Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Активированные клеточные онкогены c-Ha-rasi и c-myc как мутагены: генетическое и молекулярно-биологическое исследование

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Активированные клеточные онкогены c-Ha-rasi и c-myc как мутагены: генетическое и молекулярно-биологическое исследование"

^ I х РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 575.591

БОБРЫШЕВА Ирина Вячеславовна

АХТИВНРОВАЯНЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ ОНКОГЕНЫ с-Иа-газ1 И с-иус КАК МУТАГЕНЫ: ГЕНЕТИЧЕСКОЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОПРЙСХОВ ИССЛЕДОВАНИЕ

(03.00.15 - генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1995

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики соматических клеток Института молекулярной генетики РАН. Директор -член-корреспондент РАН Е. Д. Свердлов. .

Научные руководители:

кандидат биологических наук Н.Б.Варшавер; доктор биологических наук В.3.Тарантул.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских .наук, профессор А.А.Ставровская доктор биологических наук, профессор А.В.Зеленин

Ведущее учреждение: Московский государственный университет

им-Н.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится (¿ЛЛ-рлиьЛ. 1995 г.

в _ часов на заседании специализированного Ученого Совета

(Д.001.16.01) Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478 Москва, ул.Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.

Автореферат разослан "/£ " 1995 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

доктор биологических наук, профессор Л.Ф.Курило

Актуальность проблемы. Большинство злокачественных опухолей имеет юноклональную природу, т.е. все клетки опухоли является потомками од-юй клетки, претерпевшей наследуемое изменение генетического катериа-ia. Однако хорошо известен факт гетерогенности опухоли, возникающей в 1роцессе ее роста (Pathak, 1990) . Опухоль начинает представлять из се-' 5я популяцию различных по генотипу клеток, отличающихся по таким приз-)акам, как: морфологические изменения, степень дифференцированное™/ ;пособиость к нетастазированию и др. Причем, генетическая нестабильность опухолевых клеток возрастает по мере продвижения опухоли по пути злокачественной трансформации (Kendal, Frost, 1986; Hill, 1990). Показано, что опухолевые клетки и трансформированные клеточные линии ха-зактеризуюгея высоким уровнем хромосомной изменчивости (Погосянц, 1981; Yunis, 1983; Howell et al., 1976). Мутабильность опухолевых клеток проявляется также в их способности повышать частоту генных мутаций 5 экзогенной ДНК, введенной'в клетку. Так, при пассировании вируса герпеса в опухолевых клетках человека частота генных мутаций в вирус-юй ДНК повышалась в четырех из пяти линий в 4-10 раз по сравнению с <октрольными нетрансформированными клетками (Bockstahler et al.,1982). <роме этого была выявлено повышение частоты индуцированных мутаций при увеличении метастазирующего потенциала первичных опухолей молочной же-1езы мыши (Yaaiashina, Heppner, 1985). Все эти данные позволили высказать предположение о возможном повышении темпа спонтанного мутагенеза з опухолевых клетках не только на хромосомном, но и на генном уровне.

Каковы же те факторы, которые могут способствовать ускорению мутационного процесса? В настоящее время убедительно показано, что тредставители всех групп онкогенных ДНК-содержащих вирусов являются 1утагеками (Shapiro et al., 1984; Pilon et al., 1985; Teile et al., 1980; Giles et al., 1991). Причем для двух из них (SV40 и BAV3) уста-ювлено, что это свойство KoppejinpyeT с биологической активностью их жкогенов (гена Т-антигена SV40 и области Е1А бычьего аденовируса) IGorbunova et al., 1982; Lukash et al., 1985). Представлялось вероят-шм, что и активированные клеточные онкогены могут являться теми факторами, возможно не единственными,.которые определяют повышение гене--ической изменчивости опухолевых клеток.

Задачи исследования. Задачей работы явилось изучение мутагенного . |ффекта активированных клеточных онкогенов. Для изучения были выбраны >нкоген c-Ha-rasl, чвыделенный из линии клеток EJ карциномы мочевого гуэыря человека, и онконген с-шус из мышиной плазмоцитомы МОРС 315.

Научная новизна. В результате проведенной работа впервые были по-

лученные данные о кутагеккой активности активированных клеточных онк генов c-Ha-rasl и с-тус. Показано повышение как частоты генных мутац резистентности к аналогам пуриновых оснований, так и частоты хромосо ных аберраций в клетках китайского хомячка под влиянием данных онког нов. Тот факт, что два клеточных онкогена, причем отличавшихся по сп цифике действия и локализации их продуктов в клетке, характеризует мутагенным эффектом, говорит в пользу предположения о -том, что актив рованные клеточные онкогены могут вносить вклад в определение генет ческой изменчивости злокачественных клеток.

Практическая значимость. Обнаружение факторов, отвечающих за п< вышени'е генетической изменчивости опухолевых клеток представляется а: туальиын в связи с важностью изучения механизмов канцерогенеза. Обще! ризнаио, что данный процесс является многоэтапным, причем в злокачес-венном перерождении клетки принимает участие несколько онкогенов (Lai et al., 1983: Bishop, 1987). To есть, для становления опухолевого фен! типа необходимы нутационные изменения в нескольких протоонксгека: приводящие к их оккогекной активации, а также мутации, выключающие rt ны-супрессоры злокачественной трансформации. Поэтому, факторы, повышг ющие мутабильность клетки, увеличивают вероятность активации новых ov когенов и, следовательно, продвижение клетки по пути злокачественное перерождения. Тахим образом, обнаружение мутагенной активности у акту вированных клеточных.онкогенов может иметь значение для понимания прс цессов, приводящих к малигнизации.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

1. Активированный клеточный онкоген c-Ha-rasl индуцирует ' геннъ мутаций и хромосомных аберраций в культивируемых клетках млекопитающи

2. Индуцированные онкогеном c-Ha-rasl мутантные клоны имеют ста 'бильный мутантный фенотип, многие из них являются 1еаку-мутантами.

3. Механизм действия онкогена не связан с экспрессией стабильи интегрированного онкогена и принадлежит к: типу "hit-and-run'.".

4. Мутагенным эффектом облабает также активированный клеточны онкоген с-тус, что подтверждает представление о распространенное данного явления и рели клеточных онкогенов в определении генетичесхо нестабильности опухолевых клеток.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюз ной конференции по генетихе соматических хлеток в культуре (Москва 1989), совещании "Биология клетки в культуре". (Санкт-Петербург, 1992) VI съезде ВОГиС (Минск, 1992), на конференции по генетике сонатичесхи: клеток в культуре (Черноголовка, 1993), I съезде ВОГиС (Саратов,1994)

Объем диссертации. Материал диссертации изложен яа Iстраницах шинописного текста, содержит' V рисунков и <0 таблиц. Список цити-эванной литературы состоит из 2-72-работ.

Основные результаты получены автором самостоятельно. Результы по «дукции генных мутаций получены "совместно с Е.М.Барон.

\ ' ' МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Клетки и условия их культивирования^ Работу проводили на клетках ^бклона 7-84 , выделенного из клона 2379 спонтанно трансформированной' еревиваемой линии фибробластов китайского хонячка Blld-i Í-FAF28. летки выращивали на среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного огатого скота. При разреженном посеве (100 клеток на чашку диаметром 00 мм) в среду добавляли 20 % сыворотки. В экспериментах по проверке иологической активности онкогена c-Ha-rasl использовали крысиные летки псевдонормальной линии Rat-2. Клетки культивировали на среде гла с добавлением 10% эмбриональной сыворотки.

Плазмиды. В работе были использованы плазкида рЕЗб.б, содержащая ктивировакный клеточный онкоген c-Ha-ras-l из линии клеток ЕЗ харци-омы кочевого пузыря человека (Shih, Weinberg,1" 1982), и плазмида SVc-myc-1, содержащая активированный клеточный онкоген с-шус из ДНК ышиной плазмоцитомы МОРС 315 (Land et al-, 1983). А также плазмиды: SV2neo, несущая ген пеог, обуславливающий резистентность к неомицину Southern, Berg, 1982), и pBR322.

Трансформация клеток млекопитающих. Введение ДНК в клетки клеко-итающих осуществляли методом кальций-фосфатного преципитата в модифи-ации Виглера (Wigler et al., 1980). Для обработки 1 или. клеток ис~ ользовали 4-60 икг плазнидной ДНК, при малых дозах добавляли высоко-оликернуп ДНК тимуса теленка в качестве носителя до суммарной дозы 20 кг. Клетки инкубировали с преципитатом 18 ч.

Эксперименты по индукции генных мутаций. Модельной системой для зучения мутагенеза в клетках китайского хомячка служил ген hprt, ко-ирующий фермент гипоксантин-фосфорибоэилтрансфераэу (Г<РРТ). Снижение ли потеря^активности Г9РГ приводит к появлению в клетках реэистент-ости к аналогам пуриновых оснований. С момента обработки до начала елекции клетки проходили 2-3 генерации на неселективной среде для фе-отипической экспрессии мутации. Селекцию мутантов, резистентных"'к налогам пуриновых оснований, осуществляли на среде, содержащей 30 кг/мл 6-меркаптопурина (6МП) или 1 мкг/мл б-тиогуанина (6ТГ), в тече-

ние 12-14 дней, меняя среду каждые 3-4 дня. Подсчет окрашенных колон! проводили на шифрованных чайках. Учитывали колонии. Содержащие не Mi нее 100 клеток. Частоту мутантов определяли по отношению выросших Ki лоний к числу посеянных клеток с поправкой на их выживаемость, котор; определяли при параллельном разреженном посеве клеток в неселективн) условия как отношение числа выросших колоний к числу посеянных клето: Число индуцированных мутантов оценивали по разности между частотой м; тантов в опытных и контрольных вариантах.

Определение частоты генетической трансформации. Контроль эффе; тивности процесса трансформации клеток китайского хомячка проводи, путем оценки частоты генетических трансформантов по гену пеог, возн: хающих при котрансфекции изучаемых плазиид с плазмидой pSV2neo в соо' ношении 10:1. Селекцию Neor-трансформаитов осуществляли на среде, ci держащей 1 мг/ня антибиотика G418. Селективную среду меняли каждые 3-дня в течение 12-14 дней. Частоту генетических трансформантов вычисл; Ли как отношение числа С418-резистентных колоний к числу посеянш клеток, вводя поправку на их выживаемость.

Получение Фокусов морфологической трансформации. Для проверки 6i алогической активности онкогена c-Ha-rasl клетки Rat-2 noflBepraj трансфекции изучаемыми плаэкидами и рассевали на неселективную сред) содержащую 10 % сыворотки. После достижения клетками монослоя снижау процент сыворотки до 3% с"последующей сменой среды каждые 3-4 дня. Ф< кусы морфологической трансформации окрашивали и считали на 9-12 день Приготовление и анализ препаратов метафазных хромосом. Индукщ хромосомных аберраций в клетках китайского хоиячка изучали на 3-й су: ки после трансфекции. Препараты метафазных хромосом готовили по ста1 дартной методике (Zakharov et al., 1964). Кариологический анализ npt водили на шифрованных препаратах. Исследовали метафазные пластинки хорошим разбросом хромосом, содержащие 16-20 хромосом (модальное чиа хромосом 13). В каждом варианте анализировали по 100 - 250 метафаз.

Получение мутантов, индуцированных онкогеном. Для повышения вер< ятности выделения мугантвых (ГФРТ") клонов, индуцированных онкогенo¡ была применена схема флуктуационного теста (Luria, Delbrück, 1943] так как при такой постановке эксперимента возникают культуры, в коте рых.в ходе подращивания не возникло ни одной спонтанной мутации, т.е культуры с "нулевым фоном", из которых и были изолированы индуцирова! ные мутантные клоны. '

Характеристака индуцированных нутантных клонов. Мутантные кло1 культивировали в неселективных условиях в течение 5-17 пассажей и прс

зводили массовый и разреженный посев клеток каждого клона на четыре зрианта сред: 1 - неселективную среду (эффективность посева); 2 - с обавлением 1 мкг/мл 6ТГ; 3-е добавлением 0,5 мкг/нл 6ТГ; 4-е до-авлениен 13,б.ккг/кл гипоксантина, 3,9 мкг/кл тимидина и 0,18мкг/мл миноптерина (среда HAT).

Статистическая обработка результатов. Достоверность различий межу ' частотой мутантов в опытном и контрольном вариантах определяли по эитерию ф Фишера, применяемому при сравнении двух малых выборочных элей. Значимость различий между двумя совокупностями данных (в опыте в контроле) оценивали по критерию Вилкоксона для сопряженных пар Урбах, 1964).

Все работы с ДИК (получение делеционных производных плазмиды EJ6.6, получение компетентных клеток Е. coli и их трансформация плаз-лдиой ДНК, выделение плазмидной ДНК из Е. coli щелочным методом и ае чистку, выделение .высокополимерной эукариотической ДНК из культуры четок и др.) проводили по общепринятым методикам (Маниатис и др., Э84) с модификациями.

Блот-гибридизация. Перенос ДНК на кктроцеллюлозные фильтры,полу-гние меченых 32 Р зондов„для гибридизации с фильтрами и гибридизацию зуществляли по методу Саузерна (Southern, 1975).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ

I -Мутагенная активность плазмиды рЕДб.6

Х.1. Индукция генных иугаций поп действием плазмиды рЕЭб.б. Плаз-ада рЕЗб.б сконструирована на основе вектора PBR322, в BamHI-сайт ко->рого встроён 6,6 тпн фрагмент генома человека, несущий активирован-1й клеточный онкоген c-Ha-rasl (рис.1). Поэтому в качестве контроль-)й на данном этапе работы была взята векторная плазмида pBR322.

Биологическая активность используемых в работе препаратов ПС плазмиды рЕЗб.б была проверена в экспериментах по трансфекции :евдонорнальных крысиных клеток Rat-2. При дозе 2 мкг ДНК плазмиды ;Э6.б на 300 тыс. клеток фокусы морфологической трансформации, свиде-¡льствующие об онкогенном потенциале плазмиды, возникали с частотой :10"4 , в то время как г.лазмида pBR322 при тех же условиях трансформа-[и не вызывала образования фокусов.

В таблице 1 представлены результаты опытов по индукции нутаций IPT" под действием плазмиды рЕЭб.б по сравнению с pBR322. На основе >едварительных экспериментов была выбрана доза 20 мкг плазмидной ДНК

на 1 млн. клеток. Наблюдается заметное увеличение частоты мутантов т сравнению с контролем (в среднем в 2,6 раза). Величина индукции, определенная по разности между частотой резистентных колоний в опытном 1 контрольной вариантах, колеблется от 0,02 до 6,54 х 10"5 и достоверн: по критерию 9 Филера в пяти из семи опытов. Несмотря на вариабельност! результатов, характерных для работы с культурой клеток, анализ все] совокупности данных по критерию Вилкоксона для сопряженных пар позво ляет сделать вывод о достоверности наблюдаемой индукции генных мутаци: (Р < 0,05).

Х.2. Индукция хромосомных аберраций под действием плазмид! РЕЭ6.6. Результаты экспериментов приведены в таблице 2. Видно, чп плазмида рЕЛб.6 индуцирует хромосомные аберрации во всех трех опытах Процент аберрантных метафаз повышается по сравнению с контролем в 1,: - 3,4 раза. Аналогичная картина наблюдалась и при оценке числа разры вов на клетку (данные не приведены), которое после воздействия плазми ды рЕЭб.б превышала контрольный уровень в 1,3 - 4,6 раза. Анализ раз личий между опытвыми и контрольными вариантами как по частоте абер рантных метафаз,так и по числу разрывов на клетку по критерию ф Фишер, показал, что они достоверны в двух опытах из трех. В опыте 2 различи; статистически недостоверны, несмотря на полное совпадение значений чисел разрывов на клетку и близкие цифры процентов аберрантных метафаз I аналогичными данными в'опыте 3." Это, очевидно, обусловлено неньши; объемом выборки в опыте 2.

Рис. 1. Рестрнктная карта плазмиды рЕЗб.б. Размер плазмиды - 11 тпн Штриховкой выделен 6.6 тпн фрагмент генонной ДНХ, несущий активирован ный клеточный онкоген с-На-гаэ!. Черным цветом показаны экзоны.

Таблица 1. Индукция генных мутаций ГФРТ" в клетках китайского хомячка под действием плаэмиды рЕЭб.б по сравнению с рВН322.

N Частота мутантов х10 (с поправкой на выживаемость) Индукция

оп. опыт (рЕЛб.б) контроль (рВК322) отношение опыт/контроль разность опыт-контроль х 10" 5 ^ Р

1 10,50 6,74 1,6 3,76 <0,05

2,13 0,65 3,3 1,48 <0,05

3 3,15 0,55 5,7 2,60 <0,001

4 10,90 4,36 2,5 6,54 <0,001

5 1,77 1,75 1,0 0,02 >0,05

6 5,85 ' 2,06 1 2,8 3,79 <0,01

7 2,68 2,08 1,3 0,60 >0,05

Примечание. Селекцию ГФРТ"-мутантов осуществляли на селективной среде, содержащей 6МП. Эффективность посева не отличалась в опытных и контрольных вариантах обработки и колебалась от 50 до 100 %.

Таблица 2. Индукция хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка под действием плаэмиды рЕЭб.б по сравнению с рВК322.

N Доза ДНК на 1 млн. клеток Число исследован, метафаз % аберрантных метафаз Индукция

оп О К О К отношение О / К разность 0 - К, % Р

1 15 150 150 11,3 3,3 3,4 8,0 <0,01

2 20 150 150 14,0 10,6 1,3 3,3 >0,05

3 20 250 200 13,6 9,0 1,5 4,6 <0,05

Примечание. 0 -К - опытные варианты (рЕЗб.б), контрольные варианты (рВК322)

Таким образом, результаты экспериментов по индукции хромосомные аберраций и генных мутаций хорошо согласуются. Анализируя совокупноси полученных данных, можно сделать вывод,, что плазмида рЕЗб.б, несуща! активированный клеточный онкоген человека c-Ha-rasl, обладает мутагенной активностью.

Необходимо отметить, что в работе не ставилась задача выяснени: мутагенного эффекта экзогенной ДНК, в данном случае pBR322. Известно, что введение в клетку экзогенной ДНК повышает ее мутабильность. Существуют данные о мутагенном действии плаэмиды pBR322, повышающей частоту мутаций Г<РРТ~ в клетках мыши NIH ЗТЗ в несколько раз по сравнена с необработанными клетками (Brandt et al., 1987). В то же время в ряд< работ других авторов у данной плазииды мутагенного эффекта не обнаружено (Theile et al., 1976; Razzaque et al., 1984). Возможно, обнаружение мутагенности последовательностей ДНК зависит от применяемых в ра боте методов селекции мутантов, особенностей клеточных систем и т.п Полученные нами результаты по изучению мутагенной активности плазнид! pBR3 22 также были противоречивы и не позволяли сделать вывода о ее мутагенном действии. Если, тем не менее, допустить, что pBR322 таким эффектом обладает, то в сравнении с "mock"-вариантом (обработка каль ций-фосфатным преципитатом, не содержащим ДНК) плазмида рЕЗб.6 должн; обладать еще большим мутагенным эффектом, а величина индукции мутаци; под действием,рЕЗб.6 "относительно pBR322 является заниженной.

Необходимо отметить, что в настоящей работе использовали спонтан но трасформированные клетки китайского хомячка, которые обладают мно гими характерными признаками опухолевого фенотипа, вплоть до способ ности вызывать опухоли при инъекции в сингенных животных, а также име ют высокий уровень мутабильности. Тем не менее, несмотря на исходи» высокую генетическую нестабильность клеток, в работе удалось выявит мутагенное действие плазииды рЕЗ6.6, что подтверждало исходное предпо ложение о наличии мутагенной активности онкогена c-Ha-rasl.

Однако нельзя было исключить обусловленность мутагенного эффект какими-либо другими последовательностями в составе плазмиды рЕЭб.б т.к. покимо биологически активного онкогена она содержала также флан кирующие его последовательности человеческого геноиа. Поскольку основ ной. задачей данной работы являлось вычленение мутагенного действи именно онкогена, а не используемой конструкции ДНК вообще, то дл окончательного решения вопроса о специфическом мутагенном действи c-Ha-rasl была проведена серия дополнительных исследований с боле строгими контролями.

<_

II. Роль активированного клеточного онкогена c-Ha-rasl в мутагенной эффекте плазмиды pEJ6.6

11.1. Создание контрольной плазмиды pEJdl с инактивированным он-эгеном. Инактивацию онкогена c-Ha-rasl осуществляли с помощью делеции »большой части кодирующей последовательности. Для получения делецион-эго контроля были проведены рестрикция плазмиды рЕЭб.б по Xbal- и эп1-сайтам, обработка линейных молекул ДНК эхзонуклеазой Ва131, лиги-эвание укороченных молекул, трансформация Е. coli НВ101 и отбор коло-1й, содержащих делеционные "варианты плазмиды нужного размера. Из порченной серии делеционных вариантов плазмиды с помощью р'естрикционно-5 анализа была выбрана плазмида pEJdl с наименьшей делецией (= 0,3 IH), включающей первый ингрон и слегка затрагивающей границы первого

второго экзонов.

11.2. Проверка биологической активности плазмиды pEJdl ■ Данная тазмида была проверена на биологическую активность по способности вызвать фокусы морфологической трансформации при введении их в псевдо-зрмальные крысиные клетки Rat-2. В отличие от плазмиды рЕЗб.6 с ий-1ктным онкогеном, вызывающей фокусы трансформации с частотой 1х10~4 » 1 мкг ДНК, плазмида pE3dl их не вызывала. Следовательно, полученная глеция инактивировала онкоген и данная конструкцияс^могла быть исполь-звана в качестве контрольной.

II-. 3. Индукция генных мутаций под' действием активированного кле-зчного онкогена c-Ha-rasl. Результаты опытов по индукции мутаций №Т~ в клетках китайского хомячка плазмидой рЕЭб.б по сравнению с шэмидой pEDdl приведены в таблице 3. В опытах 4-6 контроль эффектности трансфекции осуществляли путем оценки частоты генетических зансформантов по гену пеог, возникающих при котрансфекции изучаемых '.азкид с плазмидой pSV2neo. Частота G418-резистентных колоний была шзкой по значениям в разных опытах и имела порядок 10~4 Эти данные ззволягат сделать вывод, что применяемая методика введения ДНК обеспе-!вает достаточно высокий уровень трансформации и может быть использо-ша для оценки мутагенного действия изучаемых плазмид. Как видно из 1блицы 3, во всех шести опытах наблюдается индукция мутаций под денежен плазмиды с активным онкогеном (рЕЭб.б) по сравнению с плазмидой инактивированным онкогеном (pECJdl) в среднем в 1,6 раза. Величина [дукции, определяемая по разности между частотой резистентных колоний опытном и контрольном вариантах, варьирует от 0,39 до 5,26 х 10"5 и ютоверна по критерию <р Фишера в трех опытах из шести. Несмотря на > что наблюдаемый мутагенный эффект был слабым, анализ всей совокуп-

Таблица 3. Индукция генных иутаций ГФРТ"" _ в клетках китайского хомячка под действием плазмиды рЕЗб.б по сравнению с рЕЗсЛ.

N Доза ДНК на 1 Частота мутантов (с поправ, на выживаем.) х Ю"5 Индукция Частота С418г колоний на 1мкг ДНК (с попр. на выживаем.)х10~4

оп. клеток К О отнош. 0 / к разность 0-КхЮ"5 Р " ч К \ О

1 20 9,63; 10,50 1,1 0,87 >0,05

2 20 1,32 2,69 2,0 1,36 <0,05

3 15 5.23 10,49 2,0 5,26 <0,05

4 15 2,34 2,73 1,2 0,39 >0,05 2,00 2,30

5 20 1.25 1,86 1,5 0,61 >0,05 1,71 1,10

6 20 1Д5 2,11 1,8 0,96 <0,05 6,18 6,^0

Примечание. О - опытные варианты (рЕЛб.б), К -контрольные варианты (рЕЗсЦ)., В опытах 1-3 селекцию ГФРТ" -мутантов осуществляли на среде, содержащей 30 икг/мл 6МП, а.в опытах З-б-на среде, содержащей 1 ккг/нл бТГ. Эффективность посева не отличалась в опытных и контрольных вариантах обработки и колебалась от 60 до 100 %.

ности данных по критерию Вилкоксона позволяет сделать вывод о ' досто верности наблюдаемых различий в опытном и контрольной вариантах (Р 0,05).

Таким образом, полученные результаты говорят о наличии кутагенно активности плазмиды рЕЗб.б, несущей активированный с-Нагаз1, по срав нению с плазмидой рЕСс11, в которой данный онкоген инактивировак. Прин ципиальныи отличием опытной плазмиды от контрольной являлось наличи< экспрессируемого онкогена. Нуклеотидные последовательности обеих плаз кид практически идентичны.- Следовательно, можно утверждать о непос редственной роли активированного с~На-гае1 в индукции нутаций ГФРТ* Однако в опытах, представленных в таблице 3, величина индукции нес колько ниже, чей в тех опытах, где в качестве контроля использовал] плазмиду рБК322 (таблица 1). Поэтому нельзя исключить того, что в мутагенный эффект плазииды рЕОб.6 определенный вклад вносят также какие-то другие плазиидные последовательности.

Величина индукции иутаций под действием активированного клеточного онкогена с-На-гагг несопоставимо ниже величии, получаемых в экспериментах по химическоиу мутагенезу. Однако она сравнима с величине!

вирусного мутагенеза. Так, вирусы SV40 и BAV3 вызывают повышение частоты ГФРТ--мутантов в культивируемых клетках в 2 - 9 раз (Spapiro et al.,1984), а человеческие полиомавирусы BKV и 3CV в 1,5 - 6 раз (Thei-le et al., 1980). ' .

III. Характеристика мутантов, индуцированных онкогеном c-Ha-rasl. и природа мутагенного действия онкогена III.1. Выделение ГФРТ"-мутантов, индуцированных c-Ha-rasl. Для выяснения вопроса о механизме возникновения индуцированных онкогеном мутаций, т.е. связан ли он с инсерцией онкогена в геномную ДНК или действует иной механизм, была поставлена задача выделения 6ТГ-резистентных клонов клеток китайского хомячка, индуцированных онкогеном c-Ha-rasl, их характеристика и исследование присутствия в их геноме экзогенных ras-последовательностей человека.

Для повышения вероятности выделения мутантов, заведомо индуцированных онкогеном, необходимо было освободиться от фона спонтанных мутантов. С этой целью была использована специальная методика на основе схемы флгактуациоиного теста (Luria, Delbrück, 1943). Поскольку подращивание независимых культур начинали со 100 клеток на чашку, а исходная частота спонтанных ("фоновых") мутантов в популяции имела порядох 10"5, то при такой постановке эксперимента практически снималась вероятность внесения в культуру "фоновых" мутантов. Вследствие того, что мутации возникают в независимых культурах в процессе их подращивания разновременно, появляются культуры, в которых за этот период не возникало ни одной спонтанной мутации, ("нулевой" фон). Мутантные (ГФРТ") клоны изолировали только из тех опытных субкультур (трансфекция плаз-мидой рЕЭб.6 с активным c-Ha-rasl), которые имели "нулевой фон" в параллельных контрольных субкультурах (трансфекция плазмидой р£МГ с инактивированным онкогеном).

Было выделено 10 нутантных клонов из 6 независимых культур с "нулевым фоном" в параллельных контрольной и "mock" субкультурах. Расчеты показывают, что вероятность того, что хотя бы один из этих клонов является спонтанным, имеет порядок 10~2.

IXX.2. Характеристака индуцированных мутантов. Для характеристики выделенных мутантов, индуцированных онкогеном c-Ha-rasl, и подтверждения мутационной природа выявляемой резистентности была проверена стабильность признака. Показано, что мутантные клоны после культивирования в неселективных условиях (5-17 пассажей) сохраняли способность расти на среде с 6ТГ как в массовом (данные не приведены), так и в

разреженном посеве (таблица 4). Сохранение у выделенных клонов резистентности к 6ТГ в ряду клеточных локолений вне селективных условий свидетельствует о мутационной природе изменений. Однако во многих случаях степень резистентности к токсичному аналогу оказалась ниже ожидаемой. Несмотря на то, что мутантные клоны были выделены при селекции на среде, содержащей 1 мкг/мл 6ТГ, некоторые из них (2-V-1.2-VII-1, 2-VIII-l, 3-VI-1) имели низкую эффективность клонирования при данной дозе. Объяснение этому явлению может быть дано, исходя из хорошо известного факта влияния сыворотки на селекцию резистентности к аналогам, пуриновых оснований. Известно, что недиализованная сыворотка содержит значительные количества свободных пуринов, содержание которых варьирует в зависимости от различных серий сыворотки. Обогащенность сыворотки пуриновыми основаниями может приводить к увеличению резистентности клеток к токсичным аналогам, не связанной с возникновением мутации. Индуцированные мутанты были выделены в трех независимых экспериментах, в которых использовали различные партии сывороток. Можно предположить, что в первом опыте, в котором оба выделенных клона (1-VI-1 и 1-V1-2) были высокорезистентны, сыворотка была бедна пуринами и, следовательно, условия селекции более жесткими. При снижении дозы 6ТГ до 0,5 мкг/мл выживаемость клонов во всех исследованных случаях существенно повышалась.

Некоторая чувствительность к 6ТГ нескольких мутантных Клонов, по-видимоиу, обусловлена сохранением, частичной активности фермента ГФРТ. К этому же выводу приводят результаты их культивирования на среде НАГ, содержащей гипоксантин (источник пуринов), аминоптерин (ингибитор биосинтеза пуринов и пиримидинов de novo) и тимидин (источник пиримидинов) (таблица 4). Как известно, для роста на данной селективной среде необходима активность фермента ГФРТ, так как при блокировании синтеза пуринов de novo клетки должны сохранять способность утилизовать гипоксантин в качестве источника пуринов. Только 2 клона из 10 (1-VI-1 и 1-V1-2) оказались нежизнеспособными на данной среде, что свидетельствует о практически полной потере ферментативной активности. Выживаемость большинства изученных клонов колебалась от нескольких единиц до высоких значений, что очевидно было вызвано, как уже сказано,'. сохранением частичной активности фермента ГЧ>РТ.

Дополнительное культивирование двух клонов (2-Х-1 и. 2-V-1) на среде с 1 мкг/мл 6ТГ с последующим переводом на селективные среды (6ТГ и HAT) не изменял их соответствующие эффективности посева (таблица б). Это говорит о том, что относительно слабая резистентность этих клонов

Таблица 4. Выживаемость мутантных клонов и исходного клоиа 7-84 на селективной (6ТГ) и контрселективной (HAT) средах

КЛОН Число Эффективность ВЫЖИВАЕМОСТЬ, % (с учетом эффективности посева)

опытов посева. 6ТГ HAT

% 1 мкг/мл 0,5 мкг/мл

Контроль 7-84 15 100 0 0 100

1-VI-1 2 46 90 111 0

1-VI-2 2 40 33 94 0

2-1-1 2 63 38 78 "48

2-1-2 5 81 36 63 93

2-V-1 3 83 10 24 11

2-VII-1 2 90 16 33 9

2-VII-2 2 ' 82 49 82 38

2-VIII-1 2 67 7 17 15

3-IV-1 _ 2 . 60 - - ни 73

3-VI-1 1 26 8 ни 5

Примечание. Контрольные клетки при массовом посеве имеют частоту бТГ-резистентных колоний в среднем 1 х 10~5; ни - не исследовано.

Таблица 5. Влияние культивирования мутантных клонов на селективной (6ТГ) среде на их резистентность к 6ТГ и HAT.

Клон

Культивирование на 6ТГ

Эффективность посева; X

Выживаемость, % (с учетом эффективности посева)

6ТГ 1МКГ/МЛ

6ТГ -0,5 мкг/мл

HAT

2-V-X 2-V-I

69,0 47,7

8,4

9,8

29,8 34,2

2-1-2 2-1-2

61,5 67,2

29,0 33,8

60,7 -66,7

86,3 90,1

+

+

не является следствием гетерогенности популяции (присутствием в выделенных клонах как мутантных ГФРТ-, так и нормальных ГФРТ* клеток), поскольку чувствительные клетки при дополнительной селекции должны были элиминировать. Следовательно, приведенные в таблице 8 результаты подтверждают предположение о сохранении клетками данных клонов некоторого уровня активности фермента.

Различная степень резистентности к 6ТГ, а также способность большинства мутантных клонов расти как на селективной (6ТГ), так и на контрселективной (HAT) средах говорит о сохранении у них частичной, ферментативной активности. Анализ литературных данных показывает, что подобный тип "аномальных" мутантов не является редкин событием. Выло показано, что мутанты, резистентные к аналогам пуриновых оснований, способны расти на среде HAT даже в тех случаях, когда, у них сохраняется всего 2-10% нормальной активности ГФРТ (Gillin et al, 1972; Волкова и др., 1981). Следует подчеркнуть, что нногииц авторами отмечается существенное (до 200 раз) увеличение активности фермента при блокировании аминоптерином синтеза пуринов de novo. Таким образом, "аномальные" мутантные клоны, как правило, обладают сниженной активностью фермента ГФРТ, позволяющей им расти на средах с токсичными аналогами (6ТГ). Однако увеличение ферментативной активности при ингибировании биосинтеза пуринов de novo способствует выживанию мутантных клеток на среде HAT. Все эти данные свидетельствуют в пользу представления о том, что мутанты, способные к росту и на селективной среде, содержащей аналоги пуриновых оснований, и на контрселективной среде HAT, сохраняют частичный уровень активности ГФРТ и являются leaky-мутантами, которые, как известно, в большинстве случаев возникают в .результате missen-se-мутаций'.

XII.3. Определение присутствия в геноме индуцированных мутантных клонов экзогенных ras-последовательностей человека. Анализ с помощью блбт-гибридизации по Саузерну не выявил наличия ras-последовательнос-тей человека и других последовательностей плазниды рЕЭб.б ни у одного из 10 мутантов, индуцированных c-Ha-rasi(рис. 2). Эти данные позволяют сделать вывод, что бТГ-резистентность индуцированных клонов не связана со стабильной инсерцией плазниды рЕЗб.6, несущей активированный онкоген человека c-Ha-rasl, в геномную ДНК, а следовательно и с постоянной экспрессией данного онкогена. Так как не обнаружено стабильной интеграции онкогена, то, вероятнее всего, он оказывает свое мутагенное действие на ранних сроках после введения плазмидной ДНК в клетки, как это было показано для онкогенных ДНК-содержадих вирусов." Очевидно, в

данной случае механизм мутагенного действия онкогена можно отнести к типу "hit-and-run". Этот механизм получил подтверждение в работах по индукции мутаций и злокачественной трансформации, вызываемой некоторыми вирусами.

IV. Мутагенная активность активированного клеточного онкогена c-mvc Для ответа на вопрос, является ли наблюдаемый мутагенный эффект специфичной особенностью онкогена c-Ha-rasl или он присущ и другим активированным клеточным онкогенам> было исследовано мутагенное действие плазмиды pSVc-myc-1, содержащей другой активированный клеточный онкоген с-тус.

Во всех экспериментах по изучению индукции генных мутаций (ГТОТ") и хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка под влиянием плазмиды pSVc-myc-1 в качестве контроля использовали плазмиду pSV2neo (рис.3). Выбор контроля был основан на том, что обе плазмиды принадлежат к одному семейству вектора-прототипа pSV2 и отличаются друг от друга лишь последовательностями клонированных генов. К тому же при-

12345678

Рис. 2. Блот-гибридизация геномной ДНК (15-30 мкг) мутантных клонов, исходного клона 7-84 и клеток ЕЭ с плазмидой рЕЛб.6 (Итпн), меченной 32Р. Рестрикция ЕсоИ1 - 1-6; рестрикция ВашН1 - 7,8. Мутантные клоны -1-3. Негативный контроль: родительский клон 7-84 (6). Позитивные конт-роли: 7-84 + 1 копия рЕЗб.6 на гаплоидный геном (5,7); 7-84 + 10 копий рЕЗб.б на гаплоидный геном (4); линия ЕЗ клеток карциномы мочевого пузыря-человека, из которой был клонирован 6,6 тпн ВатН1-фрагмент, содержащий активированный с-На-газ1 (8); эндогенные газ-гомологичные хо-мячковые последовательности, имеющие идентичное расположение полос у исходного и мутантных клонов.

сутствие в контрольной плазмиде гена Neor позволяло одновременно с исследованием мутагенеза оценивать эффективность трансфекции (по числу, G418-резистентных колоний). В опытных вариантах для той же цели применяли котрансфекцию плазмиды pSVc-myc-1' с плазмидой pSV2neo в соотношении 10:1. Частота генетических трансформантов на 1 нкг ДНК плазмиды pSV2neo имела близкие значения во всех экспериментах и тот же порядок 10"4 (таблица 6), что и в экспериментах по индуцированному мутагенезу под действием онкогена c-Ha-rasl.

IV.l. Индукция генных мутаций под действием плазмиды pSVc-myc-1.• Полученные результаты по индукции генных мутаций представлены в таблице 6. Как показывают данные таблицы, частота мутантов ГФРТ" в 6 опытах из 7 превышала уровень, наблюдаемый в контроле и имела порядок 10~5-1076. Частота мутантов в опытных вариантах по отношению к контролю составляла в среднем 1,6. В трех экспериментах разница между опытными и контрольными вариантами была достоверна по критерию ({> Фишера, а оценка всей совокупности опытов по критерию Вилкоксона говорит о достоверности факта индукции (Р<0,05), , несмотря на относительно слабый мутагенный эффект, как и в случае с онкогеном c-Ha-rasl.

IV.2. Индукция хромосомных аберраций под действием плазмиды pSVc-myc-1. Во всех грех опытах, представленных в таблице 7, частота -хромосомных аберраций после воздействия плазмиды pSVc-myc-1 была выше их частоты в контроле, причем эта разность во всех случаях была достоверна по критерию (р 'Фишера.

Рис.. 3. Структурная организация плазмид рЗУс-шус-1 и рБУгвео. Штрихов-хой выделены последовательности вируса SV40:. РЕ„40 - промотор раннних генов БУ40; ААА - область, содержащая сигнал полиаденилирования и инт-рон малого 1.-антигена. Черным цветом обозначены клонированные гены, цифрами - экзоны гена с-шус.

Таблица 6. Индукция генных мутаций ГФРТ" в клетках китайского хомячка под действием плазмиды рЭУс-тус-! по сравнению с рЭУ2пео.

N Частота мутантов (с поправкой на выживаемость) х 10"5 Индукция Частота С418г колоний на 1мкг ДНК (с попр. на выживаем.)х10

оп. К 0 отношение 0 / К разность 0-К,Х10"5 Р К 0

1 1,70 2,61 1,5 0,91 >0,05 0,47 0,20

2 1,70 3,97 2,3 2,27 <0,05 0,93 0,39

3 0,35 0,35 1,0 0,00 >0,05 1,56 1,46

4 0,63 1,10 1,7 0,47 >0,05 2,33 2,34

5 0,94 2,03 2,2 1,09 <0,05 0,53 0,16

~ 6 3,19 5,19 1,5 2,00 <0,05 4,77 5,30

7 2,94 3,36 1,1 0,42 >0.05 4,86 3,21

Примечание. 0 - опытные варианты (рЗУс-тус-1), К - контрольные варианты (рБУгнео). Селекцию ГФРТ"-мутантов осуществляли на селективной среде, содержащей 1-мкг/мл 6ТГ. Эффективность посева не отличалась в опытных и контрольных вариантах и колебалась от 60 до 100 %.

Таблица 7. Индукция хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка под действием плазмиды рЭ'/с-тус-! по сравнению с рБУ2пео.

N Доза ДНК . на Число исследован. кетафаз % аберрантных метафаз Индукция

ОП клеток О К О К отношение 0 / К разность 0 - К, У. Р

1 20 100 100 11 6 1,8 5 <0,05

2 20 100 100 13 6 2,2 7 <0,05

3 20 100 100 9 4 2,3 5 <0,05

Примечание. 0 -К - опытные варианты (р5Ус-оус-1), контрольные варианты (рЭУ2пео),

Таким образом, показана индукция мутаций резистентности к 6-тио-гуанину и хромосомных аберраций под влиянием плазмиды pSVc-myc-1, содержащей активированный клеточный онкоген с-гаус, выделенный из плазмо-цитомы мыши. По аналогии с данными, полученными при изучении гена c-Ha-rasl, можно с достаточным основанием предположить, что и в данном случае мутагенное действие определяется активированным. онкогеном с-пус. ,

Необходимо отметить, что белки, кодируемые генами с-шус и c-ras, отличается как по локализаций в клетке, так и по характеру их дейс-. твия. В отличие от c-Ha-rasl, продукт которого локализован на внутренней поверхности клеточной мембраны и является СТР-связываюцим белком, участвующим в передаче митогенных сигналов от клеточной мембраны к ядру, с-шус кодирует ядерный белок, участвующий в процессах транскрипции и репликации ДНК.

Тот факт, что два активированных клеточных онкогена, причем отличающихся по специфике действия и локализации их продуктов в клетке, характеризуются мутагенным эффектом, говорит в пользу предположения о распространенности этого явления-

Позволяет ли, однако, выявление такого слабого мутагенного эффекта считать, что активированные клеточные онкогены могут быть теми факторами, хотя безусловно не единственными, которые вносят свой вклад в определение генетической нестабильности опухолевых клеток? Как уже высказывалось* ранее, при рассмотрении этого вопроса следует иметь в виду, что по современным представлениям процесс канцерогенеза является многоэтапным. Возникновение на первом этапе активирующей мутации в одном из протоонкогенов будет приводить, пусть к незначительному, но к повышенному спонтанному темпу мутирования. Как следствие повысится вероятность кутации в другом прогоонкогене или генесупрессоре. В результате возникнет некая цепкая реакция, которая с каждым новым мутационным событием будет повышать уровень нутабильносги н генетической изменчивости, что в конечном итоге будет способствовать злокачественной трансформации клетки.

ВЫВОДЫ

1. Показана статистически достоверная индукция генных мутаций и хромосомных аберраций в клетках китайского хомячка, под влиянием- плаз-миды рЕЗб.б, несущей активированный онкоген человека c-Ha-rasl, по сравнению с плазмидой pBR322.

2. Эксперименты по индукции генных мутаций, где в качестве контроля была использована плазмида pE3dllc инахтивированным онкогеном, продемонстрировали, что основной вклад в мутагенную активность плазми-ды рЕЗб.б вносит онкоген c-Ha-rasl.

3. Показано, что выделенные мутантные клоны независимого происхождения, индуцированные c-Ha-rasl он::огеном, имеют стабильный мутант-ный фенотип. Большинство изученных мутантов, способных расти как на селективной (6ТГ), так и на контрселективной (HAT) средах, являются 1еаКу-мутантами.

4. Анализ методом блот-гибридиэации не выявил наличия ras-после-довательностей человека ни у одного из изученных мутантов. Следовательно, механизм действия, онкогена не связан с экспрессией стабильно интегрированного онкогена и, по-видимому, принадлежит к типу "hit-and-run". . '

5. Под воздействием плазмиды pSVc-myc-J, содержащей активированный клеточный онкоген с-туе, выделенный из плазмоцитомы мыши, в линии клеток китайского хомячку также достоверно повышается частота генных мутаций, и хромосомных аберраций.

6. Наличие мутагенного эффекта у двух разных типов онкогенов подтверждает представление о том, что активированные клеточные онкогены могут вносить вклад в определение генетической изменчивости злокачественных клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Барон Е.М., Бобрышева И.В., Варшавер Н.Б. Роль активированного онкогена c-Ha-ras-1 в мутагенной эффекте плазниды рЕЭб.6. Тезисы Всесоюзной конференции по генетике соматических клеток в культуре, посвященной памяти Н.И.Шапиро, Москва, 1989, стр. 10.

2. Барон Е.М., Бобрышева И.В., Варшавер Н.Б. Плазмида рЕЗб.6, несущвя активированный онкоген c-Ha-ras-1, повышает частоту мутаций в клетках китайского хомячка. Генетика, 1992, tí 28, N'6, стр. 25-40.

3. Бобрышева И.В., Барон Е.М., Варшавер Н.Б. Роль активированного клеточного онкогена c-Ha-ras-1 в мутагенном эффекте " плаэкиды рЕЗб.б. Генетика, 1992, Т. 28, N 8, стр. 5-12.

4. Baron Н.М., Bobrisheva I.V., Varshaver N.B. The activated humar c-Ha-ras-1 oncogene as a mutagen. Cancer genet. Cytogenet., 1992, v. 62, pp. 15-20.

5. Бобрышева И.В., Барон Е.М., Варшавер Н.Б. Активированные клеточные онкогены - гекы-мутаторы. Тезизы докладов и сообщений, представленных на совещание "Биология клетки в культуре". Цитология, 1992, Т.34, N 9, стр.55.

6. Бобрышева И.В.; Барон Е.М., Варшавер Н.Б. Плазмида pSVc-myc-1 индуцирует генные мутации и хромосомные аберрации в культивируемые

"клетках хи'тайского хомйчкаС Цитология и генетика, 1993, т. 27, "н 4, стр. 51-56.

7. Бобрышева И.В., Варшавер Н.Б. Является ли механизм мутагенногс действия активированного клеточного онкогена c-Ha-rasl инсерцион-ным. Тезисы конференции по генетике соматических клеток в культуре, Москва, 1993, стр. 49.