Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль генетических и эпигенетических факторов в развитии рака молочной железы и немелкоклеточного рака лёгкого

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль генетических и эпигенетических факторов в развитии рака молочной железы и немелкоклеточного рака лёгкого"

На правах рукописи

БУРДЕННЫЙ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В РАЗВИТИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЁГКОГО.

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 СЕН 2ІЛЗ

Москва-2013

005533580

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»)

Научный руководитель: Кандидат биологических наук,

ФГУП «ГосНИИ генетика», г. Москва Логинов Виталий Игоревич

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, доцент

ФГБУ МГНЦ РАМИ Стрельников Владимир Викторович

Кандидат биологических наук, доцент

МБФ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Кулакова Ольга Георгиевна Ведущая организация: Институт молекулярной биологии

Диссертационного совета при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».

им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится «

/У» 0 2013 года в 14.00 часов на заседании

Учёный секретарь Диссертационного совета, Кандидат химических наук, доцент

Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия частота онкологических заболеваний неуклонно растет. Ежегодно более 10 млн. человек во всем мире заболевают раком и около 6 млн. человек умирают от рака ежегодно, что составляет 12% от умерших во всем мире. Только 5-10% случаев рака являются наследственными, а остальные случаи рака являются результатом генетических и эпигенетических повреждений, возникающих в течение жизни в соматических клетках. Повреждения могут происходить либо вследствие воздействия внешних факторов (курения, радиации, алкоголя), либо внутренних (гормоны, иммунная система).

В структуре онкологической заболеваемости на рак легкого, в том числе и немел ко клеточный рак легкого (HMPJI), приходится около 13% и показатели 5-летней выживаемости очень плохие, даже в странах с высоким уровнем здравоохранения они составляют всего 15% (Jemal et al., 2010). В России ежегодно от HMPJI погибает около 60000 человек, что составляет более 20% всех умерших от злокачественных опухолей. Считается, что причиной этих новообразований является курение Щмянитов, 2006).

В развитых странах рак молочной железы (РМЖ) выявляется у каждой десятой жешципы, смертность при этом доходит до 40%. В отличие от рака легкого, для рака молочной железы не удалось убедительно выявить факторы риска окружающей среды. Предполагается, что в этом случае на первый план выходят факторы, участвующие в поддержании геномной стабильности (Imyanitov et al., 2004).

Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют не только генетические факторы, определяющие индивидуальные различия фермептпых систем (Ревазова и др, 2006), но и эпигенетические факторы — метилирование промоторных районов генов (Ходырев и др., 2011). Изменение статуса метилирования промоторных районов генов является характерной чертой опухолевых клеток, причем аномальное метилирование наблюдается уже на ранних этапах канцерогенеза. Изменения в уровне метилирования промоторных районов генов MGMT и RASSF1A показаны для рака молочной железы, легкого и опухолей других локализаций.

Генетические и эпигенетические факторы предрасположенности к развитию

онкологических заболеваний связаны с несколькими уровнями системы клеточной защиты. К первому уровню можно отнести гены биотрансформации ксенобиотиков, главным образом, гены глутатион-8-трансфераз 77, М1, Р1 (р8ТТ1, ОКТМ1, ОЗТР1) {Мартов и др., 2010; Корчагина и др., 2011). Следующий уровень клеточной защиты связан с механизмами прямой репарации повреждения ДНК и на этом уровне важным геном является 0(6)-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (МОЛ) (Степанов и др., 2010; Пономарева и др., 2011). Третий уровень связан с генами, осуществляющими контроль за пролиферацией и дифференцировкой клеток, к ним относятся ген ТР53 со своим регуляторным геном МйМ2 (Желтухин и др., 2010), а также ген-супрессор опухолевого роста КАББРЫ.

В данном исследовании сделана попытка объединить два аспекта в изучении проблемы повреждения генома человека - нарушение статуса метилирования генов ЛЛ55/<7Л и \iGMT и генетический полиморфизм систем клеточного контроля и детоксикации ксенобиотиков, применительно к генам, кодирующим ключевые ферменты этих систем - 05777, вБТЫ!, 08ТР1, ТР53 и МЛМ2. При этом, чтобы подчеркнуть универсальность участия данных ферментов в онкологических процессах, были выбраны две принципиально различные по механизмам развития онкопатологии - немелкоклеточный рак легкого и рак молочной железы.

Цель исследования: Изучить вклад метилирования промоторных районов генов ЯАЗБРМ и \iGMT, а также полиморфных маркеров генов 05777, 05777, ОЯТКН, ТР53 и МОМ2 в патогенез немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы.

Задачи исследования:

1. Оценить распределение генотипов полиморфных маркеров генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (05777, 05771//, 05ГР7) и генов контроля пролиферации клеточного цикла и апоптоза (ТР53, МИМ2) у больных злокачественными новообразованиями разных локализаций (немелкоклеточный рак легкого и рак молочной железы).

2. Провести сравнительный анализ комбинаций генотипов генов 65777, 05ГА7/, С8ТР1, ТР53, МЛМ2 у всех обследованных больных и выявить специфичные сочетания, предрасполагающие к развитию немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы.

3. Определить профили метилирования промоторных областей генов 1ЫББРЫ,

МСМ'Г в эпителиальных опухолях молочной железы и легкого. Выявить возможные корреляции между уровнем метилирования этих генов и прогрессией опухоли.

4. Подобрать информативные системы маркеров, оптимальные для выявления данных видов опухолей.

Научная новизна: В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование ассоциации генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, репарации ДНК и регуляции клеточного цикла и апоптоза с патогенезом онкологических заболеваний различных локализаций и выявлена связь неблагоприятных сочетаний генотипов с риском развития опухоли определенной локализации, ее клинико-гистологическими особенностями. Также впервые получены данные об уровне ассоциации комбинаций генотипов генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков и гена белка-онкосупрессора р53 с развитием злокачествешшх новообразований. Получены новые данные об ассоциации глутатион-8-трансфераз и генов ТР53 и МОМ2 с патогенезом НМРЛ и РМЖ. Впервые выявлена ассоциация предрасполагающих генотипов генов 05ГТ1, С$ТМ1, 08ТР1, ТР53 и МОМ2 и их сочетания с гистологичесим типом опухоли. Впервые получены данные об ассоциации сочетанных предрасполагающих генотипов генов ОПТ!, С8ТР1, ТР53, КАХЫ-ЧА и МОМТ с патогенезом РМЖ. Впервые обосновано, что суммарное влияние функционально неполноценных вариантов генов глутатион-Б-трансфераз Т1, М1, Р1 и предрасполагающих генотипов генов ТР53 и МЛМ2 превышает эффект индивидуальных генотипов. Проведен анализ молекулярно-генетических нарушений, определяющих различия молекулярного патогенеза НМРЛ и РМЖ.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные по итогам проведешюго исследования данные фундаментального характера об ассоциации полиморфных маркеров генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков (ОЯТТ!, йЗТМ!, С,$ТР1), и генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и апоптоза (ТР53 и МИШ), а также анализ сочетанных предрасполагающих генотипов этих генов в эпителиальных опухолях, существенно расширяют имеющиеся представления о молекулярно-генетических механизмах возникновения и развития злокачественных новообразований.

Установление роли исследованных генов в развитии злокачественных опухолей обосновывает возможность рекомендовать определение этих показателей в качестве диагностических параметров для выявления групп повышенного онкологического риска. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых патогенетически оправданных подходов к профилактике и ранней диагностике онкологических заболеваний, а также прогнозированию клинического течения злокачественных опухолей.

Апробация работы. Аппробация диссертационной работы состоялась на заседании Секции молекулярной биологии Учёного совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 22 мая 2013 года. Результаты настоящей работы были представлены на конференциях: «4th International Conférence for Young Scientists 2011 "Molecular biology: advances and prospectives"» (Ukraine, Kiev, 2011), «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 2011), XV Российский онкологический конгресс (Москва,

2011), «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск,

2012), «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации, 7 материалов конференций и конгрессов, 1 статья в зарубежном сборнике.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 126 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 325 источников. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 25 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выборка образцов.

Образцы опухолевой и прилежащей гистологически нормальной ткани, а также крови собраны и клинически охарактеризованы в РОНЦ РАМН. Использовали кровь

и ткани только тех больных, которые до операции не получали химио- или лучевую терапию. Из исследования были исключены больные с обострением хронических воспалительных процессов, аутоиммунными заболеваниями, наследственными и психическими болезнями. Все случаи НМРЛ и РМЖ классифицированы клинически по системе TNM в соответствии с требованиями Международного противоракового общества (UICC, версия 7, 2009 г. (So bin et al, 2009)) и типированы гистологически в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической отологии ГУ РОНЦ РАМН. Выборка парных тканевых образцов включала образцы немелкоклеточного рака легкого 49 случаев (в т.ч. илоскоклеточный рак легкого — 29 случаев и аденокарциному легкого - 20 случаев) и 58 образцов рака молочной железы (преимущественно «протоковой» гистологии, ипРМЖ). Выборка образцов ДНК, выделенная из периферической крови, включала образцы немелкоклеточного рака легкого - 88 случаев (плоскоклеточный рак -59 случаев, аденокарцинома - 29 случаев) и образцы рака молочной железы - 140 случаев (в т.ч. инфильтративный протоковый — 105 случаев, инфильтративный дольковый - 35 случаев). В качестве популяционного контроля использовали сопоставимую по возрасту и полу выборку онкологически здоровых индивидов (п=240). Также были использованы 10 образцов ткани легкого и 10 образцов ткани молочной железы от постмортальных лиц без выявленных онкопатологий (по данным анамнеза), полученных в патологоанатомическом отделе НИИ Скорой Помощи им. Склифосовского. Далее постмортальные лица без онкопатологии в анамнезе будут обозначены как доноры.

Методы исследования

Выделение геномной ДНК осуществляли по стандартному протоколу (Sambrook et al., 1989). Для анализа полиморфных маркеров генов GSTT1, GSTMI, GSTP1, ТР53 и MDM2 использовали метод ПЦР-ПДРФ. Анализ метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT проводили с помощью бисульфитной конверсии ДНК с последующей метил-специфичной ПЦР. Наличие участка метилирования определяли по присутствию на электрофореграмме участков, длиной 169 п.н. для гена RASSF1A и 81 п.н. для гена MGMT, контролем амплификации служило обязательное наличие на электрофореграмме фрагмента ДНК такой же длины, соответствующее неметилированной области гена.

Для статистической обработки данных использовался пакет программ STATISTICA® 6.0. Для сравнения частот метилирования нами использовался точный критерий Фишера. Достоверными считали различия при р<0.05. При сравнении частот генотипов использовался стандартнгый критерий х2 Пирсона.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Ассоциация полиморфных маркеров генов бнотрансформации с риском развития НМРЛ и РМЖ. Связь с клинико-гистологическими параметрами опухоли.

Ферментами второй фазы биотрансформации ксенобиотиков являются глутатион-Э-трансфсразы (GSTs). Наиболее значимыми генами в своих классах с точки зрения генетических и биомедицинских исследований являются гены GSTM1, GSTT1 и GSTP1 (Nebert and Vasiliou, 2004). У носителей "нулевых генотипов" (-/-) генов GSTM1 и GSTT1, синтез соответствующих ферментов полностью отсутствует (Rotunno et al., 2012). У носителей аллеля Val полиморфного маркера IlelOSVal гена GSTP1 имеет место снижение концентрации фермента в клетках.

Частоты генотипов полиморфных маркеров генов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 в обследованных группах больных НМРЛ и РМЖ представлены в табл. 1. Частота нулевого (-/-) генотипа гена GSTT1 в исследованных группах больных НМРЛ и его гистологических подтипах - АК и IIP Л была достоверно выше, чем в контрольной группе в 2,5 (х2= 14,18), 3,2 (х2= 15,71) и 2,3 раза &2= 9,65), соответственно (рис. 1А). Полученные нами данные согласуются с данными других авторов (Timofeeva et al., 2010; Dzian et al., 2012). Для рака молочной железы и его инфильтративно-протоковой формы (ипРМЖ) было выявлено увеличение частоты пулевого генотипа гена GSTT1 в 1,5 раза (х2 = 6,39 и jf = 7Д2, соответственно) по сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц (рис. 1 А). В популяционных исследованиях зарубежных ученых отмечена ассоциация этого гена только с развитием рака молочной железы (Naushad et al., 2011, Ramalhinho et al., 2011).

Таким образом, проведенные нами исследования делеционного полиморфного маркера гена GSTT1 свидетельствуют, что наличие генотипа (-/-) гена GSTT1 является фактором риска рака для всех изученных нами опухолей.

Таблица 1.

Распределение частот генотипов полиморфных маркеров генов биотрансформации - 05777, С8ТМ1 и ОЗТР!, а также полиморфных маркеров генов апоптоза - ТР53 и \4DM2 среди больных НМРЛ и РМЖ, их гистологических

подтипов и здоровых индивидов.

Контроль п = 138 ипРМЖ п = 105 идРМЖ п = 35 РМЖ п = 140 Генотип Ген Генотип НМРЛ n = 88 AK n = 29 ПКР n = 59 Контроль n = 160

0,710 0,543 0,571 0,564 (+/+) GSTT1 (+/+) 0,659 0,552 0,678 0,863

0,290 0,457* 0,429 0,436 (+) 0,341 0,448 0,322 0,138

0,616 0,524 0,371 0,493 (+/+) GSTM1 (+/+) 0,591 0,517 0,576 0,575

0,384 0,476 0,629 0,507 (-/-) (-/-) 0,409 0,483 0,424 0,425

0,500 0,410 0.343 0,357 Ile/Ile GSTP1 Ile/Ile 0,330 0,241 0,373 0,500

0,406 0,467 0.371 0,464 Ile/Val Ile/Val 0,489 0,552 0,458 0,350

0,094 0,124 0.286 0,179 Val/Val Val/Val 0,182 0,207 0,169 0,150

0,384 0,124 0,086 0,129 Arg/Arg TP53 Arg/Arg 0,261 0,241 0,288 0,406

0,312 0,448 0,429 0,421 Arg/Pro Arg/Pro 0,432 0,345 0,458 0,519

0,304 0,429 0,486 0,450 Pro/Pro Pro/Pro 0,307 0,414 0,254 0,075

0,971 0,933 0,914 0,943 T/T MDM2 T/T 0,875 0,828 0,847 0,975

0,029 0,067 0,086 0,057 T/G T/G 0,125* 0,172 0,153 0,025

*Жирным шрифтом выделены частоты предрасполагающих генотипов, показавших ассоциацию (р<0.05)

Б

Рисунок 1. Показатели отношения шансов (OR) развития злокачественных новообразований для носителей нулевых генотипов генов GSTT1 (A), GSTM1 (Б) и Val/Val генотипа гена GSTP1 (В) при р<0,05 и доверительном интервале - 95% (С195%).

В настоящем исследовании не было установлено значимого увеличения риска развития НМРЛ в случае делеционного полиморфного маркера гена GSTMI. Однако нами установлена ассоциация «нулевого» генотипа гена GSTM1 с повышенным риском развития рака молочной железы, что ранее было отмечено для итальянской популяции (Ramalhinho et al, 2012). Для больных РМЖ инфильтративно-долькового типа (идРМЖ) также было зарегистрировано статистически значимое увеличение частоты генотипа (-/-) гена GSTM1 по сравнению с контрольными значениями {■£ = 6,80) (рис. 1Б).

Частоты генотипов Ile/Val и Val/Val полиморфного маркера IlelOSVal гена GSTPI среди больных с НМРЛ были статистически значимо выше, чем в контрольной группе (рис. 1В). Для аденокарциномы легкого в группе больных также была установлена статистически более высокая частота предрасполагающего генотипа по сравнению со здоровыми лицами (20,5% при р = 0,04). Результаты, полученные нами, для русской популяции московского региона показаны впервые. Для РМЖ и идРМЖ была установлена высокодостоверная ассоциация генотипа Val/Val полиморфного маркера Ile 105 Val гена GSTP1 с риском возникновения этих опухолей (рис. 1В). Показано значимое увеличение частоты генотипа Val/Val гена GSTP1 в группе больных с РМЖ и идРМЖ в 1,9 и 3 раза, соответственно, по сравнению с контрольной группой (х2 = 7,48, р = 0,02 и у.2 = 9,26, р = 0,01. соответственно).

Следует отметить, что ранее ассоциация этого полиморфного маркера с риском развития РМЖ была установлена только для представителей монголоидной расы (Lu etal., 201 J; Feng et ai, 2012).

Также нами был проведен анализ распределения частот генотипов полиморфных маркеров генов глутатион-Э-трансфераз 77, Ml a PI у больных HMPJI и РМЖ в зависимости от клинико-патогенетических характеристик злокачественного процесса (табл. 2 и 3).

Подавляющее большинство случаев HMPJ1 обусловлено курением. Курение само по себе является фактором риска развития возникновением опухоли (Zhang and Liu, 2013), а при наличии у пациентов «нулевых» генотипов генов GSTT1 или GSTM1 показано увеличение риска развития немелкоклеточного рака легкого в несколько раз (Cabrai et al., 2010). Полученные нами данные подтверждают данный факт (табл. 2).

Таблица 2.

Ассоциация нулевого генотипа гена GSTT1 с риском развития HMPJI у больных, объединённых в группы по клинико-патогенетическим параметрам.

Отягощвшость курением

Ген Генотип НМРЛ п=4б Контроль 11 = 42 Я Р OR

знач.

GSTT2 (+*) 0,543 0,857 10,16 0,006 0,20 0,07-0,56

(-О 0,457 0,143 5,04 1,78 -14,27

Возраст (более 60 лет)

Ген Генотип НМРЛ п=41 Контр ОЛЬ П = б6 £ р OR

знач. CW.

GS777 (+*) 0,512 0,864 15,81 0,0004 0,17 0,07-0,42

(-4 0,483 0,136 6,03 2,37-15,32

Стадия І/П

Ген генотип НМРЛ п=48 Контроль п = 160 р ОЙ

знач. С1э£<н>

GKTT1 (+А) 0.7СЄ 0,863 6,13 0,01 0,35 0,18-0,83

(-Н 0,292 0,138 2,58 1,20-5,57

Стадия ГИЛУ

Ген генотип НМРЛ Контроль и = 160 11 OR

знач.

GSTJ1 (+*) 0,525 0,863 22,37 1н10'5 0,18 0.08-0,38

(-П 0,475 0,138 5,68 2.64-1Я21

У исследованной нами группы курящих больных обнаружено, что частота генотипа (-/-) гена GSTT1 оказалась более чем в 3 раза выше, чем у некурящих пациентов, а относительный риск развития HMPJ1 составил 5,04.

В нашем исследовании показано, что относительный риск развития HMPJ1 у лиц старше 60 лет повышается в 6 раз. Среди больных со стадией III/IV частота генотипа (-/-) гена GSTT1 была в 1,6 раза выше, чем среди больных со стадией I/II и в 3,4 раза выше, чем у здоровых индивидов - 47,5%, 29,2% и 13,8%, соответственно. Следует отметить, что риск развития РМЖ у пациенток моложе 53 лет, носителей нулевого генотипа гена GSTT1 и генотипа Val/Val полиморфного маркера Ile¡05Val гена GSTP1 составил соответствено 2,33 и 2,3 (табл. 3), что согласуется с результатами, полученными в других популяционных исследованиях (Park et al., 2004; Kadouri et al., 2008). В то же время нами впервые показана ассоциация нулевых генотипов генов GSTT1 и GSTM1 у больных со стадиями I и II рака молочной железы.

Таблица 3.

Ассоциация генотипов полиморфных маркеров генов GSTT1, GSTM1 и G.S7P1 с

риском развития рака молочной железы у различных групп больных.

Возраст до 53 лет

Ген Генотип РМЖ n = T6 Катар оль n = 80 & P OR

знач.

GSTT1 (+/+) 0,579 0,763 11,93 0,0006 0,43 0,26-0,70

(S-) 0,421 0,238 2.33 1,44-3,80

GSTP1 ПеПІе 0,329 0,588 10,81 0,005 0,34 0,18-0,66

lie/Val 0,513 0,338 2,07 1,08-3,95

VaJ/Val ОДЖ 0,075 2,31 0,82-6,51

Стадия І/П

Ген Генотип РМЖ n= 120 Контроль n = 138 2? P OR

знач. CTjs%

GSTT1 (+/+) 0,592 0,710 3,99 0,05 0,59 0,35 - 0,99

0,408 0,290 1,69 1,01-2,84

GSTM1 (V+; 0,500 0,710 11,94 0,0006 0,41 0,24-0,68

(s-) 0,500 0,290 2,45 1,47-4,09

Мы не нашли значимой ассоциации полиморфных маркеров генов GSTT1, GSTMI и GSTP1 с такими клиническими проявлениями прогрессии заболевания, как лимфогенное и гематогенное метастазирование, размером и степенью дифференцировки опухоли как у больных HMPJI, так и РМЖ.

2.2. Ассоциация полиморфных маркеров генов ТР53 и MDM2 с риском развития НМРЛ и РМЖ. Связь с клипико-гистологическими параметрами опухоли.

Ген ТР53 - является одним из ключевых генов-супрессоров опухолевого роста. Недостаточность этого белка ведет к неизбежному развитию злокачественных новообразований, в том числе немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы (Moura Gallo et al., 2005). На данный момент в гене ТР53 выявлено 86 полиморфных маркеров, из них 17 в экзонах и 69 в интронах (Petitjean et al., 2007), однако наиболее значимым является однонуклеотидный полиморфный маркер, в котором гуанин в кодопе 72 экзона 4 заменяется на цитозин (Arg72Pro) (Желтухин и Чумаков, 2010). Следует отметить, что основным функциональным регулятором активности гена ТР53, является белок Mdm2, кодируемый одноименным геном (MDM2) (Желтухин и Чумаков, 2010).

Распределение частот генотипов полиморфных маркеров Arg72Pro гена ТР53 и T309G гена MDM2 у пациентов с НМРЛ, РМЖ и в контрольных группах представлено в табл. 1. Частота Предрасполагающего генотипа Pro/Pro гена TP53 в группе больных с НМРЛ была в 4,1 раза выше по сравнению с группой контроля (%2 = 23,64), относительный риск развития НМРЛ при этом составил 5,46 (С195% = 2,60 -11,47, р = 8x10"6). Для генотипа TG полиморфного маркера T309G гена MDM2 относительный риск развития НМРЛ составил 5,57 (С195% = 1,72 — 18,07, р = 0,007) (Wilkening et al., 2007). Установлено, что частота предрасполагающего генотипа Pro/Pro гена TP53 в группе больных с РМЖ в 1,5 раза выше по сравнению с группой контроля, в то же время частота генотипа Arg/Arg снижена в 3 раза (%2 = 23,95), относительный риск развития РМЖ составил 1,87 (Cl95% = 1,14 — 3,06, р = 6х10"6). Показано, что частота генотипа TG гена MDM2 в группе больных с РМЖ не отличалась от таковой в контрольной группе.

При формировании групп больных по гистологическому признаку были получены

интересные данные. Так для генотипа Pro/Pro гена ТР53 была показана значимая ассоциация с риском развития АК и ПРЛ, относительный риск развития которых составил 8,71 и 4,2, соответственно. Также было показано статистически значимое увеличение частоты предрасполагающего генотипа Pro/Pro гена ТР53 в идРМЖ и ипРМЖ в 1,6 и 1,4 раза по сравнению с контрольной группой, при этом частота защитного генотипа Arg/Arg была снижена в 4,5 и 3 раза соответственно. Относительный риск развития составил 2,16 для идРМЖ (С195% = 1,01 - 4,60, р = 0,003) и 1,79 для ипРМЖ (С195% = 1,06 - 3,03, р = 4х10"5). В нашем исследовании также показана статистически значимая ассоциация генотипа TG гена MDM2 с повышенным риском развития АК и ПРЛ (OR = 8,13, р = 0,0006 и OR = 7,02, р = 0,0004, соответственно). Полученные нами данные находятся п согласии с данными других авторов (Bisof et al., 2010; Proestling et al., 2012; Tilak et al., 2013).

Нами также были изучены частоты распределения генотипов полиморфных маркеров Arg72Pro гена ТР53 и T309G гена MDM2 у больных с НМРЛ и РМЖ с различными клинико-патогенетическими характеристиками опухоли. Так, нами установлено, что частота генотипа Pro/Pro гена ТР53 в группе больных пожилого возраста (старше 60 лет) с НМРЛ составила 36,6%, статистически значимо превышая этот показатель в контроле — 7,5% (табл. 4).

Частота генотипа TG гена MDM2 в этой же группе больных была в 4,9 раз выше, чем в группе контроля. Относительный риск развития НМРЛ для исследованных генотипов составил 7,12 и 5,42, соответственно. Все это указывает на важную роль этих генотипов в развитии злокачественных новообразований (Wilkening et al., 2007; Cäceres et al., 2009). В то же время, при изучении влияния возрастного фактора у больных РМЖ нами были показаны значимые различия в распределения частоты генотипа полиморфного маркера Arg72Pro гена TPS3 у пациенток моложе 53 лет (табл. 5).

Так, частота генотипа Pro/Pro гена TP53 в группе больных РМЖ младшего и среднего возраста (моложе 53 лет) составила 46,1%, статистически значимо превышая этот показатель в контроле (28,8%), что указывает на ассоциацию данного генотипа с повышенным риском возникновения РМЖ. Частота генотипа TG гена MDM2 в той же возрастной группе больных не превышала таковую в группе контроля. Полученные нами результаты согласуются с данными зарубежных авторов (.Läng et al., 2009).

Таблица 4.

Распределение частот генотипов полиморфных маркеров А^72Рго гена ТР53 и Т3090

гена МОМ2 среди больных НМРЛ.

Возраст (старше 60 лет)

Гея Генаттт НМРЛ Кшггроль Р ОН

11 = 41 и = 160 энач.

ЛГ£/АГ£ 0,244 0,406 0,47 0.22-1.03

ТР53 Аг&'Рго 0,390 0,519 23.95 6x1 СГв 0.59 0,29 — 1,20

Рт/Рго 0,366 0,075 7,12 2,99 - 16.92

МПМ2 Т/Т 0,878 0,975 7,17 0,03 0.18 0.05 - 0.72

Т7С 0,122 0.025 5,42 1.38-21,19

Отягощвдность курением

Геи Геттип НМРЛ Контр поп. 72 Р ОН

1г = 4б п = 160 знач.

0,370 0,406 0,86 0,44 - 1,69

ТР53 Агд'Рго 0,348 0,519 14.98 0,0006 0,49 0,25-0,98

Рга/Рго 0,283 0,075 4,86 2.03 - 11.60

МОМ2 Т/Т 0,870 0.975 8,60 0.01 0,17 0,05-0.63

27С? одзо 0,025 5,85 1,58-21,72

Стадия 1/Н

Гея Геттип НМРЛ Котроль х2 р ОН

и =54 п= 160 знач.

Ат-Я'Агз 0,204 0,406 0.37 0.18-0.78

ТР53 Агц/Рт 0,481 0,519 21.91 2x105 0.86 0,46-1.60

Рга/Рго 0^15 0,075 5,67 2,49-12.89

МОМ2 17Т 0,849 0,975 11.88 0.003 0,14 0,08 - 3,19

'ПС 0,151 0,025 6,93 2.00 - 24,08

Стадия Ш/ГУ

Ген Рензпш НМРЛ Контроль тХ Р ОН

п =34 п = 160 знач.

Агд/Агш 0,294 0.406 0.61 0.2Г7 - 1.36

ТР53 Лг^Рт 0,324 0,519 23,67 7х10гв 0,44 0.20 -0.97

Рга/Рго 0382 0.075 7,63 3.08 - 18,93

Таблица 5.

Распределение частот генотипов полиморфного маркера Аг§72Рго гена ТР53 среди больных РМЖ в возрасте до 53 лет.

Возр акт да 53 лег

Геи Генотип РМЖ п= 76 Контроль п= 80 X? Р ОН

знач.

ТР53 Агз/Аг% 0,092 0,463 26,48 1 х 10"6 0,12 0,05-0,29

Аг^/Рго 0,447 0,250 2,43 1,23-4,79

РгоЯУо 0/161 0,288 2,12 1,09-4,10

При сравнении частот генотипов полиморфных маркеров Arg72Pro гена ТР53 и T309G гена MDM2 у больных НМРЛ, отягощёгаплх курением, была показана ассоциация генотипа Pro/Pro гена ТР53 и генотипа TG гена MDM2 с риском развития НМРЛ для курящих пациентов (OR = 4,86, р = 0,0006 и OR - 5,85, р = 0,01) (табл. 4), что согласуется и с данными других авторов (Wilkening et al., 2007; Caceres et al., 2009; Hancox et al, 2009).

Мы не обнаружили значимой ассоциации полиморфных маркеров Arg72Pro гена ТР53 и T309G гена MDM2 с такими клиническими проявлениями прогрессии заболевания, как лимфогенное и гематогенное метастазирование, размером и степенью дифференцировки опухоли как у больных НМРЛ, так и РМЖ, а также стадией опухоли у больных с РМЖ.

2.3. Сравнительный анализ исследованных генов и их комбинаций у больных с немелкоклеточным раком легкого и раком молочной железы.

Значительный интерес представляет изучение ассоциации сочетанных генотипов полиморфных маркеров. Следует отметить, что в зарубежной практике исследования ассоциации сочетанных генотипов с развитием заболевания и его прогрессией наблюдается не так часто (Sreeja et al., 2008). Для пациентов московского региона подобный анализ проводился впервые.

Мы показали, что "нулевой" сочетанный генотип (-/—) генов GSTM1 и GSTT1 в 2,6 раза чаще встречается у больных НМРЛ - 27,3 против 10,6% в группе контроля (%2 = 11,4) (Рис. 4А). Относительный риск развития НМРЛ для данного сочетания генотипов составил 3,15 (С1?5% = 1,59 - 6,27, р = 0,003). Также была обнаружена высокодостоверная ассоциация сочетанного генотипа (-/—)/(Val/Val) генов GSTT1 и GSTP1. Мы выявили, что частота такого сочетанного генотипа в 3 раза выше у больных НМРЛ - 11,4 против 3,8% в группе контроля {yl = 5,45) (Рис. 4Б). При этом относительный риск развития составил 3,29 (С195% = 1,15-9,39, р - 0,02), что согласуется с данными других авторов (Sreeja et al., 2008). Проведенный нами анализ показал, что в группах больных РМЖ сочетанный генотип GSTM1 (-/-)/GSTTl (-/-) встречается в 2,2 раза чаще, чем в контрольной группе (45,7% против 21%; %2 = 19,05) (Рис. 4А). Относительный риск развития РМЖ при носительстве данного сочетанного генотипа составляет 3,17 (С195% = 1,87-5,36, р = 7,0х10"5).

[~А~] Контроль

ІП Контроль

/96,2%

і (ЩЩкШЫ) О (-ЩШ1)

Контроль

РМЖ

,45,7%

Рисунок 4. Распределение частот сочетанных генотипов генов GSTM1, GSTT1 и GSTP1 в контрольной группе и группе больных с НМРЛ и РМЖ: А. «нулевых» генотипов генов GSTM1 и GSTTI; Б. генотипа (-/-)/(Val/Val) генов GSTT1 и GSTP1.

Сочетапный генотип GSTTl(-/-)/GSTMl(-/-)/GSTPl (Val/Val) встречается у больных РМЖ в 2,3 раза чаще, чем в контрольной ipynne: 42,1% против 18,1% (%2 = 19,03). Мри этом относительный риск развития составляет 3,29 (С195%=1,90-5,69, />=8,0x10"5) (Рис. 4Б). Сходные данные получены в исследованиях в других популяциях (Saxena et al., 2009; Ramalhinho et al., 2011).

Также интерес представляют результаты, полученные при изучении распределения частот сочетанных генотипов изученных полиморфных маркеров генов ТР53 и MDM2. Так, частота сочетанного генотипа (Pro/Pro)/(TG) генов ТР53 и MDM2 в группе больных НМРЛ составила 9,1 % (у2 = 9,02, р = 0,01, OR = 7,90, С195% = 1,64 - 38,07), статистически значимо превышая этот показатель в контроле 1,3 %. Следует также отметить увеличение частоты сочетанного генотипа (Arg/Pro+Pro/Pro)/(TG) генов ТР53 и MDM2 и в группе больных с АК и в группе больных с ПРЛ в 7-8 раз по сравнению с контрольной группой (у2 - 7,88 и yl - 8,82, соответственно) (Рис. 5А). При этом относительный риск развития АК составил 9,12 (С195% = 1,45 - 57,21, р = 0,02), а ПРЛ - 8,59 (С195% = 1,61 - 45,73, р = 0,01). Наши результаты согласуются с данными зарубежных авторов (Wilkening et al., 2007). Следует отметить, что частота сочетанного генотипа Pro/Pro + TG генов ТР53 и MDM2 в группе больных РМЖ составила 33,3%, что статистически значимо превышает этот показатель в контрольной группе (2,7%) (р = 0,0016).

15

Е Контроль НМРЛ АК ПРЛ

1.3% 9.1% Ю.3% 9,8%

98,6% 90.9% 89 7% 90,2%

ш(АгдтгдУ(ТТ) а (Агд/Ргоч-Рго/Рго)/( Т/3)

® Контроль РМЖ ипРМЖ

2,7%

97,3% 66,7% 61.9%

■&(Аге/Аг§+Аг0/Рго)/(тт} ъ(Рго/Рго)/(Тв) Рисунок 5 Распределение частот сочетанных генотипов генов ТР53 и МОМ2-. А. в контрольной группе и группе больных с НМРЛ и его гистотипами (АК, ПРЛ); Б. в контрольной группе и группе больных РМЖ и его основного гистотипа (ипРМЖ).

Таблица 6.

Распределение частот сочетанных генотипов гена ТР53 и генов П фазы биотрансформации ксенобиотиков с развитием НМРЛ и РМЖ.

Геи Решил НМРЛ Г 36 Квятрёл^ ИЗ £ г т

ГШ тч.

+ ШТ1 0,411 т 10Д1 яда № 0,08-0,5?

0,583 0,233 т 1,75-12,18

........................... - НМРЛ 1=51 Кокгро.ц. ИТ $ г 01

ягач,

12? 0,4Й 14,47 0,15 0,06-0,44

/да + Ша1+.{'фо+Ыйо 0,873 0,532 6ДЗЗ

+ШП+ та НМР1 8=31 Квнтрмь а=ЗР $ ? ок

тч.

0,® ОД т 0,02 0,2? 0,10-0,70

0Л5 0,282 3,73 МЗ-9,73

+ШТ1+ стгют/ ....... ....... - НМРЛ «43 Кмпрш п=33 $ р ОН

яач, сь»

0,333 0,66? т 0,03 0,25 0,09-0,70

А+ЩЩ + №Ш +А>$Рго+Ш?го 0,66? ода 4,00 -11,13

+ШШ РМЖ п=56 Квкгрвль Н5 г- р ОК

знач. йв»

о,ш1 1 т 1 (1 0,21 0,06-0,71

В+АЯЙО+ЙЙЙО ода | одзз I - 4,73 М1 -15ДО

При рассмотрении сочетания генотипов изученных полиморфных маркеров генов TP53 и MDM2 в гистологических подтипах РМЖ, было отмечено увеличение частоты встречаемости генотипа Pro/Pro + TG в группе больных ипРМЖ в 14 раз (р = 0,0007) (Рис. 5Б).

Нами также была изучена ассоциация сочетанных генотипов полиморфного маркера Arg72Pro гена ТР53 и генов фазы II биотрансформации ксенобиотиков с риском развития HMPJI и РМЖ (табл. 6). Важно отметить, что с относительным риском развития РМЖ ассоциирован только сочетанный генотип генов ТР53 и GSTM1 (OR = 4,73, р = 0,03). Таким образом, комбинация неблагоприятных вариантов данных генов может обсуждаться как значимый фактор увеличения онкологического риска для HMPJI и РМЖ.

2.4. Анализ метилирования промоторных районов генов MGMT и RASSF1A при HMPJI и РМЖ, связь с прогрессией рака.

В данном разделе представлены результаты исследования спектра метилирования промоторных районов генов-супрессоров MGMT и RASSFIA в опухолях немелкоклеточного рака лёгкого (49 случаев) и рака молочной железы (58 случаев). В работе использован метод метил-специфичной ПНР (МС-ПЦР

Для всех исследованных генов обнаружены более частые случаи метилирования в образцах опухолевой ткани, чем в образцах условно нормальной ткани легкого и молочной железы, причем различия статистически значимые (Р<0.05 по Фишеру, табл. 7). Кроме того, анализ образцов ДНК тканей легкого и молочной железы десяти доноров показал полное отсутствие метилирования этих генов (табл. 7).

Частота метилирования генов RASSFIA и MGMT в образцах HMPJI и РМЖ составляет от 19% до 31%. Следует отметить, что метилирование промоторного района гена RASSFIA наблюдали и в образцах ДНК из гистологически нормальной ткани (2%, 1/49), прилежащей к опухоли. Также нами показано значимое различие по частоте метилирования гена RASSFIA у пациентов с плоскоклеточным раком легкого и инфильтративно-дольковым раком молочной железы (р - 0,0024 и р = 0,035, соответственно) и условно нормальной, прилежащей тканью. Ген MGMT значимо чаще метилирован у пациентов с АК, ПРЛ и ипРМЖ (р = 0,02, р = 0,012 и р = 0,015, соответственно), чем в условно нормальной, прилежащей ткани.

Таблица 7.

Частота метилирования генов и МвМТ в образцах ДНК пациентов с НМРЛ

и РМЖ и их гистологическими типами. Использовали ДНК опухоли (О) и прилежащей гистологически нормальной ткани (Н).

Ввдрма ием тнстолшгескне пшы msm мшт Доноры

0 Н Я* 0 Н Pi

Немеовк.ге'гочиынр« легкого 15/49,31% 1/49,2% 0.0002 15/49,31% 0/49,0% 0,00(11 0/10,0%

Адегакардшгоа 4/20,20% 0/20,0% Р> 0Д)5 7120,35% 0/20,0% У2 0/10,0%

Пгоаоклеташнрю легкой 11/29,38% 1/29,3% 0,0024 8/29,22% 0/29,0% 0.012 0/10,0%

Рак галгаин железы 11/58,19% 0/58,0% 0,002 12/58,21% 0/58,0% 0,00997 0/10,0%

Ил фнлыр зтнпю-пр отокошх 5/44,11% 0/44,0% Р>0,05 8/44,18% 0/44,0% 0,015 0/10,0%

Инфияиратшко-дольковый 61И 43% 0/14,0% Ш 4,14,29% 0/14,0% Р > 0,05 0/10,0%

*р - достоверность различия частоты метилирования исследованных генов в ДНК опухоли и условно нормальной ткани того же пациепта; рассчитана по Фишеру.

Данные о метилировании промоторных районов генов RASSF1A и MGMT противоречивы и изменяются в широких пределах: от 36 до 65% для гена RASSF1A и от 30 до 64% для гена MGMT при НМРЛ, а также от 19 до 87% для гена RASSF1A и от 0-8 до 25% для гена MGMT при РМЖ (Esteller et al, 2001; Землякова и др., 2003; Sharma et al., 2010; Ekim et al, 2011; Jiang et al, 2012; Tserga et al, 2012). При этом определенные нами частоты метилирования гена RASSF1A при РМЖ и НМРЛ весьма близки или совпадают с литературными данными (Pfeifer et al, 2002). Также с данными литературы согласуются данные о частоте метилирования промоторного района гена MGMT в НМРЛ (Zochbauer-Muller et al, 2002). Однако нами впервые отмечено значительное повышение частоты метилирования гена MGMT при РМЖ до 31%.

Частота метилирования генов RASSF1A и MGMT у больных с аденокарциномой, составила 20% и 35% соответственно, что в 2 раза ниже и выше значений приведенных в литературе для этих генов (40,5 и 17%, соответственно) при НМРЛ {Choi et al, 2005; Kim et al., 2005). Для больных с плоскоклеточным раком лёгкого частота метилирования генов RASSF1A и MGMT составила 38% и 28%

18

соответственно, что в 2 - 2,8 раз выше частоты метилирования этих генов приведенной в литературе (Howes et al., 2010). Частота метилирования гена RASSF1A при идРМЖ составила 43%, что согласуется с данными, полученными ранее (Логинов и др., 2004). Данные по частоте метилирования гена MGMTв идРМЖ получены нами впервые. Для больных с инфильтративно-протовым РМЖ значения частоты метилирования для этих генов составили 11% и 18%, соответственно, что в 8 раз ниже для гена RASSF1A и в 2 раза выше для гена MGMT по сравнению с данными мировых исследований (85% и 9%, соответственно) (Muggeritd et al., 2010).

Наблюдаемые различия в частотах метилирования генов RASSF1A и MGMT могут быть связаны как с чувствительностью использованного метода, так и с этнографческими особенностями западноевропейской, американской и российской (московской) популяций.

Нами также были исследованы возможные корреляции между частотами метилирования генов RASSF1A и MGMT и размером опухоли, клинической стадией, степенью дифференцировки и метастазированием при HMPJI и РМЖ. Статистически значимая корреляция частоты метилирования гена MGMT с размером опухоли выявлена при НМРЛ и РМЖ (р < 0,05, по Фишеру) (рис. 8А, Б), для гена RASSF1A -при РМЖ (р = 0,035, рис. 8Б). Данная зависимость сохраняется и при сравнении гистологических подтипов НМРЛ (аденокарциномы и плоскоклеточного рака легкого, рис. 8В) и РМЖ (ипРМЖ, рис.8Г). С переходом от ранних (I + II) к более поздним (III + IV) клиническим стадиям статистически значимо увеличивается частота метилирования гена MGMT при НМРЛ (7% против 65%, р < 0,05, рис. 8А) и РМЖ (8% против 100%, р < 0,05, рис. 8Б), а гена RASSF1A только при РМЖ (14% против 50%, р< 0,05, рис. 8Б).

Частота метилирования гена MGMT также статистически значимо (р < 0,05) увеличивается на более поздних стадиях онкологического процесса при АК, ПРЛ и ипРМЖ (рис. 8В, Г), а гена RASSF1A при ипРМЖ (рис. ЮГ)- Для гена MGMT показана также значимая корреляция частоты метилирования с потерей дифференцировки при РМЖ (6%, в высоко и средне дифференцированных опухолях против 43%, в низко дифференцированных опухолях, (р = 0,0008, рис. 8Б), ПРЛ {р = 0,038, рис. 8В) и ипРМЖ (р = 0,019, рис. 8Г). Для гена RASSF1A такая связь отмечена только при РМЖ и ипРМЖ (рис. 8Б, Г)-

мант

Рисунок 8. Корреляция частоты метилирования генов МОМТ и 1Ы5ЯПА с параметрами прогрессии НМРЛ и РМЖ: А. Корреляция частоты метилирования гена МОМТ со стадией, размером опухоли и наличием/отсутствием метастазов для НМРЛ. Б. Корреляция частоты метилирования генов МОМТ и КЛ88Р1А со стадией, степенью анапяазии и размером опухоли для РМЖ. В. Корреляция частоты метилирования гена МОМТ со стадией, размером опухоли и наличием/отсутствием метастазов для АК и ПРЛ. Г. Корреляция частоты метилирования генов МОМТ и ЯА38Р1А со стадией, степенью анаплазии, размером опухоли и тройным негативным фенотипом для ипРМЖ. Достоверность рассчитана с помощью теста Фишера.

Для НМРЛ и аденокарциномы легкого было показано, что частота метилирования гена МОМТ в образцах ДНК выделенной у пациентов с метастазированием в лимфотические узлы и другие органы значимо выше таковой (р < 0.05, по Фишеру) у пациентов без метастазов.

При раке молочной железы нами было исследовано изменение частоты метилирования генов ЯЛ88Р1А и МОМТ в зависимости от иммуно-гистохимического

20

статуса опухоли. Было показано, что при тройном негативном РМЖ, характеризующимся агрессивным течением и отсутствием в большинстве случаев привычных для этого заболевания терапевтических мишеней — рецепторов эстрогенов (ER), прогестерона (PgR) и HER2/neu (Тюляндин и др, 2010), происходит увеличение частоты метилирования обоих генов (33% и 40%, соответственно). Однако статистически маргинально значимое различие показано только для инфильтративно-протокового РМЖ (0.1< р < 0.05, по Фишеру, рис. ЮГ). Полученные нами данные согласуются с данными других исследований (Feng et al, 2007; Xu et al., 2012).

Значительный интерес представляет также данные полученные при изучении сочетанного влияния метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT и предрасполагающих генотипов полиморфных маркеров генов ТР53, GSTT1 и GSTMI.

Нами не выявлено ни одной ассоциации сочетапных генотипов исследованных генов с риском развития HMPJI, что может говорить о независимом влиянии метилирования промоторных районов генов (RASSF1A и MGMT) и полиморфных маркеров генов трансформации ксенобиотиков и апатоза (GSTTI, GSTMI и ТР53) на риск развития немелкоклеточного рака легкого.

При анализе различных сочетаний генотипов исследованных маркеров у пациентов с РМЖ было показано, что частота сочетанного генотипа Pro/Pro (TP53) + M (MGMT) в группе больных с РМЖ составила 60% (р = 0,03), статистически значимо превышая этот показатель в контрольной группе (23,3%) (у_2 = 6,82, OR = 4,95, СЛ,3%=1,42 — 17,31). Также, было показано что частота сочетанного генотипа M(RASSF1A и MGMT) + (Arg/Pro и Pro/Pro)(TP53) + D/D(GSTT1 и GSTMI) в группе больных с РМЖ в 4,8 раза выше таковой в контрольной группе (у! = 6,5), относительный риск составил 6,67 (С195%=1,36 - 32,70, р = 0,04). Все это говорит о значительном вкладе метилирования в развитие рака молочной железы.

Таким образом, нами впервые установлена достоверная корреляция частоты метилирования промоторного района гена MGMT с клинико-гистологическими параметрами РМЖ. Впервые исследована связь метилирования генов RASSFIA и MGMT и гормонального статуса рецепторов при РМЖ у пациентов московского региона. Также впервые получены данные о совмесном влиянии метилирования промоторных районов генов RASSFIA и MGMT и предрасполагающих генотипов полиморфных маркеров генов ТР53, GSTT1 и GSTM1 на риск развития РМЖ.

Все это позволяет рассматривать данные гены как молекулярные маркеры неблагоприятного прогноза в особенности для больных с РМЖ. (Karray-Chouayekh et al, 2010-, Wang et al., 2011; Xu et al, 2012).

выводы

1. Обнаружена высокодостоверная ассоциация полиморфных маркеров генов систем биотрансформации (СЛТМ1, 057Т/, СБТРУ) и пролиферации клеточного цикла и апоптоза (ТР53 и МОМ2) с развитием немелкоклеточного рака лёгкого и рака молочной железы и их гистологических подтипов.

2. Составлен профиль метилирования Срв-островков промоторных районов генов МСШ и ЯАЗЯПА. Впервые показано значимое повышение частоты метилирования гена МО А/Г при раке молочной железы.

3. Показана ассоциация полиморфных маркеров изученных генов (<Э8ТМ1, ОЬ1Т1, С8ТР1, ТР53 и МВМ2) и метилирования промоторных районов генов МОМТ и НАББРЫ с клинико-гистологическими и патофизиологическими параметрами опухолей.

4. Впервые выявлена статистически значимая ассоциация частоты метилирования гена МОМТ с прогрессией рака молочной железы, в том числе и у пациентов с трижды негативным раком молочной железы.

5. Обнаружены высокодостоверные ассоциации сочетанных генотипов исследованных в работе генов с риском развития немелкоклеточного рака лёгкого и рака молочной железы. Выявлены как общие, так и специфичные предраспологающие сочеташгые генотипы для немелкоклеточного рака лёгкого и рака молочной железы.

6. Показано независимое влияние на риск развития немелкоклеточного рака лёгкого генетических и эпигенетических факторов онкологического процесса.

7. Впервые показана связь полиморфных маркеров ферментов второй фазы биотрансформации ксенобиотиков и апоптоза с метилированием генов супрессоров опухолей с риском развития рака молочной железы.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. A.M. Бурденный, Т.П. Казубская, Э.А. Брага, В.В. Носиков, В.И. Логинов. Ассоциация генов ТР53 и MDM2 с риском развития рака молочной железы у русских женщин Московского региона. // Медицинская генетика №2, 28-31 (2013)

2. Бурденный A.M., Казубская Т.П., Брага Э.А., Носиков В.В., Логинов В.И. Ассоциация полиморфных маркеров гепов биотрансформации ксенобиотиков с раком молочной железы у женщин Московского региона. // Молекулярная медицина №5, 30-34 (2012)

3. Аткарская М.В., Логинов В.И., Заварыкина Т.М., A.M. Бурденный, С.В. Рыков, Т.П. Казубская, Г.П. Жижина, Э.А. Брага. Ассоциация полиморфных маркеров генов биотрансформации ксенобиотиков с риском развития немелкоклеточного рака легкого у русских московского региона. // Молекулярная медицина №3, 34-37, (2012)

4. Т. Zavarykina, V. Loginov, М. Atkarskaya, A. Burdennyy, Т. Kazubskaya, Е. Braga, G. Zhizhina. Genetic polymorphic markers of xenobiotic transformation and proliferation control genes associated with risk of lung cancer and cancer of upper respiratory tract. // Modern Problems in Biochemical Physics: New Horizons. Nova Science Publishers, Inc., NY., chapter XIX, 155-162. (2012)

5. Бурденный A.M., Аткарская M.B., Логинов В.И., Заварыкина T.M., Казубская С.В., Жижина Г.П. Ассоциация полиморфных маркеров генов биотрансформации ксенобиотиков с риском развития немелкоклеточного рака легкого у русских московского региона. Тезисы докладов научной конференции «Постгсномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Казань, Россия, 31-32 (2012)

6. Бурденный A.M., Логинов В.И., Брага Э.А Ассоциация полиморфных маркеров генов биотрансформации ксенобиотиков с риском развития опухоли разной локализации у жителей московского региона. VII региональная конференция молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» Сибирский Онкологический журнал, 312-313 (2012)

7. М.В. Аткарская, В.И. Логинов, Т.М. Заварыкина, A.M. Бурдснпый, Т.П. Казубская, Г.П. Жижина, Э.А. Брага. Ассоциация полиморфных маркеров генов ТР53 и MDM2 с развитием рака легких и верхних дыхательных путей. Тезисы докладов научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики», Москва, Россия, октябрь, 2011. Медицинская генетика Т. 10, № 10,. С. 3-4. (2011)

8. В.И. Логинов, М.В. Аткарская, Т.М. Заварыкина, A.M. Бурдеипый, Т.П. Казубская, Э.А. Брага, Г.П. Жижина. Изучение вклада генов детоксикации в развитии рака легкого. Тезисы докладов научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики», Москва, Россия, октябрь, 2011. Медицинская генетика Т. 10, № 10,. С. 14. (2011)

9. Т.М. Заварыкина, В.И. Логипов, М.В. Аткарская, A.M. Бурденный, Т.П. Казубская, Э.А. Брага, Г.П. Жижина. Анализ связи полиморфных маркеров генов биотрансформации ксенобиотиков с риском развития рака легких и верхних дыхательных путей. Материалы XV Российского онкологического конгресса, Москва, Россия, ноябрь. С. 149-150. (2011)

10.Atkarskaya M.l, Loginov V., Zavarykina Т., Burdennyy A., Kazubskaya Т., Zhizhina G., Braga E. Genetic polymorphic markers of proliferation control genes associated with risk of lung cancer and cancer of upper respiratory tract. Abstracts of the 4th International Conference for Young Scientists 2011 "Molecular biology: advances and prospectives" Kyiv, Ukraine, September, p. 138. P-MG2.46 (2011)

11.Zavarykina Т., Loginov V., Atkarskaya M., Burdennyy A., Kazubskaya Т., Braga E., Zhizhina G. Genetic polymorphic markers of genes of xenobiotic biotransformation enzymes associated with risk of lung cancer and cancer of upper respiratory tract. Abstracts of the 4th International Conference for Young Scientists 2011 "Molecular biology: advances and prospectives" Kyiv, Ukraine, September, p. 145. P-MG2.53 (2011)

Подписано в печать:

04.09.2013

Заказ № 8707 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www .autoreferat. ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бурденный, Алексей Михайлович, Москва

На правах рукописи

БУРДЕННЫЙ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

04201361923

РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В РАЗВИТИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЁГКОГО.

03.01.03 - Молекулярная биология

Научный руководитель

к.б.н. Логинов В.И.

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2013

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота РНК - рибонуклеиновая кислота м-РНК - матричная (информационная) РНК т-РНК - транспортная РНК р-РНК - рибосомальная РНК dATP - 2'-дезоксиаденозинтрифосфат dCTP - 2'-дезоксицитидинтрифосфат dGTP - 2'-дезоксигуанидинтрифосфат dTTP — 2'-дезокситимидинтрифосфат dNTP - 2'-дезоксинуклеотидтрифосфат Трис - Трис(гидроксиметил)аминометан ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота DTT - дитиотреитол

TEMED - N,N,N',N'- тетраметилэтилендиамин ед. - единица активности ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - количественная ПЦР в режиме реального времени

МС-ПЦР - метил-специфичная ПЦР

TSG - ген-супрессор опухолевого роста

HMPJI - немелкоклеточный рак легкого

АК - аденокарцинома лёгкого

ПРЛ - плоскоклеточный рак лёгкого

РМЖ - рак молочной железы

ипРМЖ - инфильтративно-протоковый рак молочной железы

идРМЖ - инфильтративно-дольковый рак молочной железы

Зр - короткое плечо хромосомы 3 человека.

РАН - Российская Академия Наук

РАМН - Российская Академия Медицинских Наук

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений..................................................................................................................................................2

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................................................................................6

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................................9

1.1. Общие закономерности канцерогенеза....................................................................................9

1.1.1. Онкогены и гены-супрессоры опухолевого роста......................................................12

1.2. Современные подходы к поиску новых «онкозначимых» генов......................17

1.2.1. Основные подходы к анализу генетического полиморфизма генов в

18

эпителиальных опухолях.................................................................

1.2.2. Подходы к анализу метилирования промоторных районов генов в ^ эпителиальных опухолях..................................................................

1.2.3 Комплексные подходы.............................................................. 26

1.3. Роль генных полиморфизмов в формировании онкологического риска... 28

1.3.1. Полиморфные маркеры генов глутатион-8-трансфераз в патогенезе онкологических заболеваний...........................................................

1.3.2. Ген ТР53 и его регулятор МБМ2 - связь с формированием и ^ развитием рака..............................................................................

1.4. Роль метилирования ДНК в канцерогенезе...................................... 35

1.5. Гены многоуровневой системы «клеточной защиты» организма, вовлечённые в патогенез немелкоклеточного рака легкого и рака молочной 40 железы.........................................................................................

1.5.1. Гены биотрансформации ксенобиотиков - С5ТМ/, С5ТТ1 и ^ в8ТР1.........................................................................................

1.5.2. Гены системы репарации, пролиферации, клеточного цикла и апоптоза.......................................................................................

1.5.2.1. Ген ТР53 и функционально связанный с ним ген М£>М2............... 45

1.5.2.2. Ген МБЗПА............................................................................... 48

1.5.2.3. ГенМСЖГ.................................................................................................. 50

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..................................................................................................................54

2.1. Реактивы, ферменты и буферные растворы..........................................................................54

2.2. Материалы исследования..........................................................................................................................54

2.3. Выделение геномной ДНК из крови и ткани........................................................................55

2.4. ПЦР-ПДРФ........................................................................................................................................................56

2.5. Бисульфитная конверсия ДНК..........................................................................................................59

2.6. Метил-специфичная полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР)..............................61

2.7. Статистическая обработка результатов....................................................................................61

2.7.1. Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов. Точный ^ критерий Фишера. Поправка Бонферрони............................................

2.7.2. Оценка относительного риска. Odds ratio. Доверительный интервал... 62

2.7.3. Критерий согласия Пирсона х2.......................................................... 63

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................. 64

3.1. Ассоциация полиморфных маркеров генов биотрансформации с риском развития немелкоклеточного рака лёгкого и рака молочной железы. 64 Связь с клинико-гистологическими параметрами опухоли..............................

3.2. Ассоциация полиморфных маркеров генов пролиферации клеточного цикла и апоптоза с риском развития немелкоклеточного рака лёгкого и ^ рака молочной железы. Связь с клинико-гистологическими параметрами опухоли........................................................................................

3.3. Изменение профиля метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT при немелкоклеточном раке лёгкого и раке молочной 73 железы; связь с прогрессией рака.......................................................

3.4. Сравнительный анализ исследованных генов и их комбинаций у

82

больных с немелкоклеточным раком легкого и раком молочной железы......

3.5 Заключение и дальнейшие перспективы........................................... 91

ВЫВОДЫ........................................................................................... 94

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................. 95

ВВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия частота онкологических заболеваний неуклонно растет. Ежегодно более 10 млн. человек во всем мире заболевают раком и 6 млн. человек умирают от рака ежегодно, что составляет 12% от умерших во всем мире.

Факт, что злокачественное новообразование возникает в результате генетических и эпигенетических повреждений в одной клетке уже не вызывает сомнений, а количество генов прямо или косвенно вовлеченных в канцерогенез неуклонно возрастает. Единичного повреждения, как правило, недостаточно для превращения клетки в опухолевую. Лишь накопление 5-10 таких повреждений в течение продолжительного времени, часто многих лет, приводит к злокачественному новообразованию. Генетические и эпигенетические нарушения способствуют либо активации протоонкогенов, стимулирующих пролиферацию клеток, либо подавлению генов - супрессоров опухолевого роста, тормозящих пролиферацию. Неправильная работа генов, контролирующих рост и деление клеток, вызывает неконтролируемую клеточную пролиферацию.

Только около 5-10% случаев рака являются наследственными, а остальные случаи рака являются результатом генетических и эпигенетических повреждений, возникающих в течение жизни в соматических клетках. Но даже при наследственной передаче предрасположенности к раку злокачественное новообразование возникает только в результате дополнительных соматических повреждений. Повреждения могут происходить либо вследствие воздействия внешних факторов (курение, химические вещества, радиация, инфекционные агенты, солнечное излучение, алкоголь), либо внутренних (гормоны, иммунная система, наследуемые мутации).

Ещё 100 лет назад рак легкого (PJI) считался уникально редким заболеванием, в частности, к 1898 г. в медицинской литературе было описано всего 140 случаев PJ1. Широкое распространение курения в начале XX века привело к тому, что PJI быстро занял позицию самого частого онкологического заболевания: ежегодно новообразования лёгкого диагностируются примерно у 1,2 миллиона человек, причём более 1 миллиона жителей планеты погибают от PJI. В структуре онкологической заболеваемости на PJI приходится 12,8%. Показатели 5-летней выживаемости при PJI выглядят весьма удручающе: даже в странах с самым высоким стандартом здравоохранения они составляют всего 15%, а при среднем уровне развития медицины эта цифра едва достигает 5-7% {Jemal et al., 2010). В разных географических регионах среди мужчин ежегодно регистрируется от 5,3 до 99,7 новых случаев PJI на 100000 человек в год, заболеваемость женщин в 6-10 раз ниже. В России ежегодно от PJ1 погибает свыше 60000 человек, что составляет более 20% всех умерших от злокачественных опухолей (Имянитов, 2006). Приблизительно 80% всех опухолей легкого приходится на немелкоклеточный рак (HMPJI), оставшиеся 20% представлены мелкоклеточным раком легкого.

В этиологии рака легкого определённую роль играют химические соединения, связанные с индустриальными процессами и неблагоприятными экологическими условиями. Однако, несмотря на большой перечень канцерогенных воздействий, влияющих на превращение нормальных клеток эпителия легкого в злокачественные, их вклад в развитие опухолей легкого не превышает 10-20%. Подавляющее большинство случаев PJI (80-90%) обусловлено курением. Популяризация «низкосмолистых» (lowtar) сигарет, «как менее канцерогенных», привела к возрастанию доли аденокарцином, среди опухолей легкого. Подобные изменения в эпидемиологии PJI связаны с тем, что в сигаретах с высоким содержанием смолы основная доля канцерогенов представлена полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ), тогда как в «низкосмолистых» преобладают нитрозамины (Имянитов, 2006).

Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующие позиции среди злокачественных опухолей у женщин, каждая 10-я - имеет риск заболеть в течение жизни, смертность доходит до 40%. Последние годы наблюдается тенденция омоложения РМЖ. Так средний возраст женщин с диагнозом РМЖ составляет 53 года, тогда как 10 лет назад он составлял 65 лет (Мусаева и др., 2005; Asadzadeh et al., 2011). В отличие от рака легкого, ни один из канцерогенов окружающей среды не удалось убедительно связать с причиной возникновения рака молочной железы. Поэтому на первый план выходят факторы, участвующие в поддержании геномной стабильности. Во-первых, гены, задействованные в распознавании и/или репарации повреждений ДНК (Imyanitov et al., 2004). Во-вторых, гены ответственные за регуляцию клеточного цикла и алоптоза.

Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют не только генетические факторы, в том числе и различные индивидуальные вариации ферментных систем (Ревазова и др., 2006), но и эпигенетические факторы — метилирование промоторных районов генов и ацетилирование гистонов {Логинов и др., 2004; Ходырев и др., 2011).

Гиперметилирование CpG-островков в промоторном районе найдено для ряда генов-супрессоров, таких как GSTP1, MGMT RASSF1A и др. (Ходырев и др., 2011). Метилирование регуляторных участков нарушает их взаимодействие с факторами транскрипции, блокируя эти участки с помощью белков, специфично связывающихся с метилированными CpG-парами (Methyl-CpG binding proteins), и более того, вносит изменения в окружающий хроматин, переводя его в стабильно репрессированное состояние {Springfield et al., 2012). Изменение статуса метилирования промоторных районов некоторых генов является характерной чертой опухолевых клеток, причем аномальное метилирование наблюдается уже на ранних этапах канцерогенеза. Изменения в уровне метилирования промоторных районов ряда генов показаны для рака молочной железы, простаты, легкого и рака других локализаций {Shenker et al., 2012; Lu et al., 2012).

Таким образом, генетические и эпигенетические факторы предрасположенности к развитию онкологических заболеваний связаны с несколькими уровнями системы клеточной защиты организма. Первый уровень - связан с генами биотрансформации, которые обеспечивают метаболизм чужеродных соединений. В этот процесс главным образом вовлечены гены глутатион 8 трансфераз Т1, М1, Р1 (ОБТП, С8ТМ1, ОБТР!) (Мартов и др., 2010; Корчагина и др., 2011). Следующий уровень клеточной защиты связан с механизмом репарации молекул ДНК при повреждении её структуры. На этом уровне важным геном является регулятор опухолевой супрессии ДНК метилтрансфераза 06-метилгуанина (МСМГ) (Степанов и др., 2010; Пономарева и др., 2011). Третий уровень - связан с генами контроля пролиферации, дифференцировки и роста клеток. Таковыми являются ген-супрессор КАББРЫ и транскрипционный фактор ТР53 со своим регуляторным геном МИМ2 {Желтухин и Чумаков, 2010).

В данном исследовании сделана попытка объединить две позиции в изучении проблемы повреждения генома человека - нарушение статуса метилирования генов ЯАББРЫ и МСМГ и генетический полиморфизм систем клеточного контроля и детоксикации ксенобиотиков, применительно к генам, кодирующим ключевые ферменты этих систем - СБТТ!, СБТМ!, С5ТР1, ТР53 и МБМ2. При этом чтобы подчеркнуть универсальность участия данных ферментов в онкологических процессах были выбраны две принципиально различные по механизмам развития онкопатологии -немелкоклеточный рак легкого и рак молочной железы.

Противоречивость данных литературы о вкладе полиморфных маркеров генов контроля клеточного цикла и ферментов системы биотрансформации ксенобиотиков в развитие НМРЛ и РМЖ, отсутствие информации о влиянии комбинаций их генотипов, а также связи полиморфных маркеров с метилированием ключевых генов с развитием этих форм рака делает целесообразным, на наш взгляд, проведение исследования по оценке вклада сочетаний этих генов в предрасположенность к НМРЛ и РМЖ. Не менее актуальным представляется установление взаимосвязи повреждения исследуемых генов с клинико-морфологическими особенностями онкозаболеваний, а так же проведение сравнительного анализа полиморфных маркеров генов ТР53, МйМ2, глутатион-8-трансфераз и их комбинаций при НМРЛ и РМЖ. Полученные данные послужат основой для определения дополнительных критериев прогноза клинического течения заболевания.

Целью данного исследования является изучение роли метилирования промоторных районов генов ЯАББРЫ и МСМТ, а так же полиморфных маркеров генов СБТР1, СБТП, ОБТМ!, ТР53 и МВМ2 в патогенезе немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие закономерности канцерогенеза.

Канцерогенез - это многоступенчатый процесс накопления изменений в геноме клеток, приводящий к появлению асоциальных клеток, характеризующихся морфологическим, функциональным, биохимическим атипизмом, автономным ростом, «ускользанием» клеток от гуморальных и нервных влияний (Hanahan and Weinberg, 2011). Накопление генетических повреждений в клетках сопровождается селекцией клона, способного к неконтролируемой пролиферации, и в дальнейшем к метастазированию. При этом в силу высокой генетической изменчивости и селекции в популяции клеток такого клона постоянно возникают и отбираются все более и более автономные и агрессивные субклоны, что описывается термином опухолевая прогрессия. В результате довольно длительной эволюции неопластического клона формируется опухоль.

В последнее десятилетие достигнут значительный прогресс, как в идентификации генов, нарушения функции которых ведут к развитию новообразований, так и в выяснении роли белковых продуктов таких генов в физиологии клетки. Все это позволило выделить ряд важнейших свойств, приобретение которых предопределяет способность клетки к образованию злокачественной опухоли (Рис. 1).

Во-первых, это - сниженная потребность во внешних сигналах для поддержания клеточной пролиферации, так называемая, самодостаточность в пролиферативных сигналах. Снижение зависимости от факторов роста достигается за счет изменений в системах внутриклеточной сигнализации, в результате возникает секреция необходимых факторов роста, либо резко увеличивается количество рецепторов для факторов роста, либо спонтанно запускается каскад событий, аналогичный тому, который в норме инициируется связыванием ростового фактора со своим рецептором {Cheng et al., 2008; Lemmon et al., 2010).

Во-вторых, отличительной особенностью опухолевых клеток являются приобретенные аномалии в морфологии и движении клеток. В основе морфологических изменений лежат взаимосвязанные между собой нарушения в цитоскелете и в адгезионных взаимодействиях клеток друг с другом и с внеклеточным матриксом. Они выражаются в нарушении формирования фокальных контактов и в ослаблении связи клеток с внеклеточным матриксом. Пониженная потребность неопластических клеток во внешних пролиферативных сигналах и нарушения адгезионных свойств выражаются в потере зависимости от субстрата (Hirohashi et al., 2003; Curto et al., 2007; Shaw, 2009).

Нечувствительность к рост-супрессирующим сигналам

Самодостаточность в пролиферативных сигналах

Генетическая нес табильность

Отсутствие р еплнк ативного старения

Ослабление индукции апоитоза

Стимуляция неоангиогенеза

Изменения Морфологии. Инвазия и мета с тарирование

Блокирование клеточной диффер енцир овки

Рисунок 1. Важнейшие свойства неопластической клетки, приобретаемые в ходе опухолевой прогрессии и обеспечивающие злокачественный рост (из Hanahan and Weinberg, 2011, с модификацией).

Третьей особенностью трансформированных клеток является их пониженная чувствительность к антипролиферативным сигналам. Опухолевые клетки значительно менее чувствительны к действию ф