Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях"

На правах рукописи

ХОДЫРЕВ ДМИТРИЙ СЕРГЕЕВИЧ

ИЗМЕНЕНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ ПРОМОТОРНЫХ ОБЛАСТЕЙ СЕМИ ГЕНОВ ХРОМОСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА В ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ

ОПУХОЛЯХ

03.00.03 - Молекулярная биология

□03480335

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2009

003480335

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП «ГосНИИгенетика»).

Научный руководитель: доктор биологических наук Брага Элеонора Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпухин Александр Васильевич

ГУ Медико-генетический научный центр РАМН

доктор биологических наук, профессор Сломииский Петр Андреевич

Институт молекулярной генетики РАН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Защита состоится «10» ноября 2009г. в 14°° часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд,1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика». Автореферат разослан « 3 » 2009 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

кандидат химических наук

Т,Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема онкологических заболеваний остается приоритетной для современного общества. По прогнозам ВОЗ заболеваемость и смертность от онкологических заболеваний во всем мире неуклонно растет и за период с 1999 года по 2020 год увеличится в 2 раза: с 10 до 20 млн. новых случаев. Учитывая, что в развитых странах наблюдается тенденция к замедлению роста заболеваемости и снижение смертности от злокачественных опухолей (как за счет антираковых программ, профилактики онкологических заболеваний, так и за счет улучшения ранней диагностики и лечения), то основной прирост придется на развивающиеся страны, к которым сегодня следует отнести и Россию.

Исследование молекулярно-биологических причин возникновения рака представляет одну из наиболее актуальных проблем здравоохранения. Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют как генетические, так и эпигенетические факторы. Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов (и протонкогенов), или факторов позитивного контроля деления клеток, а затем - антионкогенов или генов-супрессоров опухолевого роста (ТБО), осуществляющих негативный контроль клеточного роста. Онкогены активируются в опухолях по доминантному механизму и стимулируют развитие опухоли. Напротив, ТЭО ииактивируются в опухолях по рецессивному типу с повреждением обоих родительских аллелей. В случае сохранности некоторых критичных ТБв (например, гена р53) в клетке, подверженной неопластическим изменениям, эти Т80 могут вызвать остановку клеточного цикла или ее программируемую смерть (апоптоз), и таким образом, остановить или замедлить опухолевый рост. ТБО могут участвовать в подавлении нео-ангиогенеза, инвазии и метастазирования, в регуляции теломеразной системы. Некоторые ТЭй прямо или опосредованно участвуют в репарации мутаций, например, р53 задерживает клеточный цикл до исправления нарушений с помощью белков системы репарации. Все большая роль в регуляции экспрессии генов, связанных с развитием злокачественных опухолей, отводится метилированию СрО-островков в промоторных районах, а число работ, опубликованных в последнее десятилетие, превысило 14 тысяч. Изменение профиля метилирования промоторных районов некоторых генов является характерной чертой опухолевых клеток, причем аномальное метилирование наблюдается уже на ранних этапах канцерогенеза. Данное исследование посвящено изучению метилирования промоторных областей семи генов в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и немелкоклеточного рака легкого, а также связи метилилирования промоторных районов этих генов с прогрессией данных видов рака. В данной работе проведен подбор систем маркеров, оптимальных для выявления и

J

мониторинга данных социально-опасных видов рака, что является важной задачей молекулярной медицины и практической онкологии.

Цель и задачи исследования. Данная работа направлена на изучение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 с целью поиска молекулярных маркеров, а также подбора информативных систем маркеров, необходимых для ранней диагностики и мониторинга рака легкого, молочной железы и почки. В соответствии с указанной целью нами были поставлены следующие задачи:

1. Определение профиля метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 (Й/Ш/'7Л, БЕМАЗВ, МЯ-Ье1а2, ШОА, ШР4, ОРХ1, ЫК1М81) в эпителиальных опухолях молочной железы, немелкоклеточного рака легкого и почечноклеточного рака.

2. Выявление возможных корреляций между уровнем метилирования этих генов и прогрессией опухоли, а также отбор молекулярных маркеров неблагоприятного прогноза онкозаболевания.

3. Подбор информативных систем маркеров, оптимальных для выявления и мониторинга данных видов опухолей.

Научная иовизна работы. В данной работе впервые исследовано метилирование истинно промоторного СрО-островка гена ЯЕМАЗВ и показано, что он метилирован в 1,5 раза чаще, чем известный ранее интроиный Срв-островок при разных видах рака. Показана высокая частота метилирования промоторного района гена при почечно-клеточном раке и ее связь с прогрессией данного вида

опухоли. Впервые исследованно метилирование промоторных районов генов ШОА, \JSP4, ОРХ1, N№11481 в опухолях разных локализаций. Впервые установлено, что гены ШОА, 1!ЗР4, ЫКШАБ! представляют интерес как диагностические маркеры, изменения в метилировании которых можно обнаружить уже на ранней, доклинической стадии опухолевого процесса. Установлена достоверная положительная корреляция частоты метилирования гена М85Р1А со стадией и степенью анаплазии при раке молочной железы, а также, получены статистически достоверные корреляции изменения метилирования промоторных областей генов ШОА, \JSP4, ОРХ1, КЮЯАБ! с различными клинико-гистологическими характеристиками, такими как стадия, степень анаплазии, размер опухоли и метастазирование в регионарные лимфатические узлы.

Практическая ценность работы. Показано, что изменение метилирования промоторных областей всех исследованных генов можно обнаружить уже на ранней стадии опухолевого процесса, что позволяет использовать данные маркеры для ранней диагностики рака. С другой стороны, достоверные корреляции между уровнем метилирования генов ИАЗБРЫ, БЕМАЗВ, НАЯ-ЬеШ2, ШОА, \JSP4, ЫКШАБ! и

клинико-гистологическими показателями опухолей позволяют использовать их в качестве молекулярных маркеров неблагоприятного прогноза онкозаболевания. Подобраны информативные системы маркеров, позволяющие с высокой чувствительностью выявить рак легкого (в 89% случаев), рак молочной железы (в 80% случаев) и почечно-клеточный рак (в 68% случаев).

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП "ГосНИИ генетика" от 15 апреля 2009г. Результаты настоящей работы доложены автором диссертации на международной конференции "Генетика в России и мире" (Москва, 2006), конференции по фундаментальной онкологии "Петровские чтения" (Санкт-Петербург, 2008), V конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины"(Москва, 2008), а также пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей, а также тезисы докладов и сообщений на отечественных и международных конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 137 страницах машинописного текста и содержат 15 таблиц и 56 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выборка образцов и методы исследований. Для исследования уровня метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RAR-beta2, SEMA3B, RHOA, USP4, GPX1, NKIRAS1 была использована комбинация методов: 1) ПЦР-анализ образцов геномной ДНК, последовательно расщепленной с помощью набора метилчувствительных рестриктаз (МЧРА); 2) модификация геномной ДНК бисульфитом с последующей ПЦР, специфичной к метилированному аллелю гена (МС-ПЦР), или секвенированием ПЦР-продукта исследуемого фрагмента гена (бисульфитное секвенирование). Основные статистические методы - критерий Фишера, ранговая корреляция Спирмана с использованием t-теста Стьюдента.

Исследования были проведены с использованием 231 пары образцов ДНК, выделенных из опухолевых (Т) и морфологически нормальных (N) тканей. Выборка включала 83 случая светлоклеточного почечноклеточного рака (ПКР), 38 случаев рака легкого (HMKPJI, наиболее представлены плоскоклеточная карцинома и аденокарцинома), 110 случаев рака молочной железы (РМЖ, преимущественно

представлены случаи с инфильтративно-протоковой гистологией). Все исследованные нами опухоли были классифицированы клинически по системе TNM принятой Международным противораковым союзом, UICC-2002 г., и гистологически в соответствии с ВОЗ в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ РАМН. При отборе материала проводили дополнительный гистопатологический анализ микросрезов (3-5 мкм), что обеспечило отбор образцов с содержанием опухолевых клеток не менее 70%. Были использованы образцы опухолей только тех пациентов, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. В качестве контролей использовали лейкоциты переферической крови от 15 здоровых доноров и образцы тканей легкого, почки и молочной железы от 6 человек, онкологически здоровых в анамнезе.

2. Определение профиля метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 (RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA, USP4, GPX1, NKIRAS1) в различных эпителиальных опухолях.

2.1. Изменение профилей метилирования промоторных областей генов RASSF1A il RAR-beta2 в эпителиальных опухолях.

Ген RASSFJA (Ras Association Domain Family 1A) локализован в районе 3р21.31 короткого плеча 3 хромосомы (Зр). Этот ген протяженностью 7.6 т.п.н. содержит 5 экзонов и кодирует м-РНК длиной 2 т.н. Белковый продукт RASSF1A относится к цитоплазматическим белкам. Выявлено многообразие функций этого белка в клетке, например, задержка клеточного цикла (Shivakumar et al., 2002), участие в индукции апоптоза за счет взаимодействия с продуктом онкогена ras (Vos et ai, 2000) или гена MST1 (Oh et al., 2006), стабилизация микротрубочек (Пфайфер и Дамманн., 200S). Супрессорная активность гена RASSF1A подтверждена и с помощью нокаут-мутаций гена в клетках мыши (Tommasi et al., 2005).

Ген RAR-beta2 локализован в районе Зр24 относится к суперсемейству ядерных рецепторов, которые служат лиганд-активирующими транскрипционными факторами (Chambón et al., 1996). Лигандами для рецепторов класса RAR являются ретиноиды -витамин А и его биологически активные метаболиты. Известно, что ретиноиды способны ингибировать пролиферацию клеток и индуцировать клеточную дифференцировку. В связи с этим, их используют для профилактики и терапии различных опухолей (Hong et al., 1995). Во многих случаях метилирование промоторной области данного гена было обнаружено в предраковых новообразованиях, и частота метилирования возрастала с прогрессией заболевания и образованием карцином (Feng et al., 2007; Fendri et al., 2009; García et al., 2009).

Физические карты промоторных районов генов Л^Ш^/Л и ЯАЯ-Ьеш2 представленны на рисунке 1а и 16. На рис. 1 показаны Срв-динуклеотиды анализируемых фрагментов и позиции праймеров, использованных в данной работе. При анализе гена применяли метод МС-ПЦР, а М1(-Ьеш2 - метод МЧРА, с

использованием 3-х метил-чувствительных рестриктаз - НраП, ВзЫ2361, АсЕ и бисульфитное секвенирование. Для ЯА85Р1А исследованы 76 случаев ПКР, 110 случаев РМЖ и 32 случая НМКРД для КЛК-Ье1а2~ 6\, 56 и 37,соответственно.

Н-НЧг

МЯ-ЬеШ2

■ - Кодируемы« рклкн Нетрйшфумьшршя

НрЯНр* йрй I

\ \ I ! \/

МП

Шин.

СрС: ш

* У М) 1ЩИ 1-Й

цал а

Рисунок. 1. Физические карты промоторных районов генов Я(А) и &4/?-6е/а2 (Б). Показаны экзоны гена, начало 1-го экзона (+1). А. Праймеры для МС-ПЦР (М/и-Ь и М/и-И), показаны белым цветом на сером фоне. Б. Показаны праймеры использованные для бисульфигного секвенирования (Каг-т-Р и Наг-т-Я, белым цветом на темно-сером фоне), для МЧРА (ИАК-П и НАЯ-Ш) и для контроля сохранности препарата ДНК после

рестрикции (КАИ-П и ЯАК-Ш); стрелками отмечены прямые (—») и обратные праймеры («-)■

На рисунке 2 приведены примеры анализа метилирования Срв-островка гена ПАББРЫ (2а,2в) и гена Ш^ЬеШ2 (26).

А 199 333

К(-) limph Sssl Т N Т N

MU MU М U М U MUMUMUL

• *Ф Щ «т., , - mi шитт —noSl'

Б —Ш--ш— В 199 ззз

Г Щ Н Щ Т ГН

Н}) К.- М

ш Т N T(+)N(+) Т N TMNW L

;; : ; - •»» 180 плс.

МщЯН . " по п.н.

•*' . • ¿2;;. , 'f mm п.н.

Рисунок 2.А. Примеры типичных результатов анализа метилирования промоторной области гена RASSF1A с применением метода МС-ПЦР в 2-х образцах ПКР 199 и 333. Электрофоретическое разделение в 10%-ном ПААГ продуктов МС-ПЦР, полученных для образцов ДНК ПКР. ПЦР проводили на ДНК, конвертированной бисульфитом. Исследован фрагмент гена RASSF1A, 168 п.н. Показаны продукты ПЦР, специфичной к метилированному (М) и неметилированному (U) аллелю. В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования ДНК, использовали ДНК плаценты (placental tissue DNA) после обработки метилтрансферазой Sssl (Sssl). ДНК из лимфоцитов крови использовали как контроль для неметилированных аллелей (limph). К(-) - отрицательный контроль (в отсутствии ДНК). L - маркер с шагом 10 п.н.

Б. Примеры применения МЧРА для гена RAR-beta2: Электрофоретическое разделение в 2% агарозном геле продуктов ПЦР для 2-х образцов ДНК ПКР, до(Ш) и после (T+/N+) гидролиза рестриктазой Bshl236I. Исследуемый фрагмент гена RAR-beta2 - 680 п.н.; Контроль на полноту рестрикции (К2) - фрагмент гена beto-ЗА-адаптина, 445 п.н.; контроль сохранности ДНК (К1) -фрагмент экзона 3 гена RAR-beta2,229 п.н.; К(-) - отрицательный контроль (в отсутствии ДНК). М -маркер с шагом полос 100 п.н.; Г - продукт амплификации ДНК из опухолевой ткани; N - продукт амплификации ДНК из нормальной ткани.

В. Проверка полноты бисульфитной конверсии с применением праймеров, гомологичных фрагменту гена в исходной ДНК, не модифицированной бисульфитом: электрофоретическое разделение в 10%-ном ПААГ продуктов ПЦР. Исследован фрагмент гена RASSF1A, 168 п.н. ПЦР проводили на исходных препаратах ДНК (T/N) и на образцах ДНК, конвертированных бисульфитом (T(+)/N(+)). L -маркер с шагом 10 п.н.

Пример результатов анализа метилирования промоторных областей 2-х генов схематически представлены на рисунке 3.

| 11°-»— I 1 UHUWItV

34« аяк i___1 1» 3

Я» ■BMI 1_1 III 1

Ш яавш I_i II )

да MB t£S..\.: II 1

31? ■i 1_1 II !

!!1 1_II__I II 1

51« i и i II 1

Рисунок 3. А. Применение бисульфитного секвенирования и МЧРА при анализе метилирования Срв-островка промоторной области гена РАК-Ъш2. Сверху даны позиции СрО-динуклеотидов; СрО- динуклеотиды 4, 5, 6, И, 14 и 15, исследованные двумя методами, отмечены белым шрифтом на сером фоне; с левого края приведены номера образцов ПКР. Черный прямоугольник указывает на выявление метилирования, белый прямоугольник метилирование не выявлено. Приведены данные анализа для 9-ти образцов ДНК первичных опухолей ПКР (I) и образцов ДНК условно-нормальной ткани почки от 4-х пациентов (п). Б. Применение метода МС-ПЦР при анализе метилирования СрО-островка гена RASSF1A. Справа показаны клинико-гистологические характеристики опухоли: стадия и степень анаплазии опухоли.

Метод МС-ПЦР позволяет тестировать только 6 CpG-динуклеотидов в промоторной области гена RASSF1A, входящих в состав праймеров (M/U-L, M/U-R) (рис. 1а). Для гена RAR-beta2 метод МЧРА позволил тестировать 8 CpG-динуклеотидов (рис.1б) в промоторном районе. Данные, полученные методом МЧРА, были подтверждены с помощью бисульфитного секвенирования. На рисунке 4 приведены примеры бисульфитного секвенирования этого фрагмента. Показан участок в 40 п.н., перекрывающий 6 CpG-динуклеотидов. Соответствие результатов бисульфитного секвенирования и МЧРА оценивали с использованием ранговой корреляции Спирмана. Результаты этих методов совпали в 44 из 78 CpG (22 с метилированием и 22 без метилирования). Корреляция результатов, полученных двумя независимыми методами для образцов ПКР, высоко достоверна: Rs=0.98, t=15,8, v=l 1, Р=6.52х1(У9

Рисунок 4. Примеры бисульфитного секвенирования фрагмента гена RAR-beta2 (280 п.н.). Показан участок в 40 п.н. CpG-динуклеотиды подчеркнуты и пронумерованы в соответствии с рис 16. (А) Исходный фрагмент до обработки бисульфитом (образец ПКР 500). (Б) Модифицированный неметилированный фрагмент (образец ПКР 703): все остатки цитозинов дезаменированы и превращены в тимин. (В) Модифицированный метилированный фрагмент (образец ПКР 500): цитозин в CpG-динуклеотидах остался не измененным, остальные остатки цитозина конвертированы в тимин. Данные по частоте метилирования промоторных районов генов RASSF1A и RAR-beta2 представленны в таблице 1.

Таблица 1. Частота метилирования промоторных районов генов А^-УЗУ-УЛ и RAR-beta2 в образцах ДНК ПКР, РМЖ и НМКРЛ и в образцах ДНК гистологически нормальной ткани.

Вид рака Частота метилирования* \ ПКР РМЖ НМКРЛ

Р 2,15x10" 1,19x1(Г10 0,043

RASSF1A Т 48/76, 63% 34/110, 31% 9/32, 28%

N 7/76, 9% 1/110, 1% 2/32, 6%

Р 9,18x10' l,09xl(F7 м

RAR-beta2 Т 36''61, 59% 26/56, 46% 13/37, 35%

N 4/51, 8% 2/56, 4% 6/37, 16%

*Под частотой метилирования подразумевали долю образцов, в которых данный ген метилирован.

Итак, в данной работе впервые показана высокая частота метилирования промоторного района гена НАЯ-Ьею! при ПКР, данные по частоте метилирования при

9

РМЖ и НМКРЛ согласуется с данными литературы (Karray-Chouayekh et al., 2009; Опау. et al., 2009; De Jong et al., 2009). Результаты данной работы подтверждают высокую частоту метилирования промоторного района гена RASSF1A в этих эпителиальных опухолях и весьма близки с данными других авторов (Dammann et al., 2005; Karray-Chouayekh S. et al., 2009). В ДНК из крови 15-ти здоровых доноров, а также 6 человек, онкологически здоровых в анамнезе, не выявлено ни одного случая метилирования CpG-островка гена RASSF1A и RAR-beta2.

2.2. Изменение профилей метилирования 2-х CpG-островков гена SEMA3B в эпителиальных опухолях.

Ген SEMA3B локализован в области 3р21.31. Он состоит из 18-ти экзонов, (9533 п.н., NCBI, Build 36), кодирует мРНК длинной 3.4 т.н. и белок 750 а.е. (Lerman&Minna, 2000). Функции гена SEMA3B разнообразны и связаны с онтогенезом. Ген SEMA3B может подавлять рост клеточной линии рака легкого NCI-Н1299 и образование опухолей в мышах с иммунодефицитом (Tomizawa et al., 2001; Tse et al, 2002). Белок SEMA3B способен ингибировать активацию онкобелков МЕТ и RON, индуцировать апоптоз и подавлять неоангиогенез в опухолях (Киселев и др., 2005). Во многих линиях клеток мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легкого выявлено метилирование CpG-островка в 5'области гена (Tomizawa et al., 2001; Kuroki et al, 2003; ¡to et al., 2005), которая, как выяснилось позднее, соответствовала области первого интрона гена (NCBI, Build 36). Мы обнаружили локализованный в промоторной области протяженный CpG-островок (дистальный)(рис.5) с более высокой плотностью CpG-динуклеотидов (22 CpG/772 п.н.) по сравнению с проксимальным (8 CpG/400 п.н.), способный к связыванию ряда факторов транскрипции, содержащих участки взаимодействия с CpG-динуклеотидами (NCB1 Build 36). В связи с этим представлялось целесообразным изучить и сравнить частоту метилирования двух CpG-островков в различных видах рака.

На рисунке 5 показана структурная организация гена SEMA3B, включая расположение промоторного (1-го) и интронного (2-го) CpG-островков.

Рисунок 5. Структурная организация гена ЖАШ5. Показаны 2 Срб-островка: проксимальный (2-й СрО-островок) - в области интрона между нетранслируемым экзоном 1 и транслируемым экзоном 2 (перед АТС1, но Тотсака еI а1., 2001), и дистальный (1-й СрО-островок) - в промоторной области гена (перед АТС2 по базе данных N061, версия 36). 1-й Срй-островок содержит 22 СрО-динуклеотида на участке 772 п.н., а 2-й Срв-островок - восемь Срв на участке 400 п.н.

В данной работе исследованно 83 парных (T/N) образца почечноклеточного рака, 61 образцец рака молочной железы и 38 образцов немелкоклеточного рака легкого. Методом МС-ПЦР определяли статус метилирования 6-ти CpG-динуклеотидов в дистальном CpG-островке и 3-х CpG-динуклеотидов - в интронном. Да1шые по частотам метилирования обоих CpG-островков представлены в таблице 2.

Таблица 2. Частота метилирования 2-х СрО-островкоа гена 5ЕМАЗВ в опухолях почки (ПКР), молочной железы (РМЖ) и немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ)._

Вид рака Частота Метилирования ПКР РМЖ НМКРЛ

Р 1,72х1(Г12 i.oixia5 8,98хШ7

1-й CpG-осгровок т 42/83, 52% 34/61, 53% 20/38, 53%

N 3/83,4% 10/61,16% 1/38,3%

р 2.19x10* 0,0009 0,0001

2-й CpG-островок Т 30/83,36% 25/61,40% 14/38,37%

N 5/83,6% 8/61, 13% 0/38, 0%

В данной работе впервые проведено сравнение частоты метилирования промоторного и интронного СрО-островков гена 8ЕМАЗВ в опухолях почки, молочной железы и немелкоклеточного рака легкого, показано, что частота метилирования промоторного островка выше в 1,5 раза во всех из представленных видов опухолей. Кроме того, получены данные для ПКР о понижении содержания мРНК гена БЕМАЗВ при появлении метилирования в промоторном СрС-островке (Пронина и др., 2009), что позволяет предположить роль промоторного СрО-островка в инактивации гена-супрессора 8ЕМАЗВ при почечноклеточном раке. По данным литературы метилирование интронного СрО-островка наблюдали ранее при раке легкого (Тотггсгм/а е/ а1, 2001; КигоЫ е/ а!., 2003; Но е< а!., 2005), а также при нейробластоме, раке печени и желчного пузыря (Т1$сЬо// е1 а!., 2005; Ыагг е/ а!., 2007; Шдие1те ег а!., 2007). Однако не было сообщений о метилировании промоторного СрО-островка этого гена в каких-либо видах эпителиальных опухолей.

2.3. Изменение профилей метилирования промоторных областей генов ЯНОА/АЯНА, \JSP4 и СРХ1 в эпителиальных опухолях.

Нами проведен предварительный анализ уровней мРНК -30 генов из открытого нами нового «критичного» района между маркерами 0352409 и 0383667 (3р21.31, 600 т.п.н., Логинов и др., 2008) в эпителиальных опухолях. Использована информация, представленная в базах данных ЗЛвЕ (серийный анализ экспрессии генов). В эпителиальных опухолях выявлены изменения уровня мРНК более 10-ти генов. Среди этих генов были отобраны три близко расположенных гена

11

(RHOA/ARHA, USP4 и GPX1), которые согласно данным литературы, связаны с важными функциями клетки и предположительно участвуют в процессах онкогенеза.

Ген RHOA кодирует белок суперсемейства Ras-гомологичных малых гуанозинтрифосфатаз (Sahai and Marshall, 2002). Играет роль в адгезии, в регуляции клеточного цикла и апоптоза, а также в сигнальных путях клетки (Vial et al, 2003; Liu et al., 2004). Вызывает онкогенную трансформацию клеток in vitro и in vivo; усиливает инвазию опухолей (Kamai et al., 2003, 2004).

Ген USP4 кодирует убиквитин-специфическую протеазу 4-го типа (Unp), которая отщепляя убиквитин (76 а.о.), может на время останавливать процесс протеолитической деградации в протеасомах коротко-живущих белков, в том числе, регуляторных белков и компонентов сигнальных путей клетки, включая циклины А, В, Е, р27, р53 и pRb, транскрипционные факторы E2F, NF-кВ, протоонкогены с-шус, c-jun, c-fos, а также Ser/Thr-киназа c-mos (DeSalle et al., 2001). Ген USP4 на 90% идентичен мышиному протоокогену Unp, кодирующему ядерную убиквитин-специфическую протеазу, увеличение экспрессии которой приводит к онкогенной трансформации NIH3T3 клеток (Gupta et al, 1994). В одной из работ показано повышение уровня мРНК USP4 в опухолях легкого, а также онкогенная трансформация клеток NIH3T3 при введении кДНК этого гена (Gray et а!., 1995). В другой работе, напротив, обнаружено снижение уровня Unp-белка в клеточных линиях MKPJI и наличие двух изоформ в клеточных лизатах: 105 и 110 кД (Frederick et al., 1998).

Продукт гена GPX1 (glutathione peroxidase 1) восстанавливает перекись водорода и ее производные и представляет наиболее распространенный член семейства глутатионпероксидаз. Этот белок локализован в митохондриях, ядре и цитоплазме (Diwadkar-Navsariwala and Diamond, 2004). Как алтиоксидантный селенопротеин он играет центральную роль в защите клеток от окислительного стресса и разрушения. Выявлено снижение белкового продукта гена GPX1 в злокачественных опухолях легкого (плоскоклеточный рак и аденокарцинома, Korotkina et al., 2002) и снижение мРНК в опухолях щитовидной железы (Hasegawa et al., 2002), а также способность подавлять рост эндотелиальной линии клеток ECV304 (Faucher et al., 2003). Показана связь определенных полиморфных аллелей гена с развитием разных форм рака, например, рака молочной железы (Ни et al., 2003). Предполагается, что промоторная область гена GPX1 связывает р53 (как транскрипционный фактор), что сопровождается повышением экспрессии GPX1 и стимуляцией апоптоза (Hussain et al., 2004).

Анализ метилирования CpG-островков в промоторных областях генов GPX1, RHOA и USP4 был выполнен методом МЧРА с применением 2-х метил-чувствительных рестрикгаз Hpall и Hhal. Исследование проведено на образцах ПКР

от 39 пациентов, РМЖ от 54 пациентов и на образцах НМКРЛ от 37 пациентов. Структурная организация генов, рестрикционная карта исследованных фрагментов и позиции праймеров показаны на рисунке 6.

Рисунок 6. Структурная организация генов ивР4(А), йРХ1{Б) и ШОА(В). Показаны положение АТС кодонов и СрО-островков. Также показаны, позиции праймеров, использованных при МЧРА для амплификации фрагмента иБР4 (ШР4-Р и ШР4-К; 598 п.н.)(А), для фрагмента вРХ! (ОРХ1-Р и ОРХ1-К; 437 п.н.)(Б) и для фрагмента ЯНОА (ИНОА-Р, ШОА-Я; 416 п.н.)(В). (-♦) - прямой праймер; (<—) - обратный праймер.

Методом МЧРА определяли профиль метилирования 6 Срв-динуклеотидов в Срв-островке гена ИЗР4, 12 Срв-динуклеотидов в Срв-островке гена ОРХ1 и 11 СрО-динуклеотидов в Срв-островке гена КНОА. Данные по частотам метилирования I СрО-островков этих генов представлены в таблице 3. Для более полной картины был определен уровень метилирования каждого из генов, который рассчитывали как долю ! метилированных Срв-динуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК в данной выборке образцов (табл.3).

!

Таблица 3. Частота и уровни метилирования СрО-островков генов САН и ШЮА в образцах ДНК ПКР, РМЖ и НМКРЛ и в образцах ДНК гистологически нормальной ткани.

Кид опухоли ПКР РМЖ HMKHI

1 Уровень ^^метилирования 1 Зфовень Ч^етилвроваиня | Зфовень ^^метилирования

Частота \ штнлираваиня | Частота ^s^ метилирования | Частота ^^ метилирования {

я >0,05 >0,05 0,01 О.ОООб о,пз 1.19 -10"®

USP4 т 7/36, 19% 24/216,11% 19/54, 35% 50/324,15% 8/37, 22% 22/222,10%

N 11/30, 31% 32/216,15% 7/54. 13% 22/324, 7% 18/37, 49% 5S/222, 26%

р 0,1 1Д "10 5 >0,05 >0Л5 >0,05 >0,05

GPX1 т 0/39, 23% 54/468.12% 16/47, 34% 102/564 Д8% 7/37, 19% 48/444, 11%

N 3/35», 8% 1S/4&S, 4% 9/47, 10% S4/S64,10% 7/37, Ю% 48/444, 11%

р >0,05 >0.05 >0.05 >0,05 >0.05 0,04

RHOA Т 5/29, 17% 32/319,10% 11/33. 33% 76/363, 21% 13/37, 35% 92/407, 23%

N 5 /29, 17% 36/319,11% 10/33, 30% 70/363, 1Р% 20/37, 54% 119/407,29%

* Под уровнем метилирования подразумевали долю метилированных CpG-динуклеотидов из суммарно исследованных для конкретного CpG-осгровка в расчете на все образцы данной выборки. За 100% принимали произведение количества CpG, исследованных в конкретном CpG-островке, на число случаев в соответствующей выборке. Уровень метилирования включает в себя как частоту встречаемости случаев метилирования, так и плотность метилирования (долю метилированных CpG в каждом случае).

При РМЖ выявлено достоверное повышение частоты метилирования гена USP4, а при ПКР уровня метилирования гена GPXI. Эти данные указывают на возможное участие этих генов в супрессии данных видов опухолей. При НМКРЛ, напротив, отмечено понижение частоты метилирования для гена USP4 и уровня метилирования для гена RHOA. Эти данные указывают на возможное участие этих генов в роли протоонкогенов при НМКРЛ. Вызывает интерес ген USP4, для которого в случае ПКР и НМКРЛ наблюдается деметилирование CpG-островка промоторной области гена, в то время как при РМЖ наблюдается прямо противоположная картина. Это может быть связано с ткане-специфичным характером метилирования CpG-островка гена USP4. Полученные данные согласуются с приведенными выше данными литературы по функциям этих генов в опухолевой клетке. В литературе нет сообщений по характеристике метилирования генов GPXI, RHOA и USP4 в опухолях. Таким образом, результаты по изменению метилирования этих генов при ПКР, РМЖ и НМКРЛ представлены нами впервые.

2.4. Изменение профиля метилирования трех участков протяженного CpG-островка гена NKIRAS1 в эпителиальных опухолях.

Ген NKIRAS1 - NFKB inhibitor interacting Ras-like 1, или гомолог онкогена Ras, взаимодействующий с фактором некроза NF-kappaB. Его другие названия: KBRAS1 и kappaB-Ras 1. Белковый продукт гена функционирует как G-белки, связанные с

14

GTP/GDP и проявляющие GTP-азную активность. Показано, что белок NKIRAS1 участвует в регуляции деградации IkappaB (Ferwick et al., 2000) и в комплексе с IkappaB подавляет активность NF-kappaB (Chen et al., 2004). Ген NKIRAS1 содержит протяженный CpG-островок (1800 п.н.), окружающий 1-ый нетранслируемый экзон (рис.7). В этом островке мы выбрали три фрагмента, доступные для анализа методом МЧРА. Метилирование каждого из трех фрагментов CpG-островка данного гена было исследовано в 26 случаях РМЖ и 30 случаях HMKPJI. Структурная организация гена, рестрикционная карта и позиции праймеров, использованных в работе, показаны на рисунке 7.

№ г г | «дуо—и

NKIRAS1

В-КадЧ^амрпм ' О' НориеядошЁ регжал

Hhal

" А

//ч

Hhal

Hpall

Hhal

; ч Hpall \

l\ ANSA/

Hpall / ,Hbal

/Hpall

НраЛ

Рисунок 7. Структурная организация гена ЛЖ/А457: Показаны экзоны гена, начало 1-го экзона (+1), положение Срв-островка и расположение участков узнавания двух метилчувствительных рестрикгаз : НраИ (9 участков) и НЬа1 (И участков) - в протяженном Срв-островке. Показаны также позиции праймеров, использованных при МЧРА, трех исследованных фрагментов: фрагмента №1 (Р1 и Ш, 423 пл.), фрагмента №2 (Р2 и Я2, 522 п.н.) и фрагмента №3 (БЗ и Ю, 472 п.н.); (—) -прямой праймер; (<—) - обратный праймер.

Метод МЧРА с использованием 2-х метилчувствительных рестриктаз - Нра11 и НЬа1 позволил определить профиль метилированя 8 СрС-дипуклеотидов в первом фрагменте, 7 во втором и 10-ти в третьем. А для более полной картины был определен уровень метилирования каждого из трех фрагментов гена Ь!К1КЛ51. Данные по частоте и уровню метилирования 3-х фрагментов представлены в таблице 4.

Таблица 4. Частота и уровень метилирования 3-х фрагментов Срв-островка гена Л'А7К^5/ в образцах ДНК РМЖ и НМКРЛ и в образцах ДНК гистологически нормальной ткани.

фрагмент №1 фрагмент №2 фрагмент №3

1 ^овень ^.метклнровання I Уровень ^•^метилирования 1 !фовень ^метилирования

Частота метилирования ] Частота метилирования | Частота метилирования )

р >0,05 0,001 >0,05 0,04 >0,05 >0,05

РМЖ т 13/26,50% 53/182,29% 12/26, 46% 17/182,9% 17/26,65% 102/260,39%

N 18/26,69»/. 85/182,47% 14/26,54% 31Я82Д7% 18/26, 69% 112/260,43%

р >0,05 0,054 0,1 3,1*10"' 0,006 5,9*10"

НМКРЛ т 13/30,43% 53/210,25% 21/30, 70% 43/210,20% 14/30,47% 96/300,32%

N 19/30, 63% 72/210,34% 27/30, 90% 97/210,46% 25/30,83% 172/300,57%

Согласно данным МЧРА наблюдается деметилирование каждого из фрагментов гена NKIRASI, а т.к. данный ген имеет гомологию с онкогеном RAS и взаимодействует с фактором некроза опухолей NF-kappaB (Chen et al., 2004) можно предположить онкогенные функции данного гена при РМЖ и НМКРЛ. Причем, при РМЖ фрагменты 1 и 2 показывают достоверные различия с учетом уровня метилирования, в то время как при НМКРЛ наиболее дистальные фрагменты показывают статистически достоверные различия как частоты, так и уровня метилирования CpG-динуклеотидов этих фрагментов. Данные о метилировании гена NKIRASI получены впервые.

Следует также сказать, что в случае генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, GPX1 не было выявлено методами МС-ПЦР и МЧРА ни одного случая метилирования в лейкоцитах переферической крови от 15 здоровых доноров и в образцах тканей легкого, почки и молочной железы от 6 человек, онкологически здоровых в анамнезе. Напротив, метилирование было выявлено во всех образцах контролей в случае генов RHOA и NKIRASI. В случае гена USP4 ситуация неоднозначная, т.к. было выявлено, что изменение метилирования этого гена обладает ткане-специфичным и опухоль-специфичным характером. Ген USP4 метилирован в ДНК лейкоцитов от 15 здоровых доноров. Представляет интерес выявление метилирования промоторных районов, данных генов в образцах ДНК из гистологически нормальной ткани онкологического пациента, что может указывать на возможность молекулярных изменений в эпителиальных тканях еще до появления морфологически выраженной патологии. Для ряда генов (RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA) в нашей лаборатории проведено исследование на наличие гомозиготных делеций в промоторных областях этих генов, гомозиготные делеции выявлены с частотой 5-10% (данные не

16

представленны). Образцы с гомозиготными делециями были исключены из соответствующих выборок при исследовании метилирования.

3. Анализ корреляций между изменением метилирования СрС-островков генов ДЛЯЖИЛ, БЕМАЗВ, 1!АЛ-Ье1а2, СРХ1, иЯР4, ЯНОА и NKIRAS1 и клинико-гистологическими характеристиками исследованных опухолей ПКР, РМЖ и НМКРЛ.

Во второй части работы на основе полученных результатов проводили выявление возможных корреляций частоты и уровня метилирования промоторных СрО-островков представленных генов с клинико-гистологическими характеристиками опухолей, такими как стадия, степень анаплазии и размер опухоли, а также метастазирование в регионарные лимфатические узлы.

3.1. Связь метилирования промоторных СрС-островков генов &4557<7/1 и ЯАЯ-Ье1а2 с прогрессией эпителиальных опухолей.

Для генов ЛАББРЫ и исследована корреляция частоты метилирования

промоторных СрО-островков с клинической стадией, степенью анаплазии, метастазированием в регионарные лимфатические узлы и размером опухолей почки, молочной железы и немелкоклеточного рака легкого; результат представлен на рисунке 8.

Рисунок 8. Корреляция частоты метилирования гена КАК~Ье1а2 с прогрессией почечноклеточного рака (ПКР), уровня метилирования с прогрессией рака молочной железы; частоты метилирования гена ИА^РМ с прогрессией рака молочной железы (РМЖ) Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.

Для гена связь с Сты1!И. С1МНЯ Стзди ст^ш,

анаплазии акаллазин

между степенью метилиро- -^^- -—-

вания и зависимостью от

прогрессии наблюдали в нескольких видах рака: мочевого пузыря, головного мозга,

предстательной железы, желудка и носоглотки, хотя всего анализировали более 20

видов опухолей (Оаттапп е1а1, 2005; Реп&1 е/ а1, 2009). Нами была устанавленна

достоверная корреляция увеличения частоты метилирования промоторного района

гена с увеличением стадии и степени анаплазии опухоли молочной железы,

что согласуется с данными других авторов, установивших связь степени

метилирования гена ЯА88Р1А с плохим уровнем выживания пациентов при раке

17

% 100

[»г!

ГГО1

п

я

молочной железы (Каггау-Скоиауекк й а/., 2009). Все это позволяет рассматривать ген ЯАБЗПА как молекулярный маркер неблагоприятного прогноза РМЖ. В случае гена нами была выявлена зависимость частоты метилирования с

прогрессией почечноклеточного рака и рака молочной железы, позволяющая включить ген КАК-Ъе1а2 в панель эпигенетических онкомаркеров для прогноза течения заболевания ПКР и РМЖ.

ЙЩ

А

1-й СрС-впровот

2-й СрС-островох

3.2. Связь метилирования 2-х СрС-островков гена ЗЕМАЗВ с прогрессией эпителиальных опухолей.

Ь 1-й С)&«ступмж 1-й СрС-оорютс Для гена БЕМАЗВ показано частое

снижение уровня мРНК в опухолях за счет эпигенетического метилирования

проксимального интронного СрО-островка гена (Ап%е1от е1 а!., 2007; Неззоп е/ а!., 2007). Нами были исследованы корреляции частоты метилирования интронного и промоторного СрО-островков с прогрессией РМЖ, ПКР и НМКРЛ (рис.9). Установлено, что

метилирование промоторного СрО-островка связано с развитием всех 3-х эпителиальных опухолей. С другой стороны, выявлены статистически достоверные корреляции частоты метилирования интронного СрО-островка с размером опухоли при раке молочной железы и прогрессией рака легкого (рис.9). Таким образом, метилирование дистального СрО-островка промоторной области гена БЕМАЗВ может служить онкомаркером как для ранней диагностики опухолей, так и для прогноза и мониторинга течения ПКР, РМЖ и НМКРЛ, в то время как метилирование проксимального СрО-островка может являться маркером неблагоприятного прогноза только для НМКРЛ.

ямкш

Рисунок 9. Корреляция частоты метилирования 2-х Срб-островков гена 8ЕМАЗВ с прогрессией рака молочной железы (РМЖ), почечноклеточного рака (ПКР) и рака легкого (НМКРЛ). Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.

3.3. Связь метилирования CpG-островков генов RHOA, USP4 и GPX1 с прогрессией эпителиальных опухолей.

При анализе профиля метилирования генов RIIOA и USP4 было выявлено деметшшрование их промоторных районов при НМКРЛ, что указывает на онкогенный потенциал данных генов при этом виде рака. Выявленные корреляции уровня метилирования промоторных CpG-островков генов RHOA и USP4 с клинической стадией и степенью анаплазии немелкоклеточного рака легкого подтвердили онкогенный потенциал данных генов при HMKPJI (рис. 10).

Рисунок 10. Корреляция уровня метилирования промоторных CpG-островков генов RHOA и US Г 4 с прогрессией рака легкого (НМКРЛ). Достоверность

рассчитана с помощью теста Фишера.

В одной из работ показано повышение уровня мРНК USP4 в опухолях MKPJI и аденокарциномах легкого, а также онкогенная трансфор-мация клеток NIH3T3 при введении кДНК этого гена (Gray et al., 1995). Полученные нами данные по связи изменения метилирова-ния генов USP4 и RHOA согласуются с данными литературы об онкогенных функциях этих генов в опухолевой клетке, а связь изменения метилирования промоторных районов данных генов с прогрессией HMKPJI, позволяют включить их в панель эпигенетических онкомаркеров для прогноза течения заболевания НМКРЛ. В случае гена GPX1 связи изменения метилирования с прогрессией опухолей, обнаружено не было.

3.4. Связь метилирования 3-х фрагментов СрС-островка гена NKIRAS1 с прогрессией эпителиальных опухолей.

Исходя из наших данных все три фрагмента CpG-островка гена NK1RAS1 деметилируются в опухолях молочной железы и немелкоклеточного рака легкого. Однако в случае РМЖ статистически достоверных корреляций частоты метилирования фрагментов CpG-островка с прогрессией данного вида опухоли не было обнаружено ни для одного из фрагментов.

В то время как для НМКРЛ такие корреляции были выявлены для первого и второго фрагментов (рис. 11). Для первого фрагмента установлена статистически

Стадия Стадия Степень

анаплазии

НМКРЛ

маргинально-значимая корреляция уменьшения уровня метилирования с увеличением степени анаплазии. Для третьего фрагмента выявлена корреляция уменьшения уровня метилирования с клинической стадией, степенью анаплазии и размером опухоли, а также выявлено достоверное уменьшение метилирования третьего фрагмента с увеличением метастазирования в регионарные лимфатические узлы (рис.11), что позволяет использовать данный тест для диагностики и прогноза этого социально-опасного вида рака. Данные литературы по метилированию промоторной области данного гена отсутствуют.

%

«1 фрагмент №1

Рисунок 11. Корреляция уровня метилирования 2-х фрагментов СрО-островка гена ЫКНМЗ! с прогрессией рака легкого (НМКРЛ). Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.

фрагмент №3

~[адй]

112 3 Степень

1Л1 ПЦТС Ц2 3 71 'П ТЭГГ4

Стадия Степень Размер

1« N1.3 Метастазы

НМКРЛ

4. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров.

Одной из важных задач молекулярной медицины и практической онкологии является подбор системы из нескольких маркеров, оптимальных для диагностики и прогнозирования социально-опасных форм рака. К таким заболеваниям относятся рак легкого, который отличает высокая частота смертности, широко-распространенный рак молочной железы и почечно-клеточный рак, который часто не подлежит операбельному вмешательству. На основании полученных данных были выбраны гены наиболее полезные для диагностики, а именно, изменяющие статус метилирования при данном виде рака преимущественно в одну сторону, например, появление гиперметилирования, что характерно для генов-супрессоров, или наоборот, снятие метилирования (деметилирование), что характерно для онкогенов.

При ПКР применение 4-х генов-маркеров СРХ1, ВАБ5Р1А, БЕМАЗВ и КАК-ЬеШ2 позволяет выявить метилирование хотя бы одного из этих маркеров в 13 из 19 случаев (рис. 12). Таким образом, можно говорить, что панель этих маркеров позволяет выявить опухоль в 68% случаев ПКР.

вгзазакЕ^ааазРЗёЕЗйа

GPXI RASSFIA SEMASB BAKbetal

Степень аиаплазии

Стадия I II III IV

Рисунок 12. Схематическое изображение метилирования 4-х маркеров в 19 образцах ПКР. Черный кружок - CpG-динуклеотиды промоторной области гена метилированы в образце опухоли и не метилировании в соответствующей гистологически-нормальной ткани. Во всех остальных случаях не выявлено изменения статуса метилирования. Сверху показаны номера образцов, исследованных на изменение метилирования промоторных районов всех представленных слева генов. Для гена SEMA3B приведены данные для 2-х CpG-островков. Снизу показаны основные клинико-гистологические характеристики: стадия и степень анагаазии опухоли.

При РМЖ для 4-х генов получены репрезентативные данные для общей выборки из 45 образцов. Метилирование хотя бы в одном из этих 4-х маркеров (RASSFIA, SEMA3B, RAR-beta2 и USP4) выявлено в 36 из 45 случаев (рис.13), то есть этот набор маркеров позволяет выявить опухоль молочной железы в 80% случаев.

—< ►— 7t- —i >— —i *— t Л

—i >— —t ►—< —m—i ti У

1X12111222222333333

RASSFIA SEMASB RABhetaZ ÜSP4

нннн

И К С I- ОС ОО ÜC г- эс ч^ г-

4Hh

ИШНИНИИПОН

---— ^ £ £££

М О* Г» Г- г

нн>-

222221112222222222222222222222333333323333333

ачяр начни

Стада I II III

Рисунок 13. Схематическое изображение метилирования 4-х маркеров в 45 образцах РМЖ. Основные обозначения как на рисунке 12.

Анализ 5-ти генов при НМКРЛ: выявление гиперметилирования генов-супрессоров RASSFIA, SEMA3B и деметилирование предполагаемых потенциальных онкогенов RHOA, USP4 и NKIRASI в общей выборке образцов показал, что аномальное метилирование хотя бы одного из этих 5-ти маркеров выявляется в 25 из 29 случаев (рис. 14) т.е. в 89% случаев НМКРЛ. Таким образом, выбрана система маркеров (рис. 14) для диагностики НМКРЛ с частотой выявления 89%.

Степень акаплазкн

Стадия

1122222223222222232 233333 3 2

Рисунок 14. Схематическое изображение метилирования 5-ти маркеров в 28 образцах ПМКРЛ.

Белый кружок - СрО-динуклеотиды промоторной области гена метилированы в образце гистологически-нормальной ткани и не метилированны в образце опухоли. Основные обозначения как на рисунке 12.

К настоящему времени подобраны эпигенетические маркеры: - RASSF1A, HIN-1, RAR-beta2, Cyclin D2, Twist, BRCA1, которые позволяют в 100% случаев выявить метилирование хотя бы в одном из этих генов, и тем самым установить наличие опухоли (Fackler et al, 2003, 2009; Karray-Chouayekh et al, 2009; Feng et al, 2009; Radpour et al., 2009). Несколько более сложная ситуация с диагностикой и прогнозированием опухоли почки. При данном виде рака показана ассоциация с возникновением и прогнозом опухоли для гена UCHLHKagara et al, 2008), а также прогностическое значение гена PTEN (Ljungberg, 2007). Подобранная нами панель маркеров позволяет выявить ПКР с достаточно высокой частотой (68%), однако она нуждается в доработке. Для гена RASSF1A выявлено метилирование промоторной области на ранней стадии заболевания ПКР, что согласуется с нашими данными (Peters et al., 2007). При НМКРЛ на ранней стадии заболевания происходит метилирование генов RASSF1A, APC, ESR1, АВСВ1 и НОХС9 {Lin et al., 2009). Также описаны и другие панели маркеров для НМКРЛ - A PC, CDKN2A/p!6 и RASSF1A с чувствительностью обнаружения метилирования 53% и высокой спецификой (99% ) (Schmiemann et al, 2005). Для панелей онкомаркеров НМКРЛ используют также гены HS3ST2(30ST2), MLH1, RAR02, FHIT и HYAL2, которые по данным разных авторов имеют чувствительность определения метилирования из слюны до 76% и специфику до 86% ( Wang et al, 2003; Belinsky et al, 2006; Shivapurkar et al 2007; Li et al, 2007).

В данной работе нами показаны высокие частоты изменения профиля метилирования ряда генов, приводящих к опухолевой трансформации клетки и прогрессии рака. Эти результаты могут быть использованы в целях диагностики, прогноза и мониторинга течения этих онкологических заболеваний. Подобранны системы маркеров, позволяющие с высокой чувствительностью выявлять РМЖ, ПКР и НМКРЛ - в 80%, 68% и 89% случаев, соответственно.

выводы

1. Впервые обнаружено метилирование не исследованного ранее дистального промоторного СрО-островка гена БЕМАЗВ в опухолях почки, легкого и молочной железы. Показано, что частота метилирования промоторного СрО-островка в 1,5 раза выше, чем интронного в опухолях разных локализаций. Выявлены корреляции частоты метилирования промоторного СрО-островка гена БЕМАЗВ с прогрессией 3-х видов опухолей, а интронного с прогрессией РМЖиНМКРЛ.

2. Впервые показана высокая частота метилирования промоторного района гена ШЯ-Ьеш2 при ПКР (59%), а также установлена достоверная корреляция Частоты метилирования этого гена с прогрессией ПКР и РМЖ.

3. Выявлена корреляция частоты метилирования промоторного района гена ЯАБ5Р1А с клинической стадией и степенью апаплазии опухоли молочной железы.

4. Впервые исследование метилирование промоторных районов генов ЯН0/1, ШР4, СРХ1, КЮЯАЗ! в опухолях разных локализаций. Обнаружено частое деметилирование гена ШОА при НМКРЛ и\ cmNKIRASl при РМЖ и НМКРЛ. Показан опухоль-специфичный характер изменения профиля метилирования промоторной области гена 115Р4. Выявлены корреляции уровня метилирования промоторных СрО-островков генов ШОА и 1Л5Р4 с клинической стадией и степенью анаплазии немелкоклеточного рака легкого. Установлена корреляция уровня метилирования СрО-островка гена ЫКШАБ! с прогрессией немелкоклеточного рака легкого: с клинической стадией, степенью анаплазии и размером опухоли, а также с метастазированием в регионарные лимфатические узлы.

5. Составлены панели информативных маркеров, позволяющие с высокой чувствительностью выявлять опухоль молочной железы (в 80% случаев), опухоль почки (в 68% случаев) и немелкоклеточный рак легкого (в 89% случаев).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Логинов В.И., Малюкова A.B., Серегин Ю.А., Ходырев Д.С., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Киселев Л.Л, Забаровский Ё.Р., Брага Э.А. Уровень метилирования гена RASSF1A в эпителиальных опухолях почки, молочной железы и яичников. Молекулярная Биология, 2004 Т. 38 С. 654-667.

2. Малюкова A.B., Логинов В.И., Ходырев Д.С., Кадырова Е.Л., Пронина И.В., Иванова Т.А., Киселев Ф.Л., Забаровский Е.Р., Киселева Н.П., Брага Э.А. Метилирование предполагаемого гена-супрессора RASSF1A в опухолях шейки матки. Молекулярная Биология, 2004.Т.38С.1005-1013.

3. Э.А. Брага, В.И. Логинов, Е.А. Климов, Г. Килосанидзе, Д.С. Ходырев. Н.Л. Каганова, Т.П. Казубская, В.Д. Ермилова, Р.Ф. Гарькавцева, И.В. Пронина, О.И. Рудько, Е.Р. Забаровский, Г.Е. Сулимова, Л.Л. Киселев. Умножение копий гена и де,метилирование промоторного района - факторы активации транскрипции онкогена RHOA в эпителиальных опухолях. Молекулярная биология, 2006,Т.40С.865-877.

4. Ходырев Д.С.. Логинов В.И., Пронина И.В., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Метилирование промоторной области гена RAR-beta2 в опухолях почки, молочной железы и яичников. Генетика. 2008. Т. 44 С. 1126-1132.

5. Логинов В.И., Базов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Районы потенциальных генов-супрессоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека. Генетика. 2008. Т. 44 С. 250-256.

6. Логинов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В, Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Метилирование промоторной области гена RASSF1A и частота аллельных дисбалансов в критичных районах хромосомы 3 коррелируют с прогрессией светлоклеточного рака почки. Молекулярная биология.2009.43:436-445.

7. Логинов В.И., Ходырев Д.С.. Пронина И.В., Малюкова A.B., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Два CpG-островка гена SEMA3B-. метилирование при светлоклеточном раке почки. Молекулярная биология, 2009.Т.43.С.1081-1085.

8. Ходырев Д.С.. Логинов В.И., Пронина И.В., Губина О.Г., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Анализ метилирования промоторных областей генов 1ЫКЬе1а2 и БЕМЛЗВ для диагностики и прогноза эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников. Материалы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины»,Мос1ша,2008г.

9. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В., Губина О.Г., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Метилирование промоторной области гена НЛЯ-Ье1а2 в опухолях почки, молочной железы и яичников. Материалы 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские чтения", Санкт-Петербург,2008г.

10. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В., Брага Э.А. Метилирование двух СрО-островков гена 5ЕМАЗВ в эпителиальных опухолях разных локализаций. Материалы V Сьезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 2009г.

Подписано в печать: 07.10.2009

Заказ № 2655 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ходырев, Дмитрий Сергеевич

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста.

1.2. Современные подходы к поиску новых «онкозначимых» генов.j |

1.2.1. Анализ аллельных делеций.^

1.2.2. Участки хромосомы, подавляющие рост опухоли.

1.2.3. «Вычитающая» гибридизация как способ отбора онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста.

1.2.4. Применение микропанелей для поиска "онкозначимых" генов.

1.3 Эпигенетическая регуляция экспрессии генов в опухоли.

1.3.1 Метилирование ДНК.

1.3.2. CpG-островки в геноме человека.

1.3.3. Гипометилирование генома опухолей.

1.3.4. Гиперметилирование CpG-островков в геноме опухолей.

1.3.5. Эпигенетические механизмы инактивации генов.

1.3.6. МикроРНК человека и канцерогенез.

1.4. Подходы к анализу метилирования промоторных районов генов в эпителиальных опухолях.

1.5. Гены на коротком плече хромосомы 3, предположительно связанные с онкогенезом.

1.5.1. Ген RASSF1A (3р21.3).

1.5.2. Ген SEMA3B (3р21.3).

1.5.3. Ген RAR-beta 2 (3р23-р22.3).

1.5.4. Ген RHOAIARHA (3р21.31).

1.5.5. Геи USP4 (3р21.31).

1.5.6. Ген GPX1 (3р.21.31).

1.5.7. Ген NKIRAS1 (Зр24.2).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Сбор материала.

2.2. Выделение геномной ДНК из ткани.

2.3. Анализ метилирования ДНК с применением метилчувствительных рестриктаз (МЧРА).

2.4. Бисульфитная конверсия ДНК.

2.5. Бисульфитное секвенирование.

2.6. Метил-специфичная полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР).

2.7. Статистическая обработка результатов.5g

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Гиперметилирование промоторного района гена RASSF1A в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака.

3.2 Два CpG-островка гена SEMA3B: метилирование в опухолях разных локализаций и связь с прогрессией рака.

3.3. Метилирование промоторного района гена RAR-beta2 в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака.

3.4. Анализ метилирования промоторного района гена RHOA/ARHA в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака.

3.5. Анализ метилирования промоторного района гена USP4 в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака.

3.6. Анализ метилирования промоторного района гена GPX1 в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака. Ю

3.7. Изменение метилирования 3-х участков протяженного CpG-островка в промоторном районе гена NKIRAS1 в опухолях разных локализаций, связь с прогрессией рака. Ю

3.8. Предпосылки для разработки новых диагностических и прогностических онкомаркеров.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях"

Исследование молекулярно-биологических причин возникновения рака представляют собой одну из наиболее актуальных проблем здравоохранения. Онкологические заболевания занимают второе место в мире по причине смертности после сердечно-сосудистых заболеваний и в последнее десятилетие их частота неуклонно растет. Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют как генетические, так и эпигенетические факторы.

Значительный прогресс в понимании механизмов канцерогенеза связан с открытием сначала онкогенов (и протонкогенов), или факторов позитивного контроля деления клеток, а затем - антионкогенов или генов-супрессоров опухолевого роста (TSG), осуществляющих негативный контроль клеточного роста. Онкогены активируются в опухолях по доминантному механизму и стимулируют развитие опухоли. Напротив, TSG инактивируются в опухолях по рецессивному типу с повреждением обоих родительских аллелей.

В случае сохранности некоторых критичных TSG (например, гена р53) в клетке, подверженной неопластическим изменениям, эти TSG могут вызвать остановку клеточного цикла или ее программируемую смерть (апоптоз), и таким образом, остановить или замедлить опухолевый рост (Чумаков, 1998, 2000). TSG могут также участвовать в подавлении нео-ангиогенеза, инвазии и метастазирования, в регуляции теломеразной системы. Некоторые TSG прямо или опосредованно участвуют в репарации мутаций, например, р53 задерживает клеточный цикл до исправления нарушений с помощью белков системы репарации.

С целью поиска генов, связанных с развитием опухолей, в первую очередь проводят картирование областей ДНК, часто делетируемых в раковых клетках, и исследуют подавление роста опухоли под действием фрагментов ДНК из этих районов. Количество картированных и клонированных генов, вовлеченных в канцерогенез, постоянно увеличивается. При выявлении новых генов-кандидатов сравнивают уровень их экспрессии (синтез м-РНК) в опухоли по сравнению с аналогичным паттерном в гистологически нормальных тканях. В регуляции экспрессии генов, связанных с развитием злокачественных опухолей, все большая роль отводится метилированию CpG-островков в их промоторных районах (Attwood et al., 2002; Jain et al., 2003; Hu et al., 2008; Lorente et al., 2009).

В последнее десятилетие число опубликованных работ, связанных с процессами эпигенетической модификации генов, превысило 14 тысяч, и число обзорных статей к 2000 г. достигло 200, а к 2009 г. более 1500. С одной стороны, вызывает интерес сложнейший механизм эпигенетической модификации, протекающей с участием многокомпонентных систем и разнообразных факторов, а с другой стороны, появилась принципиально новая платформа для отбора онкомаркеров. Сочетание этих специфических молекулярных маркеров позволяет определить прогноз развития заболевания, подобрать оптимальную тактику лечения и разработать современные методики, позволяющие проводить комплексный анализ определенного типа опухоли и ДНК-диагностику для конкретного пациента.

Целью данной работы являлось изучение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3: RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA/ARHA, USP4, GPX1, NKIRAS1, с целью поиска молекулярных маркеров, а также подбора информативных систем маркеров, необходимых для ранней диагностики и мониторинга рака легкого, молочной железы и почки.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Ходырев, Дмитрий Сергеевич

выводы

1. Впервые обнаружено метилирование не исследованного ранее дистального промоторного CpG-островка гена SEMA3B в опухолях почки, легкого и молочной железы. Показано, что частота метилирования промоторного CpG-островка в 1,5 раза выше, чем интронного в опухолях разных локализаций. Выявлены корреляции частоты метилирования промоторного CpG-островка гена SEMA3B с прогрессией 3-х видов опухолей, а интронного с прогрессией РМЖ и НМКРЛ.

2. Впервые показана высокая частота метилирования промоторного района гена RAR-beta2 при ПКР (59%), а также установлена достоверная корреляция частоты метилирования этого гена с прогрессией ПКР и РМЖ.

3. Выявлена корреляция частоты метилирования промоторного района гена RASSF1A с клинической стадией и степенью анаплазии опухоли молочной железы.

4. Впервые исследование метилирование промоторных районов генов RHOA, USP4, GPX1, NK1RAS1 в опухолях разных локализаций. Обнаружено частое деметилирование гена RHOA при НМКРЛ и гена NKIRAS1 при РМЖ и НМКРЛ. Показан опухоль-специфичный характер изменения профиля метилирования промоторной области гена USP4. Выявлены корреляции уровня метилирования промоторных CpG-островков генов RHOA и USP4 с клинической стадией и степенью анаплазии немелкоклеточного рака легкого. Установлена корреляция уровня метилирования CpG-островка гена NKIRAS1 с прогрессией немелкоклеточного рака легкого: с клинической стадией, степенью анаплазии и размером опухоли, а также с метастазированием в регионарные лимфатические узлы.

5. Составлены панели информативных маркеров, позволяющие с высокой чувствительностью выявлять опухоль молочной железы (в 80% случаев), опухоль почки (в 68% случаев) и немелкоклеточный рак легкого (в 89% случаев).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ходырев, Дмитрий Сергеевич, Москва

1. Абелев Г. И., Эрайзер Т. JI. На пути к пониманию природы рака. Обзор. Биохимия, 2008, 73(5),605-618.

2. Ванюшин Б.Ф. Метилирование ДНК и эпигенетика. Генетика, 2006, 42(9), 1186— 1199.

3. Д.В.Залетаев, М.В.Немцова, В.В.Стрельников, О.В.Бабенко, Е.В.Васильев, В.В.Землякова, А.И.Жевлова, О.В.Дрозд Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях. Молекулярная биология, 2004, 38(2), 213-223

4. Забаровский Е.Р. Новые стратегии клонирования идентичных и различающихся фрагментов ДНК из сложных геномов. Молекуляр. биология, 2000, 34, 612-625.

5. Киселев JI.JL, Сенченко В.Н., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека. Молекулярная медицина, 2005,3, 17-28.

6. Киселев Ф.Л. Гены стабилизации ДНК и канцерогенез. Молекуляр. биология, 1998, 32, 197205.

7. Киселева Н.П., Киселев Ф.Л. Деметилирование ДНК и канцерогенез (обзор) Биохимия, 2005, 70, 900-912

8. Кленов М.С., Гвоздев В.А. Биохимия, 2005, 70, 1445-1458.

9. Копнин Б.П. 2000.0пухолевые супрессоры и мутаторные гены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научи, мир, стр. 75-92.

10. Логинов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Малюкова А.В., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. 2009. Два CpG-островка гена SEMA3B: метилирование при светлоклеточном раке почки. Молекуляр. Биология, 43

11. Пронина И.В., Логинов В.И., Прасолов B.C. и др. 2009. Изменение уровней экспрессии гена SEMA3B в эпителиальных опухолях. Молекуляр. Биология, 43(3), 439-445.

12. Пфайфер Г.П., Дамманн Р. Метилирование гена опухолевого супрессора RASSFIA в человеческих опухолях. 2005, Биохимия, 70, 699-708.

13. Ровенский Ю.А. и Васильев Ю.М. Морфогенетические реакции клеток и их нарушения при опухолевой трансформации. 2000. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 260-283.

14. Рогаев Е.И., Боринская С.А., Исламгулов Д.В., Григоренко А.П. МикроРНК человека в норме и патологии. 2008, Молекулярная биология, 42(5), 751-764.

15. Рязанский С.С., Гвоздев В.А. Короткие РНК и канцерогенез. 2008, Биохимия, 73(5), 640-655.

16. Саложин С.В., Прохорчук Е.Б., Георгиев Г.П. Метилирование ДНК как один из основных эпигенетических маркеров. Биохимия, 2005, 70, 641-651

17. Татосян А.Г. 2000. Онкогены. Сборник обзорных статей «Канцерогенез», под ред. Д.Г. Заридзе, М: Научн. Мир, стр. 57-74.

18. Чумаков П.М. Роль р53 в программируемой клеточной смерти. Изв. Акад. Наук, сер. Биология, 1998,2, 151-156.19.22.