРНК за счет создания стерического препятствия для посадки и скольжения рибосомы.

Цели, „ и„. задачи работы. Целью явилось изучение генетически обусловленных и индуцированных нарушений раннего развития, исследование возможности их коррекции в культуре in vitro. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать генетически обусловленные нарушения раннего развития у мышей линий SAM,

2. Изучить нарушения раннего эмбрионального развития при проалоптотическом воздействии.

3. Изучить особенности раннего эмбрионального развития в условиях введения ксеногенных низкодифференцированных клеток в эмбрион.

4. Исследовать возможные токсические эффекты олигонуклеотидных последовательностей на эмбриональное и постнатальное развитие.

5. Изучить влияние немодифицированных АсОДН на дифференцировку клеток.

6. Исследовать влияние немодифицированных АсОДН к мРНК гена Harakiri (Hrk) на раннее эмбриональное развитие.

Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы спектр и динамика генетически обусловленных нарушений раннего развития у мышей линии SAMP1, склонной к ускоренному старению. Впервые показано влияние проапоптотического агента блеомицина на раннее эмбриональное развитие в случае высокого уровня нарушений до им плантационного развития (SAMP1) и при нормальных репродуктивных показателях (ICR, C57BI6/DBA). При введении в полость бласто цисты мыши ксеногенных низкодифферен-

V ..""..у"

цнрованных клеток (нейральных и стромальных клеток костного мозга человека) показано их включение в состав как трофэ кто дермы, так и внутренней клеточной массы. Обнаружено отсутствие отсроченного действия немодифицированных олигонуклеотидных последовательностей на развитие, поведение и репродуктивные показатели мыши. Показано воздействие немодифицнрованных АсОДН на дифференцировку клеток на модели адипогенной дифференци ров к и стромальных клеток жировой ткани в культуре in vitro. Выявлена возможность стабилизации адипогенной дифферемцировки в культуре стромальных клеток жировой ткани с использованием АсОДН. Впервые установлено, что в случае индуцированных нарушений раннего развития, АсОДН к мРНК гена Hrk улучшают качество выживших эмбрионов.

Практическая значимость работы. Исследованные в работе генетически обусловленные (у линии мышей SAMP1) и индуцированные аномалии раннего развития могут быть использованы как модель нарушений развития эмбрионов человека в области вспомогательных репродуктивных технологий. Подобраны условия хнмеризаиии ранних эмбрионов, обеспечивающие эффективное включение нейральных стволовых и прогениторных клеток человека в состав внутренней клеточной массы бластоцист. Выявленное стабилизирующее влияние специфичных немодифицированных АсОДН на уровень адипогенной дифференцировки в культуре in vitro {снижение и поддержание на низком уровне количества жировых клеток) расширяет возможность использования этих соединений в клеточной терапии. Проведенное исследование эмбрионального и постнатального развития мыши после кратковременной экспозиции с немолифицированными о л н гон у клеоти да м и в доимплантационный период показало отсутствие немедленных и отсроченных токсических и тератогенных эффектов. Продемонстрировано, что культивирование доимплантационных эмбрионов в среде с олигонуклеотидами в дальнейшем не влияет на поведенческие it репродуктивные показатели взрослых животных. Также было показано положительное влияние АсОДН, специфичных к мРНК гена Hrk мыши, на индуцированные проапоптотическим воздействием in vitro нарушения раннего развития. На основании полученных результатов разработан способ управления качеством ооиитов и эмбрионов и разработаны

композиции для добавления в среду культивирования ооцитов и змбрионов (патенты РФ № 2281777 и № 228177S от 20 августа 2006).

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на научном семинаре кафедры эмбриологии Биологического ф-та МГУ им. М.В. Ломоносова и на следующих конференциях: V Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2002); Ш всероссийской конференции с международным участием "Механизмы функционирования висцеральных систем" (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской научной конференции "Гистологическая наука в России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы" (Москва, 2003); XI международной конференции и дискуссионном научном клубе "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии 1Т+МЕ 2003" (Гурзуф, Украина, 2003); VIII Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пушино, Россия, 2004); Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина" (Санкт-Петербург, 2005); конференции "Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты" (Москва, 2005); "Bioscience 2005: from genes to systems" (Glasgow, UK, 2005); 22th Annual Meeting of the ESHRE (Prague, Czech Republic, 2006).

Публика unit. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них два патента РФ на изобретение.

Благодарности. Автор выражает благодарность своему научному руководителю доценту М, Л, Се мен о вой и всем сотрудникам кафедры эмбриологии Биологического факультета МГУ им М.В.Ломоносова. Автор глубоко признателен И. Н. Ca бури ной, Е.Е.Захаровой, С.Ю.Залетову, В.В.Заевой, Р.А.Шафеи, И.И.Полетаевой и Е.БЛровой.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и сгруппированы в следующие разделы: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение экспериментальных результатов, обсуждение, заключение, выводы, список литературы и приложение. Работа содержит 32 иллюстрации (микрофотографии, графики и рисунки), 31 таблицу. Список цитированной литературы включает источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования. Эксперименты были выполнены на мышах инбредных линий SAM {senescence-accelerated mouse): SAMP1 (senescence-accelerated mouse prone) и SAMR1 (senescence-accelerated mouse resistant)* любезно предоставленных проф. Т.ТакедоЙ и проф. М.Хосокавой (Университет Киото, Япония). С 1995 года эти линии мышей разводят в виварии кафедры эмбриологии Биологического ф-та МГУ. В работе также использовали мышей линий СВА, ICR и мышей-гибридов C57B16/DBA, BALB/DBA. Объектом служили ранние эмбрионы мыши (от двух клеточной стадии до бластоиисты), плоды на стадиях 17.5 и 18.5сут. развития, мышата в возрасте 2-3 месяцев (табл. 1). В серии опытов на культурах клеток использовали культуры стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ) человека. Материал был получен в хирургических отделениях городских больниц при плановых операциях с добровольного согласия пациентов.

Таблица 1. Общая структура исследования (эксперименты на животных).

Серии экспериментов кол-во животных кол-во эмбрионов лнння животных

Изучение нарушений раннего развития гп \г\>о 109 853 SAMP1

25 131 SAMRI

19 144 ICR

49 356 C57B16/DBA

51 358 BALB/DBA

Исследование спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития т \ilro; влияние АсОДН к мРНК гена Нгк мыши 82 2Я0 SAM PI

21 90 ICR

60 317 C57B16/DBA

Изучение раннего развития после введения ксе но генных клеток 53 339 СВА

Исследование влияния АсОДН к мРНК генов HRK, FASL и ВАХ человека на раннее эмбрионал ьное развитие 131 623 C57BKS/DBA

на постам плантационное развитие 110 плодов С 57B16/DBA

на поведение и репродукцию 70 C57B16/DBA

94 Fl C57BI6/DBA

Олигоиуклеотидные последовательности. Поиск нуклеотидных последовательностей мРНК генов НКК РА5Ц ВАХ, РРАКу человека, а также гена Нгк мыши, осуществляли с помощью интегрированной базы данных ]^СВ1. Вторичные структуры мРНК генов НЙК (СепеЮ: 8739), РАвЬ (СепеЮ: 356)

BAX (GenelD: 531), PPARy (GenelD: 5468) человека и гена Hrk мыши (GenelD: 12123), а также АсОДН к данным мРНК были подобраны с использованием программы «Mmfold» для 37°С [Zuker, 2003]. Специфичность подобранных АсОДН была проверена при помощи программы BLAST 2.2 (Basic Local Alignment Search Tool). В работе применяли ^модифицированные АсОДН, синтез которых был осуществлен по нашему заказу ЗАО «Синтол», олигонуклеотиды были очищены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, обессолены it лиофилизированы.

Научение спонтанных нарушений раннего развития. Для анализа спектра и динамики нарушений раннего развития у мышей линии SAMP1, склонных к ускоренному старению, анализировали состояние доим плантационных эмбрионов на сроках 1.5,2.5 и 3.5сут. На 18.5сут. развития у самок оценивали доимплантационную смертность по разности между количеством желтых тел и числом мест имплантации. Эмбрионы оценивали по морфологическому критерию и с использованием флуоресцентных красителей: бис-бензимида (3,2нмоль/мл, 30 минут, 37°С) - для маркировки ядер, красителей кита LIVE/DEAD (30 минут, 25°С) - для выявления погибших клеток. По морфологическому критерию эмбрионы разделяли на нормальные и имеющие аномалии развития. Группу с аномалиями развития подразделяли на подгруппы в зависимости от формы аномални: фрагментация, дегенерация, остановка развития в период дробления, отставание в развитии, нарушения компактизации, нарушения кавитации.

Оценка влияния ксеногенных клеток на раннее развитие. Влияние ксе но генных низкодифференцированных клеток на раннее развитие и оптимальные условия включения клеток в состав бластоцисты оценивали на модели получения инъекционных химер по методу, предложенному Гарднером и Бринстером [Gardner, Johnson, 1975; Brinster, 1979]. Суспензии нейральных стволовых и прогениторных клеток (НСК) и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (МСК) человека, меченые витальным флуоресцентным красителем бис-бензимидом, были любезно предоставлены лабораторией новых клеточных технологий Института реабилитации и клеточных технологий им. А.Я.Фриденштейна. Использовали следующие суспензии клеток: свежие и после 24 часовой экспозиции при +4°С. Клетки суспендировали в растворе Хэнкса или в 10% растворе инфукола ГЭК, хорошо

удерживающем воду и способствующем сохранности суспензий. Состояние бластоцист н распределение введенных клеток оценивали через сутки после инъекции.

Культивирование эмбрионов мыши in vitro. Доимплантационные эмбрионы мыши культивировали со стадии ранней морулы (6-8 клеток; -2.5сут,) в течение 48 часов в среде Тб с БСА. Для опенки спонтанных нарушений раннего развития эмбрионы мышей различных линий культивировали в среде без добавок. Химическую индукцию нарушений раннего развития осуществляли добавлением в среду антибиотика блеоминина (1мкг/мл). Для изучения влияния на частоту спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития, в культуральную среду добавляли АсОДН, специфичные к мРНК проапоптотического гена Нгк мыши. Воздействие АсОДН, специфичных к мРНК генов HRK, FASL и ВАХ человека, оценивали на эмбрионах мышей С57В16/СВА, подсчитывая долю эмбрионов с нормальной морфологией и долю бластоцист с хэтчингом от общего числа бластоцист. Все олигонуклeonщные последовательности добавляли в среду в концентрации 0,1нмоль/мл, подобранной ранее в нашей лаборатории [Захарова, 2006].

Трансплантация эмбрионов мыши н анализ постнмплантапионнмх стадий развитии. Эмбрионы мышей C57BI6/DBA на стадии бластоцисты после 48 часов культивирования с добавлением АсОДН, специфичных к мРНК генов человека HRK, FASL и ВАХ (опытные группы) или без добавок (контрольные группы) трансплантировали псевдобеременным самкам белых беспородных мышей в количестве не более 7 эмбрионов в 1 рог матки. На 17.5 и 18.5сут. самок умерщвляли дислокацией шейных позвонков. По разности между количеством желтых тел и числом мест имплантации оценивали индекс имплантации эмбрнонов, отмечали количество нормальных плодов и исследовали их состояние, У плодов выявляли аномалии внутренних органов и оценивали нарушения формирования скелета по стандартной методике [Neubert el ai, 1977J. Часть оперированных самок были оставлены до родов, в дальнейшем у полученных мышат оценивали поведенческие и репродуктивные показатели.

Оценка поведенческих показателей. Поведение животных исследовали параллельно в трех группах: (1) опытная группа - животные, полученные после трансплантации эмбрионов, которые культивировали в среде с добавлением АсОДН, специфичных к мРНК генов HRK и FASL человека, (2) контрольная

группа - животные, полученные после трансплантации эмбрионов, которые культивировали в среде без добавок, (3) интактный контроль. Тестирование проводили в течение б дней на базе лаборатории физиологии и генетики поведения кафедры высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ им М.В.Ломоносова под руководством д.б.н. И.И.Полетаевой. Общий уровень активности, исследовательского поведения, поведения страха-тревоги и склонность к депрессии оценивали в четырех тестах: "открытое поле", "скользкая воронка", "стартл-реакция" и в закрытом крестообразном лабиринте.

Эксперименты в культуре in vifro на клетках человека были выполнены на базе лаборатории новых клеточных технологий Института реабилитации и клеточных технологий им, А.Я.Фриденштейна под руководством к.б.н. И.Н.Сабуриной. В культурах СЮКТ на пятом пассаже визуально по количеству клеток с липидными гранулами в течение пяти дней оценивали спонтанную адилогенную дифференцировку. Параллельно ставили следующие серии культивирования: (I) культивирование в ростовой среде без добавок, (2) культивирование в ростовой среде с добавлением гепарин-зависимого фактора роста bFGF (2нг/мл), (3) культивирование в ростовой среде с добавлением bFGF (2нг/мл) и н ем оди фицн рован ных АсОДН, специфичных к мРНК гена PPARy человека (1 нмоль/мл).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTIC А 6.0 и SPSS 11.5. С использованием критериев Шапиро-Вилка и Пирсона были проверены гипотезы о нормальности распределений исследуемых показателей. При сравнении параметров, имевших нормальное распределение, использовали t-тест для независимых выборок в предположении неравных дисперсий или однофакторный дисперсионный анализ с последующим применением метода множественных сравнений. При сравнении параметров, имевших ненормальное распределение, использовали критерий Манна-Уитни или критерий Крускалла-Уоллиса. Для анализа таблиц сопряженности 2x2 применяли либо точный двусторонний критерий Фишера, либо критерий X1 с поправкой на непрерывность Йейтса. Для выявления временных изменений использовали непараметрический критерий Фридмана. С использованием бинарной логистической регрессионной модели вычисляли отношение шансов наличия

определенного признака в двух сравниваемых группах. Критический уровень значимости для всех статистических критериев принимали равным 0,05.

результаты исследований и их обсуждение

Спонтанные нарушения раннего развития v мышей линий SAM. У мышей линий SAM с укороченной средней продолжительностью жизни отмечено снижение плодовитости [Miyamoto е/ а!, ¡995; Semenova et at., 2001]. Мы исследовали состояние доимплантационных эмбрионов мышей линии SAMPI на разных сроках развития (1.5, 2.5 и 3.5сут,), охарактеризовав спектр генетически обусловленных нарушений раннего развития. Были обнаружены следующие формы аномалий: фрагментация и дегенерация (в течение всего до им плантационного периода), остановки развития в период дробления и нарушения компактизации (с 2.5сут.), нарушения кавитации (с 3.5 сут.), а также отставания в развитии (рис. 2),

Рис.2, Морфология эмбрионов мышей линии SAMP1 in vivo на стадиях 1.5 (Л, Б,Д), 2.5 (В, 3, И) и 3.5 (Г, Е, Ж, К-М) суток развития

(■¡орчаль/ные эмбтюны: 2-ух (.А): 4-ех меточные (Е); морула (В); бластоциста (Г). Нарушения раннего развития: остановки развития в период дробления (Д, Е) с фрагментацией бластомеров (Д); дегенерация (Ж): аномалии компактизации — два центра компактизации (3, обозначены стрелками); кампактизация из малого числа клеток (И); бластоциста с метками, не участвовавшими в процессе компактизации (отмечены стрелкой. К}; аномалии кавитации • бластоциста с мачым числом меток в трофэктодерме (Л); бластоциста с двумя полостями (обозначены звездочками. М).

Стадии 1.5 и 2.5 сут. не различались по числу полученных от одного животного эмбрионов, а также по числу нормальных и аномальных эмбрионов (рис. 3). На 3.5сут., по сравнению с 1.5сут., нарушения были зарегистрированы в большем числе случаев (р<0,000). В течение всего доимплантационкого периода развития у мышей линии 5АМР1 примерно треть эмбрионов фрагментировалась и дегенерировала (рис. 3). На 3.5сут. по сравнению с 2.5сут. было обнаружено увеличение числа эмбрионов с остановками развития в период дробления (р<0,000). Данная особенность, вероятно, связана с накоплением ошибок при прохождении клеточных циклов, которые в бластомерах идут быстрее, чем в соматических клетках [Неуег ег о/., 2000].

/. 5 суток развития 2.5 суток развития 3.5 суток развития

П /г

U нормальные эмбрионы

Q эмбрионы, отстающие в развитии

В эмбрионы с фрагментацией

О эмбрионы с нарушениями компактизации

В дегенерирующие змбрионы

_ эмбрионы, остановившиеся в Q эмбрионы с нарушениями кавитации развитии в период дробления

Рис. X Распределение эмбрионов у самок мышей линии SAMP1 по морфологическим группам * доимплантационный период развития

В процессе компактизации у SAMP1 были отмечены следующие нарушения: компактизация не из 8-16 (норма), а из 4-5 клеток (рис. 2, И); появление нескольких центров компактизация (рис. 2, 3); компактизация, в которой не участвовала часть бластомеров (рис. 2, К). Аномалии в процессе кавитации были связаны с отсутствием внутренней клеточной массы (ВКМ), небольшим (1-3) числом клеток в трофэкгодерме (рис. 2, Л), формированием нескольких полостей (рис. 2, М), образованием бластоцист из небольшого числа клеток с исключением и оттеснением на периферию отдельных бластомеров (рис. 2, К).

Цветная вставка 1

Л

; ■ е

Рис. 4. Морфология ядер ранних эмбрионов мышей линии ЗАМР1 после окрашивания бис~беюимидом (красителем Хехст 33258) Интерфазные и метафазное (звездочка) ядра в бластоцисте (А, Б); сперматозоиды на поверхности блестящей оболочки морулы (В, Г); ядра с пристеночной конденсацией хроматина в бластомере (стрелка) мураяьной трофэктодермы бяастоцисты (Я, Е); дегенерирующее редукционное тельце с пшнотическим ядром (стрелка) (Ж, 3)

Рис. 6. Нарушения компактизации и кавитации после культивирования с блеомицином эмбрионов мышей линий ICR (А-3) и SAMP1 (И-М)

Бяастоцисты с кавитацией из малого числа клеток (А, В, Ж, И, К). красителем типа LIVE/DEAD окрашены отдельные погибшие клетки, не участвовавшие в компактизации (Б, Г, 3); звездочками отмечены живые клетки, не участвующие в развитии и находящиеся в полости эмбриона (Ж, К); бяастоциста с двумя ВКМ (Л, стрелки); бластоциста с двумя полостями (звездочки. М); эмбрион с нарушением компактизации и кавитацией единичных бластомеров (Д, Е)

Цветная «ставка 2

1) вариант:

клетки не вошли в состав бластоиисты

2) вариант; 3) вариант;

клетки в трофэктодер.че клетки в трофэктодерме и В КМ

блзстоцисты бластоцнсты

Рис. 8. Распределение клеток человека (красным) в бластоцистах мыши через 24 часа после инъекции; ВКМ - внутренняя клеточная масса

Пр*twrtrttta к 0.9S «нмту*!» Л«» уг^мг.ч

Рис. 9. Бластоцисты мыши через 24 часа после инъекции свежем суспензии МСК человека в растворе Хзнкса

Бластоцисты (А); инъецированные клетки и их потомки окрашены витальным флуоресцентным красителем бис-бензимидом - Хехст SS2SS (В); лишь некоторые инъецированные клетки окрашены красителем кита LIVE/DEAD, то есть погибли (В); у бластоцисты, отмеченной звездочкой, инъецированные клетки не окрашены просителем кита LIVE/DEAD, они сохранили .жизнеспособность (В)

Рис. 10. Динамика изменения количества адипоцитов в течение 120 часов культивирования стромальных меток из подкожной жировой ткани в среде без добавок (1), с добавлением bFGF (2), или с добавлением bFGF и АсОДН, специфичных к мРНКгена РГАКуО). Культуры пассировали в начале эксперимента (0 часов) и через 72 часа

2-1 ч*с* 48 час« 72 чип

Последнее может быть связано с отставанием исключенных из развития бластомеров по фазам клеточного цикла. В отдельных клетках муральной трофэктодермы нормальных бластоцист были выявлены ядра с пристеночной конденсацией хроматина (рис. 4; цветная вставка I). Подобные особенности отмечены и в ранних эмбрионах человека [Hardy et al, 2003], что указывает на сходство генетически обусловленных нарушений раннего развития у мышей линии SAMP1 и аномалий раннего развития человека.

Оценка функциональной значимости выявленных нарушений была произведена путем сопоставления общего количества аномальных эмбрионов, обнаруженных у мышей на стадиях 1.5, 2.5, 3.5сут. развития и до им плантационной гибели эмбрионов, определенной на стадии 18.5сут. Только на стадии 3.5сут. количество эмбрионов с нарушениями развития превышало количество эмбрионов, погибших в доимплантационный период (р<0,000). По-видимому, часть эмбрионов, попавших согласно нашей классификации в группу «аномалии развития», способна имплантироваться и развиваться дальше. Отставание по стадии и нарушения компактизации могут не влиять на формирование полноценных бластоцист [Bevilacqua et al., 1989].

При проведении сравнения раннего развития у мышей линий SAM (SAMP1 и SAMR1), ICR и гибридов независимо от линейных особенностей, на 2.5сут. были обнаружены одинаковые виды аномалий. В обшей структуре аномалий развития во всех линиях преобладала дегенерация. Между линией ICR и гибридами не было выявлено различий в количественных характеристиках полученных эмбрионов, нормальных и аномальных (рис. 5). Это позволило произвести дальнейший анализ эмбрионов линий SAM, используя ICR в качестве контроля. Самки мышей линий SAMP1 и ICR не различались по общему количеству эмбрионов и по количеству нормальных эмбрионов, но число аномальных эмбрионов у самок SAMP1 и SAMR1 было повышено (р<0,005 и р<0,001, сравнение с ICR). Самки SAM не отличались от ICR по количеству эмбрионов, остановившихся в период дробления и фрагментирующихся эмбрионов, но у них было увеличено количество дегенерирующих эмбрионов (р<0,012 - SAMP1; р<0,039 - SAMR1). После культивирования in vitro у эмбрионов всех проанализированных линий мышей были выявлены все виды нарушений развития, обнаруженные in vivo.

Таким образом, для мышей линий SAM характерен генетически обусловленный высокий уровень нарушений развития эмбрионов в

доимплантационный период, как in v/vo. так и после культивирования in vitro. Нарушения компактизации, обнаруженные у мышей линии SAMP1 in vivo и после культивирования in vitro полностью соответствуют одной из систем оценки качества эмбрионов человека [Atikani et al., 2000]. Эмбрионы мышей линий SAM могут быть использованы, как модель нарушений развития эмбрионов человека в области вспомогательных репродуктивных технологий.

SAMPÍ

2.1%

21,3%

5.4%

SAMR1

12,3%

36,7%

1,2%

ICR

0,7%-

6,2% _

0,5%

В ALB/DBA

13,6%

46,6%

□ нормальные эмбрионы

ib эмбрионы с фрагментацией

Щ дегенерирующие эмбрионы

Q эмбрионы, остановившиеся в развитии е период дробления

64.2%

92,5%

Рис. S. Распределение эмбрионов у самок мышей разных линий по морфологическим группам на 2.5 сутки развития in vivo

Нарушения раннего эмбрионального развития v мышей разных линии in vitro при прояпоптотическом воздействии. Эмбрионы мышей с изначально высоким (SAMP1) и низким (ICR, C57B16/DBA) уровнями нарушений раннего развития культивировали in vitro в среде без добавок (контроль) и с добавлением антибиотика блеомицина (опыт). Блеомицин обладает выраженным цитотоксическим действием, связанным с разрушением ДНК и индукцией апоптотической гибели клеток [Wingard et ai., 199}]. В опыте как у эмбрионов мышей SAMP1, так и у ICR и гибридов наблюдали описанные выше варианты аномалий процессов компактизации и кавитации, отмечали гибель исключенных из развития клеток (рис. б; цветная вставка 1). Независимо от линии мышей добавление блеомицина увеличивало количество нарушений

развития, а доля нормальных эмбрионов уменьшалась (рис. 7). Однако в спектре аномалий у SAMP1 преобладали аномалии процессов компактизаиии и кавитации (р<0,008 и р<0,000, сравнение с контролем), у ICR возрастало количество отстающих в развитии и дегенерирующих эмбрионов (р<0,019 и р<0,009, сравнение с контролем), у C57B16/DBA увеличивались нарушения гсомпактнзацни и дегенерация (р<0,001 и р<0,019, сравнение с контролем). Можно предположить, что при воздействии проапоптотического агента на эмбрионы линии мышей с исходно высоким уровнем генетических аномалий (SAMPI) нарушения развития в основном связанны с аномалиями морфогенетических процессов. А в случае воздействия проапоптотического агента на эмбрионы мышей с нормальными репродуктивными показателями гибель эмбрионов преимущественно связана с цитотоксическим действием блеомицина.

SAMPI

КОНТРОЛЬ ICR

1,5*

С5ШШВА В.0%

5.7%

23.9% I

20,0%

24,0%

13,3%

5.3%

26,0%

8.0%

Рис. 7. Распределение эмбрионов мышей разных линий по морфологическим группам после культивирования без (контроль) и с блеомицином (опыт)

Раннее развитие после введения в бласгоцисты мыши низкоджЬФереннированных клеток человека. В данной работе для получения инъекционных химер были использованы суспензии нейральных прогениторных и стволовых клеток (НСК) н мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (МСК) человека. В целом, независимо от типа вводимых клеток через сутки после инъекции было отмечено три варианта их распределения в бластоцистах (рис. 8; цветная вставка 2). Инъекция в бласгоцисты мыши ксеногенных низ кодифференциро ванных клеток не влияла на жизнеспособность эмбрионов (рис. 9; цветная вставка 2). Включение инъецированных клеток в состав бластоцист зависело от типа клеток, а также от состава и условий хранения суспензий. Ни в одной из суспензий мы не обнаружили различий между МСК и НСК по частоте включения клеток только в состав трофэктодермы (вариант 2). При инъекции свежей суспензии клеток в растворе Хэнкса шанс включения в состав не только трофэктодермы, но и ВКМ (вариант 3) у МСК был в 5,09 раз больше, чем у НСК (р<0,035). Однако 24 часовая экспозиция суспензии при +4°С или использование 10% раствора инфукола ГЭК уравнивали шансы НСК и МСК, не влияя на МСК, но увеличивая вероятность попадания НСК в формирующийся зародыш. НСК в большей степени, чем МСК экспресснруют белки клеточной адгезии [Campos, 2004; Yti, Yanagisawa, 2006]. Раствор инфукола, используемый для клинической инфузии, снижает агрегацию тромбоцитов и эритроцитов, уменьшает высвобождение циркулирующих молекул адгезии [Гальдина. Горбачевский, 1998]. Возможно, в наших экспериментах применение 10% раствора инфукола и 24 часовая экспозиция при +4°С изменяли адгезивные свойства НСК, способствуя их дезагрегации и увеличивали вероятность встраивания этих клеток в состав ВКМ бластоцист.

Исследование эмбрионального и постнатального i i воздействия о.ттгонуклеотндных последовательностей, добавляемых в среду при культивирования in vitro. В молекулярной медицине для генной терапии широко используют антисмысловые олигодезоксинуклеотиды (АсОДН) [Зеленин и др., 1998; Kim et а}., 2005]. Мы исследовали АсОДН, специфичные к мРНК генов HRK, FASL, ВАХ человека, контролем служили параллельные культуры без олигонуклеотидных последовательностей. Ни в одной из серий экспериментов не было выявлено достоверных различий между опытными и соответствующими им контрольными группами по количеству эмбрионов,

достигших стадии бластоцисты и по количеству бластоцист, прошедших хэтчинг. После трансплантации эмбрионов псевдобеременным самкам между контрольной и опытными группами не было обнаружено различий в индексе беременности, индексе имплантации и постимплантационной смертности. На 17.5 и 18.5сут. в опытных группах (87 плодов) не было обнаружено аномалий в состоянии внутренних органов и скелета; опытная и контрольная группы не различались по кранио-каудальным размерам плодов, массе и диаметру плацент. На 17.5сут. масса плодов в опытной группе с добавлением АсОДН к мРНК генов HRK и FASL человека (0,78±0,18г) была больше, чем в контрольной группе (0,91±0,16г; р<0,047), но к 18.5сут. это различие исчезало. В дальнейшем был проведен анализ поведения мышат, полученных от суррогатных матерей после имплантации им эмбрионов опытной и контрольной групп. Мышата того же возраста, что и животные опытной и контрольной групп (2-3 месяца) составили группу цитатного контроля. Нарушений поведения ни в одной из групп не было выявлено. В целом, зарегистрированные показатели поведения мышей опытной и контрольных групп находились в пределах вариации величин, свойственных лабораторным мышам [Markina et at., 2001]. Животные опытной и контрольных групп не различались и по репродуктивным показателям.

Таким образом, результаты изучения последствий влияния АсОДН на ранние эмбрионы свидетельствовали об отсутствии немедленных и отсроченных токсических и тератогенных эффектов. Культивирование доимплантационных эмбрионов в среде с олигонуклеотидными последовательностями в дальнейшем не влияет на поведенческие и репродуктивные показатели взрослых животных.

Влияние АсОДН, специфичных к мРНК гена PPARV. на адипогенную дибФеренииповку клеток, полученных из жировой ткани. Изучение эффектов антисмыслового ингибнрования in vitro обычно осуществляют с помощью модифицированных устойчивых, но токсичных фосфотиоатных производных АсОДН [Baerischi, ¡994]. Вопрос о возможности влияния ^модифицированных АсОДН на дифференцировочные процессы остается открытым. Мы оценили влияние немодифицированных АсОДН, специфичных к мРНК гена PPARy, на формирование адипоцитов в культуре стромальных клеток жировой ткани (СКЖТ). В полученной культуре СКЖТ клетки имели

фнбробластоподобныи фенотип, экс премировали СО! 05, С090 и не экспрессировали С045, С034, СОНЬ. При культивировании СКЖТ была отмечена адипогенная дифференцировка, причем, в случае добавления ЬРСР, доля адипоцитов была выше, чем в среде без фактора роста в течение всего периода наблюдения (р<0,0002); после пассирования доля адипоцитов, независимо от присутствия ЬРСР, кратковременно увеличивалась (рис 10, I, 2; цветная вставка 2). Для подавления адипогенной дифференцировки в культурах СКЖТ к ростовой среде каждые 24 часа добавляли АсОДН, специфичные к мРНК гена РРАКу. Ген РРАКу кодирует один из ключевых транскрипционных факторов адипогенеза, регулирующий начальные этапы дифференцировки преадипоцитов [С^о'и-е & а1„ 1998; РЬус! е( а!., 2006]. Через сутки после начала эксперимента доля адипоцитов в среде с ЬРйР превышала долю адипоцитов в среде без добавок (р<0,000). Добавление АсОДН в присутствии ЬРСР позволило уменьшить число адипоцитов (р<0,002, сравнение со средой с ЬРОР), уравняв их с числом адипоцитов в среде без добавок. Наблюдение за динамикой изменения адипоцитов в течение 5 суток показало, что доля адипоцитов колебалась в среде без добавок (р<0,000) и в среде с ЬРСР (р<0,000), а под действием АсОДН к мРНК гена РРАИу этот показатель стабилизировался (рис. 10; цветная вставка 2).

Считается, что СКЖТ, обладающие способностью дифференцироваться в различные производные, в том числе и в адипоциты, являются перспективными кандидатами для аутологических трансплантаций [Трактуев и др., 2006]. Выявленное влияние специфичных немодифицированных АсОДН на уровень адипогенной дифференцировки в культуре ¡п \Шо (снижение и поддержание на низком уровне количества жировых клеток) расширяет возможность использования этих соединений в клеточной терапии.

Влияние АсОДН. специфичных к мРНК гена Нгк мыши, на динамику спонтанных и индуцированных нарушений раннего развития. Последствия антисмыслового ингибирования проапоптотического гена Нгк были изучены с использованием моделей, для которых ранее нами был выявлен широкий спектр нарушений раннего развития - спонтанных или индуцированных. Моделью спонтанных нарушений явились мыши линии ЭАМР!, индуцированные нарушения провоцировали добавлением блеомицина. Добавление в культуральную среду АсОДН, специфичных к мРНК гена Нгк, не

повлияло на спектр и частоту генетически обусловленных нарушений раннего развития у мышей линии SAMP1. Однако в серии с добавлением блеомицина и с дополнительной добавкой АсОДН к мРНК Hrk доля бластоцнст от общего числа эмбрионов составила 11/70 (15,7%), шесть из них прошли хэтчинг, в то время как в среде с антибиотиком без АсОДН бластоцнст было только 6/75 (8,0%), и ни одна не прошла хэтчинг (р<0,043). Итак, при химически индуцированных нарушениях доим плантационного развития добавление АсОДН к мРНК гена Hrk не влияло на количество нарушений, но улучшало качество выживших эмбрионов - увеличивало хэтчинг бластоцнст.

заключение

Для мышей линии SAMPJ, склонной к ускоренному старению, характерен высокий уровень нарушений раннего развития. Наряду с фрагментирующимися и дегенерирующими эмбрионами у этой линии in v/vo и in vitro в значительном количестве присутствуют эмбрионы, отстающие по стадии и остановившиеся в развитии, эмбрионы с нарушениями процессов компактизации и кавитации. Эти генетически обусловленные нарушения не поддавались коррекции с помощью АсОДН, специфичных к мРНК проапоптотического гена Hrk, Блеомицин - агент, индуцирующий апоптотическую гибель клеток, у мышей SAMP1 увеличивал количество эмбрионов с нарушениями компактизации и кавитации, не влияя на число дегенерировавших эмбрионов. Как правило, ошибки в раннем развитии вызывают гибель бластомеров или всего эмбриона, после воздействия блеомицина на эмбрионы мышей с нормальными репродуктивными показателями (ICR, C57B16/DBA) отмечалось увеличение числа дегенерировавших эмбрионов. Возможно, у мышей линии SAMP1 нарушены механизмы естественной элиминации поврежденных бластомеров и эмбрионов. При исследовании раннего развития, проблемы, связанные с изучением взаимного влияния клеток, можно оценить в условиях создания химерных организмов. Работы по инъекции ксеногенных клеток в полость бластоцисты мыши немногочисленны, полученные результаты противоречивы {Макси-човский it др., ¡998; Harder et а!., 2002; Koestenbauer et at, 2007]. Мы показали, что инъекция в бластоцисты мыши ксеногенных низкодифференцированных клеток (НСК и МСК человека) не влияла на

жизнеспособность эмбрионов. Включение инъецированных клеток в бластоцисты мыши зависело от типа клеток, а также от условий хранения и состава суспензий. Использование 10% раствора инфукола или 24 часовая экспозиция суспензии при +4°С увеличивали вероятность попадания НСК в формирующийся зародыш (ВКМ бластоцист), уравнивая их по этому показателю с МСК, возможно за счет изменения адгезивных свойств.

Широкую возможность корректирующего не затрагивающего целостность генома влияния на клетки предоставляют АсОДН [Зеленин и др., 1998; Kit г reck, 2003]. В проведенном комплексном исследовании было показано, что немодифицированные олигонуклеотиды не обладают эмбриотоксическим и отсроченным тератогенным эффектами, в дальнейшем не влияют на поведение и репродукцию взрослых животных. В культуре in vitro на модели адипогенной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани было продемонстрировано влияние АсОДН на адипогенез. Полученный результат (уменьшение количества адипоцитов) показывает специфичность влияния немодифицированных АсОДН на дифференцировку клеток в культуре. Немодифицированные АсОДН, специфичные к мРНК проапоптотического гена Hrk, улучшали качество эмбрионов мыши с индуцированными блеомицином нарушениями раннего развития. По-видимому, частичное подавление трансляции белка barakiri сохраняло целостность мембран митохондрий, препятствовало высвобождению проапоптотических факторов и предохраняло эмбрионы от токсического воздействия блеомицина.

Положительное действие АсОДН, специфичных к мРНК проапоптотических генов, на раннее развитие эмбрионов in vitro получило подтверждение в области вспомогательных репродуктивных технологий. Так АсОДН, специфичные к мРНК проапоптотических генов HRK и FASL человека, улучшают качество эмбрионов человека и увеличивают частоту наступления беременности после культивирования ооцитов и эмбрионов в среде с добавлением АсОДН к мРНК генов HRK и FASL [Захарова, 2006; Семенова и др. 2006; Zaletov et at., 2006]. Разработанная композиция для добавления в среду культивирования ооцитов и эмбрионов (патенты РФ Кг 2281777 и № 2281778 от 20 августа 2006) позволяет улучшать качество ранних эмбрионов.

22

выводы

1. Родственные линии мышей SAMP1 и SAMR1 характеризуются высоким уровнем нарушений раннего эмбрионального развития как in vivo, так и при культивировании in vitro. Это выражается в аномалиях процессов компактизации и кавитации, отставаниях по стадии и остановках развития, фрагментации и дегенерации.

2. При воздействии проапоптотического агента блеомицина на эмбрионы линии мышей с исходно высоким уровнем генетических аномалий (SAMP1) нарушения развития в основном связаны с нарушениями процессов компактизации и кавитации. При воздействии на эмбрионы мышей с нормальными репродуктивными показателями (ICR, C57BI6/DBA) гибель эмбрионов преимущественно связана с увеличением числа дегенерирующих эмбрионов.

3. Инъекция в бластоцисты мыши ксеногенных клеток (ИСК и МСК человека) не влияет на жизнеспособность эмбрионов. Использование 10% раствора инфукола ГЭК или 24 часовая экспозиция суспензии при +4°С приводят к возрастанию числа случаев встраивания донорских НСК во внутреннюю клеточную массу бластоцисты.

4. Немодифицированные АсОДН, специфичные к мРНК генов HRK, FASL и ВАХ человека, в концентрации 0,1нмоль/мл не обладают токсическим влиянием на эмбрионы и отсроченным тератогенным воздействием на плоды мыши, и в дальнейшем не влияют на поведенческие и репродуктивные показатели взрослых животных.

5. Воздействие немодифицированных АсОДН, специфичных к мРНК гена PPARy, на культуру стромальных клеток жировой ткани человека приводит к уменьшению доли аднпоцитов и стабилизации этого показателя после пассирования культуры,

6. Немодифицированные АсОДН, специфичные к мРНК проапоптотического гена Hrk, улучшают качество выживших эмбрионов мыши с индуцированными блеомицином нарушениями раннего развития.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кошелева Н.В. Нарушения доим плантационного эмбрионального развития у мышей линии SAMP1. // Материалы V Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2002, С, 130-131.

2. Захарова Е.Е., Семенова М.Л., Есипов Д.С, Кошелева Н.В,. Козлова А.Ю, Голиченков В.А. Возможности использования эмбриональной модели для изучения модуляции генной экспрессии методом антисмыслового ингибирования. // Приложение к журналу «Открытое образование» «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». 2003, С.375-377.

3. Семенова М.Л., Захарова Е.Е., Есипов Д.С., Кошелев^ H.ß.. Козлова А.Ю., Ходаков Д.А., Голиченков В.А. Антисмысловые олигонуклеотиды как действующие агенты для эмбриональной генной терапии. // Сборник статей "Труды Международного биотехнологического центра МГУ". 2003. С. 17-22.

4. Кошелева Н.В.. Захарова Е,Е„ Семенова М.Л. Особенности нарушений раннего эмбрионального развития у мышей линии SAMP1. // Материалы Всероссийской научной конференции "Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы". Москва, 2003. С.63-64.

5. Захарова Е.Е., Кошелева Н.В.. Есипов Д.С, Козлова А.Ю, Ходаков Д.А., Семенова М.Л. Введение in utero тиомодифицированных антисмысловых олигонуклеотидов, специфических к мРНК гена Sry мыши. И Материалы Всероссийской научной конференции "Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы". Москва. 2003. С.221-222.

6. Кошелева Н.В,. Захарова Е.Е., Семенова М.Л. Влияние прерывистой гипоксической тренировки на эмбриогенез мышей линии SAMP1. // Тезисы докладов III Всероссийской конференции с международным участием "Механизмы функционирования висцеральных систем". Санкт-Петербург. 2003. С. 159-160.

7. Захарова Е.Е., Козлова А.Ю., Кошелева Н.В.. Есипов Д.С, Семенова М,Л. Антисмысловое ингибирование генной экспрессии в эмбриональный период развития на модели формирования мужской половой системы. // Материалы VIII Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2004. С.112.

8. Кошелева Н.В.. Комарова М.Н. Трансплантация стволовых клеток, полученных из костного мозга человека, в полость бластоцисты мыши. // Биотехнология, экология, охрана окружающей среды. Сборник научных

трудов под ред. А,П. Садчикова, С.В. Котелевцева Москва: Изд-во ООО «Графикон-принт». 2005. С. 136-139.

9. Кошелева Н.В.. Захарова Е.Е., Семенова М.Л. Химерные эмбрионы как модель для исследования потенций стволовых и прогениторных клеток. // Материалы Всероссийской конференции молодых исследователей "Физиология и медицина", Санкт-Петербург, 2005. С.58.

10. Кошелева Н.В.. Сабурина И.Н., Комарова М.Н., Семенова М.Л. Влияние инъекционной среды на результаты трансплантации клеток в полость бластоцисты. // Материалы конференции "Биология стволовых клеток; фундаментальные аспекты", Москва. 2005. С.39-40.

11.Zakharova Е., Semenova М., Kosheleva N.. Zaeva V., Zaletov S. Using of antisense oligonucleotides for modulation of gene expression in early human embryo. Abstracts of the Bioscience 2005 - From genes to systems, SECC, Glasgow UK. 2005. P. 190.

12. Захарова E.E., Семенова М.Л., Кошелева H.B. «Дети из пробирки»: экстракорпоральное оплодотворение // Биология в школе. 2005. №б. С.10-15.

13. Семенова М.Л., Захарова Е.Е., Кошелева Н.В.. Заева В.В., Залетов С.Ю. Антисмысловые олигонуклеотиды как действующие агенты для улучшения качества эмбрионов человека при культивировании in vitro, li Проблемы репродукции. 2006. № 1. С.46-52.

14. Zaletov S„ Zaeva V., Semenova M„ Zakharova E., Kosheleva N. An antisense approach can improve pregnancy rate. // Abstracts of the 22th Annual Meeting of the ESHRE. Prague Czech Republic. 2006. P.122.

15. Kosheleva N.V.. Semenova M.L. Preimplantation development of SAMP1 mice and the influence of intermittent hypoxic training on SAMP1 embryogenesis. //Ann. reports on SAM studies. 2006. V.21. P.49-50.

16. Семенова М.Л., Захарова E.E., Кошелева H.B.. Залетов С.Ю., Заева В,В Способ управления качеством ооцитов и композиция для добавления в среду культивирования ооцитов. // Патент РФ на изобретение № 2281777 от 20 августа 2006.

П.Семенова М.Л., Захарова Е.Е., Кошелева Н.В.. Залетов С.Ю., Заева В.В Способ культивирования зиготы и/или эмбриона и композиция для добавления в среду культивирования зигот и/или эмбрионов. // Патент РФ на изобретение № 22S1778 от 20 августа 2006.

Заказ № 72/03/07 Подписано в печать 13.03.2007 Тираж 100 экз. усл. пл. 1,5

,'^''.4 ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 '■'к^У; www.cfr.ru ; е-таИ:info@cfr.ru