Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль ABCC10-транспортера в формировании множественной лекарственной устойчивости рака молочной железы при лечении таксанами

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль ABCC10-транспортера в формировании множественной лекарственной устойчивости рака молочной железы при лечении таксанами"

На правах рукописи

ДОМАНИЦКЛЯ НАТАЛЬЯ ВАСИЛЬЕВНА

РОЛЬ АВССЮ-ТРАНСПОРТЕРА В ФОРМИРОВАНИИ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ТАКСАНАМИ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 г;!0Н

Новосибирск-2014

005550105

005550105

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Новосибирск, Россия.

кандидат биологических наук Григорьева Эльвира Витальевна

Белявская Валентина Александровна

доктор биологических наук, профессор, Государственный научный центр молекулярной биологии и биотехнологии «Вектор», заведующая сектором

Попова Нэлли Александровна

кандидат биологических наук, доцент, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, старший научный сотрудник

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится «25» июня 2014 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д.001.034.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (630117, г. Новосибирск, ул.Тимакова, 2; тел. 8 (383) 333-54-81)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт биохимии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: www.niibch.ru

Автореферат разослан « и » мая 2014 г.

научный руководитель:

Официальные оппопенты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Г.С. Русских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время химиотерапия является одной из ключевых форм лечения рака молочной железы. На сегодняшний день существует множество химиотерапевтических препаратов, из которых наиболее эффективными являются доцетаксел и паклитаксел, относящиеся к группе лекарственных препаратов таксанов. На сегодняшний день ответ метастатического рака молочной железы на химиотерапию первой линии лечения составляет около 30 % -70 %, безрецидивный период после лечения зачастую достигает лишь 7-10 месяцев. Большое количество смертей от данного заболевания обусловлено низкой эффективностью химиотерапии, связанной с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) опухолевых клеток. МЛУ, устойчивость клеток к ряду лекарственных препаратов, отличающихся по химической структуре и механизму действия, остается основной проблемой при лечении злокачественных новообразований.

МЛУ возникает в результате активации опухолевой клеткой её естественных защитных механизмов. На сегодняшний день доказана клиническая значимость различных механизмов множественной лекарственной устойчивости, одним из которых является механизм, основанный на транспорте лекарственных препаратов из клетки посредством трансмембранных белков ABC-транспортеров (ATP Binding Cassette (ABC) transporters, АТФ - зависимые транспортеры). Одними из наиболее изученных и охарактеризованных ABC транспортеров является Р-гликопротеин (Pgp) или АВСВ1, гиперэкспрессия которого ассоциирована с феноменом МЛУ (Riordan et al., 1985).

Ещё одним представителем данного семейства, малоизученным на сегодняшний день, но интересным для изучения развития МЛУ при лечении рака молочной железы, является транспортер АВСС10 (MRP7). АВСС10 экспрессируется в большинстве тканей человека, таких как поджелудочная железа, головной мозг, яичники, селезенка, печень, плацента, почки, сердечные и скелетные мышцы, семенники, кишечник, предстательная железа, молочные железы и др. (Dabrowska and Sirotnak, 2004; Hopper et al., 2001; Takayanagi et al., 2004). Данный транспортер обладает необычно широким спектром субстратной специфичности: гиперэкспрессия АВСС10 в опухолевых клетках in vitro обеспечивает устойчивость к таким препаратам, как таксаны, винка алкалоиды, нуклеотидные аналоги, а также эпотилон В (Hopper-Borge et al., 2004; Hopper-Borge et al., 2009; Oguri et al., 2008). Также в экпериментах на АЪсс10~'~ мышах in vivo было показано, что потеря экспрессии АЬссЮ приводит к повышенной чувствительности животных к

паклитакселу по сравнению с животными дикого типа (Hopper-Borge et al., 2011). Эти результаты позволяют предположить, что ннгибирование АВСС10 может иметь клиническое значение в лечении рака молочной железы, а также других видов онкологических заболеваний, для лечения которых используют такие химиотерапевтические препараты, как таксаны. Однако механизм участия АВСС10 транспортера в возникновение множественной лекарственной устойчивости при лечении рака молочной железы не ясен.

Целью данной работы является исследование роли транспортного белка АВСС10, в формировании множественной лекарственной устойчивости при лечении злокачественных новообразований молочной железы.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать экспрессию АВСС10 в опухолях молочной железы человека по сравнению с нормальной тканью молочной железы. Изучить взаимосвязь молекулярных характеристик рака молочной железы и уровня экспрессии АВСС10 в опухолевых тканях.

2. Получить и охарактеризовать доклиническую мышиную модель рака молочной железы человека MMTV-PyVmT нокаутную по AbcclO.

3. Получить первичные культуры из опухолей молочной железы, развившихся у MMTV-PyVmT hcclO и MMTV-PyVmT;.) бес мышей. Изучить влияние экспрессии AbcclO на морфофизиологические характеристики опухолевых клеток in vitro.

4. Изучить влияние AbcclO на цитотоксические характеристики таксанов в отношении первичных культур опухолевых клеток молочной железы MMTV-PyVmT in vitro и in vivo.

5. Изучить влияние AbcclO на развитие множественной лекарственной устойчивости при лечении PyVmT доклинической модели рака молочной железы человека доцетакселом.

Научная новизна работы.

В данной работе впервые было показано, что:

• экспрессия АВСС10 повышена в опухолевых тканях молочной железы человека по сравнению с экспрессией в нормальных тканях молочной железы, при этом показана взаимозависимость экспрессии АВСС10 и молекулярных характеристик РМЖ;

• экспрессия AbcclO в первичных культурах опухолевых клеток молочной железы MMTV-PyVmT оказывает влияние на морфофизиологические характеристики клеток независимо от функции транспорта химиотерапевтических препаратов: уменьшает пролиферативную и адгезионную активности, усиливая при этом миграционную активность клеток;

• MMTV-PyVmT;/! bed 0~А мыши характеризуются повышением скорости роста опухолей, повышенной степенью дифференцировки злокачественных опухолей и сниженной способностью к метастазированию в лёгкие;

• потеря экспрессии AbcclO не приводит к увеличению экспрессии других транспортеров, более того приводит к понижению экспрессии Abcg2;

• потеря экспрессии AbcclO повышает чувствительность опухолевых клеток молочной железы к таксанам in vitro и in vivo;

• потеря экспрессии AbcclO оказывает положительное влияние на терапевтический эффект доцетаксела в доклинической модели РМЖ MMTV-PyVmT in vivo, повышая чувствительность опухолей молочной железы к доцетакселу, и выживаемость экспериментальных животных ММТ V-Py VmT;/f bed О' '.

Научно-праетическая значимость

Полученные данные не только вносят свой вклад в понимание молекулярных механизмов МЛУ при лечении рака молочной железы, но также демонстрируют АВССЮ-транспортер как потенциальный биомаркер эффективности ответа на химиотерапию. Гетерогенность экспрессии АВСС10 для опухолей трижды негативного рака молочной железы позволяет предположить, что АВСС10 может являться кандидатом для клинического скрининга трижды негативного рака молочной железы и определение уровня экспрессии АВСС10 может стать новым шагом на пути к более персонализированной химиотерапии. Данный результат имеет принципиальное значение также потому, что трижды негативный тип рака молочной железы является наиболее агрессивным и слабо поддаётся лечению, поскольку для данных опухолей на сегодняшний день не существует таргетной терапии. Также, данная работа определяет АВСС10 транспортер как новую возможную цель для создания новых лекарственных

препаратов, направленных на подавление МЛУ и повышение эффективности антиопухолевой химиотерапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Экспрессия АВСС10 повышена в опухолевых тканях молочной железы человека по сравнению с экспрессией в нормальных тканях молочной железы. Экспрессия АВСС10 взаимосвязана с HER2 статусом опухоли и зависит от типа РМЖ.

2. Экспрессия AbcclO связана с агрессивностью злокачественных опухолей молочной железы, развившихся у MMTV-PyVmT мышей: повышенная степень дифференцировки и сниженная способность к метастазированию злокачественных опухолей молочной железы нокаутных по AbcclO.

3. Экспрессия AbcclO оказывает влияние на морфофизиологические характеристики первичных культур клеток, полученных из злокачественных опухолей, развившихся у MMTV-PyVmT мышей: уменьшение пролиферативной и адгезионной активности, увеличение миграционной активности клеток.

4. Потеря экспрессии AbcclO не компенсируется посредством увеличения экспрессии других транспореров.

5. Опухолевые клетки молочной железы, полученные из злокачественных опухолей MMTV-PyVmT мышей нокаутных по AbcclO, более чувствительны к химиотерапевтическим препаратам группы таксаны in vitro и in vivo по сравнению с клетками, полученными из опухолей MMTV-PyVmT мышей дикого типа.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на следующих конференциях: ежегодных научных конференциях студентов и аспирантов Научно-исследовательского центра рака «Фокс Чейз» (Филадельфия, США, 2010-2012); VII Международной ежегодной АВСС конференции в северной Америке (Национальный институт здоровья США, Фредерик, США, 2010); VIII Международной ежегодной АВСС конференции в северной Америке (Национальный институт здоровья США, Фредерик, США, 2011); Международной ежегодной конференции «AACR» (American Association for Cancer Research) (Орландо, США, 2011); IV Международной конференции «АВС-2012» (Инсбрук, Австрия, 2012); I Международной ежегодной биомедицинской научной конференции «Temple» (Филадельфия, США, 2012); 35-й Ежегодный симпозиум по раку молочной железы/35Л Annual San Antonio Breast Cancer Symposium (Сан Антонио, США, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из которых 3 публикации в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, включает 34 рисунков и 6 таблиц. Библиография включает 104 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Доклиническая мышиная модель рака молочной железы MMTV-PyVmT. Все

эксперименты с мышами были предварительно утверждены комитетом по уходу и использованию животных Fox Chase Cancer Center (Филадельфия, США). MMTV-PyVmT мыши 634Mul/J сублшпш были приобретены у фирмы The Jackson Laboratory (США). Гомозиготные АЬссШ/~ мыши (Hopper-Borge et al., 2011) были скрещены с MMTV-PyVmT мыши для создания AbcclO ; PyVmT-положительных самок для последующего анализа опухолей молочной железы. Мышей подвергали эвтаназии посредством ингаляции метоксифлураном, когда опухоли достигали 10% от массы тела.

Ортотопическая модель рака молочной железы. Первичные клеточные культуры, полученные из опухолей, развившихся у М \ IТ V - Ру V m Т ;/í бсс / ß17' и MMTV-PyVmT;/! beel 0 мышей, были имплантированы в области молочной железы 8-недельных самок мышей SCID. Когда опухоли достигали 50 мм3, мышей разделяли на две группы: инъекция спиртовым раствором в качестве контроля и лечение 25 мг/кг доцетаксела. Внутрибрюшинные инъекции спиртового раствора или донетаксела проводились еженедельно, пока опухоль не достигала максимального размера (200 мм3).

Получение первичных клеточных культур из опухолей, развившихся у MMTV-Vy\mJ^\hccl0,n н MMTV-PyVmT мышей. Опухоли обрабатывали 0,2%

коллагеназой в течение 2 часов при 37°С, промывали бессывороточной DMEM средой, средой с низким содержанием кальция с добавлением 5% лошадиной сыворотки и помещали в Т-25 фласки, покрытые 0,1% желатином, на ночь в инкубатор на 37°С. На следующий день супернатанты собирали и рассаживали в новые фласки. Свободные от фибробластов популяции клеток получали через 6-8 недель, в экспериментах использовали культуры, пересаженные менее 6 раз.

Определение клеточной пролиферации in vitro. Степень клеточной пролиферации определяли при помощи CyQUANT NF Cell Proliferation Assay (Invitrogen, США)

7

согласно инструкции производителя. Клетки рассаживали плотностью 100-500 клеток в 8-12 лунок 96-луночного микропланшета. Измерения проводили каждые 24 часа -удаляли среду, добавляли по 50мкл флуоресцентного красителя и инкубировали 30 минут при 37°С. Анализ проводили при помощи Fluorescence Microplate Reader (SPECTRA max, "Molecular Devices", Великобритания), на 530 нм.

Тест на формирование колоний. MMTV-Py VmT;/i be с!()'' и MMTV-PyVmT; AbcclO'1' клетки высеивали при низкой плотности на 6-луночный планшет и обрабатывали ЗнМ доцетаксела или 3 нМ паклитаксела в течение 5 диен. Колонии визуализировали окрашиванием кристаллическим фиолетовым.

Тест на "зарастание раны". М MX V - Р у V тТ>1 ft ее / ()*'' и ММТУ-РуУтТ;ЛЛсс/ Г//_ клетки высеивали на 6-луночный планшет так, чтобы через 24 часа клеточная культура достигла состояния 95% конфлюэнтного монослоя. В монослое наносили царапины (0.5 мм) и фотографировали одни и те же участки через каждые 2 часа в течение 24 часов. Степень зарастания царапины клетками вычисляли как отношение площади царапины через 8/24 часа к площади через 0 часов после повреждения. Для обсчёта площади использовали программу ImageJ.

Определение адгезионной активности клеток. М,VITV-PyVmT;/fbcc/и MMTV-PyVmT;AbccJклетки высеивали в планшеты E-plate (Roche) и помещали в прибор RTCA, который автоматически измеряет соответствующие изменения электрических свойств сенсоров, расположенных рядом с клетками.

Анализ клеточного цикла и апонтоза. MMTV-PyVmT^-íЛее/Г/*'' и MMTV-PyVmT^iec 1 (У'~ клетки были посеяны в 12-луночном планшете в количестве 2 х 105 клеток на лунку. На следующий день, к клеткам добавляли 0, 10, 25 нМ доцетаксела или паклитаксела. Через 48 часов клетки окрашивали реагентом Guava Cell Cycle или Guava Nexin согласно инструкции производителя (Millipore, США) для анализа клеточного цикла или апоптоза соответственно (для окрашивания реагентом Guava Cell Cycle клетки предварительно фиксировали 70% этанолом в течение 24 часов на 4СС). Анализ окрашенных клеток проводился при помощи проточного цитометра Guava.

Измерение накопления |3Н]-доцетаксела в клетках. МMTV-РуVmT;/fbcc 10''' и MMTV-PyVmT;/l¿>cc/0~A клетки были посеяны в количестве 2 х 105 клеток на лунку в 6-луночном планшете. На следующий день среду заменили на среду с добавлением [3Н]-доцетаксела в конечной концентрации 0.1 мкМ (5 Ки/ммоль, Movarek, США), клетки инкубировали в течение 15, 30, 60 и 90 минут при 37°С, обрабатывали трипсином-PBS,

осаждали при 500 g, ресуспенднровали в PBS. Радиоакгивность [3Н]-доцетаксела, проникшего в клетки, измеряли на "LS6500 Multi-purpose Scintillation Counter" (Beckman Coulter, США). Результаты представляли как удельную радиоактивность на 105 клеток.

Количественная ПЦР в реальном времени. ПЦР проводили с использованием TaqMan Assay (AppliedBiosystems, США) на приборе BioRad IQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection System (BioRad, США). Реакционная смесь содержала -100 нг кДНК, 1х TaqMan Universal PCR Master Mix (AppliedBiosystems, США), по 100 нМ каждого праймера, 250 нМ пробы, условия реакции: 95 °С, 15 мин; 40 циклов (95 °С, 15 сек; 60 °С, 60 сек). В качестве независимого контроля использовали ген Ppib.

Вестерн-блот анализ. Разделение белков проводили по методу Лэммли в денатурирующих условиях с использованием системы Mini-Protean II Cell-system (BioRad, США). Перенос белка осуществляли на PVDF мембрану (Bio-Rad Laboratories, США). Мембрану блокировали в течение 30 мин с использованием буфера "SuperBlock Т20 PBS" (Invitrogen, США), инкубировали с первичными и вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 часа и визуализировали ECL реагентом.

Иммупнофлуореснентный анализ. ММТ V-Py VrnT;/) bec 10*'~ и MMTV-PyVmT\Abccl0 " клетки выращивали на покровных стеклах до момента конфлюэнтности, фиксировали в метаноле, блокировали и инкубировали с первичными антителами (а-tubulin) в течение 1 часа при комнатном температуре. В качестве вторичных антител использовали антитела, конъюгированные с Alexa-568. DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндол) (Molecular Probes/Invitrogen, США) использовали для окраски ядер. Анализ проводили на спектральном конфокальном микроскопе Nikon Cl (Nikon, США).

Иммуногистохимический анализ. После депарафшшзации, демаскировку антигенов проводили при помощи раствора Unmasking solution (Vector, США). Срезы инкубировали с моноклональными антителами против АВСС10 (Е. Hopper-Borge, Fox Chace Cancer Center, США), с антителами против Ki-67, CD31 и каспазы 3 (Abeam, США). Инкубировали с вторичными антителами, наносили на каждый срез субстрат (ДАБ), инкубировали 5-15 минут при комнатной температуре. Анализ проводили при помощи микроскопа Nikon Eclipse, 50i, с использованием Nikon DS- Fil камеры.

Статистическая обработка результатов. Результаты представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (М±т). Достоверность отличий оценивали с помощью парного /-критерия Стыодента. Статистическая значимость (двусторонний критерий) была установлена на уровне Р < .05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ экспрессии АВСС10 в нормальной н опухолевой тканях молочной железы человека

Для того, чтобы сравнить уровень экспрессии гена АВСС10 в нормальных и опухолевых тканях молочной железы человека, мы проанализировали 2 набора данных, опубликованных в современной базе данных по экспрессии генов Gene Expression Omnibus: GSE5764 - инвазивная карцинома молочной железы, GSE8977 - полученные из костного мозга мезенхимальные стволовые клетки, содействующие метастазированию. Для сравнения АВСС10 с другими транспортерами мы также проанализировали экспрессию хорошо изученных генов множественной лекарственной устойчивости АВСС1, АВСВ1 и ABCG2.

А »«« Б

i " | *

ftfifГЛ lSCX.lt: ЛЙС.&1 M>C<íJ Afife'.Ct Л&Х18 AS¡í>w

ЩШ Норма ,' ' Олуксдь

Рисунок 1. Уровень экспрессии генов АВСС1, АВСС10, АВСВ1 и АВСС2 в образцах рака молочной железы и нормальной ткани. А). Анализ набора данных ОЗЕ5764. Б). Анализ набора данных 05Е8977.

Данный анализ показал повышенный уровень экспрессии АВСС10 в образцах инвазивной карциномы молочной железы по сравнению с нормальной тканью (Р = .02) (Рисунок 1А). Также экспрессия АВСС10 в мезенхимальных стволовых клетках, полученных из костного мозга больных РМЖ, повышена, по сравнению с клетками нормального организма (Р = .01) (Рисунок 1Б). С учётом того, что анализ экспрессии АВСС1, АВСВ1 и АВСй2 не выявил достоверной разницы между опухолевой и нормальной тканью, нами была выдвинута гипотеза, что именно АВСС10 играет ключевую роль в формировании феномена МЛУ при раке молочной железы.

Для анализа экспрессии белка АВСС10 нами был создан микрочип образцов опухолевой ткани молочной железы человека, состоящий из 51 образца различных молекулярных подтипов рака молочной железы человека: 18 НЕ112+, 15 НЕК2-, и 18

трижды негативных (ЕК-Я^К-/НЕ112-). Иммуногистохимический анализ проводили с использованием анти-АВССЮ моноклональных антител; образцы, не экспрессирующие АВСС10, были объединены в первую группу, образцы с положительной экспрессии АВСС10 были объединены во вторую группу.

Проведённый анализ показал, что экспрессия АВСС10 положительно коррелирует с положительным статусом НЕИ2 рецептора (Р = .039). Кроме того, трижды негативный подтип рака молочной железы показал наиболее высокую степень гетерогенности экспрессии АВСС10 по сравнению с другими подтипами - 38,9% Е11-Л^К-/НЕК2-образцов не выявили экспрессии АВСС10 по сравнению с 6,7 % и 0% для НЕЯ2- и НЕЯ2+ подтипов рака молочной железы соответственно (Р = .002).

Влияние экспрессии АВСС10 на развитие рака молочной железы и терапевтический эффект доцетаксела

Характеристика опухолей молочной железы ММТV-РуVтТ\АЬсс10+/' и ММТУ-Ру УтТ ;ЛЪсс1О" мышей. Для изучения роли АЬссЮ в развитии и лечении рака молочной железы с использованием физиологической модели мы скрестили АЬссЮ нокаутных мышей (Норрег-Во^е е1 а1., 2011) с мышами, экспрессирующими ММТУ-РуУтТ трансген. Нами были получены ММТУ-РуУтТ;Л Ьсс10+/+ и ММТУ-РуУтТ\АЬссШ''~ мыши, самки которых, за счёт экспрессируемого трансгена, развивали мультифокальные опухоли молочной железы, дающие метастазы в лёгкие.

Влияние АВСС10 на скорость роста опухолей молочной железы РуУтТ мышей. В анализе скорости образования и роста опухолей нами было использовано 26 ММТУ-РуУтТ^ЬссЮ" мышей и 21 ММТУ-РуУтТ^46сс70+/+ мышей. Скорость роста АЬссЮ-положительных опухолей была ниже по сравнению со скоростью роста АЬссЮ'' опухолей. В возрасте 20 недель средний размер опухолей, образованных у ММТУ-РуУтТ^!6сс/0мышей, достигал 1000 мм3; в то время как средний размер ММТУ-РуУтТ^Ьсс10+/+ опухолей составлял 300 мм3 (Р = .020) (Рисунок 2).

1-1

- РуУтТ.ДЬссГО"* ■ РуУшТ;ЛйссЮ(-

120 140

Возраст, дни

Рисунок 2. Скорость роста опухолей, образованных у ММТУ-РуУтТ;ЛЬсс/0+/+ и ММТУ-РуУтТ;Л6сс/0А мышей.

Влияние АЬссЮ на агрессивность и метастазирование рака молочной железы. С

учетом представленного выше результата, было удивительно, что после эвтаназии гистопатологический анализ показал, что ММТУ-РуУтТ^46сс/0+/+ и ММТУ-РуУтТ^16сс/0+/" опухоли были менее дифференцированы, чем опухоли АЬссЮ нокаутных животных (Р = .03). Данный результат может говорить о повышенной агрессивности опухолей, экспрессирующих АЬссЮ: известно, что менее дифференцированные опухоли чаще всего являются более агрессивными, отличаются ранним метастазированием и наиболее плохим прогнозом (8оецота1агат е1 а!., 2008).

Анализ легких ММТУ-РуУтТ мышей, которые развивали первичные опухоли молочной железы, указал на более высокий уровень метастазирования ММТУ-РуУтТ\АЬсс10+/+ опухолей по сравнению с ММТУ-РуУтТ;Л6сс/0'~ опухолями (Рисунок 3).

С 10 С

т

Рисунок 3. Лёгочные метастазы рака молочной железы ММТУ-РуУтТ;^(Ьсс/0+' и ММТУ-РуУтТ;Л6сс/0~" мышей. А). Окраска срезов лёгких гематоксилин-эозином. Б). Количество метастазов на см2 у РуУшТ мышей дикого типа ^Т) и АЬссЮ нокаутных мышей (КО).

Характеристика первичных культур клеток, полученных из MMTV-PyVmT\АЬсс10+/* и МMTV-РуVml \Abccl(Г опухолей. Для изучения влияния экспрессии АВСС10 на развитие рака молочной железы и множественной лекарственной устойчивости мы получили первичные культуры клеток из раковых опухолей, образовавшихся у MMTV-PyVmT^6cc70+/+ и MMTV-PyVmT^6cc70"A мышей. Для дальнейшей работы с полученными клеточными линиями необходимо было проверить их морфофизиологические характеристики.

Как и в эксперименте in vivo, AbcclOклеточные линии отличались повышенной пролиферативной активностью в сравнении с клетками дикого типа. Известно, что активно делящиеся клетки являются наиболее чувствительными к большинству химиотерапевтических препаратов, таким образом ингибирование AbcclO не только сможет приводить к повышению чувствительности клеток к таксанам посредством снижения транспорта препарата из клетки, а также посредством регуляции пролиферативной активности, ответ на лечение может стать значительно выше.

Морфологический анализ MMTV-PyVmT^6cc/0+/+ и MMTV-PyVmT^46cc70v" клеток был проведён посредством обработки клеток фаллоидином, меченным флуорохромом. Анализ препаратов на конфокальном микроскопе показал различия в размере клеток дикого типа и AbcclO''' клеток - MMTV-PyVmT;^ЬссЮ'' клетки в 3 раза больше клеток дикого типа (Р < .0001).

Клеточная адгезия играет основную роль в регуляции клеточного движения и миграции, которые являются важными характеристиками, необходимыми для понимания метастатических процессов. На начальном этапе метастазирования индивидуальные клетки должны покинуть первичную опухоль, что достигается посредством изменений молекул адгезии, расположенных на поверхности клеток. С использованием системы xCELLigence, основанной на микроэлектронных биосенсорах, которые позволяют динамически в реальном времени наблюдать за адгезией клеток, была показана повышенная адгезионная активность MMTV-PyVmT;,4 бсс/0"'" клеток (Р= .0120).

Другой важнейшей характеристикой клеток, часто ассоциированной с более агрессивным фенотипом, является способность к миграции. Миграционная активность MMTV-PyVmT;^46cc/0+/+ и MMTV-PyVmT^éccyO"7" опухолевых клеток in vitro была проверена при помощи анализа «на зарастание раны» (Рисунок 4А). Анализ миграционной активности показал, что через 24 ч после начала эксперимента AbcclO" клетки мигрировали на 40% меньше по сравнению с клетками, обладающими

положительным АЬесЮ статусом (Рисунок 4Б). Повышенная степень миграционной активности клеток дикого типа по сравнению с АЬсс10''~ клетками, также объясняет более высокий уровень лёгочных метастазов у ММТУ-РуУтТ мышей дикого типа. А

Рисунок 4. Анализ миграционной активности MMTV-PyVmT^6cc70+/+ и MMTV-PyVmT-,AbcclO''' клеток in vitro при помощи теста «на зарастание раны». А). Представлены фотографии, показывающие зарастание сформированной «раны» через 8 и 24 часа после начала эксперимента. Б). Обсчёт площади зарастания «раны» при помощи программы ImageJ.

Влияние экспрессии АВСС10 на экспрессию ABC-транспортеров. Зачастую потеря экспрессии/ ингибирование одного из транспортеров приводит к активации другого, тем самым компенсируя работу первого, и поэтому эффект ингибирования может отсутствовать. В связи с данным фактом, необходимым этапом для продолжения нашего исследования была проверка экспрессии других АВС-транспортеров.

Методом количественной ПЦР в реальном времени нами была проверена экспрессия таких транспортеров, как Abccl, АЬссЗ, Abcc4, Abcc5, Abccla/b и Abcg2. Мы показали, что потеря AbcclO не компенсируется посредством увеличения экспрессии других ABC транспортеров. Более того, мы заметили тенденцию к снижению мРНК экспрессии некоторых транспортеров в AbcclO" клеточных линиях по сравнению с экспрессией в клетках дикого типа.

Белковая экспрессия транспортеров Abcbla/b и Abcg2 в Abccl0клеточных линиях и линиях дикого типа была проверена при помощи вестерн-блот анализа (Рисунок 5А). Мы выявили тенденцию к снижению экспрессии Abcbla/b в AbcclO нокаутных клеточных линиях (Рисунок 5Б). Также мы показали статистически достоверное снижение Abcg2 в

АЬссЮ клеточных линиях по сравнению с экспрессией в клеточных линиях дикого типа (Р= .0171) (Рисунок 5Б).

Рр/тТ-АЬссЮ*

PftmTAbccW

ftbcbla.'b Abcg2

1 " о

г

«>оМа/о

3 . PyWnTiAbcelO:"

Afacg2

I I PvVmT АиК»

Рисунок 5. А). Вестерн-блот анализ с анти-АЬсЫа/Ь и aHTH-Abcg2 антителами с использованием белковых фракций, выделенных из MMTV-PyVmT;^bcc/Ob/+ и MMTV-PyVmT ;АЬсс10~'~ клеточных линий. Б). Обсчёт экспрессии Abcbla/b и Abcg2 относительно экспрессии бета актина. MMTV-PyVmT;/16cc70+/+ клетки, заштрихованные столбцы; ММТУ-РуУтТ^Лсб-УО"'' клетки, белые столбцы.

Цитотоксическая характеристика М \1 Т V - Р у V m Т; /16 ее / W и MMTV-PyVinT^Abcclff'' клеточных линий in vitro. Одной из основных задач данного исследования было изучение влияния АЪссЮ на терапевтический эффект химиопрепарагов, используемых для лечения рака молочной железы. Первым шагом в этом было изучения данного эффекта с использованием in vitro модели. Для определения токсичности таких препаратов, как паклитаксел и доцетаксел по отношению к MMTV-?yVmT;AbcclO+/+ и WM'XV-VyV ml\Abcc 10''' раковым клеткам мы использовали тест на формирование колоний (Рисунок 6А). Инкубация с 3 нМ паклитаксела в течении 5 дней не оказывала влияния на способность клеток дикого типа формировать колонии, в то время как АЬсс10''~ клетки образовывали на 20 % меньше колоний по сравнению с контролем (Р - .0351). Доцетаксел оказался более эффективным препаратом для клеток обоих генотипов в сравнении с паклитакселом. В результате инкубации с ЗнМ доцетаксела в течение 5 дней клетки дикого типа образовывали на 45 % меньше колоний, по сравнению с контролем, AbccJO'' клетки продемонстрировали более высокую чувствительность, снизив образование колоний на 90 % по сравнению с необработанными клетками (Р < .0001) (Рисунок 6Б).

А

! ШЫ. ,т 1 6

Рисунок 6. Тест на формирование колоний. А). Колонии, образованные ММТУ-РуУтТ\AbcclO*'* и ММТУ-РуУтТ\АЬсс10~/' клетками при инкубации с паклитакселом/ доцетакселом. Б). Количественный обсчёт сформированных колоний с использованием программы 1п^е.Т. ММТУ-РуУтТ■ЛЬссЮ*'" клетки, заштрихованные столбцы; ММТУ-РуУтТ;Л6сс/0~А клетки, белые столбцы.

Так как механизмом действия доцетаксела является стабилизация микротрубочек, следующим шагом нашей работы была проверка прямого эффекта доцетаксела на микротрубочки посредством иммунофлуоресцентного окрашивания клеток, обработанного различной концентрацией препарата, с использованием антител <х-тубулину. Значительная стабилизация микротрубочек была детектирована для АЬсс10~'~ клеток, обработанных ЗнМ доцетаксела, в то время как для достижения сравнимого эффекта на клетки дикого типа необходимо было увеличить концентрацию доцетаксела до 25нМ.

Мы также отметили эффект доцетаксела на миграционную активность ММТУ-РуУтТ;Л6сс/0"л клеток. Через 8 часов, а также через 24 часа после начала эксперимента миграционная активность АЬсс10~'~ клеток, обработанных 3 нМ доцетаксела, была снижена на 50 % по сравнению с контролем. Эффект доцетаксела на миграцию АЬсс10~'~ клеток через 8 часов и через 24 часа был также значительно выше в сравнении с эффектом на клетки дикого типа (Р = .0374 и Р = .0068).

Влияние доцетаксела и паклитаксела на развитие аноптоза и арест клеточного цикла. Обработка клеток дикого типа паклитакселом в течение 48 часов не вызвала изменений распределения клеток по фазам клеточного цикла, в то время как обработка АЬсс10'/' клеток 25 нМ паклитаксела вызывала 02/М арест клеточного цикла (Р < .001) (Рисунок 7Б). 10 нМ и 25 нМ доцетаксела также не оказывали влияния на клеточное

распределение AbcclO+/+ клеток, по сравнению с АЬссЮ''' клетками, для которых был детектирован G2/M арест клеточного цикла в результате обработки 10 нМ и 25 нМ доцетаксела (Р — .0115 нР= .0491) (Рисунок 7А).

223 -«^«¡Miccw»* j_j

Рисунок 7. Анализ распределения MMTV-PyVmT;/i Ьсс10~¥/+ и MMTV-PyVmT\AbcclO''~ клеток по фазам клеточного цикла G0/G1, S и G2/M при 48 часовой обработке 0, 10, 25 нМ доцетаксела (А) и паклитаксела (Б).

Дальнейший анализ клеточной смерти в результате обработки химиопрепаратами выявил тенденцию к уменьшению количества живых и увеличению числа MMTV-PyVmT^ЬссЮ''' клеток в состоянии раннего апоптоза, в то время как 48 часовая инкубация с препаратами клеток дикого типа не дала видимого результата. 48 часовая обработка АЬссЮ''' клеток 25нМ паклитаксела давала статистически значимые уменьшение живых клеток (Р = .0150) и увеличение числа клеток, находящихся в состоянии раннего апоптоза (Р = .0119).

Накопление доцетаксела, как субстрата АВСС10, в MMTV-PyVmT;.4ftcc/fl+/+ и ММТV-РуVтТ-,АЬсс1(Г' клетках. Продемонстрированная разница, ассоциированная с АЬссЮ генотипом, может быть связана с повышением концентрации препарата в MMTV-PyVmT;,4icc70"/" клетках по сравнению с клетками дикого типа, что было подтверждено в эксперименте с использованием радиоактивно-меченого доцетаксела.

Клеточные линии, полученные из MMTV-PyVmT^fecc/^17' опухолей, накапливали до 60% меньше ¡/Н]-доцетакеела на 30 и 60 мин после начала инкубации с препаратом в сопоставлении с клеточными линиями, полученными из MMTV-PyVmT;/lécc70v" опухолей (Р= .0105 и Р= .0472) (Рисунок 8).

о i

Врет мим

Рисунок 8. Клеточное накопление [3Н]-доцетаксела в эпителиальных клетках, полученных из MMTV-PyVmT^46cc70+/+ (WT, чёрный треугольник) и MMTV-PyVmT-yAhcclO''' (КО, белый треугольник) опухолей.

Цитотоксическая характеристика М МТ V-Py VmT\AbccНУ'* и MMTV-PyVmT\Abcclff'- клеточных линии т vivo

Ортотопическая модель опухолей молочной железы была использована с целью изучения MMTV-PyVmT^46cc7 0+/+ и MMTV-PyVmT^écc/O"7" клеток, как более клинически значимая модель in vivo. Для изучения влияния экспрессии AbcclO на чувствительность полученных первичных клеточных культур к доцетакселу in vivo, мы имплантировали клетки (3 клеточные линии дикого типа и 3 AbcclOклеточные линии) в область молочной железы самок иммунодефицитньгх мышей SCID.

Как и в формировании первичных опухолей, опухоли, образованные посредством имплантации MMTV-PyVmT;^6ec70v", росли быстрее, чем опухоли, формированные клетками дикого (Р = .001) (Рисунок 9). ММТУ-РуУтТ;^ЬссУ0+/+ и MMTV-PyVmTAbcclO''' опухоли были чувствительны к лечению доцетакселом (Р = .003 и Р < .001). Тем не менее важно отметить, что за период лечения (21 день) опухоли, образованные из клеток дикого типа, уменьшились на 50%; в то время как эффект доцетаксела на опухоли AbcclO''' клеток был более значительным: объём опухолей был сокращён в среднем на 86 % по сравнению с контрольной группой (Рисунок 9).

-РуУтТ АЪссЮ"* Контроль — РуУтТ.АЬссЮ"4 Доцетаксел

-РуУтТАЛсс/С" Контроль — РуУтТ.ЛЬссТО' Доцетаксел

Рисунок 9. Скорость роста опухолей, образованных в результате имплантации ММТ У-РуУтТ;ЛЬсс10+/+ и ММТУ-РуУтТ^бсс/О"'" клеток. Представленные на графике кривые определяют скорость роста опухолей контрольных групп, а также групп, леченных доцетакселом.

Для сравнения эффективности лечения доцетакселом мы проанализировали влияние экспрессии АЬссЮ на экспрессию Кл-67, СБ31 и каспазы 3, которые являются общепринятыми маркерами пролиферативной активности клеток, васкуляризации и апоптоза. Мы обнаружили, что АЬссЮ''' опухоли группы "доцетаксел" показали значительное снижение Кл-67 положительных клеток (Р = .0473), а также снижение плотности кровеносных сосудов (Р = .0022) по сравнению с опухолями контрольной группы. Мы также отметили, что число клеток в состоянии апоптоза в леченных доцетакселом АЬсс10~'~ опухолей было увеличено более чем в 3 раза по сравнению с контрольными АЬссЮопухолями (Р < .001). Для мышей дикого типа такой разницы мы не увидели.

Влияние экспрессии АВСС10 на терапевтический эффект доцетаксела

Для оценки терапевтического эффекта доцетаксела мы использовали доклиническую модель метастатического РМЖ, ММТУ-РуУтТ, мыши которой развивали опухоли с АЬссЮ'' либо АЬссЮ генотипом в естественных условиях. Мышей инъецировали спиртовым носителем (контроль) или 25мг/кг доцетаксела раз в неделю на протяжении 12 недель.

А

i

?

J i

i 8

8

Время, медеж em».«!!«

Рисунок 10. Скорость роста опухолей, MMTV-PyVmT ;Л6сс/0+/+ (синий) и MMTV-PyVmTAbcclO''' (красный) в контрольной группе (А) и при лечении доцетакселем (Б). Каплан-Майер анализ выживаемости MMTV-PyVmT ;Л6сс/0+/+ и MMTV-PyVmTyibcclO' мышей при лечении доцетакселом (В).

Ответ на лечение MMTV-PyVmT-JbcclO''' доцетакселом (Р = .006) был значительно выше ответа мышей дикого типа (Р= .063) (Рисунок 10 А, Б). Сравнение роста опухолей в группах мышей AbcclO т и AbcclO'' генотипов, получавших еженедельно доцетаксел, оказалось проблематичным, так как мыши дикого типа достигали максимального объёма опухолей раньше и подвергались эвтаназии. Сравнение выживаемости давало более наглядное представление: через 8 недель после начала эксперимента лишь 44 % мышей дикого типа выжили, в то время как все AbcclO" мыши, получавшие доцетаксел, были живы. Каплан-Майер анализ выживаемости мышей, получавших доцетаксел (Рисунок 10 В), показал значительное увеличение выживаемости MMTV-PyVmT; AbcclO" мышей по сравнению с мышами дикого типа (Р = .0298).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании мы показали, что потеря экспрессии AbcclO ведёт к повышению пролиферативной активности опухолевых клеток молочной железы, за счёт чего опухоли AbcclO нокаутных животных растут быстрее опухолей дикого типа. Тем не менее, потеря AbcclO понижала агрессивность опухолей: AbcclO ' опухоли были более дифференцированными и давали меньше метастазов в лёгкие по сравнению с опухолями дикого типа. Мы не обнаружили компенсацию потери AbcclO посредством увеличения экспрессии других транспортеров, более того, мы отметили снижение экспрессии Abcg2 при потере AbcclO. Было продемонстрировано, что потеря AbcclO оказывает влияние на восприимчивость первичных культур клеток, полученных из опухолей MMTV-PyVmT мышей, к таксанам in vitro и in vivo. Данная разница была обусловлена повышением

внутриклеточной концентрации препарата для AbcclOклеток по сравнению с клетками дикого типа, за счет снижения транспорта препарата за пределы клетки. Мы также показали, что потеря эндогенной экспрессии AbcclO оказывает значительное влияние на повышение чувствительности опухолей доклинической мышиной модели рака молочной железы MMTV-PyVmT к доцетакселу, оказывая при этом положительный эффект на общую выживаемость.

Таким образом, мы продемонстрировали, что АВССЮ-транспортер не только отвечает за транспорт химиотерапевтических препаратов, обеспечивая развитие множественной лекарственной устойчивости, но также оказывает влияние на биологию рака молочной железы. Данная работа подчеркивает необходимость исследований роли АВСС10 в патогенезе рака молочной железы и его устойчивости к химиотерапии.

ВЫВОДЫ

1. Экспрессия АВСС10 повышена в опухолевых тканях молочной железы человека по сравнению с экспрессией в нормальных тканях молочной желззы. Выявлена гетерогенность экспрессии АВСС10 в трижды негативных опухолях молочной железы по сравнению с другими молекулярными подтипами.

2. Получены М N1Т V-I'y VmT;.^ be с 10'" и MMTV PyVmT ■J.bcclO''' мыши, у которых развивались мультифокальные опухоли молочной железы. AbcclO нокаугные мыши характеризуются повышением скорости роста опухолей, повышенной степенью дифференцировки опухолей и сниженной способностью к метастазированню в лёгкие.

3. Первичные культуры, полученные из опухолей AbcclO нокаутных PyVmT мышей, отличаются увеличением клеточного размера, усилением пролиферативной и адгезионной активностей клеток и уменьшением миграционной активности клеток.

4. Первичные культуры, полученные из опухолей AbcclO нокаутных PyVmT мышей, обладают повышенной чувствительностью к химиотерапевтическим препаратам группы таксаны in vitro и in vivo.

5. Отсутствие AbcclO усиливает терапевтический эффект доцетаксела: повышает чувствительность опухолей, оказывая при этом положительный эффект на выживаемость.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Доманицкая Н.В. Роль ABC-транспортеров в формировании множественной лекарственной устойчивости при лечении рака молочной железы // Фундаментальные исследования. — 2014. — № 6 (часть 4)

2. Малофеева Е.В., Доманицкая Н.В., Иксанова А.Г., Фаттахова А. Н. и Хоппер-Борж Е. Анализ биохимических и транспортных свойств белка множественной лекарственной устойчивости MRP7 (АВСС10) на примере клеток СаСо2 // Ученые записки Казанского государственного университета. Серия Естественные науки. - 2013. — Т.156 . - № 2. — С. 9-18

3. Malofeeva E.V., Domanitskaya N., Gudima M., Hopper-Borge E.A. Modulation of the ATPase and transport activities of broad-acting multidrug resistance factor ABCC10 (MRP7) // Cancer Research. - 2012. - V. 72, № 24. - P. 6457-6467.

4. Domanitskaya N., Paulose C., Jacobs J., Foster К., E Hopper-Borge E.A. AbcclO status affects proliferation, metastases and tumor sensitivity. Cancer Res. - 2012. - V. 72, № 24, Supplement 3. - Abstract № P4-08-04.

5. Domanitskaya N., Paulose C., Jacobs J., Foster K., Hopper-Borge E.A. AbcclO as a breast cancer resistance factor // 4th FEBS Special Meeting "ATP-Binding Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases" on ABC Proteins - Innsbruck, Austria, 2012.-P. 86.

6. Domanitskaya N., Paulose C., Jacobs J., Foster K., Hopper-Borge E.A. AbcclO status affects proliferation, metastases and tumor sensitivity // The First Annual Temple Biomedical Research Day-Philadelphia, 2012. -P. 74.

7. Malofeeva E.V., Domanitskaya N., Gudima M., Hopper-Borge E.A. Biochemical activity and transport properties of ATP-binding cassette family, member 10 (ABCC10) // 4th FEBS Special Meeting "ATP-Binding Cassette (ABC) Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Diseases" - Innsbruck, Austria, 2012. - P. 115.

8. Domanitskaya N., Paulose C., Jacobs J., Foster K., Hopper-Borge E.A. AbcclO as a breast cancer resistance factor // 17th annual postdoctoral and graduate student research conference, Fox Chase Cancer Center - Philadelphia, USA 2012 - P. 4.

9. Malofeeva E.V., Domanitskaya N., Gudima M., Hopper-Borge E.A. Biochemical activity and transport properties of ATP-binding cassette family, member 10 (ABCC10) // 17lh annual postdoctoral and graduate student research conference, Fox Chase Cancer Center -Philadelphia, USA 2012-P. 18.

10. Малофеева Е.В., Домаиицкая Н.В., Иксанова Л.Г., Фаттахова А.Н. и Норрег-Borge Е. Роль тирозинкиназных ингибиторов в АВССЮ-зависимой множественной лекарственной устойчивости // III Международная научная онлайн конференция "Проблемы в биохимии и бионанотехнологии" - Казань, Россия, 2012. - С. 196.

11. Малофеева Е.В., Доманицкая Н.В., Иксанова А.Г., Фагтахова А.Н. и Норрег-Borge Е. Роль тирозинкиназных ингибиторов в АВССЮ-зависимой множественной лекарственной устойчивости // "Постгеном 2012" - Казань, Россия, 2012. - С. 281.

12. Domanitskaya N., Paulose С., Jacobs J., Foster К., Hopper-Borge E.A. AbcclO as a breast cancer resistance factor // 8th Annual North American ABC Genetic Workshop - NCI -Frederick, Maryland, USA 2011 - P. 13.

13. Domanitskaya N., Paulose C., Jacobs J., Foster K., Hopper-Borge E.A. AbcclO as a breast cancer resistance factor // 16lh annual postdoctoral and graduate student research conference, Fox Chase Cancer Center-Philadelphia, USA 2011 - P. 9.

14. Domanitskaya N., Jacobs J., Paulose C., Hopper-Borge E.A. Mrp7 as a breast cancer resistance factor // AACR 102nd Annual Meeting - Orlando, Florida, USA 2011 - Abstract № 1693 P. 956

15. Domanitskaya N., Hopper-Borge E.A. Localization of MRP7 and analysis of Mrp7 sensitivity.// 7,h Annual North American ABC Meeting - NCI-Frederick, Maryland, USA 2010 - P.17

Подписано в печать 06.05.2014 Формат 60x84 1\16 Усл. печ. л. 1,5 Объем 24 стр. Тираж 100 экз. Заказ № 103 Отпечатано Омега Принт 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6 email: omegap@yandex.ni

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Доманицкая, Наталья Васильевна, Новосибирск

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Доманицкая Наталья Васильевна

Роль АВССЮ-транспортера в формировании множественной лекарственной устойчивости рака молочной железы при лечении таксанами

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: к.б.н. Григорьева Эльвира Витальевна

Новосибирск - 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ....................................................................................................................2

Список сокращений.............................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................................6

Актуальность проблемы..................................................................................................6

Основные цели и задачи исследования..........................................................................8

Научная новизна работы.................................................................................................9

Научно-практическая значимость................................................................................10

Основные положения, выносимые на защиту.............................................................11

Апробация работы..........................................................................................................12

Публикации.....................................................................................................................12

Структура и объем диссертации...................................................................................12

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................13

1.1. Рак молочной железы. Классификация.................................................................13

1.1.1. Химиотерапия опухолей......................................................................................16

1.1.2. Таксаны: механизм действия..............................................................................17

1.2. Множественная лекарственная устойчивость......................................................20

1.2.1. Механизмы множественной лекарственной устойчивости.............................20

1.2.2. АВС-транспортеры: структура и механизм действия......................................22

1.2.3. АВСС - подсемейство белков множественной лекарственной устойчивости (МИР)...............................................................................................................................25

1.2.4. АВСС 10 белок множественной лекарственной устойчивости........................30

1.2.5. Мышиная модель, нокаутная по гену АЬссЮ...................................................31

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................................35

2.1. Материалы...............................................................................................................35

2.2. Методы.....................................................................................................................37

2.2.1. Клеточные культуры............................................................................................37

2.2.2. Доклиническая мышиная модель рака молочной железы MMTV-PyVmT.... 37

2.2.3. Ортотопическая модель рака молочной железы...............................................38

2.2.4. Получение первичных клеточных культур из опухолей, развившихся у MMTV-PyVT^6cc70+/+ и MMTV-Py VT;^ ¿>сс70~А мышей.........................................38

2.2.5. Определение клеточной пролиферации in vitro................................................38

2.2.6. Тест на формирование колоний..........................................................................39

2.2.7. Тест на "зарастание раны"...................................................................................39

2.2.8. Определение адгезионной активности клеток..................................................39

2.2.9. Анализ апоптоза...................................................................................................40

2.2.10. Анализ клеточного цикла..................................................................................41

2.2.11. Измерение накопления [ Н]-доцетаксела в клетках.......................................41

2.2.12. Количественная ПЦР в реальном времени......................................................42

2.2.13. Вестерн-блот анализ..........................................................................................43

2.2.14. Иммуннофлуоресцентный анализ....................................................................44

2.2.15. Иммуногистохимический анализ.....................................................................44

2.2.16. Статистическая обработка результатов...........................................................45

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ...................................................................................................46

3.1. Экспрессия АВСС10.............................................................................................46

3.1.1. Анализ экспрессии белка АВСС10 в клеточных линиях рака молочной железы человека.............................................................................................................46

3.1.2. Анализ экспрессии гена АВСС10 в нормальной и опухолевой тканях молочной железы человека...........................................................................................48

3.1.3. Анализ экспрессии белка АВСС10 в опухолевой ткани молочной железы человека методом иммуногистохимического анализа...............................................50

3.2. Влияние экспрессии АВСС10 на развитие рака молочной железы и

терапевтический эффект доцетаксела..........................................................................53

3.2.1. Характеристика опухолей молочной железы MMTV-PyVmT;y46cc/0+/+ и

MMTV-PyVmT;^6cc70v" мышей...................................................................................53

3.2.1.1 Влияние АВСС10 на скорость роста опухолей молочной железы PyVmT мышей..............................................................................................................................53

3.2.1.2 Влияние AbcclO на агрессивность и метастазирование рака молочной железы.............................................................................................................................54

3.2.2. Характеристика первичных культур клеток, полученных из MMTV-PyVmT^Ьсс10+/+ и MMTV-PyVmT^46cc70'А опухолей.............................................57

3.2.2.1. Морфофизиологические характеристики MMTV-PyVmT;v4ócci0+/+ и MMTV-PyVmT^écc/O"7" первичных культур клеток.................................................57

3.2.2.2. Влияние экспрессии АВСС10 на экспрессию ABC-транспортеров............62

3.2.3. Цитотоксическая характеристика MMTV-PyVmT;AbcclO+/+ и MMTV-PyVmTjAbcclO"7" клеточных линий in vitro.................................................................64

3.2.3.1. Повышенная чувствительность AbcclO нокаутных клеточных линий к химиотерапевтическим препаратам.............................................................................64

3.2.3.2. Влияние доцетаксела и паклитаксела на развитие апоптоза и арест клеточного цикла............................................................................................................68

3.2.3.3. Накопление доцетаксела, как субстрата АВСС10, в MMTV-

PyVmT;AbcclO+/+ и MMTV-PyVmT^écciO"7" клетках...............................................70

3.2.4. Цитотоксическая характеристика MMTV-PyVmT;v46cc/0+/+ и MMTV-PyVmT-^ábccjO^' клеточных линий in vivo...................................................................70

3.2.5. Влияние экспрессии АВСС10 на терапевтический эффект доцетаксела.......74

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................................77

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................................................84

ВЫВОДЫ...........................................................................................................................85

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................86

Список сокращений

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость HMPJI - немелкоклеточный рак лёгкого НСД - нуклеотид-связывающий домен

ОТ-ПЦР - обратно-транскрипционная полимеразная цепная реакция

РМЖ - рак молочной железы

ТМД - трансмембранный домен

ABC - семейство АТФ-связывающих белков

Ага-С - цитозинарабинозид

EGFR - рецептор эпидермального фактора роста

ER - эстрогеновый рецептор

HERI - рецептор эпидермального фактора роста

HER2 (HER2/neu) - рецептор человеческого эпидермального фактора роста 2 типа

GST - глутатион-8-трансфераза

MRP - белок множественной лекарственной устойчивости PgR - прогестероновый рецептор Pgp - Р-гликопротеин

Разница обозначений генов и белков ABC семейства (АВСС10 в качестве примера-):

АВСС10 - человеческий белок АВСС10 - человеческий ген AbcclO - мышиный белок AbcclO - мышиный ген

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

В настоящее время химиотерапия является одной из ключевых форм лечения рака молочной железы. На сегодняшний день существует множество химиотерапевтических препаратов, обладающих различным механизмом противоопухолевого действия. Одними из наиболее эффективных препаратов для лечения многих видов раковых заболеваний, в том числе лечения раннего и метастатического рака молочной железы, являются доцетаксел и паклитаксел, относящиеся к группе лекарственных препаратов таксанов. На сегодняшний день процент ответа метастатического рака молочной железы на химиотерапию первой линии лечения составляет около 30 % -70 %, а безрецидивный период после лечения зачастую достигает лишь 7-10 месяцев. Большое количество смертей от данного заболевания обусловлено низкой эффективностью химиотерапии, связанной с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) опухолевых клеток. МЛУ, устойчивость клеток к ряду лекарственных препаратов, отличающихся по химической структуре и механизму действия, остается основной проблемой при лечении злокачественных новообразований.

МЛУ возникает в результате активации опухолевой клеткой её естественных защитных механизмов. На сегодняшний день доказана клиническая значимость различных механизмов множественной лекарственной устойчивости, одним из которых является механизм, основанный на транспорте лекарственных препаратов из клетки посредством трансмембранных белков ABC-транспортеров (ATP Binding Cassette (ABC) transporters, АТФ - зависимые транспортеры). Одними из наиболее изученных и охарактеризованных ABC-транспортеров является Р-гликопротеин (Pgp) или АВСВ1, гиперэкспрессия которого ассоциирована с феноменом МЛУ (Riordan et al., 1985). Несмотря на десятилетия исследований данного транспортера, на сегодняшний день ни одно из клинических испытаний, основанных на ингибировании транспорта лекарственных препаратов из опухолевой клетки не увенчалось успехом. Более того, клинические испытания с использованием ингибиторов АВСВ1, дающих положительный результат in vitro, не были

эффективны для пациентов (Robey et al., 2010). Ещё одним представителем данного подсемейства, малоизученным на сегодняшний день, но интересным для изучения развития МЛУ при лечении рака молочной железы, является транспортер АВСС10 (MRP7). АВСС10 экспрессируется в большинстве тканей человека, таких как поджелудочная железа, головной мозг, яичники, селезенка, печень, плацента, почки, сердечные и скелетные мышцы, семенники, кишечник, предстательная железа, молочные железы и др. (Hopper et al., 2001; Dabrowska, Sirotnak, 2004; Takayanagi et al., 2004). Данный транспортер обладает необычно широким спектром субстратной специфичности: гиперэкспрессия АВСС10 в опухолевых клетках in vitro обеспечивает устойчивость к таким препаратам, как таксаны, винка алкалоиды, нуклеотидные аналоги, а также эпотилон В (Hopper-Borge et al., 2004; Oguri et al., 2008; Hopper-Borge et al., 2009). Также в экпериментах на АЬссЮ'а мышах in vivo было показано, что потеря экспрессии AbcclO приводит к повышенной чувствительности животных к паклитакселу по сравнению с животными дикого типа (Hopper-Borge et al., 2011). Эти результаты позволяют предположить, что ингибирование АВСС10 может иметь клиническое значение в лечении рака молочной железы, а также других видов онкологических заболеваний, для лечения которых используют такие химиотерапевтические препараты, как таксаны.

Однако механизм участия АВСС10-транспортера в возникновение множественной лекарственной устойчивости при лечении рака молочной железы не ясен.

Основные цели и задачи исследования

Целью данной работы является исследование роли транспортного белка АВСС10, в формировании множественной лекарственной устойчивости при лечении злокачественных новообразований молочной железы.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать экспрессию АВСС10 в опухолях молочной железы человека по сравнению с нормальной тканью молочной железы. Изучить взаимосвязь молекулярных характеристик рака молочной железы и уровня экспрессии АВСС10 в опухолевых тканях.

2. Получить и охарактеризовать доклиническую мышиную модель рака молочной железы человека MMTV-PyVmT нокаутную по AbcclO.

3. Получить первичные культуры из опухолей молочной железы, развившихся у ММТУ-РуУшТ;Л6сс70+/+ и MMTV-PyVmT^Í¿cc70v" мышей. Изучить влияние экспрессии AbcclO на морфофизиологические характеристики опухолевых клеток in vitro.

4. Изучить влияние AbcclO на цитотоксические характеристики таксанов в отношении первичных культур опухолевых клеток молочной железы MMTV-PyVmT in vitro и in vivo.

5. Изучить влияние AbcclO на развитие множественной лекарственной устойчивости при лечении PyVmT доклинической модели рака молочной железы человека доцетакселом.

Научная новизна работы

В данной работе впервые было показано, что:

• экспрессия АВСС10 повышена в опухолевых тканях молочной железы человека по сравнению с экспрессией в нормальных тканях молочной железы, при этом показана взаимозависимость экспрессии АВСС10 и молекулярных характеристик РМЖ;

• экспрессия AbcclO в первичных культурах опухолевых клеток молочной железы MMTV-PyVmT оказывает влияние на морфофизиологические характеристики клеток независимо от функции транспорта химиотерапевтических препаратов: уменьшает пролиферативную и адгезионную активности, усиливая при этом миграционную активность клеток;

• MMTV-PyVmT^cciO"7" мыши характеризуются повышением скорости роста опухолей, повышенной степенью дифференцировки злокачественных опухолей и сниженной способностью к метастазированию в лёгкие;

• потеря экспрессии AbcclO не приводит к увеличению экспрессии других транспортеров, более того приводит к понижению экспрессии Abcg2;

• потеря экспрессии AbcclO повышает чувствительность опухолевых клеток молочной железы к таксанам in vitro и in vivo;

• потеря экспрессии AbcclO оказывает положительное влияние на терапевтический эффект доцетаксела в доклинической модели РМЖ MMTV-PyVmT in vivo, повышая чувствительность опухолей молочной железы к доцетакселу, и выживаемость экспериментальных животных MMTV-PyVmT6сс/(Г\

Научно-практическая значимость

Данная работа носит как фундаментальный, так и прикладной характер и представляет собой определение роли АВССЮ-транспортера в развитии множественной лекарственной устойчивости при лечении рака молочной железы химиотерапевтическими препаратами группы таксаны.

Полученные данные не только вносят свой вклад в понимание молекулярных механизмов МЛУ при лечении рака молочной железы, но также демонстрируют АВССЮ-транспортер как потенциальный биомаркер эффективности ответа на химиотерапию. Показанная в данной работе гетерогенность экспрессии АВСС10 для опухолей трижды негативного рака молочной железы позволяет предположить, что АВСС10 может являться кандидатом для клинического скрининга трижды негативного рака молочной железы и определение уровня экспрессии АВСС10 для каждого пациента может стать новым шагом на пути к более персонализированной химиотерапии. Данный результат имеет принципиальное значение также потому, что трижды негативный тип рака молочной железы является наиболее агрессивным и слабо поддаётся лечению, поскольку для данных опухолей на сегодняшний день не существует таргетной терапии. Также, данная работа определяет АВССЮ-транспортер как новую возможную цель для создания новых лекарственных препаратов, направленных на подавление МЛУ и повышение эффективности антиопухолевой химиотерапии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Экспрессия АВСС10 повышена в опухолевых тканях молочной железы человека по сравнению с экспрессией в нормальных тканях молочной железы. Экспрессия АВСС10 взаимосвязана с HER2 статусом опухоли и зависит от типа РМЖ.

2. Экспрессия AbcclO связана с агрессивностью злокачественных опухолей молочной железы, развившихся у MMTV-PyVmT мышей: повышенная степень дифференцировки и сниженная способность к метастазированию злокачественных опухолей молочной железы нокаутных по AbcclO.

3. Экспрессия AbcclO оказывает влияние на морфофизиологические характеристики первичных культур клеток, полученных из злокачественных опухолей, развившихся у MMTV-PyVmT мышей: уменьшение пролиферативной и адгезионной активности, увеличение миграционной активности клеток.

4. Потеря экспрессии AbcclO не компенсируется посредством увеличения экспрессии других транспореров.

5. Опухолевые клетки молочной железы, полученные из злокачественных опухолей MMTV-PyVmT мышей нокаутных по AbcclO, более чувствительны к химиотерапевтическим препаратам группы таксаны in vitro и in vivo по сравнению с клетками, полученными из опухолей MMTV-PyVmT мышей дикого типа.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на следующих конференциях: ежегодных научных конференциях студентов и аспирантов Научно-исследовательского центра рака «Фокс Чейз» (Филадельфия, США, 2010-2012); VII Международной ежегодной АВСС конференции в северной Америке (Национальный институт здоровья США, Фредерик, США, 2010); VIII Международной ежегодной АВСС конференции в северной Америке (Национальный институт здоровья США, Фредерик, США, 2011); Международной ежегодной конференции «AACR» (American Association for Cancer Research) (Орландо, США, 2011); IV Международной конференции «АВС-2012» (Инсбрук, Австрия, 2012); I Международной ежегодной биомедицинской научной конференции «Temple» (Филадельфия, США, 2012); 35-й Ежегодный симпозиум по раку молочной железы/35th Annual San Antonio Breast Cancer Symposium (Сан Антонио, США, 2012).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, из которых 3 публикации в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, опи�