Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гены-супрессоры хромосомы 3
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Гены-супрессоры хромосомы 3"
На правах рукописи
Сенченко Вера Николаевна
ГЕНЫ-СУПРЕССОРЫ ХРОМОСОМЫ 3 ЧЕЛОВЕКА: ИНАКТИВАЦИЯ И ОПУХОЛЕВАЯ ПРОГРЕССИЯ
03.01.03 - Молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва 2014
2 7 ФЕЗ 2314
005545371
Работа выполнена в Лаборатории структурно-функциональной геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук и частично в Лаборатории почечно-клеточного рака Центра микробиологии и биологии опухолей Каролинского института (Швеция, Стокгольм).
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Александр Васильевич КАРПУХИН
(Федеральное государственное бюджетное учреждение Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук)
доктор биологических наук, профессор Галина Ефимовна СУЛИМОВА (Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук)
доктор биологических наук, профессор Юрий Борисович ЛЕБЕДЕВ
(Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук)
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение
Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина Российской академии медицинских наук
Защита диссертации состоится " W£ 2014 г. в 11 часов на заседании
диссертационного совета Д 002.235.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, ГСП-1, ул. Вавилова, 32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук.
Автореферат разослан ¿-^>7^2014 г.
УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ Диссертационного совета кандидат химических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Рак остается глобальным вызовом человечеству. Онкологические заболевания занимают второе место в мире по уровню смертности после сердечно-сосудистых заболеваний. Инвазивный локальный рост опухоли с проникновением в прилежащие ткани и ее дальнейшее метастатическое распространение в удаленные жизненно важные органы неминуемо приводит к летальному исходу, часто независимо от скорости роста первичной опухоли. Рак называют болезнью генома, а в некоторых случаях - «хромосомной катастрофой» из-за разрушительности последствий и стремительного течения заболевания (Stephens et al, 2011). В постгеномный период представление о существовании нескольких ключевых генов, вызывающих рак, претерпело значительные изменения. В большинстве случаев, наряду с онкогенами в этой роли выступают гены-супрессоры опухолевого роста. По самым последним оценкам (Vogelshtein et al, 2013) около 140 генов (т.н. «driver genes») могут инициировать запуск клеточной трансформации - в среднем 2-8 мутаций в нескольких генах из этой группы на каждый вид рака. К опухолевому заболеванию могут также привести эпигеномные структурные изменения, не затрагивающие нуклеотидную последовательность ДНК (например, метилирование ДНК и модификации гистонов), которые также вносят вклад в инактивацию генов-супрессоров и активацию протоонкогенов {Alberts et al, 2002; Weinhold et al, 2006). Кроме того, некодирующие короткие последовательности (микроРНК) играют важную роль в нарушении экспрессии генов, вызывающих рак, причем, экспрессия самих микроРНК тоже может регулироваться эпигенетическими механизмами (Chuang and Jones, 2007).
Опухолевая прогрессия характеризуется накоплением в клетках геномных и эпигеномных нарушений, приводящих к развитию все более злокачественного фенотипа, что сопровождается ускорением пролиферации и повышением устойчивости к апоптозу, нарушением механизмов дифференцировки, стимулированием неоангиогенеза, увеличением подвижности клеток и ослаблением межклеточных взаимодействий и, наконец, к инвазии и метастазированию. Основанная на понятии многоступенчатого канцерогенеза, прогрессия заболевания и метастатическая активность опухолевых клеток определяется генами, в которых накапливаются изменения на последней стадии заболевания и коррелируют со степенью злокачественности опухоли (Hanahan and Weinberg, 2011). Однако, до сих пор многие гены, вовлеченные в прогрессию, или существенные для приобретения метастатического потенциала опухолей, еще не идентифицированы. Это важно не только для понимания молекулярных механизмов канцерогенеза, но и для разработки стратегий подавления опухолевой прогрессии и метастазирования. В связи с этим анализ изменений структуры и функциональной активности генов-супрессоров, вовлеченных в опухолевую прогрессию, является актуальной задачей молекулярной
биологии и онкологии (Lee et al, 2010; Inoue et al, 2013). Решение этой задачи помогает оценить масштаб и степень нарушений при развитии каждого вида рака, гистологических типов и их вариантов, что необходимо для разработки новых стратегий и методов лечения. В этих исследованиях особое место занимают гены, расположенные в районах частых дедеций (т.н. «горячих точках») хромосомы 3, с тех пор как показана способность субхромосомных фрагментов короткого плеча (Зр) к подавлению роста опухолей. Уже более двух десятилетий в разных лабораториях мира проводится направленный и систематический поиск генов-супрессоров в этом геномном локусе, изучение их структуры, функций и роли в канцерогенезе, а также возможности их применения в клинической практике. Цель работы
Выяснение связи инактивации генов-супрессоров хромосомы 3 с прогрессией распространенных злокачественных новообразований — рака легкого, шейки матки, почки и других видов. Основные задачи исследования
1. Поиск и картирование частых гомозиготных делеций на Зр - мест локализации потенциальных генов-супрессоров, в различных эпителиальных опухолях.
2. Сравнение количественных характеристик профилей экспрессии обширной группы генов хромосомы 3 с целью обнаружения возможных ассоциаций с прогрессией основных гистологических типов немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) - аденокарциномы (АК) и плоскоклеточного рака (ПКРЛ); рака шейки матки (РШМ) - аденокарциномы (АК) и плоскоклеточного рака (ПКР); светлоклеточного (скПКР) и папиллярного (ПРП) рака почки.
3. Поиск метилирования/делеций в генах хромосомы 3 с целью обнаружения новых потенциальных генов-супрессоров, специфических паттернов этих нарушений для каждого гистотипа НМРЛ, РШМ и РП, а также связи с опухолевой прогрессией.
4. Оценка вклада классических механизмов (метилирования и делеций) в инактивацию генов-супрессоров и генов-кандидатов.
Научная новизна
Локализованы две новые «горячие точки» в центромерном и теломерном районах протяженного локуса Зр21.3 с помощью двух STS-маркеров - NLJ-003 и NL3-001. Обнаружены частые гомозиготные делеции (10-18%) на этих участках в первичных опухолях молочной железы, почки, шейки матки и клеточных линиях легкого, указывающие на расположение генов-супрессоров опухолевого роста. Точное картирование 34-х независимых делеций позволило сузить эти районы и идентифицировать более 20-ти потенциальных генов-супрессоров, большинство из которых стало объектами исследования дальнейшей работы.
Впервые показано, что характер изменений экспрессии гена-супрессора RBSP3 (локус NLJ-003) и его мишени RB1 - ключевого гена-супрессора клеточного цикла зависит от прогрессии рака почки и легкого. Одновременный скрининг нарушений
экспрессии 84-х генов-участников основных сигнальных путей, ответственных за регуляцию клеточного цикла - Rb и p53/p21Wafl, выявил согласованные изменения экспрессии многих генов в двух гистологических типах НМРЛ (АК и ПКРЛ), зависящие от наличия метастазов. Рассмотрены возможные механизмы инактивации генов RBSP3 и RB1, а также предложена гипотеза о новых звеньях в механизме контроля клеточной пролиферации.
Впервые с помощью микрочипов Clontech (США) выполнен анализ экспрессии гена CHL1 (семейство L1 молекул клеточной адгезии, САМ) в 19-ти видах рака, который обнаружил в 76% образцов как падение экспрессии гена, так и его оверэкспрессию. Показана связь этих нарушений с прогрессией рака желудка, толстой и прямой кишки, а также его экспрессия в метастазах у больных раком яичников, молочной железы и толстой кишки. Показана частая согласованная инактивация генов семейства LI - L1CAM, СНЫ и NFASC (кроме NRCAM) на фоне активации или дерегуляции экспрессии функционально связанных с ними генов различных семейств (анкиринов, интегринов и др.) при раке почки. Выявлены опухолеспецифичные особенности профилей экспрессии генов семейства L1 при раке легкого. Совокупность результатов позволяет рассматривать ген CHL1 в качестве важного онко-ассоциированного гена, связанного с прогрессией некоторых видов рака желудочно-кишечного тракта и метастазированием, а также подтверждает нашу гипотезу о его двойственной (супрессорной и онкогенной) роли в канцерогенезе.
Впервые показано одновременное и координированное падение экспрессии генов-супрессоров локуса 3р21.3 - RASSF1A, SEMA3B, SEMA3F, ITGA9, NPRL1, RBSP3, HYAL1, HYAL2 и генов-кандидатов VILL, APRG1 в опухолях легкого, в первую очередь за счет делеций и метилирования. Кроме того, гены вовлечены в прогрессию НМРЛ: частота и степень падения уровня мРНК генов RASSF1A, RBSP3, NPRL2, ITGA9, HYAL1 и SEMA3B коррелирует с прогрессией АК (Р<0.05), но только для одного гена RASSF1A - с прогрессией ПКРЛ (Р<0.05). Таким образом, эти гены кластеризованы не только позиционно, но и функционально.
В образцах рака легкого методом сравнительной гибридизации ДНК на Notl-микрочипах впервые выполнен одновременный анализ метилирования и/или делеций (М/Д) для 188-ти генов хромосомы 3, имеющих Notl-сайты. Обнаружен 41 ген с частотой нарушений более 20%. Наряду с известными генами-супрессорами, для многих генов связь с канцерогенезом показана впервые. Самое сильное различие в частоте М/Д в группах АК с метастазами и без метастазов (от 30% до 80%) отмечено у 19-и генов. В 39% образцов ПКРЛ и 17% - АК впервые обнаружен согласованный характер нарушений у более 20-ти генов в одних и тех же опухолях (т.н. фенотип CIMP+, CpG island methylator phenotype).
В образцах рака шейки матки с помощью Notl-микрочипов обнаружено 30 генов с высокой частотой М/Д (более 20%), а также фенотип CIMP+ более чем у 20-ти генов
в 23% образцов плоскоклеточного рака. На той же выборке образцов показано одновременное частое падение экспрессии генов-супрессоров локуса Зр21.3 -RBSP3, ITGA9, RASSF1A и генов-кандидатов APRG1, VILL.
В образцах рака почки выполнен аналогичный анализ экспрессии и метилирования/делеций. Обнаружено существенное и частое падение экспрессии у двух генов локуса 3р21.3 - SEMA3 и HYAL1 и генов из других районов Зр - CHLI (3р26.3) и АСУ! (Зр21.1) на всех стадиях заболевания, для остальных генов показана дифференциальная экспрессия. Показана корреляция увеличения частоты и степени изменений экспрессии генов-супрессоров локуса 3р21.3 —RBSP3, NPRL2/G21, ITGA9, HYAL2 и SEMA3F с прогрессией скПКР. С помощью Notl-микрочипов обнаружено 18 генов с высокой частотой М/Д (18-59%).
Таким образом, комплексный анализ экспрессии, делеций и метилирования генов Зр в образцах рака легкого, шейки матки и почки позволил впервые выявить новые потенциальные гены-супрессоры; протяженные области геномной, эпигеномной нестабильности и транскрипционного «молчания» многих генов; коэкспрессию ряда генов, которая зависела от опухолевой прогрессии. Теоретическая и практическая ценность работы
Широко признанная двух-ударная модель канцерогенеза Кнудсена (1971) описывает дискретные события (мутации, потерю аллеля, метилирование), приводящие к инактивации генов-супрессоров, а в конечном итоге - к неопластической трансформации клеток. Для ряда генов показано нарастание степени и частоты падения уровня мРНК генов-супрессоров при переходе от начальных стадий к последующим и, наконец, метастазирующим опухолям. Эти изменения могут быть обусловлены в первую очередь нарастанием частоты делеций и метилирования, как в случае аденокарциномы легкого, но не только, а также включением других тонких механизмов регуляции транскрипции при развитии и прогрессии заболевания. С помощью двух методом (микрочипы и ПЦР в реальном времени) показано, что делеции и метилирование — не единственные механизмы инакцивации генов-супрессоров. Результаты работы хорошо согласуются с новой моделью непрерывного ослабления опухолевой супрессии, которую предложил Кнудсен с коллегами на основе обобщения накопленных новых знаний и дальнейшего развития своей прежней широко признанной двух-ударной модели с учетом роли различных причин, влияющих на супрессорную активность (Berger, Knudson, and Pandolfi, 2011).
Кластер позиционно и функционально связанных генов-супрессоров на Зр, вовлеченных в прогрессию онкозаболеваний, характеризуется специфическими профилями экспрессии и паттернами метилирования/делеций в основных гистологических типах рака трех локализаций, что представляет большой интерес для клиницистов. Применение биомаркеров играет важную роль в развитии методов персонифицированного лечения рака. Одновременный анализ геномных и
эпигеномных нарушений (микрочипы) в сочетании с количественным анализом экспрессии генов (ПЦР в реальном времени) позволяет идентифицировать маркеры, которые могут быть полезны для уточнения диагноза, определения стадии и распространенности заболевания, выбора мишеней для таргетной и генной терапии, разработки терапевтических агентов, ингибирующих метастазирование, для прогноза и мониторинга лечения. Современная комбинированная таргетная тарапия, а также генотерапия предполагают использование не отдельных, а нескольких или многих надежных и специфичных мишеней. Хотя современные технологии позволяют получать огромные массивы данных, однако при анализе и интерпретации этих данных необходимо учитывать накопленные за последние десятилетия научные знания с применением традиционных методов. Результаты работы будут полезны для разработки многофункциональных систем/наборов онкомаркеров (геномные, эпигеномные и экспрессионные) для каждого вида/гистотипа опухоли как для решения научных задач, как и для будущего применения в клинике. Гены, связанные с прогрессией и метастазированием, особенно важны как маркеры прогноза течения заболевания, предсказания рецидивов, коррекции терапии и разработки методов индивидуального лечения пациентов. Важность обнаружения метилирования и особенно фенотипа CIMP+ (CpG island methylator phenotype), в первую очередь для ранней диагностики, очевидна в связи с разработкой новых подходов к лечению рака, основанных на применении деметилирующих агентов (Vendetti and Rudin. 2013). Личный вклад автора. Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при непосредственном участии, а именно: в постановке задач, планировании и выполнении научных опытов, анализе и интерпретации результатов. Апробация работы. Диссертационная работа представлена и обсуждена на семинаре Лаборатории структурно-функциональной геномики ИМБ РАН. Результаты работы докладывались на: Human Genome Organization Meetings, 2002, 2003 и 2006; World Congress on Advances in Oncology and International Symposium on Molecular Medicine 2006-2011, Hersonissos, Crete, Greece; 2nd International qPCR Symposium & Exhibition& Workshop, 2005, Freising, Germany; INTAS Workshop «Mid-term review of the INTAS Thematic Calls 2005 on Genomics/Proteomics & Energy», Kiev, Ukraine, 2007; 4th International qPCR Symposium & Exhibition& Workshop 2010, London, GB; Онкологическом конгрессе, Санкт-Петербург, 2007; Российском медицинском форуме, Москва, 2007; Российской конференции по фундаментальной онкологии, Москва, 2007; 4-м съезде российских биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 2008; 4-м съезде Российского общества медицинских генетиков в Ростове-на-Дону, 2010; ежегодной конференции по фундаментальной онкологии «Петровские Чтения», Санкт-Петербург, 2007-2013; конференции «Актуальные вопросы онкогенетики» 2011, ФГБУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, Москва и др. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 работ, включая два обзора в отечественных журналах, две главы в книге «Cancer, Horizons in Cancer
Research» (2011, Ed. F. Columbus, Nova Science Publishers, Inc., NY), из них 7 - в отечественных и 20 — в международных журналах, одна программа (Роспатент) и 4 патента.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения и выводов. Список литературы включает 382 наименования. Работа изложена на 190 страницах, содержит 19 таблиц и 25 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Парные образцы опухолевых и гистологически нормальных тканей собраны в отделе патологической анатомии опухолей человека и охарактеризованы в лаборатории клинической цитологии ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина, РАМН. Использовали ткани только тех больных, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. Все образцы опухолевых тканей охарактеризованы в соответствии с TNM-классификацией Международного противоракового союза (IUCC, версия 2007 г.) и типированы гистологически на основании классификации ВОЗ. Для отбора образцов с высоким содержанием опухолевых клеток проводили дополнительный гистологический анализ микросрезов (толщина 3-5 мкм), окрашеных эозином и гематоксилином. Образцы тканей хранили в жидком азоте при -70 °С. В общей сложности использовано более 200 парных (опухоль/норма) образцов ДНК и РНК, выделенных из первичных опухолей: основных гистотипов НМРЛ (ПКРЛ и АК), РШМ (ПКР и АК), РП (скПКР и ПРП), РМЖ, РЯ и др. Кроме того, проанализированы данные Notl-чипов (Каролинский институт, Швеция) для 87 образцов ДНК, полученных из тех же образцов опухолей и других выборок, а также данные коммерческих чипов фирмы Clontech (США) для 486 образцов кДНК, выделенных из 19-ти наиболее распространенных видов рака.
Основные методы: выделение РНК и ДНК из клеточных культур и образцов первичных опухолей; ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ); гибридизация по Саузерну; гибридизация ДНК на Notl-микрочипах и экспрессионных микрочипах (Clontech); иммуногистохимия; бисульфитная конверсия ДНК с последующим секвенированием. Секвенирование ДНК выполнено в Каролинском Институте (Швеция) и частично в ЦКП «Геном» ИМБ РАН. Для математической обработки данных ПЦР-РВ и микрочипов разработаны приложения АТГ (Анализ Транскрипции Генов) и NIMAN (Notl-Microarrays Analysis), которое позволяет нормировать данные микрочипов, выполнять расчеты для каждого Notl-сайта и с помощью встроенного точного критерия Фишера сравнивать частоты нарушений в группах образцов с различными патоморфологическими характеристиками. Для статического анализа количественных данных использовали непараметрические методы (Манна-Уитни, Крускала-Уоллиса) с применением программы Biostat (Giant, 2005).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Поиск участков генетической нестабильности в районах короткого плеча хромосомы 3 с целью идентификации потепциальных генов-супрессоров опухолевого роста
Как известно, гомозиготные делении (HD) указывают на расположение генов-супрессоров. Поиск нарушений ДНК короткого плеча хромосомы 3 (Зр) в различных видах рака осуществлен в лабораториях разных стран, обнаружены несколько районов частых делеций (т.н. «критичных» районов или «горячих» точек): 3р12-р13, Зр14, Зр21, Зр21-р22, и Зр25-р26 (Wei 1996, Kok 1997, Van den Berg 1997, Girard 2000). Эти результаты побудили к дальнейшей идентификации новых генов-кандидатов, наряду с уже известными генами-супрессорами. В рамках научного сотрудничества с лабораторией Е.Р. Забаровского (Каролинский институт, Швеция) выполнена оценка копийности фрагментов ДНК методом ПЦР-РВ с применением двух Notl-STS (sequence-tagged site) маркеров - NLJ-003 и NL3-001, расположенных в центромерном и теломерном районах локуса Зр21.3 - АР20 (Alu-PCR клон 20, 3.21.3С) и LUCA (Lung Cancer, 3.21.3Т). На схеме (рис.1) видно, что NL3-001 расположен на Зр близко от гена SEMA3B (семейство семафоринов), a NLJ-003 находится между геном ITGA9 (семейство интегринов, участников клеточной адгезии) и границей HD, обнаруженной в клеточной линии мелкоклеточного рака легкого (MPЛ) - ACC-LC5.
1.1. Количественный анализ изменений копийности ДНК двух локусов Зр - NLJ-003 и NL3-001 в различных видах рака
Суммарные результаты оценки количества копий ДНК в образцах скПКР, РМЖ, РШМ и клеточных линиях МРЛ представлены в табл. 1. Частые нарушения в 71-91% образцов свидетельствовали о том, что оба района - «горячие» участки для этих видов опухолей. Частоты нарушений в АР20 и LUCA были близки. Самая высокая частота гемизиготных делеций показана в клеточных линиях МРЛ: 60.9 % в NLJ-003 и 60 % в NL3-001. Самая высокая частота HD в локусе NLJ-003 обнаружена при РШМ (15.6 %) и в NL3-001 - при РМЖ (18 %). Помимо делеций, также обнаружены случаи амплификации ДНК. Самая высокая частота амплификаций обнаружена в NLJ-003 (34 %) и NL3-001 (42.5 %) при раке почки. Известно, что структурные изменения в АР20 носят сложный характер, где кроме делеций ранее обнаружены дупликации и многократное увеличение копий одного аллеля наряду с потерей другого (Dalen et al, 1998, Thiagalingam et al, 2001). Амплификации на Зр в цервикальных опухолях нами показаны впервые. Хромосома 3 человека содержит также гены, которые могут выступать в роли онкогенов, а амплификация ДНК может отражать умножение их копий, приводящее к активации, наряду с потерей копий ДНК генов-супрессоров. Так, гены RON и MST1 расположены на Зр21 и
Частота генов
Частота SNP
Млн.п.н.
Гены Маркеры
| —— 0334«{Wi.-P24S „„„„
SSMMF SSATI 017 шя
SEBAS8
НУШ
НЖ1
HYAL2
ftlSI
8ASSH
Hill
«1f« И
СДСНА2К GBl
.Ü3SJ61S ■
- DJS««
PLC31 ACAAt
Рис. 1. Схематическая карта районов Зр - Ар20 и 1Л!СА. Справа от хромосомы 3 показаны два района перекрывающихся гомозиготных делеций. обнаруженных в опухолях почки, молочной железы, шейки матки и клеточных линиях МРЛ. Расположение генов и маркеров указано в соответствии с Яе^И) [http://www.ncbi. nlm.nih.gov/mapreview/!.
повышение их экспрессии может приводить к неконтролируемой пролиферации (Angeloni et al, 2001).
Данные ПЦР-РВ для локусов NLJ-003 и NL3-001 и других районов Зр сравнили с результатами анализа LOH, выполненного Э.А. Брагой и сотр. (ФГУП «ГосНИИгенетика», Москва), в первичных опухолях - РП, РШМ, РМЖ и клеточных линиях МРЛ. Как видно из рис. 2, результаты двух методов
Таблица 1. Частота изменений копийности ДНК (%) в районах АР20 и LUCA при различных видах рака.
Локализация Ампли- Гомозиготные Гемизиготные Все изменения, %
опухоли фикации делении делении
Область LUCA (NL3-001)
почка 42.5 10.0 20.0 72.5
молочная железа 27.3 18.0 40.9 86.6
легкое 15.0 10.0 60.0 85.0
шейка матки 28.1 15.6 28.1 71.8
Область АР20 (NLJ-003)
почка 34.0 15.1 34.0 83.1
молочная железа 28.6 14.3 33.3 76.2
легкое 17.4 13.0 60.9 91.3
шейка матки 21.9 15.6 43.8 81.3
обнаружили хорошее соответствие в 85 % образцов для двух районов Зр. Данные ПЦР-РВ для некоторых образцов ДНК подтверждены методом гибридизации по Саузерну. Таким образом, поиск делеций на Зр методом ПЦР-РВ с помощью двух STS-маркеров обнаружил не только частые HD (10-18 %), но и амплификации (1542.5%). HD часто находили одновременно в двух локусах в одних и тех же опухолях (Р«0.001). Изменение копий ДНК либо в NLJ-003, либо в NL3-001 выявили более чем в 90 % случаев. Исключительно высокая частота геномных нарушений свидетельствовала, что гены-супрессоры расположены близко к этим маркерам и инактивированы в различных видах рака. Точное картирование 15-ти независимых делеций в районе LUCA позволило сузить область до 445 т.п.н., попадающую между генами CACNA2D2 и SEMA3F, где расположено 17 генов. Картирование 19-ти HD в районе АР20 позволило локализовать минимальную область (600 т.п.н.) между генами APRGl/C3orf35 и VILL (рис.1).
2. RBSP3/CTDSPL - «классический» геи-супрессор опухолевого роста
Оказалось, что универсальный Notl-STS маркер NLJ-003/D3S1642 находится в промоторной области гена CTDSPL (другие обозначения SCP3, HYA22, GenelD: 10217, 3р21.3). Ген протяжённостью 123 т.п.н. принадлежит к SCP семейству генов малых CTD (carboxy-terminal domain) сериновых фосфатаз. Повторяющаяся область С-концевого домена (CTD) самой большой субъединицы РНК-полимеразы II (Pol II) играет ключевую роль в регуляции экспрессии генов и служит структурным элементом, объединяющим такие различные процессы как транскрипция, процессинг мРНК и др. (Eglojf et al, 2008). Активность CTD зависит от статуса фосфорилирования, за который ответственны CTD фосфатазы и киназы {Palancade et al, 2004). Полагают, что CTD-фосфатазы (CTDSP1-2 и CTDSPL/ RBSP3) могут катализировать дефосфорилирование Ser5 в консенсусном повторе CTD большой субъединицы Pol II - Tyr'-Ser2-Pro3-Thr4-Ser5-Pro6-Ser7, участвуя, таким образом, в инактивации этого фермента и негативной регуляции
-теш
" лшшз /-шяш» —вша* и—иивк»
-—ВШЯ» ^-ОЯМЯ
'Увиат
Л«» vwsy»
X-sösmm
ЧЧаяию
\Ш!И
Ч/Шия
ВЗКМЫ
ода»
51.31
Ч»Ш)1 SD3S2454 -03S540«
Рис. 2. Результаты методов LOH и ПЦР в реальном времени в первичных опухолях - РШМ (А), РМЖ (Б) и скПКР (В). Черный цвет - LOH (L,H) и гомозиготные делении, белый -сохранение копий ДНК, серый - амплификации, штриховка -неинформативные случаи; L и Н - потеря соответствующего аллеля.
транскрипции, а также контролировать статус фосфорилирования иных субстратов помимо CTD домена (Feo et al, 2003, 2010). Сделано предположение, что другой функцией членов семейства SCP может быть активация фосфорилированного белка-предшественника RB1 путём его дефосфорилирования по серину в положении 807/811 (Yeo et al, 2003, 2005).
Первое исследование гена CTDSPL и его роли в канцерогенезе выполнено совместно с Е.Р. Забаровским и сотр, (Швеция). Показано существование двух изоформ мРНК — изоформа A (NM_005808, 4422 п.н.), в которой отсутствует один экзон, и изоформа В (NM_-001008392, 4455 п.н.) с соответствующим белком размером 276 а.о., что на 11 а.о. больше, чем у первого. Во время клеточной пролиферации в активно экспрессируемом районе, содержащем ген, показано наличие мутаций de novo. После трансфекции клеточных линий рака молочной железы MCF-7 наблюдали экзогенную экспрессию гена в ядрах клеток, сопровождаемую уменьшением неактивного фосфорилированного по С-концу Rbl с последующей остановкой клеточного цикла на границе G|/S. Эти результаты свидетельствовали о вкладе фосфатазы в активацию белка Rbl и позволили предположить, что снижение или отсутствие экспрессии CTDSPL в опухолях должно способствовать нарушению или утрате контроля над делением клеток. В связи с этим предложено обозначение гена, отражающее эту важную функцию, а именно RBSP3 ("Rbl serine phosphatase from chromosome 3). Опухолеподавляющая активность RBSP3 показана с помощью теста GIT (Gene Inactivation Test), основанного на функциональной инактивации исследуемого гена с помощью эукариотических векторов с регулируемой экспрессией в опухолевых клетках in vivo и in vitro (Li et al, 2004). Белки RBSP3, соответствующие изоформам А и В, проявляли противоопухолевую активность, причем у белка с большей молекулярной массой активность выражена значительнее. Методами ПЦР-РВ и Нозерн-гибридизации показано существенное падение (до 20 раз) экспрессии RBSP3 в клеточных линиях РЛ, РП, РЯ, РМЖ, РШМ (N146, N417, U2020, АСС- LC5, CaOv, MCF-7, SiHa, CaSki и др), а также в различных первичных опухолях. Кашуба и сотр. (ИМБГ, Киев) методом поверхностного плазмонного резонанса (Boltovets et al, 2004) показали прямое взаимодействие белков RBSP3 и Rbl. Кроме того, появились работы по оценке клинического и прогностического значения частых нарушений RBSP3 при раке молочной железы на ранних и поздних стадиях (Sinha et al, 2008), в ранних дисплазиях головы и шеи (Ghosh et al, 2010), в цервикальных интраэпителиальных неоплазиях (Mitra et al, 2010). Совокупность этих данных позволила рассматривать ген RBSP3 в качестве «классического» гена-супрессора, который может выступать важным звеном в регуляции клеточного цикла. Однако, сравнительный анализ экспрессии RBSP3 и RB1 в опухолях практически отсутствовал. Экспрессии генов -первый уровень реализации генетической информации на молекулярном уровне.
Нарушения экспрессии генов-супрессоров и вклад различных механизмов в их инактивацию тесно связаны с этапами злокачественной трансформации клеток.
2.1. Связь изменений экспрессии генов RBSP3 и RB1 с прогрессией рака почки и легкого
Ген RBI (13q 14.2) протяжённостью 180 т.п.н., кодирует белок ПОкДаи принадлежит к семейству Rb наряду с pi07 и р130, которые вовлечены в одни и те
же клеточные сигнальные А пути, но имеют различные
функции (Indovina et al, 2013). Белок Rbl - ключевой участник сигнального пути pl6ink4A_cdky cyclin-Rb,
который ответственен за остановку клеточного
деления на границе Gi/S (Osada et al, 2002). В работе впервые выполнено
детальное сравнение
профилей экспрессии RBSP3 и его мишени RB1 в первичных опухолях почки (рис. ЗА) и легкого (рис. ЗС).
Рис. 3. Относительный уровень мРНК генов RBSP3 и RB1 в образцах скПКР (A), hTERT (В), RBSP3 и RB1 (С) в образцах НМРЛ (АК и ПКРЛ).
Количественные данные сопоставляли с клинико-морфологическими характеристиками: гистологическим типом, степенью дифференцировки и анаплазии опухолевых клеток, клинической стадией заболевания, статусом метастазирования и др. (рис. 3, табл. 2).
Ген RBSP3. Уровень мРНК гена снижен в 2-11 раз (в среднем - около 4-х раз) в 50% образцов скПКР (Р < 0.01). Большинство образцов выборки имели 1-ю или 2-ю степень анаплазии. Самый низкий уровень экспрессии гена отмечен в образцах № 8 и № 35, которые выделены из опухолевых клеток с низкой степенью дифференцировки, 3-ей степенью анаплазии и наиболее злокачественным
фенотипом. Показано нарастание степени и частоты падения экспрессии гена от 3-х раз в 41% образцов (1-И ст.) до 5-ти раз в 69% образцов (III-IV ст., Р = 0.03).
Ген RB1. В 42% случаев скПКР обнаружено повышение экспрессии гена, в среднем около 4-х раз (Р < 0.01), в то время как снижение экспрессии обнаружено только в одном образце из 50-ти (№37, III ст.). Отмечено различие в характере изменений уровня мРНК гена RB1 на ранних и поздних стадиях скПКР: 62% случаев повышения (I-II ст.) против 13% (III-IV ст., Р = 0.01). Таким образом, в образцах рака почки профили экспрессии двух генов-супрессоров имели различный характер: на ранних стадиях преобладало повышение экспрессии RB1 при ее сохранении у RBSP3 в 44% случаев, а на поздних стадиях в 63% образцов наблюдали падение экспрессии RBSP3 при ее сохранении у RB1 (рис.3 А). Другие варианты были редкими.
Таблица 2. Суммарные статистические данные по изменению содержания мРНК генов RBSP3 и RB1 в образцах рака почки (скПКР) и легкого (АК и ПКРЛ).
Характеристики/тип рака скПКР НМРЛ
АК ПКРЛ
Ген RBSP3
Ср. уровень мРНК гена для всей выборки »2.2J. *3.8] •5.7]
Ср. уровень снижений мРПК (разы) 3.8 4.7 6.2
Частота снижений, % 50 (25/50) 85(11/13) 94 (16/17)
Ср. уровень мРНК гена скГПСР (1+Н и Ш+1У стадии) АК и ПКРЛ (без и с метастазами) 1.9] и 3.2] Р = 0.03 2.4] " 6.6| Р < 0.05 5.6] и 5.8] /> = 0.58
Ген «в;
Ср. уровень мРНК гена для всей выборки •I.9T •2.91 •3.4J
Ср. уровень снижений мРПК (разы) Ср. уровень повышений (разы) 4.2| 4.1t 4.4]. нет 4.6| нет
Частота снижений, % Частота повышений, % 2 (1/50) 42(21/50) 62 (8/13) нет 71 (12/17) нет
Средний уровень мРНК гена скПКР (1+Н и Ш+ГУ стадий) АК и ПКРЛ (без и с метаезазамн) 2.7t и 1.0 Р = 0.01 1.7] и 5.3J. Р < 0.06 3.5] и 3.34 Р = 0.80
Примечание: - повышение и снижение уровня мРНК, *- для каждого значения Р <0.01.
При оценке экспрессии этих генов в образцах НМРЛ (рис. 3 В и С) в качестве положительного контроля выбран ген каталитической субъединицы теломеразы
15
hTERT, для которого оценили уровень мРНК в 17-ти образцах HMPJI из той же выборки. В большинстве случаев экспрессия hTERT повышена, что согласуется с данными литературы о высоком содержании мРНК гена hTERT в опухолях, в частности HMPJ1 (Fujita et al, 2003). Эти результаты свидетельствуют об отсутствии опухолевого процесса в «условных нормах», что служит доказательством правомерности их использования в качестве образцов сравнения.
Ген RBSP3. Заметное (до 94 раз) и частое снижение экспрессии гена выявлено в 85% образцов АК и 94% - ПКРЛ, средние уровни падения экспрессии близки - 5 и 6 раз (рис. 3 С). В образцах АК с метастазами средний уровень мРНК гена RBSP3 ниже, чем в группе без метастазов (6.6 раза против 2.4, Р < 0.05).
Ген RB1. Частота снижения уровня мРНК гена (до 19 раз) составила 62% в случае АК и в 71% - ПКРЛ. Средний уровень мРНК гена в образцах АК с метастазами в 3 раза ниже, чем в группе без метастазов (5.3 против 1.7, Р < 0.05). Кроме того, обнаружена положительная корреляция между уровнями мРНК двух генов -значение коэффициента ранговой корреляции Спирмена rs составило 0.65 (Р = 0.02) для АК и 0.47 (Р = 0.05) для ПКРЛ, т.е. при НМРЛ обнаружено частое одновременное падение экспрессии двух генов-супрессоров RBSP3 и RB1. Таким образом, профили экспрессии двух генов резко отличались для рака почки и легкого, что предполагает различные механизмы регуляции.
2.2. Механизмы инактивации RBSP3 и RB1 при раке легкого и почки
Помимо делеций, важную роль в контроле экспрессии генов при канцерогенезе играет метилирование (Sharma et al, 2010), которое является частым механизмом инактивации генов-супрессоров и способствует злокачественной трансформации клеток. Анализ метилирования и/или делеций (М/Д) выполнен на Notl-микрочипах, содержащих клонированные геноспецифичные фрагменты ДНК хромосомы 3, с которыми гибридизовали меченые парные пробы (норма/опухоль, СуЗ/Су5), предварительно обогащенные Notl-сайтами (Li et al, 2002). Гибридизация ДНК выполнена для тех же образцов рака легкого и почки, в которых оценили экспрессию RBSP3. Согласно данным Notl-микрочипов у гена RBSP3 найдены М/Д в 45% (5/11) образцов АК, в 52% (14/27) - ПКРЛ и 29% (5/17) -скПКР. С помощью ПЦР-РВ и бисульфитного секвенирования в образцах АК с падением уровня мРНК гена обнаружены делеции в 25% и метилирование в 38% случаев, а в образцах ПКРЛ - делеции и метилирование в 50% случаев. Снижение экспрессии гена не связано с М/Д в 37% случаев АК и в 50% случаев ПКРЛ, что может быть вызвано другими причинами, например мутациями или микроРНК.
С помощью Notl-микрочипов у гена RBSP3 также обнаружены М/Д в других видах рака, причем частота этих нарушений заметно различается - от 15% для рака молочной железы до 71% для рака простаты. В образцах рака толстой
кишки и яичников показано, что частота падения экспрессии гена также выше, чем частота М/Д. Таким образом, метилирование и делеции играют роль в инактивации гена RBSP3 при раке, однако полученные оценки предполагают наличие других механизмов.
В разных гистологических типах рака легкого описаны потеря или делеции одного аллеля гена RBI, нонсенс мутации или частичные делеции другого аллеля, гиперфосфорилирование белка Rbl, а в некоторых случаях полное его отсутствие (см. обзор Osada et al, 2008). Метилирование промоторной области гена RB1, приводящее к его инактивации, в опухолях лёгкого отмечено редко (Di Fiore et al, 2013). Наши данные о падении его экспрессии не противоречат многочисленным данным литературы о снижении или полном отсутствии белка Rbl.
Для гена RB1, инактивированного в различных урологических опухолях, метилирование при раке почки не обнаружено, хотя другие гены-супрессоры, участвующие в сигнальном пути Rb гиперметилированы, например, р!б'^К4а и pl4ARF (Dulaimi et al, 2004, Hoffiman et al, 2011). На начальных стадиях скПКР обнаруженное нами заметное и частое повышение уровня мРНК гена RB1 возможно вызвано мутациями или дупликацией аллелей ДНК. В работе (Lai et al, 2006) при раке толстой кишки показано повышение экспрессии гена RB1, связанное в 38% случаев с умножением копий ДНК и повышением содержания белка. В этих случаях Rbl может выполнять другую роль, поскольку этот многофункциональный белок, помимо участия в регуляции клеточного цикла и апоптоза, играет роль в ре-моделировании хроматина, индукции старения, а также может выступать в качестве транскрипционного фактора (Di Fiore et al, 2013). В связи с этим активация экспрессии гена RB1 на начальных стадиях скПКР заслуживает отдельного исследования.
Согласно полученным данным, на последующих стадиях содержание мРНК RB1 и, вероятно, белка остается на уровне нормы, но поскольку при этом экспрессия RBSP3 снижена, то белок, скорее всего, не активен. Наши результаты согласуются с данными многих работ, в которых не обнаружено падения экспрессии гена RBI (Mamschke et al, 2011), а также показано присутствие белка Rbl на больших выборках образцов рака почки (например, Presti et al, 1996 Hedberg et al, 2004), в то время как гиперфосфорилирование Rbl определяли в 50% образцов, а геномные нарушения были редкими. Таким образом, нарушение экспрессии генов RBSP3 и RB1 при раке легкого и почки вызвано различными механизмами, при этом метилирование играет роль для гена RBSP3 в большей степени при HMPJI, чем скПКР, однако не играет заметной роли для гена RB1.
Учитывая достаточно высокую корреляцию между уровнями экспрессии этих генов в опухолях легкого, особенно АК, нельзя исключить их ко-регуляцию посредством других механизмов, например микроРНК. За последний год появились работы по исследованию роли микроРНК в регуляции клеточного
цикла, имеющие отношение к RBSP3 и RB1. Так, при острой миелоидной лейкемии RBSP3 является мишенью miR-100, которая может регулировать переход Gl/S {Zheng et al, 2012). Согласно TargetScan (http://targetscan.org/), miR-7 также может действовать как регулятор экспрессии RBSP3 и RB1, повышение уровня которой зависело от стадии НМРЛ {Duncavage et al, 2010).
Известно, что около 40% всех микроРНК расположено внутри интронов (Kim et al, 2009). Недавно показано, что в интронах генов SCP семейства малых CTD-фосфатаз {CTDSP1/2/L) расположены микроРНК семейства miR-26(a,b), которые также могут принимать участие в регуляции клеточного цикла (Zhu et al, 2012). Эти
Рис. 4. Упрошенная схема ключевых белковых взаимодействий в сигнальном пути №.
Светло-зеленый цвет показывает гены, белки которых вносят остановку клеточного цикла, светло-розовый - способствующие прохождению клеточного цикла; зеленый - гены-супрессоры, розовый - протоонкогены. 1шЛ-26 могут проявлять как супрессорные, так и онкогенные свойства.
фосфатазы и их микроРНК вместе и отдельно могут блокировать переход G1/S посредством дефосфорилирования белка Rbl. В модельных системах in vivo и in vitro, благодаря miR-26-связывающим сайтам в РНК-мишенях, эти микроРНК снижали экспрессию генов циклин-зависимой киназы CDK6 и циклинов CCND2, CCNE1, CCNE2, белковые комплексы которых инактивируют Rbl. В свою очередь, CTDSPL/1/2 непосредственно дефосфорилировали Rbl. В первичных опухолях печени падение экспрессии miR-26(a,b) и/или CTDSPL/1/2 коррелировало с усилением экспрессии генов CDK6 и CCNE1. Эти результаты подтверждают наши
данные о важной роли гена RBSP3/CTDSPL в качестве гена-супрессора и нового звена в регуляции клеточного цикла.
В отличие от HMPJI, падение экспрессии гена RB1 не обнаружено при скПКР. На фоне интактной или повышенной экспрессии RB1 основными механизмами дерегуляции пути pl6ink4A-Cdk/cyclin-Rb скорее всего является гиперфосфорилирование Rbl, осуществляемое комплексами циклина D1 и киназ CDK4, CDK6 наряду с падением экспрессии супрессоров р21 и р27 {Park et al, 2003). Нельзя исключить другие механизмы, осуществляемые через опосредованное участие микроРНК, например тех же miR-26, обладающих супрессорными и онкогенными функциями (Zhu et al, 2012).
На схеме (рис. 4) нами представлена лишь небольшая часть взаимодействий разных участников клеточного цикла при HMPJI. Наряду с известными фосфатазами РР1 и РР2А, в схему нами включены два новых звена: 1) фосфатаза RBSP3/CTDSPL, способная активировать Rbl; 2) miR-26al с супрессорными и онкогенными свойствами, для которой RBSP3 является геном-хозяином. Можно предположить, что miR-26al может также приводить к накоплению активной формы Rbl при HMPJ1, хотя и опосредованно. При этом нельзя исключить участия двух других фосфатаз семейства SPC и их микроРНК (miR26b/a2) с опухоль-подавляющей активностью, осуществляемой с помощью двух различных молекулярных механизмов в системе защиты клетки от злокачественной трансформации. Для подтверждения или опровержения этой гипотезы требуются дальнейшие исследования.
3. Дифференциальная экспрессия гена CHL1 (Зр26) в наиболее распространенных видах рака
Ген CHL1 (close homolog of LI, CALL, cell adhesion Ll-like, 3p26.3), открытый при изучении генов в связи с задержкой умственного развития у пациентов с Зр-синдромом (Angeloni et al, 1999), кодирует трансмембранный белок, вовлеченный в процессы, связанные с умственной деятельностью, заболеваниями нервной системы, а также канцерогенезом. Белок CHL1 отвечает за распознавание нейронов и, возможно, вовлечен в процесс трансдукции сигналов.
Развитие рака яичников, предстательной железы, толстой кишки, меланомы может сопровождаться изменением экспрессии и функций CHL1 ( Wei et al, 1998, Ross et al, 2000). Поскольку ген расположен в одном из районов частых делеций Зр, в ряде работ CHL1 был отнесен к потенциальным генам-супрессорам опухолевого роста.
3.1. Анализ нарушений экспрессии гена CHL1 в 19-ти видах рака на микрочипах Clontech
Оценка экспрессии гена CHL1 выполнена с помощью микрочипов (Cancer Profiling Arrays I, II Clontech, США) на большой выборке кДНК образцов (486) из первичных опухолей (включая 90 - метастатических и 12 метастазов) и нормальных
тканей (рис. 5 А и Б). Результаты статистического анализа суммированы в табл. 3. Частое статистически значимое падение (48-75%) уровня мРНК гена СНИ выявлено при раке молочной железы, толстой кишки, прямой кишки, щитовидной железы, почки и тонкого кишечника. Для опухолей желудка, мочевого пузыря, А)
Оуагу
¡9 29 23 14
,,;. ___ ш*
Ж
К»! »еу МееШШ Т!|,гЫ(1 31 XI 35 ЗА «
ФФ * *
■ *
• • •
, »
Е'.ЗтК.ч т
?>гйа||
- ИШ
Б)
В)
• • *
'Ж;
т
„ **
ШлМ«-19М V*!.* .«34 37»
- * - ■ * и
•|«Ла Т.ч. ' * *
« ' *г/
... # - * - - ф* ;
— # • • • *
*
молочная железа
прямая кишка
Рис. 5. Результаты анализа экспрессии гена СН1.1 на микрочипах I (А) и II (Б) СЫотес11. Т — опухоль, N — норма, М -метастаз4 по оси X: внизу - N и Т, наверху -виды рака и номера рядов; по оси У: справа и слева координаты пятен. (В) - образцы (Т, N. М) от одного пациента показаны в увеличенном виде.
вульвы, поджелудочной железы, а также меланомы отмечена та же тенденция.
Повышение уровня мРНК гена CHL1 с частотой 20-100% отмечены для опухолей яичников, матки, лёгкого, печени, кожи, предстательной железы, шейки матки и трахеи, но статистически значимо только для рака лёгкого. Значимое падение экспрессии гена наблюдали чаще в образцах с метастазами, чем без них, в опухолях желудочно-кишечного тракта: толстой (36% и 83%) и прямой кишки (31% и 75%), а также желудка (28% и 59%). Та же тенденция отмечена для рака яичников (19% и 60%). В отдельных случаях уровень экспрессии гена CHLl повышен в образцах метастатических опухолей (желудка, лёгкого, трахеи, яичника и матки). Для опухолей матки и яичников отмечена достаточно близкая суммарная частота снижения и повышения уровня мРНК гена CHL1 (табл.3). Полученные данные согласуются с немногочисленными данными литературы, где ген CHL1 рассматривали как один из потенциальных генов-супрессоров в районе частых делеций Зр26 ( Wei et al 1998; Rokman et al, 2005), однако, для некоторых форм рака (например, яичников) показано повышение его экспрессии и сделан вывод, что CHLl не подходит на роль гена-кандидата (Manderson et al, 2009). Экспрессия гена CHLl (т.н. ре-экспрессия) нами впервые обнаружена непосредственно в метастазах (в 4-х из 12-ти) на фоне ее снижения в первичных опухолях яичников, Таблица 3. Частота нарушений экспрессии гена CHLl (%) в разных видах рака.
Вид рака Образцы без метастазов Образцы с метастазами *Р Все образцы **р
i Т 1 т 1 т
Молочная железа 64 (25/39) 13 (5/39) 83 (20/24) 4 (1/24) 0.25 71 (45/63) 10 (6/63) <0.01
Толстая кишка 36 (13/36) 11 (4/36) 83 (10/12) 8 (1/12) 0.01 48 (23/48) 10 (5/48) <0.01
Прямая кишка 31 (5/16) 6 (1/16) 75 (9/12) 8 (1/12) 0.05 50 (14/28) 7 (2/28) <0.01
Желудок 28 (5/18) 17 (3/18) 59 (10/17) 29 (5/17) 0.02 43 (15/35) 23 (8/35) 0.13
Щитовидная железа 58 (7/12) 19 (3/12) 100 (4/4) 0 (0/4) 0.30 69 (11/16) 19 (3/16) 0.01
Легкое 18 (4/22) 64 (14/22) 33 (1/3) 67 (2/3) 0.65 20 (5/25) 64 (16/25) <0.01
Почка 70 (16/23) 18 (5/23) 100 (5/5) 0 (0/5) 0.36 75 (21/28) 18 (5/28) <0.01
Тонкая кишка 60 (3/5) 20 (1/5) 75 (3/4) 0 (0/4) 0.64 67 (6/9) 11 (1/9) 0.05
Примечание: снижение, повышение. Параметр *Р характеризует различия между образцами си без метастазов, рассчитан с помощью критерия х2. **Р характеризует различия между группами опухолевых образцов и условных норм, рассчитан с помощью точного теста Фишера.
толстой кишки и молочной железы (рис. 5 В). Результаты микрочипов выборочно подтверждены методом ПЦР в реальном времени для РМЖ и скПКР (табл. 4). Таблица 4. Сравнение результатов, полученных с помощью мнкрочипов н ПЦР-РВ.
Локализация опухоли Характер изменений Частота изменений уровня мРНК, %
Микрочипы ПЦР-РВ
молочная железа повышение 11 (7/61) 22 (5/23)
снижение 75 (46/61) 61 (14/23)
почка повышение 13 (3/23) 3 (1/30)
снижение 78 (18/23) 87 (26/30)
3.2. Анализ экспрессии генов семейства молекул клеточной адгезии L1 и других онко-ассоциированных генов различных семейств при раке почки и легкого
Как уже отмечено, ген CHL1 является близким гомологом основного гена семейства L1CAM. Повышение экспрессии гена L1CAM в нормальных и раковых клетках может способствовать подвижности клеток, увеличению скорости их роста, онкогенного и метастатического потенциала (Raveh et al, 2009). Известно, что цитоплазматическая часть трансмембранного белка CHL1 может взаимодействовать с цитоскелетом клетки (Wei et al, 1998), участвуя в формировании филоподий и способствуя тем самым активной миграции опухолевых клеток и дальнейшей инвазии опухоли (Machesky et al, 2009).
Рис. 6. Схема взаимодействий белков суперсемейства LI: CHL1, NrCAM, NFASC.
Л '»
Роль белка CHL1 в процессе канцерогенеза может быть схожа с ролью L1, взаимодействующего с актиновым комплексом клетки (Husemann et al, 2008). Учитывая эти данные можно предположить, что близкие аналоги L1CAM и CHL1, а также гены других рецепторов семейства L1, ответственные за межклеточное узнавание, при различных видах рака могут играть двойственную (супрессорную и
онкогенную) роль.
Согласно Reactome (Croft et al, 2010) гены семейства LI могут взаимодействовать с белками различных
семейств, которые
способны проявлять
супрессорные или
онкогенные свойства в различных видах рака (рис. 6). Для анализа экспрессии генов в образцах скПКР нами выбраны все члены семейства LI - L1CAM, СНЫ, NFASC, NRCAM и функционально связанные с ними гены разных семейств (рис.6).
Рис. 7. Анализ экспрессии генов семейства И и генов разных семейств при светлоклеточиом раке почки (А, Б) и при немелкоклеточном раке легкого (В).
Эти гены, кодирующие ^САМ (СИТИб) интегрины {\TGA1, 1ЮА2, 1ЮА9, 1ТОВ1), нейропилин (ИРМ), анкирин (АИК1) и фосфобелок 1 (БТ1Р1). Так, контактен 6 (СИТИб) является геном-кандидатом при раке яичников (МапЛегхоп е1 а1, 2009). Для бета-интегринов показана ассоциация с агрессивностью опухолевых клеток и способности к метастазированию при различных видах рака, например при раке толстой кишки (Ье! е/ а1, 2011). Взаимодействие анкиринов с белком Т1АМ1 (по сигнальному пути Racl) способствует инвазии и метастазированию опухолей, в
частности, РМЖ {Bourguignon et al, 2000). Рецептор эндотелиального фактора ангиогенеза NRP1 обладает противоопухолевой активностью для рака лёгкого {Hong et al, 2007). Фосфобелок 1 (STIP1), индуцируемый стрессом, взаимодействует с белками теплового шока (HSPs) и может стимулировать пролиферацию раковых клеток яичников {Tsai et al, 2012).
Таблица 5. Частота и степень изменений уровня мРНК генов семейства 1Л н функционально связанных с ними генов при светлоклеточном раке почки.
Гены Среднее изменение, разы Частота событий, %
1 î ~
"L1CAM 19i(3.3*103l-3î) 85 (23/27) 4(1/27) 11 (3/27)
*CHL1 12|(3.0xl02i-2î) 85 (23/27) 4(1/27) 11 (3/27)
*NFASC 3J.(1.2xl02i-7î) 56(15/27) 4(1/27) 41 (11/27)
NRCAM 1.3î(35|-7î) 19(5/27) 30 (8/27) 52 (14/27)
ITGA1 1.6î(4|-4î) 13(2/15) 47 (7/15) 40 (6/15)
1TGA2 1.0 (8J.-2T) 13 (2/15) 13(2/15) 73(11/15)
ITGA9 1.6î(l-2î) 0(0/15) 20(3/15) 80(12/15)
ITG/S1 1.8î(2i-4î) 7(1/15) 47 (7/15) 47 (7/15)
NPRI 1.6T C64.-7Î) 13 (2/15) 47 (7/15) 40 (6/15)
CNTN6 1.8J. (20X-3T) 50 (7/14) 21 (3/14) 29 (4/14)
STIP1 Uî(l-4î) 0(0/15) 7(1/15) 93(14/15)
*ANK1 4T(13i-78T) 19(5/27) 63 (17/27) 19 (5/27)
Примечание: |> ~ — снижение, повышение и сохранение уровня мРНК генов. В скобках указан диапазон изменений.* — для 4-х генов Р < 0.01 (Критерий Уилкоксона).
В образцах рака почки обнаружено наибольшее сходство профилей экспрессии генов L1CAMи CHL1\ частое (85%) и сильное падение уровня мРНК - в среднем 19 и 12 раз, в отдельных случаях более 100 раз (рис. 7 А, Б и табл. 5). Для пар генов L1CAM, CHLl и NFASC показана положительная корреляция (rs = 0.42 - 0.67, Р < 0.01). Для гена NRCAM преобладает сохранение экспрессии, однако отмечены как случаи повышения экспрессии (доЮ-ти раз), так и редкое, но заметное падение (до 35-ти раз), в том числе в образцах с метастазами. Для генов других семейств преобладало сохранение {ITGA9 и STIP1) или дерегуляция экспрессии. Обнаружены положительные корреляции (rs = 0.39 - 0.81, Р < 0.05) между уровнями мРНК генов, кодирующих а- и Р- субъединицы интегринов {ITGA1, ITGA2, ITGA9, ITGB1) и нейропилин {NPR1). Наибольшее значение коэффициента корреляции показано для генов двух а-субъединиц интегринов - 1TGA1 и ITGA2. Для генов ITGA1, ITGB1 и NPRI показаны похожие экспрессионные профили. Самое заметное (до 78 раз, в среднем 4 раза) и частое (63%) повышение экспрессии показано для гена ANK1. Ген ANK1 (8р11.1) идентифицирован в районе частых амплификаций (умножение копий ДНК), в качестве потенциального онкогена при РЖМ {Adélaïde et al, 1995) и
принадлежит семейству анкиринов, которые связывают мембранные белки с цитоскелетом и играют важную роль в подвижности и пролиферации клеток.
«Молчание» трех генов семейства L1 и частое падение экспрессии гена иммуноглобулинового суперсемейства CNTN6 из одного геномного локуса с геном СНЫ (Зр26) на фоне повышения экспрессии генов ANK1, ITGA1, ITGB1 и NPL1 характерно для всех стадий. С учетом свойств белковых продуктов можно ожидать, что обнаруженные нарушения могут способствовать ослаблению межклеточных контактов, усилению подвижности клеток, миграции и инвазии при скПКР. На последней стадии заболевания в двух метастазирующих опухолях уровень мРНК генов L1CAM, CHLI и NFASC соответствует уровню нормы, что может указывать на смену их функций в результате прогрессии заболевания. Эти данные, а также высокий уровень мРНК гена NRCAM и ANK1 в образцах скПКР с метастазами, заслуживают отдельного исследования.
Для того чтобы оценить, насколько специфичны обнаруженные изменения экспрессии генов семейства L1 для опухолей почки, выполнили анализ их экспрессии в образцах двух основных гистологических типов HMPJI - АК и ПКРЛ (рис. 7 В). Самое частое падение экспрессии гена NFASC (около 90%) обнаружено в АК и ПКРЛ (табл. 6). У остальных генов СНЫ, NRCAM, L1CAM частота падения экспрессии тоже достаточно высокая (50-75%).
Таблица 6. Частота и средний уровень мРНК пяти генов при НМРЛ (АК и ПКРЛ).
Ген Частота снижений (%) / Средний уровень мРНК (разы)
АК ПКРЛ НМРЛ
ITGA9 75 (6/8) 44(364- 1)* 92(11/12) 94(704- 1)* 85 (17/20) 84 (704- 1)*
NFASC 88 (7/8) 64(254. - 1)* 92(11/12) 54(284- 1)* 90(18/20) 64 (284- 1)*
CHL1 50 (4/8) 1.91(351-1) 75 (9/12) 54(444- 1)* 65 (13/20) 3.54 (444- 1)*
L1CAM 50 (4/8) 2.34(114-4?) 58 (7/12) 2.24(94-5Î) 55(11/20) 2.24(114-51)
NRCAM 63 (5/8) 3.04(254-3Î) 67 (8/12) 2.94(194-4Î) 65 (13/20) 2.94 (254-4Î)
Примечание: Д.,Т - снижение и повышение уровня мРНК генов. В скобках указан
диапазон изменений. * - Р < 0.02 (критерий Уилкоксона).
Степень падения экспрессии генов семейства L1 в среднем не так значительна, как при скПКР, кроме гена NRCAM. Случаи повышения экспрессии L1CAM и NRCAM отмечены в нескольких образцах АК и ПКРЛ как на ранних стадиях заболевания, так и в метастатических опухолях. Следует отметить, что у генов ITGA9 и NFASC похожие экспрессионные профили, характеризующиеся наиболее частым (85% и 90%, соответственно) и значительным (до 10 и более раз) снижением уровня мРНК. Интегрины играют важную роль в ангиогенезе и метастазировании. Ген ITGA9 (3р21.3) кодирует а9 субъединицу, причем ITGA9 взаимодействует только с ITGB1,
25
образуя гетеромер a9ßl. Для гена ITGA9 показана супрессорная активность in vitro в клеточных линиях рака почки KRC/Y и легкого U2020 (Dmitriev et al, 2012). Известно, что потеря интегринов или их избыток сопряжены с высокой степенью злокачественности опухолей и метастазированием. Как видно на рис.7 В, в образцах HMPJI наблюдали заметное и частое падение экспрессии ITGA9, но не в образцах скПКР, где в 80% случаев изменений не наблюдали у этого гена.
Роль LI САМ в развитии и метастазировании рака легкого до недавнего времени была неизвестна. В работе (Tischler et al, 2011) экспрессия белка L1CAM обнаружена в 25% случаев ПКРЛ и 24% АК, которая коррелировала с инвазией кровеносных сосудов и метастазированием, а также показано, что LI САМ играет важную роль в стимулировании клеточной миграции, инвазии и метастазировании in vivo, что позволило авторам утверждать, что LI САМ - новая заслуживающая внимания терапевтическая мишень при HMPJI. Впервые выполненная нами количественная оценка экспрессии генов всех членов семейства LI и функционально связанных с ними генов различных семейств выявила важные закономерности и новые потенциальные мишени для таргетной терапии рака почки и легкого.
В работе (Long et al, 2013) показано, что ген CHL1 может быть мишенью miRlOa, негативно регулирующей его на уровне мРНК и белка, что сопровождается усилением клеточного роста, миграции и инвазии в цервикальных опухолях и клеточных линиях. Ресурс для микроРНК (http://www. mirnabodymap.org, выпуск 1.1) объединяет данные нескольких источников, включая TargetScan, miRDB, MicroCosm. Для микроРНК-182 предсказана возможность одновременной регуляции LI, CHL1 и NRCAM, согласно данным пяти ресурсов, а для NFASC -четырех. TargetScan 6.2 (http:// http://www.targetscan. org) показывает с высокой степенью предсказания для микроРНК-182 возможность регуляции LI САМ, CHL1 и NRCAM, но не NFASC. Ранее показана способность микроРНК-182 увеличивать злокачественность и агрессивность различных опухолей. Согласно нашим оценкам гены L1CAM, CHL1 и NFASC, но не NRCAM, обнаружили согласованное падение в 10-100 и более раз, что отражает исключительную управляемость этих процессов и вполне допускает участие микроРНК-182 в качестве общего регулятора, однако необходимы дополнительные исследования.
Таким образом, результаты позволяют рассматривать гены рецепторов клеточного узнавания семейства LI наряду с CHL1 важными онко-ассоциированными генами и предполагают их двойственную роль в канцерогенезе. В то же время, миссенс-мутации, затрагивающие внеклеточную часть кодируемых белков, могут обеспечить высокую эффективность узконаправленных терапевтических агентов для лечения различных форм рака даже на поздних стадиях заболевания, включая метастазы (Sjoblom et al, 2006).
4. Анализ нарушений генов на коротком плече хромосомы 3 в трех видах рака
Поскольку гомозиготные делеции были часто обнаружены в первичных опухолях различной локализации одновременно в двух критичных районах Зр -LUCA и АР20 (Р « 0.01), сделано предположение об одновременной инактивации генов-супрессоров при развитии и прогрессии РЛ и других видов (см. раздел 1). После идентификации группы генов при картировании гомозиготных делеций Е.Р. Забаровским и сотр. показана опухолеподавляющая активность in vitro и in vivo для ряда генов: RBPS3, RASSFl(A), NPRL2/G21, SEMA3B, SEMA3F, HYAL1, HYAL2, LRRC3B, ITGA9 (Zabarovsky et al, 2011). Выбранные нами гены для количественного анализа их экспрессии играют роль в важных биологических процессах, часто претерпевающих нарушения при канцерогенезе. В частности, белки RASSF1A, RBPS3 и NPRL2/G21 участвуют в регуляции клеточного цикла. Семафорины SEMA3B и SEMA3F подавляют ангиогенез в опухолях, конкурируя с VEGF за связывание с Np-рецепторами. Гиалуронидазы HYAL1 и HYAL2, APRG1, интегрин ITGA9 вовлечены в мембранные взаимодействия, клеточную адгезию и миграцию клеток, часто нарушаемых в метастатических опухолях. NPRL2/G21 также индуцируют апоптоз, VILL из семейства виллинов/гельзолинов связывает F-актин. Поскольку многие из них проявляют в различной степени супрессорную активность, можно предположить возможность функционирования локуса Зр21.3 в качестве протяженного района опухолевой супрессии, благодаря разнообразным функциям расположенных в нем генов и соответствующих белков, а также их одновременной инактивации в опухолях. Однако, в основных гистологических типах рака легкого, шейки матки и почки одновременный анализ экспрессии этих генов не проводился.
4.1. Одновременное падение экспрессии кластера генов-супрессоров при немелкоклеточном раке легкого
Рак легкого (РЛ) - самая распространённая неоплазия в мире с более 1 млн. новых случаев ежегодно (Parkin et al, 2005). Средняя 5-летняя выживаемость составляет 15% в США, 10% в Европе и 8,9% в развивающихся странах (Parkin et al, 2005). Плохой прогноз обусловлен тем, что 2/3 случаев РЛ выявляют при наличии метастазов (Brambilla et al, 2003). Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет примерно 80% от всех случаев, но это заболевание излечимо, если диагноз поставлен на ранних стадиях. Прежде, чем заболевание становится клинически очевидным, по крайней мере, несколько событий, возможно, имели место: активация прото-онкогенов, таких как туе, K-ras, EGFR, Her-2/neu, BCL-2 и инактивация генов-супрессоров р53, Rb, FHIT и р1б (Girard et al, 2000). Изменения, затрагивающие гены-супрессоры, обычно включают два основных события: а) потерю больших областей ДНК в одной хромосоме и б) мутации (например, точечная мутация, делеция или метилирование промотора второго аллеля (эпимутация). До сих пор, за небольшим исключением, большинство из известных онкогенов и генов-
супрессоров не нашли применения в диагностике и лечении рака, включая рак легкого (Sellers 2011).
В данной работе оценили уровень мРНК генов-супрессоров и генов-кандидатов в образцах ПКРЛ и АК (рис. 8). Показано заметное (от 2 до 100 раз) и частое падение уровня мРНК генов приАК- от 25% (VHL) до 92% (SEMA3B), а при ПКРЛ - от 71% (СНЫ) до 100% (RBSP3, SEMA3B, HYAL2). Обнаружены корреляции между уровнями мРНК в парах генов. Значения коэффициента корреляции Спирмена rs составили при этом 0.63-0.91 (Р < 0.001). Наибольшие значения rs обнаружены у пар генов ITGA9 и HYAL2, HYAL1 и HYAL2, что указывает на возможную корегуляцию этих генов. Кроме того, во всех образцах средний
пкрл
адк
Рис. 8. Изменение уровня мРНК генов при НМРЛ (АК в ПКРЛ). Разным цветом отмечены образцы без и с метастазами в регионарные лимфоузлы. Контрольные гены СЛР/Ж и ЛРЛ7.
уровень мРНК генов 1ТвА9, НУАЬ НУАЫ, НУАЬ2, БЕМАЗВ, СНЫ, белковые продукты которых участвуют в клеточной адгезии и взаимодействиях клеток с внеклеточным матриксом, заметно ниже, чем у ЯВБРЗ, ИРШ2Ю21, ЯАББРМ, белковые продукты которых участвуют в регуляции клеточного цикла: 3-7 против 11-12 раз при АК и 5-6 против 10-15 раз при ПКРЛ.
4.1.1. Связь инактивации генов-супрессоров двух областей Ар20 и ШСА с прогрессией заболевания
АК. Обнаружена зависимость разнонаправленных изменений экспрессии ряда генов от степени дифференцировки и злокачественности опухолевых клеток. Так, повышение уровня мРНК в 3-8 раз у генов ИРНЬ2/С21, НАЗЗПА и НУ АН в образцах АК (№ 1, 3, 6). Эти опухоли характеризовались высокой степенью Таблица 7. Частота снижений и средний уровень мРНК генов при НМРЛ (АК и ПКРЛ).
Частота снижений (%) и средний уровень мРНК генов (разы)
Ген АК ПКРЛ АК ПКРЛ
метастазы (-) (+) метастазы (-) (+)
аряс!/ С30г/35 75 (3/4) 31(1-181) 75 (3/4): - 31(1-51) 100 (4/4) 101(91-321) 88 (7/8) 91(1-321)* : 75 (6/8) 31(1-181)* : 92(11/12) ■■ ■■■.; 10К1-321)» :
х Р > 0.05*« Р - 0.02 |
1ТвЛ9 57 (4/7) 2|(2Т-4» : 83 (5/6) : »1(1-361 )• 100 (6/6) 10Ц51-361)* 91(10/11) 81(1-701)» /: 69 (9/13) 2Ц2Т-36П* 94(16/17) -91(1-701)«
Р < 0.05 Р - 0.29 Р-0.01 I
ЯВЯРЗ/ СТОЯРЬ 71 (5/7) 31(1-61)* 100(6/6) 7К21-26Ц« 100 (6/6) 61(31-81)* 100(11/11); 41(21-941)« 85(11/13) 31(1-261)* : 100(17/17) : ; «1(21-941)* :
Р < 0.05 Р = 0.58 Р - 0 23 |
VIи 14(1/7) кзт-зп Г 50(3/6) : 21(1-431) 83 (5/6) 31(1-191)* : 82(9/11) : 31(1-341)« : 31 (4/13) кзмзп 82(14/17) ■-: 31(1-341)* :
Р > 0.05 Р = 0.80 Р - 0.01 |
8ЕМАЗР 71 (5/7) 31(1-61)» : 83 (5/6) 514-221)* 83 (5/6) 31(1-61)* : 64(7/11) 31(1-201)« 77(10/13) 31(1-221)« 71 (12/17) 31(1-201)« :
Р > 0.05 Р = 0.96 Р = 0.69 |
ЯЕМАЗИ 86 (6/7) 31(1-1001)« 100(6/6) 191(101-361)* 100(6/6) 1 100(11/11) 191(71-28»* | 141(21-2821)« 92(12/13) 101(1-1001)* 100(17/17) 151(21-2821)»
Р < 0.05 Р = 0.45 Р = 0.39 |
ПУАЫ 43 (3/7) 2Г(8Т-91) 83 (5/6) 81(1-930« : 83(5/6) 1 100(11/11) 81(1-251)* [ 81(31-771)*, 62 (8/13) 61(81-931) 94(16/17) 81(1-771)*
Р < 0.05 Р = 0.88 Р = 0.25 |
НУАи 71 (5/7) 31(1-81)' 100(6/6) 51(21-201)* 100(6/6) | 100(11/11) 101(21-531)* | 7.(21-52;)* 85(11/13) 41(1-201)« 100(17/17) 71(21-531)* :: ;
Р > 0.05 Р = 0.73 Р - 0.05 |
л-т« 29 (2/7) 1(61-51) : 100(6/6) 7К31-2Ц)* 67(4/6) I 91 (10.11) ИС1-81) Г 6.(1-57;)* 62(8/13) ЗК6Т-2Ц)« 82(14/17) : : : 3.(1-571)«
Р < 0.05 Р - 0.05 Р = 0.57 |
КРЯ1.2 29 (2/7) 1(ЗГ-21) 83 (5/6) 31(1-61)« 100 (6/6) 41(31-151)« 91(10/11) 51(1-201)* 54(7/13) 21(31-61) 94 ()6/17) 51(1-201)* : ,
Р < 0.05 Р = 0.96 Р < 0.01 1
УИЬ изоф. 1 0 (0/3) 1(1-1) 100(1/1) ■-.......31..:.. : 100 (3/3) 41(31-41) 67(4/6) 4.('.-<> И* 25(1/4) Ц1-31) : 78 (7/9) 4Ш-61)* ;
* Р - 0.05 |
Примечание: В скобках рядом с средним значением уровня мРНК указан диапазон изменений; 4.» Т — снижение и повышение уровня мРНК; * - Р < 0.05, критерий Уилкоксона. ** — Р-параметр, характеризирующий статистическую значимость различий сравниваемых групп (с метастазами и без АК и ПКРЛ; АК и ПКРЛ), критерий Манна-Уитни. * - выборка слишком мала для расчетов.
дифференцировки, в отличие от образцов (№ 2, 4, 9, 10) с низкой степенью дифференцировки клеток и высокой степенью злокачественности. Степень анаплазии этих клеток настолько выражена, что с трудом выявлялись признаки эпителиальной
дифференцировки и клетки напоминали герминогенные. Показана связь нарушений экспрессии (частоты и среднего уровня мРНК) 6-ти генов 1TGA9, RBSP3, SEMA3B, HYALl, RASSF1A и NPRL2/G21 с прогрессией AK (Р < 0.05), ту же тенденцию наблюдали у генов HYAL2 и VILL (рис. 8, табл. 7).
ПКРЛ. Исключительно частое и значительное падение экспрессии, характерное для большинства генов, отмечено уже на ранней стадии и на последующих стадиях ПКРЛ, которое не зависело от степени дифференцировки опухолевых клеток клинической стадии, наличия метастазов в регионарные лимфоузлы, а также клинической стадии заболевания. В отличие от АК, только для одного гена RASSFl(A) частота и степень падения уровня мРНК коррелирует с прогрессией ПКРЛ (Р<0.05).
АК и ПКРЛ. Профили экспрессии анализируемых генов отличались у 6-ти из них: APRG1, NPRL2/G21, ITGA9, VILL, HYAL2 и VHL (Р<0.05), ту же тенденцию наблюдали у генов RBSP3 и HYAL1 (табл. 7). Как уже отмечено выше, в первую очередь это различие обусловлено разнонаправленными изменениями экспрессии этих генов на начальных стадиях. Исследования, основанные на таком подходе, позволят разработать новые оптимальные наборы генов для дискриминации двух гистологических типов НМРЛ. Эта проблема стоит особенно остро из-за актуальности точной диагностики АК и ПКРЛ, т.к. ошибочный диагноз и выбор терапии может привести к серьезным осложнениям или стоить пациенту жизни (.Russell etat, 2011; Fischer et al, 2011).
Таким образом, впервые показано, что гены двух критичных областей кластеризованы не только позиционно (3р21.3), но и функционально. Координированное изменение экспрессии функционально связанных генов свидетельствуют в пользу ранее предложенной гипотезы об одновременной инактивации генов-супрессоров при раке легкого. Кроме того, ряд генов вовлечен в прогрессию НМРЛ, которая сопровождается количественными изменениями уровня и частоты их экспрессии, что, несомненно, имеет перспективы для клиники.
4.1.2. Анализ частоты метилироеания/делеций для генов хромосомы 3 с применением Notl-микрочипов
Одновременный анализ метилирования и/или делеций (М/Д) для всех 180-ти генов хромосомы 3, имеющих Notl-сайты, выполнен методом сравнительной гибридизации ДНК на Notl-микрочипах на той же выборке образцов НМРЛ, для которой выполнен анализ экспрессии в предыдущем разделе (рис. 9). Обнаружено 40 генов с частотой М/Д более 15%, наряду с генами-супрессорами опухолевого роста VHL, RBSP3, 1TGA9 и др., для многих генов связь с канцерогенезом показана впервые СRPL32, LÖC285205, FGD5 и др.).
АК и ПКРЛ. Паттерны М/Д многих генов различны для АК и ПКРЛ, у трех генов (СвввР!, /0ЖС7 и ТЯН) это различие статистически значимо (Р = 0.02, 0.04 и 0.05, соответственно). Различие в паттернах М/Д у 24-х генов с такой тенденцией
ПКРЛ АК
без метастазов
гл г-
без метастазов ме тастазы
1QSECI
CORASI'I ТТС21А NKIRASI/RPLI5
ШШ>5/СЗог(77 RBSP3 (CTDSPL) NBEAL2 LRRN1 ITGA9 FOX PI CGGBP1 LRRCÎB gata: UBE2E2 GNA12
ROPNl/KALRN VHL FBLN2 LOC2H5205 TR 11
RPL32/1QSEC1 \ИШ7А ~ GATA 2 \LOC285375 FGD5 iMITF \EPHB! 7-1С4 LMCDI
NEK.il/NUDT16 PAOR9 GPR149 PLCL2 THRB В H LHE 41) PRICKLE2 ALDIULI К Y
PPP2R3A ANKRD2K ROBO1 MISA BCL6 FGFI2
Рис. 9. Результаты гибридизации ДНК на микрочипах для рака легкого (АК и ПКРЛ). По
вертикали слева - номера Notl-сайтов с убывающей частотой М/Д (от 58% до 15%); справа -обозначения соответствующих генов. По горизонтали - образцы HMPJI (28 ПКР и 12 АК).
было очевидным - 44% для ПКРЛ и 17% для АК (Р < 0.01). Важно, что основной вклад в это различие вносила группа АК без метастазов, а группа АК с метастазами была ближе к двум группам ПКРЛ.
АК. Многие гены показали увеличение частоты М/Д с прогрессией АК. Самое сильное различие наблюдали в образцах без и с метастазами для 12-ти генов WNT7A, UBE2E2, FGD5, LRRC3B, FGF12, RPL32, THRB, ABHD5, C3orf77, LRRN1, 1QSEC1, RBSP3, но только для двух генов WNT7A и UBE2E2 - статистически значимо (Р< 0.05). Если принять во внимание все гены с той же тенденцией (всего 21 ген), то это
различие становится очевидным: частота М/Д возрастает от 5% в образцах без метастазов до 49% случаев в группе с метастазами (Р < 0.01).
ПКРЛ. Количество генов, вовлеченных в прогрессию ПКРЛ, значительно меньше, чем АК. Гены VHL, GORASP1, ТТС21А, FOXP1 и LRRN1 показали тенденцию к увеличению частоты М/Д, а для группы всех пяти генов различие между образцами с и без метастазов статистически значимо (Р<0.01). Кроме того, впервые обнаружены одновременные нарушения (М/Д) у более 20-ти генов (т.н. фенотип CIMP+, CpG island methylator phenotype) - в 39% (И/28) образцов ПКРЛ (№ 2, 6, 8,9, 11, 12, 13, 16, 17, 21, 26) и в 17% (2/12) образцов АК (№ 39, 40, рис. 9).
4.1.3. Подтверждение данных микрочипов методом ПЦР в реальном времени
Для десяти генов с высокой частотой М/Д из разных критичных районов, включая Зр21.3, FOXP1 (Зр14); RBSP3/CTDSPL, GNA12 и ITGA9 (3р.21.3); FGD5, IQSEC1 и VHL (Зр25), LRRN1 (Зр26), ALDHlLl(iq2\) и BCL6 (3q27) выполнена оценка экспрессии в тех же образцах НМРЛ (рис. 10, табл. 8). В общем, уровень в образцах ПКРЛ снижен чаще и сильнее, чем в образцах АК. В образцах ПКРЛ падение экспрессии наблюдали в 70% случаев уже на первой стадии, но только в 45% случаев АК. В образцах метастатических аденокарцином 7 генов из 10-ти, кроме LRRNI, FGD5 и ALDH1L1, характеризовались более высокой частотой и
лоскоклеточныи рак легкого
1QSEC1
FGD5 ALDH1L1
Аденокарцинома легкого
Рис.10. Оценка экспрессии генов методом ПЦР-РВ в образцах рака легкого (ПКРЛ и АК).
степенью падения экспрессии по сравнению с образцами без метастазов (для генов ЯВЗРЗ и 1ТСА9, Р < 0.05). Для 5-ти генов /£>ЖС7, РОХР1 ЬМЫ1, и ВСЬб
также обнаружена связь с прогрессией ПКРЛ (Р<0.05). Для гена ТО О 5 на расширенной выборке образцов ПКРЛ средний уровень мРНК упал с 5 до 21 раза в образцах с метастазами (Р<0.01). Случаи повышенного уровня экспрессии у нескольких генов обнаружены в образцах АК с высокой степенью дифференцировки.
Таблица 8. Сравнение данных 1ЧоИ-микрочипов и ПЦР-РВ для 10-ти генов при АК и ПКРЛ.
Гены Рч'оИ-мчкрочипы ПЦР-РВ
частота метилирования/ делеций частота падения уровня мРНК, % средний уровень мРНК (разы)
АК ПКРЛ А К ПКРЛ АК ПКРЛ
10$ЕС1 33 (4/12) 68 (19/28) 90(9/10) 92(11/12) 54 (1 - 124) 84 (1 - 1144)
СТЭВРЪ 42 (5/12) 50 (14/28) 78 (7/9) 91 (10/11) 31(1-264) 44 (1 - 134)
1ТОА9 33(4/12) 50(14/28) 67 (6/9) 100(11/11) 34(2Т-361) 114 (34- 364)
ГОХР1 42 (5/12) 46 (13/28) 78 (7/9) 82(9/11) 34(41-154) 64 (1 - 154)
33 (4/12) 50(14/28) 30(3/10) 70 (7/10) И8Т-134) 24 (1 -324)
вШ12 25(3/12) 43 (12/28) 70 (7/10) 83(10/12) 34 (зт-134) 34(1-114)
УНЬ 17(2/12) 39(11/28) 50 (2/4) 67 (3/9) 24 (1 -84) 34 (1-94)
25(3/12) 29 (8/28) 67 (6/9) 86 (6/7) 54 (1-294) 84(54 - 444)
люты 8(1/12) 25 (7/28) 50 (3/6) 38(3/8) 34(34-104) 24(24-94)
ВС16 8(1/12) 18 (5/28) 70 (7/10) 67 (8/12) 44 (1 -3564) 44(1 - 164)
Примечание: 4»Т " уровень снижения и повышения мРНК, в скобках диапазон изменений.
Таким образом, для генов-кандидатов с высокой частотой М/Д отмечены те же закономерности изменения экспрессии в образцах АК и ПКРЛ, что и для генов-супрессоров опухолевого роста локуса 3р21.3 (рис.10). Кроме того, для ряда генов показана связь с прогрессией с помощью двух методов (Мо11-микрочипов и ПЦР-РВ), например, РОХР1, ЬЯШ1 при ПКРЛ, КВ8РЗ, 1()8ЕС1 при АК. Совокупность полученных данных позволяет считать новые гены, обнаруженные с помощью чипов, потенциальными генами-супрессорами, которые играют важную роль в развитии НМРЛ. Частота падения уровня мРНК практически всех генов выше, чем частота М/Д как для АК, так и ПКРЛ (табл. 8), что предполагает другие механизмы инактивации исследуемых генов, помимо двух основных — делеций и метилирования.
4.2. Геномная и эпигеномная нестабильность района 3р21.3 при РШМ
Рак шейки матки (РШМ) - одна из наиболее распространенных в мире причин смертельных случаев рака среди женщин. Известно, что возбудителями РШМ являются вирусы папилломы человека высокого риска (НРУ 16 и 18). Цервикальный плоскоклеточный рак (ПКР) составляет 80-85% выявляемых случаев РШМ. Разработка молекулярных тестов для цервикальных цитологических исследований с целью выявления женщин с повышенным риском возникновения РШМ предполагает поиск новых биомаркеров для обнаружения атипичных цервикальных клеток и пораженных сигнальных путей. Как обсуждалось в разделе 2, область 3р21.3 содержит «горячие» участки с частыми делециями при РШМ, однако всесторонний
анализ статуса метилирования генов-супрессоров хромосомы 3 при РШМ до недавнего времени отсутствовал.
4.2.1. Анализ частоты метилирования/делеций генов на Notl-микрочипах
Результаты анализа М/Д на Notl-микрочипах, выполненного для 48-ми образцов двух гистологических типов РШМ (АК и ПКР), показаны на рис. 11. Обнаружено 30 генов с высокой частотой М/Д, причем паттерны изменений отличались для АК и ПКР, а нарушения в ПКР были чаще, чем в АК (Р< 0.01). Среди генов с частыми М/Д некоторые из них известны как гены-супрессоры и гены-кандидаты, например VHL, RBSP3/CTDSPL, ITGA9, ALDH1L1, EPHBI и LRRC3B. Для ряда генов ранее не была известна связь с канцерогенезом (ABHD5, C3orf77, PRL32, LOC285375, FGD5 и др.), однако, согласно нашим результатам, многие из них также вовлечены в развитие НМРЛ (ЮС285205, ROPN1, CGGBP1, NBEAL2 и др.).
Паттерны М/Д цервикальных ПКР и АК различны для многих генов (рис. 11). Однако, только для двух генов PPP2R3A и LRRN1 это различие статистически значимо. Если принять во внимание все 22 гена, показывающие, по крайней мере, тенденцию к различию паттернов М/Д для двух гистологических типов РШМ, это различие становится очевидным: средняя частота М/Д выше для ПКР, чем для АК (37% против 5%, Р<0.01).
Несмотря на общее снижение случаев заболевания, вклад АК по сравнению с вкладом ПКР устойчиво повышается во многих странах, особенно среди молодых женщин. Это может быть обусловлено трудностями обнаружения АК во время скрининга РШМ: аденокарциномы часто диагностируют уже на поздних стадиях заболевания (Seoud et al, 2011). В связи с этим дальнейшая разработка наборов генов, позволяющих отличить ПКР и АК, могла бы быть полезна для анализа метилирования, основанного на ПЦР или ПЦР в реальном времени, на ранних стадиях заболевания.
Одновременные нарушения (М/Д) обнаружены у более 20-ти генов в 23% (9/39) тестируемых образцов ПКР. Большинство их них расположено на коротком плече хромосомы, включая гены «горячих» районов Ар20 и LUCA (рис. 11, образцы 11, 17, 20, 25, 27, 38, 42, 47 и 48). Среди них только некоторые известны как гены-сз'прессоры и гены-кандидаты, а для ряда генов (например, ЮС285205, ROPN1, CGGBP1, NBEAL2 и др.) связь с РШМ показана впервые. Одновременное метилирование CpG-островков многих генов в опухоли (т.н. фенотип CIMP+, CpG island methylator phenotype) отражает эпигеномную нестабильность Зр и является характерной особенностью части HPV-позитивных цервикальных ПКР. Ранее гиперметилирование некоторых генов идентифицировано не только при РШМ, но и в предшествующих раку состояниях, т.е. анализ этих молекулярных событий может быть полезным для цитологического скрининга и диагностики РШМ на ранних стадиях (Lendvai et al, 2012).
11 13 15 17
ИКР
14 21 23 25 27 29 .31
35 37 34 41 43
лкял / гни К11:
1ТЦ, I1
/ Л7'Ш
(юШг! ТТ( .1
ШШГ! Ш1В1
иШ1)У(м1>Г~ /К 4 (\ЛГ\ I «/•::/.:
г/ш ПК
ггг;кх1
КЦ1'\1 к..
( Уш-ил О
ККчч.и ЩРМРГП, гш.\:
nx.il:
А/Л I
т /о
**#******
- оорашы с мстастами
Рис 11. Результаты гибридизации ДНК на микрочипах для двух основных гистотипов рака шейки матки. По вертикали слева - номера 41 ЫоЦ-сайта хромосомы 3, справа - обозначения генов, расположенных по убыванию частоты метилирования /делеций (от 44% до 15%). По горизонтали - номера 48-ми образцов РШМ (9 АК и 39 ПКР).
Белковые продукты генов, обнаруженных с помощью Мо1:1-микрочипов, вовлечены в пути, часто нарушаемые при канцерогенезе, например: в сигнальном пути \\ПЧТ, регулирующем эмбриогенез, дифференцировку клеток и развитие злокачественных опухолей (РОгЯЮ), в регуляции клеточной полярности и инвазии (РШСКХЕ2), в регуляции актинового цитоскелета (Р005), в сигнальном пути МАР-киназы (РСР12). Некоторые из них являются транскрипционными факторами, вовлеченными в регулирование апоптоза (ВНЬНЕ40) и тканеспецифичную экспрессию (РОХР1). Функции некоторых белков до сих пор неизвестны, например LRR.N1, ЦЖСЗВ и СЗогЛ7. Высокая частота М/Д, наряду с падением экспрессии генов, участие в сигнальных путях, затронутых во многих видах рака, а согласно нашим данным в НМРЛ, РШМ и скПКР, свидетельствуют в пользу супрессорных функций белковых продуктов этих генов.
Два гена и ЗОХ14 имели нарушения только при РШМ. Р02В.Ю
кодирует убиквитин-протеин-лигазу ЕЗ, которая играет важную роль в регуляции
35
синтеза белка MUSK, специфичного для скелетной мышцы рецептора тирозин-киназы. Ген SOX14 из семейства транскрипционных факторов вовлечен в регуляцию эмбрионального развития и определение судьбы клетки. Нарушения в этих двух генах указывают на специфические пути развития РШМ, не задействованные в других видах рака.
4.2.2. Уточнение результатов Notl-чипов другими методами
Анализ статуса метилирования выборочно для 7-ми генов с высокой частотой М/Д (27-44%) выполнен с помощью бисульфитной конверсии ДНК с последующим секвенированием (Каролинский Институт) в 23-х образцах ПКР. Среди них были
Таблица 9. Результаты анализа статуса метилирования бисульфитиым секвенированием генов, для которых обнаружены М/Д иа Notl-микрочипах при РШМ.
Ген Метилированные образцы Неметилированные образцы
LRRN1 17, 22, 37 42
ITGA9 13, 17, 20, 26, 27, 37 -
LRRC3B 17 -
NK1RAS1 - 17
VHL 17, 42 15
RBSP3 13, 20, 22,36, 47 17
FGF12 17,42 -
Примечание: нумерация образцов аналогична рис. 9.
гены-супрессоры - VHL, RBSP3 и ITGA9, и гены-кандидаты - LRRC3B, NKIRAS1, LRRN1 и FGF12. Метилирование CpG островков подтверждено в большинстве образцов (19 из 23, 83%) кроме четырех случаев: LRRN1 (№ 42), NKIRAS1 (№ 17), VHL (№15) и RBSP3 (№ 17) (рис. 11 и табл. 9). Согласно данным ПЦР-РВ, делеции - основной механизм инактивации гена NK1RAS1 (Gerashchenko et al, 2010). Возможно, HD имели место и для трех других случаев, в которых не обнаружено метилирование, хотя нельзя исключить потерю Notl- сайтов в результате мутаций. Таким образом, результаты двух методов хорошо согласуются между собой и показывают, что метилирование - частое событие для многих генов хромосомы 3 при раке шейки матки.
4.2.3. Одновременное падение экспрессии генов района 3р21.3 - RBSP3, ITGA9, VILL, APRGl/C3orß5 и RASSFIA
Принимая во внимание частые М/Д у многих генов на Зр (рис.11), можно предположить, что области геномной и эпигеномной нестабильности будут сопровождаться падением экспрессии генов. Причем у соседних генов без Notl-сайтов экспрессия также может быть снижена за счет метилирования в CpG-островках их промоторов. Чтобы оценить частоту одновременного падения экспрессии генов области 3р21.3, сравнили уровни мРНК нескольких генов в образцах ПКР. В анализ включили четыре гена из района АР20: два гена-супрессора,
36
имеющих Notl-еайты - RBSP3 и ITGA9, и два гена-кандидата - VILL и APRG1 без Notl-сайтов в их промоторных участках.
10 II 12 13 14 15 16 17 18
без метастазов с мстастазами
Образцы кДНК ■ ШХЯЭД HRBSP3 QlTGA9anUaAPRGI
Рис. 12. Относительный уровень экспрессии пяти генов локуса 3р21.3 в образцах РШМ.
Образцы без метастазов (стадии I и II), образцы с метастазами в лимфатические узлы (стадия III);
(*) — образцы, в которых мРНК гена APRG1 не обнаружена в опухоли и условных нормах.
Гены RBSP3 и ITGA9, как известно, вовлечены в канцерогенез и, согласно нашим данным, для них характерны частые М/Д при многих видах рака, включая РШМ. Хотя гены VILL и APRG1 расположены в районе АР20, данные, подтверждающие их причастность к канцерогенезу, довольно скудны. Из района LUCA нами выбран известный и не имеющий Notl-сайта в промоторе ген-супрессор - RASSF1 (изоформа А), для которого во многих видах рака показана инактивация, вызванная метилированием его промотора, но данные литературы о частоте метилирования RASSF1 при РШМ противоречивы фаттапп et al, 2005).
У всех 5-ти генов обнаружено частое падение экспрессии (2-78 раз) в 53-89%, случаев ПКР (рис.12 и табл. 10), кроме двух случаев (образцы № 1 и 2), при этом высокая частота падения экспрессии характерна как для генов-супрессоров, так и мало изученных генов. Четыре гена (кроме APRG1) показали тенденцию к увеличению частоты и степени падения уровня мРНК в образцах ПКР с метастазами в лимфатические узлы по сравнению с образцами без метастазов (табл.10), а для RASSF1A и RBSP3 это различие статистически значимо (Р < 0.05). Обнаружена
37
положительная корреляция между уровнями мРНК трех генов &4.!й7г.М, РВЗРЗ и 1ЮА9. Так, значения коэффициентов корреляции Спирмена для пар генов составили: 0.69 для и ИВБРЗ (Р < 0.01), 0.43 для КВ8РЗ и 1ТвА9 (Р = 0.07),
0.48 для ДЛ&ШЛ и 1ТОА9 (Р = 0.04).
Таким образом, показано одновременное падение экспрессии генов из двух «критичных» районов (3р21.3) - КВ8РЗ, ¡ТОЛ9, АРКв!, УИЬ и Я/ШГ/Л в образцах ПКР. Высокая частота (53-89%) падения экспрессии этих генов показана впервые в цервикальном ПКР. Наряду с известными генами-супрессорами РАБЗР!А, ЯВБРЗ и 1ТОА9, два мало изученных гена АРК01 и УИЬ также часто инактивированы - в 60% и 53% случаев, соответственно. Информации об их функциях и причастности к раку немного (Хега е1 а1, 2005). Ген АРРС1 кодирует белок из 170 аминокислот (изоформа В), который имеет на "М-конце консервативную часть, характерную для членов семейства генов эукариотического фактора трансляции 6, а также мотив Оу-Авр, характерный для белков, участвующих в процессах клеточной адгезии и мембранных взаимодействий (РШоророч е1 а1, 2003). Белок, кодируемый геном У1Ы, принадлежит семейству виллинов/ гельзолинов и необходим для формирования актиновых микрофиламентов. Связь с канцерогенезом для У1ЬЬ ранее не была показана. Наши результаты позволяют предположить, что гены АР]Ю1 и КДХ можно рассматривать как гены-кандидаты, однако, необходимо дальнейшее исследование их функций и роли в канцерогенезе. Итак, известные гены-супрессоры -Я/Ж-РУЛ, РВЗРЗ и 1ЮА9, показали координированное падение экспрессии при РШМ, что позволяет предположить существование общих механизмов, приводящих к падению экспрессии генов в этом локусе, но не только метилирования. С помощью бисульфитного секвенирования подтверждено наличие метилирования промоторов генов ЯВБРЗ и ¡ТОА 9 в образцах ПКР (табл. 9). Однако, когда сравнили частоту падения экспрессии (ПЦР-РВ) и М/Д (ЫоЧ- микрочипы) в одних и тех же образцах ПКР для этих генов, то оказалось, что частота падения их экспрессии заметно выше, чем частота М/Д: 68% и 31% для Л55Р5; 89% и 42% для 1ЮА9, соответственно. Это указывает на существование дополнительных механизмов инактивации этих генов, Таблица 10. Результаты ПЦР-РВ анализа экспрессии 5-ти генов (3р21.3) в образцах ПКР.
Частота падения уровня мРНК, % Средний уровень снижения мРНК*, (разы)
Гены без с Все без с Все
метастазов метастазами образцы метастазов метастазами образцы
RASSF1A 44 (4/9) 70 (7/10) 58(11/19) 3(2-4) 11 (2-74) 4(2-74)
RBSP3 44 (4/9) 90(9/10) 68(13/19) 3(2-4) 3(2-11) 3(2-11)
ITGA9 78 (7/9) 100(10/10) 89(17/19) 6(2-9) 5(3-78) 6(2-78)
VILL 44 (4/9) 60 (6/10) 53 (10/19) 3(2-4) 4(2-9) 3(2-9)
APRG1 57 (4/7) 62 (5/8) 60 (9/15) 4(2-18) 5(4-12) 5(2-18)
Примечание: (*)- в скобках показан диапазон снижений уровня мРНК генов, для каждого Р< 0.01.
помимо метилирования ДНК, например, могут вносить вклад в падение экспрессии генов модификации хроматина и микро-РНК вместо или в дополнение к метилированию ДНК.
Чтобы предсказать возможность регуляции экспрессии генов RASSF1, RBSP3 и ITGA9 посредством микроРНК, использовали информацию, доступную на сайте (http://www.mirnabodymap.org/index.php), который включает данные пяти информационных ресурсов (TargetScan, DIANA, PITA, miRDB и MicroCosm) с применением различных алгоритмов предсказания мишеней для микроРНК. Анализ показал, что каждая из трех мРНК генов RASSF1, RBSP3 и ITGA9 может быть одновременно мишенью трех микроРНК (miR-346, miR-515 и miR-767-5p), для которых показана онкогенная роль в различных опухолях (Tsang et al, 2011). Участие любой из этих микроРНК могло бы привести к координированной инактивации трех генов.
4.2.4. Корреляция между содержанием мРНК и белка RASSFA в клеточных линиях рака шейки матки
Выполнен анализ содержания мРНК и содержания белка RASSF1A методами ПЦР-РВ и иммуногистохимии в 4-х клеточных линиях РШМ (рис 13). Количество белка оценили по средней интенсивности окраски (красный цвет), которая составила 11, 16, 21 и 25 у.е. в ряду клеточных линий C33A<Caski< C4-l< SiHa (рис. 15, слева направо). Как видно из табл. 11. изменение уровня мРНК гена и содержания белка RASSF1A находятся в хорошем соответствии между собой.
Рис 13. Результаты иммунохимического анализа белка А в клеточных линиях РШМ.
Сверху - иммунохимическая детекция ЯА88Р1 А, снизу - то же, что сверху плюс окраска ядер ОАР1 (голубой цвет).
Таким образом, для рака легкого и шейки матки впервые обнаружены новые гены кандидаты в гены супрессоры на Зр с высокой частотой метилирования/делеций, одновременные геномные и эпигеномные нарушения многих генов в одних и тех же опухолях (т.н. фенотип С1МР+) и согласованное падение экспрессии генов Зр21.3
независимо от наличия в них МоИ-сайтов. Поскольку в ряде работ гиперметилирование некоторых генов показано в предшествующих раку состояниях,
Таблица 11. Результаты количественной оценки содержания мРНК и белка Л в
клеточных линиях РШМ.
Клеточные линии Относительное содержание мРНК Снижения мРНК, (разы) Уровень белка (У.е.)
СЗЗА 0,003 (0,002-0,004) 347 11
Caski 0,08 (0,06-0,09) 13 16
С4-1 0,10(0,07-0,13) 10 21
SiHa 0,21 (0,16-0,27) 5 25
анализ с помощью Notl-микрочипов может быть полезен для цитологического скрининга и диагностики PJI и РШМ на ранних стадиях. Использование маркеров метилирования в дополнение к обычному скринингу поможет обнаружить у больных раковые клетки с фенотипом CIMP+. В настоящее время проводятся перспективные исследования на модельных системах о возможности снятия эпигенетической супрессии генов или целых районов генома
деметилирующими агентами с целью реверсии опухоли в незлокачественный непролиферативный фенотип за счет реактивации генов и последующих каскадных изменений в сигнальных путях (Vendetti and Rudin. 2013).
4.3. Дифференциальная экспрессии генов-супрессоров при раке почки
Рак почки характеризуется высокой частотой смертности среди онкозаболеваний мочеполовой системы (Hoffman and Cairns, 2011). Из наиболее распространенных типов почечно-клеточного рака 75% составляет светлоклеточный почечно-клеточный рак (скПКР) и 10-15% - папиллярный рак почки (Г1РП). При спорадическом скПКР общими генетическими нарушениями признаны инактивация гена-супрессора VHL и потеря всего или части короткого плеча хромосомы 3 благодаря делециям или транслокациям, причем чаще всего делеции находят в локусах Зр12-14, Зр21 и Зр25. Нарушения по крайней мере в двух из этих областей необходимы для развития скПКР. но в Зр21 - обязательны (Mizuno et al, 2011).
В отличие от НМРЛ, при скПКР обнаружено частое падение экспрессии (5097%) только у трех генов-супрессоров RBSP3, SEMA3, HYAL1 локуса 3р21.3 и генов других районов Зр - CHL1 (3р26.3) и ACY1 (Зр21.1). У последних двух генов самый низкий средний уровень падения мРНК 18 и 14 раз, независимо от клинической стадии заболевания и наличия метастазов. У SEMA3 наблюдали повышение экспрессии в 60% образцов и редкие случаи снижения, а у остальных генов NPRL2,
Рис. 14. Изменение уровня мРНК генов при раке почки (скПКР). Разным цветом отмечены образцы скПКР 1-11 и Ш-ГУ стадий. Контрольные гены 0(755 и №N1.
HYAL2, ITGA9 - отсутствие изменений в 72% случаев с редкими случаями разнонаправленных изменений (рис. 14). «Молчащие» одновременно пары генов из двух семейств семафоринов и гиалуронидаз в образцах HMPJI имеют принципиально различные профили экспрессии в образцах скПКР. Обнаружена корреляция изменений экспрессии 5-ти генов с прогрессией скПКР - HYAL2, SEMA3F, 1TGA9, RBSP3 и PL6/TMEM115 (для каждого Р< 0.05).
С помощью Notl-микрочипов в 17-ти образцах скПКР той же выборки для 18-ти Notl-сайтов (NK1RAS1, RPLI5, LRRN1, LRRC3B, VHL, IQSEC1, RBSP3, GORASP1/TTC21А, FOXP1, RPL32/IQSEC1, PRICKLE2, ZIC4, FGD5, PLCL2, THRB, ABHD5/C3orf77, GNAI2, ALDH1L1) выявлены М/Д с частотой 18-59%.
Далее оценили изменения экспрессии 8-ми генов в образцах двух основных гистологических типов рака почки - скПКР и ПРП (табл.12). В основном преобладало падение экспрессии, но также обнаружены случаи повышения экспрессии уровня мРНК генов. У генов ALDH1L1, FGD5 и PLCL2 отмечена самая высокая частота падения экспрессии в образцах ПРП - 92%, 83% и 83% соответственно, но только у одного гена ALDH1L1 - 92% в образцах скПКР. У этого гена также обнаружено самое сильное падение уровня мРНК на III-ей ст. по сравнению с 1-ой ст. как в образцах скПКР, так и ПРП. Таким образом, при раке легкого (НМРЛ) и почки
Ген Частота изменений уровня мРНК, % Средний уровень мРНК (разы)
скПКР ПРП скПКР ПРП
Ы1т1 53 (9/17) | 0 (0/17) Т И (1/9) 4 33 (3/9) т 34 (1 - 154) ЗТ(103 - 104)
вОИА5Р1 33 (4/12) 4 0 (0/12) Т 36 (4/11)4 0 (0/12) Т 1(1-34) 1(1-71)
10$ЕС1 0(0/12) 4 8 (1/12) Т 58 (7/12) 4 0 (0/12) Т КЗТ-1) 34 (1 -534)
РОХР1 10 (1/10) 4 0 (0/10) т 17(2/12) 4 25 (3/12) Т 1(1-24) К19Т-144)
лионш 92 (11/12) 4 0 (0/12) Т 92 (11/12) 4 0 (0/12) Т 64 (1 - 1124) 94(1 - 1574)
РСй5 25 (3/12) 4 8 (1/12) | 83 (10/12)4 0 (0/12) Т 1(3?-74) 44(1 -594)
Р1СЬ2 42 (5/12) 4 0 (0/12) Т 83(10/12)4 8(1/12)1 1(1-54) 34(2Т-84)
ОУА12 8 (1/12) 4 33 (4/12) Т 17(2/12)4 25 (3/12)1" И4Т-21) ИЗТ-44)
Примечание: 4, Т - снижение и повышение уровня мРНК, в скобках указан диапазон изменений.
(скПКР) профили экспрессии генов локуса 3р21.3 и других районов Зр обнаружили существенные различия.
4.4. Опухолеспецифичные и универсальные нарушения экспрессии и паттерны метилирования/делеций генов-супрессоров хромосомы 3
Оценки генетических, эпигенетических и экспрессионных нарушений генов-супрессоров опухолевого роста - важные этапы в исследовании сложных процессов малигнизации клеток. Обнаруженные специфические, а также независящие от вида рака нарушения многих генов хромосомы 3 указывают на их важную роль в канцерогенезе. Так, особенности профилей экспрессии генов и паттернов метилирования/делеций в первичных опухолях легкого, шейки матки и почки позволили выявить специфические и общие гены, связанные с определенными гистологическими типами опухолевых клеток. Одновременное и согласованное падение экспрессии многих генов, в первую очередь локуса 3р21.3, обнаружено при НМРЛ, РШМ, но не скПКР (рис. 8, 10, 12, 14). Хотя частота и степень падения экспрессии гена ЯВБРЗ коррелируют со степенью распространенности всех трех заболеваний, несколько генов этого локуса с разнонаправленными изменениями экспрессии также вовлечены в прогрессию скПКР. Группы генов-супрессоров, проявивших согласованное изменение профилей экспрессии, коррелирующее с прогрессией опухолевых заболеваний различной этиологии, следует рассматривать в качестве «модулей коэкспрессии», связанных с важнейшими биологическими процессами, нарушаемыми при канцерогенезе - делением клеток, миграцией и инвазией, ангиогенезом.
Анализ данных Ыой-микрочипов также позволил выявить как специфичные, так и общие гены для этих форм рака, причем частота нарушений на Зр примерно вдвое выше, чем на Зя- Для генов АМККВ28 (2с\22) и КУ (Ъ<\22.\) обнаружены М/Д только при НМРЛ, а для генов РйгШЗ (3р13) и 80X14 (3я22-я23) - только при РШМ. Однако, несмотря на различие паттернов М/Д частые нарушения (10-59%) в большинстве случаев НМРЛ, РШМ и скПКР затрагивали одни и те же N011-
сайты/гены. Среди них есть как известные гены-супрессоры опухолевого роста (VHL, THRB, RBSP3, ITGA9, ALDH1L1, LRRC3B и др.), так и гены, для которых связь с канцерогенезом показана впервые (LRRN1, PRICKLE2, GORASP1, ТТС21А, PLCL2, ABHD5, C3orf77, RPL32, FGD5 и др.).
Результаты работы в дальнейшем могут быть использованы при создании многофункциональных наборов специфичных и универсальных эпигеномных и экспрессионных маркеров для применения в научных целях и клинической практике (например, для дискриминации гистологических типов, метастатических и неметастатических опухолей), а также для разработки подходов к лечению рака, основанных на восстановлении активности генов-супрессоров, или их адресной доставке в опухолевые клетки с помощью нетоксичных систем.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящей работе впервые выполнен комплексный анализ экспрессии, делеций и метилирования обширной группы генов хромосомы 3 с применением количественной ПЦР в реальном времени и микрочипов на общих выборках образцов эпителиальных опухолей трех локализаций (легкое, шейка матки и почка). Сравнение количественных характеристик (частоты и степени нарушений) и их сопоставление с клинико-патологическими показателями (гистологический тип опухолей, степень дифференцировки опухолевых клеток, статус метастазирования и др.) позволило выявить: 1) новые потенциальные гены-супрессоры опухолевого роста (гены-кандидаты); 2) протяженные области геномных, эпигеномных нарушений и транскрипционного «молчания» многих генов; 3) одновременное и согласованное падение экспрессии генов кластера в протяженном локусе короткого плеча хромосомы 3; 4) количественный вклад геномных и эпигеномных механизмов инактивации генов-супрессоров и генов-кандидатов; 5) связь обнаруженных нарушений ряда генов (экспрессии и/или метилирования/делеций) с опухолевой прогрессией; 6) потенциальные гены-маркеры дискриминации метастатических и неметастатических опухолей, а также основных гистологических типов рака легкого, шейки матки и почки.
Гены, связанные с опухолевой прогрессией и метастазированием, особенно важны как маркеры прогноза течения заболевания, предсказания рецидивов, для мониторинга эффективности терапии и разработки методов индивидуального лечения пациентов. Результаты работы подтверждают и обеспечивают дальнейшее развитие современной постгеномной модели непрерывного ослабления опухолевой супрессии А. Кнудсона, в которой классическая двухударная модель канцерогенеза объединена с гипотезой тонких эффектов, влияющих на активность генов-супрессоров, когда даже незначительное падение их экспрессии, в том числе при сохранении аллелей, может привести к возникновению и прогрессии онкозаболевания.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ
1. В протяженном локусе 3р21.3 с помощью анализа двух STS-маркеров NLJ-003 и NL3-001 методом ПЦР в реальном времени локализованы две новые «горячие точки» с частыми гомозиготными делениями (10-18%) в первичных опухолях молочной железы, почки, шейки матки и клеточных линиях рака легкого. Точное картирование 34-х независимых делений позволило идентифицировать более 20-ти потенциальных генов-супрессоров, в том числе гены с неизвестными функциями в канцерогенезе.
2. Характер изменений экспрессии генов-супрессоров - RBSP3 (локус NLJ-003) и его мишени - ключевого гена-супрессора клеточного цикла RB1, зависит от прогрессии немелкоклеточного рака легкого и светлоклеточного рака почки. Одновременный скрининг нарушений экспрессии генов-участников основных сигнальных путей, ответственных за регуляцию клеточного цикла (Rb и p53/p21Wafl), показал согласованные разнонаправленные изменения экспрессии многих генов, зависящие от наличия метастазов в аденокарциноме и плоскоклеточном раке легкого. Предложены возможные механизмы инактивации гена RBSP3 в сравнении с известными механизмами для гена RB1 и новые звенья в системе регуляции клеточного цикла.
3. С помощью микрочипов Clontech обнаружено как падение, так и повышение экспрессии гена СНЫ (семейство L1 молекул клеточной адгезии САМ) в 76% образцов 19-ти видов рака. Показано возрастание частоты случаев инактивации гена в метастатических опухолях желудочно-кишечного тракта (рака желудка, толстой и прямой кишки) и восстановление его экспрессии непосредственно в метастазах у больных раком яичников, молочной железы и толстой кишки на фоне отсутствия экспрессии гена в первичных опухолях.
4. Выявлены специфичные для немелкоклеточного рака легкого и светлоклеточного рака почки особенности профилей экспрессии генов семейства LI (L1CAM, СНЫ, NFASC и NRCAM) и функционально связанных с ними генов различных семейств (анкиринов, интегринов и др.). Совокупность результатов позволяет отнести СНЫ к важным онко-ассоциированным генам и подтверждает гипотезу о его двойственной (супрессорной и онкогенной) роли в канцерогенезе.
5. Установлено, что гены протяженного локуса (3р21.3) кластеризованы не только позиционно, но и функционально. Выявлены общие и специфичные одновременные нарушения многих генов-супрессоров и генов-кандидатов в определенных гистологических типах опухолей. Ряд генов этого локуса вовлечен в прогрессию аденокарциномы легкого (RASSF1A, RBSP3, NPRL2, SEMA3B, ITGA9 и HYAL1), плоскоклеточного рака легкого (RASSF1A), цервикального плоскоклеточного рака (RASSF1A, RBSP3, ITGA9, APRG1 и VILL) и светлоклеточного рака почки (RBSP3, ITGA9, HYAL2, SEMA3F и PL6).
6. Для оценки вклада различных механизмов инактивации генов использован метод сравнительной гибридизации ДНК на Notl-микрочипах. Частота метилирования и/или делеций у имеющих Notl-сайты генов-супрессоров и генов-кандидатов в основном на 20-50% ниже, чем частота падения их экспрессии. Показана связь нарушений многих генов с прогрессией аденокарциномы и плоскоклеточного рака (легкого и шейки матки). Обнаружен согласованный характер эпигеномных нарушений (т.н. фенотип CIMP+) у более 20-ти генов в плоскоклеточном раке и аденокарциноме легкого и 30-ти генов в цервикальном плоскоклеточном раке.
7. Результаты работы продолжают дальнейшее развитие современной пост-геномной модели непрерывного ослабления опухолевой супрессии.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Обзоры:
1. Брага Э.А., Кашуба В.И., Малюкова А.В., Логинов В.И., Сенченко В.Н., Базов И.В., Киселев Л.Л., Забаровский Е.Р. Новые гены-супрессоры опухолевого роста в горячих точках хромосомы 3 человека: новые методы идентификации (обзор). Молекулярная биология. 2003, 37, 194-211.
2. Киселев Л.Л., Сенченко В.Н., Опарина Н.Ю., Брага Э.А., Забаровский Е.Р. Гены-супрессоры опухолевого роста, локализованные на коротком плече хромосомы 3 человека (обзор). Молекулярная медицина. 2005, 3, 17-28.
Главы в книге:
3. Е. Zabarovsky, Е. Braga, V. Loginov, V. Senchenko, A. Kudryavtseva, A. Dmitriev, D. Khodyrev, Т. Pavlova, A. Rynditch, M. Lerman, V. Kashuba, Novel Methylation-Dependent Markers/Tumor Suppressor Genes Involved in the Development of Renal Cell. In: Cancer, Horizons in Cancer Research, 2011, Ed. F. Columbus, Nova Science Publishers, Inc., NY., 42, chapter 4, 104-127.
4. E. Zabarovsky, V. Senchenko, V. Loginov, T. Pavlova, V. Zabarovska, A. Dmitriev, M. Lung, C. Panda, V. Kashuba, M. Lerman, E. Braga: Positional cloning of tumor suppressor genes from 3p21.3 involved in major human cancers. In: Cancer, Horizons in Cancer Research, 2011. Ed. F. Columbus, Nova Science Publishers, Inc., NY., 42, chapter 5, 130-152.
Статьи:
5. Braga E., Senchenko V., Bazov I., Loginov W., Ermilova V., Kazubskaya Т., Garkavtseva R., Mazurenko N., Kisseljov F., Liu J., Kisselev L., Lerman M., Klein G., Zabarovsky E. Critical tumor-suppressor gene regions on chromosome 3p regions in major human epithelial malignancies: allelotyping and quantitative real time PCR. Int. J.Cancer. 2002,100: 534-541.
6. Li J., Protopopov A., Wang F„ Senchenko V., Petushkov V., Vorontsova O., Petrenko L., Zabarovska V., Muravenko O., Braga E„ Kisselev L„ Lerman M.I., Kashuba V., Klein G., Ernberg I., Wahlestedt C., Zabarovsky E. Notl subtraction and A'o/I-specific microarras to detect copy number and methylation changes in whole genomes. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 2002, 99: 10724-10729.
7. Angeloni D., Duh F.-M., Dean M„ Zabarovsky E.R., Braga E., Senchenko V., Lerman M.I. С to A Single Nucleotide Polymorphism in Intron 18 of the Human MST1R (RON) Gene that Maps at 3p21.3. Molecular and Cellular Probes. 2003,17: 55-57.
8. Senchenko V., Liu J., Braga E„ Mazurenko N., Loginov W., Seryogin Y., Bazov I., Kisseljov F., Kashuba V., Lerman M., Klein G„ Zabarovsky E. Deletion mapping of cervical carcinomas using quantitative real-time PCR identifies two frequently affected regions in 3p21.3. Oncogene. 2003, 22, 2984-2992.
9. Senchenko VN, Liu J, Loginov W, Bazov I, Angeloni D, Seryogin Y, Ermilova V, Kazubskaya T, Garkavtseva R, Zabarovska VI, Kashuba VI, Kisselev LL, Minna JD, Lerman MI, Klein G, Braga EA, Zabarovsky ER. Discovery of frequent homozygous deletions in chromosome 3p21.3 LUCA and AP20 regions in renal, lung and breast carcinomas. Oncogene. 2004; 23 (34):5719-28.
10.Kashuba V.I., Li J., Wang F., Senchenko V.N., Protopopov A., Malyukova A., Kutsenko A.S., Kadyrova E., Zabarovska V.I., Muravenko O.V., Zelenin A.V., Kisselev L.L., Kuzmin 1., Minna J.D., Winberg G., Ernberg I., Braga E, Lerman M.I., Klein G., Zabarovsky E.R.. RBSP3 (HYA22) is a tumor suppressor gene implicated in major epithelial malignancies. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 2004, 101: 4906-4911.
И.Анедченко E.A., Киселева Н.П., Дмитриев А.А., Киселев Ф.Л., Забаровский E.P., Сенченко В.Н. Ген-супрессор опухолевого роста RBSP3 при раке шейки матки: копийность и уровень транскрипции. Молекулярная биология, 2007, 41, 86-95.
12.Е.А. Анедченко, А.А. Дмитриев, Г.С. Краснов, Т.Т. Кондратьева, Е.П. Копанцев, Т.В. Виноградова, М.В. Зиновьева, И.Б. Зборовская, Б.Е. Полоцкий, О.В. Сахарова, В.И. Кашуба, Е.Р. Забаровский, В.Н. Сенченко, Л.Л. Киселев. Подавление экспрессии генов RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G2I, RASSF1A, ITGA9, HYAL1 и HYAL2 при немелкоклеточном раке легкого. Молекулярная биология, 2008, 42(6), 960-970.
13. F. Wang, E.V. Grigorieva, J. Li, V.N. Senchenko, T.V. Pavlova, E.A. Anedchenko, A.V. Kudryavtseva, A. Tsimanis, D. Angeloni, M.I. Lerman, V.I. Kashuba, G. Klein, E.R. Zabarovsky. HYAL1 and HYAL2 Inhibit Tumour Growth In Vivo but Not In Vitro. PLoS ONE, 2008, 3(8), e3031.
14. EA Anedchenko, NYu Oparina, AA Dmitriev, G Krasnov, FL Kisseljov, VN Senchenko. Activation of hTERT mRNA expression in squamous cervical carcinoma
does not associated with amplification of hTERTUNA copy number. Oncology Reports. 2008, 20 (2), 464-474.
15. V. I. Kashuba, T. Pavlova, E. V. Grigorieva, A. Kutsenko, S, P. Yenamandra, J. Li, F. Wang, Protopopov, V.I. Zabarovska, V.N. Senchenko, K. Haraldson, T. Eshchenko, J. Kobliakova, O. Vorontsova, I. Kuzmin, E. Braga, V. M. Blinov, L. L. Kisselev, Yi-Xin Zeng, I. Ernberg, M. I. Lerman, G. Klein, E.R. Zabarovsky. High mutability of the tumour suppressor genes RASSF1 and RBSP3 (CTDSPL) in cancer. PLoS ONE, www.plosone.org, 4 (5), e5231.
16.A.B. Кудрявцева, E.A. Анедченко, H. Ю. Опарина, Г.С. Краснов, K.H. Кашкин, И.Б. Зборовская, А.А. Дмитриев, Т.Т. Кондратьева, Е.В. Виноградова, М.В. Зиновьева, Е.П. Копанцев, В.Н.Сенченко. Экспрессия генов FTL и FTH, кодирующих субъединицы ферритина, при раке легкого и почки. Молекулярная биология, 2009, 43(6), 1044-1054.
17. Senchenko VN, Anedchenko ЕА, Kondratieva ТТ, Krasnov GS, Dmitriev AA, Zabarovska VI, Pavlova TV, Kashuba VI, Lerman MI, Zabarovsky ER. Simultaneous down-regulation of tumor suppressor genes RBSP3/CTDSPL, NPRL2/G21 and RASSF1A in primary non-small cell lung cancer, BMC Cancer. 2010, 10:75.
18.Г.С. Краснов, Н.Ю. Опарина, А.А. Дмитриев, А.В. Кудрявцева, Е.А. Анедченко, Т.Т. Кондратьева, Е.Р. Забаровский, В.Н. Сенченко. Новый контрольный ген RPN1 для нормирования количественных данных при раке легкого и почки Молекулярная биология, 2011, 45 (2), 238-248.
19.V.N. Senchenko, G.S. Krasnov, А.А. Dmitriev A.V. Kudryavtseva, Е.А. Anedchenko, Е. A. Braga, I.V. Pronina, Т.Т. Kondratieva, S. V. Ivanov, E.R. Zabarovsky, M.I. Lerman. Differential Expression of CHL1 Gene during Development of Major Human Cancers. PlosOne, 2011, 6 (3), el5612.
20.E.Braga, V. Loginov, D. Hodyrev, I. Pronina, T. Kazubskaya, J. Bogaryrova, V. Kashuba, V. Senchenko, G. Klein, M. Lerman, L.Kisselev, E. Zabarovsky. A novel MECA3 region in human 3p21 harboring putative tumor suppressor genes and oncogenes. Exp. Oncol. 2011, 33, 1-9.
21.Cherkasova E, Malinzak E, Rao S, Takahashi Y, Senchenko V, Kudryavtseva A, Nickerson M, Merino M, Hong J, Schrump D, Srinivasan R, Linehan W, Tian X, Lerman M, Childs R, Inactivation of the von Hippel-Lindau tumor suppressor leads to selective expression of a human endogenous retrovirus in kidney cancer. Oncogene, 2011,30 (47): 4697-706.
22. E. Cherkasova, E. Malinzak, V. Senchenko, A. Kudryavtseva, L. Kiselev S. Rao, Y. Takahashi, N. Harashima, M.Linehan, R. Srinivasan, M. Lerman, R. Childs. Loss of function of the VHL tumor suppressor gene resurrects an endogenous retrovirus in
kidney cancer that encodes a tumor antigen targeted by allogeneic T-Cells following hematopoietic cell transplantation (HCE). Blood. 2009,114 (22), 194.
23. Сенченко B.H., Дмитриев A.A, Краснов Г.С., Кудрявцева A.B., Анедченко Е.А., Брага Е.А., Пронина И.В., Кондратьева Т.Т., Павлова JI.C., Забаровский Е.Р., Лерман М.И. Двойственная роль гена CHL1 при канцерогенезе. Медицинская генетика. 2012, 7,45-52.
24.Dmitriev A.A, Kashuba V.I., Haraldson К., Senchenko V.N., Pavlova T.V., Kudryavtseva A.V., Anedchenko E. A., Krasnov G.S., Pronina I. V., Loginov V. I, Kondratieva T.T, Kazubskaya T.P., Braga E. A., Yenamandra S.P., Ignatjev I., Ernberg I., Klein G„ Lerman M.I, Zabarovsky E.R. Genetic and Epigenetic Analysis of Non-Small Cell Lung Cancer with Notl-microarrays. Epigenetics. 2012, 7 (5), 502-513.
25. Haraldson K., Kashuba V. I., Senchenko V. N, Kudryavtseva A.V, Dmitriev A.A, Pavlova T.V, Braga E. A, Pronina I. V, Kondratov A.G, Rynditch A.V, Lerman M.I, Zabarovsky E. R. LRRC3B gene is frequently epigenetically inactivated in several epithelial malignancies and inhibit cell growth and replication.. Biochimie. 2012, 94 (5), 1151-1157.
26. V.I. Kashuba, A.A. Dmitriev, G.S. Krasnov, T. Pavlova, I. Ignatjev, V.V. Gordiyuk, A.V. Gerashchenko, E.A. Braga, S.P. Yenamandra, M. Lerman, V.N. Senchenko, E. Zabarovsky. NotI microarrays: novel epigenetic markers for early detection and prognosis of high grade serous ovarian cancer. Int. J. Mol. Sci. 2012,13, 13352-13377.
27. Senchenko VN, KisseljovaNP, Ivanova ТА, Dmitriev AA, Krasnov GS, Kudryavtseva AV, Panasenko GV, Tsitrin EB, Lerman MI, Kisseljov FL, Kashuba VI, Zabarovsky ER. Novel tumor suppressor candidates on chromosome 3 revealed by Notl-microarrays in cervical cancer. Epigenetics. 2013, 11, 8(4) [Epub ahead of print].
Программа:
28. Программа для ЭВМ «Анализ транскрипции генов», авторы Дмитриев А.А., Киселев Л.Л., Краснов Г.С., Опарина Н.Ю., Сенченко В.Н. Свидетельство № 200862585, Роспатент, 2008.
Патенты:
29.Е.А. Анедченко, Т.В. Виноградова, И.Б. Зборовская, М.В. Зиновьева, Л.Л. Киселев, Т.Т. Кондратьева, Е.П. Копанцев, О.В. Сахарова, Е.Д. Свердлов, В.Н. Сенченко. Способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления (NPRL2), 2010, № 2390780, Бюл. № 15.
30. В.Н. Сенченко, Е.А. Анедченко, В.И. Дубовая, Т.Т. Кондратьева, О.В. Сахарова, Е.П. Копанцев, Т.В. Виноградова, М.В. Зиновьева, И.Б. Зборовская, Е.Д. Свердлов, Л.Л. Киселев. Способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления (RBSP3), 2009, № 2351936, Бюл. № 10.
48
31.В.Н. Сенченко, Е.А. Анедченко, Т.Т. Кондратьева, О.В. Сахарова, И.С. Фрейдлин, E.H. Имянитов, Л.Л. Киселев. Способ диагностики немелкоклеточного рака легкого и набор для его осуществления (ITGA9, HYAL1 и HYAL2), 2010, № 2403575, Бюл.№ 31.
32. A.B. Кудрявцева, Е.А. Анедченко, Т.Т. Кондратьева, М.И. Лерман, В.Н. Сенченко. Способ диагностики светлоклеточной почечноклеточной карциномы и набор для его осуществления (CALL), 2010, № 2393472, Бюл.18.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АК - аденокарцинома
а.о. - аминокислотные остатки
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
кДНК — комплиментарная ДНК
МРЛ — мелкоклеточный рак легкого
мРНК — матричная (информационная) РНК
НМРЛ — немелкоклеточный рак легкого
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция, сопряженная с реакцией обратной транскрипции
ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого
ПКР — плоскоклеточный рак шейки матки
ПРП - папиллярный рак почки
п. н. - пар нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - ПЦР в режиме реального времени
РЛ - рак легкого
РМЖ — рак молочной железы
РП - рак почки
РШМ - рак шейки матки
РЯ - рак яичников
скПКР — светлоклеточный почечно-клеточный рак т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов
АР-20 - район Зр, перекрываемый Alu-ПЦР-клоном 20 HD - гомозиготные делеции
LUC А — район Зр генетической нестабильности при раке легкого (от англ. lung cancer TSG region)
LOH - потеря гетерозиготности (от англ. loss of heterozygosity) Зр - короткое плечо хромосомы 3 человека
Работа выполнена при финансовой поддержке международным грантом ШТАБ (20042007) 03-51-4983; грантами РФФИ (2004-2010): 04-04-08154-офи_а, 05-04-49408а, 08-04-01577-а; грантами в рамках реализации нескольких федеральных целевых программ (ФЦП) на 2005-2011 годы: госконтракгы № 02.467.11.30006, 02.512.11.21.01, 02.512.11.2241 и 02.740.11.5227, а также соглашением № 8270 от 10.08.2012 в рамках реализации ФЦП «Научные и педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы.
Подписано в печать: 20.01.14
Объем: 2,0 усл. п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 206 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д.2 (495) 978-66-63, www.reglet.ru
Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Сенченко, Вера Николаевна, Москва
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Российской академии наук
На правах рукописи
05201450598
СЕНЧЕНКО ВЕРА НИКОЛАЕВНА
гены-супрессоры хромосомы з 40.ю&е ^;
инактивация и опухолевая прогрессия
03.01.03 - Молекулярная биология
ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2014
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................13
1.1. Двухударная модель канцерогенеза и ее развитие после расшифровки генома - сорок лет спустя.....................................................13
1.1.1. Открытие онкогенов и генов-супрессоров.....................................14
1.1.2. Двухударная парадигма....................................................................15
1.1.3. Роль гаплоидной недостаточности и квази-достаточности в возникновении рака.....................................................................................19
1.1.4. Два удара для опухолевой супрессии..............................................25
1.1.5. Непрерывная модель опухолевой супрессии.................................28
1.1.6. Регуляция активности генов-супрессоров......................................32
1.1.7. Применение непрерывной модели для оценки предрасположенности к раку и лечения онкозаболеваний.....................34
1.2. Опухолевая прогрессия и метастазирование........................................38
1.2.1. Накопление генетических изменений при опухолевой прогрессии и метастазировании.....................................................................................40
1.2.2. Прогностическое значение нарушений онкогенов и генов-супрессоров ..................................................................................................42
1.2.3. Специфичность генетических изменений для каждого типа опухоли.........................................................................................................45
1.2.4. Гетерогенность опухолевых клеток относительно метастатического потенциала раковых клеток........................................48
1.2.5. Дифференциальная экспрессия генов, связанная с метастатическим потенциалом раковых клеток......................................49
1.2.6. Связь генотипа с метастатическим фенотипом раковых клеток..50
1.2.7. Роль молекул клеточной адгезии в опухолевой прогрессии и метастазировании........................................................................................54
1.2.8. Супрессоры метастазирования......................................................58
1.2.9. Перспективные направления дальнейших исследований.............68
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................70
2.1. Образцы первичных опухолей...............................................................70
2.2. Культуры опухолевых клеток................................................................71
2.3. Выделение РНК и ДНК...........................................................................72
2.4. Реакция обратной транскрипции...........................................................74
2.5. Анализ содержания ДНК и мРНК с помощью ПЦР в реальном времени............................................................................................................74
2.6. Анализ продуктов ПЦР в реальном времени.......................................77
2.7. Математическая обработка количественных данных..........................78
2.8. Анализ метилирования (бисульфитная конверсия с последующим секвенированием)...........................................................................................79
2.9. Анализ белка методом иммуногистохимии..........................................79
2.10. Анализ экспрессии гена СНЫ с использованием коммерческих микрочипов С1оп1есЬ......................................................................................80
2.11. Сравнительная гибридизация ДНК с использованием ЫоИ-микрочипов.....................................................................................................81
2.12. Гибридизация ДНК по Саузерну.........................................................83
2.13. Статистический анализ данных...........................................................84
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ........................................................85
3.1. Разработка методической базы для ПЦР в реальном времени...........85
3.1.1.Оптимизация условий проведения реакций....................................85
3.1.2. Выбор контрольных генов для нормирования количественных данных..........................................................................................................86
3.1.3. Выбор образцов сравнения...............................................................93
3.2. Поиск участков геномной нестабильности в районах короткого плеча хромосомы 3 с целью идентификации потенциальных генов-супрессоров опухолевого роста..........................................................................................95
3.2.1. Количественный анализ изменений копийности ДНК двух локусов Зр - МЛ-003 и ЫЪЗ-001 в различных видах рака......................96
3.2.2. Сравнение данных ПЦР в реальном времени с результатами анализа ЬОН.................................................................................................98
3.3. RBSP3/CTDSPL - «классический» ген-супрессор опухолевого роста ........................................................................................................................101
3.3.1. Сравнительный анализ профилей экспрессии генов RBSP3 и его мишени RB1 при светлоклеточном раке почки и немелкоклеточном раке легкого................................................................................................103
3.3.2. Возможные механизмы инактивации RBSP3 и RB1 при раке легкого и почки..........................................................................................107
3.3.3. Анализ одновременных нарушений экспрессии RBSP3, RB1 и участвующих в регуляции клеточного цикла генов при раке легкого 110
3.4. Дифференциальная экспрессия гена СНЫ (Зр26) в наиболее распространенных эпителиальных опухолях............................................116
3.4.1. Анализ нарушений экспрессии гена CHL1 в 19-ти видах рака с использованием коммерческих микрочипов Clontech..........................117
3.4.2. Количественный анализ экспрессии генов семейства LI и функционально связанных с ними генов различных семейств при раке почки и легкого..........................................................................................120
3.5. Анализ нарушений генов хромосомы 3 в опухолях трех локализаций ........................................................................................................................129
3.5.1. Одновременное падение экспрессии кластера генов-супрессоров при немелкоклеточном раке легкого.......................................................130
3.5.1.1. Связь инактивации генов-супрессоров двух областей Ар20 и LUC А с опухолевой прогрессией........................................................132
3.5.1.2. Анализ частоты метилирования/делеций в генах хромосомы 3 с применением Notl-микрочипов.........................................................134
3.5.1.3. Подтверждение данных микрочипов методом ПНР в реальном времени..................................................................................137
3.5.2. Геномная и эпигеномная нестабильность хромосомы 3 при раке шейки матки...............................................................................................139
3.5.2.1. Анализ частоты метилирования/делеций с использованием Notl-микрочипов....................................................................................139
3.5.2.2. Уточнение результатов Notl-чипов другими методами.......142
3.5.2.3. Одновременное падение экспрессии генов района 3р21.3 -RBSP3, ITGA9, VILL, APRGl/C3orß5 и RASSF1A..............................143
3.5.2.4. Корреляция между содержанием мРНК и белка RASSFA в клеточных линиях рака шейки матки..................................................147
3.5.3. Геномная и эпигеномная нестабильность хромосомы 3 при раке почки...........................................................................................................149
3.5.3.1. Дифференциальная экспрессии генов-супрессоров Зр при раке почки...............................................................................................149
3.5.3.2. Анализ частоты метилирования/делеций с использованием Notl-микрочипов....................................................................................152
3.5.3.3. Сравнение экспрессии генов, обнаруженных с помощью микрочипов, при светлоклеточном и папиллярном раке почки.......153
3.5.4. Опухолеспецифичные и универсальные нарушения экспрессии и паттерны метилирования/делеций генов-супрессоров хромосомы 3 ..154
ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................158
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ..................................................................................159
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ............................161
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................168
БЛАГОДАРНОСТИ.........................................................................................190
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АК - аденокарцинома
а.о. - аминокислотные остатки
ГК - гиалуроновая кислота
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
к ДНК - комплементарная ДНК
ММР - микросателитный мутаторный опухолевый фенотип
MPJI - мелкоклеточный рак легкого
мРНК - матричная (информационная) РНК
HMPJI - немелкоклеточный рак легкого
ОТ - реакция обратной транскрипции
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция, сопряженная с реакцией
обратной транскрипции
ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого
ПКР - плоскоклеточный рак (шейки матки)
ПРП - папиллярный рак почки
п. н. - пара нуклеотидов
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ - ПЦР в режиме реального времени
РЛ - рак легкого
РМЖ - рак молочной железы
РП - рак почки
РШМ - рак шейки матки
РТК - рак толстой кишки
РЯ - рак яичников
скПКР - светлоклеточный почечноклеточный рак т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов
АР20 - критичный район на Зр, перекрываемый Alu-ПЦР-клоном 20, с высокой генетической нестабильностью в различных опухолях
LUCA - критичный район на Зр с высокой генетической нестабильностью
в опухолях легкого (от англ. lung cancer TSG region)
LOH - потеря гетерозиготности (от англ. loss of heterozygosity)
Зр - короткое плечо хромосомы 3 человека
Обозначения некоторых генов, расположенных на коротком плече хромосомы 3:
CHL1 - ген, кодирующий трансмембранные молекулы клеточной адгезии
(САМ - cell adhesion molecule) NPRL2 - ген, кодирующий аналог 2 регулятора пермеазы азота (nitrogen
permease regulator like-2) CTDSPL /RBSP3- ген, кодирующий малую С-концевую сериновую фосфа-тазу (полипептид А РНК полимеразы II), которая активирует Rbl (RBI serine phosphatase from chromosome 3) RBI - ген, кодирующий фосфобелок pRBl, который играет ключевую роль
в контроле перехода клетки из G0/G1 в S фазу SEMA3B, SEMA3F - гены, принадлежащие к семейству семафоринов-колапсинов, белковые продукты которых участвуют в передаче ак-сонных сигналов
HYAL1, HYAL2 — гены, кодирующие белки семейства эндоглюкозаминидаз (гиалуронидазы)
ITGA9 - ген, кодирующий субъединицу мембранного белка, принадлежащего семейству интегринов VHL - ген, кодирующий два биологически активных белка, принимающих участие в сигальных путях, связанных с развитием гипоксии и играющих важную роль при раке почки VILL - ген, кодирующий белок из семейства виллинов/гельзолинов
Для обозначения генов использован шрифт italic, для белков - шрифт normal.
ВВЕДЕНИЕ
Рак остается глобальным вызовом человечеству. Онкологические заболевания занимают второе место в мире по уровню смертности после сердечно-сосудистых заболеваний (R. Siegel, D. Naishadham, et al., 2013). Рак называют болезнью генома, а в некоторых случаях - «хромосомной катастрофой» из-за разрушительности последствий и стремительного течения (P.J. Stephens, C.D. Greenman, et al., 2011). Отличительные признаки рака включают ряд биологических особенностей, приобретенных во время многостадийного процесса развития опухолевого заболевания, которые составляют принципы рациональной организации сложного новообразования, а именно: устойчивую пролиферативную передачу сигналов, подавление действия супрессоров клеточного роста, уклонение от апоптоза, предоставление возможности для репликативного бессмертия, стимулирование ангиогенеза и активацию инвазии и метастазирования (D. Hanahan and R.Ä. Weinberg, 2011). В основе разнообразия эпителиальных опухолей лежит геномная нестабильность, которая ускоряет приобретение опухолью не только этих признаков, но и индивидуальных особенностей организма. В прошлом десятилетии активное внимание приковали к себе еще две важные особенности опухоли, о которых было известно и раньше, - перепрограммирование энергетического метаболизма и уклонение от иммунного ответа. Кроме того, опухоли способны формировать «микро-окружающую среду», когда клетки, кажущиеся нормальными, под влиянием различных факторов, секретируемых опухолью, приобретают выше перечисленные признаки опухолевых клеток. Признание широко распространенной применимости этих понятий будет все более и более влиять на разработку новых способов лечения рака. Новые перспективные подходы к лечению рака должны быть нацелены на все морфологические и генетические проявления опухолевой транс-
формации клеток - от подавления ангиогенеза, инактивации онкогенов и активации функций генов-супрессоров до минимизации влияния опухоли на микроокружение (D. Hanahan and R.A. Weinberg, 2011).
В постгеномный период представление о существовании нескольких ключевых генов, вызывающих рак, претерпевает значительные изменения благодаря расширению и углублению научных представлений о канцерогенезе. Последнее десятилетие характеризуется открытием многих новых онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста. Общее количество и их соотношение непрерывно меняется по мере появления новых данных в результате анализа геномов раковых клеток. Так, около 10-ти лет назад согласно данным GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), насчитывалось более сотни потенциальных онкогенов (клеточных и вирусных), несколько десятков генов-супрессоров и более 300 потенциальных генов-супрессоров, расположенных на разных хромосомах человека. Совсем недавно в результате анализа базы данных COSMIC Фогелынтейн Б. с сотрудниками (I. Bozic, Т. Antal, et ah, 2010) достоверно смогли классифицировать на основе предложенных критериев ключевые гены (т.н. «drivers»), которые инициируют запуск неопластической клеточной трансформации (в первую очередь, гены-супрессоры и онкогены). К пассажирам («passengers») отнесены гены, мутации в которых сопровождают нарушения в ключевых генах, но не вносят вклад в канцерогенез. База данных COSMIC (http://www.sanger.ac.uk/ genetics/CGP/cosmic/) содержит данные о 105084 мутаций в 3142 генах, которые обнаружены для 353 различных гистопа-тологических подтипов опухолей человека (всего 91991 образец). Фогель-штейн и соавт. разделили все найденные мутации на две группы: инакти-вирующие мутации - нонсенс-мутации, нарушения в сайтах сплайсинга, сдвиги рамки считывания, возникающие из-за делеций или инсерций (вставок), и другие мутации - миссенс мутации, инсерции или делеции, не приводящие к сдвигу рамки считывания. Авторы пришли к выводу, что
для известных генов-супрессоров соотношение числа инактивирующих мутаций к остальным составляет более 0.2. Этот критерий позволил идентифицировать новые потенциальные гены-супрессоры, в общей сложности 286 генов. Кроме того, ген отнесен к онкогенам, если а) не классифицирован как ген-супрессор и/или б) одна и та же аминокислота изменена, по крайней мере, в двух опухолях или в) в гене идентифицировано более 4-х различных мутаций. Этот критерий позволил классифицировать 91 ген в качестве онкогенов, а оставшиеся 560 генов - в качестве «пассажиров». Наконец, по самым последним оценкам тех же авторов (В. Vogelstein, N. Papadopoulos, et al., 2013) около 140 генов («driver genes») насчитывают в среднем по 2-8 мутаций на каждый тип рака, которые далее приводят к нарастающим каскадным нарушениям в остальных генах, участвующих в ключевых сигнальных путях (7-12 на каждый тип рака).
К опухолевому заболеванию могут также привести эпигеномные структурные изменения, не затрагивающие нуклеотидную последовательность ДНК (например, метилирование ДНК и модификации гистонов), которые вносят вклад в инактивацию генов-супрессоров и активацию прото-онкогенов (P. Munoz, M.S. Iliou, et al., 2012, H. Suzuki, R. Maruyama, et al., 2012). Кроме того, некодирующие короткие последовательности - мик-роРНК, играют важную роль в качестве альтернативных регуляторов экспрессии и могут проявлять как онкогенные, так и супрессорные свойства. При этом экспрессия самих микроРНК тоже может регулироваться эпигенетическими механизмами (С. Baer, R. Claus, et al., 2013, Н. Suzuki, R. Maruyama, et al., 2012). Ген с любым из эпигеномных нарушений (т.н. epi-mutation/эпимутацией), который инициирует возникновение рака, называют «epi-drive gene» (В. Vogelstein, N. Papadopoulos, et al., 2013). В настоящее время научным сообществом в глобальном масштабе выполняются исследования по соотнесению известных и недавно идентифицированных ге-
нов-супрессоров и онкогенов с такими генами (drivers или epi-drivers) для различных видов рака.
Помимо ключевых генов («drivers»), непосредственно участвующих в инициации опухолевой трансформации, известно большое число генов, изменения в которых ассоциированы с опухолевой прогрессией, локальной инвазией и метастазированием (С. Greenman, P. Stephens, et al., 2007, T. Sjoblom, S. Jones, et al., 2006). Опухолевая прогрессия - многоступенчатый процесс, который характеризуется накоплением в трансформированных клетках различных молекулярных нарушений, приводящих к развитию все более злокачественного фенотипа. (D. Hanahan and R.A. Weinberg, 2011). Метастазирующие клетки могут образовываться уже на начальных стадиях роста первичной опухоли (L. Ding, M.J. Ellis, et al., 2010). Инвазивный локальный рост опухоли с проникновением в прилежащие ткани и ее дальнейшее метастатическое распространение в удаленные жизненно важные органы неминуемо приводит к летальному исходу, часто независимо от скорости роста первичного очага (M. Mareel and A. Leroy, 2003). Однако до сих пор многие гены, вовлеченные в опухолевую прогрессию или существенные для приобретения метастатического потенциала опухолей, еще не идентифицированы. В связи с этим, анализ изменений структуры и функциональной активности генов-супрессоров, связанных с опухолевой прогрессией, является актуальной задачей молекулярной биологии и онкологии (N.V. Cherdyntseva, P.A. Gervas, et al., 2010, J.L. Dean and K.
-
Сенченко, Вера Николаевна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2014
-
ВАК 03.01.03
- Полиморфные и STS-маркеры хромосомы 3 человека и локализация делеций на коротком плече хромосомы 3 в опухолях легкого, молочной железы и шейки матки
- Изменение метилирования промоторных областей семи генов хромосомы 3 человека в эпителиальных опухолях
- Анализ генетических и эпигенетических нарушений хромосомы 3 человека при раке легкого, шейки матки и яичников
- Поиск и характеристика онко-ассоциированных генов на хромосоме 3 человека с помощью сравнительной геномной гибридизации на NotI-микрочипах
- Идентификация онко-ассоциированных генов при светлоклеточном раке почки
