Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ ингибирования репродукции вируса лейкоза коров различными видами комплементарно-адресованных полинуклеотидов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ ингибирования репродукции вируса лейкоза коров различными видами комплементарно-адресованных полинуклеотидов"

ргб од

на правах рукописи

ГЕРЗЙЛОВА Александра Георгиевна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИНГИБИРОВАНИЯ РЕПРОДПВДИ

ШРУСА ЛЕЙКОЗА КОРОВ РАЗЛИЧНЫМИ ВИДАМИ КОМПЛЕМЕНТАРНО-АДРЕСОВАННЫХ ПОЛИНШЕОТИДОВ.

(специальность 03. 00. 03. - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно - исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Научный руководитель:

Научный консультант: Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, чл.-корр. РАСХН Тихоненко Т.И.

кандидат биологических наук, Борисенко A.C. доктор биологических наук, Каверин Н-В-

кандидат биологических наук Крикун В.А.

Ведущая организация - Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится " . "_1995г.

в_час. на заседании специализированного совета Д 020.40.01

при ВНИИ Сеяьскохозяйтвенной Биотехнологии РАСХН. (127550,

Ь5осква, ул. Тимирязевская, д.42.)

С диссертацией мохно ознакомится сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " '

-7Г-

в библиотеке ВНИИ

1995г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

iu< С.А.Меликова.

ОБДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Исследования механизмов функционирования плазмидных генов привели к открытию ряда природных $ибополинуклеотидов, способных регулировать механизмы трансляции-транскрипции в клетке. По аналогии с такими природными молекулами - были получены и искусственные

комплементарно-адресованные полинуклеотиды, разделяемые на три основных вида по механизму взаимодействия с молекулой-мишеныэ. Это так называемые, антисмысловые РНК (асРНК), олигодезокинуклеотиды (олигоДН) и' рибозимы. Введение генов антисмысловых рибополинунлеотидов в живые клетки осуществляется с помощью векторов различной природы (плазмиды, ретро- или аденовирусные векторы), программирующих синтез асРНК или рибозимов, как методом трансфекции в клетки в опытах in vitro, так и с помощью микроиньекции в зародышевые клетки в опытах in vivo с получением трансгенных животных. В настоящее время показано ингибирование репродукции различных вирусов в "культурах клеток с помощью генов асРНК, в частности, RSV,- BLV, Adh5, HIV-I, PPV, HTLV-I и т.п. Кроме применения асРНК, другим быстро развивающимся подходом к подавлению вирусной инфекции in vitro, а главным образом, in vivo является применение олигоДН. Впервые специфическое ингибирование процесса трансляции in vitro синтетическими олигоДН было описано для белка, транслируемого с мРНК вируса саркомы Рауса (Stephenson, Zameonlk, 1978). С тех пор олигоДН широко использовались в различных областях молекулярной генетики, а также разрабатывалось их применение в качестве терапевтических агентов нового поколения. В частности, ингибируший эффект олигоДН в культуре клеток

продемонстрирован для вируса Сендай, VSV, EMV, HSV-Iвируса хрипла, HIV-I и т.п. Однако, существенным недостатком олигоДН является быстрая деградация немодифицированных ДНК-молекул в средах, содержащих сыворотку крови или в кровяном русле животных, что ограничивает возможности широкого применения олигоДН. С целью увеличения эффективности действия олигоДН в клетках культуры и In vivo, разрабатываются различные формы их химической модификации, однако, механизм действия модифицированных олигоДН более сложен и включает также взаимодействие модифицированных молекул с клеточными белками (Wagner R.W., .1995, Stein С.А., 1995), обуславливая тем самым значительную неспецифическую, дозозависимую активность олигоДН.

Обнаружение каталитических свойств у полирибонуклеотвдов, получивших впоследствии название "рибозимы", дало новый толчок к поиску подходов в области генной терапии вирусных болезней, в частности ретровирусных заболеваний человека и животных. Появилось большое число работ по применению рибозимов для подавления инфекции, вызванной' HIV-I. Показано эффективное подавление вирусной инфекции рибозимами направленными -против участков вирусного генома, кодирующих трансактиваторные элементы таких вирусов, как HIV-I, HTLV-I, BLV. Несмотря на значительный прогресс в области антисенс- и рибозим-стратегии, ряд аспектов проблемы остается недостаточно изученным. Так например, поиск новых промоторных элементов, обеспечивающих высокую копийность антисшсловых транскриптов, а также возможность тканеспецифической экспрессии антивирусных генов не потерял своей актуальности. Интенсивно исследуются подходы , к осуществлению адресной доставки (введения) антивирусных и противооухолевых средств непосредственно к больным клеткам. Значительный. интерес представляет также и

сравнительный анализ ингибирупцего эффекта различит видов комплементарно-адресованных полинуклеотвдов (КАП) на одной вирусной модели. Широкие возможности для исследования влияния КАП на репродукцию вирусов предоставляют клеточные культуры, in vitro моделирующие хроническую вирусную инфекцию. Подобные клеточные системы позволяют на ранних стадиях исследований оценить эффективность того или иного агента, не прибегая к дорогостоящим исследованиям на животных. Создание различных видов комплементарно-адресованных полинуклеотидов и испытание их антивирусного действия, является одним из направлений исследований, ведущихся в лаборатории генной инженерии вирусов животных ВНИИ СБ под руководством профессора, чл. корр. ВАСХНИЛ, Т.И. Тихоненко.

Цели и задачи исследования: Целью настоящей работы являлось сравнение ингибирупцего • действия созданного рибозимного гена, химически синтезированных олигодезоксинуклеотидов (олигоДН), и генов антисмысловых РНК (асРНК) к вирусу лейкоза коров (ВЛК) в клеточной культуре, хронически инфицированной ВЛК.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Создать генно-инженерную конструкцию несущую рибозимный ген под контролем вирусного промотора U3- области LTR-BLV, активируемого вирусными трансактиваторными белками и обеспечивающего эффективную экспрессию антивирусных генов в условиях ВЛК инфекции.

2. Синтезировать ряд немодифицированных олигодезоксинуклеотидов (олигоДН) к функционально-активным участкам R области генома ВПК.

3. Получить клеточные линии, стабнльно-трансфицированные генами асРНК и рибозима. ■

4. Провести сравнительный анализ ингибирунцего действия асРНК, олигоДН и рибозима в клеточных культурах, полупермиссивных для вируса лейкоза коров и моделирупцих хроническую вирусную инфекцию в условиях in vitro.

5. Сравнить метод анализа вирусной репродукции в клеточной линии FLK-BLV-SEAP с общепринятыми методами оценки репродукции ретровирусов по синцитийобразованию и активности обратной транскриптазы.

Научная новизна и практическая значимость: В настоящей работе впервые показана возможность подавления хронической ВЛК инфекции в культуре клеток генами асРНК и рибозима под контролем собственного вирусного промотора U3 области LTR-BLV. Первая часть работы посвящена созданию рибозимной конструкции под контролем промотора LTR-BLV и синтезу олигодезоксинуклеотидов, комплементарных функционально-активным участкам R области генома ВЛК. Вторая часть работы является исследованием эффективности антивирусного действия acPIffi, олигоДН и рибозима в линии клеток, хро!шчески-инфицированной ВЛК. Оценка- уровня вирусной репродукции проводилась по различным параметрам: по уровню синтеза маркерного гена '(в данном случае' по синтезу щелочной фосфатазы), чуствительного к вирусным трансактиваторным факторам BLV; по уровню вирусиндуцированного синцитийобразования при сокультивированш клеток-продуцентов ВЛК с клеточной линией CC8I; по уровню активности обратной транскриптазы. Максимальной иш лбирующей активностью в культуре, клеток обладали конструкции, содержащие ген асРНК к RU5 области генома ВЛК и рибозимный ген к R области области вирусного генома под контролем промотора U3 области LTR-BLV. Таким образом, показана возможность применения собственного вирусного,промотора ВЛК для эффективного подавления

хронической ВЛК инфекции в культуре клеток. Работа представляет не только научный, но и практический интерес так как дает возможность, применяя технологию получения трансгенных животных, получить линию с/х животных, устойчивых к заражению вирусом бычьего лейкоза.

Апробация работы: Результаты работы были доложены и обсуждены на расширенном заседании отдела генной инженерии ВНИИ Сельскохозяйственной Биотехнологии и на I Евро-Азиатском Симпозиуме по современным достижениям в ■биотехнологии (Анкара, октябрь 1995).

Объем и структура диссертации: Диссертационная работа состоит из введения, глав "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты", "Обсуждение результатов", выводов и списка литературы, включающего 178 библиографических ссылок. Работа изложена на 114 машинописных, страницах включая 8 таблиц и 9 рисунков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. .

В 1989 году Matt Cotten с сотр. впервые сравнил эффективность действия асРНК, асДНК и рибозима на snRNP Ц7-зависиыый процессинг гистоновой пре-мРНК в бесклеточной системе. Наиболее эффективно процессинг пре-мРНК гистона подавлялся полноразмерной асРНК, а наименее эффективными оказались рибозим и короткие (18 нт.) асДНК. Однако сами авторы объясняют слабую эффективность рибозимов и асДНК как недостатками самой бесклеточной системы, так и сложностью процессинга гистоновой пре-мРНК. Сравнительный анализ ингибирующего действия асРНК, олигоДН, рибозима и смысловых РНК на репродукцию вируса мышиного гепатита провели Mizutani и Hayashi с сотр. в 1993 году. Продемонстрировано, что синтез ас-транскриптов в клетке эффективно снижает репродукцию вируса в культуре клеток мыши по сравнению с олигоДН. Как показали исследования антивирусной активности асРНК и рибозима к вирусу бычьего лейкоза,проводившиеся в нашей лаборатории (Борисенко,А.С. с сотр. 1990, 1994; Зеливянский. C.B. с сотр. 1994), наиболее эффективны антивирусные полинуклеотиды, направленные против 5'-нетранслируемой области генома "BLV. Так асРНК к ШДЗ-региону генома BLV под контролем промотора TK-HSV-I и рибозим к этому же участку под контролем промотора CMV эффективно подавляли процесс однораундовой репликации ВПК в культуре клеток CC8I. Испытание ингибирупцего действия антисмысловых конструкций к R- и КЧБ-регионам генома BLV, синтез которых направляется промотором LTR-BLV в клеточной культуре CJJ8I при котрансфекции их с прогеномной ДНК BLV, показало высокую эффективность подобных конструкций (ингибирование репродукции вируса достигало 98%). Одним из основных критериев оценки противовирусного действия

различных антисмысловых конструкций являются эксперименты на культурах клеток, позволяющих in vitro моделировать процессы вирусной инфекции. Причем, чем более модельная клеточная система отражает реальные процессы течения вирусной инфекции in vivo, тем скорее можно ожидать, что противовирусный эффект исследуемых КАП, получений в экспериментах in vitro, может быть воспроизведен такжев условиях in vivo.

I. Получение рекомбинантной плазмиды для экспрессии рибозимной РНК под контролем LTR-BLV.

Одной из первых работ, посвященных исследованию антивирусного действия рибозимов была работа Sarver с сотр. (1990) в которой изучалось антивирусное действие рибозима направленного против участка gag-генэ IIIV-I и показано эффективное действие рибозима типа, "головка молотка", сконструированного согласно модели Haseloff- Gerlach. Именно такая модель рибозима, учитывая простоту вторичной структуры и небольшую протяженность такой конструкции, была выбрана нами для создания плазмидного гена, несущего рибозим под контролем промотора из U3 области LTR-BLV. Данные, полученные в нашей лаборатории, по ингибированию репродукции ВЛН в культуре клеток CC8I с помощью асРНК и рибозима к R- и RU5- области генома ВЛК (Борисенко с сотр. 1992; Зеливянский с сотр. 1994) демонстрируют высокую эффективность антисмысловых конструкций, направленных против 5'области генома ВЛК. Эффективность применения

промотора из U3 области LTR-BLV для ингибирования репродукции ВЛК

i

в культуре клеток CC8I была продемонстрирована в работе Борисенко с сотр. (1994) - синтез антисмысловых генов под контролем этого промотора практически полностью подавлял репродукцию вируса в культуре клеток CC8I даже при небольших весовых избытках

плазмвдной ДНК над вирусной прогеномной ДНК. Таким образом, учитывая ■ результаты предыдущих исследований, • была создана генно-инженерная конструкция, содеркащая рибозимную последовательность против R-региона генома ВПК под контролем промотора из U3 области LTR-BLV, как теоретически эффективная для подавления репродукции ВЖ в хронически инфицированной культуре клеток.

Фрагмент плазмиды pCMVR (Sall-Sall), содержащий рибозимную последовательность, фланкированную комплементарными участками к R-области LTR-BLV (351-368. н.п.), ген устойчивости к гигромицину В и сигнал полиаденилирования TK-HSV-I, обрабатывали нуклеазой из проростков золотистой фасоли (Mung Bean) с целью модифицирования сайта встраивания. Далее модифицированный фрагмент дополнительно гидролизовали рестриктазой Hindlll. Подученный фрагмент (Ecl136I-HindIII) длиной 3450 н.п. клонировали в векторную плазмиду pLT, содержащую участок EcoRI-SacI (7925-8426) прогенома ВЛК с вирусным промотором из U3 области, из которой предварительно был удален участок Sacl-Hindlll, содержащий сигнал полиаденилирования TK-HSV-I. Полученная плазмидная конструкция длиной 6964 н.п обозначенная как pLTRZ (Рис. I) содержит ген рибозима против R-области генома ВЛК под контролем промотора из U3 области LTR-BLV, а также ген устойчивости к гигромицину В под контролем промотора TK-HSV-I, в качестве возможного селективного маркера и сигнал полиаденилирования TK-HSV-I.

2. Синтез олигодезоксирибонуклеотвдов комплементарных различным участкам 5'области геномной РНК ВЛК.

Как уз:;е отмечалось, Б'-лидерная область генома ВЖ является наиболее подходящей мишенью для действия различных антисмысловых

полинуклеотидов. Учитывая, что как асРНК, так и рибозим, исследуемые в наших экспериментах, направлены к различным участкам 5'-области геномной РНК ВЛК, являющейся наиболее существенной для процесса репродукции вируса, мы синтезировали три различных олигодезоксинуклеотада (олигоДН), комплементарных функционально важным зонам этой же области геномной РНК вируса: олигоДН (CPS) комплементарный участку на границе U3 и R области (8391-8409), содержащей кэп-сайт вириошшх РНК; олигоДН (DSS) комплементарный 'донорному сайту сплайсинга для всех субгеномных мРНК (8480-8492), кодирующих env-бвлки и трансактиваторнне белки; олигоДН (RZS) комплементарный участку разрезания рибозимом (8571-8589) R-области. Также было синтезировано три рандомизированных олигонуклеотндных последовательности, не имеющих гомологии в геноме ВЛК, длиной 18 н. (Табл. I) (Данный раздел работы проводился совместно с с.н.с. отдела генной инженерш животных Карповым В.А.)

Направленность к участкам в геноме ВЛК различных видов комплементарно-адресованных полинуклеотидов (КАП), включая асРНК, олигодезоксинуклеотиды и рибозим, представлена на Рис. 2 *Таблица I Нуклеотидная последовательность олигоДН комплементарных различным участкам R-области генома ВЛК.

N Последовательность Индекс Комплементарный участок

генома вируса (координаты в геноме)

1. 5'-CGT GCT TGC СТТ АСС ТСА-3' DSS Донорный сайт сплайсинга

(8480-8492)

2. 5*-TGG TGC CGC TAA CCT CGA-3' CPS Сайт кэпирования мРНК

(8391-8409)

N Последовательность Индекс Комплементарный участок

генома вируса (координаты в геноме)

3. 5'-GGA GAT AGA GCT CGC GGT-3* RZS Участок расщепления

рибозимом .(8571-8589)

4. 5'-TAG TAG TCT ACC CAT TCA-3* 499 рандомизированная пос-ть

5. 5*-САС ТСС CGG CGT TGA AGA-3* 500 рандомизированная пос-ть

6. 5'-ATA GGT ААС ААС CCA AAG-3* 501 рандомизированная пос-ть

* Выбор нуклеотидных последовательностей проводился с использованием программы DNASIS (Hitachi).

3. Получение линий клеток БЧЖ-ВЬУ.содежащих гены асРНК и рибозима против 5'области геномной РНК ВЛК.

Методом котрансфекциц в линию клеток PLK-BLV вводились плазмидные гены как асРНК или рибозима, так и ген устойчивости к генетицину (G4I8) в составе плазмиды pSV2neo. Далее трансфицированные клетки выращивали на селективной среде с генетицином (G418,"Sigma") с целью получения отдельных клонов. Изолированные клоны клеток, устойчивых к генетицину, анализировали на наличие интегрированных в геном клетки генов асРНК или рибозима методом блоттинг-гибрвдизации. Для этогс* из клеточных популяций отбранных клонов выделяли хромосомную ДНК и анализировали ее методом блоттинг-гибридизации по Саузерну (Maniatis et al. 1982).

Рисунок I Схема плазмиды р1/Ш, содержащей рибозимную последовательность под контролем промотора из УЗ области ЬТИ-ВЬУ.

| £ Лм РИБОЗИМ

Ну-ген устойчивости к гпгромицину В

Рисунок N2. Направленность КАП к участкам 51 области

геномной РНК ВЛК.

Я

1Ш5

?! ' ' п ) НИ ! П > > и '■{ ' И И'! "'И Н'Л И

г I И И г I г | И 111 И - ^ г Ч'Н I И1 И И И-Н

И ! I ; м г Ц И ' ? < и 1 И н 1 е Н' п » I ( ? | } ! п

----------1. {■ Г.у £ г- 1 I { М М

САР

Эй

V РВБ

одн

<ь

Т

RZS

ас РНК(р1Л1)

ас РНК(рШ)

З'сссиса Ападасасса. 5' л с ж и в л с ев в л ли и а с с с А С ОТ

рибозим (Рида:)

В качестве зонда использовали меченный методом ник-трансляции SacI-EcoRI фрагмент плазмиды pLT, включающий промоторную область LTR-BLV, общую для всего семейства плазмид. Выделенную и очищенную хромосомную ДИК клонов FLK-BLV, предположительно несущих гены асРНК, гидролизовали рестриктазой PvuII для получения необходимых фрагментов, а в случае клонов с рибозимной плазмидной конструкцией, хромосомную ДНК гидролизовали рестриктазой EcoRI. В качестве положительного контроля использовали фрагмент PvuII-PvuII плазмиды pLR, а в качестве маркера плззмнду pLU, гидролизованную рестриктазой PvuII. Результаты блотт-гибридизационного анализа представлены на Рис. 3, где видны фрагменты, специфически гибридизупщеся с зондом (SacI-EcoRI фрагмент pLT) и соответствующие по подвижности PvuII-фрагментам плазмид pLU, pLT, pLR (500 н.п.), применявшемся для трансфекции линии FLK, а также фрагмент гибридизугщийся с этим же зондом и соответствующий по подвижности EcoRI-фрагменту плазмиды pLTRZ (850н.п.). Как показал денситометрический анализ радиоавтографов с калибровочными треками, трансфицированные плазмиды присутсвуют в полученных линиях в интегрированном состоянии и в количестве приблизительно 60-70 копий на клетку.

4. Репродукция вируса бычьего лейкоза в клеточных линиях FLK-BLV, стабильно трансфицированных генами асРНК.

Реакция вирусиндуцированного синцитийобразования при сокультивировании клеток-продуцентов вируса BLV с клетками CC8I применяется для тестирования интактного вируса лейкоза коров в крови больных животных (Ferrer, J.F., et al. 1981). Вирусиндуцированное синцптийобразование является критерием

Рисунок 3. Анализ ДНК из клеток РЬК-БЬУ, трансфицированных плазмвдами с генами асРНК и рибозима против 5'области геномной РНК ВЯК, методом блотт-гибридизацни по Саузерну.

500

¿23 4 5 6 7 8 9

I-фрагмент Бас1-ЕсоШ: плазмиды рЬТ(500 нукл,) (положительный контроль); 2, 3, 4, .5, 6,-линии БЪК-ВЬУ с генами асРНК 7-линия клеток РЪК-ВЬУ, трансфицированная пл'азмвдой рйШ1 (отрицательный контроль); .8, 9-линии клеток РЬК-ВЬУ с геном рибозима

цитопатического действия многих ретровирусов в культуре клеток которое характерно также и для ВПК. По-видимому, формирование синцитиев связано со взаимодействием поверхностного поверхностного гликопротеида (врбО) почкующегося вириона со специфическими рецепторами близлежащих клеток, что вызывает в конечном итоге слияние зараженных и незараженных клеток (ИоЬага.Б. а1. 1981). Линии клеток БЪК-ВЬУ, несущие гены антисмысловых РНК или рибозима в составе клеточного генома и полученные в результате селекции на среде с генетицином, а также линию клеток РЬК-ВИ-рАОЙ (227),

несущую плазмиду pAGR, содержащую ген асРНК к RU5 области под котролем TK-HSV-I промотора (предоставлена Пономаревой Т.И.), сокультивировали с клеточной линией CC8I по стандартной методике, подробно описанной выше. Уровень репродукции ВЛК в клеточной линии FLK-BLV оценивали в реакции вирусиндуцированного синцитийобразования, а также по уровню ревертазной активности в линиях клеток.(см.Таблицу 2, Рис. 4). Минимальное количество синцитиев было обнаружено в линии FLK-BLV, стабильно трансфицированной плазмидой pLTRZ несущей ген рибозима (ингибирование синцитийобразования достигает 81%) и в линии клеток, стабильно трансформированной плазмидой pLU несущей ген асРНК к RU5-peraoHy генома BLV (ингибирование синцитийобразования достигает 87%). Преимущество применения вирусного промотора U3 области LTR-BLV для транскрипции антисмысловых генов в условиях хронической ВЛК инфекции подтверждается также и результатами, полученными с плазмидой pAGR, содержащей ген асРНК направленный на тот же участок вирусного генома, что и в плазмвде pLR, но контролируемый промотором TK-HSV-I. В условиях модельной клеточной системы FLK-BLV ' этот плазмидный ген оказался малоэффективен. Уровень синцитийобразования в клеточной линии FLK-BLV-pAGR был снижен всего на 13% от уровня синцитийобразования в контрольной культуре. Промотор 'тимидинкиназы вируса герпеса (TK-HSV-I), являющийся промотором относительно "слабым" и не чуствительным к трансактиваторным белкам ВПК, не обеспечивает достаточного количества ас-транскриптов для эффективного подавления репродукции вируса в хронически инфицированной культуре клеток. В то же время уровень ингибирования репродукции вируса в линии клеток, несущей плазмиду pLT, был существенно выше, чем в линии клеток с плазмидой pAGR и составлял 73%. Как показано в работе Шаяхметова с сотр.

(1995) наличие в клетках свободных последовательностей ИЗ-области ЬТЙ-ВЬУ существенно снижает транскрипционную активность интактного вирусного промотора и таким образом влияет на репродукцию вируса в клетках РЬК-ВЬУ. Анализ ревертазной активности в линиях клеток БЪК-ВЬУ, содержащих гены асРНК и рибозима также демонстрирует снижение уровня репродукции вируса в линиях, неоущих гены асРНК и рибозима под контролем промотора ИЗ области ЬТИ-ВЬУ. Ввдимо, наличие антисмысловых генов, синтез которых направляется вирусным промотором из области ЬТБ-ВЬУ, в составе клеточного генома обеспечивает необходимое количество антисмысловых транскриптов для эффективного подавления репродукции вируса даже в условиях хронической вирусной инфекции в линии клеток РЬК-ВЬУ.

5. Анализ транскрипционной активности промотора

ИЗ области ЬТЙ-ВЬУ в клеточноой линии РЬК-ВЬУ.

Для подтвервдения данных об обнаруженном эффективном подавлении репродукции ВЛК генами асРНК и рибозима под контролем промотора из из области ГЛК-ВЬУ в хронически инфицированной вирусом клеточной культуре, мы провели анализ, транскрипционной активности промотора ЬТИ-ВЬУ в клетках линии ИЖ-ВЬУ. Однако непосредственное обнаружение ас-транскриптов в клеточной культуре БЪК-ВЬУ не представляется возможным, ввиду большого количества молекул мРНК-мшпеней в клетках РШ-ВЬУ и быстрой утилизации асРНК непосредственно в клетках. Для решения этой задачи мы использовали плазмиду рИ,, содержащую ген (З-галактозидазы под контролем промотора ИЗ области ЬТИ-ВЬУ (Борисенко с сотр. 1994). Плазмида рОЬ, несущая ген р-галактозидазы под контролем промотора из промотора ЬТИ-ВБУ ранее уже использовалась для анализа транскрипциошюй активности промотора ЬТЙ-ВЬУ и в реакции

вирусиндуцированного синцитийобразования в клеточной линии СС81 (Борисенко с сотр. 1994). Для анализа транскрипционной активности промотора ЬТЙ-ВГЛГ в культуре клеток, хронически инфицированной ВЛК, ДНК плазмиды рМ. трачсфицировали в клеточную линию-продуцент ВПК (РЬК-ВЬУ) и в контрольную линию (НеЬа) не инфицированную вирусом и не способную поддерживать репродукцию вируса. Через 48 часов после трансфекции в клетки плазмиды рбЬ, выделяли тотальную клеточную РНК и анализировали наличие транскриптов мРНК р-галактозидазного гена методом защиты от РНКаз. Из полученных результатов, представленных на Рис.5 видно, что в контрольной клеточной линии клеток НеЬа, в которой отсутствуют вирусные трансактиваторные белки ВЛК, ..мРНК-транскрипты (3-галактозидазного гена не детектируются, что говорит об отсутствии транскрипционной активности промотора ИЗ области ЬТИ-ВЬУ в этой клеточной линии (трек I). В линии клеток ЕЪК-ВЬУ (трек 2) обнаруживается большое количество мРНК-транскриптов" исследуемого гена, что прежде всего связано с высоким базовым уровнем вирусного трансактиваторного белка рЗЭ^ синтезируемого в процессе репродукции вируса в клеточной линии РЬК-ВЬУ и активирующего процессы транскрипции с промотора ЫЛ-ВЬУ. Таким образом, следует' ожидать, что синтез антисмысловых генов под контролем промотора ИЗ области ЬТИ-ВЬУ в клеточной линии, хронически инфицированной ВЛК, будет протекать достаточно эффективно. Опыты по ингибнрованию репродукции ВЛК в клеточных линиях РЬК-ВЬУ-БЕАР и ЕЪК-ВЬУ, описанные нами, действительно демонстрируют высокую ингибирупцую активность генов асРНК и рибозима под контролем вирусного промотора ЫЙ-ВЬУ.

6. Анализ уровня синтеза секретируемой щелочной фосфатазы в клеточной линии РЬК-ВЬУ-БЕАР, трансфицированной плазмидами с генами асРНК к вирусу ЕЛК.

Линия клеток FLK-BLV-SEAP является линией клеток FLK-BLV, стабильно трансформированной плазмидой pLBSEAP, содержащей ген' щелочной фосфатазы под контролем промотора из U3 области LTR-BLV (Зеливянский с сотр. 1994). Высокий базовый уровень вирусных трансактиваторных белков в линии клеток FLK-BLV обеспечивает высокоэффективный синтез щелочной фосфатазы, так как экспрессия гена щелочной фосфатазы контролируется вирусным промотором, чуствительным к действию трансактиваторных белков вирусного происхождения. Ингибирование процессов вирусной репродукции с помощью различных видов полинуклеотидных молекул в клеточной линии FLK-BLV-SEAP приведет к снижению количества трансактиваторных белков в клетке и неизбежно повлияет на уровень синтеза секретируемой щелочной фосфатазы в сторону его уменьшения. Таким образом, по данным об экспрессии репортерного гена щелочной фосфатазы можно судить об уровне вирусной репродукции в культуре клеток FLK-BLV-SEAP. Линия клеток FLK-BLV-SEAP уже успешно применялась для анализа действия рибозима против R-области ВЛК под контролем промотора CMV на репродукцию вируса (Зеливянский с сотр. 1994). Задачей нашего исследования являлось сравнение антивирусного действия плазмид, содержащих гены асРНК и рибозима, в условиях транзиентной экспрессии антивирусных генов, в хронически инфицированной ВЛК клеточной культуре FLK-BLV-SEAP. В исследование были включены как плазмида с промотором LTR-BLV, так и плазыиды не содержащие промотор из U3 области LTR-BLV, но обладавшие сильным ингибирушщм действием в культуре клеток CC8I

(pAGR) (Борисенко с сотр., 1993): pLT -векторная плазмида без антисмысловой последовательности, содержащая промотор из U3 области LTR-BLV и сигнал полиаденилирования TK-HSV-I; pLU -плазмида содержащая Sacl-Bcll (356-551) участок RU5 области генома ВЖ, включающий ф-сигнал упаковки и PBS-сайт инициаторного синтеза минус-цепи ДНК, в обратной ориентации по отношению к промотору LTR-BLV; pLR -плазмида содержащая участок SacI-SacI (265-356) R области генома ВЖ, включающий сайт сплайсинга для всех вирусных мРНК, в обратной ориентации по отношению к промотору LTR-BLV; pLTRZ -плазмида с геном рибозима к участку (356-358) R-области генома BLV под контролем промтора LTR-BLV; pAGR -плазмида содержащая участок SacI-SacI (265-356) R области генома ВЛК, включающий сайт сплайсинга для всех вирусных мРНК, в обратной ориентации по отношению к промотору TK-HSV-I; pGEM1 -контрольная векторная плазмида (Promega). После трансфекции клетки обрабатывали 25% ДМСО и затем рассевали на культуральные флаконы. Активность щелочной фосфатазы измеряли в течение 5-ти дней, начиная со дня трансфекции. Активность щелочной фосфатазы в культуральной среде оценивалась по стандартным методикам, подробно описанным в разделе Материалы и методы. Из данных анализа активности щелочной фосфатазы в культуральной среде, представленных в Таблице 3 видно, что в течение первых трех дней после трансфекции уровень активности щелочной фосфатазы невысок как в клетках, трансфицированных экспериментальными плазмидами, так и в трансфицированных контрольной плазмидой pGEM1, а также в контрольной линии клеток FLK-BLV-SEAP. Это связано с началом фазы логарифмического роста клеток и небольшой начальной концентрацией клеток. Начиная с третьего дня активность щелочной фосфатазы в контрольной линии клеток FLK-BLV-SEAP и в клетках,

Таблица 2. Уровень синцитийобразования в клетках СС81 при сокультивировании с линиями клеток ЕЪК-ВЬУ, несущими гены асРНК и рибозима.

Трансфищфовагагая плазмида Уровень ишнбнровашм (%) Ш'-акпшность ИМП/МИН

рЫ* 73 7.200

рШ 82 6.900

рЬТ 73 6.956

рАСЖ 13 17.800

рЫК/, 81 6.700

ЕЬК-ВЬУ 0 25.560

»Рисунок 4. Уровень синцитийобразования линиями клеток РЬК-ВЬУ, несущими гены асРНК и рибозима

Трансфицированные плазмиды

* На гистограмме представлены усредненные сводные данные четырех повторностей трех независимых экспериментов

Рисунок 5. Транскрипция гена р-галактозидазы под контролем промотора 113 области ЬТИ-ВЬУ в клеточных линиях ЕЬК-ВЬУ и НеЬа.

i 2 3

20О

_ ¿53 ? Ш

UO

Трек I-РНК из клеток линии Hela, трансфицированной плазмидой pGL; трек 2-РНК из клеток линии FLK-BLV, трансфицированной pGL; трек 3-маркер молекулярных весов pGEM/HpalI

трансфицированных pGEM1, быстро возрастает и к пятому даго с начала инкубации достигает максимального значения (0.8 мЕд/мл). На пятый день с начала инкубации минимальный уровень синтеза щелочной фосфатазы (0.2 мЕц/мл), составляющий 26% от уровня синтеза фермента в контрольной линии, обнаружен в метках, трансфицированных плазмидой, содержащей рибозимный ген (pLTRZ). Необходимо отметить, что низкий уровень синтеза щелочной фосфатазы в клеточной линии FLK-BLV-SEAP, трансфицированной плазмидой pLTBZ

отмечался в течение всех пяти дней. В линиях клеток, трансфицированных плазмидами, содержащими гены асРНК под контролем промотора из ИЗ области ЬТИ-ВЬУ (рШ, рШ) также наблюдалось значительное снижение синтеза щелочной фосфатазы на 42-48% от уровня синтеза фермента в контрольной культуре. Плазмвда рАйБ обладавшая высоким ингибиругщим эффектом в культуре клеток СС81, при котрансфекции ее с прогеномной ДНК ВЛК, оказывала ингибирупцее действие и на синтез щелочной фосфатазы в линии клеток БЪК-ВЬУ-БЕАР (уровень активности щелочной фосфатазы составлял 50% от уровня активности щелочной фосфатазы в контроле), однако ингибирупций эффект был невелик по сравнению с таковым в клеточной линии СС81 (98%), что возможно является следствием недостаточной транскрипционной активности промотора ТК-ШУ-Г для обеспечения большого количества антисмысловых транскриптов в условиях транзиентной экспрессии в хронически инфицированной ВЛК клеточной линии РЬК-ВЬУ-БЕАР. Плазмида рЬТ, содержащая только последовательность вирусного промотора и сигнал полиаденилирования ТК-НЗУ-1, также обладала ингибирувдим действием на синтез щелочной фосфатазы в клеточной культуре РЬК-ВЬУ-БЕАР, хотя и менее выраженным, чем плазмида с антисмыеловыми или рибозимными генами. В работе Шаяхметова с сотр.(1995) детально изучен данный феномен и продемонстрировано, что наличие в клетках определенного количества вирусных промоторных последовательностей, содержащих участки связывания как транскрипционных клеточных, так и вирусных трансактиваторных последовательностей ДНК, способно снижать уровень транскрипционной активности - интактного вирусного промотора, а следовательно и уровень репродукции вируса в клетках. Однако, по всей видимости, сам по себе этот эффект недостаточен для существенного подавления репродукции вируса в хронически

инфицированной клеточной культуре. Результаты анализа активности щелочной фосфатазы на 5-й день с начала эксперимента представлены в виде гистограммы на Рисунке 5.

^Таблица 3. Активность ' щелочной фосфатазы в линии клетках РЬК-ВЬУ-БЕАР при трансфекции различными антисмысловыми

конструкциями.

Название плазмид Активность щелочной фосфатазы (мЕд/мл)

1 день 2 день 3 день 4 день 5 день %

рЫ* 0.025 0.035 0.090 0.415 0.415 48

рЬТ 0.050 0.085 0.160 0.555 0.585 69

Рш 0.075 0.085 0.160 0.240 0.350 42

рАвЯ 0.080 0.215 0.305 0.385 0.425 50

рОЕМ1 0.023 0.320 0.450 0.450 0.835 98

рьтяг 0.035 0.160 0.190 0.215 0.225 26

РЬК-ВЬУ-БЕАР 0.039 0.190 0.200 0.720 0.840 100

рЫЬплазмида с геном асРНК против И-области ЬТЙ ВЛК под контролем промотора ЬТЙ-ВЬУ; рЬТ-векторная плазмида содержащая промотор Ш-ВЬУ и сигнал полиаденилирования ТК-НЗУ-1; рЫГ-плазмида с геном асРНК против ИШ^-области ЬТИ-БЬУ под контролем промотора ЬТЙ-ВЬУ; рАОИ-плазмвда с геном асРНК против Ш5-области ЬТЙ-ВЬУ под контролем промотора ТК-1БУ-1; рЬТВД-плазмида с геном рибозима против К области ЬТИ-ВЬУ под контролем промотора ЬТИ-ВЬУ; рОЕМ1-векторная плазмида (Promega)

* Приведенные в таблице результаты являются усредненными данными трех независимых экспериментов.

Рисунок 5. Активность щелочной фосфатазы в метках ЕЪК-ВЬУ-ЗЕАР, трансфицированных различными антисмысловыми конструкциями, (пятый день от начала эксперимента)

0,9-,

Плазмиды

рШ-плазмида с геном асРНК против Е-области ЬТБ ВЖ под контролем промотора ЬТЙ-ВЬУ; рЬТ-векторная плазмида содержащая промотор ЬТН-ВЬУ и сигнал полиаденилирования ТК-НБУ-1; рЫЬплазмида с геном асРНК против ИГ5-области ЬТИ-ВЬУ под контролем промотора ЬТЙ-ВЬУ; рАСИ-плазмида с геном асРНК против В115-области 1ЛБ-ВЬУ под контролем промотора ТК-НЕ№-1; рЬТИИ-плазмида с геном рибозима против К области ЬТЙ-ВЬУ под контролем промотора ЬТЙ-ВЬУ; рБ0Л1-векторная плазмида (Pгoшega)

7. Ингибирование репродукции ВЛК в клеточной линии БЪК-ВЬУ-БЕАР при обработке клеток антисмысловыми олигоДН.

Подходы к использованию антисшсловых олигодезоксинуклеотидов

в качестве антивирусных агентов активно исследуются в последние годы, учитывая возможное применение олигоДН в клинической практике в качестве химиотерапевтических агентов. Однако наряду с несомненными успехами в этой области, существует и ряд нерешенных еще проблем. Одной из них является вопрос о целесообразности применения олигоДН в качестве терапевтических средств для лечения хронических вирусных инфекций таких например, как СПИД или лимфолейкозы вирусного генеза. Клеточная линия FLK-BLV, моделирующая in vitro хроническую ВЛК инфекцию, является удобной моделью для изучения ингибирующего действия олигоДН на репродукцию вируса в хронически инфицированной культуре клеток и скрининга наиболее чуствительных к действию олигоДН мишеней в геноме ВЛК. Задачей данного исследования было сравнить эффективность действия немодифицированных олигоДН, направленных против различных участков R-области геномной РНК ВЛК на репродукцию вируса в клеточной линии FLK-BLV-SEAP, несущей репортерный ген щелочной фосфатазы. В эксперименты были включены шесть синтезированных нами олигоДН, три из которых являются антисмысловыми последовательностями: а)к сайту кепирования вирионных PHK(CPS)(8391-8409), б)к донорному сайту сплайсинга всех мРНК BflK(DSS)(8480-8492), в)к участку R-области LTR-BLV в котором происходит разрезание 1 рибозимом (RZS)(8571-8589). Три других олигоДН представляют собой рандомизированные последовательности, • не имеющие гомологии в геноме ВЛК. Данные анализа представление в Таблице 4 п Ркс. 6 являются усредненными данными трех повторностей в трех независимых экспериментах. Одновременно с исследованиями активности щелочной фосфатазы оценивали и Изменение индекса пролиферативной активности клеток при обработке меток различными концентрациями олигоДН. При конечной концентрации олигоДН в культуральной жидкости- 25мкг/мл

индекс пролиферации клеток не изменялся, а при концентрации олигоДН в культуральной жидкости 100 мкг/мл индекс пролиферации был в среднем снижен на 27-30%. Из результатов представленных в Табл. 4 видно, что существенного снижения синтеза щелочной фосфатазы при однократной обработке клеток относительно малыми дозами олигоДН (25 мкг/мл) достичь не удалось. В случае антисмысловых олигоДН наименее эффективно ингибировал синтез щелочной фосфатазы олигоДН направленный против донорного сайта сплайсинга (DSS), а олигодезоксинуклеотиды, направленные против сайта копирования (CPS) и участка разрезания рибозимом (RZS) приводили к снижению активности щелочной фосфатазы на 40% от уровня активности в контрольной линии FLK-BLV-SEAP. При этом необходимо отметить, что обработка клеток рандомизированными последовательностями также приводила к снижению активности щелочной фосфатазы на 30-50% от уровня активности в контрольной линии клеток. При обработке клеток более высокими концентрациями антисмысловых олигоДН (100 мкг/мл) помимо снижения активности щелочной фосфатазы на 60% от уровня активности в контрольной культуре, наблюдалось также снижение пролиферативной активности клеток на 27-30%. Отсутствие специфического характера ингибирования вирусной инфекции можно объяснить быстрой деградацией коротких 18-ти членных ^модифицированных олигоДН в культуральной среде и неспецифическим влиянием очень коротких нуклеотидных цепей на процессы репродукции вируса и клеточного деления. С подобного рода неспецифическими эффектами столкнулись исследователи при попытке подавить хроническую инфекцию в культуре клеток M0LT-3 вызванную HIV-I (Agrawal, S., Ikeuchi.R. et al. 1989). Vikers и Baker (1991), Wagner R.W., Stein С.A. (1995) при исследовании ннгибирупцего действия олигоДН на репродукцию HIV-I.и

других вирусов, также отмечали неспецифическую, дозозависимую активность олигоДН. Факты, обнаруженные нами в проведенном исследовании, свидетельствуют о том, что в условиях хронической вирусной инфекции добиться существенного снижения уровня репродукции вируса однократным воздействием олигоДН не удается, однако возможно сочетание обработки малыми дозами олигоДН с применением каких-либо других антивирусных препаратов (асРНК, рибозимов) для достижения полного ингибирования репродукции вируса. Изучение этого вопроса требует дальнейших исследований.

8. Снижение уровня вирусиндуцированного синцитийобразования в

клеточной линии CC8I при сокультивировании с клетками FLK-BLV после обработки их антисмысловыми олигоДН.

Как уже отмечалось, реакция вирусиндуцированного синцитийобразования при сокультивировании линии клеток CC8I с клетками-продуцентами ЕЛК является диагностической реакцией для определения больных животных и отражает уровень экспрессии вирусных- (главным образом оболочечных) белков в клеточной культуре. Задачей нашего исследования было определить как влияет обработка клеток FLK-BLV антисмысловыми олигоДН на уровень вирусиндуцированного синцитийобразования в клеточной линии CC8I. В эксперименты были включены три вида антисмысловых олигоДН комплементарных различным участкам генома BLV (DSS, CPS, RZS) и одна рандомизированная последовательность (500). Результаты представленные в таблице (Табл. 5) являются относительным выражением (в процентах) статистически обработанных результатов 3-х кратных повторностей каждого варианта опыта. Клетки линии CC8I культивировали в нормальных ростовых условиях в течении суток,

Таблица 4. Активность щелочной фосфатазы в клеточной линии ИЖ-В1ЛМЗЕАР при обработке олигодезоксинуклеотидами.

Индекс олигоДН Активность щелочной фосфатазы (мЕд/мл) Уровень щелочной активности фосфатазы (%)

Концентрация олигоДН 25 мкг/мл 100 мкг/мл 25 мкг/мл 100 мкг/мл

DSS 0.8±0.02 0.4±0.03 80 40

CPS 0.6±0.08 0.4Ю.05 60 40

RZS 0.6+0.06 0.4±0.05 60 40

499 0.5Ю.03 0.4±0.01 50 40

500 0.6+0.02 0.5±0.07 60 50

501 0.7±0.03 ' 0.5Ю.06 70 50

FLK-BLV-SEAP 1.02+0.06 1.02±0.07 100 100

FLK-BLV 0 0 0 0

Рисунок 6. Активность щелочной фосфатазы в клеточной линии ЕТЖ-ВЬУ-БЕАР при обработке клеток различными концентрациями

олигоДН.

S 1.2 л

а

3

2 10-

§ 0,8 -о

О | °в"

ï 0,4

г

I I -концентрация олигоДН- 25 мкг/мл К. I -концентрация олигоДН-100 мкг/мл

гХ,

X

dss

срэ

rzs 499 олигоДН

500

501

К+

КЗЗ-олигоДН против донорного сайта сплайсинга; СРЗ-олигоДН против коп-сайта; И25-олигоДН против участка разрезания рибозимом; К+ -активность щелочной фосфатазы в линии клеток РЬК-ВЬУ-ЗЕАР; К- -активность щелочной фосфатазы в линии клеток ЕЪК-ВЬУ

затем вносили клетки FLK-BLV и после распластывания клеток обрабатывали олигоДН в бессывороточной среде в течении 5 часов. Далее клетки культивировали в течении' 4-х дней в среде с добавлением полибрена и 1П% фетальной сыворотки. На пятый день от обработки олигоДН клетки фиксировали и подсчитывали количество синцитиев на чашку. Одновременно с этим проводилась и оценка пролиферативной активности клеток, обработанных олигоДН. Из приведенных в таблице результатов видно, что обработка клеток FLK-BLV антисмысловыми олигоДН в малых концентрациях (12,5 мкг/мл) приводит к падению уровня синцитийобразования в клеточной линии CC8I от 35% до 55% и не сопровождается снижением индекса пролиферации клеток. При обработке клеток большими концентрациями олигоДН (100 мкг/мл) уровень синцитийобразования в клетках CC8I был еще меньше, однако в значительной мере это явилось следствием снижения пролиферативной активности клеток (до 30%), напрямую связанной с процессом синцитийобразования. Необходимо отметить, что наблюдалось и неспецифическое ингибирование синцитийобразования рандомизированной последовательностью, что можно объяснить токсическим действием на клетки продуктов быстрого распада олигонуклеотвдов. Понятно, что такое же токсическое действие связанное с влиянием продуктов распада олигоДН на пролиферацию клеток, должно иметь место и в случае применения специфических олигоДН, в результате ■ чего снижение уровня синцитийобразования в данном случае можно рассматривать как суммарный эффект специфического (антисмыслового) - и неспецифического (токсического) воздействия олигоДН на клетку.

Наш впервые проведено сравнение ингибирующего действия трех типов комплементарно-адресованных полинуклеотидов на хроническую ВПК инфекцию в культуре клеток а также показана эффективность

применения собственного вирусного промотора 113 области ЬТН-ВЬУ для ингибирования репродукции ВЛК в культуре клеток.

♦Таблица 5. Уровень вирусиндуцированного синцитийобразования в клеточной линии СС81 при сокультивированш с клетками БЪК-ВЬУ при обработке их антисмысловыми олигоДН.

Индекс олигоДН Концентрация в мкг/мл Ингибирование синцитийобраз.(%) Падение индекса пролиферации (%)

12,5 54 0

100 46 25

12,5 55 0

СРв 100 74 25

12,5 35 0

100 59 27

12,5 60 0

500 100 87 30

БЗЗ-олигоДН против донорного сайта сплайсинга; СРБ-олигоДН против кэп-сайта; ШЕ-олигоДН против участка разрезания рибозимом; 500-рандомизированная полинуклеотидная последовательность

♦ Данные, представленные в таблице являются усредненными результатами трех повторностей в трех экспериментах

ВЫВОДЫ:

1. Создана ллазмидная конструкция, содержащая ген рибозима к ВД5-области генома ВЬУ под контролем вирусного промотора из 113 области Ш-ВЬУ.

2. Впервые проведено сравнение ингибиругацего действия трех различных видов комплементарно-адресованных полинуклеотидов (асРНК, олигоДН, рибозима) на хроническую ретровирусную инфекцию в культуре клеток ЕЬК-ВЬУ и показано преимущество рибозимных и асРНК генов для достижения стабильного ингибиругацего эффекта на репродукцию вируса по сравнению с олигодезоксинуклеотидами в условиях однократного введения препарата.

3. Впервые показана возможность эффективного подавления хронической вирусной инфекции, вызванной вирусом бычьего лейкоза в культуре клеток с помощью гена рибозима и асРНК под контролем промотора ИЗ области ЬТЙ-ВЬУ, экспрессирувдихся в составе генома клетки, что позволяет разработать конструкции индуцируемых антисмысловых генов, активирующихся с началом вирусной инфекции.

4. Впервые в модельной системе репортерного гена секретируемой щелочной фосфатазы, линии клеток ЕЪК-ВЬУ-БМР проведено сравнение трех ввдов комплементарно-адресованных полинуклеотидов и показано эффективное ингибирование хронической ВЛК-инфекции геном рибозима под контролем из-области ЬТИ-ВИ.

5. Исследование влияния олигодезокийуклеотидов на репродукцию вируса ВШ в хронически инфицированной культуре клеток показало слабую ингибирушую активность немодифицированных олигоДН в условиях хронической вирусной инфекции при условии однократного введения препарата.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Борисенко А.С., Шаяхметов Д.М., Герзилова А.Г., Тихоненко Т.И.."Использование промотора U3 области LTR вируса лейкоза коров для экспрессии генов противовирусных антисмысловых РЖ в клеточных культурах."// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1994, №3, стр.16-20

2. Шаяхметов Д.М., Герзилова А.Г., Борисенко А.С., Тихоненко Т.И.."Исследование транскрипционной активности промотора из U3 области LTR вируса лейкоза коров и его способность контролировать экспрессию генов противовирусных антисмысловых РНК в. клеточных культурах."// "Биоинженерные и трансгенные сельскохозяйственные животные" (под ред. Эрнста Л.К.), 1995, т.1,

стр.367-378

3. Герзилова А.Г., Борисенко А.С., Шаяхметов Д.М., Зеливянский С.В., Тихоненко Т.И.. "Сравнительный анализ эффективности ингибирования репродукции вируса лейкоза крупного рогатого скота антисмыловыми РНК и немодифицированными олигодезоксинуклеотидами в клеточных культурах."// "Биоинженерше и трансгенные сельскохозяйственные." (под ред.

Эрнста Л.К.) 1995, т.1, стр.329-340

4. Borisenko A., Shayakhmetov D., Gersilova A., Tikchonenko Т.I.//Investigation of Antiviral Activity of different Complementary-Adressed Polynucleotides (antisense RNA, antisense DNA and ribozyme) on Bovine Leukaemia Virus infection in cell cultures.//Euroasian simposium on current trends in biotechnology: gene diagnostics, gene therapy and informational immunity. Ankara, "Karadeniz Jornal of Medical Sciences", v.8, N4, 1995

5. Shayakhmetov D.M. Borisenko A.S. Gersilova A.G. Tikchonenko T.I. //The use of the LTR U3 promoter of bovine leukaemia virus for expressing antisense antiviral RNAs and competitive inhibition of viral infection in cell cultures.//Vir. Res. 1995, (in press)

Подписано ь печать 2t.tl.9f Формат 60*84//® Заказ Ш9

Усл. печ. л. 2,0 ' Тираж///

Типография Россельхозакадемни 115598, Москва, ул. Ягодная, 12.