Биохимические свойства транспортера АВСС10, принимающего участие в формировании фенотипа множественной лекарственной устойчивости

Малофеева, Екатерина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биохимические свойства транспортера АВСС10, принимающего участие в формировании фенотипа множественной лекарственной устойчивости
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Биохимические свойства транспортера АВСС10, принимающего участие в формировании фенотипа множественной лекарственной устойчивости"

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

На правах рукописи Ог(. .

МАЛОФЕЕВА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНА

Биохимические свойства транспортера АВСС10, принимающего участие в формировании фенотипа множественной лекарственной устойчивости

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 ИЮЛ 2013

005531ь»|

Казань-2013

005531691

Работа выполнена на кафедре биохимии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Фаттахова Альфия Нурлимановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Каримова Фатима Габдуллазяновна (ФГБУН «Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук», заведующий секцией сигнальных систем)

доктор биологических наук, профессор Шарипова Маргарита Рашидовна (ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», профессор института фундаментальной медицины и биологии, отделения фундаментальной медицины, кафедры микробиологии)

Ведущая организация Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита диссертации состоится 26 сентября 2013 г. в 13°° часов на заседании диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Казанский (Приволжский) федеральный университет, аудитория №211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Автореферат разослан «/-/ » tfjCAJl^ 2013 г.

Просьба высылать отзывы на автореферат по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская 18, главное здание КФУ к.104, отдел аттестации, ученому секретарю диссертационного совета Д212.081.08 проф. Абрамовой З.И., факс: (843)238-76-01. E-mail: ziabramova@mail.ru

Ученый секретарь Диссертационного

совета, доктор биологических наук и Абрамова З.И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Одним из основных методов терапии злокачественных новообразований, по-прежнему, является химиотерапия с использованием противоопухолевых препаратов (Joensuu Н. // Lancet Oncol. 2008. № 9(3). Р.304). Однако, применение этих средств, наряду с очевидными положительными эффектами, приводит к значительным нежелательным побочным эффектам. Высокая токсичность лекарственных средств диктует необходимость регулирования схемы и продолжительности лечения, что позволяет опухолевым клеткам вырабатывать механизмы резистентности и формировать фенотип множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) (Szakacs G. // Nature Reviews. Drug Discovery. 2006. № 9. P.219). Наиболее распространенным механизмом формирования МЛУ является АТФ-зависимый транспорт гидрофобных лекарственных препаратов с участием АВС-транспортеров, экспрессия которых повышена в опухолевых клетках (Gottesman М.М. // Nature Reviews. 2002. № 2. Р.48). Гиперэкспрессия АВС-транспортеров является одной из основных причин низкой эффективности современной химиотерапии. ABC-транспортеры способны выводить лекарственные вещества из клеток, способствуя развитию резистентности (Ullah M.F. // Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 2008. № 9. P.l). В связи с этим основной задачей исследователей остается разработка высокоэффективных ингибиторов АВС-транспортеров. Однако, достигнутые в настоящее время результаты являются весьма скромными, поскольку известные противоопухолевые препараты обладают низкой эффективностью и тканеспецифичностью и зачастую являются субстратами нескольких обратных транспортеров (Deeley R.G. // Physiol Rev. 2006. №86. P. 849).

Хорошие результаты по ингибированию действия транспортеров АВСВ1 и АВСС1 были получены в ходе доклинических исследований in vivo (Coley Н.М. // Methods Mol Biol. 2010. № 596. P. 341; Palmeira A. // Curr Med Chem. 2012. № 19(13). P. 1946). Однако, в ходе работы было показано, что таксаны способны переноситься из клеток с помощью других обратных транспортеров. Чаще всего ингибирование одного из транспортеров приводит к

активации другого (Couture L. // Pharmacological Reviews. 2006. № 58(2). P. 244). Таким образом, происходит компенсация работы первого транспортера и нивелирование действия ингибитора. На сегодняшний день описаны неудачные результаты клинических исследований по модуляции и ингибированию активности белков множественной лекарственной устойчивости (Kolitz J.E. // Blood. 2010. № 116(9). P. 1413; Robey R.W. // Anticancer Agents Med Chem. 2010. № 10(8). P. 625). Причина подобных неудач может заключаться в отсутствии достаточных экспериментальных данных о биохимических свойствах белков семейства ABC в присутствии модуляторов.

В связи с вышеизложенным была поставлена цель - определить некоторые биохимические, структурные и транспортные свойства белка АВСС10 как представителя семейства белков множественной лекарственной устойчивости.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1. Охарактеризовать АТФазную активность АВСС10. Изучить субстратную специфичность белка АВСС10. Выявить потенциальные ингибиторы АВСС10.

2. Определить локализацию АВСС10 в клетках с гиперэкспрессией АВСС10.

3. Изучить транспортные свойства белка АВСС10 с использованием клеток, гиперэкспрессирующих белок: провести сравнительный анализ накопления доцетаксела в клетках без и с гиперэкспрессией АВСС10; оценить трансэпителиальный транспорт веществ через плазматическую мембрану клеток.

4. Определить влияние мутаций в нуклеотид-связывающих доменах белка на АТФазную активность и транспорт субстратов АВСС10.

Научная новизна

В работе впервые исследованы биохимические свойства белка-транспортера АВССЮ.Впервые было установлено, что АВСС10 локализуется в базолатеральной части плазматических мембран, участвует в переносе субстратов в направлении с апикальной на базолатеральную часть

мембраны. АТФазная природа белка АВСС10 была подтверждена методом авторадиографии. Впервые были определены физиологические субстраты АВСС10, достоверно увеличивающие АТФазную активность белка,-лейкотриен С4, эстрадиол.-глюкуронид и тамоксифен. Среди цитотоксических средств, увеличивающих АТФазную активность АВСС10, субстратами белка являются доцетаксел, паклитаксел и цитарабин. Были установлены ингибиторы активности АВСС10 - тирозинкиназный ингибитор сорафениб и природный алкалоид сефарентин, препятствующие транспорту доцетаксела из МЛУ клеток с гиперэкспрессией АВСС10. Впервые с помощью мутационного анализа установлена существенная роль нуклеотид-связывающих доменов в транспорте субстратов АВСС10.

Научно-практическая значимость работы

Полученные результаты представляют интерес в качестве методологической базы для скрининга веществ - потенциальных высокоэффективных и селективных ингибиторов АВСС10. Количественные результаты исследования представляют интерес в качестве справочных данных для таких областей науки, как биохимия, молекулярная фармакология, клеточная биология, медицина и могут быть использованы в учебном процессе на биологических, химических и медицинских факультетах.

Положения, выносимые на защиту:

1. Белок АВСС10, вызывающий множественную лекарственную устойчивость, является АТФ-зависимым обратным транспортером, осуществляющим транспорт из клетки физиологических субстратов (лейкотриен С4, эстрадиол и тамоксифен)и противоопухолевых средств (таксаны и цитарабин).

2. Специфическими модуляторами активности АВСС10 являются тиразинкиназный ингибитор сорафениб и природный алкалоид сефарантин.

3. АТФазная активность и транспорт субстратов АВСС10 зависят от ароматических аминокислотных остатков, расположенных в нуклеотид-связывающих доменах белка АВСС10.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на следующих конференциях: III Международной научной онлайн конференции «Проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2012), III Международной научно-практической конференции «Посттеном» (2012);Х1Х Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва, 2012); II Международной научной конференции «Современная биология: вопросы и ответы» (Санкт-Петербург, 2012); ежегодных научных конференциях студентов и аспирантов Научно-исследовательского центра рака «Фокс Чейз» (Филадельфия, США, 2011-2013);VIII Международной ежегодной АВСС конференции в северной Америке (Национальный институт здоровья США, Фредерик, США, 2011); IV Международной конференции «АВС-2012» (Инсбрук, Австрия, 2012); I Международной ежегодной биомедицинской научной конференции «Temple» (Филадельфия, США, 2012); Международной ежегодной конференции «AACR» (American Association for Cancer Research) (Вашингтон, США, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 1 статья в рецензируемом журнале из списка ВАК, а также 1 статья в международном журнале.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включает 26 рисунков. Библиография включает 198 наименований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. В экспериментах использовали следующие модели: плазматические мембраны, выделенные из клеток ШПге, инфицированных АВССЮ-содержащим бациловирусом, клетки с гиперэкспрессией АВСС10 (клетки колоректальной аденокарциномы человека СаСо2и эпителиальные клетки почек свиньи ЬЬС-РК1), а также мутантные варианты АВСС10, полученные путем точечного мутагенеза и трансформированные в клетки СаСо2 и ЫС-РК1.

Выделение плазматических мембран клеток ШПуе. Мембранную фракцию клеток ШР'ке с гиперэкспрессией АВСС10 и контрольных клеток получали путем гомогенизации клеток в буфере на основе 1><ФСБ (без Са2+, Mg2+) (рН 7,5), содержащим 50 мМ трис-НС1, 50 мМ маннитола, 2 мМ ЕСТА, 0,2 % апротинина, 2 мМ ЭТТ, 1 мМ АЕВЗР. Гомогенаты клеток подвергали поэтапному ультрацентрифугированию. Мембраны выделяли при 100000§ и ресуспендировали в буфере на основе 1><ФСБ (без Са2+, Mg2+) (рН 7,5), содержащим 10% глицерин, 50 мМ трис-НС1, 300 мМ маннитола, 1 мМ ЕвТА, 0,1 % апротинина, 1 мМ ЭТТ, 0,5 мМ АЕВБР, и в дальнейшем использовали для изучения АТФазной активности белка. Концентрацию белка определяли методом Шаффнера и Вейсмана. В качестве стандарта использовали концентрационную зависимость по БСА. После определения концентрации белка мембранную фракцию ресуспендировали до концентрации 1 мг/мл и хранили при -80°С.

Идентификация экспрессии белка АВСС10 методом Вестери-блот. Для

идентификации АВСС10 использовали Вестерн-блот анализ. Для этого проводили электрофоретическое разделение мембранной фракции в 3-8% ЫиРАОЕ геле (1пукп^еп, США). После электрофоретического разделения белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану в трансфер-буфере при 4°С в течение ночи. После переноса мембрану окрашивали моноклонапьными антителами к АВСС10 в разведении 1:1000 или поликлональными антителами к АВСС10 в 1:3000. В качестве вторичных антител использовали мышиные антитела ^О и кроличьи антитела ^О, конъюгированные с пероксидазой

хрена, соответственно. Инкубацию с антитела проводили в течение 10 мин, после каждого этапа мембрану промывали 4x45 мл ФСБ+Т\уееп20 с использованием вакуумной системы SNAP I.D. После дополнительной отмывки 3x45 мл ФСБ регистрировали хемилюминесценцию. В качестве количественного маркера использовали антитела к ß-актину в разведении 1:30000.

Определение АТФазной природы АВСС10. Тест на BeF-индуцированное связывание [а-32Р]-8-азидоАТФ проводили с использованием АТФазного буфера, содержащего 0,5 мМ BeF, 2 мМ MgCl2, 1 мг/мл АВСС10 мембран и 100 мкМ [а-32Р]-8-азидоАТФ (2.5-10 мкКи/нмоль) (Affinity Photoprobes, LLC). Мембраны преинкубировали с буфером, не содержащим [а-32Р]-8-азидоАТФ, в темной комнате в течение 3 минут, потом добавляли [а-32Р]-8-азидоАТФ на 5 минут инкубации, затем в контрольных пробирках реакцию приостанавливали добавлением холодного АТФ (100 мМ). После инкубации реакцию останавливали облучением при 365 нм на льду в течение 10 минут. Затем пробы разделяли в ДСН-ПААГ геле, высушивали и проводили экспозицию на рентгеновскую пленку в течение 12-72 часов при -80°С.

Изучение АТФазной активности АВСС10. АТФазную активность выделенных плазматических мембран измеряли по высвобождению неорганического фосфата в реакции гидролиза АТФ. Специфическую активность АВСС10 определяли на фоне ортованадат- или BeFx-зависимой АТФазной активности. В 2хАТФазный буфер (100 мМ трис-HCl pH 7,5; 1 М KCl; 0,25М азид натрия; 0,125 М EGT А; 1 мМ уабаин; IM DTT) перед использованием добавляли 2 М MgCl2, затем вносили тестируемые вещества к 10 мкг мембранной фракции белка и выдерживали 5 мин при 37°С на водяной бане. В качестве контроля использовали BeF (BeSo4 + NaF), который добавляли в контрольные пробирки для каждой группы экспериментов. Гидролиз проводили путем добавления 5 мМ АТФ, через 20 минут инкубации реакцию гидролиза останавливали введением 100 мкл 5% ДСН. В качестве колометрического детектора использовали Pi-реагент (1 г молибдата аммония; 14 мг калия тартрата сурьмянокислого; 6,9 мл серной кислоты) в комбинации с

1% аскорбиновой кислотой. Количество неорганического фосфата измеряли после 20 минут инкубации с Pi-реагентом и аскорбиновой кислотой при 37°С на спектрофотометре при 880 нм. Кинетический анализ проводили по методу Лайнуивера-Берка с использованием программы GraphPad Prism 4. Метод получения плазматических мембран опухолевых клеток СаСо2 и LLC-PK1. Клеточные мембраны получали путем гомогенизации клеток с последующим центрифугированием гомогената. Гомогенизацию клеток проводили в РМ-буфере (1 М HEPES, 1 М MgCl2, 1 М KCl), содержащим протеазные ингибиторы: 5 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл лейпептина, 2 мкг/мл пепстатина, 100 мМ PMSF. Клеточные ядра и неразрушенные клетки устраняли центрифугированием при 500g в течение 10 минут при 4°С, затем супернатант центрифугировали при 3000g в течение 10 минут при 4°С. Клеточные мембраны отбирали центрифугированием супернатанта2 при 10000 g в течение 45 минут при 4°С, и осадок мембран ресуспендировали в РМ-буфере. Определение чувствительности клеток СаСо2 и LLC-PK1 к доцетакселу. Чувствительность АВСС10 к доцетакселу анализировали в MTS-тесте (Promega, США). Контрольные CaCo2-pcDNA3.1 и LLC-pcDNA3.1, а также СаСо2-АВСС10- и ¿¿С-Л£СС70-трансфецированные клетки рассеивали на 96-луночныйпланшет в количестве 5><103клеток/лунку (три повтора) в среде MEM. Далее клетки инкубировали в течение 24 часов при 37°Сдля их прикрепления ко дну лунки. На следующий день добавляли доцетаксел в различных концентрациях (0-800 нМ)и продолжали инкубацию в течение 72 часов. По окончании инкубации в каждую лунку добавляли MTS-реагент (бромистый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразол) и инкубировали еще 4 часа. Далее измеряли оптическую плотность при 490 нм на спектрофотометре Biomate3 (Thermo Scientific, США). Концентрации вещества, время инкубации и температура, используемые в эксперименте, подобраны экспериментально. Методика измерения накопления [3Н1доцетаксела в клетках. Контрольные CaCo2-pcDNA 3.1/LLC-PKl-pcDNA 3.1 клетки и АВССЮ-трансфецированные CaCo2/LLC-PKl клетки сажали в количестве 2 х 105 клеток на лунку в 6-луночном планшете. На следующий день среду заменяли на среду с

добавлением [3Н]-доцетаксела в конечной концентрации 0.1 мкМ (5 Ки/мМ). Далее клетки инкубировали в течение 15, 30, 60 и 90 минут при 37"С. С целью выявления воздействия ТК ингибиторов или других модуляторов на процесс накопления [3Н]-доцетаксела, клетки преинкубировапи с модуляторами в концентрации 2.5 мкМ в течение часа при 37"С. Далее среду заменяли на аналогичную, но с содержанием 0.1 мкМ [3Н]-доцетаксела, и проводили инкубацию с препаратом в течение 15, 30, 60 и 90 минут при 37°С. После инкубации клетки отмывали в холодном ФСБ и монослой клеток трипсинизировали с последующей инактивацией трипсина добавлением среды MEM, содержащей 10% БСА. Далее клетки осаждали центрифугированием с трехкратной отмывкой ФСБ при 500 g. Осадок клеток ресуспендировали в ФСБ. Внутриклеточную концентрацию [3Н]-доцетаксела измеряли на "LS6500 Multi-purpose Scintillation Counter". Удельная радиоактивность рассчитывалась на 10б клеток. Все данные оценивали с помощью параметрического критерия * Стьюдента с введением поправки Бонферрони, аР<0,05 считали статистически достоверными (Акберова, 2003).Концентрации вещества, время инкубации и температура, используемые в эксперименте, подобраны экспериментально. Исследование трансэпителиального транспорта веществ через плазматическую мембрану клеток СаСо2 и LLC-PK1. Исследуемые клетки сажали на поликарбонатные мембранные фильтры-вставки в 24-луночные планшеты (3,0 мкм - размер пор, 6,5 мм вставка, Transwell 3415, Costar, США) в количестве 1*106 клеток на фильтр-вставку для LLC-PK1 клеток и 1,5x10б клеток на фильтр-вставку для СаСо2 клеток. Клетки росли в среде в течение 5-7 дней до момента конфлюентности, со сменой среды каждые два дня. В течение этого периода проводили измерение трансэпителиального электрического потенциала (TEER), используя эпителиальный вольтметр EVOM2. Измерения проводили каждые два дня, и после достижения значения TEER >500 Qcm2, начинали эксперимент. Монослой клеток, выросших на фильтре-вставке отмывали 3 раза HBSS (37°С), затем добавляли HBSS-буфер, содержащий 0,1 мкМ [3Н]-доцетаксела (5 Ки/мМ), либо в апикальную часть, либо в базолатеральную часть планшета со вставкой. Для изучения ингибиторных

свойств веществ, после этапа отмывки монослоя клеток, их преинкубировали с разведенными в HBSS-буфере веществами-модуляторами в течение 1 часа при 37°С. После этапа преинкубации с модуляторами, раствор HBSS удаляли и добавляли HBSS-буфер с веществом с тритиевой меткой в донорную часть вставки. Клетки инкубировали при 37°С в присутствии 5% С02, затем отбирали 25 мкл аликвоты из каждой части вставки после 0, 2, 6, 12, 20 и 30 минут инкубации. Аликвоты растворяли в специализированном для измерения радиоактивности буфере и измеряли радиоактивность на "LS6500 Multi-purpose Scintillation Counter".

Исследование локализации АВСС10 в клетках LLC-PK1 и СаСо2. Для определения локализации исследуемого белка АВСС10 использовали метод иммуннофлуоресцентного анализа. Для этого LLC-PK1 и СаСо2 АВСС10-трансфектанты, и контрольные линии выращивали на покровных стеклах в течение трех дней до момента конфлюентности. После стекла промывали ФСБ и фиксировали в холодном метанолев течение 10 минут. Далее клетки перфорировали в 1% Тритон-ХЮО, затем блокировали 1хФСБ буфером, содержащим 3% БСА, 0.1% Тритон-ХЮО, и инкубировали с поликлональными кроличьими АВСС10 антителами (разведение 1:50 в блокирующем буфере) и с мышиным анти-р-катенином (разведение 1:500) в течение 1 часа при комнатной температуре. В качестве вторичных антител использовали анти-крысиные, конъюгированные с А1еха-488, и анти-мышиные, конъюгированные с Alexa-568. Для покраски ядер использовали DAPI в разведении 1:2000. Локализацию АВСС10 регистрировали с использованием конфокальной микроскопии (Nikon Eclipse Cl Plus, Nikon, Япония).

Получение мутантных вариантов опухолевых клеток LLC-PK1 и СаСо2. ABCC10-pcDNA3.1 использовалась как основа для сайт-направленного мутагенеза по Туг747, Tyr12ÎS и Тгр607, находящихся в нуклеотид-связывающихся доменах белка АВСС10. Мутагенез проводили с использование QuickChange kit (Stratagene,CIIIA) по протоколу, описанному компанией, используя следующие праймеры (замененный нуклеотид подчеркнут): Y747C (5'-caggaaaaggagctctGtctcctcgatgac-3'), Y1255C (5'- gtgttggcgtGçcggcca-3'), W607C

(5'- Н£йс1сс)£С£ассса;ЗД>§аасс - 3'). Два праймера, используемые в ПЦР-реакции, являются комплементарными противоположным концам разных цепей ДНК. После проведения ПЦР и проверки всех мутаций путем рестрикции и сиквенса, АВСС10 фрагменты, содержащие точечные мутации клонировали в рсБКАЗЛ вектор. Далее пустой вектор, вектор АВССЮ-рсОМАЗЛ и вектор, содержащий мутантные варианты АВСС10 трансфецировали в ЫС-РК1 клетки с использованием ПроГейатте 2000. Индивидуальные колонии отбирали путем селекции в среде с повышенным содержанием гентамицина (1 мг/мл). Один клон от каждой мутации, в которых АВСС10 был выявлен путем вестерн-блот анализа, использовался в последующих экспериментах. Клетки проверяли каждые 3-6 месяцев на наличие микоплазмы, а также на экспрессию АВСС10 белка. После трансформации все клоны проверялись повторным сиквенированием на наличие мутаций.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Биохимические особенности транспортера АВСС10 на модели плазматических мембран клеток /ДОУуе.гипреэкспрессирующих АВСС10

1.1 Идентификация АВСС10, гиперэкспрессированного в клетках насекомых ШРгуе. Изучение природы АВСС10 Согласно результатам электрофоретического разделения белков и вестерн-блот анализа выявлена экспрессия белка (190 кДа) в плазматических мембранах клеток ШПуе, инфецироваяных АВССЮ-содержащим бацилловирусом (рис. 1А и В). Продукты деградации в образцах не выявлены.

Рисунок 1 - Детектирование АВССЮ-белка. А -Вестерн-блот анализ с анти-АВССЮ антителами с использованием мембранных белковых фракции, выделенных из клеток насекомых ШРке. инфицированных контрольным рРа$1Вис АВССЮ-не содержащим бацилловирусом и АВССЮ-содержащим ба11илловирусом. Б - идентификация АВССЮ-белка с помогцью покраски геля Кумасси, показываю1цая чистоту образца и отсутствие деградации белка. В -данные авторадиографии по связыванию [32Р]-8азидоА ТФ с АВССЮ-белком плазматических мембран ШР'меклеток.

Для доказательства того, что АВССШ-белок способен гидролизировать АТФ использовали радиоактивный нуклеотидный аналог [а-32Р]-8-азидоАТР.Результаты авторадиографии демонстрируют связывание [а-32Р]-8-азидоАТФ с белком АВСС10 плазматических мембран клеток ШПуе (рис. 1В).

1.2 Основные особенности АВССЮ-зависимого гидролиза АТФ Для определения особенностей функционирования АВСС10, как обратного транспортера, определяли АТФазную активность изолированных мембран клеток ШПуе.

Концентрация (мМ) Рн

Рисунок 2 - АВССЮ-зависимый гидролиз АТФ. А - АТФ гидролиз измеряли с использованием АВСС10-экспрессирующих мембран в присутствии ряда концентраций ВеР. Б - АВСС10 АТФазная активность при различных рНреакционной среды.

При концентрации ВеР 0,8 М ингибирование АТФазной активности АВСС10 достигает 32%, в случае использования ортованадата -11,4% (рис. 2А). На рисунке 2Б показано, что оптимальная АТФазная активность АВСС10

достигается при рН 7,5. Оптимальная концентрация АТФ для АВСС10-зависимого гидролиза составляет 6 мМ (рис.ЗА).

Рисунок 3 - АВССЮ-зависимый гидролиз АТФ при различных концентрациях АТФ (А), двувалентных ионов в концентрации 2мМ (Б). Для каждого эксперимента результаты представлены как среднее значение от трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. * - статистически достоверное увеличение АТФазной активности АВСС10 в присутствии Мп2+ по сравнении с

Показано, что для белка АВСС10 АТФазная активность снижается в ряду Мп2+>1^2+>Са2+>Со2+(рис. ЗБ).

Таким образом, максимальная АТФазная активность белка АВСС10 наблюдается при следующих условиях: рН 7-7.5; 6 мМ АТФ; наличие 1У^2+ в качестве кофактора и фторида бериллия как ингибиторанеспецифической АТФазной активности.

1.3 Индукция АТФазной активности АВСС10 в присутствии физиологических субстратов В качестве физиологических субстратов были исследованы лейкотриен С4, эстрадиол-глукуронид, тамоксифен и глутатион. Результаты влияния этих соединений на АТФазную активность АВСС10 приведены на рис.4.

АТФ (мМ)

(Р=0,0178).

Лейкотриен С4. мкМ Г

Тамоксифен, мкМ

Эстардиол, мкМ

Гпутатион, мкМ

Рисунок 4 - Влияние лейкотриена С4 (А), эстрадиола (Б), тамоксифена (В) и глутатиона (Г) на АТФазную активность АВССЮ. Для каждого эксперимента результаты

представлены как среднее значение от трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение.

Лейкотриен С4, эстрадиол и тамоксифен взаимодействуют с АВССЮ, проявляя свойства субстратов АВССЮ, а глутатион подавляет АВССЮ АТФазную активность.

1.4 Индукция АТФазной активности АВССЮ в присутствии противоопухолевых средств Результаты по влиянию лекарственных средств на АТФазную активность АВССЮ приведены на рис. 5. АТФазная активность плазматических мембран клеток ШР'ме с контрольным вектором рРавСВас не изменяется под действием анализируемых веществ (рис. 5А и Б).

0.625 мкМ 5 мкМ

Рнсунок5 - Стимуляция АВССЮ АТФазной активности противоопухолевыми веществами. Обзор эффекта двух концентрациий ве/цеств на А ТФазную активность: 0.625 мкМ (А) и 5 мкМ (Б). Данные эксперимента представлены средним значением трех независимых опытов ± стандартное отклонение. Достоверность различии между вариантами оценивали с помощью t-mecma (Р<0,05). Сокращения: Doc - доцетаксел, Рас - паклнтаксел. АгаС - цитарабин. ЕроВ - эпотшон Б, Cis -цнсплатин.

Аналогичная ситуация наблюдается и в случае плазматических мембран клеток //(Тчуе с гиперэкспрессией АВСС10. Однако в этом случае обращает на себя внимание тот факт, что АТФазная активность зависит от концентрации противоопухолевых средств. Так, при использовании АгаС в концентрации 0,625 мкМ, доцетаксела и паклитаксела в концентрациях 5 мкМ наблюдается статистически достоверное увеличение АВСС10 АТФазной активности на 32%, 15% и 24% соответственно.

2. Локализация и транспортные свойства белка-транспортера АВСС10

2.1 Экспрессия АВССЮ-белка в эпителиальных 1ЬС-РК] и СаСо2 тетках Для изучения локализации и экспрессии белка были получены

поляризованные клетки с гиперэкспрессией АВСС10. Согласно результатам

вестерн-блот анализа в образцах плазматических мембран, выделенных из

клеток с АВССШ-содержащим вектором, экспрессия белка АВСС10

значительно превосходит таковую в образцах плазматических мембран клеток с

пустым рсБКА 3.1 вектором (рис. 6 А и Б).

-I

ф ч*. у_ V - \ а ' - ...

Х7 хг

Х2 к

Х2 за.

СаСо2-АВСС10

Р-кзтенин АВСС10

Рисунок 6 - Экспрессия АВСС10 в эпителиальных клетках ЪЬС-РК] (А) и СаСо2 (Б). В Вестерн-блот анализе использовали анти-АВССЮ антитела и анти-^-актин антитела. Локализация АВСС10 в поляризованных эпителиальных клеточных линиях ЬЬС-РК1 (В) и СаСо2 (Г). В анализе использованы антитела к АВСС10 и к /3-катенину (маркер базолатерального расположения в мембранах клеток). АВСС10 (зеленый), р-катенин (красный), окрашенная по ОАР1 ДНК (синий). Значение по и/кале 20мкМ. увеличение 60х, ХТ-ЗО-срез.

Согласно результатам иммунофлуоресцентного анализа (рис. 6В и Г) АВСС10 преимущественно локализуется в плазматической мембране, но при этом обнаруживается и в цитоплазме клеток. Установить локализацию АВСС10 в контрольных клеточных линиях LLC-PK1ÇB) и СаСо2(Г)с пустым pcDNA 3.1 вектором не представляется возможным, поскольку в этом случае экспрессия АВСС10 не наблюдается.

2.2 Чувствительность LLC-PK1 и СаСо2 клеток к доцетакселу in vitro Чувствительность клеток СаСо2 и LLC-PK1 к доцетакселу анализировали с помощью трехдневного MTS-теста. Установлено, что клетки СаСо2-АВСС10 и LLC-ABCC1 менее чувствительны к действию доцетаксела, чем контрольные клетки CaCo2-pcDNA3.1 и LLC~pcDNA3.1 (рис. 16). Полученные результаты свидетельствуют о том, что доцетаксел является субстратом обратного транспортера АВСС10.

й в0 X

зо

C*Loj4tcOHA3.1

СвС02-АВСОй

0,05 0.1 0.5 1

20 50 100 500

Доцетаксел (нМ)

Рисунок 7 - Чувствительность контрольных линий клеток и трансфещрованных АВСС10 клеток к доцетакселу. А - СаСо-2, Б - ЬЬС-РК1. В эксперименте результаты представлены как среднее значение трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. Для статистической обработки использовался непараметрический !-тест, где значение Р < 0.05.

2.3 Накоплениеи трансэпителиальный транспорт (вН]-доцетаксгла в

эпителиальных поляризованных клеточных линиях без и с гиперэкспрессией

АВСС10

Установлено, что при инкубации клеток СаСо2~АВСС10 и ЬЬС-АВССЮ на фоне контрольных клеток внутриклеточная концентрация доцетаксела увеличивается в меньшей степени (рис. 8 А, Б). а б в

Рисунок 8 — Накопление ['Н]доцетаксела в поляризованных эпителиальных клетках СаСо2 (А) и LLC-PK1 (Б). Трансэпителиальный транспорт ^Н]доцетаксела в поляризованных LLC-PK1 клетках (В). Данные эксперимента представлены средними значениями трех независимых опытов ± стандартное отклонение. Для статистической обработки использовался критерий Стьюдента для множественных сравнений с введением поправки Бонферрони, Р<0,05. Сокращения: апикально-базолатеральный транспорт (А-Б), базолатерально-апикальный транспорт (Б-А).

Клетки LLC-PK1 с гиперэкспрессией АВСС10 транспортируют [3Н]-доцетаксел с апикальной на базолатеральную часть плазматической мембраны (рис. 8В). При этом контрольная клеточная линия, трансфецированная пустым pcDNA3.1 вектором, не показала различия в транспорте как с апикальной на базолатеральную часть мембраны, так и в противоположном направлении. Апикально-базолатеральный транспорт [3Н]-доцетаксела клетками LLC-АВСС10 был на 70-80% выше по сравнению с таковым для клеток LLC-pcDNA3.1.

2.4 Влияние модулирующих веществ на АТФазную активность АВСС10 Сефарентин, сорафениб, иматиниб, нилотиниб, эрлотиниб и лапатиниб в концентрации 5 мкМ являются эффективными ингибиторами гидролиза АТФ белка АВСС10 (рис. 9).

Рисунок 9 - Влияние модуляторов в концентрациях 0,625 мкМ и 5 мкМ на АТФазную активность ABCCJO. В качестве модуляторов использовали: сефарентин (Ceph), сорафениб (Sor), дасатиниб (Das), иматиниб (ImaíJ, нилотиниб (Nil), эрлотиниб (Erl), лапатиниб (Lap). Доцетаксел (Doc) использовали в качестве субстрата.Данные эксперимента представлены средними значениями трех независимых опытов ± стандартное отклонение.

При понижении концентрации до 0,625 мкМ гидролиз АТФ ингибируют лишь нилотиниб (41%) и сорафениб (47%). Тирозинкиназный ингибитор дасатиниб при концентрациях 0,625 мкМ и 5 мкМ не проявляет свойств модулятора АВСС10.

2.5 Влияние модулирующих веществ на процесс накопления f3HJ-доцетаксела в эпителиальных LLC-PKl клетках Для ТК ингибиторов использовали концентрацию 2,5 мкМ, а для природного алкалоида сефарентина — 5 мкМ. Практически все используемые модуляторы из ряда ТК ингибиторов (нилотиниб, сорафениб, дасатиниб и эрлотиниб) и сефарентин увеличивают накопление [3Н]-доцетаксела в клетках с гиперэкспрессией АВСС10 (рис. 20). Поскольку некоторые из исследованных модуляторов (нилотиниб, дасатиниб и лапатиниб) оказывают действие и на контрольные клетки LLC-pcDNA 3.1, можно сделать вывод о неспецифическом относительно АВСС10 воздействии на транспорт доцетаксела. Мы полагаем, что механизм действия этих соединений обусловлен их воздействием на сигнальные пути, в которых участвуют тирозинкиназы.

I i i Iii

г ■f <г

I 5мкМ O.S25MKM

Рисунок 10 — Влияние модуляторов на клеточное накопление [*Н] доцетаксела в эпителиальных LLC-PK.1 клетках. Данные эксперимента представлены средними значениями трех независимых опытов ± стандартное отклонение. Для

статистической обработки использовался критерий Стьюдента для множественный сравнений, Piß,05.

Следует отметить, что в отличие от большинства исследованных модуляторов селективными являются лишь сорафениб и сефарентин, которые не оказывают воздействия на контрольную клеточную линию LLC-pcDNA 3.1, но достоверно увеличивают накопление доцетаксела в клетках с гиперэкспрессией АВСС10.

2.6 Влияние сефарентина и сорафениба на трансэпителиальный транспорт f HJ-доиетаксела в поляризованных LLC-PK1 клетках

Сорафениб является потенциальным ингибитором транспорта доцетаксела в направлении от апикальной части на базолатеральную часть плазматической мембраны в клеточной линии LLC-PK1 с гиперэкспрессией АВСС10 (рис. 11А). В контрольных клетках LLC-pcDNA3.1 сорафениб не оказывает влияния на транспорт доцетаксела (рис. 11В).

Аналогичная ситуация наблюдается и для сефарентина. При этом максимальное ингибирование апикально-базолатерального транспорта доцетаксела в клетках LLC-ABCC10 наблюдается в интервале 6-20 минут после начала инкубации (рис. 11 В). Подобно сорафенибу, сефарентин не оказывает влияния на транспорт доцетаксела в контрольной клеточной линии (рис. 11Г).

Таким образом, ингибиторами активности АВСС10 являются природный алкалоид сефарентин и тирозинкиназный ингибитор сорафениб.

£ ¡0

¿DO :

-♦-LLC-ABCC ИМ - 6 -O-UX-ABfCWC A 55() j

-fr-aOABCCWA • S Sor 300 i -л-ас-жооЕ.-А 4«

UC-AECC1XlA-f. •ЦС-Л6СС10 Б - A UC-AEC&í) A • o Cccii .1С-АЙСС1Э fi-Afcph

-•-UCpíDBAÍ.Í А- G

■"O-UC0iDNA3.S6.-A *TÍr-tlC pcONA 3.1 А- Б Süí —¿r-UC pcDNA S.í Б A Sof

-а-й.С-$СОКАЗЛ5-А —«-UC«cDNA»¿ A-SCeph -O-liC-pC&MAS.l S-ACopfc

Время (мин) время (ММИ)

Рисунок 11 — Влияние модуляторов сорафениба (Sor) и сефарентина (Ceph) на трансэпителиальный транспорт f Н]доцетаксела в поляризованных клетках LLC-ABCC10 (А, Б) и LLC-pcDNA3.1 (В, Г). Данные эксперимента представлены средними значениями трех независимых опытов ± стандартное откпонение.Сокращения: апикально-базолатералъный транспорт (А-Б), базолатерально-апикальный транспорт (Б-А).

3. Влияние мутаций по ароматическим аминокислотам в нуклеотид-связывающих доменах на АТФазную активность и транспорт субстратов

АВСС10

3.1 Экспрессия АВССЮ-белка в эпителиальных клетках, содержащих АВСС10 с точечными мутациями (W60'^ Y747С, YJ235C) в нуклеотид-

связывающих доменах Для изучения влияния точечных мутаций по ароматическим аминокислотам (с заменой на цистеин) на траспортные и биохимические свойства белка АВСС10 мутантные варианты АВСС10 были трансфецированы в эпителиальные LLC-PK1 клетки. Иммуноблоттинг мембранной фракции, выделенной из клеточных линий, экспрессирующих мутантные варианты АВСС10, АВСС10 без мутации и контрольный pcDNA3.1 вектор, проводили с использованием моноклональных антител к АВСС10.

У и

Z D

< ? > 5 К

■Щ АВСС10

Рисунок 12 — Экспрессия АВСС10 в клеточной линии ££С-РК1, экспрессирующей АВСС10 без мутации, мутантные варианты АВСС10: У747С, У1255С, 1У607С, и контрольный рсОА'АЗ 1 вектор. В вестерн-блот анализе использовали антитела против АВСС10 и антитела к /?-актину, в качестве количественного контроля белковой нагрузки лунки.

Э-актин

Экспрессия мутантных вариантов АВСС10 несколько ниже в сравнении с экспрессией АВСС10 без мутаций. Таким образом, мутации в АВСС10 не оказывают значимого влияния на процессинг и стабильность белка.

3.2 А ТФазная активностьмутантных вариантов АВС.С10. экспрессирующихся в LLC-PK1 клетках При использовании таксанов (доцетаксела и паклитаксела) мутация Y1255C и W607 Сприводит к достоверному снижению АТФазной активности АВСС 10. Однако мутация Y747C приводит к снижению АТФазной активности АВСС 10 только при использовании паклитаксела. В случае использования АгаС мутация Y1255C не оказывает достоверного эффекта, в то время как мутации W607C и Y747C приводят к увеличению АТФазной активности АВСС10.

Рисунок 13 - АТФазная активность мутантных по ароматическим аминокислотам вариантов АВСС10 в присутствии различных субстратов АВСС10. Данные эксперимента представлены средними значением трех независимых опытов ± стандартное отклонение. Для статистической обработки использовался критерий Стьюдента для множественных сравнений,

Р<0,05. Сокращения: Doc - доцетаксел, Рас -паклитаксел, АгаС - цитарабин.

S fZ

§ 1« к »О га £ 2

U-1-

Таким образом, мутации У1255С, \V607C и У747С в нуклеотид-связывающих доменах (НСД) приводят к изменению АТФазной активности АВСС10.

3.3 Влияние мутаций в нуклеотид-связываюгиих доменах АВСС10 на клеточное накопление fHl-меченых субстратов кАВССЮ Мутации W607C, Y1255C не влияют на накопление субстратов в сравнении с рсБЫАЗЛ-экспрессирующими клетками. Однако, мутация Y747C достоверно понижает накопление субстратов в сравнении с pcDNAS.l-экспрессирующими клетками. На основе этих данных можно сделать вывод, что мутации W607C, Y1255C оказывают влияние на транспортные свойства АВСС10, способствуя накоплению субстратов в клетках.

A S ® Doc

" J- f-JHi

Б «а AraC

se CiZ

I J5 ■

f » !

cismsi ssc«« nsK m'.7. wssst

Рисунок 14 - Накопление Н]-меченных субстратов доцетаксела (А) и цитарабина (Б) в поляризованных эпителиальных клетках ЫС-РК1 с гиперэкспрессией мутантных вариантов АВСС10. Данные эксперимента представлены средними значениями трех независимых опытов ± стандартное отклонение.

3.4 Влияние мутаций в нуклеотид-связываюгиих доменах АВСС10 на трансэпителиальный транспорт ^Н]-меченых субстратов АВСС10 в поляризованных ЬЬС-РК1 клетках

Установлено, что в трансэпителиальном транспорте [3Н]-доцетаксела участвует непосредственно ароматическая аминокислота в положении 1255 (тирозин). Замена на цистеин (мутация У1255С) приводит к понижению транспорта [3Н]-доцетаксела.

В случае АгаСв качестве ароматической аминокислоты, влияющей на транспорт, выступает триптофан в положении 607. Замена его на цистеин

(мутация \V607C) также, как и в случае мутации У1255С, приводит к понижению апикально-базолатерального транспорта субстрата (рис. 15).

Рисунок 15 - Влияние\¥607С, У747С, У1255С мутаций на трансэпителиальный транспорт Н]АгаС в поляризованных клетках ЫС-РК1. Графики сверху вниз: У747С, У1255С, }¥607С. Данные эксперимента представлены средними значениями трех независимых опытов ± стандартное отклонение. Для статистической обработки использовался критерий Стъюдента для множественных сравнений с введением поправки Бонферрони. Р<Р. 05.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что физиологическими субстратами АТФ-зависимого транспортера АВССЮявляются лейкотриен С4, эстрадиол и тамоксифен и противоопухолевые средства-таксаны и цитарабин.

2. АВССЮ-белок локализуется в базолатеральной части плазматических мембран эпителиальных клеток и участвует в апикально-базолатеральном транспорте субстратов АВСС10.

3. Специфическими ингибиторами АТФазной активности и транспортных функций АВССЮ-транспортера являются природный алкалоид сефарентин и тирозинкиназный ингибитор сорафениб.

4. Мутации Y747C, Ш07Си Y1255C приводят к снижению АТФазной активности АВСС10. Мутация Y1255C (замена тирозина на цистеин) приводит к снижению трансэпителиального транспорта доцетаксела, а мутация W607C (замена триптофана на цистеин) — АгаС.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Малофеева, Е.В. Анализ биохимических и транспортных свойств белка множественной лекарственной устойчивости MRP7 (АВСС10) на примере клеток СаСо2 I Е. В. Малофеева, Н.В. Доманитская, А. Г. Иксанова, А. Н. Фаттахова и Е. Хоппер-Борж // Ученые записки Казанского государственного университета. Серия Естественные науки. -2013. — Т. 156 . - № 2. - С.9-18.

2. Malofeeva, E.V. Modulation of the ATPase and transport activities of broad-acting multidrug résistance factor ABCC10 (MRP7) / E.V. Malofeeva, N.V.Domanitskaya, M. Gudima, E.A. Hopper-Borge // Cancer Research. — 2012. - V. 72, №24. - P. 6457-6467.

3. Малофеева, Е.В. Мутации ароматических аминокислотных остатков с заменой на полярные аминокислоты в нуклеотид-связывающих доменах приводят к изменению транспортных свойств АВСС10 / Е. В. Малофеева, Е. Hopper-Borge// AACRAnnualMeeting 2013 - Вашингтон, США, 2013. -С. 874.

4. Малофеева, Е.В. Биохимическая активность и транспортные особенности АВСС10 траснортера, члена семейства АТФ-зависимых белков/ Е. В. Малофеева, Н.В. Доманитская, М. Гудима,Е.А. Hopper-Borge// АВС2012-4ЛРЕВ8 Spécial Meeting on ABC Proteins - Инсбрук, Австрия, 2012.-С. 115.

5. Малофеева, Е.В. Биохимическая активность и транспортные особенности АВСС10 траснортера, члена семейства АТФ-зависимых белков/ Е. В. Малофеева, Н.В. Доманитская, М. Гудима,Е.А. Норрег-

Borge// 17th annual postdoctoral and graduate student research conference, Fox Chase Cancer Center - Филадельфия, США, 2012 - P. 18.

6. Малофеева,Е.В. Эффект тирозинкиназных ингибиторов на биохимические особенности АВСС10 (MRP7) / Е.В. Малофеева,Норрег-Borge Е. // the First AnnualTemple Biomedical Research Day -Филадельфия, США, 2012. -P. 129.

7. Малофеева, Е.В. Анализ базальной АВССЮ-зависимой активности/ Е. В. Малофеева, М. Гудима,Е.А. Hopper-Borge// 16th annual postdoctoral and graduate student research conference, Fox Chase Cancer Center -Филадельфия, США, 2011-P.30.

8. Малофеева,Е.В. Анализ биохимической активности и транспортных особенностейАВССЮ (представителасемействаАТФ-зависимыхбелков) / Е.В. Малофеева, М.Гудима, S. Ambudkar, E.Hopper-Borge //8th annual North American ABCC Genetic Workshop, National Cancer Institute -Фредерик, США, 2011. - P. 22.

9. Малофеева, Е.В. АТФазная активность мембранного транспортера, белка множественной лекарственной устойчивости АВСС10 (MRP7) /Е. В. Малофеева, А. Н. ФаттаховаиЕ. Hopper-Borge// Международная научная конференция"Современная биология: вопросы и ответы" — Санкт-Петербург, Россия, 2012. - С. 39.

10.Малофеева, Е.В. Роль тирозинкиназных ингибиторов в АВССЮ-зависимой множественной лекарственной устойчивости/ Е. В. Малофеева, Н.В. Доманитская, А. Г. Иксанова, А. Н. Фаттахова и Е. Hopper-Borge //ШМеждународная научная онлайн конференция"Проблемы в биохимии и бионанотехнологии" - Казань, Россия, 2012.-С. 196.

11.Малофеева, Е.В. Роль тирозинкиназных ингибиторов в АВССЮ-зависимой множественной лекарственной устойчивости / Е. В. Малофеева, Н.В. Доманитская, А. Г. Иксанова, А. Н. Фаттахова и Е. Hopper-Borge//"Постгеном 2012"-Казань, Россия, 2012. - С. 281.

12.Малофеева, Е.В. АТФазная активность мембранного транспортера, белка множественной лекарственной устойчивости АВСС10 (MRP7) /Е. В. Малофеева, А. Н. ФаттаховаиЕ. Hopper-Borge// XIX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2012" - Москва, Россия, 2012. - С. 52.

Отзывы на автореферат просьба отправлять по адресу 420008, Казань, ул. Кремлевская, д.18, главное здание КФУ, к.104, отдел аттестации научных кадров, Диссертационный совет Д 212.081.08, Ученому секретарю З.И. Абрамовой, факс: (843)238-76-01 E-mail: ziabramova@mail.ru

Подписано в печать 03.07.2013. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,75. Тираж 100. Заказ №307/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) 4201П, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92 e-mail: westfalika@inbox.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малофеева, Екатерина Викторовна, Казань

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

04201361929 „

На правах рукописи

Малофеева Екатерина Викторовна

03.01.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Фаттахова А.Н.

Казань -2013

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 7

ВВЕДЕНИЕ 9

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14

1.1 Рак и множественная лекарственная устойчивость 14

1.2 Клеточные механизмы множественной лекарственной 17 устойчивости

1.3 Неклеточные механизмы множественной лекарственной 19 устойчивости

1.4 АВС-транспортеры: от бактерий к человеку. Роль ABC 20 транспортеров во множественной лекарственной устойчивости

1.4.1 Структура, функции и механизм активации ABC- 21 транспортеров

1.4.2 Представители подсемейства белков множественной 25 лекарственной устойчивости

1.5 Модуляторы множественной лекарственной устойчивости 34

1.5.1 Вещества природного происхождения, как модуляторы 36 множественной лекарственной устойчивости

1.5.1.1 Флавоноиды 37

1.5.1.2 Нефлавоноидные полифенолы 38

1.5.2 Тирозинкиназные ингибиторы, как модуляторы 40 множественной лекарственной устойчивости

1.5.2.1 Неспецифические ингибиторы тирозинкиназ 40

1.5.2.2 BCR/ABL-зависимые ингибиторы тирозинкиназ ^

1.5.2.3 Ингибиторы рецептеров эпидермального фактора роста

(ЕОРЯ) 42

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 46

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 46

2.1 Реактивы и оборудование 46

2.2 Объекты исследований 52 2.2.1 Клеточные линии 52

2.3 Исследование биохимических особенностей транспортера 56 АВСС10

2.3.1 Выделение плазматических мембран ШПге клеток

2.3.2 Идентификация экспрессии белка АВСС10 методом Вестерн- 56 блот

2.3.3 Определение АТФазной природы транспортера АВСС10 57

2.3.4 Изучение АТФазной активности АВСС10 58

2.4 Изучение транспортных свойств и локализации белка- 59 транспортера АВСС10

2.4.1 Метод получения плазматических мембран ЬЬС-РК1 и СаСо2 ^ клеток

2.4.2 Идентификация гиперэкспрессии АВСС10 в ЬЬС-РК1 и СаСо2 60 клеточных линиях

2.4.3 Чувствительность клеток ЬЬС-РК1 и СаСо2 к доцетакселу 60

2.4.4 Методика измерения накопления [3Н]доцетаксела в ЫС-РК1 и 61 СаСо2 клетках конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

2.4.5 Исследование трансэпителиального транспорта веществ через 61 плазматическую мембрану ЫС-РК1 и СаСо2 клеток

2.4.6 Исследование локализации АВСС10 в ЫС-РК1 и СаСо2 63 клетках

2.5 Анализ мутации нуклеотид-связывающих доменов АВСС10 64

2.5.1 Получение мутантных вариантов АВСС10 и трансфекция в ЫС-РК1 и СаСо2 клетки

2.5.2 Характеристика мутантных вариантов АВСС10 65

2.5.2.1 Выделение плазматических мембран ЬЬС-РК1 и СаСо2 65 клеток с гиперэкспрессией мутантных вариантов АВСС10

2.5.2.2 Вестерн-блот анализ экспрессии мутантных вариантов 65 АВСС10, гиперэкспрессирующихся в ЬЬС-РК1 и СаСо2 клетках

2.5.2.3 Определение АТФазной активности мутантных вариантов 65 АВСС10 белка

3 3

2.5.2.4 Измерение накопления [ Н]доцетаксела и [ Н]-АгаС в клетках 65 с гиперэкспрессией мутантных вариантов АВСС 10

2.5.2.5 Измерение трансэпителиального транспорта веществ через 66 плазматическую мембрану клеток с экспрессией мутантных

вариантов АВСС 10 белка

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 67

3.1 Исследование биохимических особенностей транспортера 67

АВСС10

3.1.1 Идентификация АВСС 10, гиперэкспрессированного в клетках насекомых ШПуе

3.1.2 Определение АТФазной природы АВСС10

3.1.3 Особенности АВСС 10-зависимого гидролиза АТФ

3.1.4 Индукция АВСС 10 АТФазной активности в присутствии противораковых веществ

3.1.5 Индукция АВСС10 АТФазной активности в присутствии противораковых веществ

3.2 Характеристика локализации и транспортных свойств белка-транспортера АВСС10

3.2.1 Экспрессия АВССЮ-белка в эпителиальных LLC-PK1 и СаСо2 клетках

3.2.2 Локализация АВСС 10 в поляризованных клеточных линиях LLC-PK1 и СаСо2

3.2.3 Чувствительность LLC-PK1 и СаСо2 клеток к доцетакселу in vitro

3.2.4 Накопление [ Н]доцетаксела в эпителиальных поляризованных клеточных линиях без и с гиперэкспрессией АВСС 10

3.2.5 Трансэпителиальный транспорт доцетаксела через плазматическую мембрану LLC-PK1 клеток

3.2.6 Влияние модулирующих веществ на АТФазную активность АВСС 10

3.2.7 Влияние модулирующих веществ на процесс накопления [3Н]доцетаксела в эпителиальных LLC-PK1 клетках

3.2.8 Влияние сефарентина и сорафениба на трансэпителиальный транспорт [3Н]доцетаксела в поляризованных LLC-PK1 клетках

3.3 Роль мутации по ароматическим аминокислотам в

нуклеотид-связывающих доменах белка множественной лекарственной устойчивости АВСС10

3.3.1 Экспрессия АВССЮ-белка в эпителиальных клетках, содержащих АВСС10 с точечными мутациями (\¥607С, У747С,

1255т

У С) в нуклеотид-связывающих доменах

3.3.2 АТФазная активность \У607С, У747С, У1255С мутантных вариантов АВСС10, экспрессирующихся в ЬЬС-РК1 клетках

3.3.3 Влияние мутаций в нуклеотид-связывающих доменах АВСС10

на клеточное накопление [ Н]-меченных субстратов к АВСС10

3.3.4 Влияние мутаций в нуклеотид-связывающих доменах АВСС10 на трансэпителиальный транспорт [3Н]-меченных субстратов к АВСС10 в поляризованные ЬЬС-РК1 клетках

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ АДЕНОЗИН ТРИФОСФОРНАЯ КИСЛОТА

ДНК ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА

МЛУ МНОЖЕСТВЕННАЯ ЛЕКАРСТВЕННАЯ

УСТОЙЧИВОСТЬ

ТМД ТРАНСМЕМБРАННЫЙ ДОМЕН

НСД НУКЛЕОТИД-СВЯЗЫВАЮЩИЙ ДОМЕН

АДФ АДЕНОЗИН ДИФОСФОРНАЯ КИСЛОТА

ДГЭА-С ДЕГИДРОЭПИАНДРОСТЕРОН-3-СУЛЬФАТ

НМРЛ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНЫЙ РАК ЛЕГКОГО

ОМЛ ОСТРЫЙ МИЕЛОИДНЫЙ ЛЕЙКОЗ

ТК ТИРОЗИНКИНАЗЫ

ДСН ДОДЕЦИЛСУДЬФАТ НАТРИЯ

ПААГ ПОЛИАКРИЛАМИДНЫЙ ГЕЛЬ

ФСБ ФОСФАТНО-СОЛЕВОЙ БУФЕР

БСА БЫЧИЙ СЫВОРОТОЧНЫЙ АЛЬБУМИН

РМЕА 9 - (2-ФОСФОНИЛМЕТОКСИЭТИЛ) АДЕНИН

EGFR РЕЦЕПТОР ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА

РОСТА

VEGFR РЕЦЕПТОР ФАКТОРА РОСТА ЭНДОТЕЛИЯ

СОСУДОВ

PDGFR РЕЦЕПТОР ФАКТОРА РОСТА

ТРОМБОЦИТОВ

ХМЛ ХРОНИЧЕСКИЙ МИЕЛОИДНЫЙ ЛЕЙКОЗ

ТКИ ТИРОЗИНКИНАЗНЫЕ ИНГИБИТОРЫ

DOC ДОЦЕТАКСЕЛ

РАС ПАКЛИТАКСЕЛ

CIS ЦИСПЛАТИНА

ЕроВ ЭПОТИЛОН Б

АгаС ЦИТАРАБИН

LTC4 ЛЕЙКОТРИЕН С4

Vi ОРТОВАНАДАТ

TEER ТРАНСЭПИТЕЛИАЛЬНЫЙ ЭЛЕКТРИЧЕСКИЙ

ПОТЕНЦИАЛ

HBSS СБАЛАНСИРОВАННЫЙ СОЛЕВОЙ РАСТОР

ХЭНКСА

BeF ФТОРИД БЕРРИЛИУМА

Imat ИМАТИНИБ

Nil НИЛОТИНИБ

Das ДАСАТИНИБ

Sor СОРАФЕНИБ

Lap ЛАПАТИНИБ

Erl ЭРЛОТИНИБ

Ceph СЕФАРЕНТИН

GST ГЛУТАТИОН-8-ТРАНСФЕРАЗА

ABC АТФ-ЗАВИСИМЫЕ ТРАНСПОРТЕРЫ

P-GP П-ГЛИКОПРОТЕИН

DOX ДОКСОРУБИЦИН

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Одним из основных методов терапии злокачественных новообразований, по-прежнему, является химиотерапия с использованием противоопухолевых препаратов. Однако, применение этих средств, наряду с очевидными положительными эффектами, приводит к значительным нежелательным побочным эффектам. Высокая токсичность лекарственных средств диктует необходимость регулирования схемы и продолжительности лечения, что позволяет опухолевым клеткам вырабатывать механизмы резистентности и формировать фенотип множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). Наиболее распространенным механизмом формирования МЛУ является АТФ-зависимый транспорт гидрофобных лекарственных препаратов с участием АВС-транспортеров, таких как Р-гликопротеин (АВСВ1) и MRP1 (АВСС1), способных выводит лекарственные соединения из клетки. Экспрессия таких транспортеров повышена в опухолевых клетках. Таким образом, гиперэкспрессия АВС-транспортеров является одной из основных причин низкой эффективности современной химиотерапии.

В связи с этим основной задачей исследователей остается разработка высокоэффективных ингибиторов АВС-транспортеров. Однако, достигнутые в настоящее время результаты являются весьма скромными, поскольку известные противоопухолевые препараты обладают низкой эффективностью и тканеспецифичностью и зачастую являются субстратами нескольких обратных транспортеров.

Хорошие результаты по ингибированию действия транспортеров АВСВ1 и АВСС1 были получены в ходе доклинических исследований в системе in vivo. Однако, чаще всего ингибирование одного из транспортеров приводит к активации другого. Таким образом,

происходит компенсация работы первого транспортера и нивелирование действия ингибитора. На сегодняшний день описано большое количество неудачных результатов клинических исследований по модуляции и ингибированию активности белков множественной лекарственной устойчивости. Причина подобных неудач может заключаться в отсутствии достаточных экспериментальных данных о биохимических свойствах белков семейства ABC в присутствии модуляторов.

Поэтому основной задачей остается подробное изучение структурных, биохимических и транспортных свойств транспортеров; подбор специфического ингибитора для определенного белка семейства АВС-транспортеров, а также тщательное изучение эффекта каждого потенциального ингибитора на другие транспортеры с использованием различных моделей доклинических исследований.

В связи с вышеизложенным была поставлена цель - определить биохимические, структурные и транспортные свойства белка АВСС10, как представителя семейства белков множественной лекарственной устойчивости.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

2. Определить локализацию АВСС10 в клетках с гиперэкспрессией АВСС10.

4. Определить влияние мутаций в нуклеотид-связывающих

доменах белка на АТФазную активность и транспорт субстратов АВСС10.

Научная новизна

В работе впервые исследованы биохимические свойства белка-транспортера АВСС10. Впервые было установлено, что АВСС10 локализуется в базолатеральной части плазматических мембран, участвует в переносе субстратов в направлении с апикальной на базолатеральную часть мембраны. АТФазная природа белка АВСС10 была подтверждена методом авторадиографии. Впервые были определены физиологические субстраты АВСС10, достоверно увеличивающие АТФазную активность белка, - лейкотриен С4, эстрадиол-глюкуронид и тамоксифен. Среди цитотоксических средств, увеличивающих АТФазную активность АВСС10, субстратами белка являются доцетаксел, паклитаксел и АгаС. Были установлены ингибиторы активности АВСС10 - тирозинкиназный ингибитор сорафениб и природный алкалоид сефарентин, препятствующие транспорту доцетаксела из МЛУ клеток с гиперэкспрессией АВСС10. Впервые с помощью мутационного анализа установлена существенная роль нуклеотид-связывающих доменов в транспорте субстратов АВСС10.

Научно-практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту:

1. Белок АВСС10, вызывающий множественную лекарственную устойчивость, является АТФ-зависимым обратным транспортером, осуществляющим транспорт из клетки физиологических субстратов (лейкотриен С4, эстрадиол и тамоксифен) и противоопухолевых средств (таксаны и АгаС).

2. Специфическими модуляторами активности АВСС10 являются сорафениб и сефарантин.

3. АТФазная активность и транспорт субстратов АВСС10 зависят от ароматических аминокислотных остатков, расположенных в нуклеотид-связывающих доменах.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на следующих конференциях: III Международной научной онлайн конференции «Проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2012), III Международной научно-практической конференции «Постгеном» (2012); XIX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» (Москва, 2012); II Международной научной конференции «Современная биология: вопросы и ответы» (Санкт-Петербург, 2012); ежегодных научных конференциях студентов и аспирантов Научно-исследовательского центра рака «Фокс Чейз» (Филадельфия, США, 2011-2013); VIII Международной ежегодной АВСС конференции в северной Америке (Национальный институт здоровья США, Фредерик, США, 2011); IV Международной конференции «АВС-2012» (Инсбрук, Австрия, 2012); I Международной ежегодной биомедицинской научной конференции «Temple» (Филадельфия, США, 2012); Международной ежегодной конференции «AACR» (American Association for Cancer Research) (Вашингтон, США, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 1 статья в рецензируемом журнале из списка ВАК, а также 1 статья в международном журнале.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, включает 26 рисунков. Библиография включает 198 наименований.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Рак и множественная лекарственная устойчивость

В настоящее время предотвращение индукции и развития злокачественных новообразований представляет собой одну из самых важных задач здравоохранения. Рак может быть охарактеризован как процесс нерегулируемого клеточного деления, приводящего к формированию опухоли в любой части тела (Plutynski, 2013). Возникновение злокачественных новообразований является результатом ряда молекулярных событий, которые существенно изменяют нормальные свойства клеток. В опухолевых клетках "отключен" нормальный контроль системы, который предотвращает разрастание клеток. Опухолевые клетки делятся и растут в присутствии сигналов, которые в нормальных клетках нужны для подавления активного неконтролируемого роста. Также опухолевые клетки приобретают новые характеристики, в том числе изменения в структуре клетки, снижение клеточной адгезии. Эти изменения позволяют опухолевым клеткам постоянно расти и делиться, даже при наличии нормальных клеток, которые обычно тормозят рост близлежащих клеток. Кроме того, такие изменения позволяют опухолевым клеткам распространяться и проникать в другие ткани, что приводит к такому явлению, как метастаз (Kleinsmith, 2006; Takimoto et al, 2008; Tannock, 2005).

Существует несколько видов терапии онкологических заболеваний, зависящие от типа рака, его расположения и стадии малигнизации (Skeel, 2003). Одним из основных типов лечения является хирургическое вмешательство для удаления солидных опухолей. Данный тип терапии может быть эффективным только на ранних стадиях рака. Второй тип терапии - это радиотерапия, которая убивает раковые клетки лучами высокой энергии, нацеленными непосредственно на опухоль. Он действует, в первую очередь, на ДНК, повреждая ее и предотвращая репликацию, поэтому используя данный метод, преимущественно

убиваются бысто делящиеся раковые клетки. Минусом радиотерапии является гибель нормальных клеток, особенно тех, которые находятся на стадии деления. Третьим типом терапии принято считать химиотерапию (Skeel, 2003; Takimoto et al., 2008). В химиотерапии используются токсичные препараты различных классов соединений, предназначенные для лечения соответствующих типов рака.

Молекулярный механизм действия антиопухолевых соединений заключается в предотвращении синтеза молекул, необходимых для репликации ДНК; в снижении способности клетки завершать S фазу клеточного цикла; в обширном повреждении ДНК, приводящем к остановке репликации; в ингибировании синтеза микротрубочек, что влияет на репликацию клеток в начале митоза. Несмотря на то, что большинство стареющих неопухолевых клеток делятся не часто, и могут быть менее чувствительны к препаратам, чем быстро делящиеся опухолевые клетки, данные препараты являются токсичными для всех типов клеток организма, в особенности для клеток желудочно-кишечного тракта, костного мозга и волосяных фолликулов. Данный эффект приводит к некоторым из побочных эффектов химиотерапии, в том числе расстройствам желудочно-кишечного тракта, низкому содержанию белых кровяных телец в крови и выпадению волос.

Химиотерапия может быть неэффективна, когда клетки становятся устойчивыми к терапевтическим препаратам (Hirsch, 2006). Также немало важно, что опухоль может находиться в таких частях тела, в которы�

Информация о работе

Малофеева, Екатерина Викторовна
кандидата биологических наук
Казань, 2013
ВАК 03.01.04

Диссертация

Биохимические свойства транспортера АВСС10, принимающего участие в формировании фенотипа множественной лекарственной устойчивости - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы