Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гены микроРНК, подверженные метилированию в опухолях легкого и толстой кишки, и их диагностическое значение

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гены микроРНК, подверженные метилированию в опухолях легкого и толстой кишки, и их диагностическое значение"

На правах рукописи

РЫКОВ СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ

Гены микроРНК, подверженные метилированию в опухолях легкого и толстой кишки, и их диагностическое значение

03.01.03 "Молекулярная биология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г з май т

ииэ060412

Москва - 2013

005060412

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»)

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор, ФГУП «ГосНИИ генетика)), г. Москва Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, г. Москва

Доктор биологических наук, профессор, ФГБУН «Институт молекулярной генетики» РАН, г. Москва

Ведущая организация:

гена» РАН, г.Москва

Брага Элеонора Александровна

Лебедев Юрий Борисович

Сломинский Петр Андреевич ФГБУН «Институт биологии

Защита состоится «28» мая 2013 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».

Реферат разослан апреля 2013 г. ,

Ученый секретарь к «Ц ■

Диссертационного совета, )■ „

№ Т. Л. Воюшина кандидат химических наук, доцент '

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В развитых странах онкологические заболевания занимают второе место в структуре смертности, сменив инфекционные заболевания. Рак легкого стоит на третьем месте по заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей, как в мире, так и в России (Мукерая и Заридзе, 2010). На немелкоклеточный рак легкого (HMPJI) приходится 85-87% всех мировых случаев выявления новообразований. Пятилетняя выживаемость при диагностике на I-II стадии составляет 57-67%, на III - 5-25% и на IV - менее 1%.

Рак толстой кишки (РТК) в России является чрезвычайно насущной проблемой, занимая четвертое место в структуре женской онкологической заболеваемости (-10 % в 2011 году в России) и пятое место (5.8% в 2011 году в России) в структуре мужской заболеваемости (Чиссов и др., 2012). Тяжесть заболевания и низкая выживаемость при раке толстой кишки связаны, прежде всего, с поздним выявлением опухоли. Так, при первичном обращении пациентов к врачу запущенные формы рака (III-IV стадии) диагностируются у 71% больных. Пятилетняя выживаемость больных РТК при выявлении заболевания на I стадии составляет 96%, на II - 87%, на III - 55% и на IV -только 5%.

Аномальное функционирование и измененный профиль экспрессии генов, контролирующих клеточный цикл, апоптоз и дифференцировку, являются ключевым свойством злокачественного процесса (Hanahan and Weinberg , 2010). Исследования последних лет показывают, что эпигенетические нарушения (метилирование ДНК и модификации гистонов), в совокупности с генетическими изменениями, составляют комплекс механизмов, ответственных за формирование фенотипа трансформированной клетки (Godfrey et al., 2007). Изменение степени метилирования ДНК происходит при различных патологиях и характерно для онкологических заболеваний, при которых на фоне глобального деметилирования генома происходит избирательное гиперметилирование промоторов генов, проявляющих опухоль-супрессорные свойства (Jones and Baylin, 2007).

МикроРНК относятся к классу малых некодирующих РНК длиной 19-24 нуклеотида, выполняющих функцию посттранскрипционного регулятора экспрессии целевых генов (Макарова и Крамеров, 2007). Показана важная роль дифференциальной экспрессии генов микроРНК в процессах злокачественной трансформации, причем профили экспрессии микроРНК носят опухоль-специфичный характер (Meto and Esteller, 2011).

Экспрессия генов микроРНК также подвержена регуляции посредством метилирования CpG-динуклеотидов в составе CpG-островков, перекрывающих промоторные участки генов (Lopez-Serra and Esteller, 2012). Следует отметить, что для генов микроРНК метилирование является более характерным эпигенетическим механизмом подавления экспрессии, чем для белок-кодирующих генов. Так, 11,5% всех генов микроРНК подвержены регуляции посредством метилирования (122 из 1048 генов микроРНК по состоянию на

2011 год), для белок-кодирующих генов этот показатель составляет 1-2% {Кипе] е/ а!., 2011).

Цель работы. Целью данной работы явилось изучение вовлеченности метилирования СрО-островков, перекрывающих промоторные участки генов микроРНК в патогенез НМРЛ и РТК и оценка диагностических качеств панелей маркеров на основе исследованных генов.

Задачи исследования.

1. Исследовать статус и частоту метилирования СрО-островков 14 генов микроРНК: т1г-9-1, т1г-9-3, т1г-34Ь/с, пт-107, т1г-124аЗ, т1г-125Ы, т1г-130Ь, т'1г-137, т'1Г-129-2, т'1Г-193а, т1г-203, т1г-212, т1г-375 и пйг-1258 на представительной выборке клинических образцов первичных опухолей и гистологически нормальной ткани легкого пациентов с НМРЛ и ткани легкого доноров без онкопатологий.

2. Исследовать статус и частоту метилирования СрО-островков семи генов микроРНК Iтг-9-1, пиг-9-3, т'1г-34Ь/с, т1г-129-2, Ш1г-193а, т1г-203 и т\г-212 на представительной выборке клинических образцов опухолей и гистологически нормальной ткани толстой кишки пациентов с РТК и ткани толстой кишки доноров без онкопатологий.

3. Исследовать корреляции между частотой метилирования изучаемых генов и клинико-патологическими свойствами первичных опухолей РТК и НМРЛ, а также их подтипов.

4. Разработать на основе полученных данных о частотах метилирования группы генов микроРНК панели молекулярных маркеров для ранней диагностики опухолей легкого и толстой кишки.

Научная новшна. В результате проведенного исследования опухоль-специфичное метилирование СрО-островков, перекрывающих регуляторные участки генов микроРНК, при НМРЛ впервые выявлено для генов: Ш1Г-125Ы, т'1г-129-2, т'1г-212, тгг-375 и т'ц--1258. Кроме того, впервые исследовано метилирование гена т'1г-137 на клиническом материале опухолей НМРЛ и определена частота метилирования СрО-островка этого гена в первичных опухолях легкого. Впервые показано отсутствие метилирования СрО-островков при НМРЛ генов тк-130Ь и т1г-107. Выявлено специфичное метилирование СрО-островка гена тк-1258 при НМРЛ, что представляет первое сообщение о вовлеченности метилирования гена ти-1258 в процесс онкогенеза. Впервые показано специфичное метилирование гена т1г-9-3 на клиническом материале первичных опухолей РТК.

Впервые выявлена статистически значимая ассоциация частоты метилирования СрО-островка гена т/г-125Ы с со стадией НМРЛ (Р=0,03б) и наличием метастазов в региональных лимфоузлах (Р-0,049б). Впервые выявлена статистически значимая ассоциация частоты метилирования СрО-островка гена т1Г-137 со стадией НМРЛ {Р=0,023).

Составлены оригинальные системы маркеров метилирования, позволяющие с высокой чувствительностью и специфичностью различать опухолевую ткань НМРЛ и здоровую ткань легкого.

Теоретическая и практическая значимость. Идентифицированы новые гены микроРНК, подверженные аномальному метилированию при HMPJI. Показана высокая частота метилирования CpG-островков группы генов микроРНК при злокачественных новообразованиях легкого и толстой кишки. Показана связь метилирования генов mir-l25bl и mir-137 с прогрессией HMPJL

Предложена система из 7 маркеров, которая позволяет с чувствительностью 81% и специфичностью 83% различить злокачественную опухоль HMPJI от окружающей гистологически нормальной ткани легкого при обнаружении метилирования более чем в одном локусе из панели. Предложенная система маркеров позволяет различить злокачественную опухоль пациентов с HMPJI от ткани легкого человека без онкопатологий с чувствительностью 81% и специфичностью 95% при обнаружении метилирования более чем в одном локусе из панели.

Предложена система из 4 маркеров, которая позволяет с чувствительностью 82% и специфичностью 93% различить злокачественную опухоль РТК от окружающей гистологически нормальной ткани тоетой кишки при обнаружении метилирования более чем в двух локусах из панели. Предложенная система маркеров позволяет различить злокачественную опухоль пациентов с РТК от ткани тоетой кишки человека без онкопатологий с чувствительностью 97% и специфичностью 78% при обнаружении метилирования более чем в одном локусе из панели.

Апробация работы. Диссертационная работа была представлена на заседании Секции молекулярной биологии Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» 28 марта 2013 г. Материалы работы были представлены на 7-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2011» (Санкт-Петербург, апрель, 2011), научной конференции «Актуальные проблемы оикогенетики» (Москва, октябрь, 2011), XV Российском онкологическом конгрессе (Москва, ноябрь, 2011).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации, 4 материала конференций, зарегистрирована заявка на патент.

Структура п объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 326 источников. Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 32 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Выборка образцов. Парные образцы опухолевой и гистологически нормальной ткани получали в Отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ Клинической Онкологии ГУ РОНЦ РАМН. Использовали ткани только тех больных, которые до операции не получали лучевую или химиотерапию. Выборка включала 87 случаев: 48 случаев немелкоклеточного рака легкого и 39 случаев рака толстой кишки. Все случаи НМРЛ и РТК классифицированы клинически по системе TNM и типированы гистологически в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ РАМН. 20 образцов ткани легкого и 14 образцов ткани толстой кишки от постмортальпые лиц, без выявленных онкопатологий (по данным анамнеза), были получены в патологоанатомическом отделе НИИ Скорой Помощи им. Склифосовского. Далее постмортальные лица без онкопатологий в анамнезе будут обозначены как доноры.

Выделение геномной ДНК. Выделение геномной ДНК осуществляли по стандартному протоколу {Sambrook et al., 1989).

Бисульфитная конверсия ДНК. Бисульфитную конверсию геномной ДНК проводили по стандартному протоколу фаттап et al., 2000).

Метил-специфичная полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР). МС-ПЦР проводили на бисульфит-конвертированной ДНК с праймерами, специфичными к метилированному и неметилированному аллелю. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2% агарозном геле, либо в 10% полиакриламидном геле. Для каждой пары праймеров проверяли отсутствие продукта ПЦР на неконвертированной ДНК. Конвертированную ДНК клеточной линии L-68 ("СибЭнзим", Россия) использовали как контроль для неметилированных аллелей. В качестве позитивного контроля 100%-ого метилирования использовали конвертированную ДНК клеточной линии L-68, обработанную метилтрансферазой Sssl ("СибЭнзим", Россия).

Секвепирование продукта МС-ПЦР. Продукт МС-ПЦР наносили на 1,5 % агарозный гель и очищали с использованием QLAquick Gel Extraction Kit ("Qiagen", Германия). Секвепирование проводили на секвенаторе SEQ 8000 ("Beckman-Coulter", США) в Центре коллективного пользования в "ГосНИИ генетика".

Бнсульфптное секвенирование. Бисульфитную конверсию образцов ДНК осуществляли набором EZ DNA Methylation Kit ("Zymo research", США), амплифицировали, очищали с использованием Invisorb Spin DNA Extraction Kit ("Stratec molecular", США), клонировали с помощью набора CloneJET PCR Cloning Kit ("Thermo Scientific", США) и секвенировали клоны на приборе ABI 3730 ("Applied Biosystems", США).

Статистическая обработка результатов. Расчет значимости различий между выборками выполняли с помощью точного критерия Фишера с применением программы Attestat. При проведении ROC-анализа применяли программы MedCalc v. 11.5 и Attestat.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На основании анализа биоинформационных баз данных и данных литературы были отобраны и экспериментально исследованы 14 генов микроРНК: mir-9-1, mir-9-3, mir-34b/c, mir-107, mir-124a-3, tnir-125bl, mir-130b, mir-137, mir-129-2, mir-193a, mir-203, mir-212, mir-375 и mir-1258. Экспериментальная часть включает исследование выборки парных образцов опухолей и гистологически нормальной ткани от пациентов с немелкоклеточным раком легкого и раком толстой кишки, а также образцов ткани тех же органов от доноров без онкопатологии в анамнезе. В качестве основного метода исследования использован метод метил-специфичной ПЦР (МС-ПЦР). Корректность результатов, полученных методом МС-ПЦР, проверена и подтверждена с применением метода бисульфитного секвенирования на примере генов mir-34b/c и mir-124a-3 в отдельных образцах HMPJI. Анализ метилирования гена mir-34b/c выполнен прямьм секвенированием продукта МС-ПЦР, а гена mir-124a-3 с помощью секвенирования предварительно полученных клонов бисульфит-конвертированной ДНК.

2.1 Профиль метилирования генов микроРНК при HMPJI

Первичный скрининг перечисленных 14 генов микроРНК при HMPJI был проведен на образцах опухолей и гистологически нормальной ткани легкого 11 пациентов и ткани легкого 14 доноров без онкопатологии в анамнезе. По результатам первичного скрининга дальнейшее исследование генов mir-107 и mir-130b признано неперспективным, т.к. для этих генов показано практически полное отсутствие метилирования.

Анализ метилирования 12 генов микроРНК при HMPJI выполнен на выборках, включающих от 39 до 46 парных образцов опухолей и гистологически нормальной ткани пациентов с НМРЛ и 20 образцов ткани легкого от доноров без онкопатологии.

При проведении МС-ПЦР, специфичной к неметилированному аллелю, продукт амплификации выявлен во всех анализированных образцах ДНК опухолей. Образование такого продукта при анализе ДНК первичных опухолей связывают, главным образом, с их загрязнением прилежащей гистологически нормальной тканью и наличием в опухолевом очаге клеток иммунной системы и ассоциированных фибробластов. Таким образом, наличие метилирования определяли по результатам МС-ПЦР с праймерами, специфичными к метилированным аллелям. Корректность результатов, полученных методом МС-ПЦР, проверена и подтверждена с применением секвенирования продукта МС-ПЦР локуса mir-34b/c. Карты CpG-островков, перекрывающих регуляторные районы генов микроРНК и положение соответствующих сайтов связывания праймеров показаны на примере четырех генов (mir-203, mir-212, mir-375 и mir-1258) на рис. 1.

На основании результатов анализа метилирования методом МС-ПЦР рассчитаны частоты метилирования 12 генов микроРНК при НМРЛ (39-46 случаев), в т.ч. ПРЛ (32 случая) и АД (16 случаев); результаты анализа показаны графически на рис. 2, 3 и 4, отражая профили метилирования 12 генов микроРНК при НМРЛ, ПРЛ и АД.

Как следует из полученных данных частоты метилирования СрО-островков 9-ти генов микроРНК (т/г-9-/, тг>-9-3, пиг-34Ь/с, ти-124аЗ, ти-~ 125Ы, т1г-129-2, ти--193а, т'1Г-212, пиг-З75) в опухолях при НМРЛ достигают 46-63%. Статистически значимые различия (р<0.05 по Фишеру) между частотами метилирования в образцах опухолей и гистологически нормальной ткани пациентов с НМРЛ установлены для 10-ти генов: та-9-1, >тг-9-3, т1г-34Ь/с, пиг-124а-3, т1г-125Ы, ти--137, ти--129-2, т1г-212, ти--375 и т1г-1258.

17р13.3

MF щ I» *

♦ MR

»m

CpG-ОСТрОБ

mir-375

2q35

LOC100129176

MF y UF >

CpG-OCTpOB

mir-1268

2q31.3

■a-'i. , £ ! -a

4 MR <UR

CpG остров

Рисунок 1. Локализация CpG-островков в промоторных регионах и дизайн праймеров для четырех генов микроРНК (mir-203, mir-212, mir-375 и mir-1258). Праймеры подобраны с помощью программ Primer Select ("DNAstar", США) и MethPrimer Express ("Invitiogen", США). Участок связывания включал от 4 до 7 CpG на пару праймеров и от 4 до 10 цитозиновых остатков, окружающих CpG-динуклеотиды. MF/MR - прямой и обратный праймеры к метилированному аллелю; UF/UR -прямой и обратный праймеры к неметилированному аллелю; 100 п.о. - масштаб.

100 -I

80

0.021 5.3ПО' 0,006

0,004 4,3*10 s 2,6*10 » 6,6*10'*

1,7*10" 2,8*10"

0,005

mir-S-1 mir-3-3 mir- mir- mir- mir- mir-137 mir- mir-203 mir-212 mir-375 mir-ЗДЬ'с 124a-3 125Ы 129-2 193a 12S8

■ Опухоль о Условная норма о Норма Рисунок 2. Профиль метилирования 12 генов микроРШС в образцах опухолевой и гистологически нормальной ткани (условная норма) тех же пациентов с HMPJI, а также нормальной ткани легкого от доноров без онкопатологий в анамнезе (норма). Показаны статистически значимые вероятности, рассчитанные с помощью точного теста Фишера.

100 1

0,004 3,8*10* 0,002 0,001 0,002

0,067 0,004 0,002 0,038 0,023

mir -9-1 mir -9-3 mir- mir- mir- mir- mir-137 mir- mir-203 mir-212 mir-375 mir-34b.'c 124a-3 12SM 129-2 193a 12S8

■ Опужгль □ Условная норма

Рисунок 3. Профили метилирования 12 генов микроРНК в образцах опухолевой и гистологически нормальной ткани тех же пациентов с ПРЛ. Статистическую значимость рассчитывали при помощи точного теста Фишера. Даны показатели достоверных (р<0.05) различий и показатели маргинальной значимости (0.05<р<0.1) (когда обнаруженное различие достоверно на 94% в отличие от стандартного доверительного интервала 95% при р=0.05).

mir-9-1 mir-9-3

mir-137

mir-203 mir-212 mir-375 rnir-1258

■ Опухоль □ Условная норма Рисунок 4. Профили метилирования 12 генов микроРНК а образцах опухолевой и гистологически нормальной ткани (условная норма) тех же пациентов с АД. Статистическую значимость рассчитывали при помощи точного теста Фишера. Даны показатели достоверных (р<0.05) различий и показатели маргинальной значимости (0.05<р<0.1) (когда обнаруженное различие достоверно на 94% в отличие от стандартного доверительного интервала 95% при р=0.05).

Следует отметить, что у семи генов микроРНК (mir-34b/c, mir-124a3, mir-125Ы, mir-137, mir-129-2, mir-212, mir-1258) из 12 изученных частоты метилирования в образцах тканей легкого от 20 доноров без онкопатологии варьировали 0-5%, и составили 10% у mir-375. Интересно, что частота метилирования этих восьми генов была в 2-3 раза выше в гистологически нормальной ткани легкого пациентов с HMPJI. Повышение частоты метилирования гена в условной норме по сравнению с нормой по донорам может означать, что события, выявленные нами на молекулярном уровне, опережают изменения на морфологическом уровне, и может указывать на вовлеченность в онкогенез ткани, близлежащей к опухоли. Можно предполагать также, что метилирование этих генов относится к ранним событиям в патогенезе легкого.

Напротив, для генов mir-9-l, mir-9-З и mir-193a отмечены высокие частоты метилирования и в образцах гистологически нормальной ткани легкого пациентов с HMPJI, и в образцах тканей легкого от 20 доноров без онкопатологии, составившие 20, 35 и 37-40%, соответственно. Для генов mir-9-1, mir-9-З и mir-193a, по данным литературы, выявлены черты онкосупрессоров и показана роль метилирования в эпигенетической инактивации при раке легкого (Lujambio et al, 2008; Tan et al., 2010; Kitano et al., 2011; Heller et al., 2012). С учетом таких данных, можно предположить специфическое метилирование этих онкосупрессорных генов в тканях легкого

здоровых людей региона России, возможно обусловленное экологическими особенностями нашего региона.

Статус метилирования промоторного участка mir-34b/c при HMPJI по данным литературы изучен подробно, однако окончательной ясности в этом вопросе нет. Так, частота выявления метилирования локуса mir-34b/c различается в опубликованных работах от 41% до 26% (Watanabe et al.,2011; Тапака et al, 2012). Причем при анализе клеточных линий и первичных опухолей рака легкого оказалось, что метилирование локуса mir-34b/c встречается существенно чаще при МРЛ, чем при НМРЛ (р<0.001) (Тапака et al., 2012). Согласно нашим результатам частота метилирования CpG-островка промоторного района локуса mir-34b/c в первичных опухолях НМРЛ достигает 63%, в гистологически нормальных тканях легкого пациентов - 20% и в образцах тканей легкого доноров без онкопатологии — 5%. Данные литературы наряду с нашими результатами убедительно свидетельствуют в пользу онкосупрессорной функции гена mir-34b/c.

Ранее гиперметилирование локуса mir-124a-3 в опухолях легкого было выявлено с частотой 48-50% (Lujambio et al., 2007; Tan et al, 2010; Kitano et al, 2011). Согласно нашим результатам частота метилирования промоторного района гена mir-124a-3 в опухолях НМРЛ составляет 48%, в условной норме пациентов — 13% и в образцах ткани легкого от доноров метилирование не обнаружено. Полученные результаты хорошо согласуются с данными литературы.

Метилирование CpG-островков девяти генов микроРНК (mir-129-2, mir-203, mir-212, mir-107, mir-130b, mir-137, mir-125bl, mir-375, mir-1258) исследовано в первичных опухолях НМРЛ впервые. Статистически значимые различия между частотой метилирования в опухолях и гистологически нормальной ткани легкого нациента выявлены для шести генов: mir-129-2, mir-212, mir-137, mir-125bl, mir-375 и mir-1258. Ранее для каждого из этих генов имелись экспериментальные данные о вовлеченности в патогенез эпителиальных отгухолей.

Так, при НМРЛ выявлено снижение экспрессии гена mir-137 (Dacic et al., 2010) и на клеточных линиях с помощью деметилирующего агента показана роль метилирования в подавлении активности этого гена (Zhu et al., 2013). Нами впервые определена частота метилирования CpG-островка mir-137 в первичных опухолях легкого, составившая 31%.

Данные литературы о роли mir-375 в патогенезе легкого неоднозначны. Так, показано повышение экспрессии mir-375 при МРЛ (Zhao et al., 2012), нейроэидокринном раке легкого (Nishikawa et al., 2011) и аденокарциноме (Yu et al., 2010). При НМРЛ, напротив, показано снижение экспрессии mir-375 (Friboulet et а!., 2011; Li et al, 2012). Выявленное нами впервые гиперметилирование mir-375 в первичных опухолях НМРЛ с частотой до 56% может быть механизмом подавления активности этого гена в опухолях легкого, что позволяет предположить опухоль-супрессорную функцию mir-375 при НМРЛ.

Нами впервые обнаружено метилирование CpG-островка гена mir-1258 при HMPJI с частотой 36%. Ранее установлено 3-х кратное снижение уровня экспрессии mir-1258 при HMPJI (Liu et al„ 2012). Наши данные о гиперметилировании mir-1258 показывают, что механизм подавления mir-1258 при HMPJI может быть связан с метилированием этого гена. Ранее было также показано, что ген mir-1258 при НМРЛ и РМЖ выполняет функцию негативного регулятора экспрессии гена гепараназы (HPSE), участвующей в регуляции ростовых и ангиогенпых процессов (Zhang et al„ 2011; Liu et al, 2012). HPSE характеризуется повышенной экспрессией в опухолях разных локализаций, которая увеличивается с метастазированием. Сопоставление наших и литературных данных позволяет предположить, что гиперметилирование mir-1258 может быть опосредованно вовлечено в активацию гена HPSE при НМРЛ.

Данные литературы о роли mir-212 в патогенезе НМРЛ неоднозначны. Рядом исследований показана повышенная экспрессия mir-212 в опухолях легкого с различной гистологией (Yanaihara et al., 2006; Rabinowits et al., 2009). С другой стороны, in vivo и in vitro показано, что ген mir-212 снижает свою экспрессию в клеточных линиях и первичных опухолях НМРЛ (Incoronato et al., 2010). Причем, восстановление экспрессии mir-212 в клеточных линиях НМРЛ активирует пролиферацию, процессы миграции и инвазии (Li et al, 2012). Сделано предположение, что модификации гистонов (НЗК27шеЗ, НЗК9те2 и НЗК9Ас) ответственны за подавление экспрессии mir-212 при НМРЛ (Incoronato et al, 2011).

Нами впервые изучено метилирование гена mir-212 в первичных опухолях НМРЛ. Согласно нашим результатам, CpG-островок гена mir-212 метилирован в опухолях при НМРЛ с частотой 48%, в условно нормальной ткани легкого пациентов с частотой 11% и в ткани легкого у доноров без онкопатологии с частотой 5%. Эти данные могут означать вовлеченность метилирования mir-212 в патогенез НМРЛ и, возможно, в эпигенетическую инактивацию этого гена.

Связь с прогрессией заболевания НМРЛ

Проведен анализ возможных корреляций частот метилирования 12 генов микроРНК с показателями прогрессии НМРЛ, и раздельно ПРЛ и АД. На основании полученных результатов были рассчитаны возможные корреляции частот метилирования генов микроРНК с клинической стадией (III/IY vs. I/II), со степенью анаплазии (Id vs. md/hd), с размером опухоли (ТЗ/Т4 vs. Т1/Т2) и с появлением метастазов в регионарных узлах (N1/N2 vs. N0). Выявленные корреляции представлены на рис. 5 и 6.

Так, установлены значимые корреляции частоты метилирования генов mir-125bl и mir-137 со стадией НМРЛ и mir-I25bl — с метастазированием при НМРЛ, а также маргинально значимые корреляции частоты метилирования генов mir-124a-3 со стадией НМРЛ и mir-125bl, mir-137 и mir-203 с увеличением размера опухоли. При ПРЛ выявлены только маргинально значимые корреляции для гена mir-125bl с клинической стадией и размером

опухоли и для гена т'п-203 с метастазированием. Причем, показана тенденция связи активного метастазирования с деметилированием гена ппг-203.

A 10Q

80

ео

20 -

В юо

80

Р=0,0496

N1ÍN2

mir-124a-3

m¡r-125b! mír-137

m¡r-125t>1

100 п

60 %

АО

20 -

Р=0,073

ТЗЯ4

m¡r-137

Р=0,08б

ТЗЯ4

Т1Я21

mir-203

Рисунок 5. Корреляция частоты метилирования генов микроРНК с прогрессией HMPJI. Анализ выполнен с учетом клинико-гието логических данных пациентов: А, клинической стадии (I+II/III+IV); В, размера опухоли (Т1/Т2/ТЗ+Т4); В, отсутствия (N0) или наличия (N1/2) метастазов в лимфоузлах. Статистическую значимость рассчитывали при помощи точного теста Фишера.

Согласно данным литературы, для гена mir-l25bl показана связь экспрессии с клинико-патологическими свойствами опухолей. Так, показано, что к генам-мишеням mir-125bl относится ген ETS1, для которого установлена повышенная экспрессия при метастазирующем РМЖ и корреляция с плохим прогнозом (Soto-Reyes et al., 2012). Ранее также показано, что эпигенетическая инактивация mir-125bl вносит вклад в формирование инвазивного фенотипа при гепатоцеллюлярной карциноме. В частности, mir-125bl подавляла экспрессию ММР-2 и ММР-9 - генов, участвующих в деградации межклеточного матрикса (Alpini et al., 2011).

Рисунок 6. Корреляция частоты метилирования генов микроРНК о прогрессией ПРЛ. Анализ выполнен с учетом клинико-гистологических данных пациентов: клинической стадии (I+II/lII+rV); размера опухоли (Т1/Т2/ТЗ+Т4); отсутствия (N0) или наличия (N1/2) метастазов в лимфоузлах. Статистическую значимость рассчитывали при помощи точного теста Фишера.

Нами впервые показана статистически значимая (р< 0.05) корреляция частоты метилирования гена mir-125bl с клинической стадией НМРЛ (44% при I+II против 83% при III+IV) и наличием метастазов в региональных лимфоузлах (41% при No против 76% при N1+N2). Кроме того, нами показана маргинально значимая корреляция частоты метилирования mir-125bl с размером опухоли (46% при Т1+Т2 против 82% при Т3+Т4) (рис. 5).

Метилирование промотора гена mir-137 ассоциировано с худшим прогнозом заболевания при опухолях головы и шеи ( Wang et al., 2011).

Нами впервые показано, что метилирование CpG-островка гена mir-137 связано с прогрессией НМРЛ. Так, частота метилирования гена mir-137 статистически значимо (Р< 0.05) ассоциирована со стадией НМРЛ (19% при I+II против 58% при II1+IV) и маргинально значимо - с размером опухоли (21% при Т1+Т2 против 55% при ТЗ+Т4) (рис. 5).

В нашей работе показаны маргинально значимая корреляция повышения частоты метилирования mir-203 с размером опухоли при НМРЛ (Р=0,08б), но понижения частоты метилирования mir-203 с метастазированием при ПРЛ (Р=0,06) (рис. 5 и 6). Данные литературы по свойствам и функции гена mir-203 также весьма противоречивы. Например, для РТК показана ассоциация гиперэкспрессии гена mir-203 с агрессивным характером опухолей (Yantiss et al., 2009), однако в другой работе показано, что гиперэкспрессия mir-203 может подавлять пролиферацию и активировать апоптоз (Li et al., 2011).

Анализ метилирования методом бисулъфитного секвенирования

Корректность результатов, полученных методом МС-ПЦР, проверена и подтверждена с применением метода бисульфитного секвенирования на примере локуса ти--124а-3. Анализ метилирования т'1г-124а-3 выполнен с применением секвенирования предварительно полученных клонов амплифицированного фрагмента этого гена с праймерами, специфичными к бисульфит-конвертированной последовательности. Изучены парные образцы НМРЛ №709 и №831. На рис. 7 приведена последовательность локуса янг-124а-3 и результаты бисульфитного секвенирования для случая №831.

А

6&^УЗДíMG^aДGIaз:sesa!rIrгtИ|aatИ|qaaq^qattqgaataatataat:|Я|at!:gaaДtaa||gfctt:t^

______X 2 4 5 6 7

ltttterttИttaii#sУЩÍaaaгШtttaaa^tt^ШtttttP|aaPiaagattttaЩ¡!:aaa^:l:Д|a■at.fЩ 8 3 10 11 12 13 1415 16 17 18 19 20

gtttЩattttggttt^aЩctЛtg|ttШt:t1:ta9ttttgsgggtttttttgДtgtttatagHgattttg 21 22 23 24 25 26 27 28

м."г ААеез1 аябсестсмдат ■ишзье

831 N

№ клона

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1

2 Щ

1

4

5

6 «г

7

8

9

10

11

и

13

14

15

16

17

18

19

28

21

22

23

24

25

26

27

28

Рисунок 7. Результаты бисульфитного секвенирования промоторного района гена т1г-124а-3 в образцах 831-Т и 831 -М. А - Нуклеотидная последовательность бисульфитно конвертированной ДНК региона гена т1г-124а-3. Позиции праймеров подчеркнуты; позиции СрО-динуклеотидов выделены и пронумерованы; Б -результаты анализа метилирования 28 СрО-динуклеотидов этого региона в 14 клонах ДНК опухоли (831-Т) и в 14 клонах ДНК гистологически нормальной ткани легкого того же пациента (831-Ы).

Результаты бисульфитного секвенирования согласуются с данными, полученными с применением метода МС-ПЦР. Бисульфитным секвенированием метилирование в образце опухоли 831-Т обнаружено с частотой 40%, а в образце гистологически нормальной ткани легкого 831-Ы с частотой 3%. При этом методом МС-ПЦР в образце опухоли 831-Т метилирование обнаружено, а в образце 831-Ы не обнаружено. В образце опухоли 709-Т метилирование обнаружено с частотой 6,6%, а в образце 709-И с частотой 3,2%, что соответствовало отсутствию метилирования в этих образцах при использовании метода МС-ПЦР.

2.2 Профиль-метилирования генов микроРНК при РТК

Были исследованы СрО-островки семи генов микроРНК (т\г-9-1, т1г-9-3, т1г-34Ь/с, т1г-129-2, т1г-193а, т\г-203 и т1г-2Щ в парных образцах опухолевой и морфологически не измененной ткани толстой кишки пациентов с РТК, а также в образцах ткани толстой кишки доноров без онкопатологии в анамнезе. Суммарная выборка составила 39 случаев РТК (а именно, аденокарциномы толстой кишки) и 14 доноров без онкопатологии. В исследованной выборке РТК представлены опухоли, локализованные во всех отделах толстой кишки - ободочной, сигмовидной и прямой кишке.

Метилирование Срв-островков четырех генов микроРНК (т/г-9-7, т\г-9-3, т'1Г-34Ь/с, т1г-129-2) исследовано на полной выборке из 39 случаев РТК, а трех генов микроРНК (т '1Г-193а, т\г-203, ш1Г-212) на выборке из 11-24 случаев РТК. Метилирование четырех генов (тгг-9-3, тгг-193а, т'1г-203 и тгг-212) исследовано в первичных опухолях РТК впервые.

На основании полученных данных рассчитаны частоты метилирования семи генов микроРНК при РТК; результаты анализа представлены графически на рис. 8, который отражает профиль метилирования этих генов микроРНК при РТК. Частоты метилирования семи генов микроРНК (т\г-9-1, тп-973, т\г-34Ь/с, Ш1Г-129-2, т'1г-193а, т1г-212, т1г-203) в опухолях при РТК варьируют от 38% до 85%. Статистически значимые различия (/?<0.05 по Фишеру) между частотами метилирования в образцах опухолей и гистологически нормальной ткани пациентов установлены для 4-х генов: т\г-9-1, т~1Г-9-3, т'1Г-34Ь/с, т\г-129-2 (рис. 8).

Частоты метилирования генов т\г-9-1, т1г-9-3 и т'1г-34Ыс в образцах ткани толстой кишки доноров без онкопатологии варьировали от 21% до 36 %, а в условной норме от 28% до 36%. Высокая частота обнаружения метилирования данных генов микроРНК в образцах ткани толстой кишки и в условной норме, и у доноров без онкопатологии, возможно, является свойством данного вида ткани, связанным с выполняемой функцией.

Частота метилирования гена пиг-129-2 повышается от 0% в ткани толстой кишки доноров без онкопатологии до 26 % в гистологически нормальной ткани пациентов с РТК. Данное изменение носит выраженный опухоль специфичный характер.

mir-9-1

mir-s-з

8,1*10'

1,1*10-'

гшг-34Ь/с mir-129-2 rnir-i93a mir-203

mir-212

■ Опухоль □ Условная норма п Норма

Рисунок 8. Профиль метилирования 7 генов микроРНК на выборке опухолевой и гистологически нормальной ткани (условная норма) пациентов с РТК и нормальной ткани толстой кишки от доноров без онкопатологии в анамнезе (норма). Показаны статистически значимые вероятности, рассчитанные с помощью точного теста Фишера.

Сравнение профилей метилирования генов микроРНК при HMPJT и РТК показывает, что для РТК в целом характерна более высокая частота обнаружения метилирования CpG-островков генов микроРНК, чем для HMPJL Метилирование гена mir-212 наблюдается в 50% случаев HMPJI и только в 40% случаев РТК и, по-видимому, более специфично для HMPJ1.

По данным литературы поведение генов mir-9-l и mir-9-З при РТК отличается двойственностью. Повышенной экспрессией генов семейства mir-9 характеризуются опухоли РТК с отдаленными метастазами (Zhu et al., 2012). В в других работах показано, что mir-9-l и mir-9-З метилированы в клеточных линиях РТК, ген mir-9-l метилирован в первичных опухолях РТК с частотой 56% и метилирование mir-9-l ассоциировано с присутствием метастазов в лимфоузлах (Bandres et al., 2009; Vinci et al., 2013). Полученные в данной работе результаты о высокой частоте метилирования генов mir-9-l и mir-9-З при РТК (рис. 8) и данные литературы позволяют предполагать роль онкосупрессоров для этих генов на стадиях онкогенеза до метастазирования. Можно отметить, что в нашей работе впервые исследовано метилирование mir-9-3 на клиническом материале РТК и определена частота метилирования этого гена в первичных опухолях, достигающая почти 80% (рис. 8).

Метилирование промоторной области гена mir-34b/c, по данным литературы, ассоциировано со снижением содержания этих микроРНК mir-34b и mir-34c в клеточных линиях и образцах первичных опухолей РТК, причем

частота метилирования достигала 90% {Toyota et al., 2008). Результаты, полученные в нашей работе, согласуются с данными литературы и показывают важную роль метилирования гена mir-34b/c в патогенезе РТК.

По данным литературы метилирование гена mir-129-2 обнаружено в клеточных линиях и первичных опухолях толстой кишки с частотой 91% (Bandres et al., 2009). Наши результаты согласуются с данными литературы. Нами показано, что mir-129-2 метилирован в первичных опухолях РТК с частотой до 77%, в условной норме пациентов с частотой 26% и в ткани толстой кишки доноров без онкопатологии метилирование mir-129-2 не обнаружено.

2.3 Диагностическое применение систем маркеров, основанных на анализе метилирования генов микроРНК, при НМРЛ и РТК

В качестве молекулярных маркеров широко используются тесты по изменению экспрессии наборов генов микроРНК в тканях опухолей, крови, плазме и других биологических жидкостях пациента. Панели маркеров на основе экспрессии генов микроРНК позволяют различать типы опухолей легкого (МРЛ и НМРЛ) и подтипы НМРЛ - АД и ПРЛ (Wu et al., 2011), выявлять заболевание на ранней стадии по анализу плазмы крови (Ren Y., 2011), а также выделять группы пациентов с плохим прогнозом выживаемости (Jassem and Skrzypski, 2012). Возможности использования метилирования CpG-островков генов микроРНК для диагностики и прогностических целей при НМРЛ и РТК изучены слабее. Имеется единственный патент для диагностики опухолей разных локализаций, основанный на определении экспрессии и/или статуса метилирования генов mir-148, mir-34b/c и генов семейства mir-9 (Lujambio and Esteller, 2010). Хотя применение этих методов при анализе опухолевой ткани и/или биологических жидкостей пациента позволяет различать опухоли с метастатическим потенциалом и при наличии метастазов.

Системы маркеров для диагностики НМРЛ

На основе полученных результатов по изменению метилирования группы генов микроРНК нами проведена оценка диагностических качеств панелей маркеров. Были оценены системы маркеров по способности различать опухолевую и нормальную ткань. Методом сравнения диагностических качеств панелей генов микроРНК был выбран метод ROC-анализа. В качестве группы «случай» использованы данные полной выборки образцов НМРЛ (48 случаев) без разбиения на подтипы; в качестве группы «контроль» использованы выборка гистологически нормальной ткани легкого (условная норма) от тех же пациентов (48 случаев) и выборка ткани легкого от 20 доноров без онкопатологии в анамнезе.

При использовании в качестве маркера какой-либо одной из исследованных микроРНК, не достигается требуемых практикой значений чувствительности и специфичности. Для подбора системы маркеров был

проведен анализ сочетаний генов микроРНК для достижения наилучшего соотношения чувствительности, специфичности и AUC. Панели генов микроРНК оценивали по параметру индекса метилирования с определением оптимального отсекающего значения для максимизации чувствительности и специфичности. Под индексом метилирования понимается отношение числа метилированных локусов к общему числу локусов модели.

По результатам предварительного анализа сочетаний двух, трех и более маркеров были отобраны гены, которые вносят наибольший вклад в повышение диагностических характеристик системы маркеров: mir-125bl, mir-375, mir-129-2, mir-34b/c, mir-124a-3, mir-137 и mir-1258. Расчеты проведены для панели, составленной из пяти генов микроРНК, выявленных впервые в данной работе Оmtr-l25bl, mir-375, mir-129-2, mir-137 и mir-1258, рис. 9); и для панели семи наиболее представительных маркеров, включающих также гены mir-34b/c, mir-124а-3, описанные в литературе ранее (рис. 10).

Более показательным можно считать сравнение данных для опухоли с данными для нормы (доноры без онкопатологии), чем с условной нормой пациентов. На рис. 9 и 10 показано построение ROC-кривых для двух вариантов (контроль — условная норма, либо норма по донорам без онкопатологии).

А Б

Рисунок 9. КОС-анализ по параметру индекс метилирования для системы из пяти маркеров: тЬг-125Ы, ттг-129-2, т1г-137, т1г-375, ппг-1258. А - результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и нормы (доноры без онкопатологии в анамнезе); Б — результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и условной нормы, вс - чувствительность; ЮО-вр — доля ложно положительных результатов. А11С - показатель интегральной оценки качества и предсказательной способности модели; критерий — критерий отсечения ЛОС-кривой.

100

80

60 Se

40 20 0

7

Sensitivity: 81.1 Specificity: 95.0 Criterion: >0,1429

AUC=0,947

100

60

Se

40 20

Sensitivity: 81,1 Specificity: 83,8 Criterion : >0,1429

AU 00,8,86

0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 100-Sp 100-Sp

Рисунок 10. ROC-анализ no параметру индекс метилирования для системы из семи маркеров: mir-125bl, mir-375, mir-129-2, mir-34b/c, mir-124a3, mir-137, mir-1258. A -результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и нормы (доноры без онкопатологии в анамнезе); Б - результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и условной нормы. Se - чувствительность; 100-Sp - доля ложноположительных результатов; AUC - показатель интегральной оценки качества и предсказательной способности модели; критерий — критерий отсечения ROC-кривой.

Как следует из рис. 9 и 10, каждая из рассмотренных систем (из 5 и 7 маркеров) имеет преимущества по какому-либо параметру (специфичности и чувствительности) и может найти применение в тестировании конкретного пациента. Качество модели (интегральный параметр) у обеих систем (если сравнение проводить с нормой по донорам) можно считать отличным - AUC варьирует между 0,9 и 1. В случае применения выборки норм от доноров без онкопатологии в анамнезе в качестве группы «контроль» значение критерия отсечения (порог отсечения) для панели из 5 генов равен «О», что означает возможность диагностики уже по одному идентифицированному локусу из панели. В случае выборки условных норм от тех же пациентов для постановки диагноза необходимо обнаружить метилирование минимум 2-х локусов из панели. В случае панели из 7 генов критерий отсечения равен одному локусу и, следовательно, для постановки диагноза необходимо обнаружить метилирование минимум 2-х локусов из панели.

Системы маркеров для диагностики РТК

Аналогичным образом, метод ЯОС-анализа применили для формирования и оценки системы маркеров для диагностики РТК. В качестве группы «случай» использованы данные полной выборки образцов опухолей РТК (39 случаев); в качестве группы «контроль» использованы выборка

условных норм от пациентов (39 случаев) и выборка ткани толстой кишки от 14 доноров без онкопатологии в анамнезе. Для анализа взяты только те гены микроРНК, которые показали опухоль специфичное гиперметилирование: т'и-9-1, 1тг-9-3, пйг-34Ь/с, пнг-129-2. Далее проведен анализ сочетаний генов микроРНК для достижения наилучшего соотношения чувствительности, специфичности и Аис. Панели групп генов микроРНК оценивали по параметру индекса метилирования с определением оптимального отсекающего значения для максимизации чувствительности и специфичности. Расчеты проведены для панели из 4-х генов и представлены на рис. 11.

Критерий отсечения для норм доноров составил 1 локус, для условных норм составил 2 локуса. Качество модели можно считать отличным — Аис составляет 0,95 и 0,93. Если сравнивать с нормой (доноры без онкопатологии), чувствительность системы составляет 97%, а специфичность — 79%. При сравнении с условной нормой чувствительность системы ниже и равна 82%, а специфичность оказалась выше — до 92%. Но повышение этой величины при сравнении с условной нормой скорее связано с особенностями выборок, тем более что их численность составила 39 случаев РТК и только 14 норм доноров без онкопатологии. Тем не менее, диагностическое значение этой системы для раннего выявления опухолей толстой кишки очевидно.

100

80

60 ве

40

20

ЭепзЫу: 97,4 Бреайсйу: 78,6 СгЛегюп: >0.25

А110=0,953

100

80

60 ве

40

20

0 -г'

20 40 60 80 100 ЮО-Эр

ЗепаЫу: 82,1 ЭреоМу: 92,3 Сгйепоп : >0,5

АиС=0,927

20 40 60 80 100 ЮО-Эр

Рисунок 11. 1ЮС-анализ по параметру индекс метилирования для системы из четырех маркеров: т1Г-9-1, т'1г-9-3, тгг-34Ь/с, т\г-!29-2. А - результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и норм (доноры без онкопатологии в анамнезе); Б -результаты, полученные при сравнении образцов опухолей и условной нормы, ве -чувствительность; 100-8р - доля ложноположительных результатов. А11С -показатель интегральной оценки качества и предсказательной способности модели; критерий - критерий отсечения ЯОС-кривой.

выводы

1. Исследовано метилирование Срв-островков 14 генов микроРНК при немелкоклеточном раке легкого. Метилирование СрО-островков девяти генов микроРНК (/и/г-/29-2, т1г-203, тг-212, т1г-107, ппг-130Ъ, ти-137, т'1Г-125Ы, тгг-375, т'1г-1258) исследовано в первичных опухолях НМРЛ впервые. Повышение частоты метилирования в опухолях по сравнению с гистологически нормальной тканыо легкого статистически значимо для группы генов микроРНК: т\г-9-1, т1г-9-3, т'1Г-34Ь/с, т'1г-124а-3, т1г-212, т1г-129-2, т'1Г-137, т1г-125Ы, т1г-375 и т\г-1258.

2. Идентифицирован новый локус, подверженный метилированию в опухолях, - СрО-островок, перекрывающий ген т\г-1258. Изменение статуса метилирования шести генов микроРНК (т/г-272, пиг-129-2, т\г-137, т1г-125Ы, т'1Г-375 и т1г-1258) в первичных опухолях НМРЛ выявлено нами впервые, причем повышение частоты метилирования в опухолях по сравнению с гистологически нормальной тканью легкого статистически значимо..

3. Исследовано метилирование СрО-островков семи генов микроРНК в первичных опухолях толстой кишки, из них для четырёх генов (ттг-9-3, т1г-193а, т'1Г-203, т\г-212) впервые. Показано статистически значимое повышение частоты метилирования генов: т\г-9-1, т1г-9-3, т1г-34Ь/с и т1г-129-2. Профили метилирования семи генов микроРНК при НМРЛ и РТК в целом похожи, хотя для РТК характерны более высокие частоты метилирования, чем для НМРЛ.

4. Впервые выявлена статистически значимая ассоциация частоты метилирования СрО-островка гена т\г-125Ы с со стадией НМРЛ и наличием метастазов в региональных лимфоузлах, и гена т1г-137 — со стадией НМРЛ.

5. Составлены системы информативных маркеров, позволяющие с высокой чувствительностью и специфичностью определять опухоль легкого и толстой кишки, причем в панель маркеров НМРЛ входят пять генов, исследованных в первичных опухолях легкого впервые (пиг-129-2, т'1г-137, т1г-125Ы, т'1г-375 и т'1г-1258).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Ходырев Д.С., Пронина И.В., Рыков C.B.. Береснева Е.В., Фридман М.В., Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. Метилирование группы генов микроРНК вовлечено в регуляцию экспрессии генов-мишеней RAR-beta2 и NKIRAS1 при раке легкого. Молекулярная биология. 2012. Т.46, № 5, С.773-785.

Рыков C.B.. Ходырев Д.С., Береснева Е.В., Пронина И.В., Корчагина EJL, Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. Профили метилирования группы генов микроРНК в опухолях легкого, почки и толстой кишки. Медицинская генетика. 2012. Т. 11, № 8, С.26-31.

Рыков C.B.. Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. Новые гены микроРНК, подверженные метилированию в опухолях легкого. Генетика. 2013. Т. 49, №7, С. 911-915.

Ходырев Д.С., Рыков C.B.. Пронина И.В., Казубская Т.П., Логинов В.И., Брага Э.А. Система маркеров на основе группы генов микроРНК для диагностики иемелкоклеточного рака легкого, включая плоскоклеточный рак и аденокарциному, и набор праймеров для маркера miR-375 этой системы. // Патентная заявка РФ 2012 №142228 от 04.10.2012.

Рыков C.B.. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Береснева Е.В., Пронина И.В., Казубская Т.П., Брага Э.А. Анализ метилирования промоторных областей генов микроРНК в опухолях толстого кишечника и легкого. Материалы 7-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения 2011». Санкт-Петербург, апрель, 2011. Приложение к Вопросам Онкологии, Т. 57, № 2, С. 54-55.

Рыков C.B.. Д.С. Ходырев, Е.В. Береснева, И.В. Пронина, М.В. Фридман, Т.П. Казубская, В.И. Логинов, Э.А. Брага. Метилирование группы генов микроРНК в опухолях легкого, включающих плоскоклеточный рак и аденокарциному. Материалы научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики», Москва, Россия, октябрь, 2011. Медицинская генетика Т. 10, № 10, 2011. С. 2021.

Ходырев Д.С., C.B. Рыков. Е.В. Береснева, И.В. Пронина, М.В. Фридман, Т.П. Казубская, В.И. Логинов, Э.А. Брага. Группа генов микроРНК подверженных метилированию при раке толстого кишечника. Материалы научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики», Москва, Россия, октябрь, 2011. Медицинская генетика Т. 10, № 10,2011. С. 23-24.

Рыков C.B.. Д.С. Ходырев, Е.В. Береснева, И.В. Пронина, Т.П. Казубская, В.И. Логинов, Э.А. Брага. Метилирование группы генов микроРНК в опухолях толстой кишки и легкого. Материалы XV Российского онкологического конгресса, Москва, Россия, ноябрь, 2011. С. 220-221.

Список сокращений

AUC - Area Under Curve

АД - аденокарцинома легкого

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

MPJI — мелкоклеточный рак легкого

МС-ПЦР - метилспецифичная ПЦР

НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого

п.о. - пара оснований

ПРЛ - плоскоклеточный рак легкого

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМЖ — рак молочной железы

РТК - рак толстой кишки

Подписано в печать:

23.04.2013

Заказ № 8408 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рыков, Сергей Викторович, Москва

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и

*

селекции промышленных микроорганизмов»

На правах рукописи

04201357434

н

РЫКОВ СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ГЕНЫ МИКРОРНК, ПОДВЕРЖЕННЫЕ МЕТИЛИРОВАНИЮ В ОПУХОЛЯХ ЛЕГКОГО И ТОЛСТОЙ кишки, и их ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

03.01.03 - Молекулярная биология

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Брага Элеонора Александровна

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АД - аденокарцинома легкого

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДНК-метилтрансфераза (DNMT)

ДСН - додецилсульфат натрия

ед. а. - единица активности

MPJT - мелкоклеточный рак легкого

мРНК - матричная РНК

МС-ПЦР - метилспецифичная ПЦР

МЭГ - мобильные элементы генома

HMPJT - немелкоклеточный рак легкого

п.н. - пара нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПРЛ - плоскоклеточный рак легкого

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМЖ - рак молочной железы

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТК - рак толстой кишки

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

ТФ - транскрипционый фактор

XJIJI - хроническая лимфоцитарная лейкемия

AUC - Area Under Curve

CAGE - cap analysis of gene expression

DGCR8 - DiGeorge Syndrome Critical Region Gene-8

DTT - дитиотреитол

HGC, High GC content

RISC- RNA-induced silencing complex

SAM - 8-аденозил-Ь-метионин

TSS - Transcription start site

UTR - untranslated region

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................................5

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................8

1.1. Метилирование Срв-островков у эукариот......................................................8

1.1.1 Метилирование ДНК Общие сведения.......................................................8

1.1.2 Распределение Срв-динуклеотидов в геноме человека, функции Срв-островков.................................................................................................................9

1.1.3 Функции метилирования Срв-островков в зависимости от геномного контекста................................................................................................................12

1.1.4 Группы генов и геномных элементов, инактивированные метилированием Срв-островков в норме..........................................................13

1.2. Метилирование ДНК и канцерогенез..............................................................14

1.2.1 Глобальное деметилирование генома опухолевой клетки......................14

1.2.2 Гиперметилирование Срв-островков в геноме опухолевой клетки......15

1.3. МикроРНК: гены, биогенез и механизм действия.........................................16

1.4. МикроРНК и канцерогенез...............................................................................20

1.5. Эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов микроРНК при онкопатологиях........................................................................................................25

1.6. Метилирование генов микроРНК при НМРЛ.................................................31

1.7. Метилирование генов микроРНК при РТК.....................................................34

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.....................................................................................38

2.1. Сбор материала..................................................................................................38

2.2. Выделение геномной ДНК из ткани................................................................38

2.3. Бисульфитная конверсия ДНК.........................................................................40

2.3.1 Бисульфитная конверсия ДНК в растворе................................................40

2.4. Метил-специфичная полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР)...................41

2.5. Бисульфитное секвенирование.........................................................................44

2.5.1 Секвенирование продукта МС-ПЦР..........................................................44

2.5.2 Бисульфитное секвенирование..................................................................45

2.6. Статистическая обработка результатов...........................................................45

2.6.1 Точный тест Фишера...................................................................................45

2.6.2 ЯОС-анализ..................................................................................................45

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..........................................................................47

3.1 Исследование метилирования Срв-островков генов микроРНК приНМРЛ48

3.1.1 Профиль метилирования 12 генов микроРНК при НМРЛ......................48

3.1.2 Связь метилирования Срв-островков генов микроРНК с прогрессией НМРЛ.....................................................................................................................60

3.1.3 Секвенирование продукта МС-ПЦР, специфичного к метилированному аллелю бисульфит-конвертированной последовательности пш-34Ь/с...........66

3.1.4 Анализ метилирования локуса т1г-124а-3 методом бисульфитного секвенирования.....................................................................................................66

3.2 Исследование метилирования Срв-островков генов микроРНК при РТК... 69

3.2.1 Профиль метилирования 7 генов микроРНК при РТК............................69

3.2.2 Связь метилирования СрО-островков генов микроРНК с прогрессией РТК.........................................................................................................................74

3.3 Роль метилирования изученных генов микроРНК в патогенезе опухолей .. 75

3.4 Диагностическое применение систем маркеров, основанных на анализе метилирования генов микроРНК, при НМРЛ и РТК............................................95

3.4.1 Системы маркеров для диагностики НМРЛ.............................................96

3.4.2 Система маркеров для диагностики РТК................................................100

ВЫВОДЫ.....................................................................................................................103

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................104

ВВЕДЕНИЕ

В развитых странах онкологические заболевания уверенно занимают второе место в структуре смертности, сменив инфекционные заболевания. Рак легкого стоит на третьем месте по заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей, как в мире, так и в России. В России от рака легкого умирают более 40 тыс. человек, причем в ряде регионов смертность у мужчин выше, чем в большинстве стран мира, достигая 60 и более случаев на 100 тыс. человек (Мукерт и Заридзе, 2010). На немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) приходится 85-87% всех мировых случаев выявления новообразований легкого. Причем этот вид рака легкого отличается частым метастазированием, а именно в 40% случаев на момент постановки диагноза. Пятилетняя выживаемость при диагностике на первой-второй стадии составляет 57-67%, на третьей - 5-25% и на четвертой - менее 1%, что ставит исследование патогенеза и выявление новых молекулярных маркеров немелкоклеточного рака легкого в ряд важных направлений современной молекулярной биологии и онкогенетики.

Рак толстой кишки (РТК) в России является чрезвычайно насущной проблемой, занимая четвертое место в структуре женской онкологической заболеваемости (-10 % в 2011 году в России), после рака молочной железы, и пятое место (5.8% в 2011 году в России) в структуре мужской заболеваемости после рака предстательной железы и легкого (Чиссов и др., 2012). Тяжесть заболевания и низкая выживаемость при раке толстой кишки связаны, прежде всего, с поздним выявлением опухоли. Так, при первичном обращении пациентов к врачу запущенные формы рака (III-IV стадии) диагностируются у 71% больных. Пятилетняя выживаемость больных РТК при выявлении заболевания на I стадии 1 составляет 96%, на II - 87%, на III - 55% и на IV - только 5%.

Аномальное функционирование и измененный профиль экспрессии генов системы контроля клеточного цикла, апоптоза и дифференцировки являются ключевым свойством злокачественного процесса (Hanahan and Weinberg , 2010). Исследования последних лет показывают, что эпигенетические нарушения, в совокупности с генетическими изменениями (мутациями генов, хромосомными аберрациями и изменением плоидности генома), составляют комплекс механизмов, ответственных за формирование фенотипа трансформированной клетки (Godfrey et

al., 2007). Эпигенетическими называют наследуемые изменения экспрессии генов, не затрагивающие последовательность ДНК. Эпигенетические механизмы необходимы для тонкой, динамичной и специфичной по времени и локализации регуляции экспрессии генов и вовлечены у млекопитающих в процессы эмбрионального развития (Reik et al., 2001). Метилирование ДНК играет важную роль в процессах развития, дифференцировки клеток, геномного импринтинга и транскрипционной инактивации мобильных элементов генома (Пендина и др., 2004). Изменение степени метилирования ДНК наблюдается при различных патологиях и характерно для онкологических заболеваний, при которых происходит глобальное деметилирование генома, особенно мобильных элементов, и избирательное гиперметилирование промоторов генов, проявляющих опухоль-супрессорные свойства {Jones and В aylin, 2007).

МикроРНК относятся к классу малых некодирующих РНК длиной 19-24 нуклеотида, выполняющих функцию посттранскрипционного регулятора экспрессии целевых генов (Катохин и др., 2006; Макарова и Крамеров, 2007). Зрелые микроРНК в составе RISC-комплекса присоединяются к 3'-нетранслируемой области матричных РНК целевых генов и блокируют процесс трансляции. В норме микроРНК выполняют важную регуляторную функцию в процессах развития, пролиферации, дифференцировки и апоптоза и характеризуются выраженной специфичностью в отношении места и времени действия (.Bartel, 2009). Показана важная роль дифференциальной экспрессии генов микроРНК в процессах злокачественной трансформации. Для HMPJI и РТК характерны свои специфические профили экспрессии генов микроРНК, ассоциированные с клиническими и патологическими свойствами опухоли (Meló and Esteller, 2011).

Экспрессия генов микроРНК также подвержена регуляции посредством эпигенетических механизмов, одним из которых является метилирование CpG-динуклеотидов в составе CpG-островков, перекрывающих промоторные участки генов (Lopez-Serra and Esteller, 2012). Следует отметить, что для генов микроРНК метилирование является более характерным эпигенетическим механизмом подавления экспрессии, чем для белок-кодирующих генов. Так, 11,5% всех генов микроРНК подвержены регуляции посредством метилирования (122 из 1048 генов

микроРНК по состоянию на 2011 год), для белок-кодирующих генов этот показатель составляет 1-2% (.Кипе/ е1 а1, 2011).

Цели и задачи исследования. Целью данной работы явилось изучение вовлеченности метилирования Срв-островков, перекрывающих промоторные участки генов микроРНК в патогенез НМРЛ и РТК и оценка диагностических качеств панелей маркеров на основе исследованных генов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать статус и частоту метилирования Срв-островков 14 генов микроРНК: 1тг-9-1, т1г-9-3, т1г-34Ь/с, т1г-107, тгг-124аЗ, т1г-125Ъ1, т1г-130Ь, т1г-137, тгг-129-2, пш-193а, пт-203, тп-212, Ш1г-375 и гтг-1258 на представительной выборке клинических образцов первичных опухолей и гистологически нормальной ткани легкого пациентов с НМРЛ и ткани легкого доноров без онкопатологий.

2. Исследовать статус и частоту метилирования Срв-островков семи генов микроРНК т1г-9-1, ш1г-9-3, т1г-34Ъ/с, т1г-129-2, т1г-193а, гтг-203 и пйг-212 на представительной выборке клинических образцов опухолей и гистологически нормальной ткани толстой кишки пациентов с РТК и ткани толстой кишки доноров без онкопатологий.

3. Исследовать корреляции между частотой метилирования изучаемых генов и клинико-патологическими свойствами первичных опухолей РТК и НМРЛ, а также их подтипов.

4. Разработать на основе полученных данных о частотах метилирования группы генов микроРНК панели молекулярных маркеров для ранней диагностики опухолей легкого и толстой кишки.

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метилирование CpG-островков у эукариот.

1.1.1 Метилирование ДНК. Общие сведения.

Метилирование ДНК у эукариот выступает важным эпигенетическим механизмом, вовлеченным в поддержание целостности генома, геномный импринтинг, регуляцию транскрипции и процесс эмбрионального развития {Suzuki and Bird, 2008). Метилирование представляет собой ковалентную модификацию ДНК, когда цитозиновый остаток в составе CpG-динуклеотида метилируется в позиции С5 пиримидинового кольца (Рис.1). Метилирование цитозина - основная эндогенная модификация ДНК у млекопитающих. Большинство 5'-метилцитозинов в ДНК млекопитающих присутствует в динуклеотидах 5'-CpG-3'. Метилирование цитозина наблюдали и в Non-CpG-последовательностях, таких как 5'-CpNpG-3' или в асимметричных 5'-СрА-3' и 5'-СрТ-3', но существенно реже (Ramsahoye et al., 2000).

SAM-CH, SAM . АЧ

УУ / >

3 N

DNMT

СИ

5-метилцитозин

Рисунок 1. Метилирование цитозина в положении С5 пиримидинового

кольца.

Метилирование цитозиновых остатков катализируется группой ферментов ДНК-метилтрансфераз (DNMT), которые переносят метальную группу с S-аденозил-Ь-метионина (SAM). У эукариот существует три основных ДНК-метилтранферазы - DNMT1, DNMT3A и DNMT3B (Yen et al, 1992; Окапо et al., 1999). Метилтрансфераза DNMT1 осуществляет функцию поддержания паттерна метилирования геномной ДНК, присоединяясь к вновь синтезированной цепи в процессе репликации и повторяет паттерн метилирования CpG-динуклеотидов

матричной цепи. Метилтрансферазы DNMT3A и DNMT3B осуществляют метилирование CpG-динуклеотидов de novo. Обратный процесс деметилирования значительно менее изучен и может происходить либо пассивно, например, при ингибировании метил азы DNMT1, либо активно, когда энзиматически отщепляется 5-метилцитозин. У млекопитающих, геномное деметилирование происходит в двух основных периодах репродуктивного развития: в первичных половых клетках при созревании гамет и в раннем эмбриогенезе в ходе делений дробления. Пассивное деметилирование происходит в доимплантационном развитии в женском пронуклеусе (Patkin et al., 2002); а для мужского пронуклеуса характерно активное деметилирование (.Mayer et al., 2000). В процессе эмбрионального развития с момента имплантации эмбриона происходит процесс метилирования de novo, определяющий картину метилирования в различных дифференцированных органах и тканях (Пашкин и др., 2010), и таким образом во взрослом состоянии паттерн метилирования является тканеспецифичным {Yagi et al., 2008; Ikegami et al., 2009). Аномальные изменения экспрессии генов метилтрансфераз DNMT1, DNMT3A и DNMT3B наблюдаются при новообразованиях легкого, печени, молочной железы, желудка, лейкемии и ретинобластоме (Ruo-Kai et al., 2002; Saito et al., 2003; Girault et al., 2003; Qu et al., 2010), причем гиперэкспрессия DNMT1 часто ассоциирована с плохим прогнозом {Ruo-Kai et al., 2002; Saito et al., 2003).

1.1.2 Распределение CpG-динуклеотидов в геноме человека, функции

CpG-островков.

Геном позвоночных можно разделить на две неравные части по содержанию CpG-динуклеотидов и уровню их метилирования. Основная часть CpG-динуклеотидов (около 90% от общего количества) представлена отдельными CpG-динуклеотидами и фрагментами по 50-100 п.н. и интенсивно метилирована, меньшая, около 10%, представлена фрагментами длиной от 200 до 10 п.н. и неметилирована (Illingworth and Bird., 2009). Фрагменты генома с содержанием G/C-нуклеотидов более 50% и обычно локализованные в 5'-областях генов, получили название CpG-островков (Gardiner-Garden et al., 1987). Основная часть CpG-островков представлена короткими фрагментами (до 1000 п.н.) с содержанием G/C-нуклеотидов 60-70% от общего количества. Количество CpG-островков в геноме человека оценивается примерно в 25000 единиц {Illingworth et al., 2008).

Самый большой CpG-островок покрывает 36619 п.н. и расположен на 10 хромосоме, 322 крупных CpG-островка включают приблизительно по 3000 п.н. В составе некоторых больших островков содержатся гены рибосомальных РНК и псевдогены рРНК, но они составляют менее 0.5% CpG-островков генома человека. В геноме человека CpG-островки распределены неравномерно. Так, ими обогащены хромосомы 12 и 22, но их очень мало в хромосоме 18. Большинство хромосом содержит 5-10 CpG-островков на 1 млн.п.н. Однако для хромосомы Y характерна низкая плотность (2.9 на 1 млн.п.н.), в то время как максимум принадлежит хромосоме 19 (43 CpG-островка на 1 млн.п.н.). Количество CpG-островков коррелирует с плотностью активных генов в соответствующих хромосомах (Craig and Bickmore, 1994).

Большинство, если не все, CpG-островки содержат сайты инициации транскрипции, включая те, что отстоят от аннотированных сайтов инициации на расстоянии в несколько тысяч пар нуклеотидов (Deaton and Bird, 2011). Свойства последовательности ДНК, обогащенной G/C-нуклеотидами, адаптируют CpG-островки для осуществления промоторных функций через дестабилизацию нуклеосом, привлечение факторов транскрипции и формирование транскрипционно активного состояния хроматина. Суммирование опубликованных данных позволило выделить два основных типа промоторов генов у эукариот: промоторы с высоким содержанием G/C-нуклеотидов (HGC, High GC content) и промоторы с низким содержанием G/C-нуклеотидов (LGC, Low GC content). Свойства промоторов представлены в таблице 1 и рисунке 2 ( Valen and Sandelin, 2011).

Приблизительно 70% аннотированных промоторов генома человека ассоциированы с CpG-островками и относятся к HGC-промоторам (Saxonov et al., 2006). HGC-промоторы свойственны практически всем генам «домашнего хозяйства», части тканеспецифических генов и генов, ответственных за регулирование эмбрионального развития (Zhu et al., 2008).

Работы последних лет проливают свет на функциональную роль CpG-островков, отстоящих от аннотированных TSS (Transcription start site) и находящихся в межгенном и внутригенном пространстве, и выявляют их промоторную функцию.

Таблица 1. Типы промоторов генома эукариот (Valen and Sandelin, 2011).

Свойство 1ЮС-промоторы ЬвС-промоторы

Характерные элементы промотора Срв-островки у позвоночных ТАТА-бокс

Диапазон 7Ж> Широкий Строго узкий

Специфичность экспрессии конститутивная тканесп