Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Полиморфные и STS-маркеры хромосомы 3 человека и локализация делеций на коротком плече хромосомы 3 в опухолях легкого, молочной железы и шейки матки

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пугачева, Елена Михайловна, Москва

п

государственный научно-исследовательскии

институт генетики и селекции промышленных

микроорганизмов

На правах рукописи

ПУГАЧЕВА ЕЛЕНА МИХАИЛОВНА

ПОЛИМОРФНЫЕ И 8Т8-МАРКЕРЫ ХРОМОСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА И ЛОКАЛИЗАЦИЯ ДЕЛЕЦИЙ НА КОРОТКОМ ПЛЕЧЕ ХРОМОСОМЫ 3 В ОПУХОЛЯХ ЛЕГКОГО, МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ШЕЙКИ МАТКИ

03,00.03 - Молекулярная биология

Научный руководитель кандидат химических наук Брага э.а.

дисертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1999

Оглавление

Введение.................................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................8

1.1.Гены - супрессоры рака.............................................................8

1.2. Подходы при локализации районов, содержащих гены-супрессоры рака..........................................................................10

1.2.1. Цитогенетический анализ...................................................11

1.2.2. Анализ аллельных потерь..................................................12

1.2.3. Анализ нестабильности микросателлитных последовательностей..................................................................14

1.3. Тонкая локализация и идентификация генов в

клонированнных фрагментах ДНК.........................................16

1.3.1. Noil-библиотеки для картирования генов человека, в том числе ассоциированных с развитием опухолей.............17

1.3.2. CpG участки, их связь с NotI - клонами и генами.........19

1.4. Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 в опухолях легкого, молочной железы, шейки матки и других органов.............................................................................21

1.4.1. Делении на коротком плече хромосомы 3 при раке легкого...........................................................................................21

1.4.2. Делеции на коротком плече хромосомы 3 при раке молочной железы.........................................................................27

1.4.3. Делеции на коротком плече хромосомы 3 при раке женских репродуктивных органов..........................................30

1.4.4. Делеции на коротком плече хромосомы 3 в опухолях других органов.............................................................................32

1.5. Гены-кандидаты на хромосоме Зр........................................34

1.5.1. Область 3р13-р14..................................................................34

1.5.2. Область Зр21..........................................................................35

1.5.3. Область Зр25..........................................................................37

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.......................................39

2.1. Реактивы и ферменты............................................................39

2.2 Буферные растворы.................................................................39

2.3. Бактериальные штаммы и плазмиды.................................40

2.4. Not! - библиотека и контиг космид......................................40

2.5. Выделение ДНК........................................................................41

2.5.1. Выделение ДНК плазмид и космид...................................41

2.5.2. Выделение геномной ДНК из ткани человека с помощью протеиназы К и экстракции фенол-хлороформом (Grimberg, 1989)...............................................41

2.6. Расщепление ДНК рестриктазами и реакции лигирования.................................................................................42

2.7. Получение компетентных клеток E.coli JM109 и их трансформация плазмидной ДНК............................................43

2.8. Электрофоретическое разделение ДНК..............................43

2.9. Определение нуклеотидной последовательности..............44

2.10. Мечение олигонуклеотидных зондов с применением полинуклеотидкиназы фага Т4 и гибридизация по

С ау зерну........................................................................................44

2.11. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)...............................44

2.12. Окрашивание фрагментов ДНК в ПААГ азотнокислым серебром (согласно Budowle et al., 1991)..................................46

2.13. Популяционная выборка для анализа новых полиморфных локусов................................................................46

2.14. Сбор материала......................................................................46

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.......................51

3.1. Новые маркеры на хромосоме 3 человека..........................51

3.1.1. Частота встречаемости и особенности распределения микросателлитов различных мотивов в составе Notl -библиотеки хромосомы 3 и контига космид из области 3р21.31...........................................................................................51

3.1.2. Микросателлиты в Notl-связующих и прыжковых клонах как маркеры генов........................................................60

3.1.3. Получение и анализ реклонов, содержащих

микро сателлиты..........................................................................60

3.1.4. Характеристика локусов микросателлитов с помощью ПЦР................................................................................................62

3.1.5. Применение новых маркеров хромосомы 3....................66

3.2. Делеционное картирование хромосомы Зр в трех видах эпителиального рака..................................................................67

3.2.1. Анализ аллельных потерь и нестабильности микросателлитов; учет потерь Н и L-аллелей......................68

3.2.2, Аллельные изменения на коротком плече хромосомы 3 в образцах рака легкого...............................70

3.2.3. Аллельные изменения на коротком плече хромосомы 3 в образцах рака молочной железы............75

3.2.4, Аллельные изменения на коротком плече хромосомы 3 в образцах рака шейки матки......................77

3.2.5. Сравнение аллельных изменений на хромосоме Зр в разных формах эпителиального рака.....................................81

ВЫВОДЫ............................................................................88

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................89

Введение

Поиск генов, подавляющих развитие опухоли (tumor suppressor genes), является важным подходом в изучении молекулярных основ канцерогенеза. С целью обнаружения генов-супрессоров проводят картирование областей ДНК, делетируемых в раковых клетках, и исследуют подавление роста опухоли под действием фрагментов ДНК из этих областей.

Анализ делеций ДНК в раковых клетках с помощью цитогенетических методов и с использованием полиморфных маркеров -первый этап в поиске генов-супрессоров. В злокачественных новообразованиях человека делении и перестройки обнаруживают на многих хромосомах: 3, 8, 9, 13, 17 и в других (Mertens, 1997; Todd et al., 1997; Fujii et al., 1998; Ingvarsson et al., 1998). В некоторых видах опухолей, например, в светлоклеточной карциноме почки и во всех видах рака легкого в наибольшей степени повреждается короткое плечо хромосомы 3 (Kok, 1997; Leong et al., 1998; Ulimann et al., 1998). Аллельные потери в области Зр обнаружены и в опухолях многих других органов: молочной железы, шейки матки, желудка, прямой кишки, яичников и мочевого пузыря (Chen et al., 1994; Jshwad et al., 1996; Su et al., 1998). Ряд наблюдений: высокая частота потери гетерозиготности в некоторых районах Зр, обнаружение в этих же районах гомозиготных делеций и активности подавления опухолевого роста позволяют предположить, что аллельные делеции в области Зр являются критическим событием в патогенезе некоторых видов рака. В связи с этим на коротком плече хромосомы 3 проводится интенсивный поиск генов, ассоциированных с развитием рака легкого, почки, шейки матки и других органов.

Представленная работа посвящена поиску генов-супрессоров рака на коротком• плече хромосомы 3. Первый этап работы состоял в формировании новых полиморфных и STS-маркеров Зр-плеча, необходимых для анализа и картирования областей, содержащих потенциальные гены-супрессоры. Полиморфные локусы микро сателлитов, расположенные непосредственно внутри или вблизи

генов, более надежны для исследования вовлеченности гена в заболевание, чем генетически сцепленные, но физически удаленные маркеры. Маркеры на основе таких локусов применяют также для локализации гена методом скрининга панелей гибридных клеточных линий и разнообразных клонотек с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ранее для нуклеотидных последовательностей, прилежащих к NotI-участкам в Notl-связующих и Notl-прыжковых клонах хромосомы 3 человека (Zabarovsky et al., 1990), показано повышенное содержание CpG-островов, ассоциированных с генами, и последовательностей, гомологичных мРНК и известным генам (Allilcmets et al., 1994; Zabarovsky et al., 1995). В связи с этим, для создания маркеров к генам хромосомы 3 проведен скрининг на микросателлиты девяти мотивов 150 Notl-связующих и Notl-прыжковых клонов, субрегионально локализованных на хромосоме 3. Аналогичный поиск проведен также и для контига из 22 космид, покрывающих область гомозиготных делеций в районе Зр21.31, обнаруженных в опухолях легкого (Wei et al., 1997).

Полученные в этом исследовании данные по распределению микросателлитов девяти мотивов представляют самостоятельный интерес с точки зрения развития представлений о встречаемости в геноме повторяющихся последовательностей определенного типа. Так, в данной работе в ДНК обеих групп клонов выявлено трехкратное относительно генома человека в целом снижение частоты встречаемости СА-повторов и повышение частоты встречаемости мотивов CAG, GGA, ААТ, САС, AAAG, AATG и GATG, характерных для экзонов.

Делеционное картирование хромосомы Зр проводится в солидных опухолях разных локализаций в разных лабораториях мира. При этом, даже для одной формы рака, например светлоклеточного рака почки, результаты весьма противоречивы и в отношении положения областей, наиболее подверженных делециям, и в отношении доли концевых, внутренних и множественных делеций (Van den Berg et al. ,1996, 1997; Chudek et al., 1997; Shridar et al., 1997; Clifford et al., 1998). Расхождение результатов, по-видимому, связано с использованием различных наборов маркеров и с отличием методов отбора материала (применение микродиссекции или линий клеток). Сопоставление данных, полученных

для разных форм рака в разных лабораториях, по этим же причинам затруднено еще в большей степени. Тем не менее обнаруженные перекрывания делетируемых областей Зр в RCC и в опухолях легкого (Кок et al,, 1997), а также перекрывание гомозиготных делений в опухолях легкого и молочной железы (Todd et al., 1997; Selcido et al., 1998) позволяют предположить существование на Зр общих генов-супрессоров рака, участвующих в патогенезе разных форм рака. Для их обнаружения требуется детальное делеционное картирование этой хромосомы в разных формах рака в сопоставимых условиях: с применением одинаковой техники отбора материала и одной и той же панели маркеров. На втором этапе нашей работы было проведено такое делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 с использованием ДНК из 74 пар образцов эпителиальных опухолей трех локализаций (рак легкого, молочной железы и шейки матки) с использованием плотной панели ди-, три- и тетрамерных полиморфных маркеров (13 локусов). Применение техники микродиссекций при отборе большинства образцов тканей обеспечило высокое (не менее 70%) содержание опухолевых клеток в исследуемом материале. Полученные результаты позволили впервые корректно сравнить частоты нестабильности микросателлитов, аллельных потерь и делеций разного типа на хромосоме Зр в эпителиальных опухолях разной локализации. Представление полученных данных в виде профилей аллельных потерь на Зр для трех разных форм эпителиального рака позволило определить критические зоны для каждой из форм и участки их перекрывания, потенциально содержащие гены-супрессоры, общие для нескольких форм. Следует отметить, что аналогичных исследований отдельных хромосом в нескольких формах рака методом аллелотинирования ранее не проводилось.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Л.Гены - супрессоры рака

Рак ~ это заболевание генетического аппарата определенного типа клеток, при котором мутации в ДНК приводят к селекции клона клеток, способного к неконтролируемому росту (Киселев, 1998). Рост раковой опухоли и ее развитие, как правило, являются результатом множественных мутаций. Активация мутантных предонкогенов и инактивация генов-супрессоров рака играют ведущую роль в этом процессе.

В результате эпидемиологических исследований Кнадсон (Knudson, 1971) предположил, что возникновение и передача по наследству ретинобластомы связаны с дефектом - мутацией или потерей одного из аллелей гена этого заболевания. Наследуемая мутация вызывает предрасположенность к образованию опухоли, которая возникает в результате последующей делеции или инактивации другого аллеля. В спорадических случаях требуется два соматических события в клетке, инактивируюгцих последовательно оба аллеля. Потеря маркерами гетерозиготности в ДНК опухоли, рассматривалась, как указание на делеции в данном месте на одном из гомологов хромосомы 13. Ген ретинобластомы (RBI, 13q 14) - первый ген-супрессор, найденный на основании анализа делегируемых областей методами цитогенетики с применением маркеров ДНК (Yunis and Ramsey, 1978, Turleau et al., 1985). Эпидемиологические исследования, а также применение цитогенетических методов и анализа ДНК по Кавени (Cavenee et al., 1985) позволили локализовать ген ретинобластомы до того момента, как его удалось клонировать (Fiiend et al., 1985). Таким образом, на примере ретинобластомы, разработана стратегия идентификации супрессоров опухолевого роста.

Гемы-супрессоры, потеря которых является обязательным событием

для роста данного типа опухоли, могут играть определенную роль и в

развитии других типов опухолей. Так, ген RB1 показывает повсеместную

экспрессию во множестве тканей и делеции или мутации в различных

типах опухолей. Вторичные мутации гена RB1 наблюдаются при

остеоеаркоме и саркоме мягких тканей (Weichselbaum et al., 1988), а также

-8-

при лейкозе, лимфоме и мелко клеточном раке легкого (Horowitz et al., 1990). Однако инициирующая роль гена RB1 доказана только для возникновения ретинобластомы.

Гены-супрессоры опухолевого роста разделяются на две большие группы по их месту в системе функционирования эукариотической клетки. Биологическая функция генов-супрессоров может быть связана непосредственно с контролем клеточного цикла, сверки его механизмов, устранением апоптоза. Гены этого типа называются "привратниками" («genes-gatekeepers», Kinzler and Vogelsteln, 1997). Второй тип генов-супрессоров-это гены, которые поддерживают стабильность генома: их потеря или повреждение приводят к повышению нестабильности генома, увеличению скорости возникновения мутаций, а следовательно, и к повышению вероятности повреждения генов, в том числе и "генов-привратников". Гены этого типа называются "смотрителями" («genes-caretakers», Kinzler and Vogelsteln, 1997).

К группе "генов-привратников" относятся такие хорошо известные гены, как RBI, WT1 (опухоль Вильмса), NF1 (нейрофиброматоз типа 1), р53 (апоптоз), а также гены, способствующие образованию клеточных контактов (АРС, NF2, ММАС1, PTEN). Наиболее широкоизвестный ген-супрессор рака, относящийся к группе "генов-привратников"-это полифункциональный ген р53. Мутации и делеции этого гена наблюдали примерно в 50% всех злокачественных заболеваний. Основная функция р53, непосредственно связанная с канцерогенезом, - это выявление различных нарушений в ДНК и активация определенных генов для их ликвидации, что осуществляется с помощью апоптоза - программируемой гибели клеток с поврежденным геномом (Lowe et al., 1993; Lutzker and Levine, 1996). Во многих опухолевых клетках эта функция гена р53 нарушена и, как следствие, программа регулируемой гибели клеток переключается на программу фактически неограниченного долгожительства, характерного для опухолевых клеток

Классическими примерами "генов-смотрителей" являются гены, мутации в которых вызывают неполипозный рак толстой кишки (HNPCC), - MLH1 (3р21-р23) и MSH2 (2р15-р16). Гены - BRCA1 и BRCA2 вызывают наследуемый рак молочной железы и яичников и, по-видимому, также

относятся к группе "генов-смотрителей". Они отвечают за процессы репарации, и нарушение каждого из них вызывает резкое увеличение количества мутаций и, как следствие, увеличение опухолевого роста и степени злокачественности.

Следует отметить, что на коротком плече хромосомы Зр к настоящему времени открыты гены-супрессоры, относящиеся к обоим классам: УНЬ («ген-привратник», локализованный в районе Зр25) и МЬН1 («ген-смотритель», локализованный в районе 3р21-р23). Их функции описаны в главе 1.5.

Кроме генов, контролирующих пролиферацию клеток, таких как онкогены и гены-супрессоры, не менее важную роль в канцерогенезе играют и гены, осуществляющие стабилизацию молекулы ДНК, контролирующие ее размеры и правильность первичной и вторичной структуры. Это прежде всего гены, кодирующие комплекс теломеразы (т.е. РНК-затравку и белковые компоненты) - фермента, играющего ключевую роль при переключении клеток от программируемой гибели (апоптоза) к длительному персистированию, а затем и неконтролируемому росту. Эта группа генов контролирует ранние процессы, способствующие превращению нормальной клетки в иммортальную, но активность этих генов, по-видимому, необходима и для поддержания трансформированного фенотипа опухолевых клеток.

1.2. Подходы при локализации районов, содержащих

гены-супрессоры рака

В последнее время число выявленных генов-супрессоров существенно возросло. Это прежде всего связано с разработкой новых стратегии при поиске генов-супрессоров. Конкретный ген из данной области рассматривается как ген-супрессор рака на основании следующих

критериев;

1) Локализация в области делегируемого района;

2) Заметно уменьшенная экспрессия или синтез ненормального

транскрипта;

3) Подавление роста опухоли при переносе в раковые клетки.

Первый этап в поиске генов-супрессоров - картирование делеций и участков амплификации ДНК в раковых клетках, осуществляется с применением двух подходов: цитогенетического