Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Делекционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека и спектр метилирования генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta 2 в эпителиальных опухолях разных локализаций
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Делекционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека и спектр метилирования генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta 2 в эпителиальных опухолях разных локализаций"
На правах рукописи
ЛОГИНОВ ВИТАЛИЙ ИГОРЕВИЧ
ДЕЛЕЦИОННОЕ КАРТИРОВАНИЕ КОРОТКОГО ПЛЕЧА ХРОМОСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА И СПЕКТР МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОВ ВЛ88Г1Л, 8ЕМЛ3В И ВЛЯ-ЬеГа 2 В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЯХ РАЗНЫХ ЛОКАЛИЗАЦИЙ.
03.00.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2004
Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной
дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института
генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»).
Научный руководитель:
кандидат химических наук Брага Элеонора Александровна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
профессор Карпухин Александр Васильевич
кандидат биологических наук Сломннский Петр Андреевич
Ведущая организация: Институт биологии гена РАН.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».
Защита состоится «_ 2004г. в часов на заседании
Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика».
Реферат разослан «_». 2004 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета
кандидат биологических наук
Щербакова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют как генетические, так и эпигенетические факторы. С целью поиска генов, связанных с развитием опухолей, в первую очередь проводят картирование областей ДНК, часто делегируемых в раковых клетках, и исследуют подавление роста опухоли под действием фрагментов ДНК из этих районов. При выявлении новых генов-кандидатов сравнивают уровень их экспрессии (синтез м-РНК) в опухоли по сравнению с аналогичным паттерном в гистологически нормальных тканях, прилежащих к опухоли. В регуляции экспрессии генов, связанных с развитием злокачественных опухолей, все большая роль отводится метилированию CpG-островков в их промо-торных районах (Jain, 2003).
Гиперметилирование CpG-островков в промоторном районе найдено для ряда ге-нов-супрессоров, таких как VHL, hMLHl,pl6, CASP8, pl4ARF, RASSF1A и др. (Herman et al, 1994,1998; Teitz et al., 2000; Esteller et al., 2000; Dammann et al., 2003). Изменение статуса метилирования промоторных районов некоторых генов является характерной чертой опухолевых клеток, причем аномальное метилирование наблюдается уже на ранних этапах канцерогенеза (Nass et al., 2000; Esteller et al., 2001).
Идентификация и анализ генов, изменяющих статус метилирования в опухолях, — важная задача как для науки, так и для практики. С теоретической точки зрения такие исследования способствуют изучению фундаментальных механизмов патогенеза опухолей, а с практической - позволяют осуществлять поиск новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза, профилактики и мониторинга распространенных онкологических заболеваний.
В злокачественных новообразованиях человека делеции и перестройки обнаруживают на многих хромосомах: 1,3,6,8,9,13,17,18 и других (Girard et al., 2000; Richard et al., 2000). В некоторых видах опухолей, например, в светлоклеточной карциноме почки, и во всех типах рака легкого в наибольшей степени делениям подвержено короткое плечо хромосомы 3 (Зр). Высокая частота потери гетерозиготности (LOH) в некоторых районах на Зр, обнаружение в этих же районах гомозиготных делений (HD) и опухоль-подавляющей активности явились предпосылкой для поиска на Зр генов, связанных с канцерогенезом. В результате за последние несколько лет на коротком плече хромосомы 3 человека было открыто до 10 генов-супрессоров, а также кластеры генов-кандидатов в новых критичных районах Зр (Zabarovsky et al., 2002; Брага и др. 2003, 2004). Для ряда генов из этих районов показана их инактивация в опухолях за счет гиперметилирования CpG-островков в промоторных районах.
В связи с этим идентификация на Зр новых генов, участвующих в развитии эпителиальных опухолей, и анализ регуляции их активности за счет гиперметилирования -актуальные задачи онкогеномики и молекулярной биологии в целом.
Цель и задачи исследования. Данная работа направлена на идентификацию на коротком плече хромосомы 3 новых генов, связанных с патогенезом таких распространенных и социально опасных форм рака, как рак
яичников и шейки матки. В соответствии с указанной целью нами были поставлены следующие задачи:
1. Провести делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 в эпителиальных опухолях пяти локализаций и определить критичные районы, общие и специфичные для разных типов рака.
2. Выявить возможные ассоциации между частотой аллельных делеций и клинико-морфологическими характеристиками исследованных опухолей.
3. Разработать эффективную методику анализа частоты и плотности метилирования СрО-островков промоторных районов генов с использованием набора метилчувстви-тельных рестриктаз и последующей ПЦР (МЧРА), метилспецифичной ПНР (МСП) и бисульфитного секвенирования.
4. Провести детальный анализ уровня (частоты и плотности) метилирования СрО-островков в промоторных районах потенциальных генов-супрессоров ЕЛ88Ж1Л, 8ЕЫЛ3В (3р21.31) и КЛЯ-Ь&а2 (3р23-р22.3) в опухолях разных локализаций.
5. Выявить возможные ассоциации между уровнем метилирования этих генов и прогрессией опухоли.
Научная новизна работы. В данной работе впервые проведен сравнительный анализ аллельных делеций на Зр-плече в эпителиальных опухолях пяти разных локализаций с использованием идентичной и плотной панели микросателлитных маркеров. Полученные данные позволили локализовать новый район генов-кандидатов в области 3р21.31 между маркерами Б382409, Б382456 и Б383667. В этом критичном районе (0.6 млн.п.н.) содержится до 20 новых генов; для семи из них имеются данные о возможном участии в онкогенезе.
Впервые показано, что метод аллелотипирования полиморфных маркеров и метод количественной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) согласуются при исследовании парных образцов ДНК опухоли и соответствующей нормы (Р<0.05 согласно корреляции Спирмана). Впервые установлена достоверная прямая корреляция частоты ал-лельных делеций на коротком плече хромосомы 3 и в отдельных районах Зр, со стадией и степенью анаплазии опухолей разных локализаций
Выявлены особенности метилирования промоторных районов новых супрессорных генов, локализованных на Зр: КЛЯ-Ь&а2, ЕЛ88Ж1Л и 8ЕЫЛ3В - при эпителиальном раке разных локализаций. Так, ген ЕЛ88Ж1Л метилирован в опухолях яичников и почки с частотой 73% и 94% соответственно. В 1.5 раза реже (42% и 61% соответственно) при этих двух видах рака наблюдали метилирование гена 8ЕЫЛ3В. Напротив, частота метилирования гена КЛЯ.-Ь&а2 резко отличалась в опухолях этих локализаций, достигая 90% при почечноклеточном раке и только 27% в эпителиальных опухолях яичников. Впервые установлена достоверная положительная корреляция степени метилирования гена 8ЕЫЛ3В со стадией и степенью анаплазии опухолей яичников и почки, а гена ЕЛ88Ж1Л — с прогрессией опухолей яичников. Кроме того, в промоторных районах генов Зр ЕЛЛ-Ь^а2, ЕЛ88Ж1Л и 8ЕЫЛ3В обнаружены гомозиготные делеций в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников; и показана их ассоциация с тяжелой клинической стадией онкологических заболеваний.
Практическая ценность работы. Проведено детальное картирование 311 парных образцов эпителиальных опухолей различных локализаций с использованием 24 полиморфных микросателлитных маркеров. Изучен уровень метилирования СрО-островков в промоторных районах генов RAR-beta2, RASSF1A и SEMA3B в первичных опухолях почек, молочной железы и яичников (172 случая).
Прямая корреляция частоты аллельных делеций со стадией и степенью анаплазии опухолей разных локализаций для района АР20 и других участков области 3р21.3, выявленная в данной работе, означает, что гены из этих районов можно применять с целью прогнозирования течения заболевания.
Ассоциация гомозиготных делеций, обнаруженных в промоторных районах генов RAR-beta2, RASSF1A и SEMA3B, с тяжелой клинической стадией позволяет использовать этот тест как маркер неблагоприятного прогноза.
Для оценки метилирования промоторных районов генов разработана новая модификация метода МЧРА; основанная на применении набора соответствующих метил-чувствительных рестриктаз. Показано, что в такой модификации чувствительность и достоверность результатов МЧРА существенно возрастают и становятся выше чем при использовании метода МСП. В случае некоторых генов МЧРА с применением набора рестриктаз позволяет детально исследовать метилирование СрО-островка, как и с помощью бисульфитного секвенирования.
Показано, что метилирование генов RAR-beta2, RASSF1A и SEMA3B можно обнаружить уже на ранней стадии опухолевого процесса. В связи с этим данные маркеры целесообразно использовать для ранней диагностики рака. С другой стороны, прямая достоверная корреляция между уровнем метилирования генов RASSF1A и SEMA3B и клинико-морфологическими показателями опухолей позволяет применять эти факторы в качестве молекулярных маркеров неблагоприятного прогноза онкозаболевания.
Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП "ГосНИИ генетика" от 13 января 2004г. Результаты настоящей работы многократно докладывались на конференциях отечественной программы «Геном человека», на VII Российском Онкологическом Конгрессе (Москва, 2003), на конгрессах международной организации по изучению генома человека HUGO (Ванкувер, 2000; Эдинбург, 2001; Шанхай, 2002), на 28-м конгрессе FEBS (Стамбул, 2002) и на конгрессах Американской ассоциации исследований рака, AACR (Бостон, 2002; Торонто, 2003).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей, а также тезисы докладов и сообщений на отечественных и международных конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 170 страницах машинописного текста и содержат 15 таблиц и 42 рисунка.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Выборка образцов и методы исследований.
Для анализа аллельных изменений на коротком плече хромосомы 3 была использована панель из 24 полиморфных микросателлитных маркеров. Панель включала 10 три-и тетрамерных маркеров, выбранных из базы данных CHLC (Cooperative Human Linkage Center), 13 динуклеотндных маркеров, выбранных из базы данных GDB (Genome Data Base) и дннуклеотидный маркер D3S4285/NL1-024, идентифицированный нами ранее (Брага и др., 1997) Для картирования гомозиготных делеций в районах АР20 и LUCA были использованы дополнительные полиморфные и неполиморфные маркеры (суммарно более 30 маркеров). Для исследования уровня метилирования промоторных районов генов-кандидатов RAR-beta2, RASSF1A и SEMA3B была использована комбинация методов: 1) ПЦР-анализ образцов геномной ДНК, последовательно расщепленной с помощью набора метилчувствительных рестриктаз; 2) модификация геномной ДНК бисульфитом с последующей ПЦР, специфичной к метилированному аллелю гена, или секвенированием ПЦР-продукта исследуемого фрагмента гена.
Исследования были проведены с использованием 347 пар образцов ДНК, выделенных из опухолевых (Т) и морфологически нормальных (N) прилежащих тканей. Выборка включала 112 случаев рака почки (RCC), 47 случаев рака легкого (NSCLC), 99 случаев рака молочной железы (ВС) и 50 случаев рака яичников (ОЕТ). 39 образцов ДНК рака шейки матки (СС) были любезно предоставлены профессором ФЛ. Киселевым (НИИ Канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН). Все исследованные нами опухоли были классифицированы клинически по системе TNM принятой UICC — Международным противораковым союзом, 1998 г., и гистологически в соответствии с ВОЗ в лаборатории он-когеветики и в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ РАМН. При отборе материала проводили дополнительный гистопатологический анализ микросрезов, что обеспечило высокое (не менее 70%) содержание опухолевых клеток в исследуемом образце. Были использованы образцы опухолей только тех пациентов, которые до операции не получали химио- или лучевую терапию.
2. Результаты.
На рис. 1 показаны характерные картины аллельных изменений в ДНК из опухоли по сравнению с ДНК из соответствующей нормальной ткани одного и того же пациента. В случае потери гетерозиготности
371 372 375 376 наблюдают исчезновение одного из
Т М'Т N Т N М Т N „ ,-„ч п
аллелей (ВС 371 и 372). В раде случаев,
" '_ __однако, наблюдали неполную потерю
гетерозиготности, обусловленную, по-видимому, присутствием некоторого количества нормальных клеток в опухолевом образце. Потерю гетерозиготности
«
Рве. 1. Аллельные изменения в образцах ДНК ВС при амплификации полиморфного локуса 0382409.
Т - продукт амплификации ДНК ю опухолевой учитывали при уменьшении интенсив-псаии; N - продукт амплификации ДНК из нор- ности одного из аллелей на 50%. мальноВ ткани; М—маркер р11С 19!Шр\
2€.Э М.1
213
25.1 2«
241
23 223 22.1 21JJ
21.31
21.2 21.1
1<2 U1 11
Зр
0/D3S24OS HO-D3S1317 I^DJSX03S D3S12Sd
I л»$юз
[//D3S3047 v/ "$-»2S5
m
ы
" иябв^пзз?nnopiOTir"'" ~~~ "
" 'сшщюше
A03S1298 0-D3S3J2T ЛрЗЗТИ //0351161 T/D3SJ420 /.D3S2409 7ЛЯ$245« —D3S3667 v~D3S4«U N>353615 —D3S1766 ■C-D3SX300 N»$1411 D3S128S D3$2454
¡[BSDSDEiiDEnnmiinromjmmiiionciniDOiicMDjsii
_______SEDSSDDODSII
лжмшвшгаь
I^DlSSQDSSDQDagilll
-Щ
_________________________________________________Kn ISIISQ
■Евнтвдпшшшш^
ШВилЗШЛОКШНЭКаВОД
1ХЮКЯ ¡шпаг Gbcki nit in
fiDQSC: ЙП11Е.
m
flOHKillllll'
_____icDsassDirmr
1ШШЖ111001Я
___________________________„_________liEHiOUillsSltill
E^i mis iaasnnnacsj^tn .□nr^iTiaiDaLii'^.riiii;:,
^■пяшввпппппяпсввймаппаааппнапаПапГУгиапнвяааукйГаЯЯйМЧПгппт^АГЯППт ЯГМЧ* Fl
ПЕНКИОИНКШП
"IHSOIlSESlSOBii' SSinDUESOGGET "
Бхтанюдоишкиз!-. вшннлпг
OEf. IEH0B2I
]ESBD0DL ХШ9С
BH_.
ioqil JISQBD
man
ID, 91 I
[заопщтгзЕквпипггаЕдс кащШ^шЩ Dcfla __лвяошпюЕадошзПакп
Ш11£1КС1!11В»К1ГН|{П1ПВ___________________
BniailSSSDGMllIilBXIIEE&SBIIIEIipiBIBfl
ЗВДЕШЗОШШВаЗШШВтаеаШЕОКВИШЭ
MgBDiQBOBirasQ^^misDDoraassi^Brii'OicaiEi!
skiibiezel
----------й
lasDiansL ппвшпцг
УМ!!!
'ЕШеея
jpeipaq
ХПЕЕШКВЯ!. iEOTSOQEMBO!
i^mz^ini'jzm&isnwrm
IKIUKHIIDri ЩВДШЩПй
------ззнжвга
sqsiibsi
^¿книш i^iJBXiaoDs
-D3S2406
if mrЭГТТГ1ППГ1ВР1 TPmnsnpRFirmnnmsT рппгпттпплтгпг 1
пшшвшшшжшзмааа
Рис. 2. Аллельные изменсиия в 23 полиморфных локусах хромосомы Зр в опухолях молочной железы (95 случаев). Ц- потеря гстерозиготности;Ц - потеря гетерозиготности с амплификацией второго аллеля; [] - сохранение гетерозиготпости;
сохранение гетерозиготности с амплификацией одного из аллелей; 3 - пеинформативный случай; 0- микросателлитная нестабильность; || - нет данных; D - инфильтративный протоковый рак; L - инфильтративныи дольковый рак; М - медуллярный рак; Mix - смешанный рак.
Продукты амплификации ВС 376 указывают на неинформативный случай, а образец ВС 375 представляет пример сохранения гетерозиготности. Микросателлитную нестабильность (MIN) выявляли с использованием того же подхода. В отличие от картины, наблюдаемой при LOH и связанной с утратой одного из аллелей, в случае MIN изменяются размеры одного или обоих аллелей.
2.1. Анализ аллельных изменений на 3D в образца! ДНК выделенных из эпителиальных опухолей пятя локализаций.
Для анализа аллельных делеций на Зр в ДНК из эпителиальных опухолей разных локализаций была использована идентичная и плотная панель микросателлитных полиморфных маркеров. На рисунке 2 в качестве примера показаны аллельные изменения в 23 локусах при ВС (95 случаев). Аналогичное исследование было проведено для ДНК из опухолей четырех других локализаций (RCC, NSCLC, ОЕТ и СС, данные в автореферате не показаны).
Анализ полученных данных показал, что наиболее часто Зр повреждается при RCC, в 93% случаев; несколько реже в опухолях четырех других локализаций (79%-88% случаев, табл. 1). В результате картирования были выявлены аллельные делении разных типов: концевые, короткие внутренние и прерывистые или множественные. Наибольшее число концевых делеций наблюдали при раке легкого и почки 29%-34%, что, по-видимому, связано с ранней предраковой стадией возникновения подобных повреждений на Зр в этих двух видах рака и ростом аллельных делеций в процессе развития опухолей (Kok et al., 1997). Делеций всего Зр свидетельствуют о значительных хромосомных изменениях. Внутренние аллельные делеций, окруженные участками сохранения гетерозиготности, связывают с инактивацией потенциальных генов-супрессоров. Единичные внутренние делеций были выявлены 5%-21% случаев. Однако множественные делеций, которые соответствуют одной или нескольким внутренним, были обнаружены во всех видах эпителиальных опухолей с высокой частотой (30%-77% случаев). Эти типичные картины типа ."зебры" послужили указанием на существование множества генов, связанных с развитием рака и локализованных в разных районах Зр-плеча.
Таблица 1.
Типы аллельных делеций на коротком плече хромосомы 3 в опухолях пяти видов.
Рак почки Рак легкого - Рак молочной железы Рак яачвиков Рак тейкн маткн <
Делении всех типов 74/80 93% 37/47 79% 84/95, 88% 42/50 84% 31/39, 79%
Концевые 23/80 29% 16/47, 34% 3/95, 3% 1/50 2% 1/39, 3%
Внутренние короткие 4/80 5% 7/47, 15% 8/95, 8% 3/50 6% 8/39 21%
Множественные 47/80 59% 14/47, 30% 73/95, 77% 38/50 76% 22/39, 56%
2.2. Районы наиболее частых аллельных делений.
Для определения районов, содержащих гены-супрессоры опухолевого роста (TSG) проведен расчет частоты LOH для каждого использованного нами маркера (табл. 2). Как видно из этой таблицы, средние значения частоты LOH при раке почки составили 67% (703/1052), при раке легкого - 49% (314/643), молочной железы и яичников - 43% (558/1290 и 280/657 соответственно) и шейки матки - 28% (166/594). Максимумы потерь гетерозиготности в образцах ДНК из опухолей разных локализаций были определены в 6 районах: 3р25.3 (в RCC, NSCLC и СС), 3р23-р22.3 и Зр22.1-21.33 (во всех 5 типах рака), 3р21.31, D3S2409, D3S2456 и D3S3667 (во всех 5 типах рака), 3р21.31, D3S4614 (в NSCLC, ВС и СС) и Зр21.1 (в RCC, NSCLC, ОЕТ и СС). Максимумы в области Зр21.1 относятся к маркерам гена FHTT (D3S13OO,H D3S1481) и TU3A/DRR1 (D3S1766); однако они существенно ниже, чем в области 3р21.3 и двух дистальных районах Зр. Эти данные подтверждают роль генов из области 3р21.3, в составе которой выделено три критичных субрайона, и каждый из них связан с эпителиальными опухолями пяти исследованных типов. Максимумы в области маркеров D3S2409, D3S2456 и D3S3667 (3р21.31) на профиле LOH ВС установлены с достоверной вероятностью (Р~0.02-0.04 при выборке образцов 95 случаев, табл. 2). Следует подчеркнуть, что район D3S2409-D3S3667 выявлен в данной работе впервые. Он покрывает 600 т.п.н. и содержит более 20 генов, в число которых входят известные гены с важной функцией в клетке и потенциально связанные с канцерогенезом (согласно данным литературы, компьютерного анализа и нашим предварительным исследованиям). Кластеры генов, потенциально участвующих в развитии опухолей, ранее были обнаружены в районе LUCA (3p21.31, D3S4614) (Lerman et al., 2000). Локализованный нами новый критичный район прилежит к району LUCA теломерно и отделен от него участком в 200-300 т.пл. Такие данные свидетельствуют в пользу гипотезы о существовании на Зр множества генов-супрессоров опухолевого роста. Пререквизитом этих результатов было наблюдение нами и другими авторами множественных делеций, которые были обнаружены на Зр с высокой частотой в опухолях разпой локализации (Braga et al., 1999, 2002; Wistuba et al., 2000, 2001). В представленной работе высокая частота множественных делеций с показана для пяти видов рака.
Чтобы нагляднее оценить значение отдельных районов Зр, микросателлитные маркеры Зр (табл. 2) были сгруппированы в зависимости от близости их положения на хромосоме и уровня частоты LOH; так что, короткое плечо хромосомы 3 было разбито на 9 районов. Используя программу S-PLUS, были построены диаграммы уровней (Levels Plot), отражающие распределение частоты LOH для исследуемых районов (рис. 3).
Как видно из рисунка 3, пять районов действительно характеризуются наиболее высокой частотой аллельных делеций. Два из них относятся к дистальпой области Зр-плеча (№№ 1 и 3) и три - к области Зр21.3 (№№ 4,6 и 7). Для районов № 3,4, 6 и 7 высокая частота LOH была определепа в пяти исследованных видах рака. Пик в районе № 6 в опухолях ВС был установлен с высокой достоверностью (Рл0,0008).
Таблица 2.
Частота аллельных делеций в пяти видах рака.
Маркер Локализация' Рак почка Рдк легкого Рак молочной железы Рак яачнвков Рак шейки матки
0382405 3р25.3 37/48,77% 19/34, 56% 31/72,43% 10/27,37% 7/26,27%
0381317 3р25.3 35/49,71% 19/33,58% 22/63,35% 8/21,38% 8/26,31%
ЮБЮЗв 3р25.3 35/50,70% 13/30,43% 15/44,34% 8/21,38% 10/32,31%
0351286 Зр25.1 30/55,55% 23/42,55% 26/71,37% 14/42,33% 7/28,25%
швпвз 3р23 34/49,69% 19/37,51% 29/60,48% 13/27,48% 8/25,32%
0353047 3р22.3 33/44,75% 18/33,55% 32/60, 53% 17/36,47% 6/21,29%
0354285 Зр22.1 22/27,81%, 9/18,50% 19/41,46% 10/18,55% 4/11,36%
03в1298 3р21.33 32/48,67% 17/31,55% 29/58,50% 11/26,42% 8/26,31%
0353527 3р21.33 43/59,73% 14/33,42% 24/71,34% 15/37,41% 7/30,23%
Р33715 3р21.31 20/33,61% 9/25,36% 26/52,50% 12/24,50% 6/22,27%
0351767 3р21.31 33/49,67% 14/27,52% 25/52,48% 9/21,43% 7/27,26%
0352420 3р21.31 35/45,78% 16/35,46% 27/68,40% 18/37,49% 9/30,30%
0352409 Зр21.31 29/42,69% 19/32,59% 39/69,57% Р- 0,0206 18/37,49% 9/27,33%
0352456 3р21.31 35/45, 78% 12/28,43% 33/59,56% Р - 0,0373 17/37,46% 6/26,23%
0353667 3р21.31 30/45,67% nd. 34/59, 58% Р - 0,0199 11/22,50% 9/32,28%
0354614 3р21.31 41/60,68% 17/34,50% 36/75,48%, 17/41,41% 11/34.32%
0353615 Зр21.31 30/48,63% n.d. 15/37,41% 8/21,38% 11/30,37%
0351578 Зр21.2-р21.1 n.d. n.d. nd. 14/34,41%, пА
0351766 Зр21.1 31/49,63% 15/32,47% 20/54,37% 12/25,48% 3/27,11%
0351300 Зр21.1 24/33,73% 7/18,39% 6/20,30% n.d. 6/19,32%
0351481 Зр21.1 29/55,53% 21/42, 50% 22/68,32% 14/38,37% 5/33,15%
0351285 Зр14 2 13/24,54% 10/25,40% 4/15,27% nd. 8/20,40%
0352454 Зр14.1 17/35,49% 11/21,52% 19/48,40% 11/28,39% 3/12,25%
0352406 3р13 33/60,55% 12/33,36% 25/75,33% 13/37.35% 8/30,27%
Среди«« значение Зр 703/1052, 67% 314/643, 49% 558/1290, 43% 280/657, 43% 166/594, 28%
• Приведены цитогенетические локализации от теломерного кош» Зр-плеча из базы данных КСВ1, версия 33 (Ьпр./Лу^'ж.псЫ.пЬп пА £ОУ/ср-Ып/ЕМге2/тар_5еагс)|).
Рис 3. Частота аллельных потерь и потенциальные гены-супрессоры и онкогены в районах короткого плеча хромосомы 3 человека. Средние значения частоты LOH для 9 районов Зр-плеча отображены на диаграмме уровней (Levels Plot) с помощью программы S-PLUS. При этом интенсивность заливки позволяет оцепить как распределение максимумов частоты LOH вдоль Зр-плеча в пределах одного вида рака (вертикаль), так и участие данного района в разных видах рака (горизонталь). Обозначения: RCC -светлоклеточный рак почки; Non-SCLC - немелкоклеточный рак легкого; ВС - рак мо-лочпой железы; ОЕТ - эпителиальный рак яичников; СС - рак шейки матки.
Кроме того, на рис. 3 наглядно видно падение частоты LOH в проксимальных районах Зр-плеча (№№ 8 и 9), в том числе в районе генов-кандидатов FHTT и DRR1/TU3A (№ 8). Район №1, вблизи гена VHL, по-видимому, специфичен по отношению к опухолям RCC, Non-SCLC и СС, тогда как частота LOH этого района в ВС и ОЕТ существенно ниже, чем в других районах Зр.
2.3. Корреляция частоты аллельных делений со степенью и стадией анаплазии опухолей.
Для образцов рака почки, легкого, молочной железы, яичников и шейки матки была исследована корреляция частоты делеций на Зр и гистопатологических параметров
опухоли, как с учетом всей панели маркеров в целом, так и для отдельных районов. Показана достоверная корреляция (Р <0.05) между частотой аллельных делеций в области Зр и прогрессией опухолей разных локализаций (рис. 4). Значимая прямая корреляция со стадией и степенью анаплазии опухолей была выявлена и при анализе этой зависимости для отдельных районов Зр. Показано что, район АР-20 связан с прогрессией опухолей трех разных локализаций: RCC, ВС и ОЕТ, а районы №3 и LUCA - с прогрессией RCC и ВС.
РИС 4. Зависимость частоты LOH в области Зр-плеча от стадии и степени анаплазии при раке почки (RCC), легкого (NSCLC), молочной железы (ВС), яичников (ОЕТ) и шейки матки (СС).
Важно отметить, что для некоторых видов рака выявлены опухоль-специфичные районы. Так, в районе №1 (ген УНЬ) только для RCC установлена достоверная корреляция частоты аллельных делеций со степенью анаплазии (Р-0.0093) и стадией (Р=0.0435), а в районах №5 и №8 (РНГГ) - со степенью анаплазии при №СЬС.
Таким образом, наши данные говорят о том, что гены из отдельных районов Зр могут участвовать в прогрессии опухолей разных локализаций.
2.4. Подтверждение данных по картированию аллельных изменений на Зр-плече в опухолях RCC. ВС и СС с помощью ГГЦР в режиме реального временя. Картирование гомозиготных делеций методом мультиплексной ПНР.
Данные по картированию аллельных изменений на Зр-плече в опухолях RCC, ВС и СС были сопоставлены с результатами анализа числа копий двух неполиморфных ло-кусов, определенных методом количественной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) совместно с лабораторией Е.Р. Забаровского (Каролинский Институт, Стокгольм). Методом ПЦР-РВ была исследована копийность двух 8Т8-маркеров: N0-003 (АР-20) и N0-001 (ЬиСА). На рис.5 показано сопоставление результатов по анализу аллельных изменений в опухолях шейки матки.
Зр 134 235 137 МЗ 148 250 115 23» 407 411 413 414 413 419 4М 434 43« 43» 430 451
Рис. 5. Сопоставление результатов LOH-анализа с данными ПЦР-РВ для локусов №1003 и №3-001 в образцах СС. Черным цветом отмечены потеря гетерозиготности и гомозиготные делеции, белым - сохранение гетерозиготности или нормальное число копий, жирным шрифтом на белом фоне отмечены амплификации, серым - неинформативные случаи; L и Н буквы обозначают потерю нижнего или верхнего аллелей; "а" -амплификация одного из аллелей
Для сравнения данных, полученных с помощью двух разных методических подходов (ШН-анализа и ПЦР-РВ), было определено количество случаев, в которых оба метода выявили отсутствие аллельных изменений шш аберрацию одного и того же типа, например, гемизиготную делецию, или амплификацию одного из аллелей. Конкордант-ность методов была показана с помощью ранговой корреляции Спирмана. Для района АР-20 (N1.1-003) достоверность корреляции составила: в СС Р=1,09x10 (^=0,861, 1=7,18), в ЯСС Р=0,00055 (&>=0,716, 1=4,23) и в ВС Р=2,бх1(Г* (&>=0,910, 1=9,32). Для района ШГСА (N13-001) в СС Р=3,54х1(Т (^=0,823, 1=10,61), в ЯСС Р=8,93х107 (^=0,875, 1=7,48) и в ВС Р=2,25хШ7 (^=0,884, 1=8,05). Таким образом, значения Р варьировали от 1(Т до 70**, что означает высокую статистическую достоверность.
Следует отметить, что методом ПЦР-РВ в районах ШТСА и АР20 (3р21.3) в ДНК эпителиальных опухолей была определена высокая частота аберраций (более 90% случаев), в том числе гомозиготных делеций (НО) - 10%-20% случаев. 15 НО, выявленных методом ПЦР-РВ в образцах ЯСС и ВС, были картированы с использованием мультиплексной ПЦР (рис. 6 и 7). В некоторых образцах, например, ЯСС 74 и ВС 317, НО были выявлены в обоих районах (АР-20 и ШСА). Потеря гетерозиготности маркера В381298
ограничивает минимальную область перекрывания HD в районе АР-20 проксимально, а маркер D3S3623 - дистально. В районе LUCA минимальный участок перекрывания HD ограничен LOH в локусе D3S4604 (дистально) и D3S4614 (проксимально). Области перекрывания HD в районах АР-20 и LUCA показаны на рис. 7.
АР20
ШСА
НСС74 ' Т N '
ВС 317
ИСС 74
ВС 317
N М
1ГЧТЯ1Н22
-я ,
0381298 Чрг
i ] г.--: " „V*
I доо
ЙетаБ 0384604
0353667
"Л Ьг*»» *
- > • * J т' _ - г
Рис. 6 Картина электрофоретаческого разделения продуктов мультиплексной ПЦР в 8% неденатурирующем ПААГ с последующим окрашиванием серебром. Т - продукт амплификации ДНК из опухолевой пани; N - продукт амплификации ДНК из нормальной ткани, М - маркер с шагом полос в 100 п я, ЯСС - светлоклеточный рак почки, ВС - рак молочной же-
Рис 7. Картирование гомозиготных делеций в районах АР-20 и LUCA для образцов рака почки (RCC) и молочной железы (ВС).
Сужение HD позволило ограничить число потенциальных генов-кандидатов, перспективных для дальнейшего анализа и идентификации ключевых генов, участвующих в развитии опухолей. В районе АР-20 к числу таких генов относятся: APRGJ, JTGA9, RBSP3/HYA22 и VJLL, ограниченные маркерами D3S3623 и D3S1298, а в районе ШСА - 17 генов (от SEMA3F/D3S4604 до CACNA2D2/D3S4614). С помощью мультиплексной ПЦР при анализе промоторных районов генов RASSF1A и SEMA3B (район LUCA, 3p21 31) и RAR-beta2 ^23^22.3) в образцах RCC, ВС и ОЕТ выявлено 28 случаев с HD. Интересно, что для случаев с HD, детектированных в этих генах, выявлена ассоциация с тяжелой клинической стадией опухолей (Р<0 05).
амия вмт Н1 !?Т" simäi
"7" ГГШНШ / MI
Ш-яГ
■290 -257 --BO-tTB
•07 -114 « -57 48 -38 -8 •« -Hl -га -53 46
>0:2.9 9
13.« В 17.18 вЛ 212Ш52$ЛЗ 31
Рис. 8. Физическая карта промоторного района гена RASSF1A. HpdO, Hha\, Лей и Bshl236l - метил-чувствительные рестрипазы, использованные в МЧРА. Праймеры для МСП (M/U-L и M/U-R), показаны белым цветом на сером фоне; праймеры для МЧРА (RAS-F и RAS-R) и праймеры для анализа гомозиготных дслеций (RAS-int-F н RAS-Int-R) показаны черным шрифтом.
m
т N
334
Т N
341
Т N
355
Т N
391' Т N
2.5. Анализ метилирования ппомоторного района гена ЯАЗЗЕТЛ методами МСП и МЧРА В опухолях почки, молочной железы и яичников.
Физическая карта промоторного района гена ЕЛЗЗЖ1Л (Зр21.31, LUCA) представлена на рис. 8, на котором показаны позиции 18 CpG-nap фрагмента 357 п.н. от ATG-кодона и праймеров, использованных в данной работе. Метилирование гена ЕЛЗЗЖ1Л исследовано в 63 случаях RCC, 59 ВС и 50 ОЕТ методами МСП (ПЦР, специфичной к метилированному аллелю) и МЧРА с применением 4-х метилчувствитель-ных рестриктаз. Примеры продуктов МСП показаны на рис. 9А. Из 6 представленных случаев RCC метилирование наблюдается во всех 6 образцах Т и только в одном образце N ^ГС 348).
На рис. 9Б приведены характерные примеры анализа метилирования гена ЕЛЗЗЖ1Л методом МЧРА с помощью рестриктазы Асй и последующей ПЦР. Во всех образцах не гидролизованной ДНК ясно виден исследуемый фрагмент гена (357 п.н.). В образце RCC 540 видно сохранение этого фрагмента в Т и в N и после воздействия рестриктазой Асп, что указывает на метилирование исследуемого участка, как в опухоли, так и в условно нормальной ткани. Напротив, в образце RCC 545 - амплификация фрагмента 357 п.н. не наблюдается ни в Т, ни в N. Образец RCC 516 является типичным случаем, когда после гидролиза продукт ПЦР виден только в Т, но не в N.
502
Т N М
Ii
516
54®
54$
I тм н да i тм я км i от к имен
I
445м. 'З57шь I:
, 29м.
Рис. 9. Применение методов МСП и МЧРА дм анализа метилирования промоторного района гена RASSF1A. Элепрофоретическое разделение в 2% агарозном геле: продуктов МСП (А) для образцов ДНК ЯСС (фрагмент 168 П.Н.); М - маркер с шагом полос в 10 п.н. и МЧРА (Б) для 3-х образцов RCC, до и после (+) гидролиза. Контроль на полноту рестрикции - фрагмент 445 п.н.; контроль сохранности ДНК - фрагмент 229 п.п.; исследуемый фрагмент гена RASSF1A - 357 п.н.. К(-) - отрицательный контроль; М - маркер с шагом полос в 100 п.н.; Т - продукт амплификации ДНК из опухолевой ткани; N - продукт амплификации ДНК из нормальной ткани.
Рве 10 Схематическое отображение данных по метилированию промоторного района гена RASSF1A, полученных для 53 образцов ЯСС методами МСП и МЧРА. HpaU, Hhal, Асй и Bshl236l- метил-чувствительные рестриктазы, использованные в МЧРА; цифрами указаны исследованные СрО-пары; ■- метилированная СрО-пара, О - неметилиро-ванная СрО-пара. Слева черные и белые прямоугольники отображают результат МСП и суммарный результат МЧРА для данного образца. Справа для образцов ДНК опухолей приведены основные клинические и гистологические характеристики исследованных случаев Если опухоли содержат метастазы в регионарные лимфатические узлы, данные помечены светло-серым цветом, и если наличие метастазов неизвестно - данные приведены белым шрифтом на темно-сером фоне.
Таблица 3.
Данные МСП и МЧРА по частоте п уровню метилирования промоториого района гена ЕЛ88ПЛ в образцах ДНК RCC, ВС и ОЕТ и гистологически нормальной
Внд рака МСП Частота метилирования * МЧРА
Частота метилирования * Уровевь метилирования **
Р 6,07x10* 3,9x1 а' 5,42х1<Г"
RCC Т 25/29, 86% 50/53,94% 644/954, 68%
N 3/29,10% 10/30,33% 98/540,18%
Р 6,39x1а1 0,0051 7,59x10'"
ВС Т 18/28, 64% 32/41, 78% 361/738, 49%
N №8.0% 6/17, 35% 43/306,14%
Р 2,16x10* 4,14x10* 7,58х1(Г"
ОЕТ Т 17/29, 59% 33/45, 73% 346/810, 43%
N 1/29, 3% 2/19,11% 17/342, 5%
* Под частотой метилирования подразумевали делю образцов, в которых этот ген метилирован. **Под уровнем метилирования подразумевали произведение частоты метилирования на плотность; плотность соответствовала доле метилированных CpG-nap из 18 исследованных в каждом случае. При расчете уровня метилирования за 100% принимали произведение 18 CpG-nap на число случаев в соответствующей выборке.
Согласно данным МСП, метилирование промоторного района гена RASSF1A наблюдали с частотой 86% в RCC, 64% в ВС и 59% в ОЕТ, а в условно нормальной ткани эта величина составила 0%-10%.
Согласно данным МЧРА, частота метилирования промоторного района гена RASSF1A в опухолях варьирует от 94% в образцах RCC до 73% в ОЕТ. В соответствующих образцах гистологически нормальной ткани, прилежащей к опухоли, эта величина также достаточно велика, составляя 11%-35%. Можно отметить, что в ДНК из опухолей метилирование этого локуса наблюдали достоверно чаще, чем в ДНК соответствующей условно нормальной ткани, как по данным МСП, так и по данным МЧРА (Р<0.05).
Метод МСП позволяет тестировать только 6 CpG-nap (42, *13, *14, *25, *26 и *27), входящих в состав праймеров (M/U-L, M/U-R) (рис. 8). В то же время промотор-ный район гена RASSF1A содержит 20 участков узнавания метилчувствительных рест-риктаз Hpall, Hhal, Bshl236l и Acil, из которых 18 участков не перекрываются (рис. 8). С помощью МЧРА удалось охарактеризовать статус метилирования 18 CpG-nap этого локуса (рис. 10). В результате удалось более точно оценить уровень метилирования данного гена1 (табл. 3). Согласно МЧРА, уровень метилирования CpG-островка колеблется от 68% в RCC до 49% в ВС и 43% в ОЕТ (табл. 3). В гистологически нормальной,
1 Уровень метилирования здесь и далее представляет произведение частоты встречаемости случаев с метилированием на плотность метилирования (долю метилированных CpG-nap в каждом случае).
прилежащей к опухоли ткани эти величины достоверно ниже, составляя 18%, 14% и 5% для ЯСС, ВС и ОЕТ соответственно.
Методом МЧРА исследовано также метилирование 18 СрО-пар гена RASSF1A в ДНК из крови 15 здоровых доноров (использованы тс же четыре метилчувствителъные рестриктазы: Нрап, Hhal, Bskl236l иАаТ). В этих опытах ни одного случая метилирования выявлено не было.
2.6. Анализ метилирования промоторных районов генов SEMA3B и RAR-beta2 методами бисульфитного секвенирования и МЧРА в опухолях почки и яичников.
Взаимпое положение участков узнавания ряда метилчувствительных рестриктаз в промоторных районах генов SEMA3B (3р21.31, ЬиСА) и RAR-beta2 (3р23-р22.3) представлено на рис. 11 а и рис. 11 б. На рис. 11 показаны все СрО-пары анализируемых фрагментов и указаны праймеры, использованные в данной работе. При анализе гена SEMA3B использованы рестриктазы А ей и НраЛ, а RAR-beta2-НраМ, Bshl236l, Acilи Тай. Исследованы 53 случая ЯСС и 50 случаев ОЕТ.
Рис 11. Физические карты промоторных районов генов 8ЕМА3Б (А) и ИЛЯ-ЬеТа2 (Б). Праймеры, использованные для бисульфитного секвенирования (SemV-F/R и Raг-m-F/R), показаны белым цветом иа сером фойе; праймеры для МЧРА (SEMA3B-F/R и RAR-F/R) и праймеры для анализа гомозиготных делений (SEMA3B-int-F/R и RAR-int-F/R) показаны черным шрифтом; (-•) - прямой праймер; (•-) - обратный праймер.
Методом МЧРА (рис. 11) в промоторных районах генов SEMA3B и RAR-beta2 исследовано 5 и 8 СрО-пар соответственно. Согласно данным М.ЧРА, частота метилирования гена SEMA3B в ЯСС и ОЕТ близка и составляет 61% и 44%. В то же время частота метилирования гепа RAR-beta2 сильно отличается в опухолях почки и яичников, составляя 90% и 27% соответственно, а в гистологически нормальной ткани, прилежащей к опухоли - 0%-29% (табл. 4).
Таблица 4.
Частота и уровень метилирования промоторных районов генов SEMA3B и RAR-beta2 в образцах ДНК КСС и ОЕТ и гистологически нормальной ткани (МЧРЛ).
Вид рака SEMA3B RAR-beta2
Частота метилирования* Уровень метилирования** Частота метилирования* Уровень метилирования**
Р 0,0012 1,09x1СГ" 1,7x10" 6,5x1V"
RCC Т 30/49. 61% 110/245, 45% 47/52, 90% 166/416, 40%
N 7/30,23% 16/150,11% 5/30.17% 9/240, 4%
Р 0,0015 1,6x10* 0,1948 0,0014
ОЕТ Т 19/43, 44% ■ 52/215,24% 12/44, 27% 39/352,11%
N 0/19, 0% 0/95,0% 2/19, 11% 4/152,3%
* См. под табл. 3 ** См под табл. 3
» « 7 • » ID
А. ОДА С О С CA PCO АТСС OA CS С А О О ОН» О tcr О О OCÄCC ОТО ОС О СГ
м «« то «о «а
Рис 12. Примеры бисульфитного секвенирования короткого фрагмента гена RAR-beta2. CpG-пары подчеркнуты и пронумерованы в соответствии с рис 11 б. (А) Исходный фрагмент до обработки бисульфитом (RCC 347). (Б) Модифицированный неметилированныя фрагмент (ОЕТ 364): все остатки цитозинов дезаменированы и превращены в тимин. (В) Модифицированный метилированный фрагмент (RCC 347): цитозин в CpG-napax остался не измененным, остальные конвертированы в тимин.
Данные, полученные методом МЧРА, были подтверждены с помощью бисульфитного секвенирования (рис. 12). Соответствие результатов бисульфитного секвенирования и МЧРА оценивали с использованием ранговой корреляции Спирмаяа. Так, результаты обоих методов для гена SEMA3B совпали в 43 из 47 CpG-nap (16 с метилированием и 27 без метилирования) для образцов RCC и в 57 из 70 CpG-nap (12 с метилированием и 45 без метилирования) для образцов ОЕТ. Корреляция результатов, полученных двумя независимыми методами, высоко достоверна: для образцов RCC Л У = 0 8 8 3 1, t=12.629, v=45, Р=2.14хШ16, а для образцов ОЕТ fo=0.7599, t=9.641, v=68, P=2.37xl0r".
Для гена RЛR-beta2 данные бисульфитного секвенирования и МЧРА совпали в 32 из 36 CpG-nap образцов RCC (19 с метилированием и 13 без метилирования, А$=0.9537, 1=18.511, у=34, Р=2.49хКТ'*) и в 46 из 48 СрО-пар образцов ОЕТ (12 с метилированием и 34 без метилирования, А$=0.94,1=18699, у=46, Р=3.96хШгз). Таким образом, нами показана высокая положительная корреляция результатов, полученных МЧРА и би-сульфитным секвенированием. В качестве контроля методом МЧРА было исследовано метилирование CpG-островков в ДНК из крови 15 здоровых доноров. В этих опытах ни одного случая метилирования выявлено не было.
2.7. Корреляция уровня метилирования промоториых районов генов КЛЗЗГ1Л. 8ЕЫЛ3В и RЛR-beta2 со степенью анаплазии и с клинической стадией в опухолях различных локализаций.
В случае гена RЛR-beta2 не выявлена корреляция частоты или уровня (с учетом 8 CpG-nap) метилирования его промоторного района с прогрессией опухолей (стадией, степенью анаплазии и метастазированием) ни при RCC, ни при ОЕТ. В случае генов 8ЕЫЛ3В и RЛSSГ1Л выявлена положительная корреляция частоты и уровня (с учетом 5 и 18 CpG-nap соответственно) метилирования с прогрессией опухолей. В случае SEMЛ3B значимая положительная корреляция выявлена со стадией и степенью анаплазии в образцах RCC (Р=0.000] и Р=00287) и ОЕТ {Р~0.0069и Р=0.074) (рис. 13).
Для гена RASSF1A была установлена достоверная прямая корреляция уровня метилирования со степенью анаплазии и со стадией при ОЕТ {Р=5.09x1 Cf и Р=0.0464).
Следует отметить, что метилирование промоторных районов трех исследованных генов обнаружено и в морфологически нормальной ткани, прилежащей к опухоли, и в доброкачественных опухолях, например, ОЕТ. Таким образом, процесс метилирования этих генов, с одной стороны, связан с начальным этапом развития опухоли, а с другой стороны, метилирование генов RASSF1A и SEMA3B вносит вклад в прогрессию опухолей некоторых локализаций.
3. Обсуждение результатов.
3.1. Сравнение аллельных изменений на коротком плече хромосомы 3 в опухолях разных локализаций.
Выявленные в настоящее время Зр-делеции можно отнести к трем типам: а) концевые, затрагивающие значительную часть или все Зр-плечо, б) короткие внутренние, в которых один небольшой район аллельных потерь окружен участками сохранения гете-розиготности и в) множественные, где участки потери гетерозиготности в одних локу-сах перемежаются с участками сохранения гетерозиготности в других локусах. При этом для каждого типа рака характерно преобладание определенных типов делеций. Эти данные позволяют разделить пять типов рака по характеру и уровню аллельных потерь на коротком плече хромосомы 3 на две группы: а) с протяженными делениями и высокой частотой LOH (RCC и NSCLC) и б) с короткими делециями и средней частотой LOH (ВС, ОЕТ и СС), что согласуется с данными литературы (Kok et al., 1997; Martinez et al., 2000; Wistuba et al., 2000). Короткие внутренние делеций связывают с инактивацией TSG. Обнаружение множественных прерывистых делеций послужили основанием для идентификации множества (более 20) генов на Зр-плече, потенциально связанных с развитием опухолей (Zabarovsky et al., 2002; Брага и др., 2003). Кроме того, выявление более протяженных концевых делеций вплоть до полной потери всего Зр-плеча, свойственные опухолям почки и легкого, можно объяснить ранним возникновением Зр-делеций при развитии этих видов неоплазии. Действительно, короткие внутренние де-леций наблюдают при RCC и NSCLC уже в предраковом состоянии: в разнообразных гиперплазиях, дисплазиях и карциномах In situ (Kok et al., 1997).
Нами установлены максимумы LOH в образцах ДНК из опухолевых биопсий RCC, NSCLC и СС в следующих районах Зр: 3р253, 3р23-р22.3, Зр22.1, Зр21 Л и Зр21.1-р14.2, что согласуется с данными литературы (Kok et al., 1997; Alimov et al., 2000; Martinez et aL, 2000; Girard et aL, 2000; Базов и др., 2001; Braga et al., 2002)
В то же время делеций Зр-плеча при ВС и ОЕТ затрагивают в основном центральную область Зр-плеча (Зр21.3), что указывает на ее важную роль, в развитии рака данных типов локализации. Сходные результаты были получены и в ряде других работ (Matsumoto et al., 1997; Folwood et al., 1999; Maitra et al., 2001).
Проведенный нами сравнительный анализ делеций на коротком плече хромосомы 3 в пяти видах эпителиального рака с использованием идентичной и плотной панели
маркеров подтвердил существование внутренних и множественных делеций в разных видах эпителиального рака и позволил определить новые критичные районы.
3.2. Критичные районы и новые гены-кандидаты па Зр-плече.
В результате проведенного исследования было локализовано два новых критичных района: D3S4285-D3S1298,3p22.1-p2U3 и D3S2409-D3S3667, 3р21.31 (рис. 3, №№ 4 и 6). Ранее значимость района Зр21 в отношении частоты аллельпых делеций обсуждалась, главным образом, для опухолей почки (Van den Berg et ah, 1996, 1997; Martinez et al., 2000). Данные о значимости области АР20, 3р21.33-р22, были получены ранее, но только для рака почки, легкого и молочной железы (Kashuba et al., 1995; Ishikawa et al., 1997; Alimov et al., 2000; Maitra et al., 2001). В данной работе значимость этих районов продемонстрировала для эпителиального рака пяти локализаций.
Интересно отметить, что выявленный нами в области 3р21.31 новый критичный район №6 расположен рядом с районом гомозиготных делеций LUCA, №7 (рис. 3) (Lerman and Minna, 2000).
В составе районов LUCA и АР20 идентифицированы кластеры кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста (рис. 3). Например, в районе LUCA локализовано до 20 генов, потенциально связанных с развитием разных эпителиальных опухолей (Lerman and Minna, 2000). Для ряда генов обнаружено изменение уровня их экспрессии и метилирования в ряде опухолей. Кроме того, получены подтверждения их функциональной активности (Zabarovsky et al, 2002; Брага и др., 2003; Imreh et al., 2003; Damman et al., 2003). К таким генам относят новые гены-супрессоры RASSF1A, RASSF1C, SEMA3B, SEMA3F(LUCA) и RBSP31HYA22 (АР-20). Белковый продукт гена RASSF1A участвует в регуляции клеточного цикла и, возможно, в инициации апоптоза, а продукт гена SEMA3B, по-видимому, подавляет ангиогенез. Ген RBSP3IHYA22 кодирует фосфатазу, которая участвует в обратимом дефосфорилировагага С-концевого домена крупной субъединицы РНК-полимеразы П (Yeo et al., 2003; Kashuba et al., 2004). Этот процесс связан с регуляцией транскрипции и процессинга пре-мРНК в эукариотах. Кроме того, показано, что продукт гена RBSP3/HYA22 дефосфорилирует белок ppRBl (Kashuba et al., 2004).
В составе нового критичного района D3S2409-D3S3667 (Зр21.31, 600 тл.н.), согласно данным компьютерных программ (http://www.genomatix.de /cgi-bin) и базы данных NCBI (httpV/www.ncbi.nlm nih gov/mapview/maps). содержится кластер генов, из которых с помощью SAGE-анализа (Килосанидзе, неопубликованные данные) был отобран ряд генов с дифференциальной экспрессией в опухолях. По данным литературы, гены этого района MST1, RON, DAG1, USP4, ARHA и GPXJ, по-видимому, принимают участие в канцерогенезе. Согласно компьютерному анализу, 5'-области этих генов содержат участки потенциального связывания важных транскрипционных факторов.
Белковый продукт гена MSTJ (macrophage stimulating protein) гомологичен фактору роста гепатоцитов, обладает тирозин-киназной активностью, и, по-видимому, участвует в апоптозе (Lee et al., 2001). Продукт гена MSTR1, получивший также название RON, служит рецептором для MST1. Ген RON обладает свойствами протоонкогена: точковые
мутации и повышенная экспрессия этого гена вызывают клеточную трансформацию, способствуют образованию опухолей и метастазов (Peace et al., 2001).
Ген DAG1 (dystrophin-associated glycoprotein 1) кодирует белок адгезии, который осуществляет связь между цитоскелетом и внеклеточным матриксом. Этот белок состоит из двух субъединиц - внеклеточной и траыемембраиной. Потеря экспрессии этого гена показана при исследовании клеточных линий и первичных опухолей молочной железы и кишечника (Sgambato et al., 2003). В нашей лаборатории совместно с ГУ РОЩ и ИОГен РАН были получены предварительные данные о дифференциальной экспрессии этого гена в первичных опухолях почки, молочной железы и яичников методом РТ-ПЦР.
Ген USP4 кодирует убиквитин-специфическую протеазу 4-го типа (Unp), которая взаимодействуя с убиквитином (76 а.о.) участвует в протеолитической деградации коротко-живущих регуляторных белков и компонентов сигнальных путей клетки, например р53 или pRb (DeSalle et al., 2001). По литературным данным, существует 4 цито-плазматические изоформы USP4, причем их экспрессия снижена в клеточных линиях SCLC. Методом ПЦР-РВ получены предварительные данные о дифференциальной экспрессии этого гена в клеточных линиях и первичных опухолях разных локализаций (Малюкова, неопубликованные данные).
Продукт гена ARHA (ras homolog gene family, member А) относят к классу малых гуанозин трифосфатаз (GTP). Он участвует в передаче сигнала внутри клетки и контроле клеточной подвижности, в связи с чем возможно участие этого гена в образовании метастазов и прогрессии опухолей (Collison et al., 2002).
Продукт гена GPX1 (glutathione peroxidase 1) представляет собой антиоксидантный фермент, локализованный в митохондриях. Показано участие гена GPX1 в развитии рака легкого и молочной железы (Ни et al., 2003; Korotkina et al., 2002). В нашей лаборатории получены предварительные данные о деметилировании промоторного района этого гена в опухолях почки.
33. Предпосылки для разработки новых диагностически! и прогностических маркеров.
Следует отметить, что ряд генов-супрессоров и онкогенов, идентифицированных в области Зр, могут быть использованы для создания новых диагностических и прогностических маркеров эпителиальных опухолей. Для этого имеются следующие предпосылки. Во-первых, делеции в области Зр обнаруживают на начальных стадиях канцерогенеза (Kok et al., 1997; Naylor et al., 1997), и, следовательно, определенные гены или непосредственно полиморфные маркеры из "горячих" точек Зр можно использовать для ранней молекулярной диагностики возникновения опухолей. С другой стороны, нами установлена достоверная корреляция (Р<0.05) частоты аллельных делеций в области Зр со стадией и степенью анаплазии опухолей разных локализаций (при RCC, ВС и ОЕТ) (рис. 4). Анализ этой зависимости для отдельных районов Зр показал значимую корреляцию с прогрессией опухолей для района АР20 и других участков из области Зр21.3 (Р<0 05). Район АР20 связан с прогрессией опухолей трех разных локализаций (RCC,
ВС и ОЕТ). Таким образом, гены из этих субрайонов Зр могут участвовать пе только в ранних событиях патогенеза эпителиальных опухолей, но и в прогрессии злокачественных новообразований. Эти гены могут быть использованы для создания маркеров послеоперационного прогноза.
В инактивации генов, связанных с развитием опухолей, все более существенная роль отводится метилированию CpG-островков в промоторпых районах (Jain, 2003; Patel et al, 2003). Так, метилирование промоторного района гена RASSF1A коррелирует с уменьшением уровня его экспрессии в опухолях почки, молочной железы и легкого (Burbee et al., 2001; Dammann et al., 2000; 2001; Dreijerink et al., 2001; Pearlly et al., 2003). Литературные данные по частоте метилирования промоторного райопа гена RASSF1A в эпителиальных опухолях различных локализаций противоречивы и варьируют в широких пределах, например для рака почки - от 23% до 91%, для рака яичников - от 10% до 40% (Pfeifer et al., 2002; Dammann et al., 2003). Полученные нами результаты подтверждают высокую частоту метилирования гена RASSFJA в эпителиальных опухолях. При этом значения частоты метилирования RASSF1A в ВС и RCC весьма близки или совпадают с наибольшими из значений, определенных ранее: 64%-78% по сравнению с 62% для ВС и 86%-94% по сравнению с 91% для RCC (Dreijerink et al., 2001; Pfeifer et al., 2002). Однако, частота метилирования этого гена в ОЕТ, определенная в представленной диссертационной работе с помощью методов МСП и МЧРА, составила 59% и 73% соответственно, что в полтора раза выше ранее определенного максимального значения - 40% (Pfeifer et al., 2002). Представляет также интерес высокая частота (от 11% до 35%) метилирования CpG-островка промоторного района гена RASSF1A в образцах ДНК из условно нормальной ткани, прилежащей к соответствующим эпителиальным опухолям Было обнаружено метилирование промоторного района этого гена и в ряде доброкачественных и пограничных случаев ОЕТ. В литературе также появились сообщения о метилировании (с частотой до 40%) промоторных районов некоторых супрес-сорных генов в ДНК морфологически нормальной ткани, прилежащей к опухоли, в отличие от нормальной ткани здоровых допоров (Li et al., 2002; Kanaya et al., 2003) Эти наблюдения указывают па возможность молекулярных изменений в ДНК эпителиальных тканей пациента еще до появления в них морфологически выраженной патологии. Кроме того, нами отмечена корреляция уровня метилирования гена RASSF1A с клинической стадией и степенью анаплазии в ОЕТ, а в СС - с метастазированием в регионарные лимфоузлы (Малюкова, неопубликованные данные).
Эти наблюдения, с одной стороны, свидетельствуют в пользу предположения о том, что эпигенетическая модификация этого гена представляет собой одно из ранних событий в развитии эпителиальных опухолей разных локализаций. С другой стороны, можно предполагать, что данный ген участвует в прогрессии эпителиальных опухолей раз-пых локализаций. Другими авторами отмечено, что метилировапие гена RASSF1A коррелирует с повышением вероятности летального исхода (Tomizawa et al., 2002). Согласно нашим результатам и данным литературы, ген RASSF1A можно использовать, как для ранней диагностики опухолей, так и для послеоперационного прогноза.
Метилирование гена SEMA3B выявлено при RCC и ОЕТ почти в 1.5 раза реже, чем метилирование гена RASSF1A в тех же образцах ДНК. Изменение уровня экспрессии этого гена под воздействием метилирования показано для NSCLC (Kuroki et all, 2003). В свою очередь нами найдена достоверная положительная корреляция уровня метилирования с прогрессией RCC и ОЕТ, что можно использовать в прогностических целях.
Частота метилирования гена RAR-beta2 резко различается в опухолях разных локализаций, достигая 90% при почечноклеточном раке и только 27% в эпителиальных опухолях яичников (табл. 4). Снижение уровня экспрессии отмечено для клеточных линий, полученных из опухолей разных локализаций (Widschwendter et al., 2001; Virmani et al., 2000, 2001). Возможно, что высокая частота метилирования гена RAR-beta2 позволит объяснить тот факт, что опухоли ряда локализаций не чувствительны к терапии рети-ноевой кислотой (Sirhia et al., 2002). Важно отметить, что метилирование гена RAR-beta2 не зависит от стадии и степени анаплазии. Инактивацию этого гена можно отнести к ранним событиям в канцерогенезе. В связи со всем выше перечисленным этот ген можно использовать для диагностики соответствующих типов рака и прогнозирования их устойчивости к терапии ретиноевой кислотой.
Следует подчеркнуть особую важность анализа метилирования промоторных областей определенных генов в целях ранней диагностики и прогноза онкологических заболеваний. Так, метилирование генов р1б, RASSF1A и других было обнаружено в ДНК, выделенной из мокроты курящих, секрета молочных желез, а также да плазмы и сыворотки крови за несколько лет до выявления опухоли (Palmisano et aL, 2000; Evron et а1„2001).
выводы
1. С применением идентичной п плотной панели полиморфных микросателлитных маркеров проведен анализ делений короткого плеча хромосомы 3 в пяти видах эпителиальных опухолях. Локализовано пять критичпых районов с высокой частотой аллельных делений.
2. Критичный райоп D3S2409-D3S3667 (Зр21Л) протяженностью 0,6 млп.п.н идентифицирован нами впервые. В этом райоле локализовано до 10 новых кандидатов в онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста.
3. Анализ корреляции частоты потери гетерозиготпости со стадией и степенью анаплазии опухолей разных локализаций выявил вклад генов Зр и его отдельпых районов в прогрессию опухолей.
4 Гомозиготные делении (15 случаев), обнаруженные методом количественной ГЩР в режиме реального времени в критичных районах АР-20 и ЬиСА, картированы методом мультиплексной ПЦР, что позволило ограничить их протяженность и число содержащихся в них потенциальных гспов-супрессоров.
5. Разработапы эффективные методики анализа метилирования промоторных районов ряда генов-супрессоров опухолевого роста, осповапные на применении набора метилчувствительных рестриктаз и последующей ПЦР. Показано, что чувствительность МЧРА при таком подходе, существенно выше, чем МС1Ь Результаты подтверждены бисульфитным секвенировапием.
6. Полученные нами данные показывают высокую частоту метилирования гена ВА88¥1Л в эпителиальных опухолях разных локализаций. Предполагается, что эпигенетическая модификация этого гена представляет собой одпо из ранпих событий в развитии эпителиальных опухолей разных локализаций.
7. Впервые изучено метилирование промоторного района гена 8ЕМА3Б в опухолях почки и яичников. При этом впервые выявлена статистически значимая зависимость уровня метилироваппя гена 8ЕМЛ3Б от прогрессии эпителиальных опухолей, что можно использовать для создания диагностического и прогностического теста.
8. Впервые показано, что промоторпый райоп гена ЕАЖ-Ье1и2 с высокой частотой метилирован при почечпоклеточпом раке и значительно реже в опухолях яичпи-ков. Уровспь метилирования этого гена не зависит от прогрессии этих опухолей и, по-видимому, относится к ранним этапам онкогенеза.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. И.В. Базов, Т.П. Казубская, В.Д. Ермилова, Р.Ф. Гарькавцева, В.И. Логинов, Е.Р. Заба-ровский, ЭА. Брага. Картирование аллельных делеций на коротком плече хромосомы 3 человека в опухолях почки.// Молекулярная Биология. 2001, Т. 35, С. 404-412.
2. Е. Braga, V. Senchenko, I. Bazov, W. Loginov, V. Ermilova, T. Kazubskaya, R. Garkavtseva, N. Mazurenko, F. Kisseljov, JXiu, LKisselev, M. Lerman, G. Klein and E. Zabarovsky. Critical tumor-suppressor gene regions on chromosome 3p in major human epithelial malignancies: allelotyping and quantitative real time PCR. IIInt. J. Cancer. 2002, V. 100, P. 534-541.
3. Брага Э.А., Кашуба В.И., Малюкова А.В., Логинов В.И., Сенченко В.Н., Базов И.В., Киселев ЛЛ., Забаровский Е.Р. Новые гены-супрессоры опухолевого роста в горячих точках хромосомы 3 человека: новые методы идентификации. // Молекулярная биология. 2003. Т. 37, С. 1-18.
4. Брага Э. А., Логинов В.И., Малюкова А.В., Килосанидзе Г., Сенченко В.Н., Серегин Ю.А., Баркевич О.А., Кашуба В.И., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Киселев ЛЛ, Забаровский Ei\ Гены хромосомы 3 человека, ассоциированные с эпителиальными опухолями разных локализаций: диагностическое и прогностическое применение. // VII Российский Онкологический Конгресс. Сборник докладов 2003, С. 141144.
5. V. Senchenko, J. Liu, E. Braga, N. Mazurenko, W. Loginov, Y. Seryogin, I. Bazov, F. Kisseljov, V. Kashuba, M.I. Lerman, G. Klein and E. Zabarovsky. Deletion mapping of cervical carcinomas using quantitative real-time PCR identifies two frequently affected regions in 3p21.3. // Oncogene. 2003, V. 22, P. 2984-2992.
6. V. Senchenko, J. Liu, W. Loginov, L Bazov, D. Angeloni, Y. Seryogin, V Ermilova, T Kazubskaya, R Garkavtseva, V Zabarovska, V Kashuba, L.L. Kisselev, J.D. Minna, M.I. Lerman, G. Klein, E. Braga and E.R. Zabarovsky Discovery of frequent homozygous deletions in chromosome 3p21.3 LUCA and AP20 regions in renaL lung and breast carcinomas. // Oncogene. 2004, V. 23, P.
7. В.И. Логинов, A.B. Малюкова, Ю.А. Серегин, Д.С. Ходырев, Т.П. Казубская, В.Д. Ермилова, Р.Ф. Гарькавцева, ЛЛ. Киселев, Е.Р. Забаровский, ЭА. Брага. Уровень метилирования промоторной области гена RASSF^ в первичных эпителиальных опухолях. // Молекулярная Биология. 2004, Т. 38, С.
8. Е. Braga, I. Bazov, V. Senchenko, J. Liu, V. Loginov, E. Pugacheva, V. Ermilova, T. Kazub-skaya, N. Mazurenko, R. Garkavtseva, L. Kisselev, E. Zabarovsky. Common Deletion Regions on Chromosome 3p in Different Types of Cancer. // Abstracts of Human Genome Meeting HGM2000, Vancouver, Canada, April, 2000, P. 75.
9. E. Braga, I. Bazov, W. Loginov, V. Ermilova, T. Kazubskaya, R. Garkavtseva, N. Mazurenko, F. Kisseljov, V. Senchenko, J. Liu, V. Kashuba, M. Lerman, L. Kisseljov, E. Zabarovsky. Frequent allele losses in 3p213-212 and inactivation ofnovel RASSF1 candidate gene in epithelial cancer of various locations. // Abstracts of Human Genome Meeting HGM 2001, Edinburgh, Scotland, April 2001, № 322, P. 89.
10. G. Kilosanidze, A. Malyukova, N. Petrash, W. Loginov, I. Bazov, V. Kashuba, V. Ermitova, T. Kazubskaya, R. Garkavtseva, M.L Lerman, E. Zabarovsky, E. Braga. Search for cancer-associated genes in 3p21.31. // Abstracts of Human Genome Meeting, HGM2002, Shanghai, China, April 2002,'№ 201, P. 129.
11. G. Kilosanidze, A. Malyukova, N. Petrash, W. Loginov, I. Bazov, V. Kashuba, V. Ermilova, T. Kazubskaya, R. Garkavtseva, M. Lerman, E. Braga, E. Zabarovsky. SAGE data for searching cancer-associated genes in 3p213. II 28* Meeting ofthe Federation of European Bio-chemica Societies, Istanbul, Turkey, October 2002, FEBS J., 2002,269: P. 40, PS1-022.
Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 23.04.2004 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ 480. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В Ломоносова.
Р1 046 1
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Логинов, Виталий Игоревич
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Гены-супрессоры опухолевого роста, TSG.
1.2. Современные подходы к поиску новых TSG.
1.2.1. Анализ геми- и гомозиготных делеций. Количественная - ПЦР в режиме реального времени.
1.2.2. Поиск участков хромосомы, обладающих способностью подавлять рост опухоли.
1.2.3. "Вычитающая" гибридизация как один из альтернативных подходов к поиску TSG.
1.2.4. Применение микропанелей для поиска генов супрессоров.
1.2.5. Методы анализа метилирования промоторных районов генов-кандидатов на роль TSG в опухолях.
1.3. Картирование на коротком плече хромосомы 3 критичных районов, потенциально содержащих гены, связанные с эпителиальными опухолями разных локализаций.
1.3.1. Картирование критичных районов Зр в опухолях почки.
1.3.2. Картирование критичных районов Зр в опухолях легкого.
1.3.3. Картирование критичных районов Зр в опухолях молочной железы.
1.3.4. Картирование критичных районов Зр в опухолях женских репродуктивных органов.
1.3.5. Критичные участки на Зр-плече, общие для эпителиальных опухолей разных локализаций.
1.4. Роль метилирования в регулировании активности генов.
1.4.1. CpG-островки и гены.
1.4.2. Гипомстилирование ДНК в опухолях.
1.4.3. Гиперметилирование ДНК в опухолях.
1.4.4. Эпигенетические механизмы инактивации генов.
1.5. Гены-кандидаты на коротком плече хромосомы 3, активность которых подавляется в опухолях за счет метилирования.
1.5.1. Новый ген-кандидат в области 3р23-р22.3 -RAM-beta 2.
1.5.2. Область 3р21.3, район LUCA (lung cancer).
1.5.2.1. Ген-кандидат RASSF1A.
1.5.2.2. Ген-кандидат SEMA3B.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Реактивы, ферменты и буферные растворы.
2.2. Сбор материала.
2.3. Выделение геномной ДНК из ткани.
2.4. Анализ потерь гетерозиготности.
2.5. Полимеразная цепная реакция.
2.6. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации.
2.7. Метилчувствительный рестриктный анализ (МЧРА).
2.8. Бисульфитная модификация геномной ДНК.
2.8.1 Бисульфитная конверсия ДНК в растворе.
2.8.2. Бисульфитная конверсия ДНК в агарозных бусах.
2.9. Метил-специфичная ПЦР (МСП).
2.10. Бисульфитное секвенирование.
2.11. Статистическая обработка результатов.
2.11.1. Точный критерий Фишера.
2.11.2. Ранговая корреляции Спирмана.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Картирование критичных районов в области короткого плеча хромосомы 3 .человека в эпителиальных опухолях пяти локализаций.
3.1.1. Аллельные изменения в полиморфных маркерах Зр-плеча в ДНК эпителиальных опухолей.
3.1.2. Аллельные изменения на Зр в образцах рака почки.
3.1.3. Аллельные изменения на Зр в образцах рака легкого.
3.1.4. Аллельные изменения на Зр в образцах рака молочной железы.
3.1.5. Аллельные изменения на Зр в образцах рака яичников.
3.1.6. Аллельные изменения на Зр в образцах рака шейки матки.
3.1.7. Сравнение аллельных изменений на Зр в образцах ДНК эпителиальных опухолей пяти локализаций.
3.1.8. Районы наиболее частых аллельных делеций в пяти типах эпителиального рака.
3.1.9. Корреляция частоты аллельных делеций со степенью и стадией анаплазии в опухолях пяти локализаций.
3.1.10. Подтверждение данных по картированию аллельных изменений на Зр-плече в опухолях RCC, ВС и СС с помощью ПЦР в режиме реального времени.
3.1.11 Картирование гомозиготных делеций методом мультиплексной ПЦР.
3.1.12. Скрининг гомозиготных делеций в генах из критичных районов Зр.
3.1.13. Кластеры потенциальных TSG и онкогенов в критичных районах Зр.
3.2. Спектр метилирования промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B и
RAR-beta2 в эпителивальных опухолях разной локализации.
3.2.1. Анализ метилирования промоторного района гена RASSF1A методами
МСП и МЧРА в опухолях почки, молочной железы и яичников.
3.2.2. Анализ метилирования промоторного района гена SEMA3B в опухолях почки и яичников с применением МЧРА и бисульфитного секвенирования. 125 3.2.3. Анализ метилирования промоторного района гена RAR-beta2 в опухолях почки и яичников с применением МЧРА и бисульфитного секвенирования.
3.2.4. Корреляция уровня метилирования промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta2 со степенью анаплазии и с клинической стадией в опухолях различных локализаций.
3.2.5. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Делекционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека и спектр метилирования генов RASSF1A, SEMA3B и RAR-beta 2 в эпителиальных опухолях разных локализаций"
Онкологические заболевания занимают второе место в мире по причине смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и представляют собой одну из наиболее, актуальных проблем здравоохранения. Достигнутый в последнее время прогресс в изучении молекулярно-генетических основ канцерогенеза является важным шагом к пониманию природы рака.
Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют как генетические, так и эпигенетические факторы. С целью поиска генов, связанных с развитием опухолей, в первую очередь проводят картирование областей ДНК, часто делегируемых в раковых клетках, и исследуют подавление роста опухоли под действием фрагментов ДНК из этих районов. При выявлении новых генов-кандидатов сравнивают уровень их экспрессии (синтез м-РНК) в опухоли по сравнению с аналогичным паттерном в гистологически нормальных тканях, прилежащих к опухоли. В регуляции экспрессии генов, связанных с развитием злокачественных опухолей, все большая роль отводится метилированию CpG-островков в их промоторных районах (Jones et al., 2001; Attwood et al., 2002; Jain 2003).
Гиперметилирование CpG-островков в промоторном районе найдено для ряда ге-нов-супрессоров, таких как VHL, hMLHl, р16, CASP8, pl4ARF, GSTP1, MGMT RASSF1A и др. (Herman et al., 1994, 1998; Teitz et al., 2000; Esteller et al., 1999a; 1999b; 2000; Dammann et al., 2003). Метилирование регуляторных участков нарушает их взаимодействие с факторами транскрипции, блокируя эти участки с помощью белков, специфично связывающихся с метилированными CpG-парами (Methyl-CpG binding proteins), и более того, вносит изменения в окружающий хроматин, переводя его в стабильно репрессированное состояние (Bird, 2002; Prokhortchouk et al., 2002). Изменение статуса метилирования промоторных районов некоторых генов является характерной чертой опухолевых клеток, причем аномальное метилирование наблюдается уже на ранних этапах канцерогенеза (Nass et al., 2000; Esteller et al., 2001). Изменения в уровне метилирования промоторных районов ряда генов показаны для рака молочной железы, простаты, легкого и рака других локализаций (Baylin et al., 1998; Palmisana et al., 2000; Esteller et al., 2001).
Идентификация и анализ генов, изменяющих статус метилирования в опухолях, -важная задача как для науки, так и для практики. С теоретической точки зрения такие исследования способствуют изучению фундаментальных механизмов патогенеза опухолей, а с практической — позволяют осуществлять поиск новых молекулярных маркеров для ранней диагностики, прогноза, профилактики и мониторинга распространенных онкологических заболеваний.
В злокачественных новообразованиях человека делеции и перестройки обнаруживают на многих хромосомах: 1,3, б, 8, 9, 13, 17, 18 и других (Girard et al., 2000; Richard et al., 2000). В некоторых видах опухолей, например, в светлоклеточной карциноме почки, и во всех типах рака легкого в наибольшей степени делециям подвержено короткое плечо хромосомы 3 (Зр). Делеции в области короткого плеча хромосомы 3 также обнаружены в опухолях многих других органов, включая рак молочной железы, шейки матки и яичников (Kok et al., 1997; Maitra et al., 2001; Simsir et al., 2001). Высо-- кая частота потери гетерозиготности (LOH) в некоторых районах на Зр, обнаружение в этих же районах гомозиготных делеций (HD) и опухоль-подавляющей активности явились предпосылкой для поиска на Зр генов, связанных с канцерогенезом.
В результате за последние несколько лет на коротком плече хромосомы 3 человека было открыто до 10 генов-супрессоров, а также кластеры генов-кандидатов в новых критичных районах Зр (Zabarovsky et al., 2002; Брага и др. 2003, 2004). Регуляция активности ряда генов из этих районов осуществляется с помощью метилирования промоторных районов: RASSF1A, SEMA3B, HYAL1, BLU, CACNA2D2 и MLH1 (Zabarovsky et al., 2002; Брага и др 2003; Lerman and Minna 2000).
В связи с этим идентификация на Зр новых генов, участвующих в развитии эпителиальных опухолей, и анализ регуляции их активности за счет гиперметилирования -актуальные задачи онкогеномики и молекулярной биологии в целом.
Данная работа направлена на идентификацию на коротком плече хромосомы 3 новых генов, связанных с патогенезом таких распространенных и социально опасных форм рака, как рак почки, легкого, молочной железы, яичников и шейки матки.
Первый этап работы состоял в проведении делеционного картирования короткого плеча хромосомы 3 в эпителиальных опухолях пяти видов с целью локализации критичных районов, общих и специфичных для разных типов рака, и потенциально содержащих гены, связанные с их развитием. Для этого была использована выборка из 311 парных образцов эпителиальных опухолей различных локализаций и панель из 24 полиморфных микросателлитных маркеров.
Полученные результаты позволили локализовать новый район генов-кандидатов в области 3р21.31 между маркерами D3S2409, D3S2456 и D3S3667. В этом критичном районе (0.6 млн.п.н.) содержится до 20 новых генов; для семи из них имеются данные о возможном участии в онкогенезе. Показано, что метод аллелотипирования полиморфных маркеров и метод количественной ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) согласуются при исследовании парных образцов ДНК опухоли и соответствующей нормы (Р<0.05, согласно корреляции Спирмана). Установлена достоверная прямая корреляция частоты аллельных делеций со стадией и степенью анаплазии опухолей разных локализаций для района АР20 и других участков области 3р21.3. Согласно этим данным, гены из определенных районов Зр связаны с прогрессией рака, и их можно применять с целью прогнозирования течения заболевания.
На втором этапе нашей работы был проведен детальный анализ уровня (частоты и плотности) метилирования CpG-островков в промоторных районах потенциальных - генов-супрессоров RASSF1A, SEMA3B (3р21.31) и RAR-beta2 (3р23-р22.3) в первичных опухолях почек, молочной железы и яичников (172 случая). Для этого была использована комбинация методов, включающая бисульфитное секвенирование, МСП (метил-специфичную ПЦР) (Clark et al:, 1994, Herman et al., 1996) и МЧРА (метилчувстви-тельный рестриктный анализ). Для оценки метилирования промоторных районов генов разработана новая модификация метода МЧРА, основанная на применении набора соответствующих метил-чувствительных рестриктаз. Показано, что в такой модификации чувствительность и достоверность результатов МЧРА существенно возрастают и становятся выше, чем при использовании метода МСП. В случае некоторых генов МЧРА с применением набора рестриктаз позволяет детально исследовать метилирование CpG-островка, как и с помощью бисульфитного секвенирования.
В результате был выявлен ряд особенностей метилирования промоторных районов этих генов. Так, ген RASSF1A метилирован в опухолях яичников и почки с частотой 73% и 94% соответственно. В 1.5 раза реже (44% и 61% соответственно) при этих двух видах рака наблюдали метилирование гена SEMA3B. Напротив, частота метилирования гена RAR-beta2 резко отличалась в опухолях этих локализаций, достигая 90% при почечноклеточном раке и только 27% в эпителиальных опухолях яичников. Впервые установлена достоверная положительная корреляция степени метилирования гена SEMA3B со стадией и степенью анаплазии опухолей яичников и почки, а гена RASSF1A - с прогрессией опухолей яичников. Кроме того, в промоторных районах генов Зр RAR-beta2, RASSF1A и SEMA3B обнаружены гомозиготные делеции в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников и показана их ассоциация с тяжелой клинической стадией онкологических заболеваний.
Показано, что метилирование генов RAR-beta2, RASSF1A и SEMA3B можно обнаружить уже на ранней стадии опухолевого процесса. В связи с этим данные маркеры целесообразно использовать для ранней диагностики рака. С другой стороны, прямая достоверная корреляция между уровнем метилирования генов RASSF1A и SEMA3B и » клинико-морфологическими показателями опухолей позволяет применять эти факторы в качестве молекулярных маркеров неблагоприятного прогноза онкозаболевания.
Следует отметить, что подобное сравнительное исследование отдельной хромосомы в нескольких формах рака проводится впервые.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Логинов, Виталий Игоревич
выводы
1. С применением идентичной и плотной панели полиморфных мнкросателлитных маркеров проведен анализ делеций на коротком плече хромосомы 3 в пяти видах эпителиальных опухолей. Локализовано пять критичных районов с высокой частотой аллельных делеций.
2. Критичный район D3S2409-D3S3667 (3р21.31) протяженностью 0,6 млн.п.н идентифицирован нами впервые. В этом районе локализовано до 10 новых кандидатов в онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста.
3. Анализ корреляции частоты потери гетерозиготности со стадией и степенью анаплазии опухолей разных локализаций выявил вклад генов Зр и его отдельных районов в прогрессию опухолей.
4. Гомозиготные делеции (15 случаев), обнаруженные методом количественной ПЦР в режиме реального времени в критичных районах АР-20 и LUCA, картированы методом мультиплексной ПЦР, что позволило ограничить их протяженность и число содержащихся в них потенциальных генов-супрессоров.
5. Разработаны эффективные методики анализа метилирования промоторных районов ряда генов-супрессоров опухолевого роста, основанные на применении набора метилчувствительных рестриктаз и последующей ПЦР. Показано, что чувствительность МЧРА при таком подходе, существенно выше, чем МСП. Результаты подтверждены бисульфитным секвенированием.
6. Полученные нами данные показывают высокую частоту метилирования гена RASSFIA в эпителиальных опухолях разных локализаций. Предполагается, что эпигенетическая модификация этого гена представляет собой одно из ранних событий в онкогенезе эпителиальных опухолей.
7. Впервые изучено метилирование промоторного района гена SEMA3B в опухолях почки и яичников. При этом впервые выявлена статистически значимая зависимость уровня метилирования гена SEMA3B от прогрессии опухолей, что можно использовать для создания диагностического и прогностического теста.
8. Впервые показано, что промоторный район гена RAR-beta2 с высокой частотой метилирован при почечноклеточном раке и значительно реже в опухолях яичников. Уровень метилирования этого гена не зависит от прогрессии этих опухолей и, по-видимому, относится к ранним этапам онкогенеза. i
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Логинов, Виталий Игоревич, Москва
1. Альберте Б, Брей Д, Льюис Дж, Рэфф М, Роберте К, Уотсон Дж. "Молекулярная биология клетки" Москва,Мир". 1994,3, 445-484.
2. Базов ИВ, Казубская ТП, Ермилова ВД, Гарькавцева РФ, Логинов ВИ, Забаровский ЕР, Брага ЭА. Картирование аллельных делеций на коротком плече хромосомы 3 человека в опухолях почки. Мол. Биол., 2001,35,404-412.
3. Баранова АВ, Янковский НК. Гены-супрессоры опухолевого роста. Мол. биол., 1998, 32, 206218.
4. Брага ЭА, Кашуба ВИ, Малюкова АВ, Логинов ВИ, Сенченко ВН, Базов ИВ, Киселев ЛЛ, Забаровский ЕР. Новые гены-супрессоры опухолевого роста в горячих точках хромосомы 3 человека: новые методы идентификации. Мол. биол., 2003,37, 1-18.
5. Брага ЭА, Киселев ЛЛ, Забаровский ЕР. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей человека. Мол. биол., 2004,38, 179-190.
6. Брага ЭА, Котова ЕЮ, Пугачева ЕМ, Гизатуллин РЗ, Кашуба ВИ, Лерман МИ, Аксенова МГ, Ефремов ИА, Забаровский ЕР, Киселев ЛЛ. Хромосома 3 человека: поиск микросателлитов, анализ их распределения и формирование маркеров. Мол. биол., 1997, 31, 988-999.
7. Забаровский ЕР. Новые стратегии клонирования идентичных и различающих ся фрагментов ДНК из сложных геномов. Мол. Биол., 2000, 34, 612-625
8. Киселев ФЛ. Гены стабилизации ДНК и канцерогенез. Мол. Биол., 1998, 32, 197-205.
9. Трапезников НН, Аксель ЕМ. "Заболеваемость злокачественными новообразованиями и смертность от них населения стран СНГ в 1997 г.", Москва. 1999, 281
10. Acevedo CM, Henriquez М, Emmert-Buck MR, Chuaqui RF. Loss of heterozygosity on chromosome arms 3p and 6q in microdissected adenocarcinomas of the uterine cervix and adenocarcinoma in situ. Cancer., 2002, 94,793-802.
11. Agathanggelou A, Honorio S, Macartney DP, Martinez A, Dallol A, Rader J, Fullwood P, Chauhan A, Walker R, Shaw JA, Hosoe S, Lerman MI,Minna JD,Maher ER and Latif F. Oncogene, 2001, 20, 1509-1518.
12. Aggerholm A, Hokland P. DAP-kinase CpG island methylation in acute myeloid leukemia: methodology versus biology? Blood, 2000, 95, 2997-9.
13. Aissani В and Bernardi G. CpG islands: features and distribution in the genomes of vertebrates. Gene, 1991,106,173-183.
14. Ali IU, Lidereau R and Callahan R. Presence of two members of c-erbA receptor gene family (c-erbA beta and c-erbA2) in smallest region of somatic homozygosity on chromosome 3p21-p25 in human breast carcinoma. Natl. Cancer Inst., 1989, 81, 1815-1820.
15. Alimov A, Kost-Alimova M, Liu J, Li C, Bergerheim U, Imreh S, Klein G and Zabarovsky ER. Combined LOH/CGH analysis proves the existence of interstitial 3p deletions in renal cell carcinoma. Oncogene, 2000,19, 1392-1399.
16. Allikmets RL, Kashuba VI, Bannikov VM, Petrov N, Pettersson B, Lebedeva T,Gizatullin R, Zakha-ryev VM, Winberg G, Dean M, Uhlen M, Kisselev LL, Klein G, Zabarovsky ER. Genomics, 1994, 19, 303-309.
17. Alves G, Tatro A, Fanning T. Differential methylation of human line-1 retrotransposons in malignant cells. Gene, 1996,176, 39-44.
18. Antequera F and Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse. PNAS 1993, 90, 11995-11999.
19. Antequera F, Boyes J and Bird A. High levels of de novo methylation and altered chromatin structure at CpG islands in cell lines. Cell, 1990, 6, 503-514.
20. Apicelli AJ, Uhlmann EJ, Baldwin RL, Ding H, Nagy A, Guha A, Gutmann DH. Role of the Rapl GTPase in astrocyte growth regulation. Glia, 2003, 42,225-34.
21. Attwood JT, Yung RL, Richardson ВС. DNA methylation and the regulation of gene transcription. Cell Mol Life Sci., 2002, 59, 241-57.
22. Bateman A, Birney E, Durbin R, Eddy SR, Finn RD and Sonnhammer EL. Pfam 1313 multiple alignments and profile HMMs match the majority of proteins. Nucleic Acids Res., 1999, 27, 260-262.
23. Batinac T, Gruber F, Lipozencic J, Zamolo-Koncar G, Stasic A, Brajac I. Protein p53 Structure, Function, and Possible Therapeutic Implications. Acta Dermatovenerol Croat., 2003,11, 225-30.
24. Batova A, Diccianni MB, Yu JC, Nobori T, Link MP, Pullen J and Yu AL. Frequent and selective methylation of pl5 and deletion of both pl5 and pl6 in T-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res., 1997, 57, 832-836.
25. Baylin SB, Herman JG, Graf JR, Vertino PM, Issa JP. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv. Cancer Res., 1998, 72, 141-196.
26. Baylin SB, Hoppener JW, de Bustros A, Steenbergh PH, Lips CJ, Nelkin BD. DNA methylation patterns of the calcitonin gene in human lung cancers and lymphomas. Cancer Res., 1986, 46, 291722.
27. Belinsky SA. Role of the cytosine DNA-methyltransferase and pl6INK4a genes in the development of mouse lung tumors. Exp Lung Res., 1998, 24, 463-79.
28. Benezra M, ChevallierN, Morrison DJ, MacLachlan TK, El-Deiry WS, Licht JD. BRCA1 augments transcription by the NF-kappaB transcription factor by binding to the Rel domain of the p65/RelA subunit. J. Biol Chem., 2003, 278, 26333-41.
29. Bird AP. CpG islands as gene markers in the vertebrate nucleus. Trends Genet., 1987,3, 342-347.
30. Bird A, Taggart M, Frommer M, Miller OJ, Macleod D. A fraction of the mouse genome that is derived from islands of nonmethylated, CpG-rich DNA. Cell, 1985, 40, 91-9.
31. Bird AP. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev., 2002, 16, 6-21.
32. Bhattacharya SK, Ramchandani S, Cervoni N, Szyf M. Amammalian protein with specific demeth-ylase activity for mCpG DNA. Nature., 1999,397, 579-583.
33. Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP, Morin GB, Harley CB, Shay JW, Lichtstei-ner S and Wright WE. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science, 1998, 279, 349-352.
34. Bouchard J, Momparler RL. Incorporation of 5-Aza-2'-deoxycytidine-5'-triphosphate into DNA. Interactions with mammalian DNA polymerase alpha and DNA methylase. Mol Pharmacol., 1983, 24, * 1 109-14.
35. Boudeau J, Sapkota G, Alessi DR. LKB1, a protein kinase regulating cell proliferation and polarity. FEBS Lett., 2003, 546, 159-65.
36. Boulay J-L, Reuter J, Ristchard R, Terracciano L, Herrmann R, Rochlist C. Gene dosage quantitative real-time PCR. BioTechniques., 1999, 27, 228-232.
37. Bovenzi V, Le NL, Cote S, Sinnett D, Momparler LF and Momparler R L. DNA methylation of reti-noic acid receptor О in breast cancer and possible therapeutic role of 5-aza-2.-deoxycytidine. Anticancer Drugs, 1999,10,471-476.
38. Brandeis M, Frank D, Keshet I, Siegfried Z, Mendelsohn M, Nemes A, Temper V, Razin A, Cedar H. Spl elements protect a CpG island from de novo methylation. Nature., 1994,371, 435-8.
39. Brazma A, Hingamp P, Quackenbush J, Sherlock G, Spellman P, Stoeckert C, Aach J, Ansorge W,
40. Budowle B, Chakraborty R, Guisti AM, Eisenberg AJ, Allen RC. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE .Am. J. Genet., 1991, 48, 137-144.
41. Buchhagen DL, Qiu L, Etkind P.Homozygous deletion, rearrangement and hypermethylation implicate chromosome region 3pl4.3-3p21.3 in sporadic breast-cancer development. Int J Cancer., 1994, 57, 473-9.
42. BuchholzTA, Weil MM, Story MD, Strom EA, Brock WA, McNeese MD. Tumor suppressor genes and breast cancer. Radiat Oncol Investig., 1999, 7, 55-65.
43. Cameron EE, Bachman KE, Myohanen S, Herman JG and Baylin SB. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer. Nature Genetics, 1999,21, 103-107.
44. Cavenee WK, Dryja TP, Philips RA, Benedict WF, Godbout R, Gallie BL, Murphree AL, Strong LC and White R. Expression of recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastoma. Nature, 1983,305, 779-784.
45. Chambon P. A decade of molecular biology of retinoic acid receptors. FASEBJ. 1996,10,940-954.
46. Chen S, Paul P, Price BD. ATM's leucine-rich domain and adjacent sequences are essential for ATM to regulate the DNA damage response. Oncogene., 2003, 22, 6332-9.
47. Cheng Y, Poulos NE, Lung ML, Hampton G, Ou B, Lerman MI and Stanbridge EJ. Functional evidence for a nasopharyngeal carcinoma tumor suppressor gene that maps at chromosome 3p21.3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, 95, 3042-3047.
48. Chino K, Esumi M, Ishida H, Okada K. Characteristic loss of heterozygosity in chromosome 3P and low frequency of replication errors in sporadic renal cell carcinoma-/. Urol., 1999, 162, 614-618.
49. Chuang LS, Ian HI, Koh TW, Ng HH, Xu G, Li BF. Human DNA-(cytosine-5) methyltransferase-PCNA complex as a target for p21 WAF1. Science, 1997, 277, 1996-2000.
50. Chung GTY, Sundaresan V, Hasleton P, Rudd R, Taylor R and Rabbitts PH. Oncogene, 1995, 11, 2591-2598.
51. Clark SJ, Harrison J, Frommer M. CpNpG methylation in mammalian cells. Nat. Genet., 1995, 10, 20-7.
52. Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucl. Acids Res., 1994,15,2990-2997.
53. Collisson EA, Carranza DC, Chen IY, Kolodney MS. Isoprenylation is necessary for the full invasive potential of RhoA overexpression in human melanoma cells. J Invest Dermatol., 2002, 119, 1172-6.
54. Connolly DC, Greenspan DL, Wu R, Ren X, Dunn RL, Shah KV, Jones RW, Bosch FX, Munoz N, Cho KR. Loss of fhit expression in invasive cervical carcinomas and intraepithelial lesions associated with invasive disease. Clin. Cancer Res., 2000, 6, 3505-10.
55. Conover WJ. (1980). Practical Nonparametric Statistics. 2nd. ed. New York: Wiley
56. Cooper DN, Taggart MH and Bird AP. Unmethylated domains in vertebrate DNA. Nucleic Acids Res., 1983,11,647-658.
57. Corral T, Jimenez M, Hernandez-Munoz I, Perez de Castro I, Pellicer A. NFI modulates the effects of Ras oncogenes: evidence of other NFI function besides its GAP activity. J. Cell Physiol., 2003, 197,214-24.
58. Costello JF, Berger MS, Huang HS, Cavenee WK. Silencing of pl6/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation. Cancer Res., 1996, 56, 2405-10.
59. Costello JF, Plass C. Methylation matters. J. Med. Genet., 2001,38,285-303.
60. Cote S, Sinnett D, Momparler RL. Demethylation by 5-aza-2-deoxycytidine of specific 5-methylcytosine sites in the promoter region of the retinoic acid receptor beta gene in human colon carcinoma cells. Anticancer Drugs, 1998, 9, 743-50.
61. Couch FJ, DeShano ML, Blackwood MA, Calzone K, Stopfer J, Campeau L, Ganguly A, Rebbeck T, Weber BL. BRCA1 mutations in women attending clinics that evaluate the risk of breast cancer. N. Engl. J. Med., 1997,336, 1409-15.
62. Craig JM and Bickmore WA. The distribution of CpG islanda in mammalian chromosomes. Nature Genetics., 1994,7,376-382.
63. Cross SH and Bird APCpG islands and genes. Curr. Opin. Genet. Dev., 1995, 5, 309-314.
64. Cross SH, Charlton JA, Nan X and Bird AP. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nat. Genet., 1994, 6,236-244.
65. Cross SH, Lee M, Clark VH, Craig JM, Bird AP and Bickmore WA. The chromosomal distribution of CpG islands in the mouse: evidence for genome scrambling in the rodent lineage. Genomics., 1997, 40, 454-461.
66. Dammann R, Li C, Yoon JH, Chin PL, Bates S and Pfeifer GP. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat Genet., 2000, 25,315-319.
67. Dasgupta B, Dugan LL, Gutmann DH. The neurofibromatosis 1 gene product neurofibromin regulates pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-mediated signaling in astrocytes. JNeurosci., 2003, 23, 8949-54.
68. Diatchenko L, Lukyanov S, Lau YF, Siebert PD. Suppression subtractive hybridization: a versatile method for identifying differentially expressed genes. Methods Enzymol., 1999, 303, 349-380.
69. Del Senno L, Maestri I, Piva R, Hanau S, Reggiani A,Romano A, Russo G. Differential hypometh-ylation of the c-myc protooncogene in bladder cancers at different stages and grades. J Urol, 1989, 142, 146-9.
70. Deng GR, Chen AD, Hong J, Chae HS, Kim YS. Methylation of CpG in a small region of the hMLHl promoter invariably correlates with the absence of gene expression. Cancer Res., 1999, 59, 2029-33.
71. Dessain SK, Yu HY, Reddel RR, Beijersbergen RL, Weinberg RA. Methylation of the human te-Iomerase gene CpG island. Cancer Res., 2000;60, 537-41.
72. Devereux TR, Horikawa I, Anna CH, Annab LA, Afshari CA, Barrett JC. DNA methylation analysis of the promoter region of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene. Cancer Res., 1999, 59, 6087-90.
73. Dikovskaya D, Zumbrunn J, Penman GA, Nathke IS. The adenomatous polyposis coli protein: in the limelight out at the edge. Trends Cell Biol., 2001,11,378-84.
74. Dillon EK, de Boer WB, Paradimitriou JM and Turbett GR Br. J. Cancer, 1997, 76, 156-162.
75. Doerfler W. DNA methylation and gene activity. Annu Rev Biochem., 1983, 52, 93-124.
76. Dodge JE, List AF, Futscher BW. Selective variegated methylation of the pi5 CpG island in acute myeloid leukemia. Int. J. Cancer, 1998, 78, 561-7.
77. Domann FE, Rice JC,Hendrix MJC. Futscher BW. Epigenetic silencing of maspin gene expression in human breast cancers. Int. J. Cancer, 2000, 85, 805-10.
78. Drabkin HA, Mendez MJ, Rabbitts PH, Varkony T, Bergh J, Schlessinger J, Erickson P and Gemmill RM. Genes. Chrom. Cancer, 1992, 5, 67-74.
79. Druck T, Kastury K, Hadaczek P, Podolski J, Toloczko A, Sikorski A, Ohta M, LaForgia S, Lasota J, McCue P, Lublinski J and Huebner K. Cancer Res., 1995, 55, 5348-5353.
80. Eads CA, Kanenberg KD, Kawakami K, Saltz LB, Blake C, Shibata D. Methylight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Res., 2000, 28, e32.
81. Esteller M, Corn PG, Baylin SB, Herman JG. A gene hypermethylation profile of human cancer. Cancer Res., 2001, 61, 3225-3229.
82. Esteller M, Corn PG, Urena JM, Gabrielson E, Baylin SB, Herman JG. Inactivation of glutathione S-transferase PI gene by promoter hypermethylation in human neoplasia. Cancer Res., 1998, 58, 4515-4518.
83. Esteller M, Guo M, Moreno V, Peinado MA, Capella G, Galm O, Baylin SB, Herman JG. Hyper-methylation-associated inactivation of the cellular retinol-binding-protein 1 gene in Human Cancer. Cancer Res., 2002, 62, 5902-5.
84. Esteller M, Hamilton SR, Burger PC, Baylin SB, Herman JG. Inactivation of Об-methylguanine-DNA-methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in multiple human neoplasia. Cancer Res., 1999a, 59, 793-797.
85. Esteller M, Herman JG.Cancer as an epigenetic disease: DNA methylation and chromatin alterations in human tumours. J Pathol., 2002, 196, 1-7.
86. Esteller M, Avizienyte E, Corn PG, Lothe RA, Baylin SB, Aaltonen LA, Herman JG. Epigenetic inactivation of LKB1 in primary tumors associated with the Peutz-Jeghers syndrome. Oncogene., 2000,19, 164-8.
87. Esteller M, Sanchez-Cespedes M, Rosell R, Sigransky D, Baylin SB, Herman JG. Detection of aberrant promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in serum DNA from non-small cell lung cancer patients. Cancer Res., 1999b, 59, 67-70
88. Esteller M, Tortola S, Toyota M, Capella G, Peinado MA, Baylin SB, Herman JG. Hypermethyla-tion-associated inactivation of pl4(ARF) is independent of pl6(INK4a) methylation and p53 mutational status. Cancer Res., 2000, 60, 129-33.
89. Evan GI, Vousden KH. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature, 2001, 411, 342-348.
90. Evron E, Dooley WC, Umbricht CB, Rosenthal D, Sacchi N, Gabrielson E, Soito AB, Hung DT, Ljung B-M, Davidson NE, Sukumar S. Detection of breast cancer cells in ductal lavage fluid by methylation-specific PCR. The Lancet., 2001,357, 1335-1336.
91. Feinberg AP. Imprinting of a genomic domain of 1 lpl5 and loss of imprinting in cancer: an introduction. Cancer Res., 1999, 59, 1743-1746.
92. Fienberg AP and Vogelstein B. Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature., 1983,301, 89-92.
93. Forgacs E, Zochbauer-Muller S, Minna JD. Molecular Genetic Abnormalities in the Pathogenesis of Human Lung Cancer Pat. Onco. Res., 2001, 7, 6-13.
94. Fouret PJ, Dabit D, Mergui JL and Uzan S. Loss of heterozygosity on the short arm of chromosome 3 in cervical intra-epithelial neoplasia without concomitant cervical carcinoma. Pathobiology, 1998, 66,306-310.
95. Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collies CM, Watt F, Grigg GW. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1827-1831.
96. Fu W, Killen M, Culmsee C, Dhar S, Pandita TK and Mattson MP. J. Mol. Neurosci., 2000, 14, 315.
97. Fuj'ii H, Biel MA, Zhou WB, Weitzman SA, Baylin SB, Gabrielson E. Methylation of the ШС-1candidate tumor suppressor gene in human breast cancer. Oncogene, 1998,16,2159-64.
98. Fujisawa H and Kitsukawa T. Receptors for collapsin/semaphorins. Curr. Opin. Neurobiol., 1998, 8, 587-592.
99. Fullwood P, Marchini S, Rader JS, Martinez A, Macartney D, Broggini M, Morelli C, Barbanti-Brodano G, Maher ER, Latif F. Detailed genetic and physical mapping of tumor suppressor loci on chromosome 3p in ovarian cancer. Cancer Res., 1999, 59,4662-4667.
100. Galm O, Rountree MR, Bachman KE, Jair KW, Baylin SB & Herman JG. Enzymatic regional methylation assay: a novel method to quantify regional CpG methylation density. Genome Res., 2002, 12, 153-157.
101. Gama-Sosa MA, Slagel VA, Trewyn RW, Oxenhandler R, Kuo КС, Gehrke CW, Ehrlich M. The 5-methylcytosine content of DNA from human tumors. Nucleic Acids Res., 1983,11, 6883-94.
102. Gibson UE, Heid CA & Williams PM A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res., 1996,6,995-1001.
103. Ginzinger DG, Godfrey ТЕ, Nigro J, Moore DH. 2nd, Suzuki S, Pallavicini MG, Gray JW, Jensen RH. Measurement of DNA copy number at microsatellite loci using quantitative PCR analysis. Cancer Res., 2000, 60, 5405-5409.
104. Girolami F, Passerini I, Gargano D, Frusconi S, Villari D, Nicita G, Torricelli F. Microsatellite analysis of chromosome 3p region in sporadic renal cell carcinomas. Pat. Onco. Res., 2002, 8, 241244
105. Gitan RS, Shi H, Yan PS, Huang TH-M. Methylationspecific oligonucleotide microarray: A new potential for high-throughput methylation analysis. Genome Res., 2002, 12, 158-164.
106. Gray JW, Collins C. Genome changes and gene expression in human solid tumors. Carcinogenesis, 2000,21,443-452.
107. Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Harris CC. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and molecular pathogenesis. Cancer Res., 1994, 54, 4855-78.
108. Guo Z, Ни X, Afink G, Ponten F, Wilander E and Ponten J. Comparison of chromosome 3p deletions between cervical precancers synchronous with and without invasive cancer. Int. J. Cancer, 2000,86,518-523.
109. Guo Z, Wilander E, Sallstrom J and Ponten J. Deletion of chromosome 3p is an early event in malignant progression of cervical cancer. Anticancer Res., 1998,18, 707-712.
110. Guo Z, Wu F, Asplund А, Ни X, Mazurenko N, Kisseljov F, Ponten J and Wilander E. Analysis of intratumoral heterogeneity of chromosome 3p deletions and genetic evidence of polyclonal origin of cervical squamous carcinoma. Mod. Pathol., 2001,14, 54-61.
111. Hansen MF, Cavenee WK. Retinoblastoma and the progression of tumor genetics. Trends Genet., 1988, 4, 125-129.
112. Harris LC, Remack JS, Brent TP. In vitro methylation of the human Об-methylguanine-DNA meth-yltransferase promoter reduces transcription. Biochim Biophys Acta, 1994,1217, 141-6.
113. Heid CA, Stevens J, Livak KJ & Williams PM Real time quantitative PCR. Genome Res., 1996, 6, 986-994.
114. Helland A, Borresen-Dale AL, Peltomaki P, Hektoen M, Kristensen GB, Nesland JM, de la Chapelle A, Lothe RA. Microsatellite instability in cervical and endometrial carcinomas. Int J Cancer., 1997, 70, 499-501.
115. Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc.Natl.Acad.Sci., 1996, 93, 9821-9826.
116. Herman JG, Jen J, Merlo A, Baylin SB. Hypermethylationassociated inactivation indicates a tumor suppressor role for pl5INK4B. Cancer Res., 1996, 56, 722-7.
117. Herzog CR, Keith AC, Sabourin CLK, Kelloff GJ, Boone CW, Stoner GD and You M. Chromosome 3p tumor-suppressor gene alterations in cervical carcinomas. Mol. Carcinog., 2001, 30, 159-168.
118. Homma MK, Li D, Krebs EG, Yuasa Y, Homma Y. Association and regulation of casein kinase 2 activity by adenomatous polyposis coli protein. Proc Natl Acad Sci USA., 2002, 99, 5959-64.
119. Hong WK,. Lippman SM, Hittelmann WN and Lotan R. Retinoid chemoprevention of aerodigestive cancer:From basic research to the clinic. Clin. Cancer Res., 1995,1, 677-686.
120. Jain PK. Epigenetics: the role of methylation in the mechanism of action of tumor suppressor genes. Ann NY Acad Sci., 2003, 983, 71-83.
121. Jones PA. The DNA methylation paradox. Trends Genet., 1999,15, 34-7.
122. Jones PA and Laird PW. Cancer epigenetics comes of age. Nature Genet., 1999, 21, 163-170.
123. Jones PA and Tatki D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics. Science, 2001, 293, 1068-1070.
124. Jones PA, Wolkowicz MJ, Rideout WMd, Gonzales FA, Marziasz CM, Coetzee GA, Tapscott SJ. De novo methylation of the MyoDl CpG island during the establishment of immortal cell lines. Proc Natl Acad Sci USA., 1990, 87, 6117-21.
125. Juttermann R, Li E, Jaenisch R. Toxicity of 5-aza-2'-deoxycytidine to mammalian cells is mediated primarily by covalent trapping of DNA methyltransferase rather than DNA demethylation. Proc Natl Acad Sci USA., 1994, 91,11797-801.
126. Kafri T, Ariel M, Brandeis M, Shemer R, Urven L, McCarrey J, Cedar H, Razin A. Developmental pattern of gene-specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line. Genes Dev., 1992, 6, 705-14.
127. Kanaya T, Kyo S, Maida Y, Yatabe N, Tanaka M, Nakamura M and Inoue M. Frequent hypermethylation of MLH1 promoter in normal endometrium of patients with endometrial cancers. Oncogene., 2003, 22,2352-2360
128. Kantharidis P, Elosta A, deSilva M, Wall DMP, Hu XF, Slater A, Nadalin G, Parkin JD, Zalcberg JR. Altered methylation of the human MDR1 promoter is associated with acquired multidrug resistance. Clin Cancer Res., 1997,3, 2025-32.
129. Kass SU, Landsberger N, Wolffe AP. DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription initiation. Curr Biol., 1997, 7, 157-65.
130. Keith RL, Miller YE, Gemmill RM, Drabkin HA, Dempsey EC, Kennedy TC, Prindiville S and Franklin WA. Angiogenic squamous dysplasia in bronchi of individuals at high risk for lung cancer. Clin. Cancer Res., 2000, 6, 1616-1625.
131. Kim ST, Lim DS, Canman CE and Kastan MB. Substrate specificities and identification of putative substrates of ATM kinase family members. J. Biol. Chem., 1999, 274, 37538-37543.
132. Kim YI, Giuliano A, Hatch KD, Schneider A, Nour MA, Dallal GE, Selhub J, Mason JB. Global DNA hypomethylation increases progressively in cervical dysplasia and carcinoma. Cancer., 1994, 74, 893-9.
133. Killary AM, Wolf ME, Giambernardi ТА and Naylor SL. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1992, 89, 10877-10881.
134. Kinzler KV, Vogelstein B. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers (news, comment). Nature, 1997,386, 761-763.
135. Knudson AG. Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. Cancer Res., 1985, 45, 1437-1443.
136. Kok K, Naylor SL, Buys CHCM. Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes. Adv. Cancer Res., 1997, 71, 27-92.
137. Korotkina RN, Matskevich GN, Devlikanova ASh, Vishnevskij AA, Kunitsyn AG, Karelin AA. Activity of glutathione-metabolizing and antioxidant enzymes in malignant and benign tumors of human lungs. Bull Exp Biol Med., 2002, 133, 606-8.
138. Koul D, Jasser SA, Lu Y, Davies MA, Shen R, Shi Y, Mills GB, Yung WK. Motif analysis of the tumor suppressor gene MMAC/PTEN identifies tyrosines critical for tumor suppression and lipid phosphatase activity. Oncogene., 2002, 21, 2357-64.
139. Kuroki T, Trapasso F, Yendamuri S, Matsuyama A, Alder H, Williams NN, Kaiser LR and Croce CM. Allelic Loss on Chromosome 3p21.3 and Promoter Hypermethylation of Semaphorin3B in Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer Res., 2003, 63, 3352-3355.
140. Kuzmin I, Gillespie JW, Protopopov A, Geil L, Dreijerink K, Yang Y, Vocke CD, Duh F-M, Zabarovsky E, Rhim JS, Emmert-Buck MR, Linehan WM and Lerman ML. (). Cancer Res., 2002, 62, 3498-3502.
141. Kuzmin I, Geil L, Ge HY, Bengtsson U, Duh FM, Stanbridge EJ, Lerman MI. Analysis of aberrant methylation of the VHL gene by transgenes, monochromosome transfer, and cell fusion. Oncogene., 1999,18,5672-9.
142. LJ, Randerath E, Randerath K. DNA hypomethylation in Morris hepatomas. Cancer Lett., 1983, 19,231-9.
143. Macleod K. Tumor supressor genes. Current Opinion in Genet. Dev., 2000, 10, 81-93.
144. Maliekal TT, Antony ML, Nair A, Paulmurugan R, Karunagaran D. Loss of expression, and mutations of Smad 2 and Smad 4 in human cervical cancer. Oncogene., 2003, 22, 4889-97.
145. Malik K, Salpekar A, Hancock A, Moorwood K, Jackson S, Charles A, Brown KW. Identification of diVerential methylation of the WT1 antisense regulatory region and relaxation of imprinting in Wilms' tumor. Cancer Res., 2000, 60, 2356-60.
146. Manderson EN, Presneau N, Provencher D, Mes-Masson AM, Tonin PN. Comparative analysis of loss of heterozygosity of specific chromosome 3, 13, 17, and X loci and TP53 mutations in human epithelial ovarian cancer. Mol Carcinog., 2002,34, 78-90.
147. Manke IA, Lowery DM, Nguyen A, Yaffe MB. BRCT repeats as phosphopeptide-binding modules involved in protein targeting. Science., 2003, 302, 636-9.
148. Martinez A, Walker RA, Shaw JA, Dearing SJ, Maher ER, Latif F. Chromosome 3p allele loss in early invasive breast cancer: detailed mapping and association with clinicopathological features. J. Clin. Pathol.: Mol. Pathol, 2001, 54, 300-306.
149. Matsumoto S, Kasumi F, Sakamoto G, Onda M, Nakamura Y and Emi M. Genes Chrom. Cancer, 1997,20,268-274.
150. Mazurenko N, Attaleb M, Gritzko T, Semjonova L, Pavlova L, Sakharova O, Kisseljov F. High resolution mapping of chromosome 6 deletions in cervical cancer. Oncol. Reports., 1999, 6, 859-863.
151. Merlo A, Herman JG, Mao L, Lee DJ, Gabrielson E, Burger PC, Baylin SB, Sidransky D. 5' CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumour suppressor p 16/CDKN2/MTS1 in human cancers. Nat Med., 1995,1, 686-92.
152. Mertens F, Johansson B, Hoeglund M and Mitelman F. Chromosomal imbalance maps of malignant solid tumors: a cytogenetic survey of 3185 neoplasms. Cancer Res., 1997, 57, 2765-2780.
153. Miralem T, Avraham HK Extracellular matrix enhances heregulin-dependent BRCA1 phosphorylation and suppresses BRCA1 expression through its С terminus. Mol Cell Biol., 2003, 23, 579-93.
154. Mitsudomi T, Oyama T, Nishida K, Ogami A, Osaki T, Sugio K, Yasumoto K, Sugumachi K, Gazdar AF. Clin. Cancer Res., 1996, 2, 1185-1189.
155. Miturski R, Bogusiewicz M, Ciotta C, Bignami M, Gogacz M and Burnouf D. Mismatch Repair Genes and Microsatellite nstability as Molecular Markers for ynecological Cancer Detection. Exp Biol Med., 2002,227, 579-586.
156. Monk M, Boubelik M, Lehnert S. Temporal and regional changes in DNA methylation in the embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development. Development., 1987,99,371-82.
157. Moren A, Hellman U, Inada Y, Imamura T, Heldin CH, Moustakas A. Differential ubiquitination defines the functional status of the tumor suppressor Smad4. J Biol Chem., 2003, 278, 33571-82.
158. Morris MR, Hesson LB, Wagner KJ, Morgan NV, Astuti D, Lees RD, Cooper WN, Lee J, Gentle D, Macdonald F, Kishida T, Grundy R, Yao M, Latif F, Maher ER. Multigene methylation analysis of Wilms' tumour and adult renal cell carcinoma.
159. McQueen HA, Fantes J, Cross SH, Clark VH, Archibald AL, Bird AP. CpG islands of chicken are concentrated on microchromosomes. Nat Genet., 1996,12, 321-4.
160. Myohanen S, Wahlfors J, Janne J. Automated fluorescent genomic sequencing as applied to the methylation analysis of the human ornithine decarboxylase gene, DNA Sequence., 1994, 5, 1-8.
161. Na X, Duan HO, Messing EM, Schoen SR, Ryan CK, di Sant'Agnese PA, Golemis EA, Wu G. Identification of the RNA polymerase II subunit hsRPB7 as a novel target of the von Hippel-Lindau protein. EMBOJ,. 2003, 22,4249-59.
162. Nakayama T, Watanabe M, Yamanaka M, Hirokawa Y, Suzuki H, Ito H, Yatani R, Shiraishi T. The role of epigenetic modifications in retinoic acid receptor beta2 gene expression in human prostate cancers. Lab Invest., 2001, 81, 1049-57.
163. Narayan A, Ji W, Zhang XY, Marrogi A, Graff JR, Baylin SB, Ehrlich M. Hypomethylation of peri-centromeric DNA in breast adenocarcinomas. Int J Cancer., 1998, 77, 833-8.
164. Nass SJ, Herman JG, Gabrielson E, Iversen PW, Pari FF, Davidson NE, Graff JR. Aberrant methylation of the estrogen receptor and E-cadherin 50 CpG islands increases with malignant progression in human breast cancer. Cancer Res., 2000, 60,4346-4348.
165. Nathanson KL, Wooster R, Weber BL, Nathanson KN. Breast cancer genetics: what we know and what we need. Nat Med,. 2001, 7, 552-6.
166. Nelkin BD, Przepiorka D, Burke PJ, Thomas ED, Baylin SB. Abnormal methylation of the calcitonin gene marks progression of chronic myelogenous leukemia. Blood., 1991, 77, 2431-4.
167. Nishimura M, Furumoto H, Kato T, Kamada M, Aono T. Microsatellite instability is a late event in the carcinogenesis of uterine cervical cancer. Gynecol Oncol., 2000, 79, 201-6.
168. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell., 1999, 99, 247-57.
169. Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res., 1996, 24, 5064-6.
170. Osborne RJ, Hamshere MG. A genome-wide map showing common regions of loss of heterozygosity/allelic imbalance in breast cancer. Cancer Res., 2000, 60, 3706-12.
171. Ouellette MM, McDaniel LD, Wright WE, Shay JW and Schultz RA. The establishment of telomer-ase-immortalized cell lines representing human chromosome instability syndromes. Hum. Mol. Genet., 2000, 9,403-411.
172. Palmisano WA, Divine KK, Saccomanno G, Gilliland FD, Baylin SB, Herman JG and Belinsky SA. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. Cancer Res., 2000, 60, 5954-5958.
173. Parkin DM, Pisani P, Ferlay J. Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990. Int J Cancer., 1999, 80, 827-41.
174. Patel A, Groopman JD and Umar A. DNA methylation as a Cancer-Specific Biomarker. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003, 983,286-297.
175. Pathak S, Strong LC, Ferrel RE and Trindale A. Familial renal cell carcinoma with a 3;11 chromosome translocation limited to tumor cells. Science, 1982, 217, 939-941.
176. Peace BE, Hughes MJ, Degen SJF, Waltz SE. Point mutations and overexpression of Ron induce transformation, tumor formation, and metastasis. Oncogene., 2001,20, 6142-6151.
177. Pearlly SY, Huidong S, Farahnaz R, Hsiau TH-C, Hsiau H-A., Yu-Wei L, Liu JC and Huang TH-M. Differential distribution of DNA methylation within the RASSFIA CpG island in breast cancer. Cancer Res., 2003, 63, 6178-6186.
178. Petersen I, Petersen S. Towards a genetic-based classification of human lung cancer. Anal Cell Pathol. 2001,22, 111-21.
179. Peto J, Collins N, Barfoot R, Seal S, Warren W, Rahman N, Easton DF, Evans C, Deacon J, Stratton MR. Prevalence of BRCA1 and BRCA2 gene mutations in patients with early-onset breast cancer. J Natl Cancer Inst,. 1999,91,943-9.
180. Pfeifer GP, Yoon JH, Liu L, Tommasi S, Wilczynski SP, Dammann R. Methylation of the RASSFIA gene in human cancers. Biol Chem., 2002,383, 907-14.
181. Ponder BAJ. Cancer genetics. Nature, 2001, 411, 336-341.
182. Prokhortchouk E and Hendrich B. Methyl-CpG binding proteins and cancer: are MeCpGs more important than MBDs. Oncogene, 2002, 21, 5394-9.
183. Prowse AH, Webster AR, Richards FM, Richard S, Olschwang S, Resche F, Affara NA, Maher ER. Somatic inactivation of the VHL gene in Von Hippel-Lindau disease tumors. Am J Hum Genet., 1997, 60, 765-771.
184. Qian XL, Vonwronski MA, Brent TP. Localization of methylation sites in the human 0-6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter correlation with gene suppression. Carcinogen., 1995,16, 1385-90.
185. Qu GZ, Dubeau L, Narayan A, YuMC, Ehrlich M. Satellite DNA hypomethylation vs overall genomic hypomethylation in ovarian epithelial tumors of diVerent malignant potential. Mutat Res Fund Mol Mech Mutagens., 1999, 423, 91 -101.
186. Rader JS, Gerhard DS, O'Sullivan MJ, Li Y, Li L, Liapis H and Huettner PC. Cervical intraepithelial neoplasia III shows frequent allelic loss in 3p and 6p. Genes Chrom. Cancer, 1998, 22, 57-65.
187. Rader JS, Kamarasova T, Huettner PC, Li L, Li Y, Gerhard DS. Allelotyping of all chromosomal arms in invasive cervical cancer. Oncogene., 1996, 13, 2737-2741.
188. Ramsahoye BH, Biniszkiewicz D, Lyko F, Clark V, Bird AP, Jaenisch R. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proc Natl Acad Sci USA., 2000, 97, 5237-42.
189. Rathi A, Virmani AK, Schorge JO, Elias KJ, Maruyama R, Minna JD, Мок SC, Girard L, Fishman DA, Gazdar AF. Methylation Profiles of Sporadic Ovarian Tumors and nonmalignant Ovaries from High-Risk Women. Clin Cancer Res., 2002, 8,3324-3331.
190. Raschle M, Dufner P, Marra G, Jiricny J. Mutations within the hMLHl and hPMS2 subunits of the human MutL-alpha mismatch repair factor affect its ATP-ase activity, but not its ability to interact with hMutS-alpha. J Biol Chem., 2002, 277, 21810-20.
191. Richard F, Pacyna-Gengelbach M, Schluns K, Fleige B, Winzer KJ, Szymas J et al., Patterns of chromosomal imbalances in invasive breast cancer. Int. J. Cancer, 2000, 89, 305-310.
192. Rideout WM 3rd, Coetzee GA, Olumi AF, Jones PA. 5-Methylcytosine as an endogenous mutagen *■ in the human LDL receptor and p53 genes. Science., 1990, 249, 1288-90.
193. Riggs AD, Jones PA. 5-methylcytosine, gene regulation, and cancer. Adv Cancer Res., 1983, 40, 1-30.
194. Rice JC, Futscher BW. Transcriptional repression of BRCA1 by aberrant cytosine methylation, his-tone hypoacetylation and chromatin condensation of the BRCA1 promoter. Nucleic Acids Res., 2000, 28, 3233-9.
195. Rice JC, Massey Brown KS, Futscher BW. Aberrant methylation of the BRCA1 CpG island promoter is associated with decreased BRCA1 mRNA in sporadic breast cancer cells. Oncogene., 1998, 17, 1807-12.
196. Robertson KD, Uzvolgyi E, Liang G, Talmadge C, Sumegi J, Gonzales FA, Jones PA: The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors. Nucleic Acids Res., 1999,27,2291-2298.
197. Robertson KD, Wolffe AP.DNA methylation in health and disease. Nat Rev Genet., 2000, 1,11-19.i
198. Rountree MR, Bachman KE, Baylin SB. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat Genet., 2000, 25,269-77.
199. Sadri R, Hornsby PJ. Rapid analysis,of DNA methylation using new restriction enzyme sites created by bisul.te modi.cation. Nucleic Acids Res., 1996, 24, 5058-5059.
200. Saito Y, Takazawa H, Uzawa K, Tanzawa H, Sato K. Reduced expression of E-cadherin in oral squamous cell carcinoma: relationship with DNA methylation of 5' CpG island. Int J Oncol., 1998, 12, 293-8.
201. Salem CE, Markl IDC, Bender CM, Gonzales FA, Jones PA, Liang GN. PAX6 methylation and ectopic expression in human tumor cells. Int J Cancer., 2000, 87, 179-85.
202. Salvesen HB, MacDonald N, Ryan A, Jacobs IJ, Lynch ED, Akslen LA, Das S. PTEN methylation is associated with advanced stage and microsatellite instability in endometrial carcinoma. Int J Cancer., 2001,91,22-6.
203. Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Press 1989.
204. Samoylova E, Shaikhaev G, Petrov S, Kisseljova N, Kisseljov F. HPV infection in cervical-cancer " cases in Russia Int. J. Cancer., 1995, 61,337-341.
205. Sanchez-Cespedes M, Esteller M, Wu L, Nawroz-Danish H, Yoo GH, Koch WM, Jen J, Herman JG, Sidransky ' D. Gene promoter hypermethylation in tumors and serum of head and neck cancer patients, Cancer1. Res., 2000, 60, 892-895.
206. Schmutte C, Jones PA. Involvement of DNA methylation in human carcinogenesis. Biol Chem., 1998,379,377-88.
207. Sekido Y, Ahmadian M, Wistuba II, Latif F, Bader S, Wei MH, Duh FM, Gazdar AF, Lerman MI and Minna JD. Cloning of a breast cancer homozygous deletion junction narrows the region of search fora3p21.3 tumor suppressor gene. Oncogene., 1998,16,3151-3157.
208. Sharrard RM, Royds JA, Rogers S, Shorthouse AJ. Patterns of methylation of the c-myc gene in human colorectal cancer progression. Br J Cancer., 1992, 65, 667-72.
209. Shen JC, Rideout WM 3rd, Jones PA. The rate of hydrolytic deamination of 5-methylcytosine in double-stranded DNA. Nucleic Acids Res., 1994, 22, 972-6.
210. Shi H, Maier S, Nimmrich I, Yan PS, Caldwell CW, Olek A and Huang TH-M. Oligonucleotide-Based Microarray for DNA Methylation Analysis: Principles and Applications. J. Cell. Biochem., 2003,88, 138-143.
211. Shin S, Verma IM. BRCA2 cooperates with histone acetyltransferases in androgen receptor-mediated transcription. Proc Natl Acad Sci USA., 2003,100, 7201-6.
212. Shivakumar L, Minna JD, Sakamaki T, Pestell RG and White MA. The RASSFIA tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation. Mol. Cell. Biol., 2002, 22, 43094318.
213. Sirchia SM, Ferguson AT, Sironi E, Subramanyan S, Orlandi R, Sukumar S, Sacchi N: Evidence of epigenetic changes affecting the chromatin state of the retinoic acid receptor в2 promoter in breast cancer cells. Oncogene., 2000, 19, 1556-1563.
214. Sirchia SM, Ren M, Pili R, Sironi E, Somenzi G, Ghidoni R, Toma S, Nicolo G, Sacchi N. Endogenous reactivation of the RARbeta2 tumor suppressor gene epigenetically silenced in breast. Cancer Res., 2002, 62, 2455-61
215. Stanbridge EJ. Human tumor suppressor genes. Annu. Rev. Genet., 1990, 24, 615-657.
216. Stirzaker C, Millar DS, Paul CL, Warnecke PM, Harrison J, Vincent PC, Frommer M, Clark SJ. Extensive DNA methylation spanning the Rb promoter in retinoblastoma tumors. Cancer Res., 1997, 57, 2229-37.
217. Sugimura T and Ushijima T. Genetic and epigenetic alterations in carcinogenesis. Mutat. Res., 2000, 462, 235-246.
218. Sugimura J, Tamura G, Suzuki., Fujioka T. Allelic loss on chromosomes 3p, 5q and 17p in renal cell carcinomas. Pathol. Int., 1997, 47, 79-83.
219. Sundaresan V, Chung G, Heppell-Parton A, Xiong J, Grundy C, Roberts I, James L, Cahn A, Bench A, Douglas J, Minna J, Sekido Y, Lerman M, Latif F, Bergh J, Li H, Lowe N, Ogilvie D and RabbittsP. Oncogens, 1998a, 17, 1723-1729.
220. Sundaresan V, Roberts I, Bateman A, Bankier A, Sheppard M, Hobbs C, Xiong J, Minna J, Latif F, Lerman M and Rabbitts P. Mol. Cell. Neurosci., 1998b, 11,29-35.
221. Suzuki H, Itoh F, Toyota M, Kikuchi T, Kakiuchi H, Imai K. Inactivation of the 14-3-3 sigma gene is associated with 5' CpG island hypermethylation in human cancers. Cancer Res., 2000, 60, 4353-7.
222. Siikosd F, Kuroda N, Beothe T, Kaur AP and Kovacs G. Deletion of chromosome 3pl4.2-p25 involving the VHL and FHITgenes in conventional renal cell carcinoma. Cancer Res., 2003, 63, 455— 457
223. Tanaka H, Shimada Y, Harada H, Shinoda M, Hatooka S, Imamura M, Ishizaki K. Methylation of the 5' CpG island of the FHIT gene is closely associated with transcriptional inactivation in esophageal squamous cell carcinomas. Cancer Res., 1998, 58, 3429-34.
224. Teitz T, Wei T, Valentine MB, Vanin EF, Grenet J, Valentine VA, Behm FG, Look AT, Lahti JM, Kidd VJ. Caspase 8 is deleted or silenced preferentially in childhood neuroblastomas with amplification of MYCN. Nat Med., 2000, 6, 529-35.
225. Tomlinson IP.M, Novelli MR, Bodmer WF. The mutation rate and cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996, 93, 14800-14803.
226. Toyota M, Shen L, Ohe-Toyota M, Hamilton SR, Sinicrope FA, Issa JPJ. Aberrant methylation of the cyclooxygenase 2 CpG island in colorectal tumors. Cancer Res., 2000, 60,4044-8.
227. Toyota M, Ho C, Ohe-ToyotaM, Baylin SB, Issa JPJ. Inactivation of CACNA1G, a T-type calcium channel gene, by aberrant methylation of its 5' CpG island in human tumors. Cancer Res., 1999, 59, 4535-41.
228. Trusolino L and Comoglio PM. Scatter-factor and semaphorin receptors: cell signalling for invasive growth. Nature Reviews Cancer., 2002, 2, 289-300.
229. Tse C, Xiang RH, Bracht T and Naylor SL. Human Semaphorin 3B (SEMA3B) located at chromosome 3p21.3 suppresses tumor formation in an adenocarcinoma cell line. Cancer Res., 2002, 62, 542-546.
230. Tycko B. Epigenetic gene silencing in cancer. J Clin Invest., 2000,105, 401-7.
231. Ullmann R, Schwendel A, Klemen H, Wolf G, Petersen I, Popper HH. Unbalanced chromosomal aberrations in neuroendocrine lung tumors as detected by comparative genomic hybridization. Hum. Pathol., 1998,29, 1145-1149.
232. Umayahara K, Numa F, Suehiro Y, Sakata A, Nawata S, Ogata H, Suminami M, Sasaki К and Kato H. Genetic alterations related to lymph node metastasis and peritoneal dissemination in epithelial ovarian cancers. Genes Chrom. Cancer., 2002,33, 98-102.
233. Vachtenheim J, Horakova I, Novotna H. Hypomethylation of CCGG sites in the 3* region of H-ras protooncogene is frequent and is associated with H-ras allele loss in non-small cell lung cancer. Cancer Res., 1994, 54, 1145-8.
234. Van den Berg A and Buys CHCM. Involvement of multiple loci on chromosome 3 in renal cell cancer development. Genes Chrom. Cancer, 1997, 19, 59-76.
235. Van den Berg A, Kooy RF, Hulsbeek MMF, de Jong D, Kok K, van der Veen AY and Buys CHC.M. Ordering of polymorphic markers in the chromosome region 3p21. Cancer Genet. Cytogenet., 1996, 72, 225-228.
236. Varella-Garcia M, Gemmill RM, Rabenhorst SH, Lotto A, Drabkin HA, Archer PA, Franklin WA. Chromosomal duplication accompanies allelic loss in non-small cell lung carcinoma. Cancer Res., 1998, 58, 4701-4707.
237. Vaziri H and Benchimol S. Alternative pathways for the extension of cellular life span: inactivation of p53/pRb and expression of telomerase. Curr. Biol., 1998, 8, 279-282.
238. Velickovic M, Delahunt B, and Grebe SKG. Loss of Heterozygosity at 3pl4.2 in Clear Cell Renal Cell Carcinoma Is an Early Event and Is Highly Localized to the FHIT Gene Locus. Cancer Res., 1999,59,1323-1326.
239. Virmani AK, Fong KM, Kodagoda D, Mclntire D, Hung J, Tonk V, Minna JD., Gazdar A.F. Al-lelotyping demonstrates common and distinct patterns of chromosomal loss in human lung cancer types. Genes Chrom. Cancer, 1998, 21, 308-319.
240. Virmani AK, Muller C, Rathi A, Zoechbauer-Muleller S, Mathis M, Gazdar AF: Aberrant methylation during cervical carcinogenesis. Clin Cancer Res., 2001, 7, 584-589
241. Vos MD, Ellis CA, Bell A, Birrer MJ and Clark GJ. Ras uses the novel tumor suppressor RASSF1 as an effector to mediate apoptosis. J. Biol. Chem., 2000, 275, 35669-35672.
242. Widschwendter M, Berger J, Muller HM, Zeimet AG and Marth C. Epigenetic downregulation of the retinoic acid receptor-<?2 gene in breast cancer J. Mam. Gl. Biol. andNeop., 2001, 6, 193-201
243. Wistuba II, Beny J, Behrens C, Maitra A, Shivapurkar N, Milchgrub S, Mackay B, Minna JD, Gazdar AF. Molecular changes in the bronchial epithelium of patients with small cell lung cancer. Clin Cancer Res., 2000a, 6, 2604-10.
244. Wolffe AP. Histone-deacetylase: a regulator of transcription. Science, 1996, 272, 371-372.
245. Wong KK, Chang S, Weiler SR, Ganesan S, Chaudhuri J, Zhu C, Artandi S.E. et al., Nat. Genet., 2000, 26, 85-88.
246. Wong IH, Lo YM, Johnson PJ. Epigenetic tumor markers in plasma and serum: biology and applications to molecular diagnosis and disease monitoring. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2001, 945, 36-50.
247. Woodcock DM, Lawler CB, Linsenmeyer ME, Doherty JP, Warren WD. Asymmetric methylation in the hypermethylated CpG promoter region of the human LI retrotransposon. J Biol Chem., 1997, 272,7810-16.
248. Wooster R, Neuhausen SL, Mangion J, Quirk Y, Ford D, Collins N, Nguyen K, Seal S, Tran T, Averill D. Localization of a breast cancer susceptibility gene, BRCA2, to chromosome 13ql2-13. Science, 1994, 265, 2088-2090.
249. Worm J, Bartkova J, Kirkin AF, Straten PT, Zeuthen J, Bartek J, Guldberg P. Aberrant p27(Kipl) promoter methylation in malignant melanoma. Oncogene., 2000, 19, 5111-15.
250. Wright WE, Piatyszek MA, Rainey WE, Byrd W, Shay JW. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. Dev.Genet., 1996,18, 173-179.
251. Xiang R, Davalos AR, Hensel CH, Zhou XJ, Tse C, Naylor SL. Semaphorin 3F gene from human 3p21.3 suppresses tumor formation in nude mice. Cancer Res., 2002, 62, 2637-43.
252. Xie S,Wang Z,Okano M,Nogami M, Li Y,He WW,Okumura K, Li E. Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. Gene., 1999, 236, 87-95.
253. Z. Xiong, P.W. Laird, COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res., 1997, 25, 2532-2534.
254. Xu X-C, Ro JY, Lee JS, Shin DM, Hong WK and Lotan R. Differential expression of nuclear retinoid receptors in normal, premalignant and malignant head and neck tissues. Cancer Res., 1994, 54, 3580-3587.
255. Yamato T, Orikasa K, Fukushige S, Orikasa S, Horii A. Isolation and characterization of the novel gene, TU3A, in a commonly deleted region on 3pl4.3-pl4.2 in renal cell carcinoma. Cytogenet Cell Genet., 1999,87, 291-295.
256. Yan J, Zhu J, Zhong H, Lu Q, Huang C, Ye Q. BRCA1 interacts with FHL2 and enhances FHL2 transactivation function. FEBS Lett., 2003, 553, 183-9.
257. Yang H, Jeffrey PD, Miller J, Kinnucan E, Sun Y, Thoma NH, Zheng N, Chen PL, Lee WH, Pav-Ietich NP. BRCA2 function in DNA binding and recombination from a BRCA2-DSSl-ssDNA structure. Science., 2002, 297, 1837-48
258. Yang X, Lippman ME. BRCA1 and BRCA2 in breast cancer. Breast Cancer Res Treat., 1999, 54, 1-10.
259. Yang Q, Yoshimura G,-Mori I, Sakurai T, Kakudo K. Chromosome 3p and breast cancer. J Hum Genet., 2002, 47, 453-459.
260. Yeo M, Lin PS, Dahmus ME, Gill GN. A novel RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase that preferentially dephosphorilates serine 5. J. Biol. Chem. 2003, 278, 26078-26085.
261. Yoder JA, Walsh CP, Bestor TH: Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends Genet., 1997,13,335-340.
262. Yoon JH, Dammann R and Pfeifer GP. Hypermethylation of the CpG island of the RASSF1A gene in ovarian and renal cell carcinomas. Int. J. Cancer., 2001, 94, 212-217.
263. Yu X, Chini СС, He M, Mer G, Chen J. The BRCT domain is a phospho-protein binding domain. Science., 2003, 302, 639-42.
264. Zabarovska V, Li J, Muravenko O, Fedorova L, Braga E, Ernberg I, Wahlestedt C, Klein G and Zabarovsky ER. CIS-cloning of identical sequences between two complex genomes. Chromosome Res., 2000, 8, 77-84.
265. Zabarovsky ER, Lerman MI, Minna JD. Tumor Suppressor Genes on Chromosome 3p Involved in the Pathogenesis of Lung and Other Cancers. Oncogene., 2002, 21, 6915-6935.
266. Zabarovsky ER, Kashuba VI, Kholodbnyuk ID, Zabarovska VI, Stanbridge EJ, Klein G. Rapid mapping of Notl linking clones with differential hybridization and Alu-PCR. Genomics., 1994, 21, 486-489.
267. Zardo G, Caiafa P. The unmethylated state of CpG islands in mouse fibroblasts depends on the poly(ADPribosyl) ation process. J Biol Chem., 1998,273, 16517-20.
268. Zhang GL, Xu KL. Loss of heterozygosity at chromosome 3p in epithelial ovarian cancer in China. Int J Gynecol Cancer., 2002,12, 198-201.
269. Zochbauer-Muller S, Gazdar AF and Minna JD. Molecular pathogenesis of lung cancer. Annu. Rev. Physiol., 2002, 64, 681-708.
270. Zochbauer-Muller S, Fong KM, Virmani AK, Geradts J, Gazdar AF and Minna JD. Aberrant promoter methylation of multiple genes in non-small cell lung cancers Cancer Res., 2001, 61, 249-255
-
Логинов, Виталий Игоревич
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.03
- Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях
- Изменение уровней экспрессии генов из критичных районов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях разных локализаций
- Идентификация потенциальных онкогенов и генов-супрессоров эпителиальных опухолей человека
- Идентификация генов-супрессоров опухолевого роста на коротком плече хромосомы 3 человека и возможные пути их инактивации
- Дифференциальная экспрессия онкозначимых генов при светлоклеточном раке почки
