Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 человека при раке легкого, шейки матки и яичников

Дмитриев, Алексей Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 человека при раке легкого, шейки матки и яичников
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 человека при раке легкого, шейки матки и яичников"

На правах рукописи

ДМИТРИЕВ Алексей Александрович

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ХРОМОСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО, ШЕЙКИ МАТКИ И

ЯИЧНИКОВ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

21 НОЯ 2013

Москва 2013

005539251

Работа выполнена в Лаборатории структурно-функциональной геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук и частично в Каролинском Институте (Швеция).

Научный руководитель:

кандидат химических наук Вера Николаевна Сенченко

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Евгений Александрович Климов

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждения высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет

кандидат биологических наук Юрий Александрович Серёгин

Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение Российский онкологический центр имени H.H. Блохина Российской академии медицинских наук

Защита диссертации состоится « 1? » Q^tQjS^a- 2013 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетным учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Автореферат разослан «

¿5 »

2013 г

Ученый секретарь диссертационного совета Кандидат химических наук

Анатолий Михайлович Крицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Рак представляет собой, прежде всего, заболевание генома, вызванное генетическими и эпигенетическими нарушениями (Esteller et al., 2001; Jones et al., 2002; Wood et al., 2007). В связи с этим уже не один десяток лет поиск геномных онкомаркеров для диагностики, прогностики, определения гистологического типа, эффективности терапии и выбора оптимальной стратегии лечения заболевания является актуальной задачей, к которой прикован огромный интерес мирового научного сообщества.

Метилирование геномной ДНК - важнейший эпигенетический механизм регуляции экспрессии генов, играющий ведущую роль в различных клеточных процессах - адаптации, дифференциации, межклеточной коммуникации, геномном импринтинге, инактивации X-хромосомы, подавлении транскрипции и транслокации повторяющихся элементов и многих других (Jin et al., 2008; Bergman et al., 2013). Метилирование ДНК имеет важное значение для нормального развития, а нарушение механизмов метилирования является одной из причин многих заболеваний, включая рак (Robertson, 2005; Gopalakrishnan et al., 2008). При раке наблюдается локальное гиперметилирование генов, в первую очередь генов-супрессоров опухолевого роста, на фоне потери метилирования других элементов генома (Jones et al., 2002).

Недавние масштабные исследования генома раковых клеток показали, что далеко не все генетические нарушения (точечные мутации, хромосомные перестройки, делеции и др.) вносят вклад в возникновение рака (Greenman et al., 2007; Wood et al., 2007; Bozic et al., 2010). В то же время гиперметилирование промоторных областей различных генов-супрессоров опухолевого роста - частое событие, нередко наблюдаемое уже на ранних стадиях заболевания или даже задолго до его возникновения (Pfeifer et al, 2009). Гиперметилирование затрагивает сотни различных генов, вовлечённых в контроль клеточного цикла, трансдукцию внешних сигналов, регуляцию адгезии и миграции. Показана потенциальная прогностическая ценность этих нарушений (Bradly et al., 2012; Dai et al, 2013; Huang et al., 2013), а также их диагностическая значимость для неинвазивных исследований (Guzman et al., 2012; Leng et al., 2012). Более того, такие исследования позволяют решать фундаментальную задачу - выявлять новые гены-супрессоры опухолевого роста.

Кроме того, последние исследования показывают, что использование «стандартного» набора макропараметров (TNM-классификации, гистологического типа, степени анаплазии и др.) недостаточно для назначения оптимального курса лечения и существуют группы больных, требующие индивидуальных схем терапии (Travis et al., 2013). Выявление таких пациентов возможно только с использованием молекулярных методов.

Вовлеченность хромосомы 3 в развитие и прогрессию различных видов рака хорошо известна (Braga et al, 2002; Hesson et al., 2007). Однако масштабного одновременного анализа

генетических и эпигенетических нарушений на представительной выборке образцов до сих пор не проводилось.

Цель исследования. Цель исследования - поиск генов хромосомы 3 человека с высокой частотой генетических и/или эпигенетических нарушений в опухолях легкого, шейки матки и яичников с различными гистологическими и патологическими характеристиками и оценка их применимости в качестве диагностических маркеров.

Задачи исследования.

1. Разработка программного приложения для обработки данных ЫоИ-микрочипов с целью повышения точности получаемых результатов.

2. Расчет границ относительного сигнала на ЫоИ-микрочипе, соответствующих различным вариантам генетических и эпигенетических нарушений (метилированию и деметилированию промоторных участков генов, делециям и амплификациям).

3. Определение паттернов метилирования и/или делеций генов хромосомы 3 в образцах рака легкого, шейки матки и яичников с использованием специфичных к хромосоме 3 ЫоИ-микрочипов.

4. Подтверждение полученных результатов методом бисульфитного секвенирования.

5. Оценка частоты и степени изменений уровня мРНК генов с высокой частой нарушений (по данным МоИ-микрочипов) методом количественной ПЦР.

6. Статистический анализ данных ЫоИ-микрочипов с целью выявления общих и специфичных нарушений для всех 3-х видов рака, а также для каждого вида рака в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками.

7. Построение предсказательных моделей для определения каждого из видов рака, а также гистологических и патологических характеристик опухоли.

Научная новизна. Для нормировки и последующей обработки данных ЬМ-микрочипов разработали программное приложение Ы1МАЫ (Ыои-гтсгоаггауз апаІуБІз). Рассчитали границы относительного сигнала на ЫоИ-микрочипе, соответствующие различным вариантам генетических и эпигенетических нарушений. Благодаря этому удалось повысить точность получаемых данных, чувствительность и специфичность метода.

С использованием чувствительного метода гибридизации ДНК на ЫоИ-микрочипах и разработанного программного обеспечения впервые оценили частоту нарушений 188-ми генов хромосомы 3 в опухолях легкого, шейки матки и яичников. Для каждого вида рака выявили более 40 генов с частотой метилирования и/или делеций выше 15%. Для многих из этих генов (около 40%, в зависимости от вида рака) вовлеченность в онкогенез показана впервые.

Для 10-ти генов с высокой частотой нарушений при раке легкого (по данным ЫоИ-микрочипов) и 2-х генов при раке шейки матки методом количественной ПЦР выявили частое и

значительное снижение уровня мРНК. Показали, что метилирование и/или делецни вносят значительный вклад в снижение экспрессии исследованных генов.

Впервые обнаружили общие и специфичные нарушения для трех видов рака, а также в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками для каждого из видов рака. Выявленные нарушения позволили построить оригинальные предсказательные модели и предложить наборы генов для определения каждого из трех видов рака, а также гистологических и патологических характеристик опухоли.

Теоретическая и практическая значимость. Поиск генов-супрессоров опухолевого роста продолжает оставаться актуальной задачей онкогеномики. Выявлено 37 Notl-сайтов, ассоциированных с 40 генами, с высокой частотой нарушений во всех 3-х исследованных видах рака. Для 17-ти из этих генов впервые показана вовлеченность в онкогенез. Все эти гены являются потенциальными генами-супрессорами опухолевого роста.

Обнаружены гены с высокой частотой нарушений только при одном из видов рака: ANKRD28 и KY при раке легкого, PDZRN3 и SOX14 при раке шейки матки, АВТВ1 и PODXL2 при раке яичников. Перечисленные гены потенциально могут быть использованы в качестве специфичных к виду рака маркеров для неинвазивной диагностики.

Построены предсказательные модели и предложены наборы генов для определения каждого из трех видов рака, а также гистологических и патологических характеристик опухоли. Точность определения параметров с использованных предложенных наборов составила 73 -90%.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на 16th World Congress on Advances in Oncology and 14th International Symposium on Molecular Medicine (Rhodes Island, Greece, 2011); 17th World Congress on Advances in Oncology and 15th International Symposium on Molecular Medicine (Crete Island, Greece, 2012); конкурсе молодых ученых ИМБ им. В.А. Энгельгардга РАН (Москва, Россия, 2012); осеннем финале молодежного инновационного конкурса по программе «У.М.Н.И.К.» (Москва, Россия, 2012),VIII Всероссийском съезде онкологов, конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, Россия, 2013).

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликованы 4 статьи в научных журналах, 2 главы в книге и 4 тезисов конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 396 источников. Работа изложена на 151 странице, включает 14 рисунков и 16 таблиц.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы тканей. Образцы опухолей легкого, шейки матки и яичников и морфологически нормальных тканей («условных норм») получены от пациентов, оперированных в ФГБУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН до проведения химиотерапии или радиотерапии. Весь материал типирован гистологически и охарактеризован в соответствии с TNM-классификацией в отделе патологической анатомии опухолей человека ФГБУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Выборка включала 40 образцов немелкоклеточного рака легкого (HMPJI), 48 образцов рака шейки матки (РШМ), 18 образцов высокодифференцированного серозного рака яичников (ВДСРЯ) и 7 доброкачественных опухолей яичников (ДОЯ).

РНК, кДНК и ДНК. Выделение тотальной РНК и ДНК, а также получение одаоцепочечных кДНК осуществляли по стандартной методике с использованием наборов RNeasy Mini Kit и QIAamp DNA Mini Kit («Qiagen») и обратной транскриптазы M-MuLV («Fermentas»).

Notl-микрочипы. В работе использованы специфичные к хромосоме 3 Notl-микрочипы, содержащие 180 Notl-клонов, ассоциированных со 188 генами. Notl-клоны со вставками до 15 тысяч нуклеотидов иммобилизованы на стеклянных слайдах в шести повторносгях каждый (Kashuba et al., 1999; Li et al., 2002). Гибридизация флуоресцентно-меченой парной пробы («условная норма» - dCTP-СуЗ/опухоль - dCTP-Cy5) на Notl-микрочипе проводилась на приборе Lucidea Base («Amersham Pharmacia Biotech») согласно протоколу производителя. Микрочипы сканировали на приборе GenePix 4000А («Amersham Pharmacia Biotech»). Полученные данные для дальнейшей обработки экспортировали в разработанное нами приложение NIMAN.

Бисульфитное секвенирование. Бисульфитная конверсия ДНК выполнена с использованием набора реагентов EZ DNA Methylation Kit («Zymo Research»), Секвенирование осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 («Applied Biosystems»).

ПЦР в реальном времени. Количественную ПЦР проводили с использование фирменных наборов праймеров и проб («Applied Biosystems») на приборе 7500 Real-Time PCR System («Applied Biôsystems»), Каждая реакция проведена трижды. Данные проанализированы с использованием двух контрольных генов (GAPDH и RPN1) и ДДФ-метода с применением разработанного нами приложения АТГ (Анализ Транскрипции Генов). С учетом вариабельности контрольных генов значимыми считали изменения экспрессии в 2 и более раз.

Статистический анализ данных. Данные количественной ПЦР анализировали с помощью непараметрических критериев Уилкоксона, Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса. Для оценки корреляций использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Частоты нарушений в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками сравнивали с помощью критерия х* и точного теста Фишера. Все вычисления выполнены с использованием разработанных нами приложений АТГ и NIMAN, а также программы BioStat (Glantz, 2005). Различия считали статистически значимыми при р < 0.05. Для построения предсказательных моделей использовали метод опорных векторов (Campbell et al, 2011), эффективность моделей оценивали с помощью коэффициента Джини (BaseGroup Labs, 2013).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. NIMAN- приложение для обработки данных Notl-микрочипов

Перед гибридизацией на Notl-микрочипе пробу, обогащенную CpG-островками, метят флуоресцентными метками и выравнивают концентрации сравниваемых образцов по тотальной ДНК (Pavlova et а!., 2009). Это необходимый этап, однако, из-за этого относительный сигнал, получаемый после сканирования Notl-микрочипа (/, отношение интенсивности сигнала в образце опухоли к интенсивности сигнала в образце «условной нормы» для конкретного Notl-сайта), будет отличаться от теоретического на поправочный коэффициент к. По сути к представляет собой то количество раз, в которое при выравнивании концентраций необходимо увеличить концентрацию ДНК из образца опухоли ввиду того, что в нем отсутствует часть метилированных и/или делегированных участков ДНК, содержащих Notl-сайты. Пусть d - доля метилированных/делетированных Notl-сайтов на одном из аллелей в образце опухоли от общего числа Notl-сайтов. Тогда для Notl-сайтов без изменений должны были бы получить относительный сигнал /сохр = ^ = 1 (N - интенсивность сигнала в образце «условной нормы» для конкретного Notl-сайта), а для метилированных/делетированных Notl-сайтов - /мет/дел =

0.S0XJV . .. „

-= 0.50. Однако из-за выравнивания концентрации получаем, что

^тотальная к X Остальная

откуда

_ /^тотальная__^тотальная__1

^тотальная ^ * 0.50 X NToxaJlbHaiI + (1 d) X /Утотальная 1 — 0.50 X d

где Д'тотальмя/'/тотальная - интенсивность сигнала от тотальной ДНК из образца «условной нормы»/опухоли, измеренная на спектрофотометре («NanoDrop»).

Тогда

гэксп _ ь V / _ Уп/мет

'дел/мет — " л 'дел/мет - l_Q50xd

Например, при d = 0.20 получим к = 1.11 и, соответственно, вместо /сохр = 1.00 будет ¡coif = 1-11, а вместо /дел/нет = 0.50 будет /дел/мет = л в случае d = 1.00 (Notl-сайтов без нарушений нет) получим к = 2.00 и /дел/мет = 1-00, то есть нарушений мы не увидим, хотя все Notl-сайты метилированы и/или делегированы. Таким образом, изменения можно выявить только в случае отсутствия нарушений в большинстве Notl-сайтов. Однако даже если это условие выполнено, то, как мы показали, в окончательный результат вносится поправочный коэффициент, причем каждый раз разный, в зависимости от частоты и степени нарушений. Для повышения чувствительность и специфичности метода гибридизации ДНК на Notl-микрочипах предложено два варианта нормировки относительного сигнала. Оба варианта нормировки реализованы в NIMAN - программном приложении для анализа данных Notl-микрочипов, совместимом с программным обеспечением прибора GenePix 4000А - GenePix Pro 6.0 («Amersham Pharmacia Biotech»). Нормировка также позволяет учесть погрешность в выравнивании концентраций (ввиду человеческого фактора и ограниченной точности спектрофотометрических методов), что значительно повышает точность получаемых данных. После нормировки программа предложит по заданным пользователем границам нарушений вывести на экран статистические данные (процент метилирования/делеций, амплификаций/деметилирования, сохранений, неинформативных образцов) для каждого гена, а затем визуализировать их в двух вариантах - цветном и «оттенках серого». Границы нарушений

задаются пользователем вручную, их можно варьировать в зависимости от условий и задач. Встроенный в ММЛЫ точный критерий Фишера позволяет сравнивать частоты нарушений в интересующих группах образцов.

2.2. Расчет границ относительного сигнала на 1ЧоИ-микрочипе, соответствующих различным вариантам генетических и эпигенетических нарушений генов

МоИ-микрочипы позволяют одновременно выявлять две из основных причин инактивации генов-супрессоров опухолевого роста - метилирование промоторных Срв-островков и делеции ДНК, а также возможные причины активации генов - амплификации и деметилирование промоторных участков.

При вычислении границ относительного сигнала приняли, что: - в опухолевом образце может быть до 30% «условной нормы»,

в образце «условной нормы» может быть до 10% опухоли,

при метилировании Срв-островка, содержащего ЬГоИ-сайт, хотя бы один СрО-

динуклеотид из ЫоИ-сайта затрагивается в 80% случаев.

Первые две поправки получены на основе информации клиницистов, а последняя - на основе данных бисульфитного секвенирования. Для получения третьей поправки статус метилирования СрС-островков, содержащих МоИ-сайт, методом бисульфитного секвенирования определили для 40 опухолей легкого, шейки матки и яичников с различными гистологическими и патологическими характеристиками. Отобрали только те образцы, в которых выявлено плотное метилирование СрС-островка (метилировано более 50% СрС-динуклеотидов Срв-островка) в большинстве клонов. Количество клонов с хотя бы одним метилированным СрБ-динуклеотидом МоИ-сайта разделили на общее количество клонов для каждого образца, а затем усреднили, и так получили оценку, приведенную в третьей поправке. Полностью неметилированные клоны в расчет не брали, так как они, скорее всего, получены из примеси «условной нормы».

Проведен расчет относительного сигнала в случае метилирования МоИ-сайта. В идеальных условиях (образцы опухоли и «условной нормы» без примесей; СрС-динуклеотиды МоИ-сайта всегда метилированы при метилировании СрС-островка, содержащего данный ЫоИ-сайт) сигнал в опухолевом образце будет составлять 0.00 - 0.50 от сигнала в образце «условной нормы», в зависимости от того метилирован МоИ-сайт на двух или одном аллеле. То есть верхняя граница сигнала (МоН-сайт метилирован только на одном аллеле) вычисляется следующим образом /мет = 05°хл' = 0.50. Принимая во внимание наши поправки, формула

будет выглядеть следующим образом:

а х N + (1 - с) х (1 - а) х N + с х (1 - а) х 0.5 х N

1мет -

(1-Ь)хЛГ + (1-с)хЬхЛГ + схЬх0.5хЛГ 1 - 0.5 х с х (1 - а)

а = 0.3 о 72

1 -0.5 хсхй

где а — доля «условной нормы» в образце опухоли, Ь - доля опухоли в образце «условной нормы», с — доля МоИ-сайтов с хотя бы одним метилированным СрС-динуклеотидом при метилировании СрС-островка, содержащего МоИ-сайт, от общего числа КоН-сайтов в метилированных СрС-островках.

Далее рассчитали верхнюю границу относительного сигнала в случае делеции (делеция ЫоИ-саНта на одном из аллелей). В данном случае третья поправка не используется.

_ а х N + (1 - а) х 0.5 х N _ 1 - 0.5 х (1 - а) _ га = 0.3 _ 0-65 _ /дел ~ (1 - Ъ) х N + Ъ х 0.5 х N ~ 1 - 0.5 х Ь ~ U = 0.1 ~ (Г95 ~ °'68

Соответственно, при относительном уровне сигнала в интервале от 0.68 до 0.75 наиболее вероятно метилирование Notl-сайта, а в случае сигнала менее 0.68 может быть как деления Notl-сайта, так и его метилирование. Метилирование промоторных CpG-островков намного более частое событие, чем делеции, особенно на ранних стадиях заболевания (Egger et ai, 2004; Yi et al., 2013). Поэтому, сниженные относительные сигналы на Notl-микрочипе будут соответствовать скорее метилированию, нежели делениям.

Аналогичный расчет провели для нижней границы относительного сигнала при амплификации (амплификация Notl-сайта на одном из аллелей в опухоли) и в случае деметилирования (в «условной норме» Notl-сайт метилирован на одном из аллелей, а в опухоли не метилирован ни на одном). Рассчитанные значения составили: /амп = 1.29, /демет = 1.38.

Соответственно, при относительном уровне сигнала в интервале от 1.29 до 1.38 наиболее вероятна амплификация Notl-сайта, а в случае сигнала более 1.38 может быть как амплификация Notl-сайта, так и его деметилирование. В большинстве случаев CpG-островки промоторных участков генов находятся в неметилированном состоянии, за исключением генов, подверженных геномному импринтингу (менее 1% от общего числа известных генов) и патологических состояний (Jones et al., 2002; Lee et ai, 2013). Поэтому повышенные относительные сигналы в случае их выявления на Notl-микрочипе будут соответствовать скорее амплификации, чем деметилированию.

Таким образом, приняли, что значение относительного сигнала в пределах от 0.75 до 1.29 соответствует отсутствию изменений, значение сигнала < 0.75 — метилированию и/или делеции, а сигнала > 1.29 — амплификации и/или деметилированию.

2.3. Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 при раке легкого

Рак легкого - самый распространенный рак в мире: около 13% от всех выявляемых онкозаболеваний и около 18% от всех смертельных случаев по причине рака (Travis et ai, 2004). Ежегодно по всему миру выявляют более 1 млн. новых случаев рака легкого и более 1 млн. человек умирает по причине этого заболевания (Jemal et ai, 2010). Немелкоклеточный рак -самый распространенный гистологический тип рака легкого, на долю которого приходится более 80% всех случаев. Выявление HMPJI на ранних стадиях значительно повышает выживаемость (до 80%), а определение гистологического типа необходимо для выбора оптимального лечения (Montuenga et ai, 2009).

2.3.1. Анализ метилирования и делеций с помощью Notl-микрочипов и бисульфитного

секвенирования

ДНК из 40 парных («условная норма»/опухоль) образцов HMPJI гибридизовали на Notl-микрочипах, содержащих 180 Notl-клонов, ассоциированных со 188 генами хромосомы 3 (Рисунок 1). Выборка образцов НМРЛ представлена двумя его основными гистологическими типами - плоскоклеточным раком легкого (ПКРЛ, 28 образцов) и аденокарциномой легкого (АК, 12 образцов) Как видно из Рисунка 1 основным вариантом нарушений, как и ожидалось, было метилирование и/или делеции (М/Д). Амплификации и/или деметилирование представляли единичные случаи, поэтому при дальнейшем анализе их не учитывали.

ПКРЛ

Рисунок 1. Паттерн нарушений ДНК при НМРЛ (ПКРЛ и АК). Данные Notl-микрочипов. По вертикали - 180 Notl-сайтов, которые расположены в той же последовательности, что и на хромосоме 3 (от Зр26.2 до Зр11.1 и от 3q 11.2 до 3q29). 3p/3q -короткое/длинное плечо хромосомы 3. По горизонтали - 40 образцов НМРЛ (28 ПКРЛ и 12 АК). Зеленые квадраты обозначают метилирование/делеции, красные — амплификации/деметилирование, желтые - нет изменений, белые - нет информации.

Для 44-х Notl-сайтов показана частота М/Д более 15% (Рисунок 2, Таблица 1). Паттерны нарушений при ПКРЛ и АК значительно отличались. При ПКРЛ частые нарушения наблюдали уже на ранних стадиях заболевания, а при АК высокую частоту М/Д отмечали преимущественно в опухолях с метастазами в регионарных лимфоузлах (Рисунок 2). В среднем частота М/Д при ПКРЛ значительно выше, чем при АК (Таблица 1). Среди 47-ми генов, ассоциированных с 44-мя Notl-сайтами, только некоторые являются известными генами-супрессорами опухолевого роста (например, RBSP3 (CTDSPL), VHL и THRB). Для большинства генов впервые показана вовлеченность в рак легкого (например, MINA, RPL32, WC285205, FGD5, UBE2E2, ROPN1, CGGBP1, NBEAL2 и LOC285375). Для генов VHL (образцы №9 и 30 на Рисунке 2) и ITGA9 (№2, 9, 16 и 17) метилирование CpG-островков подтвердили методом бисульфитного секвенирования.

ПКРЛ АК

ос і метастачов

мет астачы

ос і мстасгачов мстасгачы

- о СО О сч сч п г- ГЧ о o-i сп СП УГ, Г+-) г- ГП > •л IOSЕСЧ

14 ■ и

4í 1 GORASPI ТТС2ІЛ

14 т NKÍRAS1 'RPL15

Р L »Ш 77

V г 1

4"' RBSP3 (С IDSPL)

57 1 L NBEA1.2

LRRNJ

41 ІТСЛ9

QI FOXPI

46 CGGBP1

■И LRRC3B

116 GATA 2

?х L ÜBÍ.2E2

67 . 1 L Ч GNA12 ROPN1/KALRN

104

X 1 HL

16 FBLN2 LOC2X52Ü5

ни

Р6 TRH

р RPL32 IOS ЕС I

WNT7A "

і Р GATA 2

IX LOC2H5373

?\ Л FGD5

00 MITF

131 144 EPI/BI

/.1С 4

LMCD1

Р7 ХЕК 11 VUÜTI6

142 PAOR9

147 от 149

РІС 12

31 THRB BHLHE40

Xі; PR1CKLE2

11 ALDH1L1

ПС КГ

1 р PPP2R3A

1й ANKRD2H

Р5 ROBO1

97 MINA

I6S 11C L6

17 „1 1 FGF12

Рисунок 2. Паттерн нарушений ДНК при НМРЛ (ПКРЛ и АК). Данные N011-микрочипов. По вертикали - 44 МоЦ-сайта с наибольшей частотой М/Д, которые расположены по убыванию частоты М/Д (от 58 до 15%). По горизонтали - 40 образцов НМРЛ (28 ПКРЛ и 12 АК). Зеленые квадраты обозначают метилирование/делеции, красные амплификации/деметилирование, желтые - нет изменений, белые - нет информации.

Таблица 1. Частота метилирования/делеций 20-ти КоИ-сайтов с наибольшей частотой нарушений при НМРЛ (ПКРЛ и АК).

№ Ген* Локус Частота М/Д, %**

НМРЛ ПКРЛ АК

1 /<2ЖС7 Зр25.2 58(23/40) 68 (19/28) 33 (4/12)

2 С/ОЛЛХР1/ТТС21А 3р22-р21.33 58 (23/40) 61 (17/28) 50 (6/12)

3 МК1КА31/ЯРИ5 Зр24.2 50 (20/40) 61 (17/28) 25 (3/12)

4 ТНЯВ Зр24.2 50 (20/40) 61 (17/28) 25 (3/12)

5 АВНВ5/СЗоф7 Зр21 50 (20/40) 57(16/28) 33 (4/12)

6 КВБРЗ (СТйЗРЬ) 3р21.3 48(19/40) 50 (14/28) 42 (5/12)

7 №ЕАЬ2 3р21.31 48(19/40) 57 (16/28) 25 (3/12)

8 и№/1 Зр.26.2 45(18/40) 50 (14/28) 33 (4/12)

9 1ТвА9 3р21.3 45(18/40) 50(14/28) 33 (4/12)

10 РОХР1 Зр14.1 45(18/40) 46(13/28) 42 (5/12)

11 ССвВР] Зр12-р11.1 43 (17/40) 57(16/28) 8(1/12)

12 ишсзв Зр.24 40(16/40) 43(12/28) 33 (4/12)

13 САТА2 3я21.3 40(16/40) 46(13/28) 25 (3/12)

14 иВЕ2Е2 Зр24.2 38(15/40) 43(12/28) 25 (3/12)

15 вЫА12 3р21.31 38 (15/40) 43 (12/28) 25 (3/12)

16 яорт/КАьт 3я13.3 38(15/40) 39(11/28) 33 (4/12)

17 УНЬ 3р25.3 33(13/40) 39(11/28) 17(2/12)

18 рвьт Зр25.1 33 (13/40) 39(11/28) 17(2/12)

19 ЮС285205 3ql3.12 33 (13/40) 32 (9/28) 33 (4/12)

20 гая 3Ч13.3-Ч21 33 (13/40) 43(12/28) 8(1/12)

Примечание: Данные ЫоИ-микрочипов. * - «/» между названиями генов означает, что ЫоИ-сайт расположен между ними в общей промоторной области. ** - в скобках указано число образцов с М/Д ЫоИ-сайтом к общему числу образцов.

2.3.2. Оценка изменений уровня мРНК 10-ти генов Для выявления последствий частого метилирования и/или делеций ЫоИ-сайтов оценили относительный уровень мРНК (Я) генов /дЖС/, ЯВЗРЗ (СТРЭРЦ, 1ТСА9, РОХР1, Ы№1, вЫА12, ГНЬ, Рв05, ЛЮН1Ы и ВСЬб (частота М/Д ¡8-68% при ПКРЛ и 8-42% при АК) в 22-х образцах НМРЛ (12 ПКРЛ и 10 АК). Показали снижение уровня мРНК в 38-100% образцов ПКРЛ и 30-90% образцов АК (Рисунок 3, Таблица 2).

Как видно из Рисунка 3 и Таблицы 2 для профилей относительного уровня мРНК характерны те же тенденции, что и для паттернов метилирования/делеций. Для большинства генов при ПКРЛ уровень мРНК снижался чаще и значительнее, чем при АК (для генов 1ТСА9 и РОХР1 это различие статистически значимо, р = 0.02 и 0.05 соответственно). Для 7-ми генов (кроме ¿ЯШ], РСИ5 и АЬОН1Ь1) выявлена более высокая частота и/или степень снижения экспрессии при АК с метастазами в регионарных лимфоузлах по сравнению с АК без метастазов. Та же тенденция отмечена для 5-ти генов при ПКРЛ: 1()ЗЕС1, РОХР1 (р < 0.05), ЬЯЯЫ!, РСИ5 и ВСЬб.

Аденокарцинома легкого

Рисунок 3. Относительный уровень мРНК 10-ти генов при НМРЛ (ПКРЛ и АК).

Данные количественной ПЦР. Светло-серым выделены опухоли без метастазов, темно-серым -опухоли с метастазами в регионарных лимфоузлах.

Таблица 2. Частота снижений и относительный уровень мРНК 10-ти генов при НМРЛ (ПРКЛ и АК). _

Ген Частота снижений уровня мРНК, %* Медиана К, разы**

ПКРЛ АК ПКРЛ АК

/ОЖСУ 92(11/12) 90 (9/10) 81(1-1141) 51(1-121)

ИВЗРЗ (СТйЗРЬ) 91 (10/11) 78 (7/9) 4І (1-131) 31(1-261)

ІТСА9 100(11/11) 67 (6/9) 1Ц(3|-36|) 31(21-361)

ІЮХР1 82 (9/11) 78 (7/9) 61(1-151) ЗИ4Т-151)

ьяті 70 (7/10) 30(3/10) 21(1-321) К8Т-131)

ОЫАП 83 (10/12) 70 (7/10) 31(1-111) ЗИЗТ-131)

УНЬ 67 (3/9) 50 (2/4) 31(1-91) 21(1-81)

гот 86 (6/7) 67 (6/9) 8И5Т-441) 51(1-291)

АЮНШ 38 (3/8) 50 (3/6) 21 (2Т-91) 31 (ЗТ -101)

ВС16 67 (8/12) 70 (7/10) 41(1-161) 41 (1 -3561)

Примечание: Данные количественной ПЦР. * - в скобках указано число образцов со сниженным уровнем мРНК (Л < 0.5) к общему числу образцов. ** - в скобках указан диапазон изменений относительного уровня мРНК. 1, Т - снижение, повышение уровня мРНК. р < 0.05 для всех генов.

Для гена Рй05, уровень мРНК которого снижался намного значительнее при ПКРЛ с метастазами в регионарных лимфоузлах, чем при ПКРЛ без метастазов, оценили нарушения экспрессии на расширенной выборке образцов НМРЛ -11 АК и 22 ПКРЛ (Рисунок 4).

При ПКРЛ уровень мРНК гена снижался чаще, чем при АК (90-100% против 60-

67%). Кроме того, различие в степени снижений экспрессии при ПКРЛ с метастазами и без метастазов стало статистически значимым (р < 0.01): медиана относительного уровня мРНК при ПКРЛ без метастазов составила 5.2 раза (диапазон изменений: 1.8 - 12), а при ПКРЛ с метастазами в регионарные лимфоузлы - 21 раз (диапазон изменений: 3.9 - 204). Коэффициент ранговой корреляции Спирмена между снижением экспрессии и стадией заболевания составил 0.56 (р< 0.01).

0.01 -------—------------------------------------.....................................................—_........................................_..............

123456789 10 11 12 131415161718 1920 212223 24252627282930313233

образцы кДНК

Рисунок 4. Относительный уровень мРНК гена FGDS при НМРЛ (АК и ПКРЛ).

2.3.3. Статистический анализ паттернов метилирования/делеций в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками

Выполнен комплексный статистический анализ для выявления статистически значимых закономерностей в группах опухолей с различными гистологическими (гистологический тип, степень анаплазии) и патологическими (TNM-классификация, стадия заболевания) характеристиками.

Для многих генов отмечена большая частота М/Д при ПКРЛ, чем при АК (Таблица 1). Для 3-х из них (CGGBP1, IQSEC1 и TRH) это различие статистически значимо (р = 0.02, 0.04 и 0.05 соответственно).

При ПКРЛ выявлен ряд генов со значительным изменением частоты М/Д при прогрессии опухоли. Так Для генов VHL, GORASP1, ТТС21А, FOXP1 и LRRN1 показана повышенная частота нарушений в опухолях с метастазами в регионарных лимфоузлах по сравнению с опухолями без метастазов, а для генов ROBOl, M1TF и MINA, наоборот, - пониженная. Однако ни для одного из этих генов различие не было статистически значимым (0.09 <р< 0.23).

При АК получен более очевидный результат - для 21 гена показана повышенная частота М/Д в опухолях с метастазами в регионарные лимфоузлы по сравнению с опухолями без

метастазов. Наиболее значительные различия показаны для генов WNT7A, UBE2E2, FGDS, LRRC3B, FGF12, RPL32, THRB, ABHD5, C3orf77, LRRNI, IQSEC1 и RBSP3 {CTDSPL). Для двух из них (WNT7A и UBE2E2) это различие статистически значимо (р - 0.05 в обоих случаях).

Выявленные нарушения, а также различия между группами опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками позволили построить предсказательные модели и предложить наборы генов для определения НМРЛ, его гистологического типа (ПКРЛ или АК), а также присутствия метастазов в регионарных лимфоузлах.

Для определения НМРЛ предложена модель, основанная на значениях М/Д 8-ми маркеров: IQSEC1, GORASP1/TTC21A, NKIRAS1/RPL15, RBSP3 (CTDSPL), LRRNI, ITGA9, FOXP1 и TRH. Точность определения с использованием данного набора при пороговом значении 0.25, то есть при выявлении М/Д в двух и более маркерах образец будет отнесен к НМРЛ, составила 90%. Коэффициент Джини равнялся 0.70-0.98. Коэффициент Джини равный 1.00 соответствует идеальной предсказательной модели, а равный 0.00 - случайному угадыванию.

Для определения гистологического типа НМРЛ (ПКРЛ или АК) предложен набор из 7-ми маркеров: NKIRAS1/RPL15, CGGBP1, VHL, LOC285375, ЕРНВ1, BHLHE40 и ANKRD28, Точность определения с использованием данного набора при пороговом значении 0.29 составила 80% (при выявлении М/Д в двух и более маркерах образец будет отнесен к ПКРЛ). Коэффициент Джини равнялся 0.60-0.83.

Для определения метастазов при ПКРЛ предложен набор из 4-х маркеров - 3-х с повышенной частотой М/Д при ПКРЛ с метастазами по сравнению с ПКРЛ без метастазов (GORASPI/TTC21A, LRRNI и VHL) и одного с пониженной частотой (MITF). Точность определения с использованием данного набора при пороговом значении 0.50 составила 86% (при выявлении М/Д в двух и более маркерах с повышенной частотой или М/Д в одном и более маркерах с повышенной частотой и отсутствии изменений в маркере MITF образец будет отнесен к ПКРЛ с метастазами). Коэффициент Джини равнялся 0.55-0.83.

Для определения метастазов при АК может бьпъ предложен набор также из 4-х маркеров: LRRC3B, UBE2E2, WNT7A и FGD5. Точность определения с использованием данного набора при пороговом значении 0.50 составила 92% (при выявлении М/Д в двух и более маркерах образец будет отнесен к АК с метастазами). Коэффициент Джини равнялся 0.60-0.94.

Таким образом, получили набор из 19-ти маркеров (ANKRD28, BHLHE40, CGGBP1, RBSP3 (CTDSPL), ЕРНВ1, FGDS, FOXP1, GORASP1/TTC21A, 1QSEC1, ITGA9, LOC285375, LRRC3B, LRRNI, MITF, NKIRAS1/RPLI5, TRH, UBE2E2, VHL и WNT7A) для определения НМРЛ, его гистологического типа (ПКРЛ или АК) и присутствия метастазов в регионарных лимфоузлах.

В ряде работ показано, что изменения метилирования могут быть использованы для диагностики, прогностики и даже лечения рака легкого (Palmisano et al, 2000; Montuenga et al., 2009; Juergens et al, 2011). На основе данных о метилировании ДНК предложено множество панелей для диагностики рака легкого (Belinsky, 2004; Belinsky, 2005; Tessema et al, 2009; Hawes et al, 2010; Suzuki et al, 2010; Zhang et al, 2011). Однако, набор для выявления заболевания, определения его гистологического типа и присутствия метастазов в регионарных лимфоузлах представлен впервые.

2.4. Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 при раке шейки

матки

Рак шейки матки - третий по частоте встречаемости рак у женщин (около 10% от всех случаев заболевания раком). Ежегодная смертность в мире составляет более 400 тысяч человек (Tavassoli et al, 2003). При РЩМ различают два основных гистологических типа -плоскоклеточный рак (ПКР, 80-90% всех случаев РШМ) и аденокарциному (АК, 10-20% всех случаев). Несмотря на значительные успехи в предотвращении и диагностике РШМ (zur Hausen, 2008), изучение молекулярных механизмов и выявление перспективных маркеров для диагностики заболевания, особенно АК, остается актуальной задачей.

2.4.1. Анализ метилирования и делеций с помощью Notl-микрочипов ДНК из 48-ми парных («условная норма»/опухоль) образцов РШМ гибридизовали на Notl-микрочипах, содержащих 180 Notl-сайтов, ассоциированных со 188 генами хромосомы 3 (Рисунок 5, Таблица 3). Выборка образцов РШМ представлена двумя его основными гистологическими типами - АК (9 образцов) и ПКР (39 образцов). Для 41 Notl-сайта показана частота метилирования и/или делеций более 15%. Как видно из Рисунка 5 и Таблицы 3 паттерны М/Д при ПКР и АК значительно отличаются - в среднем частота М/Д при ПКР значительно выше, чем при АК. Среди 48-ми генов, ассоциированных с 41 Notl-сайтом, только некоторые являются известными генами-супрессорами опухолевого роста (например, RBSP3 (CTDSPL), ITGA9 и VHL). Для большинства генов впервые показана вовлеченность в рак шейки матки (например, ЮС285205, FGD5, RPL32, ROPN1, CGGBP1, NBEAL2 и LOC285375).

Таблица 3. Частота М/Д 18-ти Notl-сайтов с наибольшей частотой нарушений при

РШМ.

№ Ген* Локуе Частота М/Д, %**

РШМ AK ПКР

1 LRRN1 Зр26.2 44(21/48) 11(1/9) 51 (20/39)

2 PRICKLE2 3pl4.1 44 (21/48) 22 (2/9) 49 (19/39)

3 1TGA9 3p21.3 42 (20/48) 33 (3/9) 44(17/39)

4 LRRC3B 3p24 40 (19/48) 44 (4/9) 39 (15/39)

5 NKIRAS1/RPL1S 3p24.2 38 (18/48) 22 (2/9) 41 (16/39)

6 VHL 3p25.3 35(17/48) 11 (1/9) 41 (16/39)

7 PDZRN3 3pl3 33 (16/48) 33 (3/9) 33 (13/39)

8 IQSEC1 3p25.2 31 (15/48) 33 (3/9) 31 (12/39)

9 RBSP3 (CTDSPL) 3p21.3 31 (15/48) 11 (1/9) 36 (14/39)

10 GORASP 1/ТТС21А 3p22-p21.33 29 (14/48) 44 (4/9) 26 (10/39)

И FOXPI 3pl4.1 29 (14/48) 22 (2/9) 31 (12/39)

12 BHLHE40 3p26.1 27 (13/48) 11 (1/9) 31 (12/39)

13 CGGBP1 3pl2-pll.l 27 (13/48) И (1/9) 31 (12/39)

14 ЕРНВ1 3q21-q23 27 (13/48) 11 (1/9) 31 (12/39)

15 FGF12 3q28 27 (13/48) 22 (2/9) 28(11/39)

16 PLCL2 3p24.3 25 (12/48) 0 (0/9) 31 (12/39)

17 ABHD5/C3orJ77 3p21 25 (12/48) 33 (3/9) 23 (9/39)

18 71C4 3q24 25 (12/48) 22 (2/9) 26(10/39)

Примечание: Данные Ыо11-микрочипов. * - «/» между названиями генов означает, что ЫоИ-сайт расположен между ними, в общей промоторной области. ** - в скобках указано число образцов с М/Д ЫоН-сайтом к общему числу образцов.

АК ПКР

]] 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 ЗУ 41 43 45 47

LRRN1 ГЮСШС2

/тем

I.RRC3B KK1RASI.RPU5 VH1.

жv

misi'.i к Т/ХЧР1а

CORASI'I TTC2ÍA FOXPI В1/ШЕ40 СССВР/ ИРИВ1 FGF12 Р/С L2

ABIID5 СЗш-/?7 //(V II7V77.-I

ив/;:/-:: тнкв

ШЩш;

LOC2K5375 FGD5 pp/':r3a SOS 14 ШС285205 КОРМ KA/.RX СЗчгШ С//С! ЮЛ TR/Г

FAMI9A4 CHST13 NEKIl NL-DT/6 RA/': В

fb/.N:

PRSS4: i D I. 3

\nb/;al: cna/: mina

li( 7/1

Рисунок 5. Паттерн нарушений ДНК при РШМ (АК и ПКР). Данные Notl-микрочипов. По вертикали - 41 Notl-сайт с наибольшей частотой М/Д, которые расположены по убыванию частоты М/Д (от 44 до 15%). По горизонтали - 48 образцов РШМ (9 АК и 39 ПКР). Зеленые квадраты обозначают метилирование/делеции, красные

амплификации/деметилирование, желтые - нет изменений, белые - нет информации.

2.4.2. Подтверждение данных NoiI-микрочипов методом бисулъфитного секвенирования Для подтверждения результатов, полученных с помощью Notl-микрочипов, с помощью метода бисульфитного секвенирования установили статус метилирования CpG-островков 7-ми генов (LRRNL ITGA9, LRRC3B, NKIRAS1, VHL, RBSP3 и FGF12) с частотой М/Д 27-44% (по данным Notl-микрочипов) в 11-ти образцах ПКР шейки матки. Рассматриваемые гены в исследуемых образцах по данным Notl-микрочипов были метилированы и/или делегированы. Результаты бисульфитного секвенирования представлены в Таблице 4. Метилирование CpG-островка подтверждено в большинстве случаев (83%, 19/23). В 4-х случаях (ген LRRN1 образец №42, NKIRAS1 №17, VHL №15 и RBSP3 (CTDSPL) №17) метилирование Notl-сайта не являлось причиной снижения относительного сигнала на Notl-микрочипе.

Ген Метилированные образцы, №* Неметилированные образцы, №*

LRRN1 17,22,37 42

1TGA9 13, 17,20, 26,27, 37 X

LRRC3B 17 X

NKIRAS1 X 17

VHL 17,42 15

RBSP3 13,20, 22, 36,47 17

FGF12 17,42 X

Примечание: Данные бисульфитного секвенирования. * - номера образцов соответствуют номерам на Рисунке 5.

Согласно данным количественной ПЦР, основным механизмом инактивации гена ЛЖЖЛ£У являются делеции (СегазксИепко ег а!., 2010). Возможно, именно гемизиготные делеции послужили причиной снижения сигнала в 4-х рассматриваемых случаях с неметилированным Срв-островком. Также нельзя исключить и точечные мутации. Таким образом, данные бисульфитного секвенирования хорошо согласуются с данными ЫоИ-микрочипов и показывают, что метилирование промоторных Срв-островков - частое событие при ПКР шейки матки.

2.4.3. Оценка изменений уровня мРНКгенов ИВ8РЗ (СТЪЗРЦ и 1ТСА9 Для выявления последствий частого метилирования или делений ИоИ-сайтов оценили относительный уровень мРНК двух генов-супрессоров опухолевого роста - ЯЙ5РЗ (СТОвРЦ (КазИиЬа ег а1„ 2004) и 1ТвА9 {Отйпе\ ег ей., 2012) (частота М/Д при ПКР 36% и 44% соответственно) в 19-ти образцах ПКР шейки матки (Рисунок 6, Таблица 5).

£ з:

о о.

3 2

5 о.1

о н О

0.01

Рисунок 6. Относительный уровень мРНК генов ЯВЗРЗ (СТОЯР) и 1ТвЛ9 при ПКР шейки матки. Данные количественной ПЦР.

Щ /тс. IV

RBSP3 (CTDSPL)

___ _ _ ____ ___ _ ____1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

--]

без метастазов образцы кДНК с метастазами

Таблица 5. Частота снижений и относительный уровень мРНК генов ЙВЗРЗ (СТОЯРЬ) и 1ТСА9 при ПКР шейки матки.

Ген Частота снижений уровня мРНК, %* Медиана снижений уровня мРНК, разы**

без метастазов метастазы всего без метастазов метастазы всего

RBSP3 44 (4/9) 90 (9/10) 68(13/19) 3(2-4) 3 (2-11) 3(2-11)

ITGA9 78 (7/9) 100(10/10) 89(17/19) 6(2-9) 5(3 - 78) 6(2-78)

Примечание: * - в скобках указано число образцов со сниженным уровнем мРНК к общему числу образцов; ** - в скобках указан диапазон снижений уровня мРНК. р < 0.01 для обоих генов.

Для гена RBSP3 (CTDSPL) показано значительное (до 11 раз) снижение уровня мРНК в большинстве случаев (68%, 13/19). Кроме того, отмечена статистически значимая более высокая частота снижений уровня экспрессии при ПКР с метастазами в регионарных лимфоузлах по сравнению с ПКР без метастазов (90% против 44%. р < 0.05).

Для гена ITGA9 показано более значительное (до 78 раз) и частое (89%, 17/19) снижение уровня мРНК, чем для гена RBSP3 (CTDSPL). Также отмечена тенденция к увеличению частоты снижений экспрессии с развитием метастазов в регионарных лимфоузлах (100% снижений при ПКР с метастазами против 78% при ПКР без метастазов).

Кроме того, показана положительная корреляция между относительными уровнями мРНК генов RBSP3 (CTDSPL) и ITGA9. Коэффициент ранговой корреляции Спирмена составил 0.43 (р = 0.07), что говорит о возможной корегуляции генов RBSP3 (CTDSPL) и ITGA9.

Данные количественной ПЦР хорошо согласуются с данными Notl-микрочипов - при выявлении на микрочипах М/Д уровень мРНК оказывается значительно сниженным в большинстве случаев. Кроме того, более высокой частоте М/Д соответствует более частое и значительное снижение экспрессии: уровень мРНК гена RBSP3 (CTDSPL) снижался в 68% случаев в среднем в 3 раза при частоте М/Д 36%, а уровень мРНК гена ITGA9- в 89% случаев в среднем в 6 раз при частоте М/Д 44%. Полученный результат также указывает на наличие других механизмов инактивации генов, так как частота снижений уровня мРНК существенно выше частоты М/Д.

2.4.4. Статистический анализ паттернов метилирования/делеций в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками

Для большинства из 41 Notl-сайтов, ассоциированных с 48 генами, при ПКР показана более высокая частота М/Д, чем при АК (Рисунок 5, Таблица 4). Для генов PPP2R3A и LRRN1 это различие статистически значимо (р = 0.03 в обоих случаях). Медиана частоты М/Д для 41 Notl-сайтов составила 26% при ПКР и только 11% при АК.

Генов, вовлеченных в прогрессию ПКР или АК, обнаружить не удалось.

Для определения РШМ предложена предсказательная модель, основанная на значениях М/Д 9-ти маркеров: LRRN1, PRICKLE2, ITGA9, NKIRAS1/RPL15. LRRC3B, VHL, PDZRN3, FOXP1 и ALDH1L1. Точность определения с использованием данного набора при пороговом значении 0.22 составила 83% (при выявлении М/Д в двух и более маркерах образец будет отнесен к РШМ). Коэффициент Джини равнялся 0.77-0.99.

Для определения гистологического типа РШМ (АК или ПКР) может быть предложен набор из 7-ми маркеров: LRRN1, PRICKLE2, VHL, BHLHE40, RBSP3 (CTDSPL), CGGBP1 и

SOX14. Точность определения с использованием данного набора при пороговом значении 0.29 составила 73% (при выявлении М/Д в двух и более маркерах образец будет отнесен к ПКР). Коэффициент Джини равнялся 0.37-0.60.

Таким образом, получили набор из 13-ти маркеров (LRRN1, PRICKLE2, ITGA9, NKIRAS1/RPL15, LRRC3B, VHL, PDZRN3, FOXP1, ALDH1L1, BHLHE40, RBSP3 (CTDSPL), CGGBP1 и SOX14) для определения РШМ и его гистологического типа (АК или ПКР).

На данный момент в клинической практике активно используется молекулярная диагностика, основанная на выявлении вирусов папилломы человека и их типировании (Lui, 2013). Однако, этот метод при высокой чувствительности (> 95%), обладает довольно низкой специфичностью (Lui, 2013).

На основе метилирования ДНК активно разрабатываются маркеры не только для диагностики рака шейки матки (Wentzensen et al., 2009), но и для предсказания устойчивости к препаратам химиотерапии, а также радиотерапии (Roossink et al., 2012).

Тем не менее, для РШМ на данный момент нет ни одного маркера метилирования, который мог бы быть использован в клинической практике. Создание универсального, специфичного к данному виду рака набора с высокой чувствительностью и специфичностью остаётся актуальной задачей. Также необходима стандартизация методов анализа и проверка полученных результатов на независимых выборках (Wentzensen et al., 2009; Roossink et al., 2012).

2.5. Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 при раке яичников

Около 30% от всех видов рака женской половой системы приходится на рак яичников (Tavassoli et al., 2003). Ежегодно по причине этого заболевания умирает более 140 тысяч женщин по всему миру (Нипп et al., 2012). Высокодифференцированный серозный рак - самый распространенный гистологический тип рака яичников (около 70% от всех случаев), который типично диагностируется на поздних стадиях и, тем самым, ответственен за высокую смертность по причине этого заболевания (Landen et al., 2008; Montavon et al., 2012).

2.5.1. Аначиз метилирования и делеций с помощью Notl-микрочипов

ДНК из 18-ти парных («условная норма»/опухоль) образцов ВДСРЯ и семи парных («условная норма»/аденома) ДОЯ гибридизовали на Notl-микрочипах, содержащих 180 Notl-сайтов, ассоциированных со 188 генами хромосомы 3 (Рисунок 7, Таблица 6).

Для 35-ти Notl-сайтов показана частота метилирования/делеций более 17%. Среди 39-ти генов, ассоциированных с 35 Notl-сайтами, только некоторые являются известными генами-супрессорами опухолевого роста (например, RBSP3 (CTDSPL), VHL и THRB). Для большинства генов впервые показана вовлеченность в рак яичников (например, LOC285205, ROPN1, CGGBP1, NBEAL2 и LOC285375). Для генов LRRC3B (образцы №12-13 на Рисунке 7), T1IRB (№9-10), ITGA9 (№1-3) и RBSP3 (№14-16) статус метилирования CpG-островков подтвердили методом бисульфитного секвенирования.

В 5-ти из 7-ми образцов ДОЯ нарушений Notl-сайтов не выявлено. Однако в 2-х образцах показано М/Д более 10-ти Notl-сайтов одновременно. Как известно, при раке яичников нередко происходит трансформация из доброкачественной аденомы в злокачественную опухоль (Landen et al., 2008). Возможно, данные 2 образца как раз представляют такой переходный этап.

ВДСРЯ

доя

L'lLUlflt I и I! - ГI г*. Т — г

i-Ki urn 111 it IV

i • • "--I • АН11ШС!.;

upx^raxrniiJ1.

ГГТГ1 i I i ( ■ • i |/«*-W>

10Ш ~l

\kltf ISI НГ1.1?

THRU

IK HI ¡11

RUSr.) iCinsl'l.i

IIIRH ira i«' \!,i 11: r, v 11: i,ui: <, иi: /кч

(,<« is/'? rii :i i"

\t.KII 14111 ¡поет nib■

IRK\I

mi \: пи :\ff.<

¡1 V7 -1

voiir i'/'WMf гас и r: ro.wi

/ивш: Rl>l'\l К l!R\

aisns

1ПТИ1 ГОП vi.: Hill НП1Н1 I'1'I':RI i ran:

Рисунок 7. Паттерн нарушений ДНК при ВДСРЯ и доброкачественной аденоме яичников. Данные Notl-микрочипов. По вертикали - 35 Notl-сайтов с наибольшей частотой М/Д, которые расположены по убыванию частоты М/Д (от 33 до 17%). По горизонтали - 18 образцов ВДСРЯ и 7 ДОЯ. Зеленые квадраты обозначают метилирование/делеции, красные -амплификации/деметилирование, желтые - нет изменений, белые - нет информации.

Таблица 6. Частота М/Д 12-ти Notl-сайтов с наибольшей частотой нарушений при

№ Notl-сайт Ген* Локус Частота М/Д, %**

1 NR1-XM13C IOSEC1 Зр25.2 33(6/18)

2 NL1-CJ4R(C) NKIRAS1/RPL15 Зр24.2 33(6/18)

3 NL4-BB6R (С) THRB Зр24.2 33(6/18)

4 NL3-CA11RS LRRC3B Зр24 33(6/18)

5 NU-003RD RBSP3 <CTDSPL) 3р21.3 33(6/18)

6 NR1-KA8R (С) THRB Зр24.2 28(5/18)

7 NL1A401R (D) ITGA9 3р21.3 28(5/18)

8 NL3A006R (D) NBEAL2 3 р21.31 28(5/18)

9 NL3A001R (D) GNA12 Зр21.31 28(5/18)

10 NL1-DE18R GATA2 3q21.3 28(5/18)

11 NL4-BH3R(C) GATA2 3q21.3 28(5/18)

12 NR1-PD1R ZIC4 3q24 28(5/18)

иримечиние. пии-тпл^иппиир. ............ .....

МоИ-сайт расположен между ними, в общей промоторной области. ** - в скобках указано число образцов с М/Д МоИ-сайтом к общему числу образцов.

2.5.2. Статистический анализ паттернов метилирования/депеций в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками

Для 8-ми генов (WC285205, CGGBP1, ЕРНВ1, FOXP1, WNT7A, NKIRAS1, RPL15 и GATA2) показана повышенная частота М/Д в опухолях стадий III и IV по сравнению с опухолями стадий I и II (0.08 <р < 0.31).

Для определения ВДСРЯ предложена предсказательная модель, основанная на значениях М/Д 8-ми маркеров: NKIRAS1/RPL15, THRB, RBPS3 (CTDSPL), IQSEC1, NBEAL2, ZIC4, WC285205 и FOXP1. Точность определения с использованием данного набора при пороговом значении 0.25 составила 83% (при выявлении М/Д в двух и более маркерах образец будет отнесен к ВДСРЯ). Коэффициент Джини равнялся 0.55-0.98.

Для определения стадии ВДСРЯ (I+II или III+IV) может быть предложен набор из 4-х маркеров: LOC285205, CGGBP1, ЕРНВ1 и NKIRAS1/RPL15. Точность определения с использованием данного набора при пороговом значении 0.25 составила 83% (при выявлении М/Д в одном и более маркерах образец будет отнесен к ВДСРЯ стадии III и IV). Коэффициент Джини равнялся 0.53-0.95.

Таким образом, получили набор из 10-ти маркеров (NKIRAS1/RPL15, THRB, RBPS3 (CTDSPL), IQSECI, NBEAL2, ZIC4, LOC285205, FOXPI, CGGBP1 и ЕРНВ1) для определения ВДСРЯ и его стадии (I+II или III+IV).

Потенциальная возможность неинвазивной диагностики рака яичников с использованием биомаркеров, основанных на опухолеспецифичном метилировании генов, показана в целом ряде работ (Gifford et al., 2004; Ibanez de Caceres et al., 2004; Collins et al., 2006; Liggett et al, 2011). Однако, пока ни один из таких маркеров не может быть использован в клинической практике (Gloss et al., 2012).

Данные предсказательные модели и предложенные наборы маркеров, а также все предыдущие (для НМРЛ и РШМ, смотреть разделы 2.3.3. и 2.4.4.), являются не единственными, которые можно создать на основе полученных данных, однако, одними из наиболее удачных (основываясь на расположении Notl-сайтов и статистической значимости полученных результатов). Предложенные модели должны быть проверены на независимых выборках образцов, а наборы расширены маркерами с других хромосом для повышения точности определения заболевания, а также гистологических и патологических характеристик опухоли. Кроме того, необходимо тестирование на образцах биологических жидкостей с целью оценки их применимости для неинвазивной диагностики.

2.6. Сравнительный анализ нарушений при раке легкого, шейки матки и яичников

В каждом из рассмотренных видов рака выявлены общие и специфичные нарушения в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками.

Сравнение паттернов М/Д при НМРЛ, РШМ и ВДСРЯ между собой необходимо как для понимания механизмов развития и прогрессии рака в зависимости от поражаемого органа, так и для выявления общих и специфичных кандидатов в маркеры для неинвазивной диагностики. Как видно из Рисунков 2, 5 и 7, для каждого из видов рака характерен свой паттерн нарушений, тем не менее затрагиваемые Notl-сайты часто одни и те же. Нами обнаружено 37 Notl-сайтов, ассоциированных с 40 генами, с высокой частотой М/Д в каждом из 3-х видов рака. Среди них есть как известные гены-супрессоры опухолевого роста и гены-кандидаты, так и гены, для которых вовлеченность в онкогенез показана ранее в работах российских и зарубежных авторов.

Однако для большинства из этих 40 генов вовлеченность в онкогенез показана нами впервые (Таблица 7).

Таблица 7. Сорок генов с высокой частотой нарушений при раке легкого, шейки матки и яичников.

Известные гены-супрессоры опухолевого роста и гены-кандидаты (9 генов) VHL, THRB, ITGA9, RBSP3 (CTDSPL), ЕРНВ1, ALDH1L1, LRRC3B, FBLN2, BCL6

Гены, для которых вовлеченность в онкогенез показана ранее (14 генов) IQSEC1, NKIRAS1, RPL15, CGGBPl, FOXP1, Z1C4, GATA2, GNAI2, WNT7A, TRH, NEK11, FGF12, BHLHE40, PPP2R3A

Гены, для которых вовлеченность в онкогенез показана впервые (17 генов) LRRN1, PRICKLE2, GORASP1, TTC21A, PLCL2, ABHD5, C3orp7 (TOPAZ1), UBE2E2, RPL32, LOC285375, FGD5, LOC285205, NBEAL2, ROPN1, KALRN, NUDT16, PAQR9

Белковые продукты большинства генов, представленных в Таблице 7, участвуют в сигнальных путях и выполняют функции, которые часто задействованы при развитии и прогрессии различных видов рака. Например, WNT7A и PRICKLE2 вовлечены в сигнальный путь WNT; FGD5 и FGF12 - в регуляцию актинового цитоскелета; VHL, UBE2E2 и GORASP1 -в апоптоз; ITGA9 - во взаимодействия между клетками и клеток с внеклеточным матриксом; RBSP3 (CTDSPL) - в регуляцию клеточного цикла; GNAI2 - в трансмембранные сигнальные системы; BHLHE40, CGGBPl, FOXP1, GATA2 и MITF - Транскрипционные факторы, NKIRAS1 - регулятор NF-kappa-B активности, (Huang da et al, 2009; DAVID, 2013). Однако для целого ряда генов (например, LRRN1, LRRC3B, C3orf77 (TOPAZ1), LOC285375 и LOC285205) функции их белковых продуктов до сих пор неизвестны. Все перечисленные гены являются потенциальными генами-супрессорами опухолевого роста. Для одного из них, LRRC3B, в группе Е.Р. Забаровского в Каролинском Институте (Швеция) показана опухолеподавляющая активность на клеточных линиях рака почки KRC/Y (Haraldson et al, 2012).

Из 37-ми Notl-сайтов с высокой частотой М/Д во всех 3-х видах рака 23 Notl-сайта находятся на коротком плече хромосомы 3 (Зр). При этом на Notl-микрочипе представлено 96 Notl-клонов с Зр и 84 С 3q (длинного плеча хромосомы 3). Таким образом, можно говорить о более высокой частоте нарушений на коротком плече хромосомы 3, чем на длинном (р = 0.27).

В 28% образцов (30/106) М/Д выявлены в 16-ти и более Notl-сайтах. Такие образцы, скорее всего, представляют С1МР+ фенотип (CpG-island methylator phenotype), характеризующийся метилированием промоторных CpG-островков сразу значительного числа генов. CIMP+ опухоли представляют собой отдельную группу злокачественных новообразований, для которых свойственна эпигенетическая нестабильность. Данный фенотип выявляется во многих видах рака, включая рак легкого, шейки матки и яичников (Hughes et al, 2013). Для лечения пациентов с CIMP+ фенотипом опухоли разрабатывается специальная схема с применением деметилирующих агентов (Hughes et al, 2013).

Кроме этого, обнаружены гены с высокой частотой нарушений только при одном из видов рака: ANKRD28 (3q22) и KY (3q22.1) при НМРЛ, PDZRN3 (ЗрІЗ) и SOX14 (3q22-q23) при РШМ, АВТВ1 (3q21) и PODXL2 (3q21) при ВДСРЯ. Перечисленные гены могут быть использованы для создания специфичных к виду рака наборов маркеров для неинвазивной диагностики.

Белки, кодируемые этими генами, выполняют в клетки важные функции, многие из которых часто нарушаются при раке. Однако данные об их вовлеченности в онкогенез в литературе практически отсутствуют.

ANKRD28 является регуляторной субъединицей белка фосфатазы 6 (РР6) (GeneCards, 2013), участвует в клеточной адгезии и миграции (Ridley et al, 2003; Tachibana et al, 2009). Известно о его вовлеченности в лейкоз (Ishikawa et al, 200Т, de Jonge et al., 2011).

KY, вероятно, является протеазой, необходимой для нормального роста мышц, участвует в функционировании, созревании и стабилизации нейромышечных соединений (GeneCards, 2013).

PDZRN3, ЕЗ убиквитин-протеин лигаза, играет важную роль в регуляции поверхностного уровня MUSK (мышечно-специфического рецептора тирозинкиназы) на мышечных трубочках, может участвовать в терминальной миогенной дифференцировке (GeneCards, 2013). Кроме того, PDZRN3 негативно регулирует ВМР2-индуцированную дифференцировку остеобластов путем ингибирования сигнального пути WNT (Honda et al, 2010). Известно о его вовлеченности в рак почки и поджелудочной железы (Ко et al., 2006\ Lucito et al, 2007).

SOX14 является членом SOX семейства транскрипционных факторов, участвующих в регуляции эмбрионального развития и в определении судьбы клетки (GeneCards, 2013). Показано метилирование гена SOX14 при лимфоцитарной лейкемии (Tong et al, 2010).

АВТВ1 представляет собой белок с участком анкириновых повторов и двумя BTB/POZ доменами, которые, как предполагают, вовлечены в белок-белковые взаимодействия. Экспрессия этого гена активируется фосфатазой PTEN (phosphatase and tensin homolog), супрессором опухолевого роста (GeneCards, 2013).

PODXL2, член семейства CD34 поверхностных трансмембранных белков, представляет собой лиганд васкулярного селектина, обеспечивает быстрое прохождение лейкоцитов через стенки сосудов (GeneCards, 2013).

Таким образом, нами показано, что паттерны нарушений различны как для опухолей различных локализаций, так и для их гистологических типов. Несмотря на это, во многих случаях затронуты одни и те же гены, в первую очередь короткого плеча хромосомы 3. Тем не менее, также выявлено значительное число нарушений, специфичных как к виду рака, так и к гистологическим и патологическим характеристикам опухоли.

выводы

1. Выполнена сравнительная гибридизация ДНК на специфичных к хромосоме 3 Notl-микрочипах, содержащих 180 Notl-клонов, ассоциированных со 188 генами. Выборка включала 40 образцов немелкоклеточного рака легкого, 48 образцов рака шейки матки, 18 образцов высокодифференцированного серозного рака яичников и 7 доброкачественных опухолей яичников.

2. Разработано программное приложение NIMAN (Notl-microarrays analysis) для нормировки и последующей обработки данных Notl-микрочипов. Рассчитаны границы относительного сигнала, соответствующие генетическим (делеции/амплификации) и эпигенетическим (метилирование/деметилирование) нарушениям. Это позволило повысить точность получаемых данных, чувствительность и специфичность метода.

3. Для рака легкого, шейки матки и яичников обнаружено более 40 генов, включая известные гены-супрессоры опухолевого роста, с частотой метилирования и/или делеций выше 15%. Наибольшая частота нарушений во всех 3-х видах рака показана для 10-ти генов: IQSEC1, NKIRAS1, RPL15, ITOA9, LRRC3B, RBSP3 (CTDSPL), GORASP1, TTC2IA, THRB и LRRNI. Для 17-ти генов впервые показана вовлеченность в онкогенез. Все эти гены являются потенциальными генами-супрессорами опухолевого роста.

4. Обнаружены гены с высокой частотой нарушений только при одном из трех видов рака: ANKRD28 и KY (рак легкого), PDZRN3 и SOX14 (рак шейки матки), АВТВ1 и PODXL2 (рак яичников). Перечисленные гены могут быть использованы для создания специфичных к виду рака наборов маркеров для неинвазивной диагностики.

5. Выявлены Notl-сайты с нарушениями специфичными к двум основным гистологическим типам рака легкого и шейки матки - аденокарциноме и плоскоклеточному раку.

6. Обнаружены Notl-сайты с нарушениями специфичными к присутствию метастазов в регионарных лимфоузлах при раке легкого.

7. Выявлены Notl-сайты с нарушениями специфичными к I+II или III+IV стадиям рака яичников.

8. Показано частое (до 100%) и значительное (до З.бхЮ2 раз) снижение уровня мРНК 10-ти генов с высокой частотой нарушений по данным Notl-микрочипов при раке легкого (IQSEC1, RBSP3, ITGA9, FOXP1, LRRNI, GNAI2, VHL, FGD5, ALDH1L1 и BCL6) и 2-х генов (ITGA9 и RBSP3) при раке шейки матки. Это говорит о важном вкладе метилирования и/или делеций в инактивацию исследованных генов.

9. Построены оригинальные предсказательные модели и предложены наборы генов для определения каждого из трех видов рака, а также гистологических и патологических характеристик опухоли с точностью 73 - 90%.

Статьи в научных журналах

1. Dmitriev А.А., Kashuba V.I., Haraldson К., Senchenko V.N., Pavlova T.V., Kudryavtseva A.V., Anedchenko E.A., Krasnov G.S., Pronina I.V., Loginov V.I., Kondratieva T.T., Kazubskaya T.P., Braga E.A., Yenamandra S.P., Ignatjev I., Ernberg I., Klein G., Lerman M.I., Zabarovsky E.R. Genetic and epigenetic analysis of non-small cell lung cancer with Notl-microarrays. Epigenetics. 2012. 7(5): p. 502-513.

2. Haraldson K.*, Kashuba V.I.*, Dmitriev A.A.*, Senchenko V.N., Kudryavtseva A.V., Pavlova T.V., Braga E.A., Pronina I.V., Kondratov A.G., Rynditch A.V., Lerman M.I., Zabarovsky E.R. LRRC3B gene is frequently epigenetically inactivated in several epithelial malignancies and inhibit cell growth and replication. Biochimie. 2012. 94(5): p. 1151-1157.

3. Kashuba V.I.*, Dmitriev A.A.*, Krasnov G.S., Pavlova T.V., Ignatjev I., Gordiyuk V.V., Gerashchenko A.V., Braga E.A., Yenamandra S.P., Lerman M.I., Senchenko V.N., Zabarovsky E.R. Notl-microarrays: novel epigenetic markers for early detection and prognosis of high grade serous ovarian cancer. International Journal of Molecular Sciences. 2012. 13(10): p. 13352-13377.

4. Senchenko V.N., Kisseljova N.P., Ivanova T.A., Dmitriev A.A., Krasnov G.S., Kudryavtseva A.V., Panasenko G.V., Tsitrin E.B., Lerman M.I., Kisseljov F.L., Kashuba V.I., Zabarovsky E.R. Novel tumor suppressor candidates on chromosome 3 revealed by Notl-microarrays in cervical cancer. Epigenetics. 2013. 8(4): p. 409-420.

Главы в книгах

1. Zabarovsky E.R., Senchenko V.N., Loginov V., Pavlova Т., Zabarovska V.I., Dmitriev A.A., Lung M.L., Panda C.K., Kashuba V.I., Lerman M.I., Braga E.A. Positional cloning of tumor suppressor genes from 3p21.3 involved in major human cancers. Horizons in Cancer Research. 2011. Editor Watanabe H.S. Nova Science Publishers, Inc., NY, USA. Volume 42, chapter 4: p. 103-127.

2. Zabarovsky E.R., Braga E.A., Loginov V., Senchenko V.N., Kudryavtseva A., Dmitriev A., Khodyrev D., Pavlova Т., Rynditch A.V., Lerman M.I., Kashuba V.I. Novel Methylation-Dependent Markers/Tumor Suppressor Genes Involved in the Development of Renal Cell Cancer. Horizons in Cancer Research. 2011. Editor Watanabe H.S. Nova Science Publishers, Inc., NY, USA. Volume 42, chapter 5: p. 129-152.

Тезисы конференций

1. Kashuba V.I., Grigorieva E.V., Haraldson K., Senchenko V.N., Dmitriev A.A., Pavlova Т., Braga E.A., Yenamandra S.P., Soulitzis N., Spandidos D.A., Klein G., Lerman M.I., Zabarovsky E.R. Identification of new methylation-regulated genes as molecular targets for pharmaceutical intervention and diagnosis based on NotI microarrays. International Journal of Molecular Medicine. 2011.28(Supplement 1): p. S49.

2. Kashuba V.I., Grigorieva E.V., Haraldson K., Senchenko V.N., Dmitriev A.A., Pavlova Т., Braga E.A., Yenamandra S.P., Soulitzis N., Spandidos D.A., Klein G., Lerman M.I., Zabarovsky E.R. Novel epigenetic biomarkers for early detection and prognosis of lung, ovarian, prostate, cervical, renal and breast cancers. International Journal of Molecular Medicine. 2012. 30(Supplement 1): p. S31.

3. Дмитриев A.A. Применение Notl-микрочипов для диагностики рака шейки матки. Сборник тезисов, Осенний финал по программе «У.М.Н.И.К.» РАН - 2012. Москва. 2012. с. 11-13.

4. Сенченко В.Н., Киселева Н.П., Дмитриев А.А., Краснов Г.С., Кашуба В.И., Забаровский Е.Р. Новые кандидаты в гены-супрессоры хромосомы 3 при раке шейки матки, обнаруженные с применением Notl-микрочипов. Вопросы Онкологии. 2013. приложение к 59(3): с. 124.

* - авторы внесли равный вклад

Подписано в печать: 07.11.2013 Тираж: 100 экз. Заказ № 1012 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект д.74 (495)790-47-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дмитриев, Алексей Александрович, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Дмитриев Алексей Александрович

АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ ХРОМОСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО, ШЕЙКИ МАТКИ И

ЯИЧНИКОВ

Специальность 03.01.03 — «Молекулярная биология»

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.х.н., с.н.с. В.Н. Сенченко

Москва 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ....................................................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................................9

1.1. Роль метилирования ДНК в организме человека....................................................................9

1.1.1. Метилирование ДНК и модификации гистонов............................................................11

1.1.2. Белки группы поликомб (Рев) и их связь с метилированием ДНК при онтогенезе и канцерогенезе..............................................................................................................................19

1.1.3. Бивалентные промоторы — элемент гибкости и пластичности генома.......................22

1.1.4. Расположение нуклеосом и метилирование ДНК.........................................................24

1.1.5. Возможная роль метилирования внутренних областей гена........................................28

1.1.6. Механизмы деметилирования ДНК................................................................................30

1.2. Перспективы использования метилирования в качестве биомаркера................................33

1.2.1. Фоновое метилирование, эффект влияния опухоли на строму....................................36

1.2.2. Возможности применения метиломных онкомаркеров для неинвазивных тестов.... 38

1.3. Определение паттернов метилирования и выбор генов-кандидатов в биомаркеры с помощью микрочипов.....................................................................................................................43

1.3.1. Анализ метилирования с использованием рестриктаз..................................................44

1.3.2. Анализ метилирования с использованием аффинного обогащения............................47

1.3.3. Анализ метилирования с использованием бисульфитной конверсии.........................49

1.3.4. Ыо11-микрочипы — оригинальный метод позволяющий одновременно выявлять метилирование и делеции ДНК.................................................................................................50

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................................54

2.1. Образцы тканей.........................................................................................................................54

2.2. Получение РНК, кДПК и ДНК................................................................................................55

2.3. Гибридизация ДНК с использованием Ыо11-микрочипов.....................................................55

2.4. Бисульфитное секвенирование................................................................................................56

2.5. ПЦР в реальном времени.........................................................................................................56

2.6. Статистический анализ данных..............................................................................................58

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................................................61

3.1. ММАЫ - приложение для обработки данных Ко^-микрочипов........................................61

3.2. Расчет границ относительного сигнала на ИоН-микрочипе, соответствующих различным вариантам генетических и эпигенетических нарушений............................................................63

3.3. Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 при раке легкого.....67

3.3.1. Анализ метилирования и делеций с помощью ЫоЙ-микрочипов и бисульфитного

секвенирования...........................................................................................................................68

3.3.2. Оценка изменений уровня мРНК 10-ти генов................................................................74

3.3.3. Сопоставление данных количественной ПЦР и ЫоИ-микрочипов..............................77

3.3.4. Статистический анализ данных ЫоИ-микрочипов в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками.....................................................79

3.4. Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 при раке шейки матки ...........................................................................................................................................................86

3.4.1. Анализ метилирования и делеций с помощью ЫоИ-микрочипов................................86

3.4.2. Подтверждение данных Ыо^-микрочипов методом бисульфитного секвенирования ......................................................................................................................................................91

3.4.3. Оценка изменений уровня мРНК генов ЯВБРЗ (СТЭБРЬ) и 1ТСА9...........................92

3.4.4. Статистический анализ данных Т^оЙ-микрочипов в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками.....................................................95

3.5. Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 при раке яичников.. 97

3.5.1. Анализ метилирования и делеций с помощью МоИ-микрочипов................................97

3.5.2. Подтверждение данных Ыой-микрочипов методом бисульфитного секвенирования ....................................................................................................................................................102

3.5.3. Статистический анализ данных КоЙ-микрочипов в группах опухолей с различными гистологическими и патологическими характеристиками...................................................102

3.6. Сравнительный анализ частот метилирования/делеций при раке легкого, шейки матки и яичников.........................................................................................................................................105

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................................................112

ВЫВОДЫ............................................................................................................................................114

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................................116

БЛАГОДАРНОСТИ...........................................................................................................................151

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AK - аденокарцинома АТФ - аденозинтрифосфат

ВДСРЯ - высокодифференцированный серозный рак яичников

ВПЧ - вирус папилломы человека

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДОЯ - доброкачественная опухоль яичников

кДНК - комплементарная ДНК

М/Д - метилирование/делеции

MPJI - мелкоклеточный рак легкого

HMPJI - немелкоклеточный рак легкого

п.н. - пар нуклеотидов

ПЗК - примордиальные зародышевые клетки

ПКР — плоскоклеточный рак

ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

РШМ - рак шейки матки

ЭСК — эмбриональные стволовые клетки

Зр - короткое плечо хромосомы 3

3q — длинное плечо хромосомы 3

cfDNA — свободно циркулирующие молекулы ДНК

CGI - CpG-островок

IncRNA — длинные некодирующие РНК

те 1, те2, теЗ - монометилирование, диметилирование, триметилирование SNP - однонуклеотидные полиморфизмы TSG — ген-супрессор опухолевого роста

Обозначения белков:

CFP - CpG-binding protein, CpG-связывающий белок

DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B и DNMT3L - ДНК-метилтрансферазы EZH2, G9A, LMT1, PRMT5, SET7, SET9, SETDB1, SUV39H1/2 -метилтрансферазы гистонов HI, Н2, НЗ, Н4 - гистоны

HP 1 - Heterochromatin protein 1, семейство белков гетерохроматина MBD - Methyl-CpG-binding domain protein, метил-СрО-связываюгцие белки PcG — Polycomb-group proteins, белки группы поликомб

PCNA — Proliferating cell nuclear antigen, ядерный антиген пролиферирующих клеток

PRC1, PRC2 — polycomb-group repressive complex, репрессивные поликомб комплексы

ВВЕДЕНИЕ

Рак представляет собой, прежде всего, заболевание генома, вызванное генетическими и эпигенетическими нарушениями (Esteller et al., 2001; Jones et al., 2002; Wood et al., 2007). В связи с этим уже не один десяток лет поиск молекулярных онкомаркеров для диагностики, прогностики, определения гистологического типа, эффективности терапии и выбора оптимальной стратегии лечения заболевания является актуальной задачей, к которой прикован огромный интерес мирового научного сообщества.

Метилирование геномной ДНК - важнейший эпигенетический механизм регуляции экспрессии генов, играющий ведущую роль в различных клеточных процессах - адаптации, дифференциации, межклеточной коммуникации, геномном импринтинге, инактивации Х-хромосомы, подавлении транскрипции и транслокации повторяющихся элементов и многих других (Jin et al., 2008; Bergman et al., 2013). Метилирование ДНК имеет важное значение для нормального развития, а нарушение механизмов метилирования является одной из причин многих заболеваний, включая рак (Robertson, 2005; Gopalabishnan et al., 2008). При раке наблюдается локальное гиперметилирование генов, в первую очередь генов-супрессоров опухолевого роста, на фоне потери метилирования других элементов генома (Jones et al., 2002).

Недавние масштабные исследования генома раковых клеток показали, что далеко не все генетические нарушения (точечные мутации, хромосомные перестройки, делеции и др.) вносят вклад в возникновение рака (Greenman et al., 2007; Wood et al., 2007; Bozic et al., 2010). В то же время гиперметилирование промоторных областей различных генов-супрессоров опухолевого роста — частое событие, нередко наблюдаемое уже на ранних стадиях заболевания или даже задолго до его возникновения (Pfeifer et al., 2009). Гиперметилирование затрагивает согни различных генов, вовлечённых в контроль клеточного цикла, трансдукцию внешних сигналов, регуляцию адгезии и миграции. Показана потенциальная прогностическая ценность этих нарушений (Bradly et al, 2012; Dai

et al., 2013; Huang et al., 2013), а также их диагностическая значимость для неинвазивных исследований {Guzman et al., 2012; Leng et al., 2012). Более того, такие исследования позволяют решать фундаментальную задачу — выявлять новые гены-супрессоры опухолевого роста.

Данное исследование посвящено поиску генов хромосомы 3 человека с высокой частотой генетических и/или эпигенетических нарушений в опухолях легкого, шейки матки и яичников с различными гистологическими и патологическими характеристиками и оценке их применимости в качестве диагностических маркеров.

Вовлеченность хромосомы 3 в развитие и прогрессию различных видов рака, включая рак легкого (Woenckhaus et al., 2005), шейки матки (Choi et al., 2007) и яичников {Birch et al., 2011), хорошо известна {Braga et al., 2002; Hesson et al., 2007). Однако масштабного одновременного анализа генетических и эпигенетических нарушений на представительной выборке образцов до сих пор не проводилось.

В качестве основного метода выбрана гибридизация парной «условная норма»/опухоль ДНК на Notl-микрочипах, специфичных к хромосоме 3. Notl-микрочипы позволяют одновременно выявлять две из основных причин инактивации генов-супрессоров опухолевого роста - метилирование промоторных CpG-островков и делеции ДНК.

Для нормировки и последующей обработки данных Notl-микрочипов

разработали программное приложение NIMAN (Notl-microarrays analysis).

Рассчитали границы относительного сигнала на Notl-микрочипе,

соответствующие различным вариантам генетических и эпигенетических

нарушений. С использованием чувствительного метода гибридизации ДНК на МоИ-микрочипах и разработанного программного обеспечения впервые оценили частоту нарушений 188-ми генов хромосомы 3 в опухолях легкого, шейки матки и яичников. Для каждого вида рака выявили более 40 генов с частотой метилирования и/или делеций выше 15%. Среди них есть как известные гены-супрессоры опухолевого роста, так и гены, для которых вовлеченность в онкогенез показана впервые. Полученные результаты выборочно подтвердили методом бисульфитного секвенирования.

Методом количественной ПЦР показали частое и значительное снижение уровня мРНК генов, характеризующихся высокой частотой нарушений по данным КоЙ-микрочипов при раке легкого. Показали, что метилирование и/или делеции вносят значительный вклад в снижение экспрессии двух известных генов-супрессоров опухолевого роста, 1ТОА9 и КВБРЗ, при раке легкого и шейки матки.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Роль метилирования ДНК в организме человека

Метилирование геномной ДНК — важнейший механизм регуляции экспрессии генов, играющий ведущую роль в развитии организма и различных клеточных процессах - адаптации, дифференциации, межклеточной коммуникации и многих других. Феномен метилирования ДНК наблюдается, в основном, у эукариот (Chan et al., 2005; Law et al, 2010) . Это явление заключается в обратимом переносе метильной группы (СН3-) с S-аденозил метионина на 5 позицию пуринового кольца цитозина (Robertson, 2005). У млекопитающих метилирование цитозинов в ДНК происходит в любом месте генома, вне зависимости от контекста (Lister et al., 2009). Тем не менее, подавляющее число (более 98%) случаев метилирования ДНК наблюдается именно в динуклеотидах CG в составе так называемых CpG-островков — протяжённых областей (более 200 п.н.) с высоким содержанием CG. В то же время метилирование вне CpG-островков происходит чаще всего в эмбриональных стволовых клетка (ЭСК) (Lister et al., 2009).

Метилирование ДНК имеет важное значение для нормального развития и играет важную роль в ряде ключевых процессов, включая геномный импринтинг — предпочтительную экспрессию генов лишь с материнских либо отцовских хромосом (Туско, 2010), инактивацию Х-хромосомы, подавление транскрипции и транслокации повторяющихся элементов. В то же время нарушение механизмов метилирования ДНК являются одной из причин многих заболеваний, включая рак (Robertson, 2005; Gopalakrishnan et al., 2008; Jin et al., 2008; Jin et al., 2009).

Метилирование ДНК регулируется семейством ДНК-метилтрансфераз (DNMT): DNMT1, DNMT2, DNMT3A, DNMT3B и DNMT3L (Bestor et al., 1988; Окапо et al., 1998; Yoder et al, 1998; Bestor, 2000; Cheng et al., 2008). Ранее in vitro было показано, что DNMT1 преимущественно ответственна за метилирование гемиметилированной ДНК (когда метилирован один из двух аллелей).

Предполагается, что эта метилтрапсфераза ответственна за копирование паттерна метилирования на дочерние цепи во время репликации ДНК {Probst et al., 2009) — во время S фазы клеточного цикла DNMT1 локализуется в областях репликации хроматина. Мышиные модели с гомозиготными делециями гена DNMT1 характеризируются эмбриональной летальностью примерно на стадии Е9 {Li et al., 1992; Li, 2002). DNMT2 - гомолог метилтрансферазы 1, ответственный за метилирование цитозина-38 в антикодоне петли транспортной РНК аспарагиновой кислоты {Goll et al., 2006). DNMT3A и DNMT3B, в отличие от DNMT1, выполняют метилирование CpG дипуклеотидов de novo в процессе развития организма. Мыши, лишенные гена DNMT3A, умирают в возрасте примерно 4-х недель, в то время как нокаут DNMT3B вызывает эмбриональную летальность на стадиях от Е14.5 до Е18.5 {Li et al., 1992; Окапо et al., 1999; Li, 2002; Goll et al., 2006). Обладая гомологией к DNMT3A и DNMT3B, DNMT3L повышает эффективность других метилтрансфераз, увеличивая их способность связываться с донором метильной группы, 8-аденозил-Ь-метионином, а также стимулирует их активность in vivo {Kareta et al., 2006), в то время как сам белок DNMT3L не обладает каталитической активностью. Делеция/выключение гена DNMT3L приводит к тому, что в импринтинговых областях происходит экспрессия генов с двух аллелей, отцовской и материнской. При этом оба аллеля остаются неметилированными, в то время как уровень метилирования других генов, вне импринтинговых областей, не изменяется {Bourc'his et al., 2001).

Ранее считалось, что DNMT1, главным образом, выполняет функции метилтрансферазы, обеспечивающей копирование паттерна метилирования в процессе синтеза ДНК, a DNMT3A и DNMT3B участвуют в формировании профиля метилирования cle novo (в процессе развития организма или клеточной дифференциации). Тем не менее, все больше свидетельств указывает на то, что DNMT1 также может быть необходима для метилирования геномной ДНК de novo {Egger et al., 2006), a DNMT3A и DNMT3B способствуют сохранению паттерна метилирования ДНК при репликации {Riggs et al., 2004).

Хорошо известно, что нарушение метилирования ДНК тесно связано с развитием рака. Тем не менее, не выявлено никаких мутаций или других нарушений в генах DNMT, которые бы приводили к возникновению опухолей (по-видимому, в связи со значимой ролыо этих генов в эмбриогенезе). Эпигенетическим признаком рака является избирательное гиперметилирование CpG-островков (CGI) определённых генов на фоне общей потери метилирования ДНК других элементов генома (Feinberg et al., 2006; Suzuki et al., 2008). При раке снижению метилирования наиболее подвержены повторяющиеся элементы, включая сателлиты (например, SAT2) и ретротранспозоны (например, LINE). В нормальных тканях число этих участков, способных к самокопированию, контролируется метилированием, в то время как повышенное содержание этих элементов в геноме (так называемая микросателлитная нестабильность) является признаком опухоли и даже служит маркером её агрессивности. Микроса

Информация о работе

Дмитриев, Алексей Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 человека при раке легкого, шейки матки и яичников - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы