Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Получение полиалкилирующих производных ДНК-фрагментов Е1 онкогена SА7 и их взаимодействие с ДНК-мишенями и клетками

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Получение полиалкилирующих производных ДНК-фрагментов Е1 онкогена SА7 и их взаимодействие с ДНК-мишенями и клетками"

С Ь 9 2

V 1

ВСЕРОССИЙСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

на правах рукописи

Сац Наталья Владинировна

ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИПЛКИЛИРУВЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ ДНК-ФРАГНЕНТОВ Е1 ОНКОГЕНА БО? И ИХ ВЗАИНОДЕИСТВЧЕ С ДНК-ННИЕНЯНН И КЛЕТКАМИ.

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1992

Работа выполнена по Всесоюзной ордена Ленина и ордена трудового Красного Знамени гематологической научной центре

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Н.И.Гринева.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

член-корреспондент РАН Р.И.Салганин доктор биологических наук, профессор

С.С.Виикин

Бедуцее учреждение: Институт биоорганической химии СО РАН

Залита диссертации состоится "___" ________________ 1992 г,

в___час. на заседании специализированного совета Д 074.00.01

во Всероссийской гематологическом научном центре РАИН (125167, Москва, Новозыковский проезд, д.4а.)

С диссертацией мовно ознакомиться в библиотеке ВГНЦ РАШ!

Автореферат разослан "_:___"___^_____________1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

В.Д.Реук

■j'- Йктчальность проблемы. Изучение комплементарных олигонуклеотидов и их производных как специфических ингибиторов экспрессии и реагентов для направленной модификации нуклеиновых кислот в настоящее время получило широкое распространение. Экспериментально показано, что олигонуклеотиды и их производные способны эффективно блокировать на клеточном уровне вирусную инфекцию и зкспрессию'клеточных протоонкогенов, В связи с этим сегодня параллельно с поиском и изучением новых модификаций олигонуклеотидов yie ведется разработка терапевтических противовирусных препаратов направленного действия на основе олигонуклеотидов и их производных. Предложены и разрабатываются методы антисмислового ингибирования экспрессии онкогенов и протоонкогенов. Предполагается использовать этот подход для очистки костного мозга от злокачественных колониеобразующих клеток.

До недавнего времени основой для подобных разработок служили антисинсловые олигонуклеотиды природной структуры и хини-чески неактивные производные олигонуклеотидов с модифицированными сахарофосфатным скелетом или концевыми нуклеотидами. Олигонуклеотиды этой группы способны оказывать сильное, но временное ингибирупцее действие, длительность которого ограничена временен жизни олигонуклеотида в клетке. Можно ожидать, что, в отличие от них, олигонуклеотиды, содержание реакционноспособ-ные группировки, будут приводить к необратимым изменениям в геноме и. возможно, к наследуемой.инактивации генов-миоенеи. Среди реагентов этого типа, ранее предложенных для комплементарно адресованной модификации ДНК и РНК in vitro, - олигонуклеотиды, имеюцие алкилирувчие группы на 5'- или 3'- концах [Grineva N.I..1973, Бенимецкая /1.3.,19771; алкилирувцие группы, распределенные вдоль цепи полиедклеотида [Salgani с R.I.:. 19801; интеркалирущие фотоактивируемые группы [Helene C.,l|990. Benleetskaya L.Z.. 19831. реагенты, способствующие окислительной деструкции ДНК-мивени [Sigean D.S.. 19901. Показано. что In vitro такие производные олигонуклеотидов образуют ковалентно связанные комплексы с комплементарной цепью ДНК или расцепляют ее в заданном положении. Следствием такого взаимодействия реагентов- с ДНК на клеточном уровне может быть появ-

ление мутаций и инактивация избранного гена, т.е. направленное наследуемое изменение клеточного генотипа. Однако, ген-направленное действие реакционноспособных производных олигонуклеоти-дов на ДНК в клетке не изучено. Данное исследование посвящено разработке подходов к решению этой проблемы на примере комплементарно адресованной инактивации онкогена аденовируса обезьян S.A7, гомологичного высокоонкогенным аденовирусам человека fid 5 и fid 2.

Цель работы - получение комплементарно адресованных поли-алкилирующих реагентов и исследование их мутагенного действия на трансформированные клетки.

Задачи исследования. Поставленная цель определила постановку задач:

1. Получение химически активных адресованных реагентов для воздействия на трансформирующие последовательности 'адено- . вируса обезьян SA7, интегрированного в геном клеток SH2.

2. Доказательство эффективности и направленности действия полученных реагентов in vitro.

3. Исследование закономерностей проникновения полиалкили-руюцих реагентов в клетки SH2.

4. Изучение эффективности и направленности действия полученных полиалкилирующих ретентов на клетки SH2. трансформированные онкогеном SA7.

Научная новизна. В настоящей работе предложен способ получения комплементарно адресованных реагентов нового типа -производных Фрагментов однонитевых ДНК СонДНК) рекомбинантных Фагов М13 со вставками смысловой и антисмысловой цепей Е1 области онкогена аденовируса обезьян Sfl? (i-1750), с алкилирую-щими группировками, статистически распределенными вдоль .цепи полинуклеотидов.

Установлено, что полученные полиалкилирующие реагенты In vitro направленно взаимодействуют с комплементарными последовательностями и модифицируют их. .Предлояена модель для тестирования эффективности ковалентного взаимодействия полиалкили-

- 5 -

ругащих реагентов с ДНК-матрицей in vitro .

Впервые исследованы закономерности проникновения полинук-леотидов и полиалкилиругащих реагентов в клетки SH2 и их . распределения по субклеточным фракциям.

Показано, что действие реагентов, комплементарных Ei области онкогена SA7, на клетки SH2, трансформированные этим онкогеном. вызывает наследуемую реверсию клеток к нормальному фенотипу, т.е. онкоген-направленный мутагенез.

Практическая ценность. Полученные полиалкилируюцие реагенты, комплементарные Ei области онкогена аденовируса обезьян SA7, а также данные об их проникновении в трансформированные клетки SH2 будут использованы для дальнейшей разработки метода онкоген-направленного мутагенеза на клеточном уровне. Предложенный способ получения полинуклеотидннх адресов комплементар-' но адресованных реагентов может быть использован для любой другой последовательности. Предлоаенная модель может быть использована для тестирования эффективности действия химически активных комплементарно адресованных реагентов.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были доложены на III Всесоюзном ' совещании "Органическая, химия ДНК-дуплексов" (Тбилиси,1987), на международной конференции "Олиго-нуклеотиды и антисмысловые ингибиторы экспрессии генов: терапевтические аспекты" (Роквилл, 19891. "...

В целом работа была апробирована на заседании проблемной комиссии " Экспериментальная гематология и биотехнология" ВГНЦ РАМН 2 апреля 1992 г.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 5 научных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 111 страницах машинописного текста, состоит из следующих.разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования. результаты и обсуждение, заключение, выводы. Список литературы содержит 117 отечественных и зарубежных источников. Диссертация иллюстрированы 12 рисунками и 4 таблицами.

- 6 - .

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии НИИ экспериментальной гематологии и биотехнологии ВГНЦ (зав. лаб. - докто-р химических наук, профессор Н.И.Гринева).

СОДЕРШИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. В работе были использованы рекомбинантные фаги М13 mp8G и mp9G, полученные Е,/1.1уко-вой и В.А.Суриным в результате переклонирования G-Snal фрагмента онкогена аденовируса обезьян SA7 из плазмиды pASP, содержащей fl-Pst I фрагмент онкогена SA7, в бактериофаги N13 шр8 и ир9.

Однонитевую ДНК исходных и рекомбинантных фагов выделяли в препаративных количествах по методу 13.Messing, 1983} и подвергали дополнительной очистке бентонитом.

N.N.ti'-три-С 2-хлорзтил )-Н'-(п-формилфенил )-пропилендиа-мин-1,3 (TFP) синтезировали по схеме, предлоленной А.Д.Галлем [Галль fl.fi. и соавт. 1979]. С целью упрощения аппаратурного оформления и увеличения выхода синтез на стадиях 1, 2, 5 и 6 проводили по методикам (Суминов С.И.,1963, Беккер Г., 1979, Tipson R.S.. 1962, .Гимаутдинова О.И., 19783.

Полиалкилирующие реагенты получали по методу tSalganik R.I. et al., 1980J. От избытка непрореагировавшего TFP реагенты очищали .гельфильтрацией гэ колонке с сефадексом G-50 супертонким.

Гибридизацию онДНН с комплементарными полинуклеотидами и реагентами осуществляли в присутствии 5Н мочевины.

Фрагментацию онДНК, алкилированных комплементарно адресованными реагентами проводили по методике ДБенимецкая Л.З. и соавт., 19781.

Разделение клеток на фракции - ядра, цитозоль и мембраны проводили центрифугированием по . методу [Соловьёв Г.Я. и соавт., 19721.

Количество реагента, проникшего в клетки и его распределение по субклеточным фракциям оценивали по количеству радиоактивности 5*-[32Р]mp8f и 5'-[32P]mp8RCl.

Определение первичной структуры G-вставки рекомбинантных

фагов rap8G и mp9G проводили по методу Сэнгера tSangar F. et al.. 1977] с использованием прямого универсального праймера.

Линия клеток SH2, полученная в результате трансформации клеток эмбриона крысы ДНК аденовируса обезьян SA7C с8) была любезно предоставлена Т.И.Пономаревой.

Модель для изучения комплементарно адресованного мутагенеза.

Для достижения поставленной цели - разработки метода комплементарно адресованной инактивации онкогена на клеточном уровне в качестве клеточной модели была использована линия клеток SH2 - Фибробласты крысы, трансформированные онкогеном аденовируса обезьян SA7. Известно, что экспре'ссия ранних генов Elfi и Е1В играет ключевую роль в трансформации клеток. Логично предполойить, что инактивация Elfi и Е1В генов в результате комплементарно адресованной модификации может привести к потере клетками трансформированного статуса. Поэтому в качестве мишени комплементарно адресованного воздействия нами была избрана последовательность G-Smal фрагмента аденовируса, с i по 1750 нуклеотид (рис.1), включающая Е1А и начало Е1В области.

Полцчение полиалкилирцитих реагентов. Одной из задач данной работы было получение химически активных адресованных реагентов для воздействия на трансформирую^ последовательности онкогена аденовируса обезьян SA7. интегрированного в геном клеток SH2.

По нашему мнению, наибольший интерес для направленной инактивации онкогенных последовательностей и интегрированных вирусных последовательностей представляют полиалкилирукщие реагенты, предлояенные Р.И.Салгаником для введения мнояественных мутаций в заданную область ДНК In vitro. В работах Р.И.Салга-ника,. Г.Л.Дианова и соавт. для получения таких полиалкилирую-щих реагентов был использован полифункциональный азотистый иприт - Н.М'-три-сг-хлорзтил^Л'-Гп-формилфенилЬпропилендиа-мин-1,3 (TFP) (рис.2) [Галль A.A. и соавт., 1979]. Высокореакционная бис(2-хлорэтил)-аминогруппа этого соединения в мягких условиях алкилирует остаток гуанина или (в меньшей степени) аденина, а такие концевую фосфатную группу полинуклеотида.

Е1А Е1В

1 509

е

а

с .

..---Г477 1749

1477 1490 1500 1510 1520

ест ттстттеттс етссессетс сттеессАТТ атаайй66бт

1530 1540 1550 1560 1570

еоетсйсетт йтаа6С6ш ттасбсассс стсйсетйас атт6сстсса

1580 1590 1600 1610 1620

теедтстссе йАсессестт сасасттттс АедссАсссе ссесттссте

1630 1640 1650 . 1660 1670

спестстетт ссаатйсайс стсттттттс тесисетеет тйтттсбййс

1680 1690 1700 1710 1720

тссестсйьт ссест&бттй ееснсетейй аттабайтас бйсйабшт

1730 1740 1749 ТТСАААСААТ ТТТАСЛТСАА ТбТСССЕСб Рис Л .Структура Е1 области онкогена аденовируса обезьян 5А7. Первичная структура 5'-конца 6-фрагмента онкогена БА?.

о сн«сн/<л )

К ^ СН , СН г

Рис.2.

Н,Н,Н-три(2-хлорзтил),И-(п-формилфенил )пропилендиаиин-1,3. (ТГР )

Ароматическая хлорэтиламиногруппа TFP весьма мало реакцион-носпособна из-за электроноакцепторног'о действия соседнего п-формилфенильного остатка, но она мояет быть "включена" (активирована) путем восстановления формилфенильной группы до бензильной под действием боргидрида натрия. Активированная ароматическая хлорэтиламиногруппа мояет алкилировать основания комплементарной цепи, давая-мнояественные ковалентные сшивки внутри комплекса матрица - реагент.

В качестве "адреса" (полинуклеотидной части) полиалкили-руючего реагента мы использовали онДНК рекомбинантных фагов Н13 ap8G и ирЭб. Они содермат "-" и "+" цепи G-фрагнента соответственно, что позволяет получать полиалкилирующие реагенты, комплементарные "+" и "-" цепи ДНК Е1 области Sft7 (рис.3). Од-нонитевые ДНК данной пары рекомбинантных фагов содержат комплементарные цепи 6-фрагмента и одинаковую векторную часть, следовательно, для изучения действия полиалкилирующих реагентов in vitro онДНК одного из клонов момет быть использована в качестве адреса полиалкилирующего реагента, а другая - в качестве мишени.

Для доказательства структуры рекомбинантных фагов Н13 mp8G и шр9£ в данной работе было проведено прямое секвенирова-' ние фаговой онДНК по Сзнгеру. При определении первичной структуры вставки рекомбинантного фага вр86 была получена последовательность длиной 150 нуклеотидов, полностью соответствующих 5'-концевой последовательности G-фрагмента (Рис.1,а). В первичной структуре вставки рекомбинантного фага mp9G нами была определена ранее неизвестная последовательность длиной 272 нуклеотида (РисЛ.Ь). Следующие за ней 130 нуклеотидов полностью соответствуют литературным данным (Рис.1,с) [Kime'man D. et а!.. 19851.

Для получения полиалкилирующих реагентов в данной работе онДНК рекомбинантного фага mp8G или mp9G подвергали ограниченному гидролизу ДНКазой II, в результате чего получали статистический набор полинуклеотидов, со средней длиной 100 нуклеотидов, перекрывающих всю G-последовательность. Из них обработкой TFP получали полиалкилирующие реагенты ap8GRC1 и np9GRl со степенью модификации 4-5Х, т.е. 4-57. оснований ад-

Рис.3. Схема эксперимента". 1 .фрагментация онДНК ир8Б,

2,получение полиалкилирцющих реагентов на основе вр8£Г,

3.их гибридизация с онДНК пр9£. 4.активация реагента и внутрикомплексное алкилирование• Б-последовательности, 5.элиминирование С-вставки из онДНК шрЭЁ, 6,7-гибридиза-ция гар9(С-) с .онДНК пр86 и полинуклеотидами тр861\

реса, статистически распределенные в цепи полинуклеотидов. содержали алкилирующую RC1 группу.

Изучение направленности и эффективности действия полиал-килирцюаих реагентов In vitro. Для изучения эффективности и направленности действия полиалкилирующих реагентов mp8GRCl и mp9GRC1 нами была предложена схема, включающая следующие этапы: 1 ¡инкубация полиалкилирующих реагентов и ДНК-мишени в условиях гибридизации. 2) активация латентной хлорэтильной ■ группы реагента и дальнейшая инкубация для осуществления внут-рикомплексного алкилирования, 3)инкубация комплекса в условиях элиминирования модифицированных оснований и фрагментации ДНК по этим точкам, 4)анализ продуктов гибридизации, алкилирования, фрагментации (рис.3).

Для осуществления этой схемы нами были'выбраны условия, позволяющие реализовать каждый этап не внося случайных ненап--равленных поврекдений в векторную часть онДНК рекомбинантных фагов. в

Из рис.4 видно, что при взаимодействии'ap8GRCl или rap8Gf с онДНК rap9G образуются гибридные комплексы с меньшей ЭФ-под-вижностьп, чем исходная np9G онДНК, что свидетельствует об образовании гибридного комплекса. С ДНК np8G, не содержащей комплементарных реагенту последовательностей, реагент не гиб-ридизуется.

В результате взаимодействия онДНК up9G с реагентом up8GRCl, полностью перекрывающим всю G-последовательность „ алкилирунщим ее в многочисленных точках, и последующей фрагментации алкилированннх участков ДНК происходит элиминирование основной части G-области с образованием продуктов фрагментации ир9(G-) ДНК (рис.3, ст,5). аналогичной линеаризованной ДНК фага М13>ир9, и коротких олигонуклеотидов из фрагментированной G-последовательности (Gf). Как видно из рис.4, продукт фрагментации движется при электрофорезе значительно быстрее исходного; гибрида и несколько быстрее ДНК op9G, приближаясь по подвижности к ДНК ярй.

Для подтверждения элиминирования G-последовательности продукты фрагментации гибридизовали с полинуклеотидами mp8Gf и кольцевой np8G ДНК (рис.3, ст.6,7). Анализ продуктов гибриди-

- 12 -

1 3 5 6 8 10 12 14 16 18 20 •24 ? 9 ' 11 13 15 17 19

Рис.4. Анализ продуктов алкилирования и фрагментации ДНИ шр9С в 1 У. ■ агарозе. ДНИ трЭБ и шр8БШ после инкубации в условиях гибридизации и последующей активации реагента (1); то не без активации (2); ДНК ирЭБ и тр8БШ после инкубации в присутствии боргидрида натрия (3); ДНК ир9Б, инкубированная с предварительно активированным шр8£ЯС1 (4);. продукт гибридизации ДНК трэе с шрвег (5); ДНК вр8Б инкубированная с шр8Ш1 в присутствии 5М мочевины (6) и в отсутствие мочевины (7); ДНК шр96, инкубированная в пписутствии 5Н 'мочевины (8) и в отсутствие мочевины (9); Продукты фрагментации указанных выше гибридов (1-9) в присутствии лизина (10-18 соответственно); онДНК шр8 (19) и онДНК ар9Б (20).

зации электрофорезом в агарозном геле выявил только исходные компоненты реакционной смеси. Более медленно движущиеся гибри- ' ды, способные возникнуть за сче'г комплексообразования Б-после-довательностей тр9С-тр8Е или •. тр9С-шр8БГ, не обнаружены (рис.5, дорокки 4, 5). Следовательно, в ДНК-продукте шр9(Б-) Б-последовательность практически отсутствует. Таким образом, в результате комплементарно адресованного алкилирования и последующей фрагментации протекает практически полное элиминирование Б-фрагмента онкогена аденовируса БА7 из кольцевой онДНК

1 2 3 4 5 6 7

Рис.5. Анализ ДНК продуктов элиминирования Б-последова-тельности в 17. агарозном геле. Продукт гибридизации ДНК тр9С с шр8БГ (2); продукт алкилиро-вания ДНК тр9& реагентом шр8СЯС1 (1); он же после инкубации в условиях фрагментации

(3): гибридизация продуктов элиминирования (3) с ДНК трвй

(4) и пр8БГ (5); ДНК тр8 С6): ДНК ирЭБ (7).

ир8£ без заметного расщепления некомплементарных реагенту последовательностей. Следовательно, полученные полиалкилируга-цие реагенты In vitro специфично взаимодействуют с комплементарными последовательностями Е1 области ДНК онкогена аденовируса обезьян SA7 и направленно модифицируют заданную последовательность, не повреждая протяженную (7,2 т.п.н.) область ДНК, не комплементарную полиалкилирунщим реагентам.

Предложенная модель позволяет тестировать ковалентное взаимодействие полиалкилирующих реагентов с ДНК-матрицей.

Этйм методом обнаружено эффективное адресованное алкили-рование G-последовательностей ДНК np9G реагентом mo8GRCl без предварительной гибридизации лигандов перед восстановлением RC1 группы реагента (рис.4. дорожка 12) и реагентом ip8GRCl, активированным до взаимодействия с ир9С-ДНК (дорожка 13). Из того же рисунка (дорожка 11) видно, что часть ДНК np9G фраг-ментируется после взаимодействия с np8SRCl даме без восстановления последнего боргидридом натрия.

- 14 -

Изучение проникновения полинуклеотидов и полиалкилируюцих реагентов в клетки $Н2. Проникновение в клетки полиалкилируюцих реагентов этого типа ранее не изучалось. Для изучения их действия на клеточном уровне, для получения функциональных последствий и изучения направленной модификации ДНК прежде всего необходимо изучить закономерности проникновения полиалкилируюцих реагентов данного типа в клетки БН2 и их ядра и выбрать оптимальные условия для последующего _ мутагенного действия на клетки.

Часть данной работы, связанная с культивированием клеток 5Н2, выполнена В.И.Пантиным.

Для изучения влияния перечисленных факторов на эффективность проникновения полинуклеотидов и их полиалкилируюцих производных в клетки БН2 были использованы 5М32Р1-меченные по-линуклеотиды и их производные.

Как видно из данных таблиц 1 и 2 полинуклеотиды ир8Г и их полиалкилирующие производные ир8ЯС1 проникают в клетки $Н2 и присутствуют во всех субклеточных фракциях: в мембранах, цитоплазме, ядрах. Обнаружено, что эффективность проникновения полинуклеотидов и их полиалкилируюцих.производных существенно зависит от состояния клеток: в прикрепленном состоянии клетки поглощают в 3 - 10 раз больше реагента, чем в суспензии. По-видимому, это связано с большей площадью и большей биологической активностью плазматических мембран прикрепленных (распластанных) клеток по сравнению с клетками в суспензии.

Заметное влияние на проникновение реагента оказывает концентрация клеток. При увеличении концентрации клеток в суспензии от О.З'Ю5 клеток/мл до 12-10е клеток/мл степень проникновения реагента в расчете на 1 млн клеток падает на два поряд-' ка. Очевидно, такое резкое изменение связано с агрегацией кле- ' ток в суспензии при высоких концентрациях.

Количество проникшего в клетки реагента возрастает во . времени. При этом его распределение по субклеточным фракциям практически не изменяется (таб.2). Количество проникающего реагента тр8РС1 пропорционально его.концентрации в культуральной среде, а доля проникшего реагента практически не изменяется (таб.1).

Таблица 1

Проникновение 5'-{32Р]полинуклеотидов прбГ и их полиалкили-руючих производных тр8!ЗС1 в прикрепленные клетки 5Н2* и в клетки $Н2 в суспензии*.

Реагент концентрация реагента мкг/мл Концентрация клеток, Ю^клеток/мл (плотность клеток. Ю^кл/см ) Время инкубации (ч) Степень проникновения, У.

во все клетки (без ТХУ**) 6 на 10 клеток (без ТХУ**)

прикрепленные клетки

вр8 Г ю. 0.06 (0.04) 1 0.3? 6.17

ар8ЯС1 т р 6 Я С1 ар8КС1 вр8Ш шрвЯС1 вр8ЯС1 ар8ЯС1 10 10 10 10 ю 60 250 0.06 (0.04) 6 (0.2) 6 (0.2) 6 (0.2) 0.3 (0.2) 0.3 (0.2) 0.3 (0.2) 1 0.5 1 2 1 1 1 0.09 0.50 (2.04) 0.57 (2.62) 1.06 (3.21) 0.50 0.61 0.6 1.50 0.08 (0.34) 0.10 (0.44) 0.18 (0.54) 1.67 2.03 2.67

клетки в суспензии

вр8Г ■ 10 38 0.5 0.13 (0.50) 0.003 (0.013)

тр8ЯС1 шрвяа гар8ЯС1 ир8ЯС1 10 10 10 .250 38 12 . 38 0.3 0.5 1 2 1 0.03 (0.07) 0.02 (0.10) 0.06 (0.20) 0.23 0.001 (0.002) 0.002 (0.008) 0.002 ((5.005 ) 0.77

* Ошибка измерений радиоактивности +/-' Ш.

** В скобках дана величина,- полученная без обработки радиоактивного материала на фильтре-5%-ной ТХУ.

Таблица 2

Распределение 5'-[32Р)полинуклеотидов пр8Г и их полиалкили-рующих производных шр8ЯС1 по субклеточным фракциям в прикрепленных клетках 5Н2 (А) и клетках БН2 в суспензии (Б).

Реагент концентрация реагента мкг/мл Время инкубации, ч Распределение реагентов по субклеточным фракциям. У.

мембраны цитозоль ядра

np8RCl mp8RC1 rap8RCl 10 10 10 0.5 1 2 30 22 19 61 70 71 9 8 40

шр8 f 10 0.5 2 45 53

mp8RCl 10 0.5 5 71 24

mpBRCI 10 1 7 73 20

np8RCl 10 2 10 72 . 18

Абсолютное количество полиалкилирующего реагента ip8RCl в

ядрах прикрепленных клеток в несколько раз больше, чем в ядрах

клеток в суспензии вследствие большего суммарного проникнове-

ч ч

ния в прикрепленные клетки. Оно достигает 10 -10 молекул реагента (средняя длина - 100 нуклеотидов) на одно ядро, что зк-

2 S

вивалентно 10 - 10 избытку .копий онДНК ир8 по отновению к .последовательности-мишени. Отметим, что в опытах In vitro 5-кра1тного избытка реагента было достаточно для модификации всех молекул матричной онДНК.

В прикрепленных клетках до 20-302 поглощенного реагента приходится на фракцию мембран, а для'клеток в .суспензии -.только 5-10%. По-видимому» это объясняется больней площадью и биологической активностью плазматических мембран распластанных прикрепленных клеток по сравнению с клетками в суспензии.

Полинуклеотиды mp8f проникают в клетки эффективнее, чем полиалкилирующие реагенты ( это относится и к клеткам в

шр8(

72%

9.7<Х

8.8е*

А

II СП 2

В| О]

Рис.6. Влияние ингибиторов клеточного метаболизма на проникновение полинуклеотидов гар8Г (А) и полиалкилирующих реагентов тр8!?СГСВ) в клетки 5Н2 □ Св V. на 10 клеток), из них в ядра (в У. от количества реагента, проникшего в клетки) ЕЯ . 1 - без ингибитора. 2 - в присутствии 1мМ иодацетата, 3 - в присутствии 5иН азида натрия.

суспензии и к прикрепленным клеткам). Возмоано. это указывает на различия в механизмах проникновения полинуклеотидов и их полиалкилирующих производных, различающихся по своей гидрофоб-ности, заряду, химическим свойствам.

Существование этих различий обнаруживается и в экспериментах ро изучению действия ингибиторов метаболизма на проникновение в клетки полинуклеотидов и их полиалкилирующих производных. Как видно из рис.6, ингибитор гликолиза иодацетат и ингибитор окислительного фосфорилирования азид натрия сникают •в 2- раза проникновение полинуклеотидов шр8Г и не оказывают практически никакого влияния на проникновение в клетки полиалкилирующих производных. Приведенные данные указывают на эндо-цитоз, как наиболее вероятный механизм проникновения немодифи-цированных полинуклеотидов [Ьке Б.Ь. еЬ а1 ... 19891. В случае ир8Ш , вероятно, имеет место другой механизм переноса, пассивный, не требующий больших затрат энергии метаболизма.

%

Чтобы выяснить, присутствуют ли шр8Г и шрВШ в ядрах клеток БН2 в недеградированном состоянии, клетки 5Н2 в прикрепленном состоянии обрабатывали в течение 1 часа [32Р1-мечен-ными полинуклеотидами (или полиалкилирующими реагентами ). Из ядер этих клеток выделяли нуклеиновые кислоты и анализировали их с помощью электрофореза в 0,8Х-ном агарозном геле. Оказалось, что выделенные нуклеиновые кислоты содержат радиоактивный материал, близкий по ЭФ.-подви«ности к исходным ир8Г и пр8КС1 (рис.7). Следовательно, основная часть полинуклеотидов и полиалкилирующих реагентов присутствует в ядрах клеток БН2 в недеградированном состоянии.

Изучение мутагенного действия полученных полиалкилирующих реагентов на клетки 5Н2. Заключительным этапом данного исследования является изучение эффективности и направленности мутагенного действия полученных полиалкилирующих реагентов 1п у!ио.•Эта часть работы выполнена под руководством В.И.Пантина. Культивирование, клонирование И анализ фенотипических свойств клеток выполнены Пантиным В.И. и Боровковой Т.В.

Онтисмысловому ингибированию трансляции на клеточном -уровне олигонуклеотидами различной структуры и их производными посвящено огромное количество работ, а взаимодействие комплементарно адресованных реагентов с ДНК в клетках и его функциональные последствия практически не изучены.

Клетки 5Н2 обрабатывали полученными реагентами (одним или последовательно двумя, комплементарными "+" и цепи Е1 ДНК) в среде без сыворотки при 37*С в течение 1 часа, после чего .отмывали от несвязанного реагента, инкубировали в течение су-.ток с ЮХ-ной эмбриональной телячьей сывороткой, клонировали методом лимитирующего разведения и исследовали их фенотипи-ческие свойства: способность к образованию колоний в мягком агаре, зависимость адгезионных свойств от концентрации ростовых факторов в среде, скорость деления клеток и'их-морфологию.

Как видно из таблицы 3, обработка клеток комплементарно адресованными полиалкилирующими реагентами ингибирует образование колоний в мягком агаре и сообщает измененным клеткам зависимость адгезионных свойств от концентрации ЗТС. что не характерно для трансформированных клеток.

имп/мин "10^

О

имп/мин '10

имп/мин

имп/мин

« в > ю и

Рис.7. Профиль радиоактивности 0,82 агарозного геля после электрофореза тр81*С1 (А); тр8Г (С) и нуклеиновых кислот, выделенных из клеток 5Н2. обработанных пlp8RC 1 (В) или ир8Г (О.

- 20 -

После обработки шр9СЖ1 и вр8Ш1 реагентами значительная часть клеток БН2 изменяет свою морфологию: из округлых мелких трансформированных клеток они превращаются в распластанные Фибробластоподобные клетки. Они делятся в несколько раз медленнее трансформированных и приобретают свойство делиться ограниченное число раз.

Таблица 3.

Влияние полиалкилирующих производных полинуклеотидов на фенотипические свойства трансформированных БН2 клеток.

N тип реагента + или - цепь Е1 области Образование колоний в мягком агаре */ Доля нормализованных клеток, У. по адгезии в 1 У. и 10Х ЭТС ***/

число колоний **/ У. ингиби рования

1 вр9(Ж1 ( + ). 66 +/- 5 69 29

2 гарвСРС1 (-) 100 +/- 11 53 ' 42

3 вр9еЯС1 ( + )п 108 +/- 9 49 37

ирвбШ

4 шрВГ 227 +/- 48 0 7

5 без обработки 217 +/- 17 0 6

6 тр8ЯС1 246 +/- 11 й • 9

7 без обработки 247 +/- 24 0 7

*/ Колонии с числом клеток- более 50 **/ Высевали по 500 клеток на чашку: какдая точка - 4 чашки.

***/ Разность адгезирующих клеток в 10% и IX ЭТС в X. Опыты 1-5, 6-7 - отдельные серии.

Согласно данным Пантина и Боровковой, полученным по результатам клонирования, измененные клетки с нормализованным фенотипом можно условно разделить на 3 типа (табл.4). I тип представлен клетками с замедленным делением, но способными выходить в линии. Они сохраняют свойства иммортализованных кле-

Таблица 4.

Морфологические измениния SH2 клеток при обработке полинуклеотидами и их полиалкилируюцими производными.

N Реагенты (+ или -цепь El) Количество клеток при клонировании в 96-ячеечном плато Состав клонированных клеток%

всего норма лизо-ванных

типы клеток типы клеток

1 2 3 SH2

1 2 3 SH2

1. np9GRCL(+) 5 8 3 35 26 10 16 6 68

2. rap8GRC1(-) 4 6 7 35 . 19 8 11 13' 68

3. Bp96RCl( + b ap8QRC 1( - )J 10 9 3 43 29 15 . 14 5 66

4. np9Sf( + >, mp8Gf (- )J 6 4 15 51 13 8 5 20 67

5. mp8f - 1 1 39 2 - . 2 2 96

б. up8RCl i - 1-2 0-1 52-54 2-4 - 2-4 0-2 94-96

7. без реагента - - 0-1 0-1 26-39 2-4 - 2-4 0-2 94-100

ток, но иногда после многих пассажей погибают. Клетки II типа также имеют нормализованный фенотип, но после 2-4 делений погибают. В процессе деления клетки обоих типов сохраняют фенотип нормализованных фибробластоподобных клеток. Клетки III типа . вначале подобные клеткам I и II типов, в процессе деления в течение 1-14 дней ревертировали к исходному SH2 Фенотипу.

Из данных по клонированию и анализу . фенотипических свойств клеток, обработанных полиалкилирующими реагентами, видно, что на трансформированные, содержащие Е1 аденоонкоген клетки, оказывают специфичное и эффективное влияние только адресованные реагенты mp9GRC1 и mp8GRCl, имеющие в своем составе Е1 последовательности, комплементарные интегрированному прови-русному онкогену SH2 клеток.

Влияние адресованных полинуклеотидов вероятно объясняется кратковременным антисмысловым блокированием трансляции. Неимеющие комплементарного адреса полинуклеотиды up8f и их ал-килирующие производные np8RC1 практически не действуют на фенотип и морфологию трансформированных клеток SH2. Этот факт можно рассматривать, как свидетельство направленности действия , полиалкилирующих реагентов в клетках.

Наблюдаемые морфологические и другие фенотипические изменения, такие как потеря способности давать колонии в полужидком агаре, появление зависимости адгезионных свойств от концентрации сыворотки в среде, замедление скорости деления, приводят к заключению, что действие адресованных реагентов ведет к реверсии клеток к фибробластоподобноыу фенотипу. При этом большая часть ревертировавиих клеток наследует приобретенные свойства (время наблюдения 8-12 недель), а действие реагентов специфично направлено, адресовано на интегрированный прови-русный онкоген. Таким образом, есть основания считать, что . согласно классификации Д.Ботстайна [Botstaln D. et al., 1985], в изучаемых условиях реализуется онкоген-направленный мутагенез 1п vivo. Появление наследуемых фенотипических изменений .является основанием для дальнейшего изучения комплементарно адресованного мутагенеза на молекулярном.уровне.

- 23 -ВЫВОДИ

1.Получены комплементарно адресованные реагенты нового типа -производные фрагиентированных однонитевых ДНК рекоибинантных фагов U13 со вставками смысловой и антисмысловой цепей Е1 области онкогена аденовируса обезьян SA7 (1-1750), с алкили-рующими группировками, статистически распределенными вдоль цепи полинуклеотидов.

2.Доказано, что полученные реагенты In vitro направленно взаимодействуй с комплементарными последовательностями ДНК Е1 области онкогена SA7 и модифицируют их. Разработан метод количественного элиминирования модифицированных последовательностей без повреждения протя«енной области ДНК, некомплементарной полиалкилирумим реагентам. Предложена модель для тестирования-эффективности ковалентного взаимодействия поли-алкилирувщих реагентов с ДНК-матрицей In vitro .

3.Установлено, что полинуклеотиды и полиалкилирувцие реагенты эффективно проникает в клетки SH2 и их ядра и сохраняются в течении часа без суцественной деградации' полинуклеотидной цепи. Определены закономерности их проникновения в клетки SH2 и распределения по субклеточным фракциям.

4.Показано, что действие полиалкилируюцих реагентов, комплементарных Е1 области онкогена SA7, на клетки SH2. трансформированные онкогеном SA7. вызывает наследуемую реверсию клеток к исходному фенотипу, что можно охарактеризовать как онкоген-направленный мутагенез.

5.Впервые определена первичная структура фрагмента онкогена аденовируса "обезьян SA7(C8) с 1478 по 1749 нуклеотид .

- 24 -

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сац.Н.В., Сурин В.Л., Яукова Е.Л., Гринева Н.И. Комплементарно адресованное элиминирование Е1 а области онкогена аденовируса обезъян SA7 из кольцевых однотяшевых ДНК рекомби-нантных фагов М13 // Биоорганическая химия. - 1988. - Т.14. - С.89-95.

2. N.Grlneva, G. Solovjev, N.Sats, U.Pantin, U.Surin. A.Krutov, T.Borovkova. Conpleaentary addessed îutagenesis

. and antlsense Inhibition of provirus oncogene Integrated In transforned cell line // Oligonucleotides as antisens inhibitor of gene expression, therapeutics implication. Rockvill, MD, USA. - 1389. - P.57.

3. Пантин В.И.. Соловьев Г.Я., Сац Н.В., Сурин В.Л., Еукова Е.Л., Боровкова Т.В., Гринева Н.И. Комплементарно адресованный мутагенез и антисмысловое ингибирование интегрированного Е1а онкогена аденовируса SA7 в трансформированных клеточных линиях грызунов полиалкилируючими олиго/полинук-леотидами // Доклады АН СССР. - 1990. - Г.311. -С.1487-1491.

4. Пантин В.И... Сац Н.В., Сурин В.Л.. Егоров Л.В., Соловьев Г.Я.. Боровкова Т.В.. Гринева Н.И.. Проникновение олиго/по-линуклеотидов и их полиалкилмрувцих производных в клетки крысы, трансформированные ДНК аденовируса обезьян // Молекулярная биология. - 1991. - Т.25. - С.188-195.

5. Пантин В.И., Соловьев Г.Я., Сац Н.В., Сурин В.Л.. Боровкова -Т.В., Крутов A.A., Вукова Е.Л., Гринева Н.И., Онкоген-направленный мутагенез in vivo. Лолиалкилирувчие производные коротких однотяяевых полиндклеотидов, комплементарных El-аденоонкогену. в нормализации трансформированных аденовирусом клеточных линий грызунов //.Молекулярная биология. - 1991. - С.960-973.