Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация онко-ассоциированных генов при светлоклеточном раке почки

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация онко-ассоциированных генов при светлоклеточном раке почки"

На правах рукописи

СНЕЖКИНА Анастасия Владимировна ИДЕНТИФИКАЦИЯ ОИКО-АССОЦИИРОВАННЫХ ГЕНОВ ПРИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ПОЧКИ

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г Ь МАЙ 2014

Москва - 2014

005549419

005549419

Работа выполнена в Группе постгеномных исследований Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук Научный руководитель:

старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, кандидат биологических наук Кудрявцева Анна Викторовна

Официальные оппоненты:

старший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, доктор биологических наук, доцент биологического факультета Климов Евгений Александрович

младший научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, кандидат биологических наук Антипова Надежда Викторовна

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина Российской академии медицинских наук

¿0

Защита диссертации состоится "/£" ttXCMlij 2014 г. в -{А часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Автореферат разослан "-/^У " i-CU_2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат химических наук

С

А.М. Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак почки (РП) является одной из основных проблем онкоурологии и характеризуется высокой смертностью. Ежегодно по всему миру выявляют более 190 тыс. новых случаев рака почки и более 90 тыс. человек умирает по причине этого заболевания. Самым распространенным гистологическим типом РП (75%) является светлоклеточная почечноклеточная карцинома (светлоклеточный рак почки, СРП). В большинстве случаев РП возникает спорадически, причем мужчины заболевают в полтора раза чаще, чем женщины. Как правило, РП на ранних стадиях протекает бессимптомно. На момент постановки диагноза у 25% больных обнаруживают отдаленные метастазы. Между тем, при выявлении РП на 1-ой клинической стадии заболевания пятилетняя выживаемость больных может достигать 70%. К настоящему времени для РП не выявлено специфичных диагностических маркеров. В российской клинической практике применяется только один опухолевый маркер, М2-РК (изомерная форма пируваткиназы), для выявления метастазов и рецидивов некоторых опухолей, включая РП (Moreno-Sanche: et al„ 2009; Jahns et al„ 2011). Поэтому актуальной задачей является развитие надежных и доступных для пациентов методов ранней диагностики (чувствительные и высокоспецифичные онкомаркеры) и лечения рака почки (таргетная терапия) на основе более глубокого изучения молекулярно-генетических особенностей канцерогенеза почки.

Рак почки характеризуется многочисленными генетическими и эпигенетическими нарушениями, которые приводят к активации или подавлению экспрессии многих генов, условно разделяемых на онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста (Cairns, 2010). Вследствие этого происходит нарушение различных метаболических и сигнальных путей, например, энергетического обмена (Moreno-Sanchez et а/., 2009). Для изучения роли определенных генов в канцерогенезе проводят оценку их экспрессии на уровне мРНК и белка в опухолевых тканях по сравнению с нормальными тканями. Также исследуют возможные механизмы регуляции активности генов: статус метилирования, профиль экспрессии микроРНК, модификации гистоков и др. За последние 20 лет разработаны различные методы анализа экспрессии генов, которые позволяют не только изучать активность и регуляцию определенных генов в отдельных биологических образцах (ПЦР, SSH), но и проводить масштабный анализ (NGS, кДНК-микрочипы). Например, на основе результатов, полученных методами высокопроизводительного секвенирования и ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) возможно получить достоверные данные об экспрессии множества генов, мутациях и профиле микроРНК, сделать выводы о

возможных механизмах канцерогенеза и выбрать гены перспективные для дальнейшего применения в клинической практике.

Цель исследования. Основная цель исследования - идентификация онко-ассоциированных изменений экспрессии генов, в том числе вовлеченных в важнейшие метаболические пути, при светлоклеточном раке почки человека.

Задачи исследования.

1. Анализ транскриптомных баз данных и литературы для выбора потенциальных онко-ассоциированных генов.

2. Оптимизация методики количественных измерений уровня мРНК, а также микроРНК в образцах СРП.

3. Количественная оценка содержания мРНК выбранных генов и идентификация для некоторых из них альтернативных изоформ мРНК.

4. Поиск возможных причин, приводящих к нарушению экспрессии исследуемых генов в опухолях почки: профилирование микроРНК и оценка статуса метилирования выбранных генов.

5. Математическая обработка данных и сопоставление полученных результатов с клиническими характеристиками опухолей.

6. Анализ нарушений гликолиза и метаболизма ретинола при СРП.

7. Выбор генов, наиболее перспективных для дальнейшего применения в диагностике и, возможно, таргетной терапии СРП.

Научная новизна и практическая значимость работы. Проведен анализ баз данных EST, Oncomine и др., а также данных высокопроизводительного секвенирования, полученных на платформе Illumina для 50-ти транскриптомов парных образцов СРП человека (TCGA - cancer genome project). Для дальнейшего анализа выбраны два потенциальных онкомаркера - гены NET02 и NR0B2 и два гена, вероятно коэкспрессирующиеся с NET02 (COX4NB, NEFL), а также гены, кодирующие ферменты гликолиза и компоненты метаболизма ретинола, экспрессирующиеся в нормальных и опухолевых тканях почки. Методом ПЦР-РВ впервые проведена количественная оценка уровня мРНК 40 генов при СРП. Подтверждено значительное повышение экспрессии гена NET02 и практически полная инактивация гена NR0B2. Показано, что, возможным механизмом активация NET02 является подавление экспрессии miR-144, -206 и -335, а механизмом инактивация NR0B2 - гиперметилирование его промоторного участка. Впервые выявлено повышение экспрессии генов гексокиназ - НК1, НК2, НКЗ и гена фосфофруктокиназы PFKP, а также сохранение экспрессии нескольких генов, которые можно рекомендовать в качестве контрольных при транскриптомных исследованиях СРП.

4

Впервые подтверждено и количественно оценено изменение экспрессии ряда генов, продукты которых задействованы в метаболизме ретинола. Оценена экспрессия различных сплайс-форм гена NET02 и нескольких генов, кодирующих ферменты гликолиза. Десять генов со значительными изменениями экспрессии могут быть рекомендованы для разработки панели специфичных маркеров ранней диагностики СРП, а также в качестве потенциальных мишеней для таргетной терапии этого заболевания.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации представлены на конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2012» (Санкт-Петербург, 2012), «Петровские чтения - 2013» (Санкт-Петербург, 2013), Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ студентов и аспирантов в области биологических наук в рамках Всероссийского фестиваля науки (Ульяновск, 2011), 3-й Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии и лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012), I Международной виртуальной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Казань, 2012), II Международной виртуальной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (Казань, 2013), «FEBS 2013» (Санкт-Петербург, 2013), 8-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2014» (Москва, 2014), Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2014 (Москва, 2014). По материалам диссертации опубликованы три статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы (331 наименование). Работа изложена на 145-ти страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 55 рисунков.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы. Образцы опухолевых .тканей СРП I-III клинических стадий и прилегающих к опухолям морфологически нормальных тканей (т.н. «условные нормы») собраны и охарактеризованы в ФГБУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Средний возраст больных, среди которых 45% женщин и 55% мужчин, составлял 52 года (32 - 81).

Методы. Биоинформатический поиск генов с изменённым уровнем экспрессии при СРП проводили на основе анализа данных интернет-ресурса «The Cancer Genome Atlas» («TCGA - cancer genome project», http.//cancereenome.nih. gov/), который в настоящее время активно расширяется и включает данные 518-ти различных образцов СРП. В частности, выполнен статистический анализ результатов секвенирования на платформе Illumina

5

(RNA-Seq) для 50 случайно выбранных парных образцов СРП. Анализ проводился с использованием программ edgeR и DESeq в составе пакета Bioconductor для статистической среды R и включал оценку уровня экспрессии (по числу ридов и RPKM), нормирование данных, оценку дисперсии, поиск генов с наиболее частыми и стабильными изменениями экспрессии.

При помощи интернет-ресурса DAVID (http://david.abcc ncifcrf.eovA проведён функциональный анализ групп дифференциально экспрессирующихся генов (в терминах GO - Gene Ontology, KEGG и BioCarta). Дополнительно проанализированы данные кДНК-микрочипов Agilent (ЪИр://сапсегеепоте.тЬ.еоуЛ и Oncomine (https://www.oncomine.orgA. Для анализа данных использована библиотека limma в составе Bioconductor. Поиск коэкспрессирующихся генов проводили при помощи пакета WGCNA (для среды R).

Также использовались данные клонотек EST (http://www.ncbi.nlm.nih.govA и данные интернет-ресурса GeneCards (http://www. genecards.oreA).

Тотальную РНК выделили из 50-ти образцов опухолей почки человека, а также из 50-ти образцов «условных норм» прилежащих к опухоли тканей с использованием набора реагентов «RNeasy Mini Kit» (Qiagen, Германия) с последующей обработкой ДНКазой I (Fermentas, Литва). Из тех же тканей выделяли ДНК с использованием набора реагентов «QIAamp DNA Mini Kit» (Qiagen, Германия). МикроРНК выделяли из 10-ти образцов опухолевых и нормальных тканей с использованием набора реагентов «miRNeasy Mini Kit» фирмы Qiagen (Германия). Концентрацию РНК и ДНК определяли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Nanodrop, США), а также на флюориметре Qubit 2.0 (Invitrogen, США). Параметр RIN (RNA Integrity Number), характеризующий целостность РНК, определяли на приборе Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, США). Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием гексануклеотидных праймеров, специфических праймеров для микроРНК и обратной транскриптазы M-MuLV (Fermentas, Литва). Для проведения ПЦР-РВ использовали готовые наборы праймеров и проб производства компании Life Technologies (США).

Секвенировапи микроРНК в 5-ти образцах СРП с максимально повышенным и в 5-ти образцах с минимальным содержанием транскриптов гена NET02. Для приготовления библиотек использовали набор «TruSeq Small RNA Sample Prep Kit» (Illumina, США). Секвенирование проводили на приборе GAIIx на базе ЦКП «Геном» ФГБУН ИМБ РАН.

Анализ экспрессии генов, а также подтверждение данных профилирования микроРНК проводили при помощи ПЦР-РВ на приборе Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Life Technologies, США) в режиме относительных измерений (AACt - метод). Расчеты проводили с помощью разработанной в институте программы «Анализ

6

Транскрипции Генов - АТГ» (Свидетельство №2008612585, 2008, Роспатент, РФ). Оценивали значение R, которое показывает во сколько раз содержание мРНК гена повышено в опухоли по сравнению с «условной нормой». При значении Л<1, использовали значение MR, которое показывает, во сколько раз содержание мРНК гена снижено в опухоли по сравнению с «условной нормой». Значимыми считали изменения в 2 и более раз (R>2 или 1/R>2). Для статистического анализа использовали тесты Уилкоксона, Манна-Уитни, Крускала-Уоллиса, а также рассчитывали коэффициенты ранговой корреляции Спирмена.

Анализ метилирования проводили по стандартной методике бисульфитного секвенирования. ДНК обрабатывали бисульфитом при помощи набора «EZ DNA Methylation Kit» (Zymo Research, США). Секвенирование образцов проводили на базе ЦКП «Геном» ФГБУН ИМБ РАН. Исследовали CpG-островок гена NR0B2 (-220-560 п.н. NM 021969.2V

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Анализ транскриптомных баз данных

На основе анализ баз данных «TCGA - cancer genome project», EST и др. был получен список дифференциально экспрессируемых генов при СРП (1794 гена с пониженной и 2268 генов с повышенной экспрессией). На его основании для дальнейших исследований выбраны 2 гена, один с повышенной экспрессией - NET02, и один с пониженной экспрессией - NR0B2. Выявлены гены COX4NB и NEFL, предположительно коэкспрессирующиеся с геном NET02. Помимо этого выбраны гены, белковые продукты которых участвуют в гликолизе и основных этапах метаболизма ретинола, так как эти пути нарушены в большинстве проанализированных образцов.

2.2. Отработка методики проведения ПЦР-РВ

Выполнены необходимые предварительные опыты: выбор контрольных генов и контрольных микроРНК, образцов сравнения, оптимизация условий реакции, при которых амплитуда кинетических кривых и эффективность реакции (£) максимальны. Для оценки уровня мРНК в качестве оптимальных выбрали два контрольных гена - GUSB и RPNI, для которых значение порогового цикла (О) варьировало в пределах 2-х циклов (то есть +/- 2 раза), для оценки микроРНК выбрано 3 контроля - miR-28, -103 и -106а.

2.3. Гены, кодирующие ферменты гликолиза

Гликолиз - это основной путь метаболизма глюкозы, является главным источником АТФ в опухолевых клетках (эффект Варбурга). В гликолизе участвуют более 30 ферментов.

Гены, кодирующие ферменты гликолиза, консервативны, их экспрессия часто не зависит от тканевой дифференцировки, поскольку кодируемые ими продукты необходимы для нормальной жизнедеятельности клетки (Shen et al, 2010; Zainuddin et al, 2010). Однако показано, что некоторые гены, продукты которых вовлечены в основные этапы гликолиза, оказываются дифференциально экспрессирующимися: уровень мРНК отличается в ряде тканей в норме и в опухоли (Cheng et al, 2011; Jemal et al, 2011; Thoenes et al, 2011; Jahns et al, 2012). Для исследований выбрано 13 потенциально онко-ассоциированных генов гликолитического пути: 1 стадия (фосфорилирование глюкозы): НК1, НК2, НКЗ, ADPGK; 2 стадия (изомеризация глюкозо-6-фосфата): GPI; 3 стадия (фосфорилирование фруктозо-6-фосфата): PFKP; 4 стадия (расщепление фруктозо-1,6-дифосфата с образованием триозофосфатов): ALDO А; 6 стадия (образование 1,3-дисфосфоглицерата): GAPDH, 7 стадия (фосфорилирование субстрата с образованием АТФ): PGK1; 8 стадия (образование 2-фосфоглицерата): PGAM1, BPGM-, 9 стадия (синтез фосфоенолпирувата): EN01\ 10 стадия (образование пирувата и АТФ): РКМ2 (табл. 1).

Впервые проведен комплексный количественный анализ экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза при светлоклеточном раке почки у человека. Для нескольких генов идентифицированы частые онко-ассоциированные изменения относительного уровня мРНК - повышение экспрессии для генов, кодирующих ферменты 1 -й (основной) и 3-й стадий гликолиза в большинстве образцов СРП: НК1 (до 139-ти раз), НК2 (до 1437-ми раз), НКЗ (до 448-ми раз) и PKFP (до 34-х раз) (табл. 1). На рисунке 1 представлена экспрессия генов гексокиназ в одних и тех же образцах СРП. Для генов ALDO А и PGK1 выявлено незначительное снижение уровня экспрессии в 40% (Р<0,05) образцов СРП до 6-ти и 11-ти раз, соответственно. Для нескольких генов (GAPDH, GP1, РКМ2) наблюдали как повышение, так и снижение уровня мРНК, что свидетельствует о дерегуляции их экспрессии при канцерогенезе. Стабильный уровень мРНК в более чем 60% образцов СРП был выявлен для генов ADPGK, PGAMI, BPGM и EN01, кодирующих ферменты последних (8-й и 9-й) стадий гликолиза (табл. 1). Полученные результаты свидетельствуют о нарушении экспрессии большинства генов, кодирующих ферменты гликолиза, при СРП. Кроме того, дерегуляция экспрессии гена GAPDH, который является классическим контрольным геном, позволила сделать вывод о невозможности его использования при транскриптомных исследованиях СРП.

С помощью метода ПЦР-РВ для нескольких генов, кодирующих ферменты гликолиза, определен спектр альтернативных изоформ мРНК. В образцах СРП для генов GAPDH и GPI выявлен в каждом случае только один из двух альтернативных транскриптов, кодирующий полноразмерный белок: изоформа 2 гена GAPDH (NM 001256799.1) и

8

изоформа 1 гена ОР1 (ЫМ 001184722. П. Для гена ЕКЮ1 в образцах СРП показано отсутствие экспрессии цитозольной (гликолитической) изоформы 1 (ЫМ 001428.ЗУ выявлена экспрессия альтернативной изоформы 2 Р)М 001201483.11. которая кодирует ядерный белок МВР-1, связывающийся с промотором гена с-Мус.

Таблица 1. Частота и степень изменений относительного уровня мРНК генов,

кодирующих ферменты гликолиза, при СРП.

Этап гликолиза Ген Светлоклеточный рак почки

Среднее изменение, разы Частота событий

1 1 в

1 НК1 2,4? 20% (3-51) 60% (2- 139) 20%

1 НК2 15,91 8% (2 - 4) 81% (2- 1437) 11%

1 НКЗ 2,0 Т 18% (2-430) 52% (2 - 448) 30%

1 АОРОК МТ 4% (в 3 раза) 28% (2 - 12) 68%

2 ОР1 1,2| 11% (2-3) 25% (2 - 8) 64%

3 РРКР 5.7Т 0% 86% (2,5 - 34) 14%

4 АШОЛ 1,4? 7% (в 3 раза) 40% (2 - 6) 53%

6 аАРйн 1,2! 17% (3-44) 33% (2,5 - 7) 50%

7 РОК! 2,1 Т 0% 40% (3-11) 60%

8 РОАМ1 ит 11% (в 2 раза) 18,5% (2-7) 70,5%

8 ВРвМ 1,81 37% (2- 18) 0% 63%

9 ЕИ01 мт 4% (в 3 раза) 32% (2 - 8) 64%

10 РКМ2 2,21 4% (в 3 раза) 46% (2 - 31,5) 59%

Примечание: 1 - снижение уровня мРНК, | - повышение уровня мРНК, ~ -

сохранение уровня мРНК. Среднее изменение рассчитывалось как среднее геометрическое относительных уровней мРНК.

1000 100 10

g

1 I

0.01 0,001

Рис. 1. Относительный уровень мРНК генов НК1, НК2 и НКЗ при СРП. Данные количественной ПЦР.

2.4. Гены, кодирующие ферменты метаболизма ретинола

Метаболизм ретинола включает в себя множество этапов, в которых участвуют более 30 ферментов, а также ретинолсвязывающие белки и ядерные рецепторы ретиноидов. Основными продуктами метаболизма ретинола являются: полностью транс-ретиноевая кислота, 9-г<ис-ретиноевая кислота, 11-//ис-ретиноевая кислота и 13,14-дигидроретиноевая кислота. Ретиноевая кислота связывается с транскрипционными факторами - ядерными рецепторами ретиноидов, регулируя процессы пролиферации, апоптоза и дифференцировки (Jason et al., 2011). Ретиноевая кислота используется в противоопухолевой терапии, вызывает дифференцировку опухолевых клеток различного генеза, ингибирует их пролиферацию (Richard, 2008). На основании предварительного анализа выбрано 23 гена, кодирующих компоненты основных этапов метаболизма ретинола, экспрессирующихся в тканях почки (табл. 2):

1 стадия - обратимое окисление сложного эфира ретинола в полностью-транс ретинол: ген LRAT,

1 ** стадия - деградация сложного эфира ретинола до 1 l-i/ыс-ретинола: ген RPE65\

2А стадия - обратимое преобразование полностыо-т/юноретинола до полностью-транс-ретннапя: гены AKR1C1, ADH1B, RDH11, RDH14, DHRS3 и DHRS4,

2В стадия - обратимое преобразование полностью-транс-ретинола до полностью-транс- 13,14-дегидроретинола: ген RETSAT,

2 стадия - обратимое преобразование полностью-транс ретинола до 9-1;ис-ретинола; 2** стадия - деградация 1 l-i/мс-ретинола до 11-г/ис-ретиналя: гены RDH5, RDH10, RDH11, RDH12, RDH13 и RDII14,

ЗА стадия - обратимое преобразование полностью-отранс-ретиналя до полностью-транс-ретиноевой кислоты: гены ALDHIA1, ALDH1A2 aALDHlA3;

ЗВ стадия - обратимое преобразование полностью-13,14-дегидроретинола до 13,14-дегидроретиналя: ретинолсвязывающие белки RBP2, RBP4 и RBP7',

ЗС стадия - обратимое преобразование 9-г(ис-ретинола до 9-цис-ретиналя: гены RDH5, RDH10, RDHU, RDH12 и RDH14;

4В стадия - деградация 13,14-дегидроретиналя до 13,14-дигидроретиноевой кислоты: гены ALDHIA1, ALDH1A2 иАШН1АЗ,

4С стадия - деградация 9-цыоретиналя до 9-уыс-ретиноевой кислоты; 5 стадия - взаимодействие 13,14-дигидроретиноевой кислоты, 9-уис-ретиноевой кислоты и полностью-шранс-рстиноевой кислоты с ядерными рецепторами ретиноидов: гены RARA, RARES, RARG, RXRA, RXRB, RXRG, RORA, RORB и RORC.

Анализ нескольких типов транскриптомных данных для нормальных и опухолевых тканей почки: нуклеотидных последовательностей E-North и SAGE, данных гибридизации кДНК на микропанелях MAGE позволил провести предварительную оценку содержания мРНК генов, задействованных в метаболизме ретинола, в опухолевых тканях почки и исключить из экспериментального исследование гены, с относительно низким уровнем экспрессии - гены, кодирующие ферменты RPE6S, LRAT и RDH8, ген RBP2, кодирующий ретинолсвязывающий белок, гены RXRG и RORB, кодирующие рецепторы ретиноидов.

Впервые проведен комплексный количественный анализ уровня мРНК различных ферментов метаболизма ретинола при светлоклеточном раке почки у человека. Исследование методом ПЦР-РВ позволило выявить гены с дерегуляцией экспрессии (AKR1CI, RDH14, RDH5, RDHI3, ALDH1A3), экспрессия остальных генов понижалась в большинстве образцов СРП. Наибольшее снижение уровня экспрессии показано для генов ADH1B, RDH12, ALDH1A2 - потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста (табл. 2). Для гена ADH1B выявлено снижение экспрессии в 73% (Р<0,05) образцов СРП от 3-х до 126-ти раз (табл. 2). Корреляции со стадией и степенью дифференцировки опухоли не наблюдалось, степень и

частота изменений в образцах СРП 1-ой, П-ой и Ш-ей клинических стадий были близки (рис.

И

2). Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 3,8. В 86% (Р<0,05) образцов СРП выявлено значительное снижение экспрессии гена КОН 12, по сравнению с «условными нормами» от 3-х до 52-х раз (табл. 2). В 100% образцов СРП 1-ой стадии экспрессия гена КОН12 снижалась до 20-ти раз (Р<0,05) (рис. 3). Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 6,8. Вьивлено значительное снижение уровня экспрессии гена АЮН1Л2 в большинстве образцов СРП (78%, Р<0,05) от 2-х до 73-х раз (табл. 2). Взаимосвязи между экспрессией гена АЮН1Л2, стадией и степенью дифференцировки опухоли не наблюдалось, степень и частота изменений в образцах 1-ой, 11-ой и Ш-ей клинических стадий были близки (рис. 4). Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 6,7. Для генов АКН1С1, НОН 14, 1ЮН5, НОН 13 и АЬОН1АЗ наблюдали как повышение, так и снижение уровня экспрессии, что свидетельствует о нарушении регуляции их экспрессии при канцерогенезе. Экспрессия двух генов - 1ЮН11 и НЕТЗАТ в большинстве образцов СРП по сравнению с «условными нормами» не изменялась (табл. 2).

Для генов семейства ретинолдегидрогеназ/редуктаз О/Ж?-/, НОШ 0 и

АЮН1А1 в половине образцов СРП наблюдали снижение уровня экспрессии: в 55% (Р<0,05) образцов выявлено снижение экспрессии гена от 2-х до 48-ми раз; в 50% (Р<0,05) -

снижение экспрессии гена ОЯТШ от 2-х до 21-го раза; в 64% (Р<0,05) образцов СРП наблюдали снижение экспрессии гена 1ЮН10 от 2-х до 14-ти раз; в 46% (Р<0,05) образцов -снижение экспрессии гена АЮН1А1 от 2-х до 20-ти раз (табл. 2).

Полученные результаты позволяют предположить, что в клетках при СРП закономерно происходят нарушения регуляции метаболизма ретинола. Значительное снижение экспрессии выявлено для генов основных этапов метаболизма ретинола: окисление полпостью-траяс-ретинола до полностью-т/юнс-ретиналя (АЮН1В); окисление I \-цис-ретинола и 9-г/ис-ретинола до альдегидов [НОН 12), этап образования основных продуктов метаболизма ретинола: 13,14-дигидроретиноевой кислоты и полностью-от/жгкс-ретиноевой кислоты (АЮН1А2). Таким образом, в опухолевых клетках происходит нарушение метаболизма ретинола преимущественно на этапах образования основных продуктов -альдегидов и ретиноевой кислоты, которые являются лигандами ядерных рецепторов ретиноидов. В связи с этим, ядерные рецепторы ретиноидов не способны выполнять свою функцию (активация или ингибирование транскрипции).

Таблица 2. Частота и степень изменений относительного уровня мРНК генов, кодирующих компоненты метаболизма ретинола, при СРП.

Этап метаболизма ретинола Ген Светлоклеточный рак почки

Среднее изменение, разы Частота событий

1 Т =

2А АКШС1 ш 32% (2 - 158) 27% (2 - 230) 41%

2А А ОН! В 3,8| 73% (3- 126) 21% (3 -5) 6%

2А ОН№3 2,51 55% (2 - 48) 15% (3- 16) 30%

2А ЭНК34 1,8; 50% (2-21) 18% (3-5) 32%

2А, 2**, ЗС ИОН 11 1,Ц 30% (2-6) 20% (2- 11) 50%

2А, 2**, ЗС КВН 14 1,51 35% (3 - 9) 20% (2 - 8) 45%

2В НЕТЗАТ 1,4| 10% (в 2 раза) 30% (2 - 4) 60%

2**, ЗС КОН5 1.1Т 26% (2-8) 29% (2 - 9) 46%

2**,ЗС ШЗНЮ 2,51 64% (2 - 14,5) 8% (2 - 4) 28%

2**, ЗС шнп 6,8; 86% (3 - 52,5) 3% (в 2 раза) 10%

2** КО!¡13 1.2Т 20% (2 - 5) 35% (2-35) 45%

ЗА, 4В АЮН1А! 2,04 46% (2 - 20) 0% 54%

ЗА, 4В АШИ1А2 6,7| 78% (2 - 73) 0% 22%

ЗА, 4В АЬОН1АЗ 1,6Г 20% (2 - 5) 35% (3 - 88) 45%

ЗВ ИВР4 17,81 87% (4-660) 8% (3-21) 5%

ЗВ ЛВР7 10,зт 7% (4 - 8,5) 82% (2- 1394) 11%

5 ЛАЯА 1.6Г 5% (в 2 раза) 29% (2- 16) 66%

5 ЯАЯВ 2,21 10% (в 3 раза) 55% (2 - 22) 35%

5 ЯАКО 1,9Т 5% (в 2,5 раза) 49% (2 - 52) 46%

5 ЙШ мт 5% (в 2,5 раза) 24% (2 - 14) 71%

5 их!гв 1 19% (2-5) 19% (2 - 9) 62%

5 КОКА 1.3Т 16% (2-3) 21% (3-21,5) 63%

5 коне 1,9Т 21% (2-7) 46% (2 - 35) 33%

Примечание: I - снижение уровня мРНК, Т - повышение уровня мРНК, = -сохранение уровня мРНК. Среднее изменение рассчитывалось как среднее геометрическое относительных уровней мРНК.

Ъ & -Г/ ъ ^ ф ^ ** -а- V *гг <г V <> чг -з> -Ь

Стадия I

Стадия II

Стадия II!

Образцы кДНК

Рис. 2. Относительный уровень мРНК гена ЛВШВ при СРП. Данные количественной ПЦР.

П 1)1112

Стадия I Стадия II Стадия III

Образцы кДНК

Рис. 3. Относительный уровень мРНК гена КОНИ при СРП. Данные количественной ПЦР.

0.001

Рис 4. Относительный уровень мРНК гена ЛЬй111Л2 при СРП. Данные количественной ПЦР.

2.5. Гены, кодирующие ретинолсвязывающие белки

Гены RBP4 и RBP7 кодируют ретинолсвязывающие белки 4 и 7, соответственно. Эти белки связываются с полностью-от/га;/с-13,14-дегидроретинолом и стабилизируют его. Ретинолсвязывающие белки участвуют в поддержании гомеостаза и межклеточных взаимодействий. Гены RBP4 и RBP7 экспрессируются в большинстве тканей человека. Известно, что нарушение экспрессии гена RBP4 является потенциальным маркером рака яичников (повышение экспрессии) и поджелудочной железы (снижение экспрессии) (EI-Mesallamy et а!.. 2012; Lorkova et al., 2012). При плоскоклеточном раке пищевода выявлено метилирование гена RBP4 (Tsunodaet а!.. 2009). Данные об уровне мРНК генов RBP4 и RBP7 в опухолевых тканях почки в литературе отсутствуют.

Результаты количественной оценки уровня мРНК генов RBP4 и RBP7 представлены в таблице 2 и на рисунках 5 и 6. В большинстве образцов светлоклеточного рака почки - 87% (Р<0,05), преимущественно 1-ой и III-ей стадий, выявлено значительное снижение экспрессии гена RBP4 от 3-х до 658-ми раз, среднее значение для всей выборки составило 17,8 (рис. 5).

Стадия I Стадия II Стадия III

Образцы кДНК

Рис. 5. Относительный уровень мРНК гена КВР4 при СПР. Данные количественной ПЦР.

Для гена ЯВР7 в 82% (Р<0,05) образцов светлоклеточного рака почки выявлено значительное повышение уровня экспрессии от 2-х до 1394 раз. Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 10,3 (рис. 6).

Таким образом, впервые выявлено значительное снижение экспрессии гена ЮЗР4, потенциального гена-супрессора, при СРП, что согласуется с данными литературы для других типов рака (Ьогкот а\., 2012; Тхипойаег а!.. 2009). Впервые получены данные о значительном повышение экспрессии гена ЯВР7 при СРП, что позволяет рассматривать его в качестве потенциального онкогена.

Полученные результаты подтверждают, что в опухолевых клетках происходит нарушение метаболизма ретинола, в том числе, на стадии связывания ноП]юсгью-транс-13,14-дегидроретинола с рецепторами, что препятствует его стабилизации и транспорту.

Стадия I Стадия II Стадия III

Образцы кДНК

Рис. 6. Относительный уровень мРНК гена RBP7 при СРП. Данные количественной ПЦР.

2.6. Гены, кодирующие ядерные рецепторы ретиноидов

Известно, что ретиноиды эффективно ингибируют рост многих типов эпителиальных опухолей, главным образом, взаимодействуя с ядерными рецепторами: рецепторами ретиноевой кислоты (RAR-альфа, RAR-бета, RAR-гамма), рецепторами X ретиноидов (RXR-альфа, RXR-бета, RXR-гамма) и орфановыми рецепторами ретиноидов (ROR-альфа, ROR-бета, ROR-гамма). Рецепторы ретиноевой кислоты относятся к группе рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов, их лигандом является транс-ретиноевая кислота (Bushue et al, 2010). Рецепторы X ретиноидов связываются с лигандом - 9-цис-ретиноевой кислотой (Dawson et al, 2012). Для так называемых "рецепторов-сирот" -орфановых рецепторов ретиноидов на данный момент известно несколько потенциальных лигандов: транс-ретиноевая кислота, мелатонин и холестерин (1iallen et al., 2004; Wang et al., 2010; Soit et al, 2011). Ядерные рецепторы ретиноидов являются транскрипционными факторами и связываются с регуляторными последовательностями генов-мишеней.

Впервые проведено комплексное изучение изменения уровня мРНК генов,

кодирующих ядерные рецепторы ретиноидов - RARA, RARB, RARG, RORA, RORC, RXRA и

RXRB - в образцах светлокпеточного рака почки методом ПЦР-РВ (табл. 2). Уровень

экспрессии гена RARA в большинстве образцов 1-ой стадии не изменялся, в образцах Н-ой и

Ш-ей стадий наблюдалось частое повышение экспрессии (в 60% и 67% случаев,

17

соответственно). Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 1,6. Уровень экспрессии гена RARB повышался более чем в 50% образцов от 2-х до 22-х раз. Характерная особенность профиля мРНК этого гена - нормализация экспрессии, повышенной на первой стадии, по мере прогрессии заболевания: в образцах 1-ой стадии экспрессия повышалась в 70% случаев, в образцах И-ой стадии - в 40% случаев, в образцах Ш-ей стадии экспрессия не изменялась. Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 2,2. В 48% образцов СРП уровень экспрессии гена RARG повышался от 2-х до 52-х раз. В образцах 1-ой стадии экспрессия повышалась в 63% случаев, в образцах П-ой стадии наблюдалось повышение экспрессии в 50% случаев, в образцах Ш-ей стадии экспрессия повышалась только в 12,5% случаев. Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 1,9. В 46% образцов наблюдали повышение уровня экспрессии гена RORC от 2-х до 35-ти раз и снижение в 20,5% образцов от 2-х до 7-ми раз. Особенно частое и значительное повышение экспрессии гена RORC выявлено на П-ой стадии (до 30-ти раз в 60% образцов). Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 1,9. В большинстве образцов СРП уровень экспрессии генов RXRA, RXRB и RORA не изменялся.

Полученные результаты позволяют предположить, что ядерные рецепторы ретиноидов, связывающие транс-ретиноевую кислоту, (RAR-альфа, RAR-бета, RAR-гамма, ROR-гамма) играют важную роль в прогрессии СРП.

2.7. Экспрессия гена NET02 и ее регуляция

Ген NET02 кодирует трансмембранный белок с N-терминальной сигнальной последовательностью, двумя консервативными внеклеточными CUB-доменами, за которыми следует одна копия цистеин богатых липопротеинов низкой плотности класса А - LDLa модуль. Белок NET02 на 57% идентичен по аминокислотной последовательности белку NETOl (представителю того же семейства) (Stohr et al, 2002). Ген NET02 экспрессируется в норме, главным образом, в тканях головного мозга и сетчатки. Большинство работ посвящено изучению нейробиологических аспектов функционирования генов семейства NETO (NETOl и NET02) и лишь в нескольких исследованиях рассматривали их роль в канцерогенезе. Исследования in vitro показали, что NET02 взаимодействует с GluK2 и GluK5 субъединицами каинатных рецепторов и может значительно усиливать опосредованные ими сигналы (Permis et а!.. 2011; Diaz et al., 2010). В ряде работ изучалась экзогенная гиперэкспрессия гена-супрессора метастазирования Nm23-Hl. При нормальном функционировании экспрессия этого гена снижает метастатический потенциал различных типов раковых клеток (рак молочной железы, гепатоцеллюлярная карцинома). Было

18

выявлено девять генов, включая NET02, которые экспрессируются на низком уровне в линии дикого типа, но не в линии, мутантной по Nm23-Hl (Horak et al., 2007). Показано, что экспрессия NET02 повышается в пролиферирующих гемангиомах у детей (Calicchio el al., 2009). Данные об экспрессии гена NET02 в опухолях почки в современной биомедицинской литературе отсутствуют.

Впервые проведена оценка уровня мРНК гена NET02 в образцах СРП. В 97% образцов (29/30, Р<0,01) наблюдалось повышение уровня мРНК гена NET02 от 3-х до 100 раз. В среднем уровень мРНК повышался в 15 раз. Выявлено, что в большинстве случаев повышался уровень мРНК изоформы 1 (NM 018092.41 генаNET02. (рис. 7).

Выявленное нами значительное повышение экспрессии гена NET02 при светлоклеточном раке почки свидетельствует о его вовлеченности в канцерогенез. Литературные данные о функциях продукта гена NET02 в нервной ткани в качестве компонента каинатных рецепторов и высокий уровень экспрессии в эпителиальных тканях (Опарина и др., 2012) позволяют предположить его мультифункциональность. Это позволяет рассматривать NET02 как перспективный онкомаркер, а его белковый трансмембранный продукт - как вероятную терапевтическую мишень.

На основе данных высокопроизводительного секвенирования образцов светлоклеточного рака почки со значительным повышением до 100 раз (5 образцов) и повышением до 10-ти раз (5 образцов) экспрессии гена NET02 выполнено профилирование микроРНК, предсказанной мишенью которых является транскрипт гена NET02. Это позволило выявить три дифференциально экспрессирующихся микроРНК, вероятно регулирующих его активацию при СРП - микроРНК-144, -206 и -335. Методом ПЦР-РВ подтверждено снижение экспрессии этих микроРНК в большей части образцов СРП: miR-144 в 76% (Р<0,05) образцов СРП, miR-206 - более чем в 60% образцов (Р<0,05) и снижение экспрессии miR-335 в 82% (Р<0,05).

Комплексный биоинформатический анализ позволил выявить гены, предположительно коэкспрессирующиеся с NET02 - COX4NB и NEFL. Ген COX4NB кодирует субъединицу 8 сложного мембранного белка эндоплазматического ретикулума. Данные об экспрессии гена COX4NB в нормальных и опухолевых тканях человека в литературе отсутствуют, предположительно дупликация этого гена связана с тяжелым фенотипом при умственной отсталости (Quéméner-Redon et al., 201S). Ген NEFL кодирует белок нейрофиламентов и экспрессируется во всех тканях человека. Мутации в этом гене вызывают заболевание периферической нервной системы Шарко-Мари-Тута {Kabziñska et al, 2006). При раке молочной железы показана корреляция экспрессия гена NEFL с

метастазированием (biet al, 2012). Данные по оценке содержания мРНК генов COX4NB и NEFL в опухолевых тканях почки отсутствуют.

1000

Й

а (О

□ NETO2 изоформа 1 и 2 SNET02 изоформа 1

/■> Л>

/,. /Ч /_> /> /> АААЛЛЛ

Стадия Í

Стадия И

Образцы кДНК

Стадия II

Рис. 7. Относительный уровень мРНК гена NET02 при СРП. Данные количественной ПЦР. Светло-серым показан уровень мРНК гена NET02 выявленный с помощью набора праймеров к изоформам 1 и 2; темно-серым - уровень мРНК гена NET02, выявленный с помощью набора праймеров к изоформе 1. Таким образом, во всех образцах СРП экспрессируется преимущественно изоформа 1 гена NET02.

Результаты количественной оценки содержания мРНК генов ЫЕТ02, ЫЕЕЬ и СОХ4ЫВ в одних и тех же образцах СРП представлены на рисунке 8. В большинстве исследованных образцов светлоклеточного рака почки (81%, Р<0.05) выявлено сохранение уровня экспрессии гена СОХ4ЫВ (среднее значение 1,4). В 67% (Р<0,05) исследованных образцов СРП выявлено значительное повышение уровня экспрессии гена ЫЕЕЬ от 2,4 до 83-х раз. Среднее значение относительного уровня мРНК для всей выборки составило 4,1. Наблюдалась тенденция к увеличению уровня экспрессии гена АЙГЛ по мере прогрессии заболевания: на 1-ой стадии выявлено повышение экспрессии в 30% образцов, на Ц-ой стадии - в 73% образцов, на Ш-ей стадии наблюдалось повышение экспрессии в 90% образцов СРП.

*,\ЕТ02 9NF.FI. ®СОХ4.\8

<Х01 ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

\ \ % \ % /'ь \ \ %• \ \ % \ \ % % \ \ % % % % \ \

Стадия I Стад«« II Стадия III

0$м»(мхЖ1К

Рис. 8. Относительный уровень мРНК генов N£102, NEFL и СОХ4ЯВ при СРП. Данные количественной ПЦР.

Полученные данные свидетельствуют об отсутствии корегуляции и коэкспрессии генов СОХ4ЫВ, ИЕРЬ и гена ИЕТ02. Коэффициент корреляции Спирмена составил г5=0,03 и г5=0,06 (Р<0,05), соответственно.

2.8. Ген тОВ2

Ген ЫИ0В2 (ВНР, 5РН1) кодирует белок, относящийся к подсемейству орфановых ядерных рецепторов. Для него, в настоящее время, не выявлено лигандов. Рецептор МЯ0В2 может взаимодействовать с широким спектром других ядерных рецепторов (ЮЖ-альфа, ЮСЯ-бета, РРАЯ-дельта, рецептор витамина Оэ) и, таким образом, участвует в негативной регуляции рецептор-зависимых сигнальных путей. Дисфункция рецептор-зависимых сигнальных путей приводит к широкому спектру пролиферативных, репродуктивных, и метаболических заболеваний, включая рак. Высокий уровень экспрессии гена ЫЯ0В2 выявлен в клеточной линии МОА-МВ-231 и клинических образцах рака молочной железы (Х:е еI а/., 2010; ¡пзаЬаШ е! а/., 2009). Показано снижение уровня экспрессии белка ЫЯ0В2 в клеточных линиях рака толстого кишечника (1Уи е/ а/., 2003; Хи е/ а/., 2009). Показана обратная корреляция экспрессии между белками НЯ0В2 и Мёш2 при раке печени (Ycmg е(

al„ 2012; Chen et a!., 2012; Tai et al., 2012; Rajendran et а!.. 2012). Выявлено, что в образцах лимфомы ген NR0B2 гиперметилирован, а его деметилирование приводит к подавлению роста опухоли (Yang et al, 2009). Данные по оценке содержания мРНК гена NR0B2 при раке почки в литературе отсутствуют.

Нами впервые показано значительное подавление экспрессии гена NR0B2 в большинстве образцов СРП (86%, Р<0,01) по сравнению с образцами «условной нормы» тканью. В двух образцах СРП наблюдалось повышение уровня экспрессии гена NR0B2 от 4-х до 45-ти раз, в четырех образцах (9%) экспрессия этого гена не изменялась (рис. 9). Повышение экспрессии выявлено в образцах И-ой (один образец - пациент мужчина, возраст 68 лет) и 1П-ей (один образец - пациент женщина, возраст 36 лет) стадий, не имеющих сходной клинической картины. Методом бисульфитного секвенирования показано гиперметилирование промоторного участка гена NR0B2 (-220-560 п.н. NM 021969.2) в 70% образцов СРП.

Стадия I Стадия II Стадия III

Образцы кЦНК

Рис. 9. Относительный уровень мРНК гена NR0B2 при СРП. Данные количественной ПЦР.

Таким образом, полученный результат свидетельствует о практически полном подавлении экспрессии гена NR0B2, потенциального супрессора при СРП, что в совокупности с литературными данными позволяет сделать вывод о его важной роли при канцерогенезе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Комплексное исследование (биоинформатическое и экспериментальное) экспрессии генов позволяет выявлять общие закономерности и индивидуальные особенности опухолевых клеток, которые могут быть использованы для диагностики, прогнозирования течения заболевания, а также для выбора тактики лечения, например, для определения чувствительности опухоли к терапии. В данном исследовании на основе биоинформатического анализа транскриптомных баз данных получен список дифференциально экспрессируемых генов и проанализированы метаболические и сигнальные пути, подверженные наибольшим изменениям при светлоклеточном раке почки. Методом ПЦР в режиме реального времени впервые оценили частоту и уровень изменения экспрессии 40 потенциальных онко-ассоциированных генов, в том числе генов, кодирующих ферменты гликолиза и компоненты метаболизма ретинола при светлоклеточном раке почки. С помощью методов высокопроизводительного секвенирования и ПЦР-РВ оценили вклад микроРНК в регуляцию экспрессии гена NET02, а также вклад метилирования в регуляцию экспрессии гена NR0B2 методом секвенирования после бисульфитной конверсии.

Исследование экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза, показало, что в процессе канцерогенеза происходит значительное повышение экспрессии генов НК1, НК2, НКЗ, участвующих в первой (основной) стадии фосфорилирования глюкозы до глюкозо-б-фосфата и гена PFKP, кодирующего фермент фосфорилирования фруктозо-6-фосфата до фруктозо-1,6-дифосфата.

Для большинства генов, кодирующих компоненты метаболизма ретинола (ферменты, ретинолсвязывающие белки и ядерные рецепторы ретиноидов), наблюдались разнонаправленные значительные изменения уровня мРНК при СРП. Частые онко-ассоциированные нарушения экспрессии выявлены в генах, кодирующих ферменты ключевых этапов метаболизма ретинола: образование альдегидов и ретиноевой кислоты. В том числе, наблюдалось значительное снижение экспрессии гена ALDH1A2, продукт которого участвует в окислении полностью-т/ганс-ретиналя до поппостъю-транс-ретиноевой кислоты. Полностью-т/юнс-ретиноевая кислота является основным лигандом для ядерных рецепторов ретиноевой кислоты, для которых также наблюдалось нарушение экспрессии при СРП. Для генов, кодирующих ретинолсвязывающие белки, показано значительное изменение уровня экспрессии - повышение для гена RBP7 и снижение для гена RBP4. По-видимому, это связано с тем, что в опухолевых клетках происходит нарушение регуляции транспорта основных продуктов метаболизма ретинола и изменение их стабильности.

Биоинформатический анализ позволил выявить потенциальный онкоген ИЕТ02 и потенциальный ген-супрессор опухолевого роста Л7?0В2. Данные были подтверждены экспериментально методом ПЦР-РВ. Проведена оценка уровня мРНК генов, идентифицированных нами методами биоинформатики, как потенциально коэкспрессирующихся с НЕТ02 - генов СОХ4ЫВ и МГ^Х. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об отсутствии их корегуляции и коэкспрессии. Данные высокопроизводительного секвенирования и ПЦР-РВ показали, что одним из механизмов активации экспрессии гена МЕТ02 является его регуляция посредством трех микроРНК: ггиЯ-144, -206 и -335. Для гена N110132 показано, что вероятным механизмом подавления его экспрессии является гиперметилирование промоторного участка. Идентификация онко-ассоциированных генов и оценка экспрессии генов основных путей метаболизма в клетке, имеет важное практическое значение, так как позволяет идентифицировать новые онкомаркеры и мишени таргетной терапии, а также вносит важный вклад в понимание фундаментальных механизмов канцерогенеза.

ВЫВОДЫ

1. Биоинформатический анализ транскриптомных баз данных позволил выявить 1794 гена с пониженной и 2268 генов с повышенной экспрессией при светлоклеточном раке почки, в том числе частые изменения уровня мРНК генов, кодирующих компоненты гликолиза и метаболизма ретинола.

2. Впервые проведена количественная оценка содержания мРНК 13-ти генов, кодирующих ферменты гликолиза, при светлоклеточном раке почки. Показано частое (до 86%) и значительное (более 10 раз) повышение экспрессии генов НК1, НК2, НКЗ и РЕКР и дерегуляция экспрессии генов АЮОА, РОК1, йАРПН, СР1, РКМ2. Выявлена экспрессия только одной из двух кодирующих полноразмерный белок альтернативных изоформ генов О АРИН и СР1. Для гена ЕМ01 показана экспрессия преимущественно не принимающей участие в гликолизе изоформы 2, кодирующей ядерный белок.

3. Впервые проведена количественная оценка уровня мРНК 23-х генов, кодирующих компоненты метаболизма ретинола, при светлоклеточном раке почки. Выявлено несколько потенциальных генов-супрессоров: АВН1В, 1ЮН12, АЬОША2, КВР4, а также один потенциальный онкоген - КВР7. Для генов АКК1С1, КОН14, ИОН5, ИОН 13, АЮН1АЗ, ЯАЯВ, КАКС и КОКС показана дерегуляция экспрессии.

4. Обнаружено значительное (до 100 раз) повышение экспрессии гена ЖТО2 (за счет изоформы 1) в 97% образцов светлоклеточного рака почки, что позволяет рассматривать

его в качестве потенциального онкогена. Показано снижение экспрессии трех микроРНК (miR-144, -206 и-335), вероятно, регулирующих уровень мРНК гена NET02.

5. Выявлено практически полное подавление экспрессии гена NR0B2 в 86% образцов светлоклегочного рака почки, что позволяет рассматривать его в качестве потенциального гена-супрессора. В 70% случаев показано гиперметилирование промоторного участка гена NR0B2, которое, по-видимому, обуславливает его инактивацию.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Опарина Н. Ю. *, Садритдинова А. Ф. *, Снежкина А. В.*, Дмитриев А. А., Краснов Г. С., Сенченко В. Н., Мельникова Н. В., Беленикин М.С., Лакунина В. А., Веселовский В. А., Степанов В. А., Кудрявцева А. В. Повышение экспрессии гена NET02 как потенциальный молекулярно-генетический маркер при раке почки и легкого. Генетика. -Москва: "Наука". 2012,48, № 5, стр. 599-607.

2. Опарина Н. Ю.*, Снежкина А. В. *, Садритдинова А. Ф *., Веселовский В. А., Дмитриев А. А., Сенченко В. Н., Мельникова Н. В., Сперанская А. С., Дарий М. В., Степанов О. А., Бархатов И. М., Кудрявцева А. В. Дифференциальная экспрессия генов, кодирующих ферменты гликолиза, при раке почки и легкого человека. Генетика. - Москва: "Наука". 2013, 49, № 5, стр. 1-10.

3. Krasnov G. S., Dmitriev A. A., Snezhkina А. V., Kudryavtseva А. V. Deregulation of glycolysis in cancer: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) as a therapeutic target. Expert Opinion on Therapeutic Targets. - UK. 2013, 17 (6), P. 1-13.

* - авторы внесли равный вклад в исследование.

Тезисы

1. Снежкина А. В., Опарина Н. Ю., Садритдинова А. Ф., Дмитриев А. А., Кондратьева Т. Т., Кудрявцева А. В. Повышение экспрессии гена NET02 как потенциальный диагностический маркер при раке почки. Петровские чтения - 2012. Сборник тезисов. Санкт-Петербург. 2012. с.135.

2. Снежкина А. В., Садритдинова А. Ф., Веселовский В. А., Дмитриев А. А., Сенченко В. Н., Мельникова Н. В., Беленикин М. С., Сперанская А. С., Опарина Н. Ю., Кудрявцева А. В. Анализ вовлеченных в гликолиз генов при раке почки и легкого человека. Медицина в XXI веке: традиции и перспективы. Сборник трудов I Международной интернет-конференции.. Казань. 2012. с. 237.

3. Снежкина А. В., Садритдинова А. Ф., Дмитриев А. А., Кудрявцева А. В. Дифференциальная экспрессия генов, кодирующих ферменты гликолиза, при раке почки и

25

легкого человека. Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. Сборник тезисов. Казань. 2012. с. 355.

4. Kudryavtseva А. V., Snezhkina А. V., Dmitriev A. A., Krasnov G. S., Sadritdinova А. F., Melnikova N. V., Stepanov O. A., Uroshlev L. A., Lakunina V. A., Darii M. V., Oparina N. Y. Differential expression of glycolysis pathway genes in renal, lung and breast cancer. FEBS Journal.

2013. p. 385.

5. Кудрявцева А. В., Снежкина А. В., Дмитриев А. А., Краснов Г. С., Мельникова Н. В., Садритдинова А. Ф., Урошлев Л. А., Лакунина В. А., Бархатов И. М., Степанов О. А., Опарина Н. Ю. Нарушения экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза, при канцерогенезе. Вопросы онкологии: научно-практический журнал. Санкт-Петербург. 2013. с. 85.

6. Кудрявцева А. В., Снежкина А. В., Дмитриев А. А., Краснов Г. С., Мельникова Н. В., Садритдинова А. Ф., Урошлев Л. А., Лакунина В. А., Бархатов И. М., Степанов О. А., Опарина Н. Ю. Нарушение экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза, при раке почки, легкого и молочной железы. Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы. Сборник трудов II Международной интернет-конференции. Казань. 2013. с. 145.

7. Снежкина А. В., Садритдинова А. Ф., Дмитриев А. А., Дарий М. В., Мельникова Н. В., Кудрявцева А. В. Оценка экспрессии генов ядерных рецепторов ретиноидов у пациентов со светлоклеточным раком почки методом ПЦР-РВ. Молекулярная диагностика

2014. Сборник тезисов. Москва. 2014. с. 73.

8. Снежкина А. В., Дмитриев А. А. Повышение экспрессии гена NET02 -молекулярный маркер рака почки. Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов - 2014. Тезисы докладов. Секция «Биология». 2014. с. 258.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства Образования и Науки Российской Федерации, соглашение №8281.

Подписано в печать: 12.05.14

Объем: 1.3 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 100 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д. 2 (495) 978-66-63, www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Снежкина, Анастасия Владимировна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

04201457996

На правах рукописи

н

Снежкина Анастасия Владимировна

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ОНКО-АССОЦИИРОВАННЫХ ГЕНОВ ПРИ СВЕТЛОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ПОЧКИ

03.01.03 - Молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н., с.н.с. А.В. Кудрявцева

Москва 2014

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................................9

1.1. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста...................................................................9

1.1.1. Ген IЧЕТ02 - потенциальный онкоген СРП.....................................................................14

1.1.2. Ген N110112 - потенциальный супрессор СРП..................................................................16

1.2. Энергетический обмен в опухолевых клетках.......................................................................17

1.2.1. Гликолиз..............................................................................................................................19

1.3. Метаболизм ретинола и его нарушение при раке..................................................................24

1.3.1. Ретинол................................................................................................................................24

1.3.2. Метаболизм ретинола в клетке.........................................................................................25

1.3.3. Механизм действия рецепторов ретиноидов...................................................................29

1.3.4. Экспрессия генов, кодирующих ферменты биосинтеза ретиноевой кислоты.............31

1.3.5. Биологическая роль продуктов метаболизма ретинола.................................................32

1.4. Способы эпигенетической регуляции экспрессии генов......................................................34

1.4.1. МикроРНК..........................................................................................................................34

1.4.2. Метилирование...................................................................................................................43

1.4.3. Модификации гистонов.....................................................................................................44

1.5. Методы оценки уровня мРНК генов.......................................................................................45

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................................................52

2.1. Материалы.................................................................................................................................52

2.1.1. Образцы тканей..................................................................................................................52

2.2. Методы исследований...............................................................................................................52

2.2.1. Выделение нуклеиновых кислот.......................................................................................52

2.2.2. Реакция обратной транскрипции......................................................................................53

2.2.3. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени........................................54

2.2.4. Математическая обработка данных ПЦР-РВ..................................................................55

2.2.5. Анализ метилирования......................................................................................................57

2.2.6. Подготовка библиотек микроРНК....................................................................................57

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ...................................................................................59

3.1. Разработка методической базы для ПЦР-РВ..........................................................................59

3.2. Биоинформатический анализ экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза........60

3.2.1. Количественная оценка относительного уровня мРНК генов, кодирующих ферменты гликолиза.......................................................................................................................................61

3.3. Биоинформатический анализ экспрессии генов, кодирующих компоненты метаболизма

ретинола............................................................................................................................................76

3.3.1. Количественная оценка относительного уровня мРНК генов, кодирующих

компоненты метаболизма ретинола...........................................................................................78

3.4. Бионформатический поиск потенциальных молекулярных маркеров СРП......................102

3.4.1. Количественная оценка относительного уровня мРНК гена ЫЕТ02 и регуляция его экспрессии...................................................................................................................................103

3.4.2. Количественная оценка относительного уровня мРНК гена ЫЯ0В2 и регуляция его экспрессии...................................................................................................................................107

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................................................110

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................112

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотные остатки

п.н. - пар нуклеотидов

п.о. - пар оснований

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

кДНК - комплиментарная ДНК

мРНК - матричная РНК

микроРНК - малая РНК размером 19-25 нуклеотида ОТ - реакция обратной транскрипции РП - рак почки

СРП - светлоклеточный рак почки

НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого

ПРЛ - плоскоклеточный рак легкого

ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома

РМЖ - рак молочной железы

РЖ - рак желудка

РЩЖ - рак щитовидной железы

РТК - рак толстой кишки

ЯРР - ядерные рецепторы ретиноидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

АМФ - аденозинмонофосфат

АДФ - аденозиндифосфат

АТФ - аденозинтрифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ГДФ - гуанозиндифосфат

БЭИ - биоэнегретический индекс

Ацетил-коА - ацетил кофермент А

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

Обозначения генов:

LRAT- ген, кодирующий лецитинретинолацилтрансферазу RPE65 - ген, кодирующий белок пигментного эпителия сетчатки AKR1C1 - ген, кодирующий альдокеторедуктазу С1 ADH1B - ген, кодирующий алкогольдегидрогеназу 1В

DHRS3 и DHRS4 - гены, кодирующие ретинолдегидрогеназы/редуктазы 3 и 4, соответственно

RDH5, RDH8, RDH10, RDH11, RDH12, RDH13 и RDH14 - гены, кодирующие ретинолдегидрогеназы 5, 8 и 10-14, соответственно

ALDH1A1, ALDH1A2 и ALDH1A3 - гены, кодирующие альдегиддегидрогеназы Al, А2 и A3

RETSAT- ген, кодирующий гюлпостыо-т/?аяс-ретинол-13,14-редуктазу RBP2, RBP4 и RBP7 - гены, кодирующие ретинолсвязывающие белки 2, 4 и 7, соответственно

RARA, RARB и RARG - гены, кодирующие рецепторы ретиноевой кислоты альфа, бета и гамма, соответственно

RXRA, RXRB и RXRG - гены, кодирующие рецепторы X ретиноидов альфа, бета и гамма, соответственно

RORA, RORB и RORC - гены, кодирующие орфановые рецепторы ретиноидов альфа, бета и гамма, соответственно

NET02 - ген, кодирующий трансмембранный белок

COX4NB - ген, кодирующий субъединицу 8 сложного мембранного белка эндоплазматического ретикулума

NEFL - ген, кодирующий белок нейрофиламента

NR0B2 - ген, кодирующий белок - малый гетеродимерный партнер

НК1, НК2 и НКЗ - гены, кодирующие гексокиназы 1, 2 и 3, соответственно

ADPGK - ген, кодирующий АДФ-зависимую глюкокиназу

GPI - ген, кодирующий глюкозо-6-фосфат изомеразу

PFKP - ген, кодирующий фосфофруктокиназу

ALDOA - ген, кодирующий альдолазу А

GAPDH- ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу

PGK1 - ген, кодирующий фосфоглицераткиназу

5

PGAM1 - ген, кодирующий фосфоглицератмутазу 1

BPGM- ген, кодирующий 2,3-бифосфоглицератмутазу

ENOl - ген, кодирующий альфа-энолазу 1

РКМ2 - ген, кодирующий пируваткиназу

АСТВ - ген, кодирующий актин бета

GUSB - ген, кодирующий глюкоронидазу бета

ТВР - ген, кодирующий белок, который связывается с ТАТА-боксом

RPN1 - ген, кодирующий рибофорин 1

PPIA - ген, кодирующий пептидилпролилизомеразу А

NET1 - ген, кодирующий белок нейроэпителиальной клеточной трансформации 1

SRC - ген, гомолог онкогена V-Src вируса птичей саркомы

АКТ - ген, гомолог онкогена V-Akt вируса тимомы мышей

МУС - ген, гомолог онкогена V-Myc вируса птичьего миелоцитоматоза

RAS - ген, гомолог онкогена V-Ral вируса лейкемии обезьян

ВВЕДЕНИЕ

Рак почки (РП) является распространенным заболеванием, характеризующимся высокой смертностью. Ежегодно в мире выявляют более 190 тыс. новых случаев рака почки и более 90 тыс. человек умирает по причине этого заболевания. Основным гистологическим типом рака почки является светлоклеточная почечноклеточная карцинома (светлоклеточный рак почки, СРП), которая составляет 70-75% от всех случаев рака почки и формируется клетками проксимальных извитых канальцев. РП возникает спорадически, с одинаковой частотой для каждой почки, причем мужчины заболевают в полтора раза чаще, чем женщины. В 4% случаев это заболевание имеет наследственный характер (синдром Хиппеля-Линдау) и связано с терминальными мутациями в соответствующих генах. РП долгое время может протекать бессимптомно, жалобы у больных появляются на поздних трудноизлечимых стадиях с метастазами (на момент установления диагноза 25% больных обнаруживают отдаленные метастазы). Выявление РП на ранних стадиях в большинстве случаев являются случайными находками при плановом обследовании. Между тем, при диагностике РП на 1-ой стадии развития заболевания пятилетняя выживаемость больных может достигать 70%. Кроме того, РП характеризуется устойчивостью к химио- и радиотерапии. Применяемые в настоящее время таргетные препараты обладают низкой эфективностью и опухоль быстро приобрететает к ним резистентность. Основным методом лечения РП является хирургическое вмешательство - почка удаляется целиком (нефрэктомия) или частично (резекция).

Канцерогенез - сложный многоэтапный процесс перерождения нормальных клеток в злокачественные. Опухолевая трансформация характеризуется комплексными генетическими (соматические мутации, хромосомные аберрации, рекомбинации ДНК) и эпигенетическими (метилирование ДНК, гистоновый код, некодирующие РНК и др.) нарушениями, которые приводят к изменению экспрессии онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста. Происходит нарушение основных путей метаболизма и клеточных сигнальных путей, например, энергетического обмена. Для изучения роли определенных генов в канцерогенезе проводят оценку их экспрессии на уровне мРНК и белка в опухолевых тканях по сравнению с нормальными тканями. Также, исследуют возможные механизмы регуляции активности генов: статус метилирования, профиль

микроРНК, модификации гистоиов и др. За последние 20 лет разработаны различные методы анализа экспрессии генов, которые позволяют не только изучать активность и регуляцию определенных генов в биологических образцах (ПЦР, SSH), но и проводить масштабный анализ экспрессии генов (NGS, кДНК-микрочипы). Например, на основе результатов, полученных методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) и ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) можно получить достоверные данные об экспрессии множества генов, мутациях и профиле микроРНК, сделать выводы о возможных механизмах канцерогенеза и выбрать гены перспективные для дальнейшего применения в клинической практике.

Представленная работа посвящена идентификации онко-ассоциированных изменений экспрессии генов, в том числе, вовлеченных в важнейшие метаболические и сигнальные пути, при светлоклеточном раке почки человека. Проведена количественная оценка содержания мРНК генов: потенциального онкогена NET02, а также двух генов, вероятно коэкспрессирующихся с ним (COX4NB и NEFL)\ гена-супрессора опухолевого роста NR0B2; генов, кодирующих ферменты гликолиза (НК1, НК2, НКЗ, ADPGK , GPI, PFKP, ALDOA, GAPDH, PGK1, PGAMl, BPGM, ENOl, РКМ2); генов, кодирующих компоненты основных этапов метаболизма ретинола {AKR1C1, ADH1B, DHRS3, DHRS4, RDH5, RDH10, RDH11, RDH12, RDH13, RDH14, ALDH1A1, ALDH1A2, ALDH1A3, RETSAT, RBP4, RBP7, RARA, RARB, RARG, RXRA, RXRB, RORA, RORC). Помимо этого, в работе исследовали возможные механизмы наблюдаемых изменений уровня мРНК нескольких генов. Для поиска механизмов гиперэкспресии гена NETO2 методом высокопроизводительного секвенирования выполнили профилирование микроРНК, затем с помощью метода ПЦР-РВ провели валидацию трех выбранных микроРНК. Для гена NR0B2 оценили изменение статуса метилирования в опухоли почки по сравнению с гистологически неизмененной прилежащей тканью. Для нескольких генов, кодирующих ферменты гликолиза (GAPDH, GPI, EN01) и гена NET02 оценили вклад альтернативных изоформ в экспрессию при СРП. Даннные по количественной оценке экспрессии генов, для которых были выявлены частые и значительные изменения, могут быть рекомендованы для разработки панели специфических маркеров ранней диагностики СРП, а также в качестве потенциальных мишеней для таргетной терапии этого заболевания.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста

Ведущая роль в процессе трансформации нормальных клеток в опухолевые принадлежит генетическим и эпигенетическим нарушениям. По функции кодируемых белков, гены, ассоциированные с канцерогенезом, принято делить на два класса: 1) онкогены и 2) гены-супрессоры опухолевого роста. Продукты, кодируемые онкогенами, участвуют в позитивном контроле клеточного роста. Продукты, кодируемые генами-супрессорами, часто являются негативными регуляторами клеточного роста и в норме обладают противоопухолевым эффектом. Необходимо отметить, что это разделение довольно условно, так как одни и те же гены в одних типах опухолей могут выполнять свою функцию как онкогены, а в других - как супрессоры.

Онкогены. К продуктам онкогенов, способствующим пролиферации, относятся, в первую очередь, многие факторы роста, их рецепторы, промежуточные молекулы, передающие сигнал от мембраны к ядру, и ядерные транскрипционные факторы -регуляторные белки, способные координировано активировать или ингибировать экспрессирую множества генов (табл. 1) (Горбунова, 2007). Канцерогенный эффект онкогенов, главным образом, связан с генетическими нарушениями, приводящими к экспрессии мутантных белков. Эти белки приобретают способность к передаче сигнала, индуцирующего клетку к делению, при отсутствии внешнего стимула, что приводит к постоянной активации всей сигнальной цепи и неконтролируемому делению клетки. Генетические нарушения онкогенов, кодирующих факторы роста, приводят к гиперэкспрессии этих белков. Поскольку передача сигнала от белка к белку может осуществляться за счет фосфорилирования, трансмембранные рецепторы факторов роста и промежуточные молекулы, участвующие в сигнальной трансдукции, часто обладают протеинкиназной активностью. Это могут быть рецепторные или цитоплазматические тирозинкиназы и серин/треонинкиназы. Сигнальная трансдукция может осуществляться также с участием ГТФ-связывающих G-белков (Татосян, 2000; Yang, Xia, 2006).

Таблица 1. Классы онкогенов {Горбунова, 2007).

Протоонкогены Генетические нарушения Типы опухолей

Гены факторов роста: PDGFB, EGF, TGFA, TGFB, GDNF, INT2, HST1, NT1/WNT3, VEGF, FGFA, FGFB. Амплификация, гиперэкспрессия, нарушение экспрессии. Карциномы молочной железы, желудка и др.

Гены рецепторов факторов роста: PDGFRB, PDGFRA, EGFR, HER2/NEU, RET, EPH, ELK, FMS, KIT, MET, ROS, SEA, TRK, VEGFR. Амплификация, гиперэкспрессия, конститутивная индукция тирозин-киназной активности. Плоскоклеточные карциномы; глиобластомы; аденокарциномы молочной железы и яичников.

Гены цитоплазматических сигнальных молекул: 1. Гены тирозинкиназ: SRC семейство (BLK, FGR, FYN, НС К, 1С К, LYN, SRC, YES), CSK/C YL, FPS/FES; ABL; Конститутивная индукция тирозинкиназной активности; слияние с Ьсг-филадельфийской хромосомой; Карциномы толстого кишечника, желудка и легких; острый лимфолейкоз; опухоли слизистой нейробластомы и поджелудочной железы.

2. Гены серин/треонин-киназ: RAF/MIL, MOS, BCR, PIMI, AKT; 3. Гены G-белков: NRAS, KRAS, HARAS, GSP. сайт-специфические мутации, аминотерминальное слияние, конститутивная индукция цАМФ-зависимого киназного каскада; нарушение связи с плазматической мембраной.

Гены ядерных транскрипционных факторов: FOSB, FRAI, FRA2, JUNB, JUND, BCL3, EVI1, MYB, REL, ETS, TALI, SKI, MYCL, MYCN. Гиперэкспрессия, амплификация. Нейробластомы; карциномы желудка, кишечника, яичников и легких; лимфома Бэркитта.

Гены анти-апоптозных белков: BAX, BCL2A, BCL2B. Гиперэкспрессия, транслокации. Фолликулярная В-клеточная лимфома.

Гены-супрессорые опухолевого роста были обнаружены значительно позднее

онкогенов. Белковые продукты этих генов вовлечены в контроль механизмов

негативной регуляции клеточного роста. Как правило, для проявления

трансформирующего эффекта этих генов необходима инактивация двух гомологичных

аллелей, которая сопровождается потерей их функции. В нормальных тканях гены-

супрессоры оказывают инактивирующее влияние на процессы пролиферации,

способствуют клеточной гибели, в экспериментальных моделях способны осуществлять

ю

реверсию злокачественного фенотипа. В опухолевых тканях пациентов со спорадическими формами онкологических заболеваний, также как в раковых линиях клеток, часто присутствуют делеции областей локализации генов-супрессоров. Наличие таких делеций чаще всего идентифицируют с помощью генетического анализа состояния гипервариабельных микросателлитных маркеров, локализованных внутри рецессивных онкогенов или тесно сцепленных с ними. Высокая изменчивость микросателлитных маркеров по числу повторяющихся элементов в кластере приводит к тому, что большинство из них в норме находится в гетерозиготном состоянии. При возникновении делеции в области локализации микросателлитного маркера один из аллелей теряется, такой ген становится гомозигот