Идентификация потенциальных онкогенов и генов-супрессоров эпителиальных опухолей человека

Брага, Элеонора Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Идентификация потенциальных онкогенов и генов-супрессоров эпителиальных опухолей человека
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация потенциальных онкогенов и генов-супрессоров эпителиальных опухолей человека"

На правах рукописи

БРАГА ЭЛЕОНОРА АЛЕКСАНДРОВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ОНКОГЕНОВ И ГЕНОВ-СУПРЕССОРОВ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА

03.00 03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2007

003159682

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии (зав проф В В Носиков) Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва) и Лаборатории почечно-кпеточного рака (зав проф Е Р Забаровский) Центра микробиологии и биологии опухолей Каролинского института (Стокгольм)

Официальные оппоненты* доктор биологических наук, профессор

Петр Михайлович ЧУМАКОВ

(Институт молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН)

доктор медицинских наук Александр Сергеевич БЕЛОХВОСТОВ

(Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии РЗ)

доктор биологических наук Юрий Борисович ЛЕБЕДЕВ

(Институт биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН)

Ведущая организация: Медико-генетический научный центр РАМН

Защита диссертации состоится "25" октября 2007 г в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002 235 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте молекулярной биологии им В А Энгельгардта РАН по адресу 119991, ГСП-1, ул Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМБ РАН Автореферат разослан 2007 г

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ Диссертационного совета кандидат химических наук

А М Крицы н

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК - комплиментарная ДНК мРНК- матричная (информационная) РНК МС-ПЦР - метилспецифичная ПЦР

МЧРА - анализ с применением метилчувствительных рестриктаз ОТ-ПЦР - ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР-РВ - количественная ПЦР в режиме реального времени

AI - дисбаланс аллелей (allelic imbalance)

АР-20 - район TSG, перекрываемый Alu-ПЦР-клоном 20

ВС - рак молочной железы (breast carcinoma)

СС - рак шейки матки (cervical carcinoma)

DAG1 - ген дистрогликана

DUTT1 - отсутствующий в линии клеток SCLC U2020 (Deleted in U Twenty Twenty)

EOC - эпителиальные опухоли яичников (ovarian epithelial carcinomas)

GPX1 - ген глутатионпероксидазы

HD - гомозиготная делеция

ЮН - потеря гетерозиготности

LUCA -район TSG рака легкого (lung cancer)

МЕСАЗ - 3-ий критичный район в области Зр21 3 (Meja Epithelial Cancer 3) MST1 - ген макрофаг-стимулирующего фактора MST1R/RON - ген рецептора MST1 (или MSP)

NPRL2 - аналог 2 регулятора азот-пермеазы (nitrogen permease regulator like-2) NSCLC - немелкоклеточный рак легкого (non-small cell lung cancer) Зр - короткое плечо хромосомы 3 человека

RASSF1 - ген белка, содержащего домен гомологичный онкогену ras, семейства 1 (Ras association domain family 1)

CTDSPL / RBSP3 - ген малой С-концевой фосфатазы (полипептид А РНК

полимеразы II), ген серин-специфичной фосфатазы на Зр, активирующей RB1 (RB1

serine phosphatase from human chromosome 3)

RHOA - ген ras-гомологичной малой гуанозин-трифосфатазы

RCC - почечноклеточный рак почки (renal cell carcinoma)

SAGE - серийный анализ экспрессии генов (serial analysis of gene expression)

SEMA3B - ген семафорина семейства ЗВ

SCLC - мелкоклеточный рак легкого (small cell lung cancer)

TSG - ген-супрессор опухолевого роста (tumor suppressor gene)

USP4 - ген убиквитин-специфичной протеазы 4

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Предполагается, что в основе малигнизации лежит каскадный процесс генетических повреждений, затрагивающих не менее 20 генов Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов, или факторов позитивного контроля деления клеток, а затем - «антионкогенов», или генов-супрессоров опухолевого роста (TSG), осуществляющих негативный контроль клеточного роста Онкогены активируются в опухолях по доминантному механизму и стимулируют развитие опухоли Напротив, TSG инакгивируются в опухолях по рецессивному типу с повреждением обоих родительских аллелей В случае сохранности некоторых критичных TSG (например, гена р53) в клетке, подверженной неопластическим изменениям, эти TSG могут вызвать остановку клеточного цикла или ее программируемую смерть (апоптоз), и таким образом, остановить или замедлить опухолевый рост TSG могут также участвовать в репарации мутаций, в подавлении нео-ангиогенеза, инвазии и метастазирования и в регуляции теломеразной системы Данное исследование посвящено поиску и локализации новых TSG и онкогенов на хромосоме 3 человека Еще два десятилетия назад было показано, что геми- и гомозиготные делеции наблюдаются на коротком плече хромосомы 3 (Зр) в разнообразных солидных опухолях, причем среди других хромосом, именно Зр повреждается с наибольшей частотой в опухолях легкого и почки Функциональное изучение субхромосомных фрагментов Зр показало, что они обладают способностью к подавлению роста опухолей Долгое время на хромосоме 3 человека оставалось известным лишь два TSG (ген наследуемого рака почки, VHL, и ген системы репарации, MLH1) Таким образом, представляется обоснованным и актуальным направленный систематический поиск новых кандидатов в TSG и онкогены в этом важном в отношении канцерогенеза геномном районе

Важную роль в поиске таких генов сыграли работы, направленные на локализацию наиболее часто повреждаемых, так называемых «критичных» районов Зр, потенциально содержащих TSG и онкогены Основной подход к локализации критичных районов основан на применении полиморфных маркеров К 1993 г генетическая карта второго поколения генома человека содержала 550 локализованных полиморфных маркеров, главным образом, динуклеотидных (разрешение около 5 сМ) Для позиционного клонирования «больных генов» требовалось увеличить количество маркеров в 5-10 раз В связи с этим было целесообразно провести скрининг новых ди-, три- и тетрануклеотидных микросателлитов, в частности, на хромосомах 3 и 13, связанных с развитием онкологических и многих других генетически обусловленных заболеваний

В последние 10 лет новый подъем наблюдается в области исследований эпигенетической модификации ДНК Метилирование ДНК обнаружено при разнообразных биологических процессах, но наиболее резкие изменения отмечены при эмбриогенезе и онкогенезе Кроме гипометилирования генома в целом, в опухолях наблюдают выраженные изменения метилирования промоторных областей многих генов, приводящие к «умолканию» TSG и активации протоонкогенов Выявление новых генов, изменяющих профиль метилирования

промоторных областей в опухолях, - новый путь поиска генов-кандидатов на роль TSG и онкогенов Кроме того, данные по изменению профилей метилирования промоторных областей TSG и онкогенов в опухолях можно использовать для разработки панелей принципиально новых эпигенетических онкомаркеров Таким образом, идентификация на Зр новых потенциальных TSG и онкогенов и их комплексный анализ представляется крайне актуальным для фундаментальной молекулярной биологии, онкогеномики и практической онкологии Цель и задачи исследования. Данная работа направлена на идентификацию генов, связанных с этиологией и патогенезом эпителиальных опухолей молочной железы, почки, легкого, яичников и шейки матки, которые относят к социально опасным и распространенным формам злокачественных новообразований В соответствии с поставленной целью основные задачи исследования состояли в следующем

1 Поиск микросателлитов в клонах, локализованных на хромосомах 3 и 13, и идентификация новых полиморфных маркеров

2 Анализ аллельных дисбалансов высоко-полиморфных микросателлитных маркеров короткого плеча хромосомы 3 в эпителиальных опухолях пяти локализаций Определение наиболее часто повреждаемых, т н «критичных» районов Зр, в которых могут содержаться кандидаты на роль TSG и онкогенов

3 Анализ изменения уровня мРНК и структурных изменений в некоторых функционально важных генах из «критичных» районов Зр в клеточных линиях и первичных опухолях

4 Определение профиля метилирования промоторных областей некоторых потенциальных TSG и онкогенов Зр (RASSF1A, SEMA3B, RHOA и MST1R/RON) в эпителиальных опухолях разных локализаций

Научная новизна и практическая ценность работы Проведен поиск микросателлитов в ДНК 150 Л/ой-клонов хромосомы 3, 22 космид из области Зр21 3 (наиболее часто повреждаемой в эпителиальных опухолях) и упорядоченной клонотеки космид хромосомы 13 Впервые выявлены следующие особенности распределения ди-, три- и тетрануклеотидных микросателлитов на хромосомах 3 и 13 Микросателлиты CAG, ААТ, GGA, AAAG, AATG и GATG, распространенные в кодирующих и прилежащих к ним последовательностях, встречаются в ДНК Afofl-клонов хромосомы 3 и в космидах из области Зр21 3 в 3-10 раз чаще, чем в геноме в целом Напротив, повторы (СА)„, которые на 97% относятся к некодирующим областям, обнаружены в 3 раза реже ожидаемого Для хромосомы 13 характерно сблоченное расположение и сокластеризация с рДНК микросателлитов пяти мотивов GACA, GACT, САС, ТСС и GA Мотив GATG распределен независимо от семейства средних повторов рДНК и может быть применен для картирования хромосомы 13 и других ядрышкообразующих хромосом - 14, 15, 21 и 22 Определена первичная структура ранее не идентифицированных микросателлитов и прилежащих нуклеотидных последовательностей (более 30 т п н) и исследован полиморфизм новых локусов микросателлитов, что позволило идентифицировать 7 новых полиморфных и 8 не полиморфных STS-маркеров на хромосомах 3 и 13 Впервые проведен анализ частоты аплельных потерь на Зр в опухолях пяти

локализаций с использованием идентичного набора полиморфных маркеров (более 20 маркеров) В результате определены часто повреждаемые в эпителиальных опухолях, т н «критичные» районы, содержащие потенциальные TSG Впервые локализован новый критичный район МЕСАЗ, содержащий группу генов (RHOA, MST1, MST1R/RON, GPX1, DAG1, USP4 и др), связанных с развитием опухолей, и выявлены изменения уровня мРНК этих генов в эпителиальных опухолях разных локализаций Так, в случае гена GPX1, как и TSG SEMA3B, преобладало понижение, а в случае онкогена RHOA - повышение уровня мРНК в опухолях почки и молочной железы Выявлены структурные дефекты во многих генах, объясняющие наблюдаемые изменения уровня мРНК

Впервые обнаружено метилирование промоторной области гена RASSF1A в опухолях почки и яичников, которое сопровождалось потерей или снижением уровня мРНК этого гена, что позволило отнести ген RASSF1A к кандидатам на роль TSG рака почки и яичников Впервые показано метилирование дистального промоторного CpG-островка гена SEMA3B в опухолях почки, молочной железы и яичников, и выявлена связь метилирования этого CpG-островка со снижением уровня мРНК гена Впервые показана корреляция степени метилирования промоторных областей TSG RASSF1A и SEMA3B с клинической стадией и степенью злокачественности опухолей почки, молочной железы и яичников Впервые обнаружено изменение копийности и профиля метилирования промоторной области онкогена RHOA в опухолях молочной железы и почки и показано, что повышение уровня мРНК этого гена в опухолях может быть вызвано умножением копий гена RHOA и/или деметилированием его промоторной области

Практическая ценность исследования основана на идентификации новых генов, связанных с развитием опухолей, и выявлением структурных (профиль метилирования, копийность) и функциональных (уровень мРНК) изменений в этих генах в опухолях Анализ этих изменений может быть использован в качестве диагностических тестов, а также в качестве «мишеней» направленной терапии опухолей Так, нами показано, что метилирование промоторных областей генов RASSF1A и SEMA3B можно обнаружить уже на ранней, доклинической стадии опухолевого процесса (до возникновения морфологических изменений в ткани) В связи с этим данные тесты целесообразно использовать с целью ранней диагностики эпителиальных опухолей С другой стороны, достоверная корреляция степени метилирования промоторных областей TSG RASSF1A и SEMA3B с прогрессией опухолей разной локализации означает, что эти гены, несомненно, представляют интерес и как прогностические маркеры, - для мониторинга течения заболевания и оценки эффективности его лечения Кроме того, в данной работе выявлена корреляция частоты аллельных изменений некоторых высокополиморфных маркеров из районов Зр LUCA, АР20 и МЕСАЗ с клинической стадией и степенью злокачественности почечноклеточного рака и серозной аденокарциномы яичников, что указывает на возможную роль в прогрессии этих форм рака и некоторых других генов из этих районов Новые полиморфные маркеры на хромосомах 3 и 13 нашли применение в медико-генетических исследованиях Большинство Л/оА-маркеров хромосомы 3 находятся в 5'-

нетранслируемых участках генов, и они были использованы для уточнения локализации этих генов и для совмещения физических, генетических и функциональных карт хромосомы 3 человека

Апробация работы Результаты работы доложены на российских конференциях "Геном человека" (1993, 1996, 1998, 1999, 2000, 2001 и 2002 гг), российских съездах онкологов (2003, 2006 гг), международных собраниях Организации по изучению генома человека (Human Genome Organization Meetings, 1996, 1998,1999, 2001, 2002, 2003 и 2006 гг), международных собраниях по генетике человека (European Society Human Genetic Meetings, 1995, 1996, 1997, 1998 гг), 17"™ Международном конгрессе по изучению рака (17 International Cancer Congress, 1998), на Конференциях Американской Ассоциации по исследованиям рака (AACR Conferences on Frontiers in Cancer Prevention Research, 2002, 2003), 1-й Конференции Федерации Европейского Сообщества по Функциональной Геномике (1-st European Society Federation Conference on Functional Genomics, 2003), на 28й и 31й Конференциях Федерации Европейских Биохимических обществ (28th, 31th Meetings of the Federation of European Biochemical Societies, 2002, 2005), на четырех Всемирных Конгрессах по достижениям в области Онкологии и четырех Международных симпозиумах по Молекулярной Медицине (8th -11th World Congress on Advances in Oncology and 6th - 9th International Symposia on Molecular Medicine, 2003, 2004, 2005, 2006) и других российских и международных симпозиумах Суммарно на этих конференциях представлено более 50 тезисных сообщений, главным образом, в виде постеров и частично в виде докладов Публикации По материалам диссертации опубликовано 24 статьи в рецензируемых журналах (из них 11 - в отечественных и 13 - в международных), в том числе три обзора в отечественных журналах

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов Список цитированной литературы содержит 385 названий Диссертационная работа изложена на 281 странице машинописного текста, содержит 38 таблиц и 82 рисунка

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Основные материалы 1 150 /Vofl-связующих и Л/oíl-прыжковых клонов хромосомы 3 человека сконструированы в лабораториях Л Л Киселева (Институт молекулярной биологии, РАН) и Е Р Забаровского (Центр микробиологии и биологии опухолей, Каролинский институт, Швеция), 22 косм иды (Зр2131) получены из лаборатории М И Лермана, (Национальный институт рака - Фредерик, США) Упорядоченная космидная клонотека хромосомы 13 ICRF (UK С108, 12000 клонов) предоставлена Н К Янковским (Институт общей генетики, РАН) 2. Образцы опухолевой и прилежащей гистологически нормальной ткани легкого, почки, молочной железы и яичников собраны в Отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра им Н Н Блохина РАМН (В Д Ермиловой) Образцы ДНК рака шейки матки предоставлены Ф Л Киселевым (Лаборатория вирусов, НИИ Канцерогенеза, РОНЦ РАМН) Кпинико-генеалогические данные пациентов собраны сотрудниками

Лаборатории клинической онкогенетики НИИ КО РОНЦ РАМН (Т П Казубской и Р Ф Гарькавцевой) Использовали ткани только тех больных, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию Все образцы опухолевых тканей охарактеризованы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза (UICC, версия 2002 г) и типированы гистологически на основании классификации Всемирной Организации Здравоохранения В данной работе исследованы парные (опухоль/норма) образцы пяти форм рака (более 400 случаев) А именно, светлоклеточного почечнокпеточного рака (RCC), рака молочной железы (ВС, преимущественно представлены случаи с протоковой и дольковой гистологией), эпителиальные опухоли яичников (ЕОС, разной гистологии, наиболее представлен серозный рак), немелкоклеточный рак легкого (NSCLC, наиболее представлены плоскоклеточная карцинома и аденокарцинома) и плоскоклеточный рак шейки матки (СС) Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (толщина 3-5 мкм), окрашенных эозином и гематоксилином Отбирали образцы с содержанием опухолевых клеток не менее 70% Образцы тканей хранили при -70°С В качестве контролей использовали лимфоциты периферической крови 15 здоровых доноров и образцы тканей легкого, почки, молочной железы и яичников от 3-х человек, онкологически здоровых в анамнезе Основные методы: дот- и блот-гибридизация ДНК клонов и фрагментов ДНК, расщепление ДНК рестриктазами, лигирование фрагментов ДНК, получение компетентных клеток £ coli JM109 и DH5a и трансформация плазмидной ДНК, электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном и полиакриламидном гелях (ПААГ), окрашивание фрагментов ДНК в ПААГ азотнокислым серебром, определение нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов, выделение РНК и ДНК из клеточных культур и из образцов первичных опухолей, анализ аллельных дисбалансов полиморфных маркеров в ДНК опухолей и мультиплексная ПЦР, синтез кДНК и ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), количественная ПЦР в реальном времени на основе кДНК (ПЦР-РВ), компьютерный анализ баз данных SAGE (серийный анализ экспрессии генов), анализ ДНК с применением метилчувствительных рестриктаз (МЧРА), бисульфитная конверсия ДНК, метилспецифичная ПЦР (МС-ПЦР) и бисульфитное секвенирование, основные статистические методы - критерий Фишера, ранговая корреляция Спирмана с использованием t-теста Стьюдента

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Часть 1 Идентификация микросателлитных маркеров на хромосомах 3 и 13.* Микросателлиты на хромосоме 3

Ранее для нуклеотидных последовательностей, прилежащих к A/ofl-участкам в A/ofl-связующих и А/ой-прыжковых клонах хромосомы 3 человека, показано выокое содержание CpG-островков, ассоциированных с генами, и нуклеотидных последовательностей, гомологичных мРНК и известным генам (Zabarovsky et al,

'Выполнено в рамках российской программы «Геном Человека» и в сотрудничестве с соавторами из ИМБ РАН, ИОГен РАН и ИБГ РАН

1990, Allikmets et al, 1994) В связи с этим для создания маркеров генов хромосомы 3 проведен скрининг микросателлитов 9-ти мотивов в ДНК 150 /Voil-связующих и /Vofl-прыжковых клонов, локализованных на хромосоме 3 Аналогичный поиск проведен среди 22 космид, перекрывающих область гомозиготных делеций, локализованную в клеточных линиях мелкоклеточного рака легкого (SCLC) (Wei et al, 1996) Этот участок LUCA (Lung Cancer, Зр21 31), как показано (Lerman & Minna, 2000), отличается повышенной плотностью генов Для сопоставления содержания СА-повторов и микросателлитов тринуклеотидных мотивов CAG, GGA, ААТ и САС в клонах хромосомы 3 и в геноме человека в целом использовали данные литературы (Stalhngs etat, 1991, Stellings, 1994, Gastieret al, 1996) и базы данных GenBank (табл 1)

Таблица 1 Сравнение частот встречаемости микросателлитов 9 мотивов в ДНК Л/оЯ-клонов хромосомы 3, в 22 космидах из Зр21 3, в ДНК геномных и кДНК клонотек и в нуклеотидных последовательностях генома человека * ___

Мотив ► Клоны Т CA CAG GGA ААТ САС AAAG AATG GATG GACT

150 A/ofl-связующих и Woil-прыжковых клонов хромосомы 3, 5-15т п н 90 170 750 500 500 170 250 750 1000

22 космиды из Зр21 3, 570 т п н 90 180 550 550 >550 550 140 180 >550

Геном человека 301 13002 200025003 32002 16002 >160002 470 GB 3200 GB 1300 GB >60000 GB

A/oil-связующие клонотеки генома человека, 5-8 т п н , 5000 клонов ** ** 500 ** 4* ** ** 1000

кДНК-клонотека З'-концы, 0 2-0 9 т п н , 4500 клонов „ 400 ** ** ** ** 3000 **

кДНК-клонотека, 5'-концы, Clontech, 0 8-4 5 т п н , 2000 клонов ** 1000 ** 3000 ••

Космидная клонотека хромосомы 13, 35 т п н , 12000 клонов" ** 2000 600 ** 2000 ** ** 1000 1400

"Приведен средний размер участка ДНК, содержащего один локус данного мотива в т п н , ** - не исследовано, GB-GenBank, release 1997,1 Stallmgs et al, 1991,2 Stallmgs et al, 1994, 3 Gastieretal, 199S, "см следующую главу

Для тетрануклеотидных повторов AAAG, AATG, GATG и GACT проведен компьютерный поиск среди нуклеотидных последовательностей генома человека с суммарной длиной 61 4 млн п н (54600 секвенированных участков со средней длиной 1113 пн, GenBank, release 1997) Как показывает сопоставление полученных величин (табл 1), микросателлиты мотивов CAG, ААТ, GGA, AAAG, AATG и GATG, распространенные в кодирующих и прилежащих к ним участках ДНК, встречаются в ДНК A/ofl-связующих и прыжковых клонов хромосомы 3 и в космидах из области Зр21 3 в 3-10 раз чаще, чем в геноме в целом Напротив, повторы (СА)„,

которые относятся на 97% к некодирующим областям (Weber and May, 1989), обнаружены в 3 раза реже ожидаемого

ДНК отобранных нами клонов (в которых выявлены микросателлиты) содержит участки выраженной гомологии с генами, что согласуется с работами (Zabarovsky et al, 1990, Alhkmets et al, 1994) Очевидно, что эти микросателлиты могут быть маркерами соответствующих генов Л/оЯ-связующие клоны - NL1-212, NL-026, NLM-216, Л/оЯ-прыжковый клон J32-135H и космиды 6, 7 и 16 были субклонированы с использованием комбинации рестрикгаз Sau3AVBamH\ В нуклеотидных последовательностях субклонированных фрагментов идентифицированы локусы микросателлитов преимущественно несовершенной мозаичной структуры с числом повторов от 5 до 9 Пример нуклеотидной последовательности, содержащей микросателлитные повторы, показан на рис 1 В результате рекпонирования и определения нуклеотидных последовательностей субклонов (более 11 т п н) идентифицированы 12 локусов микросателлитов

GGATCCTCTG TGAGTTTGAG GCCAGCTTGG TCCAAAGAGT GAGTTCCAGA TAGCCAGAGC 60 TACACAGAGA AACCCTGTCT CAAAGAAAAA GAAAGAAAGA AAGAAAGAAA GAAAGAAAGA 120 AAGAAAGAAA GAAAGAAAGA AAGGAGAAAA GAGAAAAGAA AAGAAAAGAA AAGAAAAGGG 180 GAAAGGAAAA GAGAAAAAAG AAAAGAAAGG AAGAAGGGGA ATGGAGGAGA GAGGGAGGGA 240 AGGAGGGAGA GAGGGAGGNN NGGAGGAAGG GAGGGAAGAA GCCTGCTCTA AAGCATTGCC 300 TTCAAAGCAT GAGGTCTTGA GTTAATCCTA GGAAGTCACG TTTACTCCCA GCACCGGGGA 360 GCTGGAGACA GGTGGATCTG ААССАСАСАС CCTAGGTTGA 400

Рис 1 Фрагмент нуклеотидной последовательности кпона NLM-216, последовательность микросателлитов выделена жирным шрифтом, последовательности праймеров -подчеркнуты

Праймеры и условия ПЦР были подобраны к наиболее протяженным нуклеотидным последовательностям, содержащим микросателлиты (табл 2) Новые полиморфные маркеры идентифицированы в ДНК клонов NL1-024 и NL2-007 Еще один полиморфный локус на Зр выявлен при анализе гетерозиготности EST04896 (из области Зр21), содержащего тринуклеотид (CAG)i7 Локализация EST04896 на хромосоме 3 подтверждена с использованием картирующей панели гибридных кпонов человек/китайский хомячок Полиморфизм микросателлитов исследован с помощью ПЦР с использованием коллекции ДНК из 100 неродственных индивидов Наблюдаемые распределения частот встречаемости генотипов для полиморфных маркеров NL1-024, NL2-007 и EST04896 в исследованной выборке (100 неродственных индивидов) подчиняются равновесию Харди-Вайнберга (вероятность составила 0 99-1 00)

Таким образом, нами на хромосоме 3 суммарно идентифицировано 3 полиморфных (NL1-024, NL2-007 и EST04896) и 6 STS-маркеров (табл 2) Шесть маркеров, в том числе три полиморфных маркера, связаны с генами Все девять маркеров относятся к области частых делеций в ДНК опухолей (Зр21), благодаря чему они нашли применение при картировании районов, содержащих потенциальные TSG или протоонкогены (см часть 2)

Следует отметить, что Wofl-STS-маркеры были использованы для локализации соответствующих /Vofl-связующих и Л/оЯ-прыжковых клонов на хромосоме 3 методом ПЦР-скрининга, в том числе с помощью панелей

радиационных гибридов (GeneBridge 4 RH-panel) (Gyapay et al, 1996) Усилиями нескольких лабораторий этим методом локализовано 60 /Vofl-STS-маркеров на хромосоме 3 человека (Sulimova et al, 2002) Введенные в общедоступные базы данных Wo/l-STS-маркеры могут быть использованы для построения карт и расшифровки нукпеотидной последовательности хромосомы 3 человека любыми участниками международных исследований, выполняемых под эгидой HUGO К настоящему времени на хромосоме 3 идентифицированы и локализованы уже около 200 уникальных Notl-фланкирующих нуклеотидных последовательностей, из которых 90% гомологичны известным генам или EST, что позволило установить локализацию ряда генов и открыть новые белок-кодирующие участки ДНК (Kashuba etal, 1999, Sulimova et al, 2002, Сулимова и dp, 2005) В итоге, создана A/ofl-карта хромосомы 3, которая интегрирована в международную карту полиморфных и STS-маркеров генома человека

Таблица 2 Характеристика полиморфных и STS-маркеров хромосомы 3

Клон / Гомология с геном или EST человека Локализация на Зр Структура повторов в микросателлите Праймеры Mg2+ MM / t°C ПЦР-продукт п H Алл/ Гет/ Ген*

NL1-024 / OSBPHO, оксистерол-связывающий белок Зр21 33 (TG)27 GGCTGGCAGAACAGGTAACG GAGGCATCACTGGGTTCGCTG 25/ 62 140150 6/ 0 64/ 15

NL2-007 / ZDHHC3, белок 3, содержащий DHHC-домен цинковых пальцев Зр21 32 -р21 31 (GT)16 /(GA)13 AGAGCTGGAGTTGACTTAGG CACAGCATCCTAGGACTAGA 30/ 56 154162 51 0 46/ 9

EST04896 Рибосомный белок L14 Зр21 (CAG)17 CTCTCCTGAAAGCTTCTCCC GGCTGGAGCTTTTNACT 1 5/ 50 138153 8/ 0 76/ 27

NLM-216 / cDNA-5 (АА057484) Зр21 3 -р23 (AAAGJjsro TGAGTTCCAGATAGCCAGAGC TTGAAGGCAATGCTTTAGAGC 1 5/ 58 245 1/0 0/1

NL1-212 / а-субъединица метионин-аденозил-трансферазы Зр21 2 (AAAG)13 TGTCACAAAGCCAATGCAGCA AGGCAGAGGCAGGTGGATTTC 1 5/ 60 220 1/0 0/1

J32-135H / hmm31467, предсказанный in silico Зр21 (AAT) 10/13 CCCAGAGAGGGCAAGGGAGTTA GGGAAGTGGAGGTTGCAGTGA 20/ 50 147 1/0 0/1

Космида 6 Зр21 31 (TTCA)6 TCAAGTACATGGGAGCACCTC CCTGGGGTCAAGATTGCAAGA 25/ 58 220 1/0 0/1

Космида 7 Зр21 31 (CATC / AATC)9 GCGTTCCTGCCCGTCAACTC TTCCGCACTGTTCTTCTCCC 1 5/ 60 240 1/0 0/1

Космида13 Зр21 31 (AT)31 TGTCACAAAGCGAATGCAGGA AGGCAGAGGCAGGTGGATTTC 30/ 66 136 1/0 0/1

* Алл/Гет/Ген - Число аллелей/Гетерозиготность/Число генотипов

Микросателлиты на хромосоме 13.

На хромосоме 13 нами исследовано распределение микросателлитов семи мотивов (GACA; GACT, GATG, САС, ТСС, TCG и GA) Проведен скрининг панелей клонов высотой плотности представительной упорядоченной космидной клон отеки хромосомы 13 с зондами на микросателлиты мотивов: GATG, GACT, TCG и др. (рис. 2). В среднем, с использованием каждого зонда проанализировано 12000 клонов, что соответствует 3,7 эквивалента хромосомы 13. Благодаря применению единой панели клонов результаты гибридизации с разными зондами регистрировали для каждого из клонов. Такой подход позволил дифференцировать мотивы по степени их со-кластеризации, а также выявить принадлежность ряда микросателлитов области рДНК. Результаты проведенного анализа позволили также выбрать наиболее эффективные для создания генетических маркеров мотивы микросателлитов.

: ! i ' i б ~ í s a un

* ^РДДИНЫ

ту. » - ■ , ¥

С . '".'! ■ ■■ f

r v* ! ' ^ fit t ( *

"'^-'ЩИт

-ч - <• - •» •'•friSgr Ш

f . ■ ; ' ■

.? J-v ¿{¡S*". - DH

. ШШ l' ilÈlÉK

». : "„ ■ 1. H- * ' « -

Рис. 2. Гибридизация панели 7 (1536 клонов) с зондом (GACT),,. Использована клонотека ICRF C10S, штамм В, coli DH5-a, вектор Lawrist 4, вставка 35,4 т.п.н. 1536 клонов упорядочение) и воспроизводимо размещали на фильтре Hybond N размером 125x85 мм с помощью щеток-реп пика торов Колонии выращивали ночь при 37°С на 18-агаре с канамицином и фиксировали. Цифрами (по горизонтали) и буквами (по вертикали) размечены квадраты, вмещающие по 16 клонов. С каждым из зондов проведена гибридизация 8 панелей (>12000 кпонов).

Анализ содержания микросателлитов в каждом отдельном клоне показал, что часть клонов содержит микросателлиты нескольких разных мотивов. При анализе значимости корреляций по критерию х2-квадрат оказалось, что только локусы мотива GATG распределяются независимо от микросателлитов других мотивов. Для попарных сочетаний микросателлитов шести других мотивов частоты совместной встречаемости достоверно превышают частоты, рассчитанные из предположения об их независимом распределении по космидам. Таким образом, для хромосомы 13 характерно сблоченное расположение покусов одного и того же и разных мотивов. Из 7-ми исследованных мотивов в образовании кластеров участвуют 5 - GACA, GACT, САС, ТСС и GA. Кластеризация микросателлитов связана с их принадлежностью семейству генов рРНК Кластер рДНК, имеющий протяженность 2,6 млн.п.п., содержит 1 локус GATG и от 60 до 120 локусов мотивов GACA GACT, ТСС, САС и GA. Локусы, принадлежащие области рДНК, не могут быть использованы для создания генетических маркеров.

GATG-повторы расположены независимо от семейства средне повторяющихся участков рДНК и могут быть применены для картирования хромосомы 13 и других ядрышкообразующих хромосом Клоны, отобранные по гибридизации с зондами на мотивы GACT и GATG, но не гибридизующиеся с зондами на рДНК (120 клонов), исследовали методом гибридизации по Саузерну с пробами на микросателлиты Большая часть GACT-позитивных космид содержала кластеры из локусов (GACT)„, в то время как 15 из 22 GATG-позитивных космид (~70%) содержали единственный локус повтора Положение GATG- и GACT-позитивных космид определяли методом флуоресцентной гибридизации m situ в лаборатории AB Зеленина (ИМБ РАН) Оказалось, что большинство GACT-позитивных космид относится к области ядрышкового организатора, напротив, все GATG-позитивные космиды локализованы на 13q (длинное плечо)

Проведено субклонирование 16 GATG-позитивных космид и определены нуклеотидные последовательности большинства клонированных фрагментов ДНК Многие фрагменты ДНК, кроме GATG-повторов, содержали включения из тетрануклеотидов других мотивов, например, GAGG, GACG, GACA, GATA Доля единиц GATG изменялась от 50% (D13S699) до 80% (D13S1417) Высокая степень мозаичности GATG-повторов согласуется с данными других авторов о структуре тетрануклеотидных маркеров (Edwards et al, 1991) Суммарно определены 45 нуклеотидных последовательностей, содержащих по 300-900 пни перекрывающих 22 тпн (EMBL Z73328-Z73335, Z73915-Z73930) Микросателлиты обнаружены в составе 14 нуклеотидных последовательностей Подобраны праймеры и условия амплификации для 6-ти фрагментов ДНК области 13q (табл 3) Анализ гетерозиготности с помощью ПЦР выявил 4 высокополиморфных маркера (табл 3)

Таблица 3 Характеристика полиморфных и STS-маркеров хромосомы 13

Космида/ D номер в GDB Локализация Структура микросателлита Праймеры Mg2t MM /t,°C ПЦР-продукт, П H Алл/Гет/ Ген*

29В02/ D13S707 13q12 -q13 (GATG) 15/26 gacatggaaaggcttagtgaatgc aaatgatgatgacagcaggctgtg 2/65 139-151 4/0 63/10

19D05 / D13S699 13q14 (GATG) 24/50 catcaccaaacaattactgaatgtca gcatcttcttcctttagaggtatttc 2/55 208-224 5/0 64/15

59Е09/ D13S690 13q32 -q33 (GATG) 49/83 cctcatcatcttgattgaaag gggcgatccatccaacatc 1/56 344-352 6/0 75/15

75D06/ D13S705 13q34 (GATG) 43/86 gaccatgctttgaacttcac ggtgggttgatgaatagatg 2/58 436-448 4/0 68/10

85Н06/ D13S1420 13q34 (GATG) 10/18 taggtgctgtccggctgctg ctggctgctgtgtgttgggc 1/65 226 1/0 0/1

44В06/ D13S1417 13q34 (GATG) 9/11 caatacaaatcagcgacact taagcttgggtctccctata 3/65 268 1/0 0/1

*Алл/Гет/Ген - Число аллелей/Гетерозиготность/Число генотипов

Размеры продуктов амплификации этих полиморфных локусов изменяются от 140 до 450 п н Полиморфными оказались локусы с числом повторов выше 20, что согласуется с данными других авторов (Edwards et al, 1991, Mehs et al, 1993)

Показана применимость новых полиморфных маркеров 13q в медико-генетических исследованиях в результате анализа аллелей и генотипов GATG-

маркера 0138699 (13я14) установлена связь эндогенных психозов с генами из района 13я14 (Аксенова и др, 1997) СДТв-маркер 0138699 (СепВапк Асс 605106, ЭТЭ Ю 10598) локализован в составе УАС-клонов 784-д-6 и 758+4 и контигов У\/С-1352 и \Л/С-866, 28 сМ от р1ег-конца хромосомы 13 (на базе Центра полиморфизма генома человека, Франция) Таким образом, этот полиморфный локус интегрирован в международную карту генома человека Часть 2 Локализация на Зр районов, часто повреждаемых в эпителиальных опухолях и предположительно содержащих потенциальные ТЭв и онкогены

Проведен анализ частот аллельных дисбалансов полиморфных маркеров Зр в эпителиальных опухолях для локализации районов, предположительно содержащих ТЭв и протоонкогены На рис 3 показаны характерные примеры аллельных изменений тринуклеотидного микросателлитного маркера 0332409 в образцах ДНК опухолей молочной железы по сравнению с ДНК соответствующей нормальной ткани того же пациента Потерю одного из аллелей наблюдали в случаях ВС 371 и 372 Образец ВС 375 - пример сохранения обоих аллелей, а ВС 376 - пример неинформативного случая

371 372 375 376

Рис 3 Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР маркера 03в2409 в образцах ДНК ВС (номера даны сверху)

Т N Т N Т N III Т N Использован 10% неденатурирующий

ПААГ с окрашиванием нитратом серебра *•* «vWike ty. Т- продукт амплификации ДНК из опухоли,

*w N - из парной нормальной ткани,

ЙЯГ 411 М - маркер, pUC19/Mspl

110

Проведен анализ аллельных дисбалансов (allelic imbalance, AI) в опухолях 5-ти локализаций с использованием идентичного набора полиморфных микросателлитных маркеров Зр (21-23 маркера, рис 4) Результаты этого исследования позволили сравнить опухоли пяти локализаций по частоте и типам делеций на Зр (табл 4)

Таблица 4 Частоты и типы аллельных делеций на Зр в опухолях 5-ти видов*

Тип опухоли ► Тип делеций Т RCC NSCLC ВС ЕОС СС

Делеции всех типов 74/80 93% 37/47 79% 84/95, 88% 42/50 84% 31/39, 79%

Концевые (от тело-мерного конца Зр) 23/80 29% 16/47, 34% 3/95, 3% 1/50 2% 1/39, 3%

Внутренние, одиночные 4/80 5% 7/47, 15% 8/95, 8% 3/50 6% 8/39 21%

Внутренние, прерывистые 47/80 59% 14/47, 30% 73/95, 77% 38/50 76% 22/39 56%

Сумма всех внутренних 51/80 64% 21/47 45% 81/95 85% 41/50 82% 30/39 77%

*Приведено отношение числа случаев с делециями к суммарному числу исследованных случаев опухолей данного вида

|.ав»ж.| 1 1 1 1 3 | 2 1 3 1

| Стадля | ЦП 1 IB+IV 1

i« SSSSS Г PSP^SRS

|„6iSSS,,l.| 1 [ г 1 3 1 2 1 3 1

>4 1 Ш+IV 1

Жтпй^пяпцммщтаюммм!

-...-...-.-...• • -.-.-.- -.-.- ..............................

M4M.>№>*iiwM>M|i><№''Vvyv><»yntiM ........ — ——■-•-■-•■.....

II 1 ч 1 L I М 1 I 1 1 11 1 М 1 L I Mil

t Стадия [ 1+П m+iv 1 1 т+п 1 Ш+IV 1

Рис 4 Аллельный дисбаланс (allelic imbalance, AI) полиморфных маркеров Зр в опухолях 4-х видов А, ВС, Б, RCC, В, ЕОС, Г, NSCLC Обозначения белый кружок - сохранение гетерозиготности, черный кружок - потеря аллеля, черный треугольник - потеря одного аллеля и амплификация второго родительского аллеля Образцы разных клинических стадий сгруппированы (1+11) и (III+IV) Показаны степень злокачественности опухоли (по мере ее возрастания) 1, 2 и 3 для ВС и RCC, или степень дифференцировки ткани (по мере ее снижения) Н, М и L - для ЕОС и NSCLC Н, М, L - высокая, средняя и низкая степень дифференцировки ткани Приведены результаты только данной работы Данные, полученные для СС, здесь не приведены

Таблица 5 Частоты аллельных дисбалансов в эпителиальных опухолях (*)

МАРКЕР ** ПОЗИЦИЯ ** RCC (80 случаев! NSCLC (47 случаев! ВС *** (95 случаев) ЕОС (50 случаев) CC (39 случаев)

D3S2405 Зр25 3 37*4 7" • 31/72, 43% 10/27, 37% 7/26, 27%

D3S1317 Зр25 3 35?4S 71% "■ 53 22/63, 35% 8/21, 38% ¡ВШйшш

D3S1038 Зр25 3 |llli8iSlj 13/30, 43% 15/44, 34% 8/21, 38% Ш1ШВШ

D3S1286 Зр251 30/55, 55% 26/71 37% 14/42, 33% 7/28, 25%

D3S1283 3р23 34 4- 69 19 37 51 ; ~13727,48% ь щв

D3S3047 3р22 3 йшрр

D3S4285 Зр21 33 „1е /улщт: „ '"19/4-1,46^ * Г Щшц

D3S1298 Зр21 33 32/48, 67% ** '1ШВ,

D3S3527 Зр21 33 14/33, 42% 24/71, 34% 15/37, 41% 7/30, 23%

Р33715 Зр21 31 20/33, 61% 9/25, 36% ЩЩЩ 12Й4 5fi% ~

D3S1767 Зр21 31 33/49, 67% ЯВЯш 25/52 9/21 43% -

D3S2420 Зр21 31 35/45, 78'?о 2 16/35, 46% 27/68 40% Jrmj^W/o-- " С 1

D3S2409 Зр21 31 , 29/4-2,69%,. Я ИМЯЗЯЧЙ^Е®^^ 42- ~

D3S2456 Зр21 31 12/28, 43% 5" L "7 3~ ¿3 ' >2 1

D3S3667 Зр21 31 30/45, 67% - "4'"Р 5» 1"'22. 50", Q ^ ^й

D3S4614 Зр21 31 ъ^тлш^-' 17/41 41% ГЧ^&З!*-

D3S3615 Зр21 2 30/48, 63% - 15/37,41% 8/21, 38%

D3S1578 Зр21 2 - - - 14/34, 41%, -

D3S1766 Зр21 1 31/49, 63% 15/32, 47% 20/54, 37% Ml 3/27, 11%

D3S1300 Зр14 3 ярвив 7/18, 39% 6/20, 30% -

D3S1481 Зр14 3 29/55, 53% ШДрЩЩ 22/68, 32% 14/38, 37% 5/33, 15%

D3S1285 Зр14 2 13/24, 54% 10/25, 40% 4/15, 27% - ¡,^/20,40% ;

D3S2454 Зр14 1 17/35, 49% 19/48, 40% 11/28, 39% 3/12, 25%

D3S2406 3р13 33/60, 55% 12/33,36% 25/75, 33% 13/37, 35% 8/30, 27%

Средние значения Зр25 3-3р13 703/1052, 67±2%# 314/643, 49±3%# 558/1290 43+2 %# 280/657, 43±3%# 166/594, 28±3%#

'Число событий AI, поделенное на число информативных случаев, частоты А!, превышающие среднюю величину, показаны серым цветом ** Позиция маркера взята из NCBI, Build 33 ""Достоверные различия между частотами AI и средними значениями были определены для маркеров D3S2409, D3S2456 и D3S3667 при ВС по Фишеру §Р= 0,0206, §§Р = 0,0373, ШР = 0,0199 #SD (CI95) для средних значений AI рассчитывали по формуле 2{р(1-р)/2п}1'2, где п - число информативных случаев, ар- средние значения частот AI (Weiretal, 1990)

Концевые делеции (от теломерного конца Зр) и делеции всего Зр-плеча считаются следствием митотических рекомбинаций (De Nooij-vanDalen et al, 1998, Thiagalmgam et al, 1998) Внутренние делеции могут указывать на инактивацию и молчание TSG (Kok et al, 1997) Следует отметить, что разные формы опухолей существенно не различались по частоте встречаемости образцов с делециями (7993%), но значительно различались по типам делеции (табл 4) Концевые делеции выявлены сравнительно часто только при RCC (29%) и NSCLC (34%) Важно, что множественные и короткие внутренние делеции в сумме достоверно (Р<0 05, по Фишеру) преобладали над концевыми делециями во всех исследованных нами формах опухолей (табл 4) Преобладание внутренних множественных (прерывистых) делеций может быть косвенным указанием на присутствие нескольких потенциальных TSG на Зр

Рассчитаны частоты аллельных дисбалансов (allelic imbalance, AI) для маркеров Зр в опухолях пяти типов (табл 5) Замечено, что в опухолях RCC и NSCLC частоты AI в маркерах Зр, как и размеры делетируемых участков, существенно выше, чем в опухолях ВС, ЕОС и СС (рис 4, табл 5, нижняя строка) Только в опухолях RCC и NSCLC выявлены концевые делеции (29-34%), которые обычно более протяженные, чем внутренние (рис 4) Эти отличия RCC и NSCLC можно объяснить предположением, что в опухолях почки и легкого аллельные дисбалансы на Зр возникают на наиболее ранних стадиях онкогенеза

На профилях AI обнаружено несколько максимумов для опухолей каждого вида (табл 5) Значения частот AI в пиках сравнивали со средним значением этих величин среди маркеров Зр для данного типа опухолей (табл 5, нижняя строка) Для трех близко расположенных маркеров D3S2409, D3S2456 и D3S3667, локализованных внутри области Зр21 31, показаны достоверные максимумы для репрезентативной выборки ВС (95 пациентов, Р=0 02-0 04, по Фишеру, табл 5)

Чтобы сравнить разные районы Зр в разных формах опухолей, маркеры Зр разделили на девять групп, и рассчитали средние значения частот А! для каждого района Зр в каждом типе опухолей (рис 5) Четыре района, #3, 4, 6 и 7, показали высокие частоты AI для всех пяти форм опухолей Район #3 (3р23-р22 3) содержит гены RARß2, THRB и TGFBR2 (Kok et al, 1997) Три другие района локализованы в области Зр21 3 Два из них, #4, или АР20 (маркированный NL1-024/D3S4285 и D3S1298) и #7, или LUCA (маркированный D3S4614) описаны ранее (Lerman & Minna, 2000, Protopopov et al, 2003)

Третий часто повреждаемый район в области Зр21 3 (#6, маркированный D3S2409, D3S2456 и D3S3667) локализован нами впервые Этот новый район D3S2409-D3S3667 назван МЕСАЗ (Major Epithelial Cancer 3 in Зр21 3) Превышение частоты AI в районе МЕСАЗ над средним значением для маркеров Зр в эпителиальных опухолях ВС подтверждено статистически (Р<10"3, по Фишеру, рис 5)

Таким образом, четыре района Зр #3, 4, 6 и 7 подвержены частым аллельным изменениям во всех пяти исследованных эпителиальных опухолях Другие районы Зр (#1, 5 и 9) подвержены таким изменениям только при некоторых видах опухолей Так, высокая частота AI выявлена в районе #1 (вокруг гена VHL) при RCC, NSCLC и

СС. Для района #5, CER (common eliminated region), локализованного в функциональных исследованиях (Kholodnyuk et а!.. 2002), высокая частота AI более характерна для опухолей RCC и ЕОС (рис. 5). Район #9 в области 3р14.2-р13 наиболее вовлечен в СС. Из этих данных можно предположить, что районы #3, 4. 6 и 7 (включая новый район МЕСАЗ) содержат потенциальные TSG, общие для разных эпителиальных опухолей. В то же время в других районах Зр (#1, 5 и 9) вероятно содержатся потенциальные TSG, специфичные для определенных видов опухолей.

еос сс

D3S240S D3S131T D3S1038

D3SMS

D3S1283 D3S3Ü4T

Ш NSCLC ВС

Ген ы

D1S143! D3S1Z85 D3S2454 D3S24G6

1*7/14?. 744 SU97. 48/179, ИМ. 2S.H*, №

ZV4I. IVlt. 37Н 14J+5, t ' . . Мчп U|W

714, 53% tili«, 51% 48'™ 14/44,

Ur*. 71 «И», 4ЯШ* 2]'44, 4S*i Ш7, tt*b

I 31/194* 70** 1 ^^^fflC мл», ■ Hl

M13I, ll'M. IW1P. S744 444*. 4 IS'-.

Г/М, ян» ып 5, Sb IWfl. - <i>4 : 11 'M.

ШГ i

ё! * _ Vi «34?»* »S 1 Ufr*. 1 JOii ' an

«/119, «ян um, 42*-, 4S1SS. 14Л JTH IM!,

VHL

THRS

ялш

TCFBR2

JM(AP-IO)

#5iC ER)

IF UMÖI

#6(М£СА35 ■

#7 (П СА)

TU3A FHIT

Dtrni/ROBOt

MLHI

HYA22/RSSP3

VILL

DIEC1

USF4 VFXI

RHOA/ARUA DAG I MST! MSTIR

SEMAiF

ХЕШЗВ

HYAL!

HYAL2

FUSi

JUSSF1A

СЛСШЮ2

Рис. 5. «Критичные» районы Зр и функционально важные гены, связанные с развитием опухолей. Средние значения частоты AI для 9 районов Зр отображены на диаграмме уровней (Levels Plot) с помощью программы S-PLUS (tittp://www m a t h s oft com/s р I usl Интенсивность окраски (белая-серая-черная) позволяет оценить как распределение максимумов частоты AI вдоль Зр в пределах одного вида опухолей (вертикаль), так и участие данного района в разных видах опухолей (горизонталь). Пик в районе #6 (МЕСАЗ D3S2409-D3S3667) подтвержден для представительной выборки образцов ВС (95 случаев) С помощью теста Фишера 106/187, 57% vs. 658/1290. 43%)

Новый критичный район МЕСАЗ выявпен нами впервые: он расположен в области Зр21.31 (-600 Т.Л.Н., 49 3-49 9 млн.п.н. - согласно данным NCBi и UCSC) близко к участку LUCA. Участок LUGA (-600 т.п.н.) содержит более 30 генов, среди которых несколько TSG (Lerman & Minna, 2000). Согласно данным UCSC Browser, МЕСАЗ (интервал D3S2409-D3S3667) также содержит гены примерно с той же высокой плотностью, что и район LUCA (-30 генов/600 Т.П.Н.).

Некоторые из генов, расположенных в этой области (например, гены USP4. GPX1, RHOA/ARHA. DAG1, MST1, MSTR1/RON, рис. 5), участвуют в жизненно важных функциях клетки таких, как адгезия, контроль клеточного цикла, апоптоза.

пролиферации и подвижности клеток Предполагают, что эти гены играют роль в неопластической трансформации или в прогрессии опухолей (см , например, Ни е( а!., 2003 Sgambato et at., 2003; Pile et a I., 2005)

Как видно из рис. 4, А-Г, иногда потеря одного аллеля сопровождается амплификацией второго родительского аллеля Такие случаи амплификации второго родительского аллеля в данной работе показаны с помощью мультиплексной ПЦР (рис. 6) Частота встречаемости случаев с амплификацией на Зр составила в среднем 13% (141/1052) при RCC, 10% (130/1290) при ВС, 8% (52/643) при NSCLC, 9% (60/657) при ЕОС и 2% (11/594) при СС (pfc. 4, А-Г). Амплификации распределены вдоль Зр неравномерно В образцах ВС в новом районе МЕСАЗ (маркеры D3S2409. D3S2456 и D3S3667) частота амплификаций составила 16.5% (31/187). Эта величина достоверно (Р=003, по Фишеру) выше среднего значения для маркеров Зр в образцах ВС (10%, 130/1290).

Рис. 6. Применение мультиплексной ПЦР для выявления амплификаций Распределение аллельных дисбалансов полиморфных маркеров D3S2406, р33715 и D3S2456 в образцах ДНК опухоли и нормы (RCC, ВС и ЕОС); LOH - потеря одного аллеля; Ret -сохранение обоих аллелей; LOH+A -потеря одного эллепя. сопровождаемая амплификацией второго аллеля; NI - неинформативный случай. Электрофорез в 10% неденэтурирующем ПААГ с окрашиванием нитратом сереэра; М -маркер (pUC19/Mspi).

RCC ВС КОС

SS 56 58 J3

TN I N I NM TN

<104

D3S2456 _—Ж*™ г-;- i.

ТГГ

Обряди Маркер RCC 55 ВС 58 EOC 33

•да6 LOH+А LOH Bit Ret

(Ш) Ret M N1 LOH

ßplli?!6) LOH+A LOH LOH+A LOH+A

Эти наблюдения позволяют предположить, что в районе МЕСАЗ содержатся как потенциальные TSG, так и протоонкогены. Действительно, в этом районе находится ген RHOA, обладающий онкогенным потенциалом (Paterson et а/., 1990).

Частоты случаев с повреждениями в данном районе Зр сравнивали в группах больных ранних м поздних клинических стадий и с разной степенью злокачественности опухоли В некоторых распространенных гистологических типах опухолей выявлена положительная корреляция между их прогрессией и частотой аллельных изменений в трех районах Зр (АР20, LUCA и МЕСАЗ) (рис. 7). Достоверная корреляция установлена для АР20 и LUCA при светлоклеточном RCC (рис 7, А) и серозном ЕОС (рис. 7, Б) Для района МЕСАЗ выявлена корреляция с клинической стадией и степенью дифференцировки серозного ЕОС (Р<0.01. по Фишеру, рис. 7, 6). Важно, что при анализе Зр в целом корреляция с прогрессией не выявлена, что свидетельствуют об участии в прогрессии данных видов опухолей

определенных генов из районов АР20, LUCA и МЕСАЗ, помимо возможной роли глубоких структурных повреждений Зр (Сгосе et а!., 1999).

RCC

Серозный ЕОС

АР-2 О, #4

м Р^ЯМП Р-О.01Г

so ■

ШСА, m P-Ù,024S

AP-Î0, МЕСАЗ.

Х4 _m_

P-O.WS P-O.OOi P-O.MIS

LUCA.

P-HM96

ï.'! ■ : £

"Г * ■ ..

§ й 1

Степень

1-й UMV Стадия

i-n а ЧУ

Стадия

Н-М L Степень Жффереи-ияровк*

Н-М (. Степень

диффгрен-ииронкн

1-Е HHV Сгадня

Н*М L Степень дифф'ре«-цироакн

Рис. 7. Корреляция частоты аллельных изменений в критичных районах Зр с прогрессией сеетлоклеточногс почечноклеточного рака (RCC) и серозного рака яичников {серозный ЕОС), Рассчитана доля образцов опухолей, а которых выявлен A! s данном районе Зр. Сравнивали клинические стадии (1+11 га. III+1V), степень анаплзэии {1+2 vs. 3, для RCC, А) или степень дифференцировки ткани (Н+М vs. L, для серозного ЕОС, Б ; H, M, L - высокая, средняя и низкая степень дифференцировки), Достоверность показана с помощью теста Фишера

Часть 3. Идентификация потенциальных TSG и онкогенов е «критичных» районах Зр.

Нами проведен предварительный анализ уровней мРНК -30 генов (из открытого нами нового «критичного» района МЕСАЗ, 3р21.3) s эпителиальных опухолях на основе информации, представленной в базах данных SAGE (серийный анализ экспрессии генов). В эпителиальных опухолях выявлены изменения уровня мРНК более 10-ти генов. Среди этих генов были отобраны 5 генов (GPX1, DAG1, RHOA/ARHA, MSTR1/RON и USP4), которые согласно данным литературы, связаны с важными функциями клетки (регуляция клеточного цикла и аполтозэ, адгезия и подвижность клеток) и предположительно участвуют в процессах онкогенеза, В литературе представлены данные о способности генов GPX1 и DAG1 к подавлению роста некоторых опухолевых линий клеток (Faucher et al., 2003; Sgambato et al., 2004). Имеются сообщения о способности генов RHOA, USP4 и MSTR1/RON к онкогенной трансформации клеток (Patersori et al., 1990;. Gray et al., 1995; Wang et al, 2003; Xu et ai, 2004).

Изменения уровня мРНК и структурные изменения в некоторых генах из района МЕСАЗ в эпителиальных опухолях

С помощью программы SAGE охарактеризованы изменения уровня мРНК 5-ти упомянутых генов и кандидата на роль TSG SEMA3B из района LUCA (Tomizawa et

а/, 2001) в эпителиальных опухолях Для некоторых генов выявлен повышенный уровень мРНК RHOA/ARHA - в 7-ми из 9-ти типов опухолей, MSTR1/RON - в 3-х из 4-х Показано преимущественное снижение уровня мРНК гена GPX1 при ВС, но повышение - в опухолях иных локализаций Методом SAGE также показано дифференциальное изменение уровня мРНК кандидата на роль TSG SEMA3B (при SCLC и NSCLC, Tomizawa et al, 2001) достоверное снижение уровня мРНК в 2-х из 4-х типов опухолей Таким образом, требовались дальнейшие экспериментальные исследования изменений уровня мРНК этих генов в эпителиальных опухолях разного происхождения, с помощью которых можно сделать предварительную оценку возможной роли данного гена в качестве потенциального TSG или онкогена

Анализ уровня мРНК генов GPX1, DAG1, RHOA и SEMA3B в клеточных линиях ВС, RCC и ЕОС и образцах первичных опухолей ВС и RCC

Нами определены изменения уровней мРНК 3-х генов RHOA/ARHA, GPX1 и DAG1 из района МЕСАЗ и TSG SEMA3B в 11 клеточных линиях ВС, RCC и ЕОС (рис 8) и в образцах первичных опухолей ВС и RCC от 37 пациентов

ВС ЕОС ЯСС

Рис 8 Уровень мРНК генов ОАв1, вРХ1, ЯНОА/АРНА и Т8в ЭЕМАЗВ в 11 клеточных линиях ВС, ЕОС и ЯСС Применяли метод полуколичественной ОТ-ПЦР, определяли усредненные значения уровня мРНК генов из 3-х параллельных измерений (отклонения составляли 10-40%) Нормировали относительно уровня мРНК контрольного гена вАРОН и относительно уровня мРНК данных генов в соответствующих тканях трех онкологически здоровых человек (по данным анамнеза)

При исследовании клеточных линий обнаружено выраженное снижение уровня мРНК кандидата на роль Твй БЕМАЗВ (в 4-х из 11 линий клеток) и гена вРХ1 (в 3-х

из 11 линий клеток) (рис 8) Уровень мРНК гена RHOA/ARHA увеличивается в 4 520 раз в 6 из 11 клеточных линий (рис 8)

При анализе РНК первичных опухолей получены аналогичные данные показано частое понижение уровня мРНК (в 3 или более раз) гена GPX1 (4/19 vs 1/19 при RCC и 8/37 vs 4/37 в опухолях ВС и RCC в сумме) Причем частота случаев со снижением содержания мРНК гена GPX1 совпадала с частотой снижения уровня мРНК TSG SEMA3B (8/37 vs 6/37) Результаты ОТ-ПЦР согласуются с данными о способности гена GPX1 к подавлению роста линии клеток ECV304 (Faucher et al, 2003) Как известно из литературы, промоторная область гена GPX1 связывает р53 (как транскрипционный фактор), что сопровождается повышением экспрессии GPX1 и стимуляцией апоптоза, и свидетельствует об участии гена GPX1 в р53-зависимых про-апоптозных сигнальных путях (Tan et al, 1999, Hussain et al, 2004) Наши результаты и данные литературы позволяют предположить, что ген GPX1 может выполнять роль TSG некоторых видов опухолей

При RCC нами показано частое понижение количества мРНК гена DAG1 (7/19 vs 5/19), что согласуется с данными о снижении уровня белкового продукта дистрогликана в опухолях разных видов (Sgambato et al, 2003, Brennan et al, 2004, Jing et al, 2004) и с данными о супрессорной активности гена DAG1, выявленной ранее в опытах по введению мРНК в клеточную линию ВС MCF7 (Sgambato et al, 2004) Таким образом, снижение содержания белка дистрогликана в опухолях этих видов может быть обусловлено подавлением транскрипции гена DAG1

Показано существенное преобладание случаев с повышенным уровнем мРНК гена RHOA в первичных опухолях ВС (7/18 vs 0/18) и RCC (9/19 vs 5/19), в образцах ВС и RCC в сумме различие достоверно (16/37 vs 5/37, Р=0 009, по Фишеру) Повышение уровня мРНК гена RHOA в клеточных линиях и первичных опухолях ВС и RCC согласуется с данными о его способности к онкогенной трансформации клеток (Avraham and Weinberg, 1989, Paterson et al, 1990, Kamai et al, 2003) Наши результаты и данные литературы свидетельствуют о возможной протоонкогенной функции гена RHOA

Гомозиготные делении в области гена GPX1 и умножение копий гена RHOA/ARHA в опухолях

Обнаружение гомозиготных делеций (HD) - один из способов идентификации TSG Выявление HD позволило открыть TSG-содержащие районы АР20 и LUCA в области Зр21 3 (Lerman & Minna, 2000, Senchenko et al, 2004) Мы провели поиск HD в области гена GPX1, относящегося к району МЕСАЗ (D3S2409-D3S3667), в 50 случаях RCC и 37 случаях ВС Использовали мультиплексную ПЦР с двумя парами праймеров на исследуемый ген и в качестве внутреннего контроля на содержание ДНК - ПЦР фрагмента экзона 3 гена RAR/32 (рис 9)

В области гена GPX1 сравнительно часто выявлены HD в образцах RCC (12%, 6/50) и реже при ВС (3%, 1/37) (рис 9, А) Для сравнения в тех же образцах и тем же методом тестированы TSG RASSF1A и SEMA3B из района LUCA Частоты встречаемости HD в области гена GPX1 при RCC оказались выше, чем в генах

ИАЗБРЫ (0%) и БЕМАЗВ (8%) (рис 9, Б), Эти наблюдения и данные го снижению уровня транскрипции гена вРХ1 при являются косвенным указанием на

возможную функцию Т8С гена СРХ1 при почечноклеточном раке.

вес

I N

26 Т К

_ ВС

I N î RK-5M

иду т £ т щь&т* %

m »3

Ген Локализация RCC ВС

GPX1 МЕСАЗ S'W, 12% 107,

RASSF1A LllCA. «S, в% 5,46,11%

SEMAÎB 1AJCÀ 4fSÎ, 8"A

Рис. 9. Гомозиготные делеции в области гена GPX1 при RCC и ВС. А. Примеры выявления HD в области гена GPX1 в образцах ДНК RCC и ВС с помощью мультиплексной ПЦР. Фрагмент промоторной области гена GPX1 анализировали с двумя пэрами праймеров. Фрагмент гена RARj32 (экзон 3) применен как внутренний контроль содержания ДНК. Электрофорез в 1.5% агароэном геле. M -маркер с шагом 100 п.н. Б. Сравнение частот встречаемости HD а промоторной области гена GPX1 и в лромоторных областях 2-х TSG из района LUCA:

и SEMA3B, - в образцах RCC и

ВС.

При изучении аллельного дисбаланса в полиморфных локусах обнаружены случаи потери аллеля с сопутствующей амплификацией второго аллеля (часть 2), причем, в маркерах района МЕСАЗ (ОЗЭ2409 и 0352456) показана достоверно повышенная частота амплификации по сравнению с другими маркерами Зр при ВС (Р=0.03, по Фишеру, рис 6). Для гена ИНОА. расположенного на зюм участке, мы показали частые случаи умножения копий гена в образцах эпителиальных опухолей ВС и [ЧСС используя праймеры к участкам ДНК промоторной области гена (рис. 10). Таким образом, умножение копий гена ЙНОА согласуется с ранее обнаруженной амплификацией аллелей полиморфных маркеров района МЕСАЗ при ВС и РгСС.

0 7 3 2 Рис- Ю. Умножение копий

т I Т К I N Т I к- м фрагмента РНОА2 гена ЙНОА в

опухолях ВС. Мультиплексная енпд9 -— ** д. ... ПЦР фрагмента РШОА2 и

(5™ - ; " ^ Щ; т™- фрагмента экзона 3 гена

ЙАРЯ2 (контроль содержания исходной ДНК). Электрофорез в »> 1 п п *** «м» «м*> ^ 229л.н. 1,5%-ном агароэном геле. М-

маркер с шагом 100 п.н.

В образцах ВС и РСС от 37 пациентов, в которых исследовали изменение уровня мРНК гена ЙНОА, определили изменение копийности этого гена относительно нормальной ткани (рис. 11). Показано, что умножение копий гена (в 210 и более раз) в исследуемых образцах опухолей наблюдается существенно чаще, чем уменьшение копийности гена (24/37 уз. 4/37, Р=2.5 хЮ'6, по Фишеру). Важно.

что амплификацию гена RHOA наблюдали в тех же образцах опухолей, в которых было отмечено повышение уровня мРНК этого гена (в 3 и более раз) Так, при ВС умножение копий гена наблюдали в б-ти из 7-ми случаев с повышением уровня мРНК, а при RCC - в 9/9 случаев (рис. 11) Амплификация гена RHOA в сочетании с повышенным уровнем мРНК выявлена в 15-ти из 16-ти опухолей ВС и RCC (в сумме), что достоверно чаще, чем чиспо случаев с повышением уровня мРНК без амплификации гена - 1 из 16-ти (Р=8.6 х10~7: по Фишеру).

и ? 373J4S J4I i 4P ; ,'9-tl i Ш1 I вг

Ш4 Ji^Mir 19HJ53J 21 a.îûlliI!i62S 18 ЙСС

Рис. 11. Профиль изменения уровня мРНК гена ИНОА и его копийности в образцах опухолей ВС (18 случаев) и РСС (19 случаев} по сравнению с образцами нормальной ткани. По оси абсцисс -порядковые номера образцов, по оси ординат -

соотношение уровня мРНК (черные столбики) и копийности (серые столбики) гена ИНОА в опухоли и в гистологически

нормальной ткани молочной железы или почки от того we пациента. Уровень мРНК и уровень копийности гена RHOA в норме приняты за 1.

Механизм активации протоонкогена RHOA был неизвестен. Мутации в гене RHOA, которые характерны для активации протоонкогенов, как. например, в спучае гена Kras (Nakamoto et al., 2001) выявить не удавалось (Moscow ef а/., 1994, Rihet et al.. 20Q1\ Fritz et el-, 2002). Другим возможным механизмом активации протоонкогенов в опухолях может быть увеличение числа геномных копий гена, которое наблюдали в случае онкогенов N-myc и с-егЬВ (Татосян, 2000: Зборовская, 2000). Недавно такой механизм активации описан для гена PIK3CA, кодирующего р110а. каталитическую субъединицу фосфатидилинозиткиназы 3, в опухолях щитовидной железы (Wu et al.. 2005). В нашей работе впервые обнаружено, что увеличение мРНК гена RHOA при ВС и RCC может быть связано с умножением копий этого протоонкогена

Итак, нами впервые обнаружены гомозиготные делеции в составе гена GPX1 е 12% (6/50) образцов опухолей RCC (что характерно для TSG) и умножение копий онкогена RHOA в большинстве образцов опухолей ВС и RCC (24/37, 65%). Эти данные подтверждают онкогенное поведение гена RHOA и позволяют предположить TSG-подОбные свойства для гена GPX1. Кроме того, результаты этих исследований показывают, что одним из механизмов «молчания» или активации гена может быть изменение числа копий гена в геноме опухолей.

Изменение содержания альтернативных транскриптов гена USP4 в опухолях

Ген USP4 кодирует убиквитин-специфическую протеазу (Unp), которая может останавливать процесс протеолитической деградации короткоживущих белков, в том числе регуляторных белков и компонентов сигнальных путей клетки, включая р53 или pRb (DeSalle et al, 2001) Показано повышение уровня мРНК USP4 в опухолях SCLC и аденокарциномах легкого, а также онкогенная трансформация клеток NIH3T3 при введении кДНК этого гена (Gray et al, 1995) В другой работе, напротив, обнаружено снижение уровня Unp-белка в клеточных линиях SCLC, и наличие двух изоформ белка в клеточных лизатах 105 и 110 кДа (Frederick et al, 1998) Анализ изменения уровня мРНК этого гена в опухолях, проведенный нами с помощью программы SAGE, не позволил получить четких результатов Известно существование двух продуктов альтернативного сплайсинга гена USP4 UnpEL и UnpES Более короткий вариант UnpES лишен 7-ого экзона (рис 12)

STGGS USP4 GPXS

Рис 12. Структурная организация гена иЭР4, экзон 7, отсутствующий в укороченном транскрипте ипрЕБ, показан белым

Я ни

USP4

Mit < Е '.ИБП 12 13 1П '.<.-Vf 1«1в2аяя экзоны

ftättoo-

as t

Анализ уровня этих транскриптов гена USP4 проводили методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), праймеры подбирали на обе изоформы Для характеристики содержания полноразмерного транскрипта UnpEL оба праймера выбирали внутри экзона 7 (продукт ПЦР - 90 п н), а для UnpES один праймер был внутри экзона 5, а второй - внутри экзона 8 (доминирующий продукт ПЦР не включал экзон 7 и составлял 260 п н) Анализировали РНК из клеточных линий и первичных опухолей (рис 13) Относительный уровень UnpEL и UnpES рассчитан с помощью сравнительного Ст-метода (Wong & Medrano, 2005)

Рис 13 Уровень транскрипта UnpEL в клетках опухолей относительно нормальной ткани Клеточные линии SCLC N146, N417, U2020, ACC-LC5, RCC ACHN, 786-0, ЕОС CaOv, СС SiHa, CaSki Первичные опухоли RCC 1Т, 2Т, ЗТ ,4Т, ЕОС 5Т,6Т, СС 7Т, 8Т, 9Т Уровень транскрипта UnpEL в нормальной ткани принят за 1

Значительных изменений в количестве укороченного транскрипта UnpES не обнаружено, а уровень содержания полноразмерного транскрипта UnpEL изменялся в обе стороны в опухолях почки увеличивался, а в опухолях яичников и шейки матки в основном снижался (рис 13) Возможно, эти особенности связаны с тем, что альтернативные транскрипты гена USP4 имеют различные функциональные свойства, так как в UnpES отсутствует часть каталитического домена карбокситерминальной гидролазы При этом альтернативный сплайсинг может быть регулятором экспрессии функционально более значимого транскрипта Данные о повышении UnpEL в 5-ти из 6-ти образцов RCC согласуются с данными о способности гена USP4 к онкогенной трансформации клеток (Gray et al, 1995) и позволяют предположить функцию онкогена для USP4 при RCC

Структурные изменения в гене MST1R/RON в опухолях и их связь с содержанием альтернативных транскриптов и онкогенезом

Белок RON служит рецептором MST1 и имеет три домена внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный (тирозинкиназный) (Wang et al, 2000) Ген RON обладает онкогенным потенциалом (может вызывать трансформацию клеток) и повышает инвазию опухолей (Wang et al, 2003, Хи et al, 2004) Активацию протоонкогена RON могут вызывать как точечные мутации в области тирозинкиназного домена (Peace et al, 2001), так и другие механизмы Так, показана роль альтернативного сплайсинга потеря двух экзонов 5-го и 6-го из области, кодирующей внеклеточный домен, приводит к укорочению мРНК и белка (160 вместо 180 кДа), к структурным изменениям белкового продукта и его конститутивной активации с аутофосфорилированием (Wang et al, 2000, Angelom et al, 2000)

Новый вариант сплайсинга с потерей 19-го экзона гена MST1R/R0N обнаружен нами в клеточной линии рака легкого NSCLC NC1-H1666 Можно предположить, что потеря 19-го экзона из области, кодирующей тирозинкиназный домен, предрасполагает к раку, аналогично тому, как при точечных мутациях в области тирозинкиназного домена и при потере экзонов 5-го и 6-го (Wang et al, 2000, Angelom et al, 2000, Angelom et al, 2003)

Нами показано метилирование 2-х CpG-островков области проксимального промотора в 4-х из 6-ти клеточных линий SCLC и NSCLC и метилирование только 2-го CpG-островка (область 1-го экзона) в ряде образцов первичных опухолей ВС и NSCLC Метилирование 1-го CpG-островка (область перед стартом транскрипции), обнаруженное в 4-х клеточных линиях SCLC и NSCLC, сопровождается потерей полноразмерного функционального транскрипта (4 5 т п н ) и активацией короткого онкогенного транскрипта (2 т п н ), который синтезируется с внутреннего промотора, расположенного в области 10-го экзона гена (Angelom et al, 2007) Короткий онкогенный транскрипт кодирует конститутивно-активную тирозинкиназу, которая усиливает пролиферацию клеток (Angelom et al, 2007) Таким образом, показана роль метилирования в изменении соотношения количества функционального и онкогенного транскриптов гена MST1R/R0N в клеточных линиях SCLC и NSCLC

Итак, для 5-ти генов из открытого нами района МЕСАЗ получены данные о функциональных и структурных изменениях в этих генах в опухолях, которые

позволяют предполагать функцию TSG для генов GPX1 и DAG1 и функцию онкогенов для генов RHOA, MST1RIRON и USP4

Кандидаты на роль TSG из других ключевых районов Зр изменения уровня мРНК и структурные изменения в генах

В данной работе показано преимущественное уменьшение уровня мРНК гена CTDSPURBSP3 (ген семейства малых С-концевых фосфатаз, полипептид А РНК полимеразы II, RB1 серин-специфичная фосфатаза на хромосоме 3) в клеточных линиях и первичных опухолях RCC, ЕОС, ВС, SCLC и СС (14 образцов с уменьшением уровня мРНК vs 6-ти - с увеличением) методом ПЦР-РВ Определение нуклеотидных последовательностей показало, что в образцах с повышенной транскрипционной активностью этого гена выявляются или мутации (RCC-2T - Ser121Pro, SCLC N417 - His139Tyr), или делеции (в ЕОС-6Т делетированы экзоны 2 и 3) Итак, в ряде случаев в образцах с увеличенной транскрипционной активностью выявлены дефекты, вследствие которых белковый продукт гена может терять активность Таким образом, частое снижение уровня мРНК, как и случаи с повышенным содержанием транскрипта, кодирующего, однако, дефектные белковые продукты, служат косвенным указанием на функцию TSG для этого гена Действительно, функциональный анализ прямо подтвердил супрессорную активность гена CTDSPL/RBSP3 (Kashuba et al, 2004)

Ген NPRL2/G21 (аналог 2 регулятора азот-пермеазы) кодирует ядерный растворимый белок, который имеет гомологию с белком репарации MutS и, по-видимому, участвует в репарации неспаренных оснований в ДНК (Li et al, 2004) Ген содержит 11 экзонов и характеризуется альтернативным сплайсингом (число возможных транскриптов - 31) В клетках нормальной почки основной транскрипт имеет размер 1,8 т п н Методом нозерн-гибридизации обнаружена потеря этого транскрипта в 7-ми исследованных клеточных линиях RCC при сохранении минорного транскрипта 7 0 т п н (Letal, 2004) Возможной причиной потери одного из транскриптов могли быть и мутации, и гомозиготные делеции Действительно, с применением набора праймеров нами были обнаружены гомозиготные делеции в З'-части гена NPRL2/G21 в 5-ти из 7-ми исследованных опухолевых клеточных линиях RCC (HN4), SCLC (U2020, Н157), NSCLC (А549) и СС (HeLa), а также в образцах первичных опухолей RCC, ВС и ЕОС Супрессорная активность гена NPRL2/G21 установлена функционально (Li et al, 2004)

Новый ген малой РНК, не кодирующей белок, EST W91914, был обнаружен в интроне протяженного гена DUTT1 (Deleted in U2020), локализованного в районе частых гомозиготных делеции в области 3р12 3 (Angeloni et al, 2006) Нами определены изменения содержания РНК гена W91914 в 20-ти образцах первичных опухолей ВС, RCC и NSCLC по сравнению с нормальными тканями с применением ПЦР-РВ Следует отметать, что образцы РНК были предварительно обработаны ДНКазой I, т к ген W91914 не имеет интронов Снижение относительного уровня РНК гена W91914 в 5-ти из 10-ти образцов ВС и в 4-х из б-ти образцов RCC позволяет предположить, что ген W91914 может выполнять функцию TSG при ВС и RCC Эта гипотеза усиливается наблюдением, что именно в этих опухолях наблюдали инактивацию гена DUTT1 (Dalloletal, 2002, Xian etal, 2004)

Ген W91914 транскрибируется в том же направлении, что и DUTT1, и можно предполагать корегуляцию их активности Возможно, продукт гена W91914 модулирует функцию DUTT1 пост-транскрипционно, как многие другие не кодирующие белок РНК, локализованные в интронах более крупных генов (Bejanin et al, 1994, Conrad et al, 2002, Esquela-Kersher & Slack, 2006)

Часть 4. Изменения профилей метилирования промоторных областей генов RASSF1A, SEMA3B и RHOA в эпителиальных опухолях.

Анализ метилирования промоторных областей генов в опухолях и установление связи этой модификации с изменением транскрипционной активности исследуемых генов позволяет выявлять новые потенциальные TSG и онкогены

В данной части работы представлены результаты исследования метилирования промоторных областей потенциальных TSG RASSF1A и SEMA3B, относящихся к району LUCA (Зр21 31), и потенциального онкогена RHOA из района МЕСАЗ (Зр21 31) в опухолях разных локализаций Исследование проведено на ДНК клеточных линий и первичных опухолей, главным образом, RCC, ВС и ЕОС, использован набор методов, в том числе, бисульфитное секвенирование Метилирование промоторной области гена RASSF1A (LUCA, Зо213) в эпителиальных опухолях

В области перекрывания делеций LUCA идентифицирован и охарактеризован ген RASSF1 (Ras association domain family 1) (Lerman & Minna, 2000, Dammann et al, 2000) Промоторные районы двух главных транскриптов гена (RASSF1A и RASSF1 С) содержат CpG-островки, разделенные 3 5 т п н (рис 14)

BLU

RASSF1Á qpG

RASSF1C CpG

11.П.Н.

2 aß 2y

3 4 5

Рис 14 Схема структуры гена RASSF1 (экзоны 1а, 2 а|3, 2у, 3, 4, 5 и 6) Слева прилежит ген BLU Стрелками показаны старты транскрипции и CpG-островки промоторных областей Два

основных продукта РНК включают

I™™-1™""-! RASSF1A (экзоны

1а, 2 ар, 3, 4, 5 и 6) и

RASSF1C (экзоны 2у, 3, 4, 5 и 6) Принято рассматривать RASSF1A и RASSF1C как самостоятельные гены

Выявлено многообразие функций белка RASSF1A в клетке Например, задержка клеточного цикла за счет снижения содержания циклина D1 (Shivakumar et al, 2002), участие в индукции апоптоза за счет взаимодействия с продуктом онкогена ras (Vos et al, 2000), или гена MST1 (Oh et al, 2006), стабилизация микротрубочек (Пфайфер и Дамманн,, 2005) К настоящему времени твердо

установлена способность продукта гена RASSF1A подавлять рост опухолей, что показано in vitro и in viva, и в том числе с помощью нокаут-мутаций гена в клетках мыши (Dreijerink et al., 2001: Zabarovsky et al., 2002: Dammann et al., 2005).

Метилирование промоторной области гена RASSF1A в линиях клепок RCC.

В работах Dammann ef al. (2000) и Barbee et al. (2001) обнаружено метилирование СрО-островка промоторной области гена RASSF1A в клеточных пмнмях vi первичных опухолях рака легкого fSCLC и NSCLC) и молам ной железы. Нам представлялось целесообразным выяснить роль метилирования в инактивации этого гена при раке почки и яичников, а также сравнить частоту и плотность метилирования в нескольких видах эпителиальных опухолей. Метилирование прэмоторной области гена RASSF1A в клеточных линиях рака почки исследовано методами метилспецифичной ПЦР (МС-ПЦР) и с помощью секвенирования ДНК, конвертированной под действием бисульфита (дезаминирование всех не метилированных цитидиновых остатков). Эти данные сопоставили с результатами анализа содержания транскрипта RAS3F1A в тех же культурах, полученных методом нозерн-гибридиэации (рис. 15).

Нпэерн-

МС-ПЦР CpG i 2_з 4 5 б 7 8 ) i» цр 1314 isí»¡it ц ц|ю[г! a í3 24 я и я »г^а я зг

АСНМ

ТК10

Н№

| НМ51 А498 Cakil CakiJ ТКШ КЧ12 ÍÍRC

■Р™

Рис. 15. Сопоставление данных по метилированию 32-х СрО-динукпеотидов промоторной Области гена ЯМЗЙПА в клеточных линиях 1ЧСС (КН39, АСНМ, ТК10. НМ4, »N51, А4Э8, СакИ. Сак|2. ТК164. К712, ККСЛО с данными по наличию транскрипта (ЧАББР! А полученными с помощью нозерн-гибридиэации. Приведены данные МС-ПЦР и бисульфитного секвенирования СрО-островка: черные прямоугольники показывают метилирование, белые - метилирование не выявлено и серые - данные отсутствуют; Знак «+» соответствует выявлению транскрипта, «-» транскрипт отсутствует или обнаруживается в следовых количествах, # - нет данных.

С рв-островок гена РАЗЗРМ почти полностью метилирован в 11-ти клеточных линиях рака почки. Транскрипт КАвЭРТА не выявлен в 9-ти из 11-ти (82%) пиний

рака почки, подверженных метилированию (рис. 15), что позволяет предполагать доминирующую роль метилирования в инактивации гена ЯАЗЭПА при раке почки.

Метилирование промоторной области гена КАЗЭРЫ в первичных опухолях ЯСС, ВС и ЕОС.

Применяли бисульфитное секвенирование. МС-ПЦР и анализ с применением метилчувствительных рестриктаз (МЧРА). Методом МЧРА с использованием 4-х ферментов можно выявлять метилирование 18 из 32 СрО-динуклеотидов СрС-островка КАЗвПА (рис. 16).

БьМЖ I ЧР?" АсИ

Ае11

ЕАг-К

•290

■т

СрС: 2.3

-257 -190-173 -137 -П4 -86 -57 -43 -36 -6

-188 -135 -111 70 -53 -46

3 13,14 15 17,18 19.20 21 232*252627 3 31

ЛГУ КАВ-К

Рис, 16, Схема анализа метилирования промоторнсго района гена [?А85Р1А методами МЧРА и МС-ПЦР. НраИ, НЬа\, АсЛ и ВзЬ12Ш - использованные мет ил чувствительные рестриктазы,. Праймеры для МС-ПЦР (М/и-1. и М/и-Р?) показаны белым цветом на сером фоне; праймеры для МЧРА (РАЙ-Р и КАЗ-Р.) и праймеры для подтверждения гомозиготных делений (РАЗчп^Р и РА8-1П1-1-Ц показаны черным шрифтом.

На рис 17 показаны примеры анализа метилирования Срв-островка гена ЯАЭЗПА в ДНК опухолей методами МС-ПЦР и МЧРА.

ЯСС ВС

ЕОС

197 3» 3« 35! 398 5(11

т .ч г 8 т л : к т к г N м

1" - * # * 2 131 р

371 376 Т Т V 505 Т ! 57( < Г N И

1 _ < ш» • м» |

506 511 Т N Т ? Т »1 N 5Й 551 Т N I N М |И

1 йь я £

I * .. * № мм

ЗЕИ

.116

540

545

Т 8» М Им I ТН) К йч Т ВД N КИ I М ?! №.

| Ш. й'м

„ Яш

Рис. 17. Электрофоретическое разделение в 2%-ном агароэном геле продуктов МС-ПЦР (А), -для ДНК из образцов РСС, ВС и ЕОС (фрагмент 168 п.н. М - маркер с шагом 10 п.н.): и продуктов МЧРА (Б), - для ДНК из 4-х образцов ЯСС до и после (+) гидропиэа иетилчувствительной рестриктазой АсЛ (контроль полноты рестрикции - фрагмент гена [)-ЗА-адаптина 445 п.н.; контроль целостности ДНК - фрагмент экзона 3 "ена ИАН[12, 229 п.н.; анализируемый фрагмент гена ЯАБ$£1А - 357 п.н.; К(-) - отрица'ельный контроль (в отсутствии ДНК); М - маркер с шагом 100 п.н.).

Результаты анализа метилирования гена ЯАЗЭЯМ методом МЧРА в выборке из 59-ти образцов ЯСС суммированы на рис 18

Рис 18 Тестирование методом МЧРА 18 СрЭ-динуклеотидов (даны по горизонтали) промоторной области гена ЯА55Р1А в 59 образцах ДНК ЯСС, метил-чувствительные рестриктазы НраII, Ша\, Ас/1, ВвМ2361, ■ -метилированные Срв, □ -неметилированные Срй Образцы опухолей распределены сверху-вниз по мере снижения стадии рака и степени злокачественности (указаны на рис справа) Образцы опухолей, номера которых помечены* и подчеркиванием, исследованы дополнительно с помощью «бисульфитного секвенирования» (см рис 19) Аналогично исследованы 53 образца ДНК нормальных тканей почки от тех же пациентов

Достоверность данных МЧРА подтверждена бисульфитным секвенированием Данные анализа клонированных продуктов ПЦР 6-ти парных образцов ЯСС (опухоль/норма) приведены на рис 19 Результаты бисульфитного секвенирования и МЧРА сопоставлены для 18 СрО-динуклеотидов промоторной области ЯЛвЭРЫ в этих образцах ЯСС Определена корреляция данных МЧРА и бисульфитного секвенирования для этих 6-ти парных образцов по Фишеру (для образцов Т -Р=0 0003, N - Р=0 026) Корреляцию методов МЧРА и бисульфитного секвенирования, а также МЧРА и МС-ПЦР оценивали также методом ранговой корреляции Спирмана, достоверность коэффициента корреляции (Я?в) рассчитывали с использованием Ответа по таблице распределения Стьюдента (,Р<10г1г)

Проведен полуколичественный МЧРА с целью оценки пула клеток, в которых промоторная область гена ЙАЭЗРЫ подвержена метилированию в образцах опухолей Исследованы 115 образцов ЯСС, ВС и ЕОС по отношению к двум

образцам ДНК, метилированным in vitro с помощью метилтрансферазы Sss/ Показано, что степень метилирования промоторной области гена RASSF1A в ДНК опухолей колеблется от 43% до 97% Таким образом, по-видимому, метод МЧРА выявляет, главным образом, случаи, когда ген подвержен метилированию в существенной доле клеток опухоли В полуколичественном анализе применен фермент Нра\\ Следует отметить, что при анализе метилирования методом МЧРА большинство образцов также подвергали расщеплению с помощью метил-нечувствительной рестриктазы - Msp\ (изошизомер Нра\\) Отсутствие продуктов ПЦР после расщепления ДНК ферментом Msp\ свидетельствовало об очистке ДНК от примесей белков (способных маскировать участки расщепления на ДНК) и подтверждало корректность применения метода МЧРА

Клоны Опухоль Кшы Норма

^^НН HHI'irfUfrtitf'If'II'lfHfWff'H^f 'THfVi f Г If Г?: ГГТГ П"ТТТТ' Hi!—"ГГЛГГ 1 1(3 4 ? гжши 10 1515 у ГИц и ш К «ш ш кГй 24 2£

fcÜJЛЯ ■■ ■ ■■ 304*1 1 1 f и р ГГ 1

304N-3 1 I 1

3WN-4 1 1 1 U и U

виш ■ ■■ ■■ 304JK N , И -i ■ ■ ■

3Ü4N-i 1 Ш _ тг □ J b 1 £ \ П'п

Рис. 19 Применение бисульфитного секвенирования для анализа метилирования 32 Срв-динуклеотидов промоторной области гена ЯАЗЙЯМ (даны по горизонтали) в образцах 1ЧСС 304, 302, 318, 340, 347 и 348 (показаны сверху вниз) Бисульфитное секвенирование проводили после предварительного клонирования продуктов ПЦР

На рис 20 (А) приведены частоты метилирования промоторной области гена RASSF1A в опухолях RCC, ВС и ЕОС и в прилежащей гистологически нормальной ткани На рис 20 (Б) показана связь степени метилирования промоторной области гена RASSF1A с прогрессией опухолей RCC и ЕОС, которую выявили с учетом плотности метилирования CpG-островка Эти данные показывают, что промоторная область гена RASSF1A метилирована в опухолях RCC, ВС и ЕОС с высокой частотой, достигающей 80% Действительно, ген RASSF1A рассматривают как один из наиболее часто и плотно метилируемых генов при разных видах рака (Dammann et al, 2005) Выявление метилирования промоторной области гена RASSF1A в гистологически нормальных тканях онкологических больных согласуется с данными других авторов и указывает на связь этого явления с началом онкогенеза Обнаруженная нами зависимость степени метилирования промоторной области

гена ЯАББРЫ с прогрессией РСС и ЕОС (рис 20 Б) означает, что плотность метилирования этого гена можно использовать в качестве прогностического маркера опухолей почки и яичников

RCC gC ЕОС RCC ЕОС

Рис 20, А Частота метилирования промоторной области гена RASSF1A в образцах ДНК опухолей RCC, ВС и ЕОС и гистологически нормальной ткани по данным МЧРА Б Зависимость степени метилирования (с учетом плотности метилирования CpG-островка) гена RASSF1A от клинической стадии и степени злокачественности RCC и ЕОС Достоверность рассчитана по Фишеру

Анализ метилирования промоторной области гена SEMA3B (LUCA, Зр21 31) методом бисульфитного секвенирования и МЧРА

Продукт гена SEMA3B участвует в передаче сигнала между нейронами, взаимодействуя с аксональными отростками, но может выполнять разнообразные функции в клетках, формирующих другие ткани SEMA3B может ингибировать активацию онкобелков МЕТ и RON, активировать апоптоз и подавлять неоангиогенез в опухолях, конкурируя с VEGF (фактор роста сосудистого эндотелия и основной инициатор ангиогенеза в опухолях) за связывание с Np-рецепторами (нейропилинами) (Bateman et al, 1999, Roche and Drabkin, 2001, Castro-Rivera et al, 2004)

Ген SEMA3B состоит из 18-ти экзонов, (9533 пн, NCBI, Build 36), кодирует мРНК длиной 3 4 т н и белок 750 а о (Lerman & Minna, 2000) Для гена SEMA3B в некоторых клеточных линиях SCLC и NSCLC выявлено метилирование CpG-островка в 5' области гена (Tomizawa et al, 2001), которая, как выяснилось позднее, соответствовала области первого интрона гена (NCBI, Build 36) Мы обнаружили и впервые исследовали дистальный CpG-островок, расположенный в промоторной области гена перед ATG2 (рис 21) Дистальный CpG-островок характеризуется высокой плотностью CpG-динуклеотидов 18 CpG/340 п н (>5%), а проксимальный островок (Tomizawa et al, 2001, Kuroki et al, 2003, Ito et al, 2005) содержит только 8 отдельных CpG на 270 п н (<3%), и не является, по-видимому, истинным CpG-островком

Psmcw гсмозичтюн детей** шуточней G.QO G17 GNM2 ЖИА38

Ц8НГ

IfDlÜMW . №№

Рис. 21. Структурная организация гена ЭЕМАЗВ Показаны 2 Срв-островка проксимальный между нетранслируемым экзоном 1 и транслируемым экзоном 2 (АТС1, по Тотиаша etal, 2001) и дистальный в промоторной области гена (АТС2, по базе N051, версия 36)

Методом бисульфитного секвенирования определен профиль метилирования 16 CpG-динуклеотидов промоторной области гена SEMA3B в 14-ти клеточных линиях RCC, SCLC и NSCLC (9, 3 и 2 линии соответственно) и в 45 образцах первичных опухолей RCC, NSCLC и ЕОС (19, 14 и 12 случаев соответственно), результаты суммированы на рис 22

Рис 22 Данные бисульфитного секвенирования промоторного СрЭ-островка гена ЭЕМАЗВ в образцах ДНК клеточных линий и первичных опухолей ЯСС (А), вСЬС и ^С1_С (Б) и ЕОС (В), приведены также данные для образцов гистологически нормальной ткани почки (А) и яичников (В)

Согласно данным бисульфитного секвенирования частота метилирования промоторного Срб-островка гена ЭЕМАЗВ в образцах ДНК первичных опухолей варьирует от 100% (9/9) в клеточных линиях КСС до 74% (14/19) в первичных опухолях РСС, 71% (10/14) при ЫЭОХ и 50% (6/12) при ЕОС

Более представительные выборки первичных опухолей RCC, ЕОС и ВС (по 5075 пар образцов опухоль/норма) исследованы методом МЧРА С использованием двух метилчувствительных рестриктаз (Hpall и Acil) в промоторной области гена SEMA3B (фрагмент 450 пн) изучено метилирование 11-ти CpG-динуклеотидов Для сравнения, бисульфитное секвенирование фрагмента 340 п н в 5'-области гена SEMA3B позволило оценить метилирование 16-ти CpG (рис 22) Из них 9 CpG -проанализированы двумя методами, что позволило сравнить результаты, полученные двумя независимыми методами

Методом ранговой корреляции Спирмана с учетом коэффициента Стьюдента показана высокая степень соответствия результатов анализа метилирования промоторной области гена SEMA3B в опухолях RCC и ЕОС методами бисульфитного секвенирования и МЧРА (Р<10г12) Итак, соответствие данных, полученных независимыми методами, показано на примере анализа промоторных областей двух генов - RASSF1A и SEMA3B

При выявлении метилирования методом полуколичественного МЧРА степень метилирования варьировала от 45 до 98%, т е промоторная область гена SEMA3B метилирована в половине или более клеток опухоли

Определено соответствие между изменениями степени метилирования и содержания мРНК гена SEMA3B в тех образцах первичных опухолей и клеточных линий, для которых получены обе группы данных С помощью непараметрической корреляции Спирмана показана достоверная обратная корреляция при RCC и ВС снижение уровня мРНК гена SEMA3B в опухолях соответствовало появлению метилирования в промоторной CpG-островке (P<10's) Таким образом, снижение уровня мРНК гена SEMA3B в эпителиальных опухолях в значительной степени связано с метилированием промоторного CpG-островка и, следовательно, метилирование промоторной области гена SEMA3B представляет один из важных путей инактивации этого TSG в эпителиальных опухолях

Промоторная область гена SEMA3B достоверно чаще метилирована в ДНК опухолей, чем в ДНК из соответствующей гистологически нормальной ткани того же пациента (Р<1Сг4 по Фишеру) Эти данные указывают на функциональное значение и высокую специфичность метилирования промоторной области гена SEMA3B в онкогенезе, что важно для применения этого теста в целях диагностики опухолей Согласно данным МЧРА частота метилирования промоторной области гена SEMA3B составила около 50% в опухолях RCC и ЕОС, и несколько ниже при ВС (35%) (рис 23, А) Следует отметить, что в ДНК из крови 15 здоровых доноров не выявлено ни одного случая метилирования промоторного CpG-островка гена SEMA3B

Исследована корреляция частоты (рис 23, Б) и степени метилирования (с учетом плотности метилирования) промоторного CpG-островка гена SEMA3B с клинической стадией и степенью злокачественности опухолей RCC, ВС и ЕОС Выявлена достоверная корреляция частоты метилирования с прогрессией RCC и ВС (Р<0 03) и степени метилирования (с учетом ее плотности) - с прогрессией 3-х видов опухолей, причем с более высокой достоверностью RCC (Р<10'7), ВС (Р<1СГ7) и ЕОС (Р<0 02)

P-ODD iS

Рис. 23. А. Частота метилирования дистального промоторного СрС-островка гена ЭЕМАЗВ в образцах ДИК первичных опухолей КСС, ВС, ЕОС и гистологически-нормальной ткани по данным МЧРА. Б. Корреляция частоты метилирования гена ЭЕМАЗВ с прогрессией Р?СС и ВС. Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.

Ранее были получены данные по метилированию проксимального (не промоторного) CpG-островка гена SEMA3B, причем только для рака легкого (SCLC и NSCLC) (Тоmizawa et al„ 2001; Kuroki et al., 2003; Ito et al., 2005). В работе Grote et at. (2005) в мокроте больных отмечено частое метилирование CpG-островка гена 5ЕШЗВ, как при злокачественных так и при доброкачественных опухолях легкого. Однако, в работе Grote et al. (2005), как и в предыдущих публикациях, авторы анализировали не промоторную область, а прилежащую к начапу второго экзонз Как известно из исследований динамики метилирования гена RASSF1A в опухолях ВС, эта модификация распространяется от экзонов гена к промоторной области, и именно метилирование промоторной области приводит к умолканию гена RASSF1A (Yan et at., 2003). По-видимому, данные, попученные нами для дистального промоторного СрС-островка гена SEMA3B более корректны, чем данные, полученные ранее для проксимальной области гена SEMA3B

Итак, нами показано, что метипирование дистального промоторного CpG-островка гена SEMA3B связано с развитием опухолей разных локализаций, с инактивацией гена в опухолях и выявляется на ранних этапах онкогенеза, но в то же время ппотность метипирования промоторной области гена SEMA3B достоверно повышается с прогрессией опухолей RCC, ВС и ЕОС Таким образом, метилирование дистального CpG-островка промоторной области гена SEMA3B может служить онкамаркером как для ранней диагностики опухолей, так и для прогноза и мониторинга течения этих онкологических заболеваний.

Для гена SEMA3B ранее показана способность лодавпения роста клеточных линий NSCLC и образования олухопей в мышах линии NUDE при трансфекции кДНК в клеточную линию аденокарциномы яичников, что позволяет отнести этот ген

к кандидатам на роль TSG (Тотizawa et al, 2001, Tse et al, 2002) SEMA3B индуцирует апоптоз и подавляет ангиогенез (Castro-Rivera et al, 2004) Промоторная область гена SEMA3B содержит участок связывания белка р53, который индуцирует образование мРНК SEMA3B, и, возможно, ген SEMA3B участвует в проапоптозных сигнальных путях р53 (Ochi et al, 2002)

Нами получены данные о снижении уровня транскрипции гена SEMA3B в опухолях, о роли метилирования промоторной области в инактивации гена и в прогрессии опухолей RCC, ВС и ЕОС Наши результаты согласуются с предположением о способности гена SEMA3B подавлять рост эпителиальных опухолей

Следует отметить, что при анализе метилирования промоторных областей генов RASSF1A и SEMA3B с помощью мультиплексной ПЦР в образцах RCC, ВС и ЕОС выявлено около 20 случаев с гомозиготными делециями в промоторных областях этих генов Интересно, что случаям HD соответствуют наиболее поздние клинические стадии заболевания (Р<0 05), и таким образом, выявление HD в этих генах может служить дополнительным прогностическим маркером

Анализ метилирования промоторной области гена RHOA (МЕСАЗ. Зр21 31 Ген RHOA играет важную роль в адгезии и подвижности клеток, а также в регуляции клеточного цикла и апоптоза (Liberto et al, 2002, Vidal et al, 2002, Vial et al, 2003, Kang et al, 2005) Трансформация клеток m vitro и in vivo при введении гена RHO А позволяет его рассматривать как онкоген (Paterson et al, 1990, Kamai et al, 2003) Нами и другими авторами выявлено преимущественное повышение уровня мРНК этого гена в клеточных линиях и первичных опухолях, и мы обнаружили, что повышение содержания мРНК этого гена связано с умножением его геномных копий (часть 3) Мы исследовали метилирование фрагмента промоторной области гена RHOA в опухолях методом МЧРА с использованием 4-х метилчувствительных рестриктаз по схеме (рис 24), что позволило тестировать 25 CpG-динуклеотидов из 41 CpG данного участка

Рис. 24 Схема анализа метилирования CpG-островка промоторной области гена RHOA с помощью МЧРА и уровня мРНК гена - методом ОТ-ПЦР Показаны позиции праймеров для амплификации фрагмента ОТ-ПЦР RHOA1 (183 п н , экзоны 2 и 3) и фрагмента RHOA2 (437 п н ) CpG-островка Приведена карта участков расщепления фрагмента RHOA2 рестриктазами Нра]\, HhaI, ActI и Bsh1236¡

CpG г « 1 11 MM M Ш $ S 2 3S $ у п «

На рис. 25 суммированы данные изучения 19 образцов ДНК (из 37 исследованных), в которых выявлено метилирование в локусе ННОА2 в ДНК опухоли или нормы (8 случаев ВС и 11 случаев 1^СС).

вс

RCC

ВС

RCC

Эти 19 случаев можно подразделить на две группы: с пониженной (13 случаев) и повышенной (6 случаев) плотностью метилирования промоторной области гена RHOA е опухолях по сравнению с соответствующей нормальной тканью (верхняя и нижняя часть рис. 25). Полное или частичное деметилирование фрагмента RHOA2 в опухолях наблюдается вдвое чаще, чем повышение плотности метилирования: 13/37 vs. 6/37 случаев. Важно, что деметилирование фрагмента RHOA2 во всех 13 случаях сопровождается повышением уровня мРНК гена (рис. 26, верхняя часть). При анализе образцов RCC и ВС с помощью полуколичественного МЧРА пул клеток с метилированием промоторной области гена RHOA варьировал от 42% до 89%.

Таким образом, получены данные, позволяющие предполагать активацию транскрипции гена RHOA в опухолях за счет умножения копий гена, и/или посредством деметилированчя CpG-островков промоторной области этого гена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведен анализ аллельных дисбалансов на коротком плече хромосомы 3 в пяти видах эпителиальных опухолей с применением идентичного набора полиморфных микросателлитных маркеров. Показано, что все исследованные виды опухолей характеризуются высокой частотой случаев с аллельными дисбалансами на Зр и преобладанием «множественных» внутренних делеций, которые могут указывать на присутствие нескольких TSG. Однако, частота аллельных дисбалансов и размеры делетируемых участков существенно выше в опухолях почки и легкого, чем в опухопях молочной железы, яичников и шейки матки. Эти различия можно объяснить тем. что повреждения на Зр в тканях почки и легкого возникают на более ранних стадиях онкогенсза.

Применение идентичного набора полиморфных микросателлитных маркеров позволило определить районы Зр, предположительно содержащие гены, общие для

ОПртЩ,

Норма

Рис. 25. Метилирование фрагмента РНОА2 {437 п.н., 25 Срв) промоторной области гена RHOA в 19 образцах ДНК опухолей и соответствующих морфологически нормапьных тканей по данным МЧРА. Черный прямоугольник - метилирование выявлено, белый - не выявлено. Справа приведены данные об изменении (повышении или понижении) уровня мРНК гена ЯНОА в опухолях по сравнению с нормой

опухолей разных локализаций и специфичные только для определенных видов опухолей Этот подход позволил подтвердить значение района Зр21 3 в развитии эпителиальных опухолей и открыть в этой области 3-й критичный район МЕСАЗ, содержащий группу генов, прямо или косвенно участвующих в канцерогенезе Анализ изменений уровня мРНК и структурных изменений в этих генах позволил выявить гены с TSG-подобным поведением и протоонкогены

На основании полученных данных можно сравнить опухоли разной локализации по уровню мРНК определенных генов и степени метилирования их промоторных областей Так, снижение уровня мРНК для кандидата на роль TSG гена SEMA3B и для некоторых генов из района МЕСАЗ чаще наблюдается при RCC, и напротив, случаи с повышенной активностью протоонкогена RHOA и других генов чаще выявлены в опухолях ВС С использованием представительных выборок образцов RCC, ВС и ЕОС (по 50-60 случаев) показано, что промоторные области генов RASSF1A и SEMA3B чаще подвержены метилированию при RCC (до 50-80%), и несколько реже в других формах опухолей

В представленной работе получены данные о структурных изменениях (метилирование промоторных областей, делеции, умножение копий гена, мутации) и изменениях уровня мРНК в опухолях для 10 генов Сопоставление структурных и функциональных изменений позволило определить семь кандидатов на роль TSG (гены RBSP3, GPX1, DAG1, RASSF1A, NPRL2/G21, SEMA3B и W91914) и три кандидата на роль протоонкогенов (RHOA/ARHA, MSTR1/RON и USP4) Данные суммированы в таблице 6

Для большинства кандидатов на роль TSG другими авторами получены данные об их способности к подавлению роста опухолей, а для кандидатов в онкогены - свидетельства о способности к онкогенной трансформации клеток (табл 6) Белковые продукты этих генов выполняют жизненно-важные функции клетки регуляция клеточного цикла, адгезия, подвижность и пролиферация клеток, индукция апоптоза, ангиогенеза, репарация неспаренных оснований в ДНК опухолей, передача сигналов через мембрану и внутри клетки, формирование базальной мембраны и сохранение целостности ткани (табл 6)

По-видимому, многие из этих генов участвуют в разнообразных сигнальных путях клетки и их пересечениях и связаны с ключевыми процессами канцерогенеза эпителиальных опухолей

Так, гены GPX1 и SEMA3B, расположенные в соседних областях (МЕСАЗ и LUCA), оба вовлечены в индуцируемые р53 проапоптозные пути Как транскрипционный фактор р53 активирует транскрипцию GPX1 и SEMA3B (рис 26) Кроме того, в индукции апоптоза участвует ген RASSF1A, но по другим механизмам - взаимодействуя с продуктом онкогена ras и/или с продуктом гена MST1 Онкоген RHOA может участвовать в стимуляции апоптоза при наличии определенных факторов - ингибиторов циклин-зависимых киназ р21 и р27 (рис 26)

В регуляции клеточного цикла также участвуют несколько генов из областей АР20, LUCA и MECA (Зр21 3), это - TSG RBSP3 и RASSF1A и онкоген RHOA (рис 27)

Ген (район Зр) Уровень мРНКв опухолях* Структурные дефекты, изменяющие экспрессию гена (синтез РНК и /или белка ***) Функции гена или продукта гена в нормальной и опухолевой клетке ***

Кандидаты на роль TSG

CTDSPU RBSP3 (АР20, Зр21 33) Уменьшение уровня мРНК в опухолях 14/20 vs 6/20 ** Выявлены точечные мутации и делеции в гене, которые могут снижать активность белкового продукта1 Семейство генов малых С-концевых фосфатаз (полипептид А РНК полимеразы II) /фосфатаза на Зр, специфично дефосфорилирующая определенные серины, в частности на белке RB1, что приводит к его активации Подавление роста опухолевых клеток in vitro и in vivo 1

GPX1 (МЕСАЗ Зр21 31) Снижение уровня мРНК в клеточных линиях (RCC, ВС, ЕОС, 3/11) и в первичных опухолях (RCC и ВС 8/37 vs 4/37) ** Гомозиготные делеции в промоторной области гена вРХ1, обнаруженные в 12% (6/50) образцов РСС - один из путей снижения транскрипционной активности гена ** Глутатионпероксидаза защищает клетки от окислительного стресса Промоторная область гена GPX1 связывает р53, что сопровождается повышением экспрессии GPX1 и стимуляцией апоптоза2'3 Подавляет рост линии клеток эндотелия ECV3044

DAG1 (МЕСАЗ Зр21 31) Частое снижение уровня мРНК* в первичных опухолях RCC 7/19 vs 5/19 ** Снижение экспрессии белкового продукта дистрогликана в клеточных линиях опухолей5,6 Дистрогликан осуществляет взаимодействие цитоскелета с внеклеточным матриксом и участвует в адгезии5 Введение кДНК DAG1 ингибировало рост клеток MCF77

RASSF1A (LUCA, Зр21 31) Снижение уровня мРНК в 9 из 11 клеточных линий RCC (82%) ** Промоторная область метилирована в 11 клеточных линиях RCC и в первичных опухолях РСС (81%), ВС (72%) и ЕОС (71%) ** RASSF1A участвует в торможении клеточного цикла, в индукции апоптоза и в стабилизации микротрубочек8" 11 Подавление роста опухолей показано in vitro, in vivo и с помощью нокаут-мутаций гена в клетках мыши 12-1

*Рассмотрены случаи изменения уровня мРНК в 3 и более раз **Из результатов нашей работы

Цитированные источники 1Kashuba et al, 2004,2Тап et al, 1999,3Hussain et al, 2004, 4Faucher et al, 2003, *Bœnnan et al, 2004,6Jmg et al, 2004, 7Sgambato et al, 2004, "Shivakumar et al, 2002, sVo$etal, 2000,10Oft et al, 2006, "Пфайфер иДамманн,, 2005, 12Dreijermk et al, 2001, ™Zabarovsky et al, 2002,14Dammarm et al, 2005

Ген (район Зр) Уровень мРНКв опухолях* Структурные дефекты, изменяющие экспрессию гена (синтез РНК и /или белка) Функции гена или продукта гена в нормальной и опухолевой клетке***

Кандидаты на роль TSG (продолжение)

NPRL2/ G21 (LUCA, Зр21 31) Потеря основного транскрипта 1 8тпн в клеточных линиях ИСС (7/7)16 Гомозиготные делеции в З'-части гена в клеточных линиях (ЧСС (5/7) и в первичных опухолях 1*СС, ВС и ЕОС приводят к потере основного транскрипта ** NPRL2 (аналог-2 регулятора азот-пермеазы), относится к семейству ядерных растворимых белков, имеет гомологию с белком репарации MutS Подавляет рост опухолевых клеток in vitro и in vivo, инактивация в GIT15

SEMA3B (LUCA, Зр21 31) Снижение уровня мРНК в 4-х из 11-ти клеточных линий ИСС, ВС и ЕОС (36%) и в 6/19 (32%) первичных опухолей (ГСС ** Частота метилирования промоторной области гена в первичных опухолях ВС, ЕОС, РСС и ывсьс варьирует от 35% до 70%, выявлена корреляция между метилированием и снижением уровня мРНК в опухолях КСС и ВС ** SEMA3B ингибирует активацию онкобелков МЕТ и RON, подавляет неоангиогенез в опухолях и активирует апоптоз1617 Промоторная область гена SEMA3B связывает белок р53, который индуцирует образование мРНК SEMA3B, и, по-видимому, ген SEMA3B участвует в сигнальных путях р5318 Показана способность подавления роста клеток опухолей in vitro и in vivo19,20

W91914 (,DUTT1, Зр12 3) В опухолях чаще снижение уровня РНК гена, чем повышение 9/20 ^ 7/20, снижение выявлено при ВС (5/10) и 1ЧСС (4/6) ** Инактивацию гена ОиТТ1 (ТБв) наблюдали в тех же опухолях - ВС и ЯСС 21'й Ген И/91914 транскрибируется в том же направлении, что и 0итт1, и можно предполагать корегуляцию их активности W91914 - ген малой РНК, не кодирующей белок Предполагают, что ген W91914 модулирует функцию DUTT1 посттранскрипционно, как многие гены малых не кодирующих белок РНК, локализованные в интронах более крупных генов ,24

*Рассмотрены случаи изменения уровня мРНК в 3 и более раз **Из результатов нашей работы

Цитированные источники (продолжение) 1S Li et al, 2004, wBateman et al, 1999,17Roche and Drabkin, 2001, ™Ochi et al, 2002, ™Tomizawa et al, 2001,20Tse et al, 2002,21 Dallol et al, 2002, 22Xian et al, 2004, ri Conrad et al, 2002,24Esquela-Kersher & Slack, 2006

Ген (район Зр) Уровень мРНК в опухолях* Структурные дефекты, изменяющие экспрессию гена (синтез РНК и /или белка) Функции гена или продукта гена в нормальной и опухолевой клетке***

Кандидаты на роль онкогенов

RHOA/ ARHA (МЕСАЗ Зр21 31) Уровень мРНК увеличивается в 6 из 11 клеточных линий RCC, ВС и ЕОС, в первичных опухолях RCC и ВС увеличение в 16/37 vs 5/37** Выявлено умножение копий гена и деметилирование его промоторной области, которые сопровождаются повышением уровня мРНК** Ген RHOA кодирует белок суперсемейства Ras-гомологичных малых гуанозинтрифосфатаз Играет роль в адгезии, в регуляции клеточного цикла и апоптоза25"28 Вызывает онкогенную трансформацию клеток in vitro и in vivo29, усиливает инвазию опухолей30

MST1R/ RON (МЕСАЗ Зр21 31) Потеря функционального полноразмерного транскрипта (4 5 т п н ) при сохранении короткого онкогенного транскрипта (2 т п н ) в линиях клеток SCLC и NSCLC 35 Точечные мутации и потеря 5-го и 6-го экзонов активируют лротоонкоген31. Метилирование проксимального промотора в линиях клеток ЭСЬС и ЫвСЬС связано с потерей транскрипта 4 5 т п н ** Полноразмерный MST1R/R0N (рецептор MST1) имеет три домена внеклеточный, трансмембранный и внутриклеточный (тирозинкиназный)30 Ген RON может вызывать онкогенную трансформацию клеток in vitro и in vivo и повышать инвазию опухолей33,34

USP4 (МЕСАЗ Зр21 31) Повышение уровня мРНК USP4при SCLCи NSCLC 36 Уровень транскрипта UnpEL увеличен при RCC и уменьшен при ЕОС и СС, а уровень UnpES (потеря 7-го экзона) изменяется мало ** Роль альтернативного сплайсинга в регуляции уровня функционально более значимого транскрипта 11прЕ1-(сохранившего каталитический домен карбокси-терминальной гидролазы) в опухолях Ген USP4 кодирует убиквитин-специфическую протеазу Может останавливать процесс протеолитической деградации короткоживущих белков, в том числе регуляторных белков клетки, включая р53 и pRb36 Введение кДНК вызывает онкогенную трансформацию клеток NIH3T337

*Рассмотрены случаи изменения уровня мРНК в 3 и более раз **Из результатов нашей работы

Цитированные источники (продолжение) 25Liberto et а/, 2002,2S Vidal et al, 2002,27 Vial et al, 2003,28Kang et al, 2005, ™ Pater son et al, 1990,30Kamai et al, 2003,31 Wang et al, 2000, г2Апде!от et al, 2000, ™Wang et al, 2003, MXu et al, 2004, 35Angelom et al, 2007,36DeSalle et al, 2001, "Grayetal, 1995

Рис. 26. Схема участия генов RASSF1A, SEMA3B, GPX1 и RHOA в стимуляции апоптоза

Рис. 27. Схема участия генов RASSFfА и RBSP3 в аресте клеточного цикла, а гена RHOA - в продвижении клеточного цикла.

Возможна кооперация TSG RBSP3 и RASSF1A в задержке клеточного цикла в результате участия их белковых продуктов в понижении содержания фосфорилированной формы RBI RBSP3 непосредственно дефосфорилирует RB1, a RASSF1A блокирует накопление циклина D1, что подавляет фосфорилирование RB1 и тормозит переход клеток между фазами Gi/S (рис 27) Таким образом, можно предполагать синергизм некоторых генов Зр, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла и эпоптоза а также можно предполагать существование на Зр системы генов, связанных с канцерогенезом.

Кроме теоретического, представленные результаты имеют практическое значение. Выявление метилирования промоторных областей генов RASSF1A и

SEMA3B в гистологически нормальных образцах тканей пациентов показало, что эти изменения происходят на ранних стадиях онкогенеза, и таким образом, эти тесты могут быть использованы для ранней диагностики опухолей в комплексе с другими аналогичными молекулярными маркерами, а также цитогенетическими и клиническими критериями Корреляция уровня метилирования (с учетом плотности) промоторных областей генов RASSF1A и SEMA3B с клинической стадией и степенью злокачественности опухолей, выявленная нами для опухолей почки, яичников и молочной железы, позволяет предложить эти тесты для прогноза и мониторинга течения этих заболеваний Следует заметить, что промоторная область гена RASSF1A метилирована существенно чаще, чем в случае гена SEMA3B, а зависимость от прогрессии опухолей более достоверно показана для гена SEMA3B Таким образом, анализ метилирование промоторной области гена RASSF1A более важен при первичной диагностике опухоли, а тестирование промоторной области гена SEMA3B - для прогноза заболевания, например, послеоперационного

В качестве дополнительных прогностических маркеров можно также предложить гомозиготные делеции в промоторных областях генов RASSF1A и SEMA3B, так как среди 20 выявленных случаев HD подавляющее большинство характеризуется наиболее поздними клиническими стадиями заболевания (Р<0 05) Идентифицированные нами новые полиморфные маркеры на Зр нашли применение для локализации районов, часто повреждаемых в опухолях и содержащих кандидаты в TSG и онкогены Нами выявлена положительная достоверная корреляция между частотой аллельных дисбалансов в полиморфных маркерах трех «критичных» районов Зр21 3 (LUCA, АР20, МЕСАЗ) и прогрессией опухолей почки и яичников Эти закономерности могут указывать на участие и других генов из этих районов (помимо RASSF1A и SEMA3B) в прогрессии этих форм опухолей В связи с этим, частота аллельных дисбалансов полиморфных маркеров из районов LUCA, АР20 и МЕСАЗ и уровень транскрипции и/или метилирования некоторых генов из этих районов также могут оказаться полезными прогностическими маркерами

Нами разработан вариант МЧРА с применением набора метил-чувствительных рестриктаз, позволяющий тестировать метилирование большей части CpG-динуклеотидов промоторной области гена, что сопоставимо с бисульфитным секвенированием В наших исследованиях показана достоверная корреляция МЧРА с бисульфитным секвенированием (Р<0 001 по Фишеру и Р£10>6 согласно ранговой корреляции Спирмана) Известно, что циркулирующие в крови клетки или частицы клеток опухолей можно выявлять в плазме крови и других биологических жидкостях пациентов (в моче, мокроте и т п) с помощью анализа метилирования промоторных областей важных генов, например р16 (Palmisano et al, 2000) Однако при этом важно использовать достаточно чувствительный и мягкий метод, не вызывающий дальнейшей деградации полуразрушенной ДНК циркулирующих в крови клеток опухолей МЧРА несопоставимо мягче бисульфитной конверсии (разрушающей до 90% ДНК), что резко повышает чувствительность метода МЧРА Таким образом, МЧРА, причем

усовершенствованный нами вариант с применением набора рестриктаз, представляется нам наиболее оптимальным методом, пригодным для подобных исследований даже в условиях клиники В качестве дальнейших перспектив необходимо изучение роли метилирования в механизме эпигенетических модификаций, приводящих к «запиранию» гена или к его активации Как видно на примере генов SEMA3B и MST1R/RON, необходимы детальные исследования метилирования разных CpG-островков и сопоставление этих данных с уровнем мРНК гена или альтернативных транскриптов

Нами открыт новый район на Зр, в котором содержатся до 30 генов В этой работе нами исследованы только те гены, для которых имелись сообщения в литературе об их функциональной роле в клетке и о возможном участии в онкогенезе Представляется перспективным скринировать все гены этого района с применением современной методологии микропанелей Многообещающим в поиске новых генов, связанных с канцерогенезом, представляется применение геномных А/ой-микропанелей, разработанных в лаборатории Е Р Забаровского при нашем участии Л/ой-микропанели - это принципиально новые, геномные микропанели, обладающие рядом ценных достоинств анализ генов, не представленных в клонотеках кДНК, низкое содержание геномных повторов и высокая чувствительность A/ofl-микропанели - это первые микропанели, позволяющие одновременно выявлять генетические нарушения (геми- и гомозиготные делеции и амплификации) и эпигеномные аномалии (например, метилирование генов) в опухолях В первую очередь нами отобраны гены на Зр, обнаружившие такие аномалии в опухолях разных локализаций ITGA9, NKIRAS1, RBSP3, MINT24, GATA-2, BHLHB2 Для некоторых из этих генов ранее не было известно, что они вовлечены в развитие эпителиальных опухолей или, что их участие в онкогенезе сопряжено с метилированием В дальнейшем требуется детальное исследование транскрипции и метилирования новых генов в опухолях разного происхождения и разной степени прогрессии

Важной задачей молекулярной медицины является подбор панелей из нескольких маркеров, оптимальных для диагностики и прогнозирования социально-опасных видов опухолей К таким заболеваниям относятся опухоли яичников (выявляемые на поздних стадиях) и опухоли почки (которые часто не подлежат операбельному вмешательству и лечатся с помощью иммунотерапии), а также широко распространенные опухоли молочной железы К настоящему времени подобраны эпигенетические маркеры, выявляющие рак молочной железы, - 5 маркеров (RASSF1A, HIN-1, RAR-beta2, Cyclin D2 и Twist) позволяют в 100% случаев выявить метилирование хотя бы в одном из этих генов, и тем самым установить наличие опухоли (Fackler et al, 2003) Несколько более сложная ситуация с диагностикой и прогнозированием опухолей почки и яичников Нами показаны высокие частоты (40-80%) метилирования промоторных областей генов RASSF1A и SEMA3B в этих опухолях и возможность их применения, как в качестве диагностических маркеров, так и с целью мониторинга течения заболевания (по данным плотности метилирования этих генов) Подбор новых маркеров, в первую

очередь, потребует идентификации новых генов, изменяющих профиль метилирования промоторных областей в злокачественных опухолях

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1 Установлено распределение ди-, три- и тетрануклеотидных микросателлитов в 150 Л/оМ -связующих и Л/оМ-прыжковых клонированных фрагментах ДНК хромосомы 3 и в 22 космидных ДНК из района LUCA (Зр21 31), а также в клонированных фрагментах ДНК упорядоченной космидной клонотеки хромосомы 13 Определены нукпеотидные последовательности фрагментов ДНК (до 33 т п н), содержащих микросателлиты Исследован полиморфизм 15 локусов микросателлитов и идентифицированы 7 полиморфных и 8 STS-маркеров

2 Проведен анализ аллельных дисбалансов на коротком плече хромосомы 3 (Зр) в 5-ти видах эпителиальных опухолей (почки, легкого, молочной железы, яичников и шейки матки) с применением идентичного набора полиморфных микросателлитных маркеров Эти 5 видов опухолей характеризуются высокой частотой (79-93%) случаев с аллельными дисбалансами в маркерах Зр Преобладание множественных внутренних делеций может указывать на присутствие нескольких генов-супрессоров опухолевого роста (TSG)

3 На Зр локализованы четыре «критичных» района, предположительно содержащих TSG, общие для опухолей разного вида Кроме того, на Зр обнаружены районы генов-кандидатов, специфичных для определенных видов опухолей

4 Впервые идентифицирован 3-ий «критичный» район в области Зр21 3 -МЕСАЗ Высокие частоты потерь и амплификации аллелей полиморфных маркеров в районе МЕСАЗ в опухолях указывают на локализацию в этом районе как потенциальных TSG, так и онкогенов

5 Выявлена положительная корреляция частоты аллельных дисбалансов в полиморфных маркерах трех районов Зр21 3 (LUCA, АР20, МЕСАЗ) с клинической стадией и степенью злокачественности почечноклеточного рака (RCC) и серозного рака яичников (ЕОС), что указывает на возможное участие некоторых генов из этих районов в прогрессии RCC и ЕОС

6 Показано частое снижение уровня мРНК 6-ти генов Зр (RBSP3/HYA22, RASSF1A, SEMA3B, GPX1, DAG1 и W91914) в клетках опухолей В 4-х из этих генов (.RBSP3/HYA22, RASSF1A, SEMA3B и GPX1) выявлены структурные дефекты, которые могут снижать содержание мРНК или приводить к образованию неактивного белкового продукта

7 Повышение уровня мРНК онкогена RHOA в эпителиальных опухолях может быть вызвано умножением копий гена и/или деметилированием его промоторной области

8 Показана роль структурных дефектов в изменение уровней альтернативных транскриптов для генов NPRL2/G21 и MST1R/RON в опухолях Потеря основного функционального транскрипта гена NPRL2/G21 связана с делециями в З'-области гена Метилирование промоторной области функционального полноразмерного транскрипта гена MST1R/RON сопровождается снижением уровня этого транскрипта (при сохранении укороченного онкогенного транскрипта)

9 Промоторная область гена RASSF1A (район LUCA) метилирована с высокой частотой (до 80%) в первичных опухолях и клеточных линиях RCC, что сопровождается снижением уровня мРНК Выявлена достоверная корреляция степени метилирования промоторной области гена RASSF1A с прогрессией опухолей почки и яичников

10 Показана относительно высокая частота метилирования дистального промоторного CpG-островка гена SEMA3B (LUCA) в клеточных линиях и первичных опухолях легкого, почки, молочной железы и яичников, варьирующая от 35 до 70% Выявлена достоверная корреляция между метилированием промоторной области и снижением уровня мРНК в опухолях Установлена достоверная корреляция степени метилирования промоторной области гена SEMA3B с профессией опухолей почки, молочной железы и яичников

11 В итоге всего цикла исследований на хромосоме 3 человека впервые локализован район МЕСАЗ, содержащий потенциальные TSG и протоонкогены Установлено прямое или косвенное участие в онкогенезе 10-ти генов Зр Выявлены структурные и/или функциональные изменения в 10-ти генах Зр в эпителиальных опухолях, позволяющие отнести эти гены к кандидатам на роль TSG или к потенциальным онкогенам Впервые показана роль метилирования промоторных областей TSG RASSF1A, SEMA3B и онкогенов RHOA и MST1RIRON в онкогенезе Выдвинута гипотеза о синергизме генов Зр SEMA3B, GPX1, RHOA и RASSF1A в процессе инициации апоптоза и о кооперации генов RASSF1A и RBSP3 в регуляции клеточного цикла Впервые сделано предположение о существование на Зр системы генов, связанных с ключевыми процессами канцерогенеза

12 Анализ метилирования промоторных областей генов RASSF1A и SEMA3B можно использовать для разработки новых эпигенетических маркеров и их применения в комплексной диагностике злокачественных новообразований

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Брага Э А., Капанадзе Б И , Куприянова Н С , Иванова Г М , Бродянский В М , Нечволодов К К, Шкутов Г А , Рысков А П , Носиков В В , Янковский Н К Анализ распределения микросателлитов семи мотивов в составе космид упорядоченной клонотеки хромосомы 13 человека Молекуляр биология 1995,29 1001-1010

2 Иванова Г M , Чистяков Д А , Федорова Л И , Захарьев В M , Котова Е Ю , Банников В M , Красильников А С , Турецкая Р Л , Ратманова К И , Вейко В П , Зеленин А В , Янковский H К, Брага Э А. Тетрануклеотмдные маркеры на основе упорядоченной клонотеки хромосомы 13 человека Молекуляр биология 1997, 31 407-417

3 Брага Э.А , Котова Е Ю , Пугачева Е M , Гизатуллин Р 3 , Кашуба В И , Лерман M И , Аксенова M Г, Ефремов И А , Забаровский Е Р, Киселев Л Л Хромосома 3 человека поиск микросателлитов, анализ их распределения и формирование маркеров Молекуляр биология 1997, 31 988-999

4 Базов И В , Аксенова M Г, Казубская Т П , Смирнов А В , Забаровский Е Р и Брага Э.А Анализ аллельных потерь в области короткого плеча хромосомы 3 в карциномах почки, тела матки и яичников с помощью три- и тетрамерных маркеров Молекуляр биология. 1997, 31 805-809

5 Braqa Е., Pugacheva Е, Bazov I, Ermilova V, Kazubskaya Т, Mazurenko N , Kisseljov F , Liu J , Garkavtseva R , Zabarovsky E , Kisselev L Comparative allelotyping of the short arm of human chromosome 3 rn epithelial tumors of four different types FEBS Letters 1999,454 215-219

6 Kashuba VI, Gizatullin R Z , Protopopov AI, Li J , Vorobieva N V, Fedorova L, Zabarovska VI, Muravenko О V, Kost-Alimova M , Domninsky D A , Kiss С , Allikmets R , Zakharyev V M , Braqa E.A . Sumegi J , Lerman M , Wahlestedt С , Zelenin A V, Sheer D, Winberg G , Grafodatsky A , Kisselev L L , Klein G , Zabarovsky E R Analysis of Not\ linking clones isolated from human chromosome 3 specific libraries Gene. 1999, 239 259-271

7 Liu J , Zabarovska VI, Braqa E . Alimov A , Klein G , Zabarovsky E R Loss of heterozygosity in tumor cells requires réévaluation the data are biased by the size-dependent differential sensitivity of allele detection FEBS Letters 1999,462 121-128

8 Zabarovska V, Li J , Muravenko О , Fedorova L , Braqa E , Ernberg I, Wahlestedt С , Klein G, Zabarovsky E R CIS - cloning of identical sequences between two complex genomes Chromosome Res 2000, 8 77-84

9 Dreijerink К , Braqa E . Kuzmin I, Geil L , Duh F -M , Angelom D , Zbar В , Lerman M I, Stanbridge E J , Minna J D , Protopopov A , Li J , Kashuba V , Klein G , Zabarovsky E The candidate tumor suppressor gene, RASSF1A, from human chromosome 3p21 3 is involved in kidney tumorigenesis Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98 7504-7509

10 Базов ИВ, Казубская ТП, Ермилова ВД, Гарькавцева РФ, Логинов В И, Забаровский E Р , Брага Э.А Картирование аллельных делеций на коротком плече хромосомы 3 человека в опухолях почки Молекуляр биология 2001, 35 404-412

11 Braga E., Senchenko V, Bazov I, Loginov W, Ermilova V, Kazubskaya T, Garkavtseva R, Mazurenko N, Kisseljov F , Liu J , Kisselev L, Lerman M , Klein G , Zabarovsky E Critical tumor-suppressor gene regions on chromosome 3p major human epithelial malignancies allelotyping and quantitative real time PCR Int J Cancer 2002, 100 534-541

12 Li J , Protopopov A, Wang F , Sentchenko V, Petushkov V , Vorontsova О , Petrenko L , Zabarovska V, Muravenko О , Braga E . Kisselev L, Lerman M I, Kashuba V, Klein G, Ernberg I, Wahlestedt С, Zabarovsky E NotI subtraction and Л/oil-specific microarras to detect copy number and methylation changes in whole genomes Proc Natl Acad Sci, USA 2002, 99 10724-10729

13 Sulimova G E , Kutsenko A S , Rakhmanaliev E R , Udina I G , Kompaniytsev A A, Protopopov AI, Moisjak E V, Kitmov E A, Muravenko О V, Zelenin A V , Braga E A, Kashuba VI, Zabarovsky E R , Kisselev L L Human chromosome 3 integration of 60 Nott clones into a physical and gene map Cytogenet Genome Res 2002, 98 177-183

14 Брага ЗА.. Кашуба В И , Малюкова А В , Логинов В И , Сенченко В Н , Базов И В , Киселев Л Л , Забаровский Е Р Новые гены-супрессоры опухолевого роста в горячих точках хромосомы 3 человека новые методы идентификации (обзор) Молекуляр биология 2003,37 194-211

15 Angeloni D , Duh F -М , Dean М , Zabarovsky Е R, Braga E . Sentchenko V, Lerman Ml С to A single nucleotide polymorphism in mtron 18 of the human MST1R (RON) gene that maps at 3p21 3 Molecular and Cellular Probes 2003,17 55-57

16 Брага Э.А., Киселев Л Л , Забаровский ЕР От идентификации геномных полиморфизмов к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей человека (обзор) Молекуляр биология 2004,38 179-190

17 Kashuba VI, Li J, Wang F, Senchenko VN, Protopopov A, Malyukova A, Kutsenko A S , Kadyrova E , Zabarovska VI, Muravenko О V, Zelenin A V , Kisselev L L, Kuzmin I, Minna J D , Winberg G , Ernberg I, Braga E, Lerman M I, Klein G , Zabarovsky E R RBSP3 (HYA22) is a tumor suppressor gene implicated in major epithelial malignancies Proc Natl Acad Sci, USA 2004,101 4906-4911

18 Логинов ВИ, Малюкова AB, Серегин ЮА, Ходырев ДС, Казубская ТП, Ермилова В Д , Гарькавцева Р Ф , Киселев Л Л, Забаровский Е Р , Брага Э.А Уровень метилирования гена RASSF1A в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников Молекуляр биология 2004, 38 654-667

19 Малюкова АВ, Логинов ВИ, Ходырев ДС, Кадырова ЕЛ, Пронина ИВ, Иванова ТА, Киселев ФЛ, Забаровский Е.Р, Киселева НП, Брага ЭА

Метилирование предполагаемого гена-супрессора RASSF1A в опухолях шейки матки Молекуляр биология 2004,38 1005-1013

20 Li J , Wang F , Haraldson К , Protopopov A , Duh F -M , Geil L , Kuzmin I, Minna J D , Stanbridge E, Braaa E , Kashuba V, Klein G , Lerman M I, Zabarovsky E R Functional characterization of the candidate tumor suppressor gene NPRL2IG21 located in Зр21 3C Cancer Res 2004,64 6438-6443

21 Киселев Л Л , Сенченко В Н , Опарина Н Ю , Брага Э А. Забаровский Е Р Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека (обзор) Молекулярная медицина 2005,3 17-28

22 Angeloni D , Тег Elst А, Wei М Н , van der Veen A Y , Braaa E.A. Klimov E A, Timmer T, Korobeinikova L , Lerman M I, Buys С H Analysis of a new homozygous deletion in the tumor suppressor region at 3p12 3 reveals two novel intronic noncoding RNA genes Genes Chromosomes Cancer 2006,45 676-691

23 Брага Э.А. Логинов В И , Климов Е А, Килосанидзе Г, Ходырев Д С , Каганова Н Л , Казубская Т П , Ермилова В Д, Гарькавцева Р Ф , Пронина И В , Рудько О И , Забаровский Е Р , Сулимова Г Е , Киселев Л Л Активация транскрипции гена RHOA в эпителиальных опухолях может быть вызвана умножением копий гена и/или деметилированием его промоторной области Молекуляр биология 2006, 40- 865877

24 Angeloni D , Danilkovitch-Miagkova А, Ivanova Т, Braga Е , Zabarovsky Е , Lerman М I Hypermethylation of Ron proximal promoter associates with lack of full-length Ron and transcription of oncogenic short-Ron from an internal promoter Oncogene 2007, 264499-4512

Представленные исследования на протяжении длительного времени были поддержаны грантами Программы РФ «Геном Человека» и Российского Фонда Фундаментальных Исследований

Автор выражает глубокую благодарность академику Л Л Киселеву за постоянный интерес к данным исследованиям, за обсуждение результатов диссертационной работы на всех ее этапах, за полезные критические замечания, советы, консультации и большую помощь при подготовке рукописи

Автор выражает искреннюю благодарность проф Е Р Забаровскому, проф Р Ф Гарькавцевой, проф Г Е Сулимовой и всем коллегам, сотрудничество с которыми позволило осуществить эту работу Автор выражает признательность научному руководителю ФГУП «ГосНИИ генетика» член-корр РАН В Г Дебабову и зав лабораторией проф В В Носикову за поддержку при выполнении диссертации

Напечатано с готового оригинал-макета

Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01 12 99 г Подписано к печати 17 09 2007 г Формат 60x90 1/16 Услпечл 2,0 Тираж 100 экз Заказ 440 Тел 939-3890 Тел/Факс 939-3891 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы,МГУ им MB Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Брага, Элеонора Александровна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Критерии злокачественной трансформации и возникновения опухоли

1.2. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста (TSG)

1.3. Нестабильность генома и повреждения «онкозначимых» генов в опухолях

1.4. Роль метилирования ДНК при онкогенезе

1.4.1. CpG-островки в геноме человека

1.4.2. Гипометилирование генома опухолей 28 1.4.3 .Гиперметилирование CpG-островков TSG в опухолях 30 1.4.4. Эпигенетические механизмы инактивации генов

1.5. Основные подходы при поиске «онкозначимых» генов

1.5.1. Анализ аллельных делений и умножения копий гена в опухолях

1.5.2. Участки хромосомы, подавляющие рост опухоли

1.5.3. «Вычитающая» гибридизация как способ отбора онкогенов и

1.5.4. Применение микропанелей для скрининга генов, изменяющих копийность, метилирование или экспрессию в опухолях

1.5.5. Анализ метилирования промоторных районов генов-кандидатов на роль TSG и онкогенов

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клонотека рекомбинантных космид хромосомы

2.2. Клоны хромосомы

2.3. Выделение ДНК

2.4. Расщепление ДНК рестриктазами и реакции лигирования

2.5. Получение компетентных клеток E.coli JM109 и DH5a и трансформация плазмидной ДНК

2.6. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК

2.7. Окрашивание фрагментов ДНК в полиакриламидном геле

ПААГ) азотнокислым серебром.

2.8. Мечение олигонуклеотидных зондов с применением полинуклео-тидкиназы фага Т4 и гибридизация по Саузерну

2.9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

2.10. Определение нуклеотидной последовательности клонированных фрагментов ДНК

2.11. Статистическая обработка данных скрининга панелей

2.12. Определение частоты встречаемости аллей и генотипов

2.13. Образцы первичных опухолей

2.14. Клеточные линии опухолей и их культивирование

2.15. Анализ аллельных дисбалансов (AI) полиморфных маркеров хромосомы Зр в ДНК опухолей

2.16. Мультиплексная ПЦР для анализа копийности фрагментов ДНК и картирования гомозиготных делеций (HD)

2.17. Анализ метилирования ДНК с применением метилчувствительных рестриктаз

2.18. Бисульфитпая конверсия ДНК

2.19. Метилспецифичиая полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР)

2.20. Бисульфитное секвенирование

2.21. Компьютерный анализ баз данных проекта SAGE (серийного анализа экспрессии генов )

2.22. Выделение РНК

2.23. Синтез кДНК

2.24. Полуколичественная ОТ-ПЦР

2.25. Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ)

2.26. Статистические методы при анализе частот AI полиморфных 82 маркеров, частот изменения уровня мРНК генов и метилирования промоторных областей

2.27. Основные компьютерные программы, использованные в работе

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Идентификация микросателлитных маркеров на хромосомах

3.1.1. Микросателлиты на хромосоме

3.1.1.1. Частоты встречаемости и особенности распределения ди-, три- и тетрануклеотидных микросателлитов семи мотивов в космидах упорядоченной клонотеки хромосомы

3.1.1.2. Субклопирование и определение пуклеотидной последовательности микросателлитов на 13q; гетерогенность повторов

3.1.1.3. Полиморфные и STS-маркеры хромосомы 13 93 3.1.2. Микросателлиты на хромосоме

3.1.2.1. Частоты встречаемости и особенности распределения микросателлитов в Notl-связующих и прыжковых клонах хромосомы 3 и в космидах из области LUCA (Зр21.31)

3.1.2.2. Микросателлиты в Notl-связующих и прыжковых клонах как маркеры генов; структура повторов в некоторых микросателлитах

3.1.2.3. Полиморфные и STS-маркеры хромосомы 3 106 3.2. Картирование «критичных» районов Зр в эпителиальных опухолях пяти видов

3.2.1. Картины аллелыюго дисбаланса полиморфных маркеров Зр в эпителиальных опухолях

3.2.2. Частота аллельных изменений в разных районах Зр в опухолях пяти видов; типы аллельпых делений

3.2.3. «Критичные» районы Зр, общие для опухолей разного происхождения; идентификация новой «горячей точки» МЕСАЗ в районе Зр21.

3.2.4. Повышенная частота амплификации аллелей в районе МЕСАЗ (D3S2409-D3S3667)

3.2.5. Сужение критичных районов АР20 и LUCA (Зр21.33, Зр21.31)

3.2.6. Корреляция частоты аллельных изменений в критичных районах

Зр с прогрессией опухолей

3.3. Идентификация потенциальных TSG и онкогенов в районе МЕСАЗ и других критичных районах Зр

3.3.1. Скрининг кандидатов на роль TSG и онкогенов в районе МЕСАЗ с помощью программы серийного анализа экспрессии генов (SAGE)

3.3.2. Изменения уровня мРНК генов DAG1, RHOA/ARHA, GPX1 (МЕСАЗ) и TSG SEMA3B в клеточных линиях и первичных опухолях

3.3.3. Гомозиготные делеции в области гена GPX1 и умножение копий гена RHOA/ARHA в опухолях

3.3.4. Изменение содержания альтернативных транскриптов гепа USP4 в опухолях

3.3.5. Новый вариант сплайсинга и изменение копийности гепа MST1R/RON в опухолях

3.3.6. Кандидаты на роль TSG из других ключевых районов Зр: изменение уровня мРНК в опухолях и структурные изменения в генах

3.4. Метилирование промоторных областей генов RASSF1A, SEMA3B, RHOA и MST1R/RONв эпителиальных опухолях разной локализации

3.4.1. TSG RASSF1A (LUCA, 3р21.31)

3.4.2. Кандидат на роль TSG, ген SEMA3B (LUCA, 3р21.31)

3.4.3. Протоонкоген RHOA/ARHA (МЕСАЗ, 3р21.31)

3.4.4. Кандидат на роль протоонкогена MST1R/RON (МЕСАЗ, 3р21.31)

3.4.5. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация потенциальных онкогенов и генов-супрессоров эпителиальных опухолей человека"

Первые успехи в выявлении молекулярной природы рака вселили надежду на разработку новых более эффективных подходов к терапии онкологических заболеваний. Так как рак имеет разную этиологию и опухолевая прогрессия связана с бесконечной комбинацией генетических и эпигенетических изменений, порождающих несоизмеримый ряд аномалий, возникло убеждение, что и лечение рака должно быть таким же разнообразным, как и нарушения. Поиск оптимальной терапии онкологических заболеваний представлялся Геракловой и практически невозможной задачей. Однако эти утверждения оказались слишком пессимистичными. Несмотря на то, что злокачественные новообразования чрезвычайно разнообразны и гетерогенны, в основе этих изменений находится относительно небольшое количество критических событий, одновременное проявление которых требуется для малигнизации. Поэтому необходимо определить и попять молекулярную анатомию основных этапов опухолевого патогенеза и разработать терапевтические схемы, направленные на элиминацию этих этапов.

Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов (и протонкогенов), или факторов позитивного контроля деления клеток, а затем - антионкогенов или генов-супрессоров опухолевого роста (TSG), осуществляющих негативный контроль клеточного роста. Онкогены активируются в опухолях по доминантному механизму и стимулируют развитие опухоли. Напротив, TSG ипактивируются в опухолях по рецессивному типу с повреждением обоих родительских аллелей.

В случае сохранности некоторых критичных TSG (например, гена р53) в клетке, подверженной неопластическим изменениям, эти TSG могут вызвать остановку клеточного цикла или ее программируемую смерть (апоптоз), и таким образом, остановить или замедлить опухолевый рост (Чумаков, 1998, 2000). TSG могут также участвовать в подавлении нео-ангиогенеза, инвазии и метастазирования, в регуляции теломеразной системы. Некоторые TSG прямо или опосредованно участвуют в репарации мутаций, например, р53 задерживает клеточный цикл до исправления нарушений с помощью белков системы репарации.

Последнее десятилетие характеризуется открытием многих новых онкогенов и TSG. Определение нуклеотидной последовательности генома человека и создание общедоступных баз данных обеспечили мощный подъем онкогеномики и протео-мики. Согласно данным GenBank, в настоящее время известно более сотни потенциальных онкогенов (клеточных и вирусных), несколько десятков TSG и более 300 потенциальных TSG, расположенных на разных хромосомах человека. Следует отметить, что принятое разделение на онкогены и TSG достаточно условно, поскольку с появлением новых методов и подходов паши представления о роли тех или иных генов и их взаимосвязи могут значительно меняться.

Данное исследование посвящено поиску и локализации на хромосоме 3 человека новых кандидатов в TSG и онкогены. Еще два десятилетия назад было показано, что на коротком плече хромосомы 3 (Зр) геми- и гомозиготные делеции наблюдаются в разнообразных эпителиальных опухолях, причем среди других хромосом, именно Зр повреждается с наибольшей частотой в опухолях легкого и почки (Кок et al., 1997). Посредством микроклеточных гибридов и опытов по переносу субхромосомных фрагментов было показано, что определенные участки Зр характеризуется способностью к подавлению опухолевого роста.

Представленная работа направлена на идентификацию генов, вовлеченных в развитие или подавление эпителиальных опухолей. Исследованы изменения в полиморфных локусах и генах Зр в опухолях легкого, почки, яичников, молочной железы и шейки матки. Опухоли этих локализаций, как известно, широко распространены и характеризуются высокой частотой летальных исходов, которая составляет более половины от общего числа неблагоприятных исходов при онкологических заболеваниях.

Информация об онкогенах и TSG, причинно связанных с онкогеиезом или ан-ти-онкогенезом, вносит важный вклад в понимание молекулярных процессов, протекающих при опухолеобразовании. Кроме того, наборы ключевых TSG и онкогенов находят применение в качестве маркеров для диагностики опухолей, прогноза рецидивов и мониторинга терапии в клинике (Зборовская, 2000; Лихтенштейн и Потапова, 2003; Белохвостое и Румянцев, 2003а,б).

При картировании отдельных хромосом человека и генома в целом важную роль сыграли полиморфные и STS-маркеры. Наиболее эффективными среди полиморфных генетических маркеров справедливо признаны микросателлиты - короткие тандемные повторы от 2 до 6 нуклеотидных пар. Если участки ДНК, окружающие повторы микросателлитов, имеют единственную локализацию (уникальны) в геноме человека, то такие локусы могут быть идентифицированы с помощью по-лимеразной цепной реакции. Высокополиморфпые маркеры, локализованные па генетической карте друг относительно друга с помощью анализа сцепления, были использованы при построении и стыковке YAC-коптигов генома человека. Неполиморфные STS-маркеры, охарактеризованные по их нуклеотидной последовательности, условиям их идентификации с помощью ПЦР и по локализации на хромосоме, также широко применяли при построении физических карт генома человека как на основе соматических и радиационных гибридов, так и на основе перекрывающихся клопов (космид, YAC-, РАС- и ВАС-клонов, Notl-связующих и Notl-прыжковых клонов). Полиморфные маркеры, кроме полпогепомпого картирования, используют для локализации генов наследственных заболеваний и других генетических повреждений, например, связанных с возникновением опухолей.

К 1993 г. генетическая карта второго поколения генома человека содержала 550 локализованных полиморфных маркеров, исключительно динуклеотидных (разрешение около 5 сМ, Weissenbach et al., 1992). Для позиционного клонирования «больных генов» требовалось увеличить количество маркеров в 5-10 раз.

В связи с этим представлялось целесообразным провести скрининг новых ди-, три- и тетрапуклеотндных микросателлитов, в частности, на хромосомах 3 и 13, связанных с развитием онкологических и многих других генетически обусловленных заболеваний. Для хромосомы 3 человека выявлена связь с образованием эпителиальных опухолей (Кок et al., 1997). Для хромосомы 13q показана ассоциация с ретипобластомой, болезнью Вильсона, альвеолярной рабдомиосаркомой, аутосом-иой рецессивной мышечной дистрофией и другими генетическими заболеваниями. В области 13q 12 удалось локализовать второй ген, ассоциированный с развитием рака молочной железы, BRCA2, а также гены-кандидаты лимфоцитарного лейкоза.

В представленной работе идентифицированы новые полиморфные маркеры на хромосомах 3 и 13, причем некоторые из них были применены при анализе аллель-ных изменений в эпителиальных опухолях. Следует указать, что эта часть работы выполнена при поддержке Отечественной Программы «Геном человека».

В следующих разделах диссертационной работы проведены локализация районов на Зр, потенциально содержащих TSG и онкогены, и анализ генов-кандидатов по изменению уровня мРНК в опухолях, по изменению профиля метилирования промоторных областей и на основании других структурных изменений в этих генах.

В последнее десятилетие проявляется особенно повышенный интерес к вопросам, связанным с процессами эпигенетической модификации генов: число опубликованных работ превысило 14 тысяч, и число обзорных статей к 2000 г. достигло 200, а к 2007 г. - 1500. С одной стороны, вызывает интерес сложнейший механизм эпигенетической модификации, протекающей с участием многокомпонентных систем и разнообразных факторов, а с другой стороны, появилась принципиально новая платформа для отбора онкомаркеров и новые подходы к мониторингу и терапии онкозаболеваний.

В представленной работе исследована роль метилирования в изменении активности TSG RASSF1A и SEMA3B и онкогенов RHOA и MST1R/RON в эпителиальных опухолях некоторых локализаций, а также изучена связь метилирования TSG RASSF1A и SEMA3B с профессией определенных опухолей, что позволило наметить пути применения этих тестов в клинической онкологии.

В обзоре литературы освещены современные представления о роли TSG и онкогенов в малигнизации клеток, а также рассмотрены генетические и эпигенетические факторы, нарушающие активность генов в опухолях. В одном из разделов обзора описаны основные подходы к идентификации и исследованию TSG и онкогенов.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Брага, Элеонора Александровна

основные выводы

1. Установлено распределение ди-, три- и тетрануклеотидных микросателлитов в 150 Notl-связующих и -прыжковых клонированных фрагментах ДНК хромосомы 3 и в 22 космидных ДНК из района LUCA (3р21.31), а также в клонированных фрагментах ДНК упорядоченной космидной клонотеки хромосомы 13. Определены нуклеотидные последовательности фрагментов ДНК (до 33 т.п.н.), содержащих микросателлиты. Исследован полиморфизм 15 локусов микросателлитов и идентифицированы 7 полиморфных и 8 STS-маркеров.

2. Проведен анализ аллельных дисбалансов на коротком плече хромосомы 3 (Зр) в 5-ти видах эпителиальных опухолей (почки, легкого, молочной железы, яичников и шейки матки) с применением идентичного набора полиморфных микроса-теллитных маркеров. Эти 5 видов опухолей характеризуются высокой частотой (7993%) случаев с аллельными дисбалансами в маркерах Зр. Преобладание множественных внутренних делеций может указывать па присутствие нескольких гепов-супрессоров опухолевого роста (TSG).

3. На Зр локализованы четыре «критичных» района, предположительно содержащих TSG, общие для опухолей разного вида. Кроме того, на Зр обнаружены районы генов-кандидатов, специфичных для определенных видов опухолей.

4. Впервые идентифицирован 3-ий «критичный» район в области 3р21.3 -МЕСАЗ. Высокие частоты потерь и амплификации аллелей полиморфных маркеров в районе МЕСАЗ в опухолях указывают на локализацию в этом районе как потенциальных TSG, так и онкогенов.

5. Выявлена положительная корреляция частоты аллельных дисбалансов в полиморфных маркерах трех районов 3р21.3 (LUCA, АР20, МЕСАЗ) с клинической

237 стадией и степенью злокачественности почечно-клеточного рака (RCC) и серозного рака яичников (ЕОС), что указывает на возможное участие некоторых генов из этих районов в прогрессии RCC и ЕОС.

6. Показано частое снижение уровня мРНК 6-ти генов Зр (RBSP3/HYA22, RASSFIA, SEMA3B, GPX1, DAG1 и W91914) в клетках опухолей. В 4-х из этих генов (RBSP3/HYA22, RASSFIA, SEMA3B и GPX1) выявлены структурные дефекты, которые могут снижать содержание мРНК или приводить к образованию неактивного белкового продукта.

7. Повышение уровня мРНК онкогена RHOA в эпителиальных опухолях может быть вызвано умножением копий гена и/или деметилированием его промоторной области.

8. Показана роль структурных дефектов в изменении уровней альтернативных транскриптов для генов NPRL2/G21 и MST1RJRON в опухолях. Потеря основного функционального транскрипта гена NPRL2/G21 связана с делециями в 3'-области гена. Метилирование промоторной области функционального полноразмерного транскрипта гена MST1RJRON сопровождается снижением уровня этого транскрипта (при сохранении укороченного онкогенного транскрипта).

9. Промоторная область гена RASSFIA (район LUCA) метилирована с высокой частотой (до 80%) в первичных опухолях и клеточных линиях RCC, что сопровождается снижением уровня мРНК. Выявлена достоверная корреляция степени метилирования промоторной области гена RASSFIA с прогрессией опухолей почки и яичников.

10. Показана относительно высокая частота метилирования дисталыюго промоторного CpG-островка гена SEMA3B (LUCA) в клеточных линиях и первичных

238 опухолях легкого, почки, молочной железы и яичников, варьирующая от 35 до 70%. Выявлена достоверная корреляция между метилированием промоторной области и снижением уровня мРНК в опухолях. Установлена достоверная корреляция степени метилирования промоторной области гена SEMA3B с прогрессией опухолей почки, молочной железы и яичников.

11. В итоге всего цикла исследований на хромосоме 3 человека впервые локализован район МЕСАЗ, содержащий потенциальные TSG и протоонкогены. Установлено прямое или косвенное участие в онкогенезе 10-ти генов Зр. Выявлены структурные и/или функциональные изменения в 10-ти генах Зр в эпителиальных опухолях, позволяющие отнести эти гены к кандидатам на роль TSG или к потенциальным онкогенам. Впервые показана роль метилирования промоторных областей TSG RASSFIA, SEMA3B и онкогенов RHOA и MSTR1/RON в онкогенезе. Выдвинута гипотеза о синергизме генов Зр SEMA3B, GPX1, RHOA и RASSFIA в процессе инициации апоптоза и о кооперации генов RASSFIA и RBSP3 в регуляции клеточного цикла. Впервые сделано предположение о существование на Зр системы генов, связанных с ключевыми процессами канцерогенеза.

12. Анализ метилирования промоторных областей генов RASSFIA и SEMA3B можно использовать для разработки новых эпигенетических маркеров и их применения в комплексной диагностике злокачественных новообразований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СТАТЬИ

1. Брага Э.А., Капанадзе Б.И., Куприянова Н.С., Иванова Г.М., Бродянский В.М., Нечволодов К.К., Шкутов Г.А., Рысков А.П., Носиков В.В., Янковский Н.К. Анализ распределения микросателлитов семи мотивов в составе космид упорядоченной клонотеки хромосомы 13 человека. Молекуляр. биология. 1995,29: 1001-1010.

2. Иванова Г.М., Чистяков Д.А., Федорова Л.И., Захарьев В.М., Котова Е.Ю., Банников В.М., Красильников А.С., Турецкая Р.Л., Ратманова К.И., Вейко

B.П., Зеленин А.В., Янковский Н.К., Брага Э.А. Тетрануклеотидные маркеры на основе упорядоченной клонотеки хромосомы 13 человека. Молекуляр. биология. 1997,31:407-417.

3. Брага Э.А., Котова Е. Ю., Пугачева Е.М., Гизатуллин Р.З., Кашуба В.И., Лерман М.И., Аксенова М.Г., Ефремов И.А., Забаровский Е.Р., Киселев Л.Л. Хромосома 3 человека: поиск микросателлитов, анализ их распределения и формирование маркеров. Молекуляр. биология. 1997, 31: 988-999.

4. Базов И.В., Аксенова М.Г., Казубская Т.П., Смирнов А.В., Забаровский Е.Р. и Брага Э.А. Анализ аллельных потерь в области короткого плеча хромосомы 3 в карциномах почки, тела матки и яичников с помощью три- и тетра-мерных маркеров. Молекуляр. биология. 1997, 31: 805-809.

5. Braga Е., Pugacheva Е., Bazov I., Ermilova V., Kazubskaya Т., Mazurenko N., Kisseljov F., Liu J., Garkavtseva R., Zabarovsky E., Kisselev L. Comparative al-lelotyping of the short arm of human chromosome 3 in epithelial tumors of four different types. FEBSLetters. 1999, 454: 215-9.

6. Kashuba V.I., Gizatullin R.Z., Protopopov A.I., Li J., Vorobieva N.V., Fedorova L., Zabarovska V.I., Muravenko O.V., Kost-Alimova M., Domninsky D.A., Kiss

C., Allikmets R., Zakharyev V.M., Braga E.A., Sumegi J., Lerman M., Wahlest-edt C., Zelenin A.V., Sheer D., Winberg G., Grafodatsky A., Kisselev L.L., Klein G., Zabarovsky E.R. Analysis of NotI linking clones isolated from human chromosome 3 specific libraries. Gene. 1999, 239: 259-71.

7. Liu J., Zabarovska V.I., Braga E., Alimov A., Klein G., Zabarovsky E.R. Loss of heterozygosity in tumor cells requires revaluation: the data are biased by the sizedependent differential sensitivity of allele detection. FEBS Letters. 1999, 462: 121-128.

8. Zabarovska V., Li J., Muravenko 0., Fedorova L., Braga E., Ernberg I., Wahlest-edt C., Klein G., Zabarovsky E.R. CIS - cloning of identical sequences between two complex genomes. Chromosome Res. 2000, 8:77-84.

9. Dreijerink K., Braga E., Kuzmin I., Geil L., Duh F.-M., Angeloni D., Zbar В., Lerman M.I., Stanbridge E.J., Minna J.D., Protopopov A., Li J., Kashuba V., Klein G., Zabarovsky E. The candidate tumor suppressor gene, RASSF1A, from human chromosome 3p21.3 is involved in kidney tumorigenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001, 98: 7504-7509.

10. Базов И.В., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Логинов В.И., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Картирование аллельных делеций на коротком плече хромосомы 3 человека в опухолях почки. Молекуляр. биология. 2001, 35:404-412.

11. Braga Е., Senchenko V., Bazov I., Loginov W., Ermilova V., Kazubskaya Т., Garkavtseva R., Mazurenko N., Kisseljov F., Liu J., Kisselev L., Lerman M., Klein G., Zabarovsky E. Critical tumor-suppressor gene regions on chromosome 3p in major human epithelial malignancies: allelotyping and quantitative real time PCR. Int. J. Cancer. 2002, 100: 534-541.

12. Li J., Protopopov A., Wang F., Sentchenko V., Petushkov V., Vorontsova O., Petrenko L., Zabarovska V., Muravenko O., Braga E., Kisselev L., Lermam M.I., Kashuba V., Klein G., Ernberg I., Wahlestedt C., Zabarovsky E. Notl subtraction and iVo/I-specific microarras to detect copy number and methylation changes in whole genomes. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 2002, 99: 10724-10729.

13. Sulimova G.E., Kutsenko A.S., Rakhmanaliev E.R., Udina I.G., Kompaniytsev A.A., Protopopov A.I., Moisjak E.V., Klimov E.A., Muravenko O.V., Zelenin A.V., Braga E.A., Kashuba V.I., Zabarovsky E.R., Kisselev L.L. Human chromosome 3: integration of 60 Notl clones into a physical and gene map. Cytogenet. Genome Res. 2002; 98:177-83.

14. Брага Э.А., Кашуба В.И., Малюкова A.B., Логинов В.И., Сепчеико В.Н., Базов И.В., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. Новые гены-супрессоры опухолевого роста в горячих точках хромосомы 3 человека: новые методы идентификации. Молекуляр. биология. 2003, 37: 194-211.

15. Angeloni D., Duh F.-M., Dean M., Zabarovsky E.R., Braga E., Sentchenko V., Lerman M.I. С to A single nucleotide polymorphism in intron 18 of the human MST1R (RON) gene that maps at 3p21.3. Molecular and Cellular Probes, 2003, 17: 55-57.

16. Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. От идентификации геномных полиморфизмов к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей человека. Молекуляр. биология, 2004, 38: 179-190.

17. Kashuba V.I., Li J., Wang F., Senchenko V.N., Protopopov A., Malyukova A., Kutsenko A.S., Kadyrova E., Zabarovska V.I., Muravenko O.V., Zelenin A.V., Kisselev L.L., Kuzmin I., Minna J.D., Winbcrg G., Ernberg I., Braga E, Lerman M.I., Klein G., Zabarovsky E.R. RBSP3 (HYA22) is a tumor suppressor gene implicated in major epithelial malignancies. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2004, 101: 4906-4911.

18. Логинов В.И., Малюкова A.B., Серегин Ю.А., Ходырев Д.С, Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Еарькавцева Р.Ф., Киселев Л.Л, Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Уровень метилирования гена RASSF1A в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников. Молекуляр. биология. 2004, 38: 654-667.

19. Малюкова А.В., Логинов В.И., Ходырев Д.С., Кадырова Е.Л., Пронина И.В., Иванова Т.А., Киселев Ф.Л., Забаровский Е.Р., Киселева Н.П., Брага Э.А. Метилирование предполагаемого гена-супрессора RASSF1A в опухолях шейки матки. Молекуляр. биология. 2004. 38: 1005-1013.

20. Li J., Wang F., Haraldson К., Protopopov A., Duh F.-M., Geil L., Kuzmin I., Minna J.D., Stanbridge E., Braga E., Kashuba V., Klein G., Lerman M.I., Zabarovsky E.R. Functional characterization of the candidate tumor suppressor gene NPRL2/G21 located in 3p21.3C. Cancer Res., 2004, 64: 6438-6443.

21. Киселев Л.Л., Сенченко В.Н., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. Ееиы-супрессоры опухолевого роста, локализованные па коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина, 2005, 3: 17-28.

22. Angeloni D., Тег Elst A., Wei М.Н., van der Veen A.Y., Braga E.A., Klimov E.A., Timmer Т., Korobeinikova L., Lerman M.I., Buys C.H. Analysis of a new homozygous deletion in the tumor suppressor region at 3pl2.3 reveals two novel intronic noncoding RNA genes. Genes Chromosomes Cancer, 2006, 45: 676-691.

23. Брага Э.А., Логинов В.И., Климов E.A., Килосанидзе Г., Ходырев Д.С., Ка-ганова H.JL, Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Пронина И.В., Рудько О.И., Забаровский Е.Р., Сулимова Г.Е., Киселев JI.J1. Активация транскрипции гена RHOA в эпителиальных опухолях может быть вызвана умножением копий гена и/или деметилированием его промоторной области. Молекуляр. биология, 2006, 40: 865-877.

24. Angeloni D., Danilkovitch-Miagkova A., Ivanova Т., Braga Е., Zabarovsky Е., Lerman M.I. Hypermethylation of Ron proximal promoter associates with lack of full-length Ron and transcription of oncogenic short-Ron from an internal promoter. Oncogene, 2007, 26: 4499-4512.

ТЕЗИСЫ КОНФЕРЕНЦИЙ

25. Брага Э.А., Носиков В.В., Капанадзе Б.И., Янковский Н.К. Выявление потенциально полиморфных маркеров хромосомы 13 человека с использованием микросателлитных зондов (САС)5, (TCG)5, (GACT)4 и (GATG)4. Третья конференция "Геном человека - 93", г. Черноголовка, Март, 1993 г., стр. 21.

26. Braga Е., Chistyakov D., Ivanova G., Zakhariev V.M., Krasilnikov A., Yankovsky N. Novel GATG-rich microsatellites located on chromosome 13: allele polymorphism in a Russian population of Moscow. 27th European Society of Human Genetic Meeting, Berlin, Germany, May 1995. Medizinische Genetik, 2: P.161.

27. Брага Э.А ., Котова Е.Ю., Пугачева E.M., Банников В.М., Захарьев В.М., Забаровский Е.Р., Киселев JI.JL Новые три- и тетраиуклеотидные микросател-литные маркеры хромосомы 3 человека. Пятая конференция "Геном человека - 96", Москва, Январь, 1996, стр. 21.

28. Braga Е., Chistyakov D., Ivanova G., Kotova E., Nosikov V.V., Kapanadze В., Yankovsky N., Fedorova L., Krasilnikov A., Bannikov V., Zakhariev V., Zabarovsky E., Zelenin A., Kisselev L. Tri- and tetrameric microsatellite markers on chromosome 3 and 13 maps. 28th European Society of Human Genetic Meeting, London, April 1996. Eur. J. Hum. Genet. 4, Suppl 1, P.97.

29. Braga E., Chistyakov D., Ivanova G., Fedorova L., Krasilnikov A., Zelenin A., Zakhariev V., Zabarovsky E., Yankovsky N., Kisselev L. Tetra- and trimeric markers on chromosome 3, 13 and 3p21.3 maps. Abstract of Human Genome Organization Meeting, Heidelberg, March 1996. P. 14.

30. Bazov I., Aksenova M., Kazubskaya T.P., Smirnov A.V., Braga E.A., Zabarovsky E.R., Kisselev L.L. Tri- and tetranucleotide marker application for mapping chr 3p allelic losses associated with several carcinomas" Abstracts of the 29th Annual Meeting of the European Society of Human Genetic. Genoa, Italy, May 1997. Medizinische Genetik9 (N. 2), p. 85.

31. Pugacheva E., Kotova E., Aksenova M., Braga E., Zabarovsky E., Kisselev L. Microsatellite markers joined to genes based on Notl-clones of human chromosome 3, contig of cosmids from 3p21.3 and cDNA sequences., Abstracts of the 29th Annual Meeting of the European Society of Human Genetic. Genoa, Italy, May 1997, Medizinische Genetik 9 (N. 2), p. 130.

32. Пугачева E.M., Базов И.В., Котова Е.Ю., Аксенова М.Г., Ермилова В.Д., Ка-зубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Гизатуллин Р.З., Кашуба В.И., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Полиморфные и STS - маркеры хромосомы Зр для картирования локусов - кандидатов генов - супрессоров опухолевого роста. Восьмая конференция "Геном человека - 98", Москва, Январь, 1998, стр. 9.

33. Базов И.В., Пугачева Е.М., Аксенова М.Г., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. "Сравнительный анализ хромосомы Зр в четырех типах эпителиального рака". Тезисы докладов на Восьмой конференции "Геном человека - 98", Москва, Январь, 1998, стр. 10.

34. Pugacheva Е., Bazov I., Kotova Е. Ju., Kazubskaya Т.Р., Garkavtseva R.F., Ka-shuba V.I., Gizatullin R.Z., Alimov A.A., Zabarovsky E.R., Braga E.A. Polymorphic and STS markers of human chromosome 3p for mapping of tumor suppressor gene candidate loci. 30th Annual Meeting of the European Society of Human Genetic. Lisbon. May 1998. Eur. J. Hum. Gen. V.6, sup. 1, 1998, P. 92.

35. Bazov I.V., Pugacheva E.M., Ermilova V.D., Kazubskaya T.P., Garkavtseva R.F., Alimov A.A., Zabarovsky E.R., Braga E.A. Human chromosome 3p deletion mapping in different types of cancer. 30th Annual Meeting of the European

Society Human Genetic. Lisbon. May 1998. Eur. J. Hum. Gen. V.6, sup. 1, 1998, P. 92.

36. Braga E.A., Bazov I.V., Pugacheva E.M., Kotova E.Yu., Ermilova V.D., Kazub-skaya T.P., Garkavtseva R.F., Kashuba V.I., Gizatullin R.Z., Alimov A.A. and Zabarovsky E.R. Polymorphic and STS markers of human chromosome 3p and their application for mapping of tumor suppressor gene candidate loci. Abstracts of Human Genome Meeting, Turin. March 1998, P.30.

37. Kazubskaya T.P., Bazov I.V., Braga E.A., Pugacheva E.M., Ermilova V.D., Zabarovsky E.R., Garkavtseva R.F. Human chromosome 3p deletion mapping in carcinomas of kidney, lung and reproductive organs. 17th International Cancer Congress. Rio de Janeiro. August 1998. P. 600.

38. Брага Э.А., Пугачева E.M., Базов И.В., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарь-кавцева Р.Ф., Мазуренко Н.Н., Киселев Ф.Л., Забаровский Е.Р., Киселев Л.Л. Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях почки, легкого, шейки матки и молочной железы с использованием общей панели маркеров. Тезисы докладов на Девятой конференции "Геном человека - 99", Москва, Февраль, 1999, стр. 14-15.

39. Braga Е., Pugacheva Е., Bazov I., Ermilova V., Kazubskaya Т., Garkavceva R., Mazurenko N., Kisseljov F., Li J., Debabov V., Zabarovsky E., Kisselev L. "Deletion mapping of human chromosome 3p in four types of malignant epithelial neoplasia". Abstracts of Human Genome Meeting, Brisbane, Australia, March, 1999, P.24-25.

40. Брага Э.А., Базов И.В., Логинов В.И., Малюкова А.В., Пугачева Е.М., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Мазуренко Н.Н., Киселев Ф.Л., Лю Ж. Забаровский Е.Р., Киселев Л.Л. Делеционное картирование короткого плеча хромосомы 3 человека из клеток опухолей разных локализаций. Тезисы докладов на конференции "Геном человека", Москва, Январь, 2000, стр. 8.

41. Braga Е., Bazov I., Senchenko V., Liu J., Loginov W., Pugacheva E., Ermilova V., Kazubskaya Т., Mazurenko N., Garkavtseva R., Kisselev L., Zabarovsky E. Common Deletion Regions on Chromosome 3p in Different Types of Cancer. Abstracts of Human Genome Meeting, Vancouver, Canada, April, 2000, P. 75.

42. Брага Э.А., Базов И.В., Логинов В.И. ,Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарь-кавцева Р.Ф., Сенченко В.Н., Кашуба В.И., Лерман М.И., Забаровский Е.Р., Киселев Л.Л. Критичные участки и кандидаты генов-супрессоров опухолевого роста в области короткого плеча хромосомы 3 человека. Тезисы докладов на конференции "Геном человека", приглашенный докладчик, Москва, Январь, 2001, стр.11

43. Li J., Zabarovska V., Muravenko О., Braga E., Wang F., Kashuba V., Zabarovsky E. New methodologies for cloning disease genes. Abstracts of Human Genome Meeting, Edinburgh, Scotland, April 2001, # 143, P.40.

44. Braga E., Bazov I., Loginov W., Ermilova V., Kazubskaya Т., Garkavtseva R., Mazurenko N., Kisseljov F., Senchenko V., Liu J., Kashuba V., Lerman M., Kis-seljov L., Zabarovsky E. Frequent allele losses in 3p21.3-21.2 and inactivation of novel RASSF1A candidate gene in epithelial cancer of various locations. Abstracts of Human Genome Meeting, Edinburgh, Scotland, April 2001, # 322, P.89.

45. Sentchenko V., Braga E., Liu J., Mazurenko N., Lerman M., Kashuba V., Zabarovsky E. Deletion mapping with quantitative real-time PCR confirms that the two most frequently deleted in SCLC and RCC 3p21-p22 regions are also affected in other solid tumors. Abstracts of Human Genome Meeting, Edinburgh, Scotland, April 2001, # 360, P.99.

46. Sulimova G.E., Kutsenko A., Rakhmanaliev E.R., Udina I.G., Kompaniytsev A.A., Protopopov A.I., Moisjak E.V., Klimov E.A., Muravenko O., Zelenin A.V., Braga E.A., Kashuba V.I., Zabarovsky E.R., Kisselev L.L. Physical and gene map of human chromosome 3. Abstracts of Human Genome Meeting, Edinburgh, Scotland, April 2001, # 403, P. 110.

47. Брага Э.А., Логинов В.И., Малюкова A.B., Петраш Н.Ю., Базов И.В., Кашуба В.И., Протопопов А.И., Сеиченко В.Н., Лерман М.И., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Мазурепко Н.Н., Киселев Ф.Л., Забаровский Е.Р., Киселев Л.Л. Выявление и анализ новых генов-супрессоров опухолевого роста на коротком плече хромосомы 3 человека Тезисы докладов па конференции "Геном человека". Приглашенный докладчик, Москва, Январь, 2002, стр. 14-16.

48. Wang F., Li J., Bazov I., Sentchenko V., Braga E., Protopopov A., Kashuba V., Lerman M., Klein G., Zabarovsky E. Gene inactivation test for identification of chromosome 3 specific TSGs involved in the development of lung, breast, kidney and other cancers. Abstracts of Human Genome Meeting, Shanghai, China, April 2002, # 152, P. 117.

49. Kilosanidze G., Malyukova A., Petrash N., Loginov W., Bazov I., Kashuba V., Ermitova V., Kazubskaya Т., Garkavtseva R., Lerman M.I., Zabarovsky E., Braga E. Search for cancer associated genes in 3p21.31. Abstracts of Human Genome Meeting, Shanghai, China, April 2002, # 201, P. 129.

50. Li J., Protopopov A., Wang F., Sentchenko V., Petushkov V., Vorontsova O., Petrenko L., Zabarovska V., Muravenko O., Braga E., Lerman M.I., Kashuba V., Klein G., Ernberg I., Wahlestedt C., Zabarovsky E.R. NotI clones and microarrays for structural and functional analysis of human genome. Abstracts of Human Genome Meeting, Shanghai, China, April, 2002, # 624, P. 246.

51. Kilosanidze G., Malyukova A., Petrash N., Loginov W., Bazov I., Kashuba V., Ermilova V., Kazubskaya Т., Garkavtseva R., Lerman M., Braga E., Zabarovsky E. SAGE data for searching cancer-associated genes in 3p21.3. 28th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Istanbul, Turkey, October 2002, FEBSJ., 2002, 269: 40, PS 1-022.

52. Loginov W., Senchenko V., Malyukova A., Bazov I., Kazubskaya Т., Ermilova V., Garkavtseva R., Kashuba V., Zabarovsky E., Braga E. Methylation of RASSFIA (3p21.31) promoter region and deletion aberrations around this TSG in epithelial carcinomas. Abstracts of American Association of Cancer Research (AACR) Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research, Boston, October 2002, # 100369.

53. Malyukova A., Kilosanidze G., Loginov W., Bazov I., Kashuba V., Ermilova V., Kazubskaya Т., Garkavtseva R., Zabarovsky E., Braga E. Methylation of SEMA3B and new candidate TSGs in D3S2409-D3S2456 in chromosome 3p21.31. Abstracts of American Association of Cancer Research (AACR) Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research, Boston, October 2002, # 100436.

54. Брага Э. А^ Логинов В.И., Малюкова А.В., Килосанидзе Г., Сенченко В.Н., Серегин Ю.А., Баркевич О.А., Кашуба В.И., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Киселев Л.Л, Забаровский Е.Р. Гены хромосомы 3 человека, ассоциированные с эпителиальными опухолями разных локализаций. Диагностическое и прогностическое применение. VII Российский Онкологический Конгресс. Приглашенный докладчик. Сборник материалов. Москва, 2003, стр. 141-144.

55. Malyukova A., Loginov W., Petrash N., Ermilova V.D., Kazubskaya T.P., Garkavtseva R.F., Lerman M.I., Zabarovsky E.R., Braga E.A. Methylation spectrum of multiple TSG RASSF1A (3p21.31) in various epithelial carcinomas. Abstracts of American Association of Cancer Research (AACRJ 2003 Conference on Frontiers in Cancer Prevention Research, Toronto, April 2003, # 107259.

56. Kilosanidze G., Malyukova A., Kashuba V., Lerman M., Braga E., Zabarovsky E.R. Comparative analysis of gene expression for searching tumor suppressor genes in crucial regions of human chromosome 3. 1st European Society Federation Conference on Functional Genomics, Prague, Czech Republic, May 14-17, 2003, No. PD3/138, P.108.

57. Loginov W., Senchenko V., Malyukova A., Bazov I., Kazubskaya Т., Ermilova V., Garkavtseva R., Kashuba V., Zabarovsky E., Braga E. Methylation of RASSF1A (3p2I.3I) promoter region and deletion aberrations around this TSG in epithelial carcinomas. Human Genome Meeting 2003, Cancun, Mexico, 27th-30th April, 2003.

58. Muravenko O., Li J., Protopopov A., Wang F., Sentchenko V., Bazov I., Vo-rontsova O., Zabarovska V., Braga E., Kisselev L., Lerman M.I., Kashuba V., Klein G., Zabarovsky E.R. Identification of human chromosome 3-specific tumor suppressor candidate genes whose loss contribute to the genesis of kidney, lung and other major epithelial cancers. Conference: APOPTOSIS 2003. From signaling pathways to therapeutic tools. Luxembourg, January 29 - February 1st, 2003.

59. Senchenko V., Li J., Zabarovska V., Muravenko O., Braga E., Protopopov A., Kashuba V., Zabarovsky E. Combinatorial approach to clone disease genes. Conference on Genetics of Complex Diseases and Isolated Populations, Tortoli, Sardinia, Italy, 23-30 May, 2003.

60. Zabarovsky E.R., Li J., Protopopov A., Wang F., Bazov I., Barkevich 0., Malyuk-ova A., Senchenko V., Zabarovska V., Muravenko 0., Braga E., Kisselev L.L., Lerman M.I., Kashuba V., Klein G. In the hunt of unknown tumor suppressor gene. Lecture, No. 180. 8th World Congress on Advances in Oncology and 6th International Symposium on Molecular Medicine, Crete, Greece, October 16-18, 2003.

61. Muravenko 0., Li J., Barkevich 0., Katokhin A., Malyukova A., Senchenko V., Zabarovska V., Braga E., Zelenin A.V., Kisselev L.L., Lerman M.I., Kashuba V., Klein G., Zabarovsky E.R. Notl microarray and Notl passports to study genetic and epigenetic changes in cancer cells. Lecture, No. 179. 8th World Congress on Advances in Oncology and 6th International Symposium on Molecular Medicine, Crete, Greece, October 16-18., 2003

62. Zabarovsky E.R., Li J., Protopopov A., Wang F., Haraldson K., Winberg G., Gi-zatulin R., Liu J., Senchenko V., Braga E., Kutsenko A., Zabarovska V., Wahlestedt C., Ernberg I., Kashuba V., Klein G. Restriction site tagged passports and microarrrays to study epigenetic changes in the human genome. Epigenetic Reprogramming in Development and Disease, Nobel Symposium, Stockholm, Sweden, June 19-21, 2004.

63. Kashuba V., Li J., Protopopov A., Wang F., Malyukova A., Senchenko V., Zabarovska V., Muravenko 0., Zelenin A.V., Kadyrova E., Braga E., Kisselev L.L., Lerman M.I., Klein G., Zabarovsky E.R. Cluster of TSGs in 3p21.3 LUCA and AP20 regions: a new model for neoplastic transformation. 9th World Congress on Advances in Oncology and 7th International Symposium on Molecular Medicine. Hersonissos, Crete, Greece, 14-16 October, 2004.

64. Zabarovsky E., Kashuba V., Li J., Haraldson K., Protopopov A., Wang F., Senchenko V., Zabarovska V., Muravenko 0., Zelenin A., Kisselev L., Braga E., Lerman M.I., Klein G. Tumor suppressor genes in 3p21.3 LUCA and AP20 regions: a new model for the development of major epithelial malignancies. 7th International Conference of Anticancer Research, Corfu, Greece, 25-30 October 2004,S564.

65. Loginov W., Zabarovsky E.R., Braga E.A.: Clusters of TSGs in human chromosome 3: a new model for cancer development. The 7th International Engelhardt

Conference on Molecular Biology. Suzdal, Russia, November 28-December 2, 2004.

66. Kashuba V., Li J., Protopopov A., Wang F., Senchenko V., Zabarovska V., Mu-ravenko O., Zelenin A.V., Braga E., Kisselev L.L., Lerman M.I., Klein G., Za-barovsky E.R. Functional and mutational analysis of candidate tumor suppressors from the 3p21.3 LUCA and AP20 region. 10th World Congress on Advances in Oncology and 8th International Symposium on Molecular Medicine. Hersonissos, Crete, Greece. 13-15 October, 2005. International Journal of Molecular Medicine, 16 (SI): S25.

67. Loginov W., Klimov E., Pronina I., Hodirev D., Kilosanidze G., Malyukova A., Garkavtseva R.F., Sulimova G.E., Zabarovsky E.R., Braga E.A. Expression and methylation analysis of some chromosome 3p "hot spots" genes in epithelial tumors. 31lb Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Istanbul, Turkey, October 2005, FEBSJ., 2005, 269: 120, A4-034P.

68. Zabarovsky E.R., Pavlova Т., Ivanova Т., Petrenko L., Rakhmanaliev E., Mu-ravenko O., Pronina I., Loginov W., Saraev D., Yenamandra S.P., Senchenko V., Zabarovska V., Braga E., Skrypkina I., Rynditch A., Grigorieva E., Kiseljova N., Kiseljov F.L., Kisselev L.L., Klein G., Kashuba V., Zelenin A.V. Epigenetic analysis of cancer cells using NotI microarrays. Abstracts of Human Genome Meeting, 2006 (HGM2006), Helsinki, Finland, May 31 - June 3, 2006, page 215.

69. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В., Климов Е.А., Каганова Н.Л., Еарькавцева РФ., Сулимова L.E., Брага Э.А. Изменение копийности и метилирования промоторного района протоонкогена RHOA в эпителиальных опухолях. Тезисы докладов на международной конференции 'Теиетика в России и мире", Москва Июль, 2006, стр. 209.

70. И.В. Пронина, В.И. Логинов, Т.А. Иванова, Т. Павлова, Д. Сараев, Р.Ф. Еарькавцева, О.В. Муравенко, Э.А. Брага, А.В. Зелепип, Л.Л. Киселев, В.И. Кашуба, Е.Р. Забаровский. Notl-микропанели и Notl-репрезентативные пробы для скрининга онкозначимых генов Тезисы докладов па международной конференции "Еенетика в России и мире", Москва, Июль, 2006, стр. 160.

71. Ivanova Т., Pavlova Т., Skrypkina I., Petrenko L., Muravenko О., Pronina I., Loginov W., Saraev D., Yenamandra S.P., Senchenko V., Zabarovska V., Braga

E., Rynditch A., Zelenin A.V., Kisseljova N., Kisseljov F.L., Kisselev L.L., Klein G., Kashuba V., Zabarovsky E.R.: Epigenetic analysis of different cancers using Notl microarrays. 11th World Congress on Advances in Oncology and 9th International Symposium on Molecular Medicine October 12-14, 2006, Hersonissos, Crete, Greece, page 1.

72. Zabarovsky E.R., Pavlova Т., Ivanova Т., Petrenko L., Li J., Wang F., Haraldson K., Muravenko 0., Pronina I., Loginov W., Saraev D., Yenamandra S.-P., Senchenko V., Zabarovska V., Braga E., Skrypkina I., Rynditch A., Kiseljova N., Zelenin A.V., Kiseljov F.L., Kisselev L.L., Lerman M., Kashuba V., Ernberg I., Klein G.: Epigenetic analysis of epithelial malignancies using Notl microoarrays: identification of tumor suppressor genes: Epigenetics and Cancer. 1ACR Workkshop, Lion, France, June 22-23, 2006.

73. Казубская Т.П.,, Логинов В.И., Ходырев Д., Шаталова Е.Г., Ермилова В.Д., Бланчард Р.Л., Фаворова О.О., Забаровский Е.Р., Брага Э.А., Гарькавцева Р.Ф. Особенности метилирования генов RASSFIA, SEMA3B, RARH2 и полиморфизма генов SULT1A1 и UGT1A1 при раке молочной железы и их ассоциация с клиническими проявлениями заболевания. VIII Российский Онкологический Конгресс. Москва, 2006.

74. Кагапова Н.Л., Брага Э.А., Логинов В.И., Климов Е.А., Килосанидзе Г., Ходырев Д.С., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Пронина И.В., Рудько О.И., Забаровский Е.Р., Сулимова Г.Е., Киселев Л.Л. Оценка уровня экспрессии пяти генов хромосомы 3 человека, связанных с развитием опухолей // Вопросы онкологии. 2006. Т.52. 1. Приложение (Тезисы 2-й Российской конференции по фундаментальной онкологии. Санкт-Петербург, 14 апреля 2006). С.16-17.

75. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В., Ермилова В.Д., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Киселев Л.Л., Брага Э.А. Роль метилирования промоторных районов генов хромосомы 3 в эпителиальных опухолях человека. Тезисы докладов на международной конференции по фундаментальной онкологии "Петровские Чтения", Санкт-Петербург, Апрель, 2007, стр. 215.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Брага, Элеонора Александровна, Москва

1. Аксенова М.Г., Иванова Г.М., Брага Э.А., Каледа В.Г., Овчинников И.В. Поиск ассоциации микросателлитного маркера (GATG)n из локуса D13S699 (13ql4) с шизофренией и шизоаффективным психозом. Молекуляр. биология. 1997,31, 1112-1115.

2. Баранова А.В., Янковский Н.К. Гепы-супрессоры опухолевого роста. Молекуляр. биология, 1998,32,206-218.

3. Белохвостов А.С., Румянцев А.Г. Онкомаркеры. Требования к опкомаркерам и области применения трех типов онкомаркеров. Москва, 2003а, стр. 6-7.

4. Белохвостов А.С., Румянцев А.Г. Онкомаркеры. Молекулярпо-генетические онкомаркеры и методы их определения. Москва, 20036, стр. 7-42.

5. Брага Э.А., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. От идентификации геномного полиморфизма к диагностическим и прогностическим маркерам эпителиальных опухолей. Молекуляр. биология. 2004, 38,145-154.

6. Забаровский ЕР. Новые стратегии клонирования идентичных и различающихся фрагментов ДНК из сложных геномов. Молекуляр. биология, 2000, 34, 612-625.

7. Зборовская И.Б. 2000. Молекулярно-биологические исследования онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста в клинической практике. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе. М.: Научп. Мир, 361-379.

8. Киселев Л.Л., Сенчепко В.Н., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. Гепы-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина, 2005, 3: 17-28.

9. Киселев ФЛ. Гены стабилизации ДНК и канцерогенез. Молекуляр. биология, 1998, 32, 197-205.

10. Киселева Н.П., Киселев Ф.Л. Деметилирование ДНК и канцерогенез (обзор) Биохимия, 2005 70,900-912

11. Копнин Б.П. 2000.Опухолевые супрессоры и мутаторные гены. Сборник обзорных статей «Катррогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научи, мир, стр. 75-92.

12. Кост М.А., Федорова /I. Капанадзе Б.И. Зеленин А.В., Янковский Н.К. Молекуляр. биология, 1994,28, 1149-1157.

13. Лихтенштейн А.В., Потапова Г.И. Генетические дефекты как маркеры опухолевого роста. Молекуляр. биология, 2003, 37, 181-193.

14. Пфайфер Г.П., Дамманн Р. Метилирование гена опухолевого супрессора RASSFIA в человеческих опухолях. 2005, Биохимия, 70, 699-708.

15. Ровенский Ю.А. и Васильев Ю.М. Морфогенетические реакции клеток и их нарушения при опухолевой трансформации. 2000. Сборник обзорных статей «Ка/щерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 260-283.

16. Саложин С.В., Прохорчук Е.Б., Георгиев ГП. Метилирование ДНК как один из основных эпигенетических маркеров. Биохимия, 2005, 70, 641-651

17. Сулимова Г.Е., Рахманалиев Э.Р., Климов Е.А., Компапийцев А.А., Удина И.Г., Забаровский Е.Р., Киселев Л.Л., NotI Sequence-Tagged Sites as Markers of Genes on Human Chromosome 3. Молекуляр. биология, 2005, 39, 593-607.

18. Татосян А.Г. 2000. Онкогены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 57-74.

19. Чумаков П.М. Роль р53 в программируемой клеточной смерти. Изв. Акад. Наук, сер. Биология, 1998,2,151-156.

20. Чумаков П.М. Функция гена р53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия, 2000, 65, 28-40.

21. Шиф М. Метилирование и деметилирование ДНК как мишени для противораковой терапии. Биохимия. 2005, 70, 651-670.

22. Acevedo CM, Henriquez M, Emmert-Buck MR, Chuaqui RF. Loss of heterozygosity on chromosome arms 3p and 6q in microdissected adenocarcinomas of the uterine cervix and adenocarcinoma in situ. Cancer., 2002, 94, 793-802.

23. Aggerholm A, Hokland P. DAP-kinase CpG island methylation in acute myeloid leukemia: methodology versus biology? Blood, 2000, 95, 2997-2999.

24. Aissani В and Bernardi G. CpG islands: features and distribution in the genomes of vertebrates. Gene, 1991,106, 173-183.

25. Alimov A, Kost-Alimova M, Liu J, Li C, Bergerheim U, Imreh S, Klein G and Zabarovsky ER. Combined LOH/CGH analysis proves the existence of interstitial 3p deletions in renal cell carcinoma. Oncogene, 2000,19, 1392-1399.

26. Allikmets RL, Kashuba VI, Bannikov VM, Petrov N, Pettersson B, Lebedeva T,Gizatullin R, Zakharyev VM, Winberg G, Dean M, Uhlen M, Kisselev LL, Klein G, Zabarovsky ER. Genomics, 1994,19, 303-309.

27. Angeloni D., Danilkovich-Miagkova A., Ivanova SV., Breathnach R., Johnsonj BE., Leonard EJ., Lerman Ml. Gene structure of the human receptor tyrosine kinase RON and mutation analysis in lung cancer samples. Genes Chromosdomes Cancer. 2000; 29, 147-156.

28. Angeloni D., Duh F.-M., Dean M., Zabarovsky E.R., Braga E., Sentchenko V., Lerman M.I. С to A Single Nucleotide Polymorphism in Intron 18 of the Human MST1R (RON) Gene that Maps at 3p21.3. Molecular and Cellular Probes, 2003,17, 55-57.

29. Apicelli AJ, Uhlmann EJ, Baldwin RL, Ding H, Nagy A, Guha A, Gutmann DH. Role of the Rapl GTPase in astrocyte growth regulation. Glia, 2003,42, 225-234.

30. Attwood JT, Yung RL, Richardson ВС. DNA methylation and the regulation of gene transcription. CellMolLife Sci., 2002, 59,241-257.

31. Avraham H., Weinberg R.A. 1989. Characterization and expression of the human rhoH12 gene product. Mol. Cell Biol. 9, 2058-2066.

32. Bateman A, Birney E, Durbin R, Eddy SR, Finn RD and Sonnhammer EL. Pfam 1313 multiple alignments and profile HMMs match the majority of proteins. Nucleic Acids Res., 1999, 27, 260-262.

33. Batinac T, Gruber F, Lipozencic J, Zamolo-Koncar G, Stasic A, Brajac I. Protein p53 Structure, Function, and Possible Therapeutic Implications. Acta Dermatovenerol Croat., 2003, 11,225-30.

34. Baylin SB. Mechanisms underlying epigenetically mediated gene silencing in cancer. Semin Cancer Biol. 2002,12, 331-337.

35. Baylin SB. Reversal of gene silencing as a therapeutic target for cancer-roles for DNA methylation and its interdigitation with chromatin. Novartis FoundSymp. 2004, 259, 226-233

36. Baylin SB, Herman JG, Graf JR, Vertino PM, Issa JP. Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv. Cancer Res., 1998, 72, 141-196.

37. Bejanin S, Cervini R, Mallet J, Berrard S. A unique gene organization for two cholinergic markers, choline acetyltransferase and a putative vesicular transporter of acetylcholine. ,J Biol Chem. 1994,269, 21944-21947.

38. Bejerano G, Pheasant M, Makunin I, Stephen S, Kent WJ, Mattick JS, Haussler D. 2004. Ul-traconserved elements in the human genome. Science 304:1321-1325.

39. Belinsky SA. Role of the cytosine DNA-methyltransferase and pl6INK4a genes in the development of mouse lung tumors. Exp Lung Res., 1998, 24, 463-479.

40. Benezra M, Chevallier N, Morrison DJ, MacLachlan TK, El-Deiry WS, Licht JD. BRCA1 augments transcription by the NF-kappaB transcription factor by binding to the Rel domain of the p65/RelA subunit. J. Biol. Chem., 2003,278, 26333-26341.

41. Bhattacharya SK, Ramchandani S, Cervoni N, Szyf M. Amammalian protein with specific demethylase activity for mCpG DNA. Nature, 1999, 397, 579-583.

42. Bird AP. The essentials of DNA methylation. Cell 1992, 70, 5-8.

43. Bird AP. CpG islands as gene markers in the vertebrate nucleus. Trends Genet., 1987, 3, 342347.

44. Bird АР. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev., 2002,16, 6-21.

45. Boudeau J, Sapkota G, Alessi DR. LKB1, a protein kinase regulating cell proliferation and polarity. FEBSLett., 2003, 546, 159-65.

46. Boulay J-L, Reuter J, Ristchard R, Terracciano L, Herrmann R, Rochlist C. Gene dosage quantitative real-time PCR. BioTechniques., 1999,27, 228-232.

47. Braga E.A., Avdonina T.A., Zhurkin U.B., Nosikov U.U. Structural organization of rat ribo-somal RNA genes: interspersed sequences and their putative role in the alignment of microsomes. Gene, 1985, 36,249-262.

48. Breault J.E., Shiina H., Igawa M., Ribeiro-Filho L.A., Deguchi M., Enokida H., Urakami S., Terashima M., Nakagawa M., Kane C.J., Carroll P.R., Dahiya R. Hypermethylation of g-catenin gene in renal cancer. Clinical Cancer Res. 2005,11, 557-564,

49. Brennan PA, Jing J, Ethunandan M, Gorecki D. Dystroglycan complex in cancer. Eur J Surg Oncol. 2004, 30, 589-592. (Review).

50. Buchhagen DL, Qiu L, Etkind P.Homozygous deletion, rearrangement and hypermethylation implicate chromosome region 3pl4.3-3p21.3 in sporadic breast-cancer development. Int J Cancer., 1994,57,473-479.

51. Budowle B, Chakraborty R, Guisti AM, Eisenberg AJ, Allen RC. Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE. Am. J. Genet., 1991, 48, 137144.

52. Caceres M, Guerrero J, Martinez J. Overexpression of RhoA-GTP induces activation of the Epidermal Growth Factor Receptor, dephosphorylation of focal adhesion kinase and increased motility in breast cancer cells. Exp Cell Res. 2005, 309, 229-238.

53. Cameron EE, Bachman KE, Myohanen S, Herman JG and Baylin SB. Synergy of demethyla-tion and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer. Nature Genetics, 1999,21, 103-107.

54. Castro-Rivera E, Ran S, Thorpe P, Minna JD. Semaphorin 3B (SEMA3B) induces apoptosis in lung and breast cancer, whereas VEGF165 antagonizes this effect. Proc Natl Acad Sci USA. 2004,101, 11432-11437.

55. Cavenee WK, Dryja TP, Philips RA, Benedict WF, Godbout R, Gallie BL, Murphree AL, Strong LC and White R. Expression of recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastoma. Nature, 1983,305, 779-784.

56. Chen S, Paul P, Price BD. ATM's leucine-rich domain and adjacent sequences are essential for ATM to regulate the DNA damage response. Oncogene, 2003, 22, 6332-6339.

57. Chen YQ., Zhou YQ., Angeloni D., Kurtz AL., Qiang XZ., Wang MH. Overexpression and activation of the RON receptor tyrosine kinase in a panel of human colorectal carcinoma cell lines. Exp Cell Res. 2000, 26, 229-238.

58. Cheng Y, Poulos NE, Lung ML, Hampton G, Ou B, Lerman MI and Stanbridge EJ. Functional evidence for a nasopharyngeal carcinoma tumor suppressor gene that maps at chromosome 3p21.3. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, 95, 3042-3047.

59. Chuang LS, Ian HI, Koh TW, Ng HH, Xu G, Li BF. Human DNA-(cytosine-5) methyltrans-ferase-PCNA complex as a target for p21 WAF1. Science, 1997, 111, 1996-2000.

60. Clark SJ, Harrison J, Frommer M. CpNpG methylation in mammalian cells. Nat. Genet., 1995,10, 20-7.

61. Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M. High sensitivity mapping of methylated cytosi-nes. Nucl.Acids Res., 1994,15, 2990-2997.

62. Cohen Y, Singer G, Lavie O, Dong SM, Beller U, Sidransky D. The RASSF1A tumor suppressor gene is commonly inactivated in adenocarcinoma of the uterine cervix. Clin Cancer Res. 2003 9, 2981-2984.

63. Comoglio PM, Trusolino L. Invasive growth: from development to metastasis. J Clin Invest. 2002 109, 857-862. (Review)

64. Conover WJ. (1980). Practical Nonparametric Statistics. 2nd. ed. New York: Wiley

65. Conrad C, Vianna C, Freeman M, Davies P. A polymorphic gene nested within an intron of the tau gene: Implications for Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA. 2002, 99, 77517756.

66. Corral T, Jimenez M, Hernandez-Munoz I, Perez de Castro I, Pellicer A. NF1 modulates the effects of Ras oncogenes: evidence of other NF1 function besides its GAP activity. J. Cell Physiol., 2003,197, 214-24.

67. Costello JF, Berger MS, Huang HS, Cavenee WK. Silencing of pl6/CDKN2 expression in human gliomas by methylation and chromatin condensation. Cancer Res., 1996, 56, 2405-10.

68. Costello JF, Plass C. Methylation matters. J. Med. Genet., 2001, 38, 285-303.

69. Craig JM and Bickmore WA. The distribution of CpG islanda in mammalian chromosomes. Nature Genetics., 1994, 7, 376-382.

70. Cross SH and Bird AP. CpG islands and genes. Curr. Opin. Genet. Dev., 1995, 5, 309-314.

71. Cross SH, Charlton JA, Nan X and Bird AP. Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column. Nat. Genet., 1994,6, 236-244.

72. Cross SH, Lee M, Clark VH, Craig JM, Bird AP and Bickmore WA. The chromosomal distribution of CpG islands in the mouse: evidence for genome scrambling in the rodent lineage. Genomics., 1997, 40, 454-461.

73. Cui H., Horon I., Ohlsson R., Hamilton S., Feinberg A. Loss of imprinting in normal tissue of colorectal cancer patients with microsatellite instability. Nat. Med., 1998, 4,1276-1280.

74. Dammann R, Li C, Yoon JH, Chin PL, Bates S and Pfeifer GP. Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumour suppressor locus 3p21.3. Nat Genet., 2000, 25,315-319.

75. Dammann R, Schagdarsurengin U, Seidel C, Strunnikova M, Rastetter M, Baier K, Pfeifer GP. The tumor suppressor RASSF1A in human carcinogenesis: an update. Histol Histopa-thol., 2005, 20, 645-663

76. Dammann R, Takahashi T, Pfeifer GP. The CpG island of the novel tumor suppressor gene RASSF1A is intensely methylated in primary small cell lung carcinomas. Oncogene. 2001a, 20, 3563-3567.

77. Das P.M. and Singal R. DNA methylation and cancer. 2004. J. Clin. Oncol. 22, 4632-4642.

78. Deng GR, Chen AD, Hong J, Chae HS, Kim YS. Methylation of CpG in a small region of the hMLHl promoter invariably correlates with the absence of gene expression. Cancer Res., 1999, 59, 2029-2033.

79. DeSalle LM, Latres E, Lin D, Graner E, Montagnoli A, Baker RT, Pagano M, Loda M. The de-ubiquitinating enzyme Unp interacts with the retinoblastoma protein. Oncogene. 2001,20, 5538-5542.

80. Diatchenko L, Lukyanov S, Lau YF, Siebert PD. Suppression subtractive hybridization: a versatile method for identifying differentially expressed genes. Methods Enzymol., 1999, 303, 349-380.

81. Dikovskaya D, Zumbrunn J, Penman GA, Nathke IS. The adenomatous polyposis coli protein: in the limelight out at the edge. Trends Cell Biol., 2001,11, 378-384.

82. Diwadkar-Navsariwala V, Diamond AM. The link between selenium and chemoprevention: a case for selenoproteins. J. Nutr. 2004,134, 2899-2902.

83. Dodge JE, List AF, Futscher BW. Selective variegated methylation of the pi 5 CpG island in acute myeloid leukemia. Int. J. Cancer, 1998, 78, 561-567.

84. Domann FE, Rice JC, Hendrix MJC. Futscher BW. Epigenetic silencing of maspin gene expression in human breast cancers. Int. J. Cancer, 2000, 85, 805-810.

85. Dong J-M., Leung Т., Manser E., Lim L. cAMP-induced morphological changes are counteracted by the activated RhoA small GTPase and the Rho kinase ROKa. J. Biol. Chem. 1998, 273,22554-22562.

86. Du J., Jiang В., Coffey R.J., Barnard J. Raf and RhoA cooperate to transform intestinal epithelial cells and induce growth resistance to transforming growth factor beta. Mol. Cancer Res. 2004, 2,233-241.

87. Eads CA, Kanenberg KD, Kawakami K, Saltz LB, Blake C, Shibata D. Methylight: a high-throughput assay to measure DNA methylation. Nucleic Acids Res., 2000,28, e32.

88. Edwards A., Civitello A., Hammond H.A., Caskey C.T. DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats. Am. 3. Hum. Genet., 1991,49,746-756.

89. Eis PS, Tam W, Sun L, Chadburn A, Li Z, Gomez MF, Lund E, Dahlberg JE. Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human В cell lymphomas. Proc Natl Acad Sci USA. 2005,102, 3627-3632.

90. Espada J, Ballestar E, Fraga MF, Villar-Garea A, Juarranz A, Stockert JC, Robertson KD, Fuks F, Esteller M. Human DNA methyltransferase 1 is required for maintenance of the his-tone H3 modification pattern. J Biol Chem. 2004, 279, 37175-37184.

91. Esteller M. Aberrant DNA methylation as a cancer-inducing mechanism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2005, 45, 629-656.

92. Esteller M, Avizienyte E, Corn PG, Lothe RA, Baylin SB, Aaltonen LA, Herman JG. Epige-netic inactivation of LKB1 in primary tumors associated with the Peutz-Jeghers syndrome. Oncogene., 2000,19, 164-168.

93. Esteller M, Corn PG, Urena JM, Gabrielson E, Baylin SB, Herman JG. Inactivation of glutathione S-transferase PI gene by promoter hypermethylation in human neoplasia. Cancer Res., 1998, 58,4515-4518.

94. Esteller M, Guo M, Moreno V, Peinado MA, Capella G, Galm O, Baylin SB, Herman JG. Hypermethylation-associated inactivation of the cellular retinol-binding-protein 1 gene in Human Cancer. Cancer Res., 2002, 62, 5902-5905.

95. Esteller M, Hamilton SR, Burger PC, Baylin SB, Herman JG. Inactivation of 06-methylguanine-DNA-methyltransferase by promoter hypermethylation is a common event in multiple human neoplasia. Cancer Res., 1999a, 59, 793-797.

96. Esteller M, Herman JG.Cancer as an epigenetic disease: DNA methylation and chromatin alterations in human tumours. J Pathol, 2002,196,1-7.

97. Esteller M, Sanchez-Cespedes M, Rosell R, Sigransky D, Baylin SB, Herman JG. Detection of aberrant promoter hypermethylation of tumor suppressor genes in serum DNA from non-small cell lung cancer patients. Cancer Res., 1999b, 59, 67-70

98. Etienne-Manneville S., Hall A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 2002, 420, 629-635.

99. Evan GI, Vousden KH. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer. Nature, 2001, 411, 342-348.

100. Evron E, Dooley WC, Umbricht CB, Rosenthal D, Sacchi N, Gabrielson E, Soito AB, Hung DT, Ljung B-M, Davidson NE, Sukumar S. Detection of breast cancer cells in ductal lavage fluid by methylation-specific PCR. The Lancet., 2001,357, 1335-1336.

101. Fackler MJ, McVeigh M, Evron E, Garrett E, Mehrotra J, Polyak K, Sukumar S, Argani P. DNA methylation of RASSF1A, HIN-1, RAR-beta, Cyclin D2 and Twist in in situ and invasive lobular breast carcinoma. Int J Cancer. 2003, 107, 970-975.

102. Faucher K, Rabinovitch-Chable H, Barriere G, Cook-Moreau J, Rigaud M. Overexpression of cytosolic glutathione peroxidase (GPX1) delays endothelial cell growth and increases resistance to toxic challenges. Biochimie. 2003, 85, 611-617.

103. Feinberg AP. Imprinting of a genomic domain of 1 lpl 5 and loss of imprinting in cancer: an introduction. Cancer Res., 1999, 59, 1743-1746.

104. Forgacs E, Zochbauer-Muller S, Minna JD. Molecular Genetic Abnormalities in the Pathogenesis of Human Lung Cancer. Pat. Onco. Res., 2001, 7, 6-13.

105. Frederick A, Rolfe M, Chiu MI. The human UNP locus at 3p21.31 encodes two tissue-selective, cytoplasmic isoforms with deubiquitinating activity that have reduced expression in small cell lung carcinoma cell lines. Oncogene. 1998,16, 153-165.

106. Fritz G., Brachetti C., Bahlmann F., Schmidt M., Kaina B. Rho GTPases in human breast tumours: expression and mutation analyses and correlation with clinical parameters. Br. J. Cancer. 2002. 87, 635-644.

107. Fritz G., Just I., Kaina В. Rho GTPases are over-expressed in human tumors. Int. J. Cancer. 1999,819, 682-687.

108. Frommer M, McDonald LE, Millar DS, Collies CM, Watt F, Grigg GW. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 1827-1831.

109. Fujii H, Biel MA, Zhou WB, Weitzman SA, Baylin SB, Gabrielson E. Methylation of the HIC-1 candidate tumor suppressor gene in human breast cancer. Oncogene, 1998, 16, 21592164.

110. Fuks F, Hurd PJ, Wolf D, Nan X, Bird AP, Kouzarides T. The methyl-CpG-binding protein MeCP2 links DNA methylation to histone methylation. J Biol Chem., 2003, 278,4035-4040.

111. Furlan D, Carnevali I, Marcomini B, Cerutti R, Dainese E, Capella C, Riva C. The high frequency of de novo promoter methylation in synchronous primary endometrial and ovarian carcinomas. Clin Cancer Res., 2006,12, 3329-3336.

112. Galm O, Rountree MR, Bachman KE, Jair KW, Baylin SB & Herman JG. Enzymatic regional methylation assay: a novel method to quantify regional CpG methylation density. Genome Res., 2002,12, 153-157.

113. Gastier J.M., Brody Т., Pulido J.C, Businga Т., Sunden S., Ни X., Maitra S., Buetow K.H., Murray J.C, Sheffield V.C, Boguski M., Duyk G.M., Hudson T.J. Development of a screening set for new (CAG/CTG)n dynamic mutations. Genomics, 1996, 32, 75-85.

114. Gerken S., Leppert M., O'Connel P., Cavenee W., 3ames CD., Ballard L., Stauffer D., Eisner Т., Plaetke R., Lalouel 3.-M., White R.C) A genetic linkage map with 29 loci spanning human chromosome 13q. Genomics., 1993,16, 515-519.

115. Gibson UE, Heid CA and Williams PM A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res., 1996, 6,995-1001.

116. Ginzinger DG, Godfrey ТЕ, Nigro J, Moore DH. 2nd, Suzuki S, Pallavicini MG, Gray JW, Jensen RH. Measurement of DNA copy number at microsatellite loci using quantitative PCR analysis. Cancer Res., 2000, 60, 5405-5409.

117. Girolami F, Passerini I, Gargano D, Frusconi S, Villari D, Nicita G, Torricelli F. Microsatellite analysis of chromosome 3p region in sporadic renal cell carcinomas. Pat. Onco. Res., 2002, 8, 241-244.

118. Gitan RS, Shi H, Yan PS, Huang TH-M. Methylationspecific oligonucleotide microarray: A new potential for high-throughput methylation analysis. Genome Res., 2002,12,158-164.

119. Gonzales I.L., and Sylvesster 3.E. Complete sequence of the 43-kb Human ribosomal DMA repeat: Analysis of the intergenic spaser. Genomics, 1995, 27, 320-328.

120. Goodfellow PN, Sefton L, Farr CJ. Genetic maps. Philos Trans R Soc LondВ Biol Sci., 1993, 339, 139-146. (Review)

121. Gray DA, Inazawa J, Gupta K, Wong A, Ueda R, Takahashi T. Elevated expression of Unph, a proto-oncogene at 3p21.3, in human lung tumors. Oncogene., 1995,10, 2179-2183.

122. Gray JW, Collins C. Genome changes and gene expression in human solid tumors. Carcinogenesis, 2000, 21, 443-452.

123. Green D.R. Apoptotic pathways: the roads to ruin. Cell, 1998, 94, 695-698 (Review).

124. Green D.R. Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors. Cell, 2000 102, 1-4. (Review).

125. Greider, C.W. Telomerase activity, cell proliferation, and cancer. Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 1998, 95, 90-92 (Review).

126. Grimberg J., Nawoschik S., Belluscio L., McKee R., Turck A., and Eisenberg A. Nucleic Acids Res., 1989,17, 8390.

127. Grote HJ, Schmiemann V, Geddert H, Rohr UP, Kappes R, Gabbert HE, Booking A. Aberrant promoter methylation of pl6(INK4a), RARB2 and SEMA3B in bronchial aspirates from patients with suspected lung cancer. Int J Cancer, 2005,116, 720-725.

128. Gupta K, Chevrette M, Gray DA. The Unp proto-oncogene encodes a nuclear protein. Oncogene, 1994,9,1729-1731.

129. Gyapay G, Morissette J, Vignal A, Dib C, Fizames C, Millasseau P, Marc S, Bernardi G, Lathrop M, Weissenbach J. The 1993-94 Genethon human genetic linkage map. Nature Genet., 1994, 7, 246-339.

130. Gyapay G, Schmitt K, Fizames C, Jones H, Vega-Czarny N, Spillett D, Muselet D, Prud'homme JF, Dib C, Auffray C, Morissette J, Weissenbach J, Goodfellow PN. A radiation hybrid map of the human genome. Hum Mol Genet., 1996, 5, 339-346.

131. Hahn W.C., Weinberg R.A. Rules for making human tumor cells. N. Engl. J. Med. 2002, 347,1593-1603. (Review)

132. Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton. Science, 1998, 279, 509-514. Hanahan D„ Weinberg R.A. The hallmarks of cancer. Cell, 2000,100, 57-70 (Review).

133. Hansen S, Lane DP, Midgley CA. The N terminus of the murine p53 tumour suppressor is an independent regulatory domain affecting activation and thermostability. J Mol Biol., 1998, 275, 575-588.

134. Hasegawa Y, Takano T, Miyauchi A, Matsuzuka F, Yoshida H, Kuma K, Amino N. Decreased expression of glutathione peroxidase mRNA in thyroid anaplastic carcinoma. Cancer Lett., 2002,182, 69-74.

135. Heid С A, Stevens J, Livak KJ & Williams PM Real time quantitative PCR. Genome Res., 1996, 6, 986-994.

136. Henry MD, Cohen MB, Campbell KP. Reduced expression of dystroglycan in breast and prostate cancer. Hum Pathol., 2001, 32, 791-795.

137. Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc.Natl.Acad.Sci., 1996, 93, 98219826.

138. Hirohashi S, Kanai Y. Cell adhesion system and human cancer morphogenesis. Cancer Sci., 2003, 94, 575-581. (Review)

139. Horiuchi A., Imai Т., Wang C., Ohira S., Feng Y., Nikaido Т., Konishi I. Up-regulation of small GTPases, RhoA and RhoC, is associated with tumor progression in ovarian carcinoma. Lab. Invest. 2003, 83, 861-870.

140. Hu YJ, Diamond AM. Role of glutathione peroxidase 1 in breast cancer: loss of heterozygosity and allelic differences in the response to selenium. Cancer Res., 2003, 63, 3347-3351.

141. Jain PK. Epigenetics: the role of methylation in the mechanism of action of tumor suppressor genes. Ann N Y Acad Sci., 2003, 983, 71-83.

142. Jing J, Lien CF, Sharma S, Rice J, Brennan PA, Gorecki DC. Aberrant expression, processing and degradation of dystroglycan in squamous cell carcinomas. Eur J Cancer., 2004, 40, 2143-2151.

143. Jones PA and Laird PW. Cancer epigenetics comes of age. Nature Genet., 1999,21, 163-170.

144. Jones PA, Wolkowicz MJ, Rideout WMd, Gonzales FA, Marziasz CM, Coetzee GA, Tap-scott SJ. De novo methylation of the MyoDl CpG island during the establishment of immortal cell lines. Proc Natl Acad Sci USA., 1990, 87, 6117-21.

145. Jones PA. The DNA methylation paradox. Trends Genet., 1999,15, 34-37.

146. Juttermann R, Li E, Jaenisch R. Toxicity of 5-aza-2'-deoxycytidine to mammalian cells is mediated primarily by covalent trapping of DNA methyltransferase rather than DNA de-methylation. Proc Natl Acad Sci USA., 1994, 91, 11797-11801.

147. Kafri T, Ariel M, Brandeis M, Shemer R, Urven L, McCarrey J, Cedar H, Razin A. Developmental pattern of gene-specific DNA methylation in the mouse embryo and germ line. Genes Dev., 1992, 6, 705-714.

148. Kamai Т., Arai K., Tsujii Т., Honda M., Yoshida K. Overexpression of RhoA mRNA is associated with advanced stage in testicular germ cell tumor. BJU Int., 2001, 87, 227-231.

149. Kamai Т., Kawakami S., Koga F., Arai G., Takagi K., Arai K., Tsujii Т., Yoshida K.I. RhoA is associated with invasion and lymph node metastasis in upper urinary tract cancer. BJU Int., 2003a, 91, 234-238.

150. Kamai Т., Tsujii Т., Arai K., Takagi K., Asami H., Ito Y., Oshima H. Significant association of Rho/ROCK pathway with invasion and metastasis of bladder cancer. Clin. Cancer Res., 2003b., 9, 2632-2641.

151. Kamai Т., Yamanishi Т., Shirataki H., Takagi K., Asami H„ Ito Y., Yoshida K. Overexpression of RhoA, Racl, and Cdc42 GTPases is associated with progression in testicular cancer. Clin. Cancer Res., 2004,10, 4799^1805.

152. Kanaya T, Kyo S, Maida Y, Yatabe N, Tanaka M, Nakamura M and Inoue M. Frequent hy-permethylation of MLH1 promoter in normal endometrium of patients with endometrial cancers. Oncogene., 2003,22, 2352-2360

153. Kang W.K., Lee I., Ко U., Park C. Differential effects of RhoA signaling on anticancer agent-induced cell death. Oncol. Rep., 2005,13, 299-304.

154. Kantharidis P, Elosta A, deSilva M, Wall DMP, Hu XF, Slater A, Nadalin G, Parkin JD, Zalcberg JR. Altered methylation of the human MDR1 promoter is associated with acquired multidrug resistance. Clin Cancer Res., 1997, 3, 2025-32.

155. Kass SU, Landsberger N, Wolffe AP. DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription initiation. Curr Biol., 1997, 7,157-65.

156. Kim WY, Kaelin WG. Role of VHL gene mutation in human cancer. J Clin Oncol., 2004, 22, 4991-5004.

157. Kim YI, Giuliano A, Hatch KD, Schneider A, Nour MA, Dallal GE, Selhub J, Mason JB. Global DNA hypomethylation increases progressively in cervical dysplasia and carcinoma. Cancer., 1994,74, 893-899.

158. Kinzler KV, Vogelstein B. Cancer-susceptibility genes. Gatekeepers and caretakers (news, comment). Nature, 1997,386, 761-763.

159. Knudson AG. Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. Cancer Res., 1985, 45, 1437-1443.

160. Кок K, Naylor SL, Buys CHCM. Deletions of the short arm of chromosome 3 in solid tumors and the search for suppressor genes. Adv. Cancer Res., 1997, 71, 27-92.

161. Koltsova G.T., Kirillov A.V., Bannikov V.M., Belyavsky A.V., Sablina O.V., Vorobicva N.V., Grafodatsky A.S., Zakharyev V.M. (1994) 2-nd International Chromosome 13 Workshop, Groningen,. 13.

162. Korotkina RN, Matskevich GN, Devlikanova ASh, Vishnevskij AA, Kunitsyn AG, Karelin AA. Activity of glutathione-metabolizing and antioxidant enzymes in malignant and benign tumors of human lungs. Bull Exp Biol Med., 2002,133, 606-8.

163. Koul D, Jasser SA, Lu Y, Davies MA, Shen R, Shi Y, Mills GB, Yung WK. Motif analysis of the tumor suppressor gene MMAC/PTEN identifies tyrosines critical for tumor suppression and lipid phosphatase activity. Oncogene., 2002, 21, 2357-64.

164. Kuroki T, Trapasso F, Yendamuri S, Matsuyama A, Alder H, Williams NN, Kaiser LR and Croce CM. Allelic Loss on Chromosome 3p21.3 and Promoter Hypermethylation of Sema-phorin3B in Non-Small Cell Lung Cancer. Cancer Res., 2003, 63, 3352-3355.

165. Kuzmin I, Geil L, Ge HY, Bengtsson U, Duh FM, Stanbridge EJ, Lerman MI. Analysis of aberrant methylation of the VHL gene by transgenes, monochromosome transfer, and cell fusion. Oncogene., 1999,18, 5672-9.

166. Kuzmin I, Liu L, Dammann R, Geil L, Stanbridge EJ, Wilczynski SP, Lerman MI, Pfeifer GP. Inactivation of RAS association domain family 1A gene in cervical carcinomas and the role of human papillomavirus infection. Cancer Res., 2003, 63, 1888-1893.

167. S., Yan Т., Yang J.-Q., Oberley T.D. Oberley L.W. The role of cellular glutathione peroxidase redox regulation in the suppression of tumor cell growth by manganese superoxide dismutase. Cancer Res. 2000, 60, 3927-3939.

168. J, Wang F, Kashuba V, Wahlestedt С &Zabarovsky ER. Cloning of deleted sequences (CODE): A genomic subtraction method for enriching and cloning deleted sequences. Bio-techniques., 2001,31,788-793.

169. Maggiora,P., Marchio,S., Stella,M.C., Giai,M., Belfiore,A., De Bortoli,M., Di Renzo,M.F., Costantino,A., Sismondi,P. and Comoglio,P.M. Overexpression of the RON gene in human breast carcinoma. Oncogene, 1998,16, 2927-2933.

170. Maliekal TT, Antony ML, Nair A, Paulmurugan R, Karunagaran D. Loss of expression, and mutations of Smad 2 and Smad 4 in human cervical cancer. Oncogene, 2003, 22, 4889-4897.

171. Malik K, Salpekar A, Hancock A, Moorwood K, Jackson S, Charles A, Brown KW. Identification of diVerential methylation of the WT1 antisense regulatory region and relaxation of imprinting in Wilms' tumor. Cancer Res., 2000, 60, 2356-2360.

172. Manke IA, Lowery DM, Nguyen A, Yaffe MB. BRCT repeats as phosphopeptide-binding modules involved in protein targeting. Science, 2003, 302, 636-639.

173. Matsumoto S, Kasumi F, Sakamoto G, Onda M, Nakamura Y and Emi M. Genes Chrom. Cancer, 1997, 20, 268-274.

174. McQueen HA, Fantes J, Cross SH, Clark VH, Archibald AL, Bird AP. CpG islands of chicken are concentrated on microchromosomes. Nat Genet., 1996,12, 321-324.

175. Melis R., Bradley P., Eisner Т., Robertson M., Lawrence E., Gerken S., Albertsen II., White R, Polymorphic SSR (Simple sequence-repeat) markers for chromosome 20. Genomics, 1993 16,56-62.

176. Mertens F, Johansson B, Hoeglund M and Mitelman F. Chromosomal imbalance maps of malignant solid tumors: a cytogenetic survey of 3185 neoplasms. Cancer Res., 1997, 57, 2765-2780.

177. Miralem T, Avraham HK Extracellular matrix enhances heregulin-dependent BRCA1 phosphorylation and suppresses BRCA1 expression through its С terminus. Mol Cell Biol., 2003, 23, 579-593.

178. Miyakura Y, Sugano K, Konishi F, Fukayama N, Igarashi S, Kotake K, Matsui T, Koyama Y, Maekawa M, Nagai H. Methylation profile of the MLH1 promoter region and their relationship to colorectal carcinogenesis. Genes Chromosomes Cancer, 2003, 36, 17-25.

179. Miyamoto K., Fukutomi Т., Akashi-Tanaka S., Hasegava Т., Asahara Т., Sugimura Т., Ushi-jima T. Identification of 20 genes aberrantly methylated in human breast cancers. Int. J. Cancer., 2005,116, 407-414.

180. Moren A, Hellman U, Inada Y, Imamura T, Heldin CH, Moustakas A. Differential ubiquiti-nation defines the functional status of the tumor suppressor Smad4. J Biol Chem., 2003, 278, 33571-33582.

181. Moscow J.A., He R., Gnarra J.R., Knutsen Т., Weng Y., Zhao W.P., Whang-Peng J., Linehan W.M., Cowan K.H. Examination of human tumors for rhoA mutations. Oncogene, 1994, 9, 189-194.

182. Muller HM, Widschwendter A, Fiegl H, Ivarsson L, Goebel G, Perkmann E, Marth C, Wid-schwendter M. DNA methylation in serum of breast cancer patients: an independent prognostic marker. Cancer Res., 2003, 63, 7641-7645.

183. Myohanen S, Wahlfors J, Janne J. Automated fluorescent genomic sequencing as applied to the methylation analysis of the human ornithine decarboxylase gene. DNA Sequence, 1994, 5, 1-8.

184. Na X, Duan HO, Messing EM, Schoen SR, Ryan CK, di SantAgnese PA, Golemis EA, Wu G. Identification of the RNA polymerase II subunit hsRPB7 as a novel target of the von Hip-pel-Lindau protein. EMBOJ,. 2003, 22, 4249-4259.

185. Nakamoto M., Teramoto H., Matsumoto S., Igishi Т., Shimizu E. K-ras and rhoA mutations in malignant pleural effusion. Int. J. Oncol, 2001,19, 971-976.

186. Narayan A, Ji W, Zhang XY, Marrogi A, Graff JR, Baylin SB, Ehrlich M. Hypomethylation of pericentromeric DNA in breast adenocarcinomas. Int J Cancer., 1998, 77, 833-838.

187. Ochi K, Mori T, Toyama Y, Nakamura Y, Arakawa H. Identification of semaphorin3B as a direct target of p53. Neoplasia, 2002, 4, 82-87.

188. Okano M, Bell DW, Haber DA, Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell., 1999, 99,247-257.

189. Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res., 1996, 24, 5064-5066.

190. Palmisano WA, Divine KK, Saccomanno G, Gilliland FD, Baylin SB, Herman JG and Belin-sky SA. Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. Cancer Res., 2000, 60,5954-5958.

191. Pan Y., Bi F., Liu N., Xue Y., Yao X., Zheng Y., Fan D. Expression of seven main Rho family members in gastric carcinoma. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004, 315, 686-691.

192. Patel A, Groopman JD and Umar A. DNA methylation as a Cancer-Specific Biomarker. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2003, 983, 286-297.

193. Paterson H.F., Self A.J., Garrett M.D., Just I., Aktories K., Hall A. 1990. Microinjection of recombinant p21rho induces rapid changes in cell morphology. J. Cell Biol., Ill, 1001-1007.

194. Peace BE, Hughes MJ, Degen SJ, Waltz SE. Point mutations and overexpression of Ron induce transformation, tumor formation, and metastasis. Oncogene, 2001 20, 6142-6151.

195. Pearlly SY, Huidong S, Farahnaz R, Hsiau TH-C, Hsiau H-A., Yu-Wei L, Liu JC and Huang TH-M. Differential distribution of DNA methylation within the RASSFIA CpG island in breast cancer. Cancer Res., 2003, 63, 6178-6186.

196. Pfeifer GP, Yoon JH, Liu L, Tommasi S, Wilczynski SP, Dammann R. Methylation of the RASSFIA gene in human cancers. Biol Chem., 2002,383, 907-914.

197. Ponder BAJ. Cancer genetics. Nature, 2001, 411, 336-341.

198. Qian XL, Vonwronski MA, Brent TP. Localization of methylation sites in the human 0-6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter correlation with gene suppression. Carcinogen., 1995,16,1385-90.

199. Qu GZ, Dubeau L, Narayan A, YuMC, Ehrlich M. Satellite DNA hypomethylation vs overall genomic hypomethylation in ovarian epithelial tumors of diVerent malignant potential. Mutat Res Fund Mol Mech Mutagens., 1999, 423, 91-101.

200. Rabbitts P, Bergh J, Douglas J, Collins F, Waters J. A submicro-scopic homozygous deletion at the D3S3 locus in a cell line isolated from a small cell lung carcinoma. Genes Chromosomes Cancer, 1990, 2, 231-238.

201. Rader JS, Gerhard DS, O'Sullivan MJ, Li Y, Li L, Liapis H and Huettner PC. Cervical intraepithelial neoplasia III shows frequent allelic loss in 3p and 6p. Genes Chrom. Cancer, 1998, 22, 57-65.

202. Rader JS, Kamarasova T, Huettner PC, Li L, Li Y, Gerhard DS. Allelotyping of all chromosomal arms in invasive cervical cancer. Oncogene, 1996,13, 2737-2741.

203. Ramsahoye BH, Biniszkiewicz D, Lyko F, Clark V, Bird AP, Jaenisch R. Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proc Natl Acad Sci USA., 2000, 97, 5237-5242.

204. Raschle M, Dufner P, Marra G, Jiricny J. Mutations within the hMLHl and hPMS2 subunits of the human MutL-alpha mismatch repair factor affect its ATP-ase activity, but not its ability to interact with hMutS-alpha. J Biol Chem., 2002, 277,21810-21820.

205. Rice JC, Futscher BW. Transcriptional repression of BRCA1 by aberrant cytosine methylation, histone hypoacetylation and chromatin condensation of the BRCA1 promoter. Nucleic Acids Res., 2000,28, 3233-3239.

206. Rihet S., Vielh P., Camonis J., Goud В., Chevillard S., de Gunzburg J. Mutation status of genes encoding RhoA, Racl, and Cdc42 GTPases in a panel of invasive human colorectal and breast tumors. J. Cancer Res. Clin. Oncol., 2001,127, 733-738.

207. Robertson KD, Uzvolgyi E, Liang G, Talmadge C, Sumegi J, Gonzales FA, Jones PA: The human DNA methyltransferases (DNMTs) 1, 3a and 3b: coordinate mRNA expression in normal tissues and overexpression in tumors. Nucleic Acids Res., 1999,27, 2291-2298.

208. Robertson KD, Wolffe AP.DNA methylation in health and disease. Nat Rev Genet., 2000,1, 11-19.

209. Roche J, Drabkin HA. The role of semaphorins in lung cancer. Clin Lung Cancer, 2001, 3, 145-150.

210. Roff DA, Bentzen P. The statistical analysis of mitochondrial DNA polymorphisms: chi 2 and the problem of small samples. Mol Biol Evol., 1989, 6, 539-545.

211. Rountree MR, Bachman KE, Baylin SB. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat Genet., 2000, 25, 269-277.

212. Saaristo A., Karpanen Т., Alitalo K. Mechanisms of angiogenesis and their use in the inhibition of tumor growth and metastasis. Oncogene, 2000,19, 6122-6129. (Review)

213. Sadri R, Hornsby PJ. Rapid analysis of DNA methylation using new restriction enzyme sites created by bisul.te modi.cation. Nucleic Acids Res., 1996, 24, 5058-5059.

214. Sahai E., Marshall C.J. Rho-GTPases and cancer. Nature Rev, 2002, 2, 133-142.

215. Sahai E., Olson M.F., Marshall C.J. Cross-talk between Ras and Rho signalling pathways in transformation favours proliferation and increased motility. EMBOJ., 2001, 20, 755-766.

216. Saito Y, Takazawa H, Uzawa K, Tanzawa H, Sato K. Reduced expression of E-cadherin in oral squamous cell carcinoma: relationship with DNA methylation of 5' CpG island. Int J Oncol., 1998,12,293-298.

217. Salem СЕ, MarkI IDC, Bender CM, Gonzales FA, Jones PA, Liang GN. PAX6 methylation and ectopic expression in human tumor cells. Int J Cancer., 2000, 87, 179-185.

218. Salvesen HB, MacDonald N, Ryan A, Jacobs IJ, Lynch ED, Akslen LA, Das S. PTEN methylation is associated with advanced stage and microsatellite instability in endometrial carcinoma. Int J Cancer., 2001, 91,22-26.

219. Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Press 1989.

220. Samoylova E, Shaikhaev G, Petrov S, Kisseljova N, Kisseljov F. HPV infection in cervical-cancer cases in Russia. Int. J. Cancer., 1995, 61, 337-341.

221. Sanchez-Cespedes M, Esteller M, Wu L, Nawroz-Danish H, Yoo GH, Koch WM, Jen J, Herman JG, Sidransky D. Gene promoter hypermethylation in tumors and serum of head and neck cancer patients, Cancer Res., 2000, 60, 892-895.

222. Sanchez-Garcia I. Consequences of chromosomal abnormalities in tumor development. Annu Rev Genet., 1997,31,429-453.

223. Sauzeau V., Rolli-Derkinderen M., Marionneau C., Loirand G., Pacaud P. RhoA expression is controlled by nitric oxide through cGMP-dependent protein kinase activation. J. Biol. Chem., 2003,278, 9472-9480.

224. Schmutte C, Jones PA. Involvement of DNA methylation in human carcinogenesis. Biol Chem., 1998,379,377-388.

225. Schuler G.D., Boguski M.S., Stewart E.A., Stein L.D., Gyapay G., Rice K., White R.E., Rodriguez-Tome P., Aggarwal A., Bajorek E et al. A gene map of the human genome. Science, 1996, 274, 540-546.

226. Sekido Y, Ahmadian M, Wistuba II, Latif F, Bader S, Wei MH, Duh FM, Gazdar AF, Lerman MI and Minna JD. Cloning of a breast cancer homozygous deletion junction narrows the region of search for a3p21.3 tumor suppressor gene. Oncogene, 1998,16, 3151-3157.

227. Sgambato A, Camerini A, Faraglia B, Pavoni E, Montanari M, Spada D, Losasso C, Brancaccio A, Cittadini A Increased expression of dystroglycan inhibits the growth and tu-morigenicity of human mammary epithelial cells. Cancer Biol Ther., 2004,3, 967-975.

228. Sherr C.J. The pezcoller lecture: cancer cell cycles revisited. Cancer Res., 2000, 60, 36893695.

229. Shi II, Maier S, Nimmrich I, Yan PS, Caldwell CW, Olek A and Huang TH-M. Oligonucleo-tide-Based Microarray for DNA Methylation Analysis: Principles and Applications. J. Cell. Biochem., 2003,88,138-143.

230. Shin S, Verma IM. BRCA2 cooperates with histone acetyltransferases in androgen receptor-mediated transcription. Proc Natl Acad Sci USA., 2003,100, 7201-7206.

231. Shivakumar L, Minna J, Sakamaki T, Pestell R, White MA. The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation. Mol Cell Biol., 2002, 22,4309-4318

232. Sridhar, R., Hanson-Painton, O. and Cooper, D.R. Protein kinases as therapeutic targets. Pharm. Res., 2000,17, 1345-1353

233. Stallings R.L. Distribution of trinucleotide microsatellites in different categories of mammalian genomic sequence: implications for human genetic diseases. Genomics, 1994, 21, 116-121

234. Stallings R.L., Ford A.F., Nelson D„ Torney D.C., Hildebrand C.E., Moyzis R.K. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in mammalian genomes. Genomics, 1991, 10, 807-815.

235. Stanbridge EJ. Human tumor suppressor genes. Annu. Rev. Genet., 1990, 24, 615-657.

236. Stirzaker C, Millar DS, Paul CL, Warnecke PM, Harrison J, Vincent PC, Frommer M, Clark SJ. Extensive DNA methylation spanning the Rb promoter in retinoblastoma tumors. Cancer Res., 1997,57,2229-2237.

237. Stunnenberg, H.G., Garcia-Jimenez, C., and Betz J.L. Leukemia: the sophisticated subversion of hematopoiesis by nuclear receptor oncoproteins. Biochim. Biophys. Acta, 1999,1423, 15-33. (Review)

238. Su GH, Song JJ, Repasky EA, Schutte M, Kern SE. Mutation rate of MAP2K4/MKK4 in breast carcinoma. Hum Mutat., 2002,19, 81

239. Sugimura T and Ushijima T. Genetic and epigenetic alterations in carcinogenesis. Mutat. Res., 2000, 462, 235-246.

240. Szyf M. Therapeutic implications of DNA methylation. Future Oncol., 2005,1,125-135.

241. Szyf M, Pakneshan P, Rabbani SA. DNA demethylation and cancer: therapeutic implications. Cancer Lett., 2004,211, 133-143.

242. Tan M, Li S, Swaroop M, Guan K, Oberley LW, Sun Y Transcriptional activation of the human glutathione peroxidase promoter by p53. J Biol Chem, 1999,274, 12061-12066.

243. Teitz T, Wei T, Valentine MB, Vanin EF, Grenet J, Valentine VA, Behm FG, Look AT, La-hti JM, Kidd VJ. Caspase 8 is deleted or silenced preferentially in childhood neuroblastomas with amplification of MYCN. Nat Med., 2000, 6, 529-535.

244. Todd S, Franklin WA, Varella-Garcia M, Kennedy T, Hilliker CE, Jr., Hahner L, Anderson M, Wiest JS, Drabkin HA, Gemmill RM. Homozygous deletions of human chromosome 3p in lung tumors. Cancer Res., 1997, 57, 1344-1352.

245. Tomlinson IP.M, Novelli MR, Bodmer WF. The mutation rate and cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996,93, 14800-14803.

246. Tse C, Xiang RH, Bracht T and Naylor SL. Human Semaphorin 3B (SEMA3B) located at chromosome 3p21.3 suppresses tumor formation in an adenocarcinoma cell line. Cancer Res., 2002, 62, 542-546.

247. Tsugawa, K., Jones, M.K., Sugimachi, K., Sarfeh, I.J. & Tarnawski, A.S. Biological role of phosphatase PTEN in cancer and tissue injury healing. Front Biosci., 2002, 7, 245-251.

248. Tycko B. Epigenetic gene silencing in cancer. J Clin Invest., 2000,105, 401-407.

249. Uenter J.C. Whole genome squencing and comparative genoraics HUGO'S Human Genome Meeting, Heidelberg, March, 1996.

250. Urquhart'fi., Oldroyd N.3., Kimpton C.P., Gili P. BioTechniques, 1995,18, 116-121.

251. Vachtenheim J, Horakova I, Novotna H. Hypomethylation of CCGG sites in the 3' region of H-ras protooncogene is frequent and is associated with H-ras allele loss in non-small cell lung cancer. Cancer Res., 1994, 54, 1145-1148.

252. Varella-Garcia M, Gemmill RM, Rabenhorst SH, Lotto A, Drabkin HA, Archer PA, Franklin WA. Chromosomal duplication accompanies allelic loss in non-small cell lung carcinoma. Cancer Res., 1998, 58, 4701-4707.

253. Velculescu V.E., Zhang L., Vogelstein В., Kinzler K.W. Serial analysis of gene expression. Science, 1995,270,484-487.

254. Vial E., Sahai E., Marshall C.J. ERK-MAPK signaling coordinately regulates activity of Racl and RhoA for tumor cell motility. Cancer Cell., 2003, 4, 67-69.

255. Vidal A., Millard S.S., Miller J.P., Koff A. Rho activity can alter the translation of p27 mRNA and is important for RasV12-induced transformation in a manner dependent on p27 status. J. Biol. Chem., 2002,277,16433-16440.

256. Vogelstein В., Kinzler K. Cancer genes and the pathways they control. Nature Medicine, 2004,10,789-799.

257. Vos MD, Ellis CA, Bell A, Birrer MJ and Clark GJ. Ras uses the novel tumor suppressor RASSF1 as an effector to mediate apoptosis. J. Biol. Chem., 2000, 275, 35669-35672.

258. Waki T, Tamura G, Sato M, Motoyama T Age-related methylation of tumor suppressor and tumor-related genes: an analysis of autopsy samples. Oncogene, 2003,22, 4128-4133.

259. Wang MH, Wang D, Chen YQ. Oncogenic and invasive potentials of human macrophage-stimulating protein receptor, the RON receptor tyrosine kinase. Carcinogenesis, 2003, 24, 1291-1300.

260. Washington S.S., Boucock A.M., Gerken S„ Matsunami N., Lesh D„ Osborne-Laurence S.L., Cowell 3., Ledbetter D.H., White R., Chakravarti A. A somatic cell hybrid map of human chromosome 13. Genomics, 1993,18, 486-495.

261. Weber J.M. and May P.E. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am. J. Hum. Genet., 1989, 44, 388-396.

262. Weir B.S. Genetic data analysis. Sunderland, MA: Sinauer. 1990.

263. Wistuba II, Berry J, Behrens C, Maitra A, Shivapurkar N, Milchgrub S, Mackay B, Minna JD, Gazdar AF. Molecular changes in the bronchial epithelium of patients with small cell lung cancer. Clin Cancer Res., 2000a, 6,2604-2610.

264. Wolffe AP. Histone-deacetylase: a regulator of transcription. Science, 1996, 272, 371-372.

265. Wong IH, Lo YM, Johnson PJ. Epigenetic tumor markers in plasma and serum: biology and applications to molecular diagnosis and disease monitoring. Ann. N. Y. Acad. Sci., 2001, 945, 36-50.

266. Wong M. L., Medrano J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. BioTechniques, 2005, 39, 1-11.

267. Woodcock DM, Lawler CB, Linsenmeyer ME, Doherty JP, Warren WD. Asymmetric methylation in the hypermethylated CpG promoter region of the human LI retrotransposon. J Biol Chem., 1997,272,7810-7816.

268. Worm J, Bartkova J, Kirkin AF, Straten PT, Zeuthen J, Bartek J, Guldberg P. Aberrant p27(Kipl) promoter methylation in malignant melanoma. Oncogene, 2000,19, 5111-5115.

269. Wu G., Mambo E., Guo Z., Hu S„ Huang X., Gollin S.M., Trink В., Ladenson P.W., Sid-ransky D., Xing M. Uncommon mutation, but common amplifications, of the PIK3CA gene in thyroid tumors. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2005, 90, 4688-4693.

270. Xie S,Wang Z,Okano M,Nogami M, Li Y,He WW,Okumura K, Li E. Cloning, expression and chromosome locations of the human DNMT3 gene family. Gene, 1999, 236, 87-95.

271. Xu P, Guo M, Hay BA. MicroRNAs and the regulation of cell death. Trends Genet., 2004, 20,617-624.

272. Yan J, Zhu J, Zhong H, Lu Q, Huang C, Ye Q. BRCA1 interacts with FHL2 and enhances FHL2 transactivation function. FEBSLett., 2003, 553,183-189.

273. Yang H, Jeffrey PD, Miller J, Kinnucan E, Sun Y, Thoma NH, Zheng N, Chen PL, Lee WH, Pavletich NP. BRCA2 function in DNA binding and recombination from a BRCA2-DSS1-ssDNA structure. Science, 2002,297,1837-1848.

274. Yankovsky N.K., Kapanadze В., Baranova A., Koltsova G.I., Braga E.A., Zakharyev V.M. (1994) 2-nd International Chromosome 13 Workshop, Groningen, 27.

275. Yeo M., Lin P.S., Dahmus M.E., Gill G.N. A novel RNA polymerase II C-terminal domain phosphatase that preferentially dephosphorylates serine 5. J. Biol. Chem., 2003, 278, 2607826085.

276. Ying SY, Lin SL Intron-derived microRNAs-fine tuning of gene functions. Gene, 2004, 342, 25-28. (Review)

277. Yoder JA, Walsh CP, Bestor TH: Cytosine methylation and the ecology of intragenomic parasites. Trends Genet., 1997,13, 335-340.

278. Yu X, Chini СС, He M, Mer G, Chen J. The BRCT domain is a phospho-protein binding domain. Science, 2003,302, 639-642.

279. Z. Xiong, P.W. Laird, COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res., 1997,25,2532-2534.

280. Zabarovska V, Li J, Muravenko O, Fedorova L, Braga E, Ernberg I, Wahlestedt C, Klein G and Zabarovsky ER. CIS-cloning of identical sequences between two complex genomes. Chromosome Res., 2000, 8, 77-84.

281. Zabarovsky E.R., Kashuba U.I., Gizatullin R., Winberg G, Zabarovska VI, Zakharyev VM, Kisselev LL, Klein G. Construction of comprehensive physical and gene map of human-chromosome 3. Human Chromosome 3 Workshop, Minneapolis, USA. 1995.

282. Zabarovsky ER, Kashuba VI, Kholodbnyuk ID, Zabarovska VI, Stanbridge EJ, Klein G. Rapid mapping of NotI linking clones with differential hybridization and Alu-PCR. Genomics, 1994,21,486-489.

283. Zabarovsky ER, Lerman MI, Minna JD. Tumor Suppressor Genes on Chromosome 3p Involved in the Pathogenesis of Lung and Other Cancers. Oncogene, 2002,21, 6915-6935.

284. Zardo G, Caiafa P. The unmethylated state of CpG islands in mouse fibroblasts depends on the poly(ADPribosyl) ation process. J Biol Chem., 1998, 273, 16517-16520.

285. Zhang GL, Xu KL. Loss of heterozygosity at chromosome 3p in epithelial ovarian cancer in China. IntJ Gynecol Cancer., 2002,12, 198-201.

286. Zochbauer-Muller S, Gazdar AF and Minna JD. Molecular pathogenesis of lung cancer. Annu. Rev. Physiol., 2002, 64, 681-708.1. БЛАГОДАРНОСТИ

287. Представленные исследования на протяжении длительного времени были поддержаны грантами Программы РФ «Геном человека» и Российского Фонда Фундаментальных Исследований, а также частично грантами ИНТАС (1995 и 2003гг).

Информация о работе

Брага, Элеонора Александровна
доктора биологических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.03

Диссертация

Идентификация потенциальных онкогенов и генов-супрессоров эпителиальных опухолей человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы