Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетические изменения при немелкоклеточном раке легкого.

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические изменения при немелкоклеточном раке легкого."

ШИКЕЕВА АМУЛАНГ АЛЕКСЕЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ЛЕГКОГО.

03.02.07 - генетика 14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 6 NAP 20U

Москва - 2014

005545843

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор биологических наук Завалишина Лариса Эдуардовпа

кандидат медицинских наук Кекеева Татьяна Владимировна

Официальные оппоненты:

Фаворова Ольга Олеговна, доктор биологических наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой молекулярной биологии и медицинской биотехнологии медико-биологического факультета

Чхиквадзе Владимир Давидович, доктор медицинских наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр рснтгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, главный научный сотрудник хирургического отдела

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт онкологии имени Н.Н.Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится « /Уъ&идШ2014 г. в часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д.1; www.med-gen.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан « 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук,

доктор медицинских паук, профессор ^ Зинчепко Рена Абульфазовпа

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Рак легкого является одним из самых распространенных злокачественных новообразований и одной из основных причин летального исхода у онкологических больных. По данным ВОЗ на 2008 год рак легких стал причиной смерти 1,3 миллиона человек. В 2011 в России зарегистрировано более 50 тысяч новых случаев рака легкого, при этом 36% случаев выявлено на 4 стадии заболевания (Чиссов В.И., 2011). Курение является одним из главных факторов риска развития рака легкого (курильщиками являются 87% пациентов с этой нозологией).

Летальность на первом году с момента установления диагноза составляет 53%. Пятилетняя выживаемость пациентов с раком легкого очень мала и составляет в разных странах от 5 до 18%, несмотря на высокий уровень развития современных методов диагностики и лечения.

Группа немелкоклеточного рака легкого (HMPJI) включает примерно 85% всех раков. Среди гистологических типов HMPJI - аденокарцинома, плоскоклеточный рак легкого, аденоплоскоклеточный, крупноклеточный рак. Первые два типа составляют 8090% всех HMPJI. Показано, что для каждого гистологического типа существует свой профиль генетический изменений, так, например, мутации генов EGFR, KRAS, транслокация EML4/ALK характерны для аденокарцином легкого (Grepmeier U., 2005). Для плоскоклеточного рака легкого показана амплификация генов FGFR1 и SOX2 (Sos M.L., 2012). Характерной особенностью нашей страны является преобладание плоскоклеточного рака, что обусловлено большим количеством курящего населения. В последнее время в связи с развитием персонализированного подхода к выбору тактики лечения онкологических больных важное значение имеют не только клинические характеристики пациента, а также гистологический тип опухоли, но и молекулярно-генетические особенности опухоли и их применение для диагностики, прогноза заболевания и определения чувствительности к таргетной терапии.

В ряде работ показано, что молекулярно-генетические изменения характерны не только для опухолевой ткани, но часто выявляются в смежных с опухолью условно нормальных тканях. Недавние исследования выявили, что опухолевое окружение HMPJI имеет гетерогенную структуру и играет важную роль в прогрессировании опухоли и эффективности лечения (Guo М., 2004).

Однако, несмотря на постоянно усовершенствующиеся подходы к диагностике и лечению пациентов с HMPJI, существует ряд проблем (таких как позднее выявление заболевания, низкий процент выживаемости пациентов и др.), решение которых в настоящее время является актуальным. Лечение пациентов с НМРЛ зачастую не приводит к ожидаемым эффектам, что обуславливает высокий процент рецидивов и прогрессиро-вания заболевания. В этом аспекте изучение молекулярно-биологических свойств опухолевых клеток и опухолевого окружения может оказать существенную помощь в решении проблем ранней диагностики, эффективности лечения и прогноза течения НМРЛ.

Настоящее исследование посвящено изучению генетических и эпигенетических нарушений в опухоли и смежных с опухолью условно нормальных тканях, а также оценке практической (диагностической и прогностической) значимости этих нарушений.

Цель исследования

Изучить молекулярно-генетические изменения в немелкоклеточном раке легкого и смежных с опухолью условно нормальных тканях.

Задачи исследования

1. Изучить аллельный дисбаланс локусов D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938 в HMPJI и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли.

2. Изучить аномальное метилирование промотора генов FHIT, TIMP3, CDH1, MGMT, RASSF1A, DAPK1, CD44 в HMPJI и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли.

3. Определить частоты мутаций генов EGFR и KRAS и транслокацию гена ALK в не плоскоклеточном HMPJI для определения чувствительности к таргетным препаратам.

4. Определить уровни экспрессии микроРНК: let-7a, miR-155, miR-205 - в опухолевой ткани и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли.

5. Провести сравнительный анализ выявленных молекулярно-генетических нарушений для различных гистологических типов HMPJI и других клинических параметров.

Научная новизна

Впервые на российской выборке проведено комплексное исследование молекулярно-генетических изменений НМРЛ: потери гетерозиготности (ПГ), микросателлит-ной нестабильности (МН), эпигенетических изменений на материале опухолевой ткани и смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии. Впервые на российской выборке проведено исследование уровней экспрессии ряда микроРНК в опухолевой ткани, смежных с опухолью нормальных тканях пациентов с НМРЛ. Впервые изучено состояние опухолевого окружения на различных расстояниях от опухолевого очага.

Практическая значимость

Определены молекулярно-генетические характеристики плоскоклеточного рака легкого (структурные нарушения локусов D9S925, D17S928, гиперметилирование промотора генов CDH1 и CD44), которые могут рассматриваться в качестве маркеров данного гистологического типа НМРЛ в сложных диагностических случаях в дополнение к данным иммуноморфологического исследования.

Выявлены молекулярно-генетические изменения, а именно аллельные нарушения микросателлитов D2S405, D3S1300, аберрантное метилирование промотора генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, снижение экспрессии микроРНК let-7a и miR-155, которые могут рассматриваться в качестве маркеров прогноза НМРЛ.

Определена чувствительность пациентов с аденокарциномой легкого к таргетным препаратам.

Выявлен и охарактеризован молекулярный профиль «опухолевого поля» при НМРЛ, что открывает перспективы дальнейшего усовершенствования оперативного и консервативного лечения пациентов с данной нозологией.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для НМРЛ характерны высокие частоты потери гетерозиготно-сти/микросателлитной нестабильности локусов D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938, гиперметилирование промоторов генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, CDH1, CD44, TIMP3, MGMT и снижение экспрессии микроРНК let-7a.

2. В смежных с опухолью условно нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см от опухоли выявлены эпигенетические изменения и отсутствуют аллельные нарушения. В ряду: опухоль - смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см - смежная

условно нормальная ткань на расстоянии 5 см - происходит уменьшение частоты эпигенетических изменений.

3. Выявленные молекулярные повреждения: потеря гетерозиготно-сти/микросателлитная нестабильность локусов D9S925, D17S928 и метилирования генов CDH1 и CD44 - ассоциированы с плоскоклеточным раком легкого и могут использоваться в качестве маркеров для гистологической верификации опухоли; аллельные нарушения регионов D2S405, D3S1300, метилирование промоторов генов RASSFIA и FH1T, снижение уровня экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 ассоциированы со стадией заболевания, степенью дифференцировки опухоли и метастазированием и могут рассматриваться в качестве маркеров прогноза.

4. Смежные с опухолью морфологически не измененные нормальные ткани, содержащие молекулярно-генетические изменения, формируют «опухолевое окружение» выявленное на расстоянии 5 см от опухолевого очага.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены: на десятой конференции «Нанотехнологии в онкологии», 15 декабря 2012г., Москва, на конференции «European Conference of Human Genetics», 8-11 июня, 2013г., Париж, Франция.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автор принимала непосредственное участие в планировании и проведении исследования. Для реализации цели исследования автором сформированы группы пациентов с HMPJI, не получавших предварительного лечения. Автором лично проведены все мо-лекулярно-генетические исследования, использованные в работе.

Автором проанализированы современные данные отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, проведен математический и статистический анализы полученных данных, сформулированы основные результаты и выводы. Результаты исследования опубликованы в научных журналах и доложены на конференциях.

Публикации

По результатам диссертации опубликовано 6 печатных работ соискателя, в том числе 4 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и глав, посвященных описанию материалов и методов исследования, изложению полученных результатов и их обсуждения, содержит заключение и выводы. Работа изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 38 рисунков. Библиографический указатель включает 178 наименований, из них 10 отечественных и 168 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы исследования

Данная работа включала в себя анализ молекулярно-генетических нарушений (ПГ/МН, структурные нарушения генов, эпигенетические нарушения) у пациентов с НМРЛ. Материалом для исследования послужили образцы опухоли и образцы смежной условно нормальной ткани (парафиновые блоки) 216 пациентов с диагнозом НМРЛ, из которых у 108 получено по 3 образца ткани: опухолевая, смежная с опухолью условно нормальная ткань на расстоянии 2 см от опухоли, смежная с опухолью условно нор-

мальная ткань на расстоянии 5 см от опухоли. У двух пациентов получены образцы опухолевой ткани и смежной с опухолью условно нормальной ткани на расстоянии 2 см. Из 216 наблюдений у 106 пациентов получены только образцы опухолевой ткани. Всего проанализировано 434 образца ДНК. Клинические характеристики пациентов приведены в табл. 1.

Таблица 1. Клинико-морфологические характеристики пациентов.

Признак Критерии Ыобщ = 216 %

По возрасту <61 лет 102 47

>61 лет 114 53

Средний возраст 61 ±7,5

По полу мужчины 181 84

[женщины 35 16

По локализации Центральный 86 40

Периферический 123 57

не известно 6 3

По стадии I 45 21

II 67 31

III 63 29

IV 16 7

не установлена 25 12

По гистологическому гипу Аденокарцинома 147 68

Плоскоклеточный рак 48 22

Аденоплоскоклеточный рак 17 8

Др.(крупноклеточный, мукоэпидермоидный) 4 2

По степени диффе-ренцировки высоко дифференцированный 26 12

умереннодифференцированный 89 41

низкодифференцированный 86 40

не установлена 15 7

Курение Да 127 59

Нет 67 31

не известно 22 10

Методы исследования

Выделение ДНК и микроРНК проводили из операционного материала, фиксированного в формалине с последующей парафинизацией (парафиновые блоки). Для оценки частоты аллельных нарушений в образцах опухолевой ткани, смежной с ней нормальной ткани на расстоянии 2 см и 5 см и их сравнения с помощью микросателлитного анализа исследовались локусы D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938, как наиболее часто повреждаемые при HMPJI. Определение структурных нарушений генов EGFR, KRAS, ALK проводили у 140 пациентов с не плоско клеточным НМРЛ (аденокарцинома, аденоплоскоклеточный рак). Мутации генов EGFR и KRAS выявляли с помощью фрагментного анализа, прямого секвенирования и ПЦР в режиме реального времени. Наличие транслокации гена ALK определяли с помощью FISH. Оценку частоты аномального метилирования промотора генов RASSF1A (3р21.3), FHIT (Зр14.2), DAPK1 (9q21.33), CDH1 (16q22.1), CD44 (11р13), TIMP3 (22ql2.3), MGMT (10q26.3) в образцах опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани на различном расстоянии проводили с помощью анализ аномального метилирования промоторов генов, наиболее часто повреждаемых при НМРЛ.

Выделение ДНК проводили по протоколам коммерческого набора «ДНК-сорб-В», РФ, или «QIAamp DNA FFPE Tissue Kit» («QIAGEN», Германия).

Бисульфитную модификацию ДНК проводили по протоколам набора «EpiTect Bisulfite FFPE Kit» фирмы «QIAGEN», Германия.

Микросателлитный анализ проводили с помощью ПЦР по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 50-100 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимерэзы, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ КС1, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,4), 5 мМ MgC12. Амплификацию проводили по следующей программе (35 циклов): денатурация при 94'С - 40 с; отжиг при 59-6ГС - 1 мин; элонгация при 72'С - 30 с. Продукты разделяли в 6%-ном денатурирующем ПААГ и окрашивали нитратом серебра.

Фрагментный анализ. Продукты ПЦР, объём которых предварительно установлен идентификацией электрофорезом в 8% ПААГ, смешивали с 0,5 мкл флуоресцентного маркёра LIZ-500 и 11 мкл HI-DI формамида («Applied Biosystems», США). Вносили полученную смесь в соответствующие лунки в плашке аппарата. Денатурировали в течение 2 минут при температуре 98°С с последующим охлаждением до +4 °С. Плашку помещали в генетический анализатор Genetic Analyzer 3500x1 («Applied Biosystems», США).

Рестрикционный анализ. ДНК обрабатывали метил-чувствительной рестриктазой Hpall фирмы «Сибэнзим», РФ, по следующей схеме: к 1500 нг (8 мкл) геномной ДНК добавляли 3 е.а. (1 мкл) фермента и 2 мкл соответствующего 10-кратного буфера, доводили до 20 мкл диет, водой и инкубировали в течение 10-12 часов в термостате при температуре 37'С.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для определения мутаций генов EGFR и KRAS проводили ПЦР по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 65-100 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 ед. Taq-полимерэзы, 5 мМ MgC12, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ КС1, 10 мМ Трис-HCl (рН 8,4). Амплификацию проводили по следующей программе (35 циклов): денатурация при 94°С - 40 с; отжиг при 60-62°С - 40 с; элонгация при 72"С - 30 с. Финальную инкубацию проводили при 72'С в течение 10 мин.

Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР). Д ля исключения возможной гомозиготной делеции исследуемых генов МЧ-ПЦР проводилась на парных образцах: гидролизованная и негидролизованная ДНК. ПЦР проводили при помощи программируемого термоциклера «Терцик» фирмы «ДНК-технология», РФ, с использованием термофильной ДНК-полимеразы («СибЭнзим», РФ) по следующей схеме: к 0,1 мкг геномной ДНК добавляли 20-170 мкМ каждого олигопраймера, 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата, 1-2 единицы термофильной ДНК-полимеразы, 5 мкл однократного буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ КС1, 10 мМ трис-HCl рН 8.4. Оптимальное содержание MgCl2 в буфере подбирали экспериментальным путем для каждой пары используемых праймеров. Амплификацию проводили по следующей программе (35 циклов): денатурация при 94'С - 40 с; отжиг при 60-64'С - 40 с; элонгация при 72°С - 30 с. Финальную инкубацию проводили при 72"С в течение 10 мин.

Обратной транскрипция. Обратная транскрипция микроРНК проводилась с помощью полиаденилирования З'-конца микроРНК и последующим праймированием оли-ro-dT праймерами, которые на своем З'-конце имеют дегенеративный анкер, а на 5'-конце универсальную концевую последовательность, по протоколам коммерческого набора «miScript II RT Kit» фирмы «QIAGEN», Германия, в термоциклере Veriti 96-Well Thermal Cycler фирмы «Applied Biosystems», США, по программе: 37 °С - 60 мин; 95 С - 5 мин.

ПЦР в режиме реального времени (Real-time ПЦР). Для определения мутаций гена EGFR использовали 2 технологии: аллель-специфическую ПЦР и детекцию амплификации с помощью молекул Scorpions по протоколам коммерческого набора «Therascreen EGFR RGQ PCR Kit» на приборе Rotor-Gene Q 5plex HRM («QIAGEN», Германия).

ПЦР в режиме реального времени для определения уровня экспрессии микроРНК. Определение экспрессии «зрелых» микроРНК проводили по технологии SYBR Green с помощью микроРНК специфичных праймеров «miScript Primer Assay» по протоколам коммерческого набора «miScript SYBR Green PCR Kit» на приборе Rotor-Gene Q 5plex HRM («QIAGEN», Германия).

FISH исследование транслокации гена ALK проводили по протоколам коммерческого набора «Vysis LSI ALK Dual Color Break Apart FISH Probe» фирмы «Abbot Molecular», США.

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку данных проводили при помощи программ Graph Pad Instat Version 3.1a и Microsoft Excel. Для выявления достоверных ассоциаций между выявленными молекулярно-генетическими изменениями и клинико-морфологическими параметрами пациентов, последних делили на группы по возрасту, полу, локализации опухоли, стадии опухолевого процесса, статусу курения, гистологическому типу, степени дифференцировки. В выделенных группах сравнивали частоты выявленных нарушений по каждому гену и локусу, а также варианты сочетания молекулярно-генетических изменений в различных локусах и генах, с помощью двустороннего варианта точного критерия Фишера. Статистическую обработку данных об экспрессии микроРНК проводили с помощью одноконцевого парного и непарного теста Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Аллельные нарушения при НМРЛ

Анализ семи микросателлитных повторов, расположенных в наиболее часто повреждаемых при HMPJI хромосомных локусах: 2р23.3, 2q35, Зр14.2, Зр22.2, 3р26.3, 9р22.1, 17р13.3 проводили на генетическом материале, полученном из опухолевой и смежной условно нормальной ткани. Выявлено, что у 102 из 110 пациентов с НМРЛ (93%) обнаружена ПГ и/или МН, по крайней мере, по одному из маркёров. Итоговые частоты аллельных изменений приведены в табл. 2. Электрофореграммы, демонстрирующие ПГ и МН исследуемых маркеров, показаны на рис. 1.

Таблица 2. Частоты ПГ/МН в НМРЛ.

Маркер Локализация N/N информативная. %

D2S405 2р23.2 50/106 47

D2S164 2q35 44/103 43

D3S1300 Зр14.2 61/101 60

D3S1768 Зр22.2 55/105 52

D3S1539 3р26.3 54/104 52

D9S925 9р22.1 51/108 47

D17S938 17р13.3 48/98 49

Наибольшая частота аллельных нарушений у пациентов с НМРЛ выявлена для микросателлита 0381300 - 60%. Для локусов 0351300, Б98925, 0178938 характерна только ПГ. МН в этих регионах не обнаружена. Полученные значения на данной выборке соответствуют опубликованным ранее данным из разных стран, например, для

9

региона D2S164 - 50% случаев НМРЛ (Tseng R.C. et al„ 2005), для D3S1539 - 60% (Woenckhaus М., 2005).

aard

аии

13Т 13N2 13N5 14Т MN2 UNS

я mm т • i i , ........................ i

ш

—I

IT WZ 1N5 2T

№ 13 - плоскоклеточный рак легкого № 14 - аденокарцинома Т- опухоль;

N2 - смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см.; N5 - смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см.; Дорожка 13Т - микросателлитная нестабильность

№1,2- плоскоклеточный рак легкого Т- опухоль;

N2 - смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см.; N5 - смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см.; Дорожка 1Т - потеря гетерозиготно-сти.

Рисунок 1. Микросателлитный анализ локусов D3S1768 (А) и D17S938 (Б).

Аллельные нарушения в исследуемых локусах могут быть как самостоятельными маркерами нестабильности генома, так и косвенным доказательством (использоваться для косвенной диагностики) вовлечения генов, расположенных в этих регионах/находящихся рядом с этими районами, в процессы канцерогенеза. Примерами таких генов являются: ген-супрессор опухолевого роста FHIT, который поврежден в 70-90% случаев НМРЛ (Verri С., 2009); ген-супрессор опухолевого роста ТР53, индуцирующий апоптоз и арест клеточного цикла (мутирован в 40-60% случаев рака легкого (Wen J., 2011); ген ALK, ассоциированный с различными онкологическими заболеваниями, в том числе, с НМРЛ (Husain Н., Rudin С.М., 2011). В целом в исследуемых регионах насчитывается несколько десятков генов, потенциально связанных с канцерогенезом.

Для сравнения частот ПГ/МН исследуемых локусов с клиническими характеристиками пациентов, последних делили на группы по следующим критериям: стадия заболевания, гистологический тип опухоли, статус курения (табл. 3). Для выявления корреляций между изученными генетическими изменениями и клиническими параметрами пациентов с НМРЛ применяли статистический анализ категориальных данных с использованием двустороннего варианта точного критерия Фишера.

Выявлены статистически достоверные зависимости ПГ и/или МН исследуемых локусов от гистологического типа опухоли, стадии опухолевого процесса, статуса курения. Молекулярно-генетические изменения в регионах D9S925 (р = 0,005), DI7S938 (р = 0,002) характерны для пациентов с плоскоклеточным раком легкого. ПГ и/или МН в локусах D3S1768 (р = 0,004), D17S938 (р = 0,032) ассоциированы с курением. Частые нарушения в районе D2S405 (р = 0,016) характерны для пациентов с I-II стадией опухолевого процесса, а изменения в локусе D3S1300 (р=0,019) ассоциированы с III-IV стадией заболевания (Шикеева A.A., 2013).

В данной работе выявлено, что изменения в локусе D3S1300 ассоциированы с III-IV стадией НМРЛ (р = 0,019). ПГ в локусе D9S925 оказалась характерна для пациентов

с плоскоклеточным раком легкого (р = 0,005), но не ассоциирована с курением, что частично расходится с опубликованными ранее данными (Tseng R.C., 2005). Таблица 3. Частоты ПГ/МН в исследуемых локусах, ассоциированные с клинико-морфологическими параметрами.

Клинический параметр Маркер Локализация Критерии ПГ/МН % Статистическая достоверность

ПГ и/или МН/ N информативных случаев (%)

Гистологический тип D9S925 9р22.1 АК 12/30 30 р = 0,005

ПКРЛ 33/47 71

D17S938 17р 13.3 АК 9/40 23 р = 0,002

ПКРЛ 36/48 75

Стадия D2S405 2р23.3 I-II 19/51 37 р = 0,016

III-IV 10/43 23

D3S1300 Зр14.2 I-II 18/50 36 р = 0,019

III-IV 10/42 24

Курение D3SI768 Зр22.2 ДА 18/44 41 р = 0,004

НЕТ 12/44 27

D17S938 17р 13.3 ДА 26/44 59 р = 0,032

НЕТ 13/45 29

ПГ - потеря гетерозиготности; МН - микросателлитная нестабильность; АК - аденокарци-нома; ПКРЛ - плоскоклеточный рак; I, II, III, IV - стадии HMPJI.

ПГ и/или МН сателлитов D3S1768 и D17S938 составили 49 и 52% соответственно. Выявлена статистически достоверная ассоциация между курением и плоскоклеточным раком легкого (р = 0,003). Показано, что аллельный дисбаланс в исследуемых локусах характерен для курильщиков: D17S938 (р = 0,032), D3S1768 (р = 0,004), ПГ/МН в локу-се D3S1768 также ассоциирована с плоскоклеточным раком легкого (р = 0,002).

Полученные данные свидетельствуют о том, что в HMPJI происходят многочисленные мутационные события, приводящие к повреждению различных участков генома. Найденные генетические изменения могут использоваться как молекулярные маркёры плоскоклеточного рака легкого, для дифференциальной диагностики в сложных случаях, в дополнении к данным морфологического исследования, а также могут оцениваться как маркеры прогноза.

Аллельные нарушения в смежной с опухолью условно нормальной ткани на различном расстоянии

По данным ряда исследований молекулярно-генетические изменения характерны не только для опухолевой ткани, но часто выявляются в смежных с опухолью условно нормальных тканях (Tang X. et al., 2008; Yendamuri S., 2008), однако в ходе нашей работы в образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли ПГ/МН не обнаружено. Вероятно, это можно объяснить тем, что структурные изменения не затрагивают смежные с опухолью нормальные ткани, а накапливаются только в опухоли. Однако, существуют исследования, показывающие наличие молекулярно-генетических изменений не только непосредственно в опухолевом эпителии, но и в опухолевой строме (опухолевом микроокружении), а также в предопухолевых изменениях (дисплазия) и смежных с опухолью морфологически неизмененных тканях.

Ранее показано наличие структурных изменений, таких как мутации гена EGFR в опухолевом микроокружении и строме на расстоянии 5 мм (Tang X., 2008). В отечественной работе по определению аллельных нарушений и аномального метилирования

ряда генов при раке предстательной железы показано наличие ПГ/МН в стромальном опухолевом микроокружении (КекееваТ.В., 2008)

Отсутствие аллельных нарушений в условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см в нашем исследовании, позволяет предположить, что, вероятно, при HMPJ1 ал-лельный дисбаланс не затрагивает участки смежной с опухолью условно нормальной ткани на этом расстоянии.

Анализ мутации генов EGFR, KR^4S и транслокации гена ALK при НМРЛ

Для определения чувствительности опухоли к таргетным препаратам проводился анализ мутаций в генах EGFR, KRAS и транслокации гена ALK у 140 пациентов с НМРЛ с железистой дифференцировкой (аденокарцинома, аденоплоскоклеточный рак). Так как наличие транслокации ALK выявлено в случаях аденокарцином, имеющих дикий тип EGFR и KRAS, то анализ этих изменений проводился последовательно. Алгоритм исследования представлен на рис. 2. Средний возраст пациентов в исследовании составил 60 лет.

140 пациентов с АК легкого

Аналгп мутаций И. 21 -шопа гена EGFR

+

ZI AK с мутациями гена ECFR

113 А К легкого

Анализ мутаций I чк'Шиа гена KRAS

19 AK с мутациями raia KRAS

94 АК легкого

FISH на гранслокацию гена ALK

ft АК с гранелокацнеи ¡сна ALK

Х8 АК легкого Дикий тин по генам EGFR. KRAS. ALK

Рисунок 2. Схема проведения молекулярно-генетического исследования для определения чувствительности к таргетным препаратам.

Структурные изменения выявлены в 37% случаев не плоскоклеточного НМРЛ. Частота мутаций гена EGFR составила 19% (27/140), мутации в гене KRAS обнаружены в 17% (19/113) случаев, а транслокация гена ALK выявленау 6% (6/94) пациентов.

В данном исследовании 81% мутаций гена EGFR составили делеции в 19 экзоне (22/27). Выявлены следующие варианты делеций: p.E746_A750del, p.L747_A749 del,A750P, p.L747_S752 del, p.L747_A750 del, p.K745_E749del, p.A750_K754 del (Шике-ева A.A., 2011).

Определение мутаций проводили с помощью 3 различных методов: прямого се-квенирования (рис. 3); фрагментного анализа (для 19 экзона) (рис. 4); с помощью коммерческого набора «Therascreen EGFR RGQ PCR Kit».

Мутации в 21 экзоне гена EGFR составили 19% (5/27). У четырех пациентов выявлена мутация p.L858R, в одном случае обнаружена мутация p.L861Q. Все выявленные

структурные нарушения в гене EGFR ассоциированы с чувствительностью к препаратам-ингибиторам EGFR.

Мутации в гене KRAS встречаются у 15-35% пациентов с HMPJl (Roberts P.J., 2010) и считаются неблагоприятным прогностическим маркером при НМРЛ, поскольку большинство из них обуславливают резистентность к терапии препаратами-ингибиторами EGFR. При наличии мутации в гене KRAS, сигнальный Ras/Raf/Mek путь активируется не зависимо от того, заблокирован EGFR или нет.

Рисунок 3. Сиквенсограмма участка 21 экзона гена EGFR.

115 ■ В,14 19Fam.Ale)cs_E08_14_Fra9nwntAnalysis50_POP7xl_1_niodif.fsa 212 47

116 Ш В.15 19FanvAleks_ Е08..14 _FragmenlAna!ysis50_POP7xl 1..mo(Jif fsa 227 81

169 ■ В 17 19Fam-Dabak_F08_17_FragmentAnalysis50_POP7xl_1_modif.1aa 227 81

Рисунок 4. Фрагментами анализ 19 экзона гена EGFR.

В данном исследовании частота мутаций гена KRAS составила 17% (19/113). Анализ мутаций 2 экзона гена KRAS проводили методом прямого секвенирования. Наиболее частые мутации в 12 кодоне: p.G12V -32% (6/19), p.G12D - 26% (5/19), p.G12C -26% (5/19). Также выявлены мутации p.G12A, p.G12N, p.G13D. Сиквенсограмма, демонстрирующая мутацию в гене KRAS, представлена на рис. 5.

Транслокация гена ALK обнаружена в 6% (6/94) случаев. Определение транслокации гена ALK проводили с помощью метода FISH. Генетические нарушения в этом гене приводят к постоянной активации рецептора ALK, который активирует МАР-киназный и Р13К-киназный и ЗТАТЗ-зависимые сигнальные пути, ингибирующие апоптоз, стимулирующие клеточную пролиферацию и стромальную инвазию. По данным исследо-

ваний при НМРЛ частота хромосомных перестроек гена ALK составляет 2-7% (Rodig S.J., 2009).

Рисунок 5. Сиквенсограмма участка 2 экзона тешКЯАЗ.

Для выявления возможных ассоциаций клинико-морфологических характеристик с генетическими нарушениями в исследуемых генах, пациентов делили на группы по возрасту, полу, статусу курения. Деление пациентов на группы по гистологическому критерию не проводилось, т.к. все пациенты имели аденокарцииому легкого. В нашем исследовании мутации гена ЕвЕЯ чаще встречались у женщин - 26% (11/43), чем у мужчин-13% (11/86).

Аномальное метилирование промоторов генов у пациентов с 11МРЛ

Для оценки частоты эпигенетических изменений в образцах опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани на разном расстоянии от опухоли проведен анализ аномального метилирования промоторов генов, наиболее часто повреждаемых при НМРЛ. Все гены, исследуемые в работе, условно можно разделить на 3 основных группы: гены-супрессоры опухолевого роста: ИА55Е1Л (3р21.3), ЕН1Т (Зр14.2), ОАРК1 (9д21.33); гены, кодирующие белки межклеточного взаимодействия: СОН1 (16я22.1), СЭ44 (11р13), Т1МРЗ (22я12.3); ген системы репарации ДНК: МОМТ{ 10я2б.З).

В ходе работы выявлено, что у 104 из 110 (95%) пациентов с НМРЛ обнаружены эпигенетические изменения по крайней мере в одном из исследуемых генов. Частоты эпигенетических изменений в опухоли у пациентов с НМРЛ составили 70% для гена КА88Е1А, 52% для гена ЕН1Т, 17% для гена ОАРК1, 61% для гена СОН1, 34% для гена Сй44, 43% для гена Т1МРЗ, 15% для гена МСМТ. Частоты аберрантного метилирования в образцах опухоли и образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли по всем исследуемым генам приведены в табл. 4.

Таблица 4. Частоты эпигенетических изменений в исследуемых генах во всех образцах.

Гены Опухоль Смежн. ткань на 2 см. Смежн. ткань на 5 см.

N/Nooiu % N/Noönj % N/No6m %

RASSF1A 77/110 70 35/110 32 22/110 20

FHIT 57/110 52 23/110 21 18/110 16

DAPK1 19/110 17 0/110 0 0/110 0

CDH1 67/110 61 33/110 30 12/110 11

CD44 37/110 34 14/110 13 9/110 8

TIMP3 47/110 43 26/110 24 0/110 0

MGMT 16/110 15 0/110 0 0/110 0

Интересным оказался тот факт, что эпигенетические изменения в гене TIMP3 наблюдались в опухоли и смежной с опухолью ткани на расстоянии 2 см (в 24% случаев) и не обнаружены в окружающей ткани на расстоянии 5 см от опухоли. Гиперметилирование промоторов генов DAPK1 и MGMT выявлено исключительно в опухолевой ткани.

Проведен сравнительный анализ различных вариантов сочетания метилирования генов исследования. В 13 случаях НМРЛ (12%) во всех 3 исследуемых образцах выявлено метилирование регуляторных районов генов RASSF1A и FH1T. Частоты метилирования промоторов генов RASSF1A и FHIT составили: в опухоли - 31%, в опухоли и смежной ткани на расстоянии 2 см - 16%, в опухоли, смежной ткани на расстоянии 2 и 5 см (во всех исследуемых образцах) - 12%.

При проведении статистического анализа определено, что метилирование промоторов генов CDH1 (р = 0,002) и CD44 (р = 0,002) характерно для плоскоклеточного рака легкого. В девяти случаях эпигенетические изменения в гене CD44 обнаружены во всех трех образцах ДНК, и все девять имели плоскоклеточную природу и IIA стадию заболевания (табл. 5).

При проведении статистического анализа выявлено, что сочетание гиперметилирования промоторов генов RASSF1A и FHIT в опухоли, в окружающей ткани на расстоянии 2 и 5 см характерно для пациентов на III-IV стадии заболевания с метастазами в регионарные лимфоузлы (р = 0,008) (табл. 5). Согласно данным нашего исследования, гиперметилирование промоторов генов RASSF1A и FHIT во всех трех исследуемых образцах характерно для пациентов на III-IV стадии с метастазами в регионарные лимфоузлы (р = 0,008), что косвенно свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для данных пациентов и совпадает с результатами предыдущих работ (Шикеева A.A., 2013). Однако отсутствие данных об отдаленных последствиях оперативного лечения и динамического наблюдения пациентов затрудняют оценку прогностического значения полученных данных.

Таблица 5. Частоты аномального метилирования исследуемых генов, ассоциированные с клинико-морфологическими параметрами.

Клинический параметр Ген Локализация Критерии Частоты % Статистическая достоверность

N метилиров. образцов/ N известных по данному параметру случаев

CD44 11р13 ПКРЛ 26/48 54 р = 0,002

Гистологи- АК+АПКРЛ 13/55 24

ческий тип CDH1 16q22.1 ПКРЛ 39/48 81 р = 0,002

АК+АПКРЛ 28/55 51

DAPK1 9q21.33 N+ 14/45 31 р = 0,005

Метастазиро-вание N0 5/58 9

совместно RASSF1A. FHIT Зр21.3, N+ 14/23 61 р ~ 0,008

Зр 14.2 N0 4/21 19

Показана статистически достоверная разница между частотой гиперметилирования промотора гена DAPK1 в группе пациентов с метастазами в регионарные лимфоузлы и без метастазов (р = 0,005) (табл. 5). В группе пациентов с метастазами частота эпигенетических нарушений в исследуемом гене оказалась выше. Результаты нашего исследования подтверждают опубликованные данные о том, что гиперметилирование промотора гена DAPK1 ассоциировано с метастазированием, а эпигенетические изменения в гене CDH1 ассоциированы с плоскоклеточным раком легкого (Ji М., 2011).

Сиквенсограмма участка гена CDHI с метилированными CG-динуклеотидами представлена на рис. 6. В литературе показано, что гиперметилирование промоторов генов CDH1 и TIMP3 ассоциировано с благоприятным прогнозом течения заболевания (Gu J., 2006).

File: CDHmtR-13t_B10_04_FastSeg50_ Sequence Маше: (none) Run ended (unknown)

10 20 30 40

TTAATTTTAGGTTAGAGGGTTATCGCGTTTATGTGAGGTVGGGT

Рисунок 6. Метил-специфическое секвенирование на примере гена СОН1. Примечание: Красные стрелки указывают на метилированные СО-динуклеотиды.

Эпигенетические изменения в смежной условно нормальной ткани на расстоянии

2 и 5 см от опухоли

В данном исследовании выявлены эпигенетические нарушения в образцах ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. Частоты гиперметилирования промотора исследуемых генов составляют 0-33% для смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 см и 0-22% для смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли (рис. 7).

Б >s

В S

4> Я

U щ

5 1

с <и

п ^

СЗ СО

Н S

о

У

■RASSF1A DAPK1 FHIT CD44 ■ CDH1 - TIMP3 -MGMT

Рисунок 7. Распределение частот эпигенетических изменений отдельных исследуемых генов в ряду опухоль - смежная ткань на 2см - смежная ткань на 5см.

Согласно результатам исследования, метилирование промотора гена Т1МРЗ обнаружено в опухоли у 43% пациентов, в опухоли и смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 см в 24% случаев, а в образцах смежной с опухолью ткани на расстоянии 5 см отсутствовало.

В ходе исследования выявлено, что в образцах смежной нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли гены-супрессоры опухолевого роста ЯА88Р1А и БШТ имеют более высокие частоты гиперметилирования промотора, чем гены, кодирующие белки межклеточного взаимодействия СЭ44, СИШ, Т1МРЗ (аномальное метилирование промотора гена Т1МРЗ в образцах смежной ткани на 5 см от опухоли отсутствует).

Аномальное метилирование промотора гена СОН1 в образцах смежных с опухолью тканях на расстоянии 2 и 5 см от опухоли составило 30 и 11% соответственно. Наличие эпигенетических нарушений в гене СЭН1 в смежной с опухолью ткани, как и в

гене Т1МРЗ, вероятно, свидетельствует о непосредственном участии опухолевого окружения в процессах канцерогенеза и о наличии «поля канцеризации». Однако, в отличие эпигенетических изменений в гене Т1МРЗ, аберрантное метилирование промотора гена СЭН1 определяется в смежной ткани на расстоянии 5 см от опухоли.

Говоря о частотах метилирования в образцах смежной с опухолью ткани, стоит отметить, наличие общей тенденции: в ряду опухоль смежная с опухолью ткань на расстоянии 2 см смежная с опухолью ткань на расстоянии 5 см частота эпигенетических нарушений по всем исследуемым генам снижается, т.е. чем удалённее от опухоли располагается окружающая ткань, тем меньше эпигенетических изменений она содержит (рис. 8). Вероятно, «эпигенетическое поле канцеризации» для легкого не заканчивается на 5 см и необходимы дальнейшие исследования в этом направлении.

Структурные нарушения ДНК, такие как ПГ и МН, определяются строго в опухоли и не затрагивают условно нормальные ткани окружающие опухоль. Исследование статуса аномального метилирования показало, что эпигенетические нарушения (гиперметилирование промотора исследуемых генов), в отличие от структурных нарушений, характерно не только для опухоли, но и для морфологически нормальных тканей, окружающих опухоль. Наличие этих изменений в смежных с опухолью тканях свидетельствует о том, что аномальные молекулярно-генетические процессы распространяются за пределы опухолевой ткани.

х х а и

<и

3"

я

Й г

О) и я с

о «

н о н

и я 3-

Рисунок 8. Распределение частот эпигенетических изменений всех исследуемых генов вместе в ряду опухоль - смежная ткань на 2см - смежная ткань на 5см от опухоли.

Результаты экспрессии зрелых микроРНК 1е1-7а, гш11-155, 1шЦ.-205 в НМРЛ

Исследование экспрессии микроРНК проводилось на 57 образцах операционного материала (парафиновые блоки), полученных от 19 пациентов с НМРЛ: 7 пациентов с плоскоклеточным раком легкого, 7 случаев аденокарциномы легкого и 5 случаев адено-плоскоклеточного рака легкого. Проведен анализ экспрессии микроРНК: 1е1-7а, гшК-155, гшК-205 у пациентов с НМРЛ в опухолевой ткани и смежной с опухолью нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. Для количественной оценки уровня экспрессии микроРНК использовали метод относительных определений количественных значений 2-ДАС'. В качестве эндогенного контроля принимали значения экспрессии малой ядерной РНК - ЯШб («С^АОЕИ», Германия). Количественное определение экспрессии микроРНК в исследуемых тканях проводили относительно уровня экспрессии этих микроРНК в калибраторе. В нашем исследовании в качестве калибратора использовались образцы морфологически нормальной ткани, полученной от пациентов с НХЗЛ. Для оценки воспроизводимости полученных результатов, каждый образец ис-

N2

следовали в двух параллелях. Для удобства представления полученных результатов вычисляли значение логарифма Log2 2-ало для каждой пробы. После этого высчитывали среднее значение и стандартную ошибку. Для статистической обработки полученных результатов применяли одноконцевой парный и непарный тесты Стьюдента. Для выявления статистически значимых ассоциаций полученных результатов экспрессии микроРНК с клинико-морфологическими параметрами пациентов, последних делили на группы по возрасту, стадии процесса, гистологическому типу и степени диффе-ренцировки опухоли. Средний возраст пациентов в данном эксперименте составил 63 года.

МикроРНК Let-7a - микроРНК, кодирующая последовательность которой располагается в регионе 9q22.32, принадлежащая к группе микроРНК let-7. В работах по исследованию функций let-7 у человека показано, что микроРНК этой группы имеют функции супрессора опухоли.

МикроРНК MiR-155 - микроРНК, которая кодируется геном домашнего хозяйства MIR155 и располагается в районе 21 q21.3. В настоящее время miR-155 является одной из самых изученных микроРНК в медицине. Показано, что мишенями miR-155 являются около 140 генов, среди них гены-супрессоры опухолевого роста (CEBPJ3, IL17RB, PCCD4, TCF12, ZNF652, TP53INP1) (Neilsen P.M., 2013).

МикроРНК MiR-205 участвует в процессах клеточной дифференцировки, пролиферации и апоптозе. Мишенями miR-205 являются такие гены как PTEN, ERBB3, E2F1, E2F5, ZEB1, ZEB2, VEGF-A, IL24, 1132. У пациентов с HMPJI выявлена гиперэкспрессия этого типа микроРНК (Markou А., 2008).

В данной работе проводился анализ экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухолевой и смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии от опухоли с помощью ПЦР в режиме реального времени.

На гистограмме (рис. 9) представлены значения уровней экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в опухоли у каждого пациента. В опухоли экспрессия let-7a снижена у большинства пациентов. Однако для двух других микроРНК: miR-155, miR-205 изменение уровня экспрессии не столь очевидно. Для более удобного представления полученных данных мы вычисляли среднее значение экспрессии со стандартной ошибкой для каждой микроРНК в опухоли и смежных условно нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см. Для определения статистической достоверности полученных результатов применяли одноконцевой парный и непарный тесты Стьюдента.

Iet7a и mil 55 mi205

Г \

I J

ЮТ 20!

:от 14т 4т

Гт

Пациенты с HMPJ1

Рисунок 9. Экспрессия исследуемых микроРНК у пациентов с HMPJ1.

На рис. 10 представлены средние значения экспрессии микроРНК со стандартной ошибкой, указанной на гистограмме.

Анализ экспрессии трех микроРНК во всех исследуемых образцах показал, что уровень экспрессии микроРНК 1е1-7а значительно снижен в опухоли по сравнению с условно нормальной тканью как на расстоянии 2 см (р = 0,025), так и на расстоянии 5 см (р = 0,012) от опухоли (рис. 10). Статистически достоверных изменений уровня экспрессии гп1Я-155, гшК-205 в опухоли относительно смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии от опухоли не выявлено.

Для определения статистически достоверных ассоциаций полученных данных с гистологическим типом опухоли, выделяли 3 группы НМРЛ: АК, ПКРЛ, АПКРЛ. Проанализированы средние значения экспрессии микроРНК 1е1-7а, пн11-155, гшЯ-205 в опухолях и смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии при разделении опухолей по гистологическим типам. Статистически значимых различий между экспрессией микроРНК в разных гистологических типах НМРЛ не выявлено. Также не оказалось различий между экспрессией исследуемых микроРНК в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли разных гистологических типов НМРЛ.

Рисунок 10. Экспрессия микроРНК 1еЬ7а, гшК-155, гшК.-205 в исследуемых образцах ткани.

Для выявления ассоциаций экспрессии микроРНК с возрастом пациентов последних делили на две группы: моложе 63 и старше 63 лет. Анализ экспрессии микроРНК в группе пациентов старше 63 лет не показал различий в уровне экспрессии исследуемых микроРНК между опухолью и смежной условно нормальной тканью, в то время как в группе пациентов моложе 63 выявлены достоверные различия. В группе пациентов моложе 63 лет в опухолевой ткани экспрессия микроРНК 1е1-7а и 1тп11-155 значительно снижена (р=0,015; р=0,048, соответственно) по сравнению со смежной условно нормальной тканью (рис. 11).

Одним из критериев злокачественности новообразования является стадия опухолевого процесса. В нашей работе все пациенты поделены по стадии опухолевого процесса на 2 группы: пациенты с 1-11 и пациенты с Ш-1У стадией заболевания. Проводили анализ экспрессии микроРНК Ы-7а, гш11-155, 1ш11-205 в выделенных группах. На рис. 12 представлены средние значения экспрессии микроРНК в 1е1-7а, гш!1-155, тЖ-205 в выделенных группах.

Выявлено снижение уровня экспрессии микроРНК 1е1-7а и гш11-155 (р = 0,03; р = 0,023, соответственно) в опухолевой ткани в группе пациентов с Ш-1У стадией заболе-

вания по сравнению со смежной условно нормальной тканью (рис. 12). У пациентов с III стадией заболевания достоверных изменений уровня экспрессии исследуемых мик-роРНК не обнаружено.

-2

-4

__^^■М

шт«-155 □ тК-206

Опухоль

Норма 2 см

Норма 5 см

Рисунок 11. Экспрессия микроРНК Ы-7а, гш!Ы55, гт11-205 у пациентов моложе 63 лет.

5 4 3 2 1

и

■ Ы-7а Ш гп1Я-155 О т1Я-205

-3 -

4 _ Опухоль Норма 2 см Норма 5 см

Рисунок 12. Экспрессия исследуемых микроРНК у пациентов с 1П-1У стадией НМРЛ.

При разделении пациентов по степени дифференцировки опухоли, выделено 2 группы: дифференцированные (высоко и умереннодифференцированные) и низкодиф-ференцированные опухоли. В выделенных группах проводили анализ экспрессии исследуемых микроРНК во всех образцах тканей (опухолевой и условно нормальной на 2 и 5 см от опухоли). В группе дифференцированных опухолей не выявлено статистически значимых изменений экспрессии исследуемых микроРНК. На рис. 13 приведены данные об экспрессии (средние значения) микроРНК 1е1-7а, пп11-155, 1ш11-205 в группе низкодифференциров анных опухолей.

Уровень экспрессии микроРНК 1е1:-7а в низкодифференцированных опухолях достоверно снижен значительно сильнее (р = 0,013) по сравнению условно нормальной тканью на расстоянии 5 см от опухоли (рис. 13). Снижение экспрессии Ы-7а относительно условно нормальной ткани на расстоянии 2 см от опухоли статистически не зна-

чимо, однако наблюдается явная тенденция (р = 0,06), и, вероятно, при увеличении выборки возможно появление значимых отличий.

8.00 ! * в,е,.7а

В1г»1Ч-155 □ т!Н-205

-4,00

Норма 2 см Норма 5 см

Опухоль

Рисунок 13. Экспрессия микроРНК 1е1-7а, тШ.-155, 1шЯ-205 в низкодифференцирован-ных опухолях у пациентов с НМРЛ.

В группе низкодифференцированных опухолей достоверной разницы экспрессии микроРНК т1Я-155 и 111111-205 в опухолевой ткани и смежной с ней нормальной ткани на различном расстоянии не выявлено.

Для оценки изменения уровня экспрессии микроРНК 1е1>7а, гш11-155, гш1?-205 в зависимости от статуса курения, выделены 2 группы: курящие и некурящие пациенты. Проводили сравнительный анализ данных экспрессии микроРНК в образцах опухоли и образцах смежной условно нормальной ткани в выделенных группах. В группе курящих пациентов не выявлено статистически значимых различий экспрессии микроРНК 1е1-7а, гшК.-155, гш 11-205 в опухоли и смежной ткани.

Экспрессия микроРНК 1е1-7а в опухолевой ткани у некурящих пациентов значительно снижена (р = 0,044) относительно условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли (рис. 14). Достоверных различий экспрессии микроРНК гшБ1-155, тЖ.-205 не выявлено.

■ 1й-7а О гп|Я-155 □ т!К-205

10,00 8,00 -

6,00 -4,00 2,00 -0,00 -2,00 -4,00 -

Опухоль

Норма 2 см

Норма 5 см

Рисунок 14. Средние значения экспрессии микроРНК 1е1-7а, гшК-155, гш!1-205 в опухолевой ткани у некурящих пациентов.

Определение уровня экспрессии микроРНК 1е(:-7а, тЖ-155, пн11-205 в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли

Проведен сравнительный анализ экспрессии исследуемых микроРНК в образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли. На рис. 15

представлены средние значения экспрессии исследуемых микроРНК во всех образцах тканей. Для микроРНК 1е1-7а и ггпК-155 в ряду опухоль смежная с опухолью ткань на расстоянии 2см смежная с опухолью ткань на расстоянии 5 см происходит увеличение среднего значения экспрессии.

Также сравнивались средние значения экспрессии микроРНК Ы-7а, гшК-155, 1гпК-205 в образцах смежной условно нормальной ткани на расстоянии 2 и 5 см от опухоли во всех выделенных клинико-морфологических группах пациентов: по гистологическому типу (АК, ПКРЛ, АГПСРЛ), по возрасту (моложе и старше 63 лет), по стадии заболевания (ранняя и поздняя), по статусу курения (курящие и некурящие пациенты), по степени дифференцировки опухоли (дифференцированные и низкодифференцированные). Выявлены достоверные различия экспрессии исследуемых микроРНК в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в зависимости от степени дифференцировки опухоли и статуса курения. В остальных группах статистически значимых отличий экспрессии 1е1-7а, гщ11-155, гшИ-205 не выявлено.

На рис. 16 представлены средние значения экспрессии микроРНК 1е1-7а, гш11-155, гш!1-205 в смежной условно нормальной ткани на 5 см от опухоли в группах курящих и не курящих пациентов.

ЩЦ Экспрессия снижена [ | Экспрессия слаба отменена 8 | Экспрессия повышена

1,37 '

Рисунок 15. Среднее значение экспрессии микроРНК 1е1-7а, пнК-155, гш!1-205 во всех исследуемых образцах.

10 8 -6 4 2 0 -2 -4 -1

р=0.07

I курящие ] некурящие

1е1-7а

пгнР!-155

гшК-205

Рисунок 16. Средние значения экспрессии микроРНК \et-la, гш11-155, гшК-205 в условно нормальной ткани на 5 см от опухоли в группах курящих и не курящих пациентов.

В группе курящих пациентов экспрессия микроРНК 1е1-7а достоверно снижена (р = 0,038) в условно нормальной ткани на 5 см от опухоли. Разница средних значений

экспрессии для микроРНК т 1 Я-155 в условно нормальной ткани на 5 см от опухоли в группах курящих/некурящих пациентов не достоверна, однако, определенно существует тенденция к статистической значимости подобных отличий (р = 0,07). Для микроРНК гшЯ-205 достоверных отличий в экспрессии не выявлено. На рис. 17 представлены средние значения экспрессии микроРНК 1е1:-7а, 1шК.-155, гш11-205 в условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли в группах пациентов с дифференцированны-ми/низкодифференцированными опухолями.

Анализ показал, что условно нормальная ткань на расстоянии 5 см от опухоли в группах пациентов с дифференцированными и низкодифференцированными опухолями имеет противоположные профили экспрессии микроРНК \ei-la, гшК-155, ггиК-205. У пациентов с высоко и умереннодифференцированными опухолями уровень экспрессии исследуемых микроРНК снижен, а в группе пациентов с низкодифференцированным раком уровень экспрессии наоборот повышен. Статистически значимыми оказались отличия в значениях экспрессии гшЯ-155 (р = 0,046) и гшЯ-205 (р = 0,043) в смежной условно нормальной ткани на расстоянии 5 см от опухоли между выделенными группами пациентов. При сравнении уровня экспрессии гш11-155 и гтнК-205 в смежной с опухолью нормальной ткани в группах пациентов с различной степенью дифференци-ровки опухоли выявлено, что в низкодифференцированных опухолях экспрессия этих микроРНК выше.

Рисунок 17. Средние значения экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в условно нормальной ткани на 5 см от опухоли в группах пациентов с дифференцированными и низкодифференцированными опухолями.

В ряде работ показано, что гиперэкспрессия miR-205 характерна для плоскоклеточного HMPJI с чувствительностью и специфичностью 96 и 90% соответственно (Lebanony D., 2009; Bishop J.A., 2010). Статистически достоверных отличий экспрессии микроРНК miR-205 в опухоли относительно смежной с опухолью условно нормальной ткани и каких-либо ассоциаций с клинико-морфологическими параметрами пациентов не выявлено.

Проведенное исследование показало, что, во-первых, экспрессия let-7a снижена в опухолевой ткани, относительно смежной условно нормальной ткани. Во-вторых, снижение уровня экспрессии let-7a и miR-155 в опухоли характерно для относительно молодых (моложе 63 лет), некурящих пациентов, поздней стадии опухолевого процесса, низкодифференцированных опухолей. В-третьих, уровни экспрессии let-7a, miR-155, miR-205 в смежных с опухолью условно нормальных тканях на расстоянии 5 см различны в группах курящих/некурящих пациентов, пациентов с различной дифференци-ровкой опухоли.

-ч

let-7a

miR-155

miR-205

•6

Выявлено, что у относительно молодых пациентов онкологические заболевания обычно протекает более агрессивно, чем у пациентов старше. Это явление может объяснить тот факт, что в нашем исследовании снижение уровня экспрессии микроРНК в опухолевой ткани, выполняющих функции супрессоров опухоли, 1е1-7а и тПи55 ассоциировано с молодым возрастом, поздней стадией заболевания и низкой степенью дифференцировки. Результаты нашего исследования показывают обратную корреляцию между уровнем экспрессии двух микроРНК (в большей степени 1е1-7а, в меньшей -гш 11-155) и злокачественностью опухолевого процесса. Этот факт позволяет предположить использование микроРНК 1е1-7а и пнИ-155 в перспективе в качестве прогностических маркеров опухоли, вероятно, свидетельствующих о не благоприятности прогноза.

ВЫВОДЫ

1. Частоты аллельных нарушений локусов 028405, 023164, 0331300, 0381768, 0381539, 098925, 0178938 в НМРЛ составили 47%, 43%, 60%, 52%, 52%, 47%, 49%, соответственно. Потери гетерозиготности и/или микросателлитной нестабильности в смежных с опухолью условно нормальных тканях на 2 и 5 см от опухоли не обнаружено.

2. Частоты аномального метилирования промоторов генов ЯАЗЗПА, РН1Т, ОАРК1, СйН!, С044, Т1МРЗ, МОМТв НМРЛ составили 70%, 52%, 17%, 61%, 34%, 43% и 15%, соответственно. В смежных с опухолью условно нормальных тканях на 2 и 5 см от опухоли выявлены эпигенетические изменения, частота которых снижается при удалении от опухолевого очага.

3. Частота мутаций гена Е0Р11 составила 19%: 81% мутаций гена £'GFД составляют делеции 19 экзона, 19% приходится на однонуклеотидные замены в 21 экзоне. Мутации в гене ПЯЛЯ обнаружены в 17% случаев, из них 84% мутаций в 12 кодоне гена. Транслокация гена АЬК выявлена у 6% пациентов.

4. Экспрессия микроРНК Ы-7а достоверно снижена в опухолевой ткани, относительно смежной условно нормальной ткани. Снижение уровня экспрессии 1е1-7а и гтЯ-155 в опухоли характерно для относительно молодых, некурящих пациентов, III-VI стадии заболевания, низкодифференцированных опухолей. Уровни экспрессии микроРНК Ы-7а, гшК-155, ппЯ-205 в условно нормальных тканях на расстоянии 5 см от опухоли различны в группах курящих/некурящих пациентов, пациентов с различной степенью дифференцировки опухоли.

5. В качестве маркеров неблагоприятного прогноза могут рассматриваться аллель-ные нарушения локусов 028405, 0381300, гиперметилирование промоторов генов ЯА55Р1А, ПИТ, ВАРК1, снижение экспрессии микроРНК 1е1-7а и гш11-155 в опухолевой ткани. В качестве маркеров дифференциальной диагностики плоскоклеточного рака легкого - потеря гетерозиготности и/или микросателлитная нестабильность локусов 098925, 0178938, аномальное метилирование промоторов генов СйН1 и СБ44.

6. В смежных с опухолью морфологически неизмененных тканях на расстоянии 2 и 5 см от опухоли происходят такие эпигенетические изменения как, гиперметилирование промоторов генов и изменение экспрессии микроРНК. Выявленные в смежных с опухолью условно нормальных тканях эпигенетические изменения формируют «опухолевое окружение» выявленное на расстоянии 5 см от опухолевого очага.

Практические рекомендации

1. Выявленные молекулярные повреждения: аллельный дисбаланс локусов 028405, 0381300, метилирование генов ЯА55Р1А, РН1Т, БАРК!, снижение экспрессии мик-

poPHK let-7a и miR-155 в опухолевой ткани могут использоваться в качестве маркеров прогноза HMPJI в комплексе с другими клиническими показателями.

2. Аллельные нарушения локусов D9S925, D17S938, аномальное метилирование промоторов генов CDH1 и CD44 могут быть использованы в качестве диагностических маркеров плоскоклеточного рака легкого.

3. Определение мутаций генов EGFR, KRAS и транслокации гена ALK у пациентов с не плоскоклеточным HMPJI (аденокарцинома, аденоплоскоклеточный рак) рекомендовано для определения чувствительности к таргетной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Шикеева A.A. Аллельные нарушения у пациентов с немелкоклеточным раком легкого / A.A. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Архив Патологии. - 2013. - № 2. - Том 75. - С. 3-8.

2. Шикеева A.A. Молекулярно-генетические аспекты немелкоклеточного рака легкого / A.A. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. -2013. -№5. - С. 62-67.

3. Шикеева A.A. Эпигенетические изменения при немелкоклеточном раке легкого / A.A. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. -2013. -№5. -С. 19-25.

4. Шикеева A.A. Анализ молекулярно-генетических изменений в гене EGFR у пациентов с НМРЛ / A.A. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Онкохирургия. - 2011. - № 2. - Том 3. - С. 87-88.

Публикации в других изданиях:

5. Шикеева A.A. Молекулярно-генетические изменения у пациентов с немелкоклеточным раком легкого / A.A. Шикеева, Т.В. Кекеева, Л.Э. Завалишина, Ю.Ю. Андреева, Г.А. Франк // Вопросы онкологии. - 2013 - приложение к №3 - том 59 - Материалы VIII Всероссийского съезда онкологов. Том I - стр. 417.

6. Shikeeva A.A. Allelic imbalance in non-small cell lung cancer / Shikeeva A.A., Ke-keeva T.V., Zavalishina L.E., Andreeva Y.Y., Frank G.A. // European Journal of Human Genetics - 2013 - June; 21 (Supplement 2) - p. 305 (PI 1.168).

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

FISH — флуоресцентная гибридизация in situ AK - аденокарцинома

АПКРЛ - аденоплоскоклеточный рак легкого МН - микросателлитная нестабильность

МЧ-ПЦР - метил-чувствительная полимеразная цепная реакция

НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого

НХЗ Л - неспецифические хронические заболевания легких

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГ - потеря гетерозиготности

ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Подписано в печать:

17.02.2014

Заказ № 9337 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Шикеева, Амуланг Алексеевна, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Московский научно-исследовательский онкологический институт

им. П. А. Герцена» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

04201456618

Шикеева Амуланг Алексеевна

«Молекулярно-генетические изменения при немелкоклеточном раке легкого.

03.02.07 - генетика 14.01.12 - онкология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научные руководители:

доктор биологических наук Завалишина Л.Э. кандидат медицинских наук Кекеева Т.В.

Москва - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.........................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................5

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................9

1.1. Этиология, классификация, диагностика и лечение НМРЛ.............................9

1.2. Молекулярно-генетические изменения при НМРЛ........................................16

1.2.1 Структурные изменения...............................................................................16

1.2.2 Эпигенетические изменения........................................................................23

1.2.2.1 Аномальное метилирование промоторов генов...................................25

1.2.2.2 МикроРНК...............................................................................................27

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.....................................................................29

2.1. Клинический материал.......................,...............................................................30

2.2. Выделение геномной ДНК.................................................................................31

2.3. Выделение микроРНК из парафиновых блоков..............................................31

2.4. Бисульфитная модификация ДНК....................................................................31

2.5. Микросателлитный анализ................................................................................33

2.6. Фрагментами анализ..........................................................................................34

2.7. Рестрикционный анализ.....................................................................................34

2.8. Метил-чувствительная полимеразная цепная реакция (МЧ-ПЦР)...............35

2.9. Метил-специфическая ПЦР (МС-ПЦР)...........................................................36

2.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).............................................................37

2.11. Обратная транскрипция...................................................................................38

2.12. ПЦР в режиме реального времени (Real time-ПЦР)......................................39

2.12.1 Real time-ПЦР для определения мутаций гена EGFR.................................39

2.12.2 Real time-ПЦР для определения уровня экспрессии микроРНК................40

2.13. Секвенирование................................................................................................40

2.14. Электрофорез в ПААГ.....................................................................................40

2.15. Ультратонкое окрашивание нитратом серебра..............................................41

2.16. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)................................................41

2.17. Программное обеспечение...............................................................................42

2.18. Статистическая обработка данных.................................................................42

3.1. Аллельные нарушения при HMPJ1....................................................................43

Аллельные нарушения в смежной с опухолью условно-нормальной ткани на — различном расстоянии...........................................................................................50

3.2. Результаты анализа мутации генов EGFR, KRAS и транслокации гена ALK при HMPJI...................................................................................................................51

3.3. Результаты аномального метилирования промоторов генов у пациентов с НМРЛ..........................................................................................................................58

Эпигенетические изменения в смежной с опухолью условно нормальной ткани на различном расстоянии............................................................................63

3.4. Результаты экспрессии зрелых микроРНК в НМРЛ.......................................65

Определение уровня экспрессии микроРНК let-7a, miR-155, miR-205 в смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии.......................73

3.5. Анализ генетических и эпигенетических изменений в опухолевом окружении..................................................................................................................78

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................................81

ВЫВОДЫ......................................................................................................................84

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..................................................................85

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................86

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ

Real time-ПЦР - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ÄK - аденокарцинома

АПКРЛ - аденоплоскоклеточный рак легкого

ИФР - интерферон

КРЛ - крупноклеточный рак легкого

KT - компьютерная томография

МН - микросателлитная нестабильность

МРТ - магнитно-резонансная томография

МС-ПЦР - метил-специфическая полимеразная цепная реакция

МЧ-ПЦР - метил-чувствительная полимеразная цепная реакция

МЭ - мукоэпидермоидный рак

НМРЛ - немелкоклеточный рак легкого

НХЗЛ - неспецифические хронические заболевания легких

ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГ - потеря гетерозиготности

ПКРЛ - плоскоклеточный рак легкого

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭТ - позитронно-эмиссионная томография

УФ излучение - ультрафиолетовой излучение

ВВЕДЕНИЕ.

Рак легкого является одним из самых распространенных злокачественных новообразований и одной из основных причин летального исхода у онкологических больных. По данным ВОЗ на 2008 год рак легких стал причиной смерти 1,3 миллиона человек (World health statistics, 2013). В 2011 в России зарегистрировано более 50 тысяч новых случаев рака легкого, при этом 36% случаев выявлено на 4 стадии заболевания (Чиссов В.И., 2011). Курение является одним из главных факторов риска развития рака легкого (курильщиками являются 87% пациентов с этой нозологией).

Летальность на первом году с момента установления диагноза составляет 53%. Пятилетняя выживаемость пациентов с раком легкого очень мала и составляет в разных странах от 5 до 18%, несмотря на высокий уровень развития современных методов диагностики и лечения.

Все раки легкого можно разделить на 2 большие группы: мелкоклеточный и немелкоклеточный раки легкого.

Группа немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ) включает примерно 85% всех раков. Среди гистологических типов НМРЛ - аденокарцинома, плоскоклеточный рак легкого, аденоплоскоклеточный, крупноклеточный рак. Первые два типа составляют 80-90% всех НМРЛ. Показано, что для каждого гистологического типа существует свой профиль генетический изменений, так, например, мутации генов EGFR, KRAS, транслокация EML4/ALK характерны для аденокарцином легкого. Для плоскоклеточного рака легкого показана амплификация генов FGFR1 и SOX2. Характерной особенностью нашей страны является преобладание плоскоклеточного рака, что обусловлено большим количеством курящего населения.

В ряде работ показано, что молекулярно-генетические изменения характерны не только для опухолевой ткани, но часто выявляются в смежных с опухолью условно нормальных тканях. Недавние исследования показали, что опухолевое окружение НМРЛ имеет гетерогенную структуру и играет важную роль в прогрессировании опухоли и эффективности лечения.

В последнее время в связи с развитием персонализированного подхода к выбору тактики лечения онкологических больных большое значение имеют не только клинические характеристики пациента, а также гистологический тип опухоли, но и молекулярно-генетические особенности опухоли и их применение для диагностики, прогноза заболевания и определения чувствительности к таргетной терапии.

Настоящее исследование посвящено изучению генетических и эпигенетических нарушений в опухоли и смежных с опухолью условно нормальных тканях, а также оценке практической (диагностической и прогностической) значимости этих нарушений.

Цель работы - комплексное изучение молекулярно-генетических изменений в немелкоклеточном раке легкого и смежных с опухолью условно нормальных тканях.

Задачи исследования.

1. Изучить аллельный дисбаланс локусов D2S405, D2S164, D3S1300, D3S1768, D3S1539, D9S925, D17S938 в НМРЛ и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли.

2. Изучить аномальное метилирование промоторов генов FHIT, TIMP3, CDH1, MGMT, RASSF1A, DAPK1, CD44 в НМРЛ и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли.

3. Определить частоты мутаций генов EGFR и KRAS и транслокацию гена ALK в не плоскоклеточном НМРЛ для определения чувствительности к таргетным препаратам.

4. Определить уровни экспрессии микроРНК: let-7a, miR-155, miR-205 -в опухолевой ткани и смежных с опухолью условно нормальных тканях на различном расстоянии от опухоли.

5. Провести сравнительный анализ выявленных молекулярно-генетических нарушений для различных гистологических типов НМРЛ и других клинических параметров.

Научная новизна.

Впервые на российской выборке проведено комплексное исследование молекулярно-генетических изменений НМРЛ: потери гетерозиготности, микросателлитной нестабильности, эпигенетических изменений на материале опухолевой ткани, смежной условно нормальной ткани на различном расстоянии. Впервые на российской выборке проведено исследование уровней экспрессии ряда микроРНК в опухолевой ткани, смежных с опухолью нормальных тканях пациентов с НМРЛ. Впервые изучено состояние опухолевого окружения на различных расстояниях от опухолевого очага.

Практическая значимость.

С развитием таргетной терапии, направленной против специфических молекулярных мишеней, точная гистологическая верификация опухолей легкого стала еще более необходимой. Выявленные в нашей работе молекулярно-генетические изменения локусов D9S925, D17S928, а также гиперметилирование промоторов генов CDH1 и CD44 могут рассматриваться в качестве маркеров плоскоклеточного рака легкого в сложных диагностических случаях в дополнение к данным иммуноморфологического исследования.

Выявленные в нашей работе аллельные нарушения микросателлитов D2S405, D3S1300, гиперметилирование промоторов генов RASSF1A, FHIT, DAPK1, а также снижение экспрессии микроРНК let-7a и miR-155 могут рассматриваться в качестве маркеров прогноза.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены: на десятой конференции «Нанотехнологии в онкологии», 15 декабря 2012г., Москва, на конференции «European Conference of Human Genetics», 8-11 июня, 2013г., Париж, Франция.

Положения, выносимые на защиту.

1. Для НМРЛ характерны высокие частоты потери гетерозиготности/микросателлитной нестабильности локусов 028405, Б28164, Б381300, 0381768, Б381539, 098925,Ш78938~, гиперметилирование промоторов" " генов ДЛЖМ, РН1Т, ЭАРК1, СИН!, СИ44, Т1МРЗ, МвМТ и снижение экспрессии микроРНК 1е1-7а.

2. В смежных с опухолью условно нормальных тканях на расстоянии 2 и 5 см от опухоли выявлены эпигенетические изменения и отсутствуют аллельные нарушения. В ряду: опухоль - смежная условно нормальная ткань на расстоянии 2 см - смежная условно нормальная ткань на расстоянии 5 см - происходит уменьшение частоты эпигенетических изменений.

3. Выявленные молекулярные повреждения: потеря гетерозиготности/микросателлитная нестабильность локусов Б98925, 0178928 и метилирования генов СДШ и СБ44 — ассоциированы с плоскоклеточным раком легкого и могут использоваться в качестве маркеров для гистологической верификации опухоли; аллельные нарушения регионов Б28405, Б381300, метилирование промоторов генов ЯАББРЫ и РН1Т, снижение уровня экспрессии микроРНК 1е1>7а и гш!1-155 ассоциированы со стадией заболевания, степенью дифференцировки опухоли и метастазированием и могут рассматриваться в качестве маркеров прогноза.

4. Смежные с опухолью морфологически не измененные нормальные ткани, содержащие молекулярно-генетические изменения, формируют «опухолевое окружение» выявленное на расстоянии 5 см от опухолевого очага.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Этиология, классификация, диагностика и лечение НМРЛ.

Рак лёгкого — обобщенное понятие, включающее разные по происхождению, клиническому течению, гистологической структуре и прогнозу злокачественные эпителиальные новообразования. В 2011 в России зарегистрировано более 50 тысяч новых случаев рака легкого, при этом 36% случаев выявлено на 4 стадии заболевания (Чиссов В.И., 2011). Летальность на первом году с момента установления диагноза составляет 53%. Пятилетняя выживаемость пациентов с раком легкого очень мала и составляет в разных странах от 5 до 18%.

Курение является одним из главных факторов риска развития рака легкого. Курильщиками являются 87% пациентов с этой нозологией. Также, в группу риска развития рака легкого могут попасть люди, имеющие: профессиональные вредности (асбест, уголь, хром и т.д.), хронические заболевания легких (туберкулез, НХЗЛ и т.д.), генетическую предрасположенность (зачастую прослеживаются семейные случаи рака легких), воздействия различных канцерогенов, встречающихся в повседневной жизни (УФ излучение, выхлопные газы и пр.), онкологические заболевания в анамнезе. Однако наличие этих факторов не всегда ведет к развитию рака легкого, что скорее говорит о мультифакториальной природе данного заболевания.

В зависимости от места возникновения новообразования выделяют (Чиссов В.И., 2007):

центральный (новообразование возникает из эпителия главных, долевых, сегментарных бронхов)

периферический (опухоль возникает из эпителия мелких бронхов и альвеол)

медиастинальный (множественное метастатическое поражение лимфатических узлов средостения, без выявления первичного очага в легком)

диссеминированный (множественное поражение легких, без выявления первичной опухоли в других органах)

В зависимости от гистологического строения выделяют (ВОЗ, 2001):

плоскоклеточный (происходит из покровного эпителия

бронхов)

аденокарциному (происходит из железистого эпителия

бронхов)

мелкоклеточный

крупноклеточный

аденоплоскоклеточный

карциномы с плеоморфными, саркоматиодными и саркоматозными компонентами.

С целью унификации подходов в лечении и прогнозе выживаемости пациентов в онкологии выделяют мелкоклеточный и немелкоклеточный раки легкого.

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет 85% всех раков легкого. Группа немелкоклеточного рака легкого довольно многочисленна и включает в себя аденокарциному, плоскоклеточный, крупноклеточный, аденоплоскоклеточный раки легкого. При этом первые два подтипа составляют 80-90% всех НМРЛ (Рис 1, 2).

Первоначальное состояние, так же как и прогрессирование заболевания любого онкологического больного, описывается с помощью ТМЫ классификации. В табл. 1 приведена ТЫМ классификация для пациентов с НМРЛ.

Для определения общей характеристики степени развития заболевания разные сочетания показателей Т>1М классификации объединены в группы - стадии (табл. 2).

Таблица 1. Современная TNM классификация рака легкого (Mirsadraee S., 2012).

Т (tumor) - размер опухоли

ТХ Первичная опухоль не может быть определена или опухоль при наличии злокачественных клеток в мокроте или бронхиальном смыве не наблюдается при рентгенографии или бронхоскопии

ТО Нет признаков первичной опухоли

Tis Карцинома in situ

TI Опухоль менее 3 см в наибольшем направлении, окружена легочной или висцеральной плеврой, без бронхоскопических признаков инвазии проксимальнее, чем дольковый бронх (например, нет в главном бронхе)

Tía Опухоль менее 2 см в наибольшем направлении

Tib Опухоль более 2 см, но менее 3 см в наибольшем направлении

T2 Опухоль более 3 см, но менее 7 см, или опухоль с каким-либо из признаков: Вовлечен главный бронх, более чем на 2 см дистальнее киля трахеи Инвазия в висцеральную плевру Ассоциирована с аталектазом или обструктивным пневмонитом, который распространяется на прикорневую область, но не на целое легкое

T2a Опухоль более 3 см, но менее 5 см в наибольшем направлении

T2b Опухоль более 5 см, но менее 7 см в наибольшем направлении

ТЗ Опухоль более 7 см или при инвазии в одно из следующего: Грудная стенка (включая опухоль Панкоста), диафрагма, диафрагмальный нерв, медиастинальная плевра, париетальный перикард Опухоль в главном бронхе менее чем 2 см дистальнее киля трахеи, но без его вовлечения Ассоциированный аталектаз или обструктивный пневмонит целого легкого Наличие других опухолевых очагов в этой доле легкого

Т4 Опухоль любого размера при инвазии в одно из следующего: Средостение, сердце, большие сосуды, трахея, возвратный гортанный нерв, пищевод, тело позвонка, киль трахеи Наличие других опухолевых очагов в других ипсилатеральных долях легкого

N (nodes) - лимфатические узлы

NX Метастазы в региональные лимфатические узлы не могут быть определены

N0 Нет метастазов в региональные лимфатические узлы

N1 Метастазы в ипсилатеральные перибронхиальные лимфатические узлы и/или ипсилатеральные прикорневые лимфатические узлы и внутрилегочные лимфатические узлы, включая их вовлечение непосредственным увеличением размеров

N2 Метастазы в ипсилатеральные медиастинальные лимфатические узлы и/или трахеобронхиальные лимфатические узлы

N3 Метастазы в контралатеральные медиастинальные, контралатеральные прикорневые, ипсилатеральные или контралатеральные лестничные, или супрклавикулярные лимфатические узлы

М (metastases) - метастазы