Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние адриамицина на синтез иммуноглобулинов в клетках мышиных В-клеточных линий, различающихся по устойчивости к цитотоксическим препаратам

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние адриамицина на синтез иммуноглобулинов в клетках мышиных В-клеточных линий, различающихся по устойчивости к цитотоксическим препаратам"

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

МЕЛИКСЕТЯН Марине Борисовна

На правах рукописи

ВЛИЯНИЕ АДРИАМИЦИНА НА СИНТЕЗ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В КЛЕТКАХ МЫШИНЫХ В-КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО УСТОЙЧИВОСТИ К ЦИТОТОКСИЧЕСКИМ ПРЕПАРАТАМ.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.00. 25 - Клеточная биология

Научные руководители: д. б. н. ,проф. Т. Н. Игнатова д. м. н.,проф. Ю. Т. Апексанян

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1995

Работа выполнена в Институте цитологии РАН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Игнатова Татьяна Николаевна; доктор медицинских наук, профессор Ллексанян Юрий Татевосович.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Борхсениус Сергей Николаевич; доктор биологических наук, профессор Назаров Петр Григорьевич.

Ведущее учреждение: НИИ онкологии им. проф. H.H. Петрова МЗ РФ (Санкт-Петербург).

Защита состоится ^¡Cßc^h^- 1995 г. в /часов на заседа-

нии Диссертационного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064 , С-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии

РАН .

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук

JI.H. Писарева

©Институт ЦИТОЛОГИИ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Воздействие противоопухолевых цитостатиков на клетки может приводить к двум взаимосвязанным процессам: с одной стороны, к нарушению структуры и функции макромолекул клетки, в первую очередь ДНК, с другой- к формированию клеточного ответа на ДНК-повреждающее стрессовое воздействие, выражающегося в координированных изменениях экспрессии генов. Ключевую роль в регуляции ответа клетки на повреждение ДНК играет белок опухо-лесупрессор р53 (Kastan et al., 1991). В зависимости от исходного генетического статуса и фенотипических особенностей клетки, а также характера стрессового воздействия, клеточный ответ на цитотоксические препараты может заключаться в остановке клеточного цикла в фазах Gi или G2/M, в программированной клеточной гибели (Lowe et al., 1993; Lane et al., 1994), индукции дифференцировки (Rappa et al.,1990; Aloni-Grinstein et al., 1995). В клетках с нарушенной регуляцией пролиферации и высокой генетической нестабильностью при длительном воздействии цитостатиков возможно формирование множественной лекарственной устойчивости (Gottesman, Pastan, 1993).

Характерной особенностью ответа клетки на цитостатики, также как и самого феномена лекарственной устойчивости, является плейотропность изменений фенотипа, обусловленная комплексными изменениями в экспрессии генов. Существуют данные об изменении в устойчивых к цито-токсическим агентам клетках экспрессии генов дифференцировки ( Bates et al. , 1989; Stromskaya et al., 1995), ДНК-топоизомеразы II (Beck et al. ,1990), ферментов детоксикации ксенобиотиков (Akman et al., 1990; Nakagawa et al. , 1990), цитокинов и генов главного комплекса гистосо-вместимости (Scheper et al., 1991; Zyad et al., 1994).

Изучение ответа иммунокомпетентных клеток на воздействие цито-токсических противоопухолевых препаратов представляет двоякий

интерес. Во-первых, это удобная модель для изучения взаимодействия стресс-индуцибельных защитных механизмов клетки с системой ткане-специфической экспрессии генов. Во-вторых, изменение зффекторных функций клеток иммунной системы при воздействии противоопухолевых препаратов может существенно влиять на динамику развития иммунного ответа организма на опухоль .

Согласно литературным данным, большинство антинеопластиче-ских препаратов обладает иммуносупрессивным действием (Kempf, Mitchell, 1989). Однако для отдельных препаратов, в частности, противоопухолевого антибиотика адриамицина (АД) показана стимуляция активности NK-киллеров (Nanbara et al., 1991) и лимфокин-активированных киллеров (Ehrke, Gautam, 1991 ) как в клинических исследованиях, так и в системах in vitro. Кроме того, показана индукция дифференцировки клеточных линий гемопоэтического происхождения в культуре под воздействием АД (Rappa et al. , 1991; Hoffman, Newlands, 1991; Ge, 1994).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении изменений тканеспецифической экспрессии генов в процессе развития клеточного ответа на противоопухолевый антибиотик АД и выявлении возможной зависимости этих процессов от взаимодействия препарата с внутриклеточными мишенями. В качестве объекта для исследований нами были выбраны постоянные B-клеточные линии, продуцирующие иммуноглобулины (ИГ) . Выбор объекта объяснялся тем, что регуляция экспрессии генов ИГ- наиболее хорошо охарактеризованная модель тканеспецифической экспрессии генов в клетках иммунной системы. Наличие нескольких вариантов этих линий, обладающих фенотипом множественной лекарственной устойчивости, открывало возможности для сравнительного изучения упомянутых процессов в клетках, различающихся по чувствительности к цитотоксическим препаратам. Кроме того, мы попытались проследить судьбу индуцибельных изме-

нений в экспрессии генов в процессе формирования устойчивого фенотипа при селекции клеток на устойчивость к АД, а также выявить возможную корреляцию между изменениями в тканеспецифической экспрессии генов и наличием конкретных механизмов лекарственной устойчивости в клетках отселектированных сублиний.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

1. Проанализировать изменения синтеза ИГ, индуцированные АД в клетках мышиных миелом (гибридом), конститутивно продуцирующих ИГ и различающихся по устойчивости к цитотоксическим препаратам.

2. Выявить механизмы изменений синтеза ИГ в присутствии АД.

3. Изучить процессы клеточной гибели под воздействием АД и проследить возможную связь между изменениями экспрессии генов ИГ и индукцией апоптоза в клетках чувствительных и устойчивых вариантов.

4. Провести сравнительный анализ экспрессии генов ИГ , шс!г1 и активности ДНК-топоизомеразы II в различных сублиниях гибридо-мы , отселектированных на устойчивость к бромистому этидию (БЭ) и АД.

Научная новизна работы. Работа содержит новые данные относительно механизмов воздействия противоопухолевого препарата АД на постоянные В-клеточные линии. В частности, мы показали значительное усиление конститутивного синтеза ИГ в клетках В-клеточных гибридом и миелом. Ранее нами было показано усиление индуцибельного синтеза ИГ лимфоцитами периферической крови человека в присутствии АД( Дав-тян и др., 1993). Кроме того, мы показали, что усиление экспрессии генов ИГ под влиянием АД предшествует апоптозу (программированной клеточной гибели) в клетках как чувствительных к ядам, так и обладающих фенотипом множественной лекарственной устойчивости клеток миелом. Мы обнаружили также различия в биохимических механизмах апоптоза в клетках устойчивой и чувствительной линий. Если в клетках

чувствительной миеломы Sp2/0 процесс был независим от содержания внутриклеточного кальция и был ассоциирован с активацией как Са2+-Mg—эндонуклеазы. так и кислой катионнезависимой эндонуклеазы, то в клетках миеломы SpEBR-5 с фенотипом МЛУ, подвергающихся апоптозу в присутствии АД. мы зафиксировали лишь Са2+-Мд3+-зависимую эндо-нуклеазную активность. Нам удалось показать, что изменения в экспрессии генов ИГ, индуцированные кратковременной обработкой клеток АД, сохраняются в процессе селекции клеток на устойчивость к АД. Нам удалось установить, что усиление экспрессии ИГ в клетках гибридом, устойчивых к АД, коррелирует с наличием определенного механизма избирательной устойчивости к АД, а именно, с негативной регуляцией активности ДНК-топоизомеразы И, но не с экспрессией генов mdr.

Практическая ценность работы. Полученные нами результаты касаются малоисследованных аспектов противоопухолевого и иммуномоду-лирующего действия АД - препарата, широко применяющегося в клинической практике, и потому могут представлять интерес для практической онкологии. В частности, это вывод об индукции апоптоза в культивируемых клетках как одном из механизмов антинеопластического действия АД. Кроме того, возможные изменения В-клеточного иммунного ответа в организме в процессе химиотерапии АД также могут представлять интерес для клинической практики. Предложенная нами модель изучения влияния АД на В-клетки in vitro может служить основой для исследования воздействия препарата на эффекторные функции других клеток иммунной системы, принимающих участие в противоопухолевом иммунном ответе, в частности естественных и лимфокин-активированных киллеров, что весьма важно для совершенствования терапевтических подходов в онкологии. Наконец, наши результаты могут представлять интерес и для гибридом-ной техноглогии, поскольку получение гибридом и (или) их селекция в присутствии АД может способствовать получению вариантов гибридом с повышенной продукцией специфических антител .

Лпробация работы. Материалы диссертации были представлены на двустороннем советско-финском симпозиумепо морфологии клет-ки(Москва,1990), международной конференции "Современные направления терапии рака"(Тайпей,Тайвань, 1994). ХШ-м Собрании Европейской Ассоциации по исследованию рака (Берлин, ФРГ,1994). на всероссийском совещании "Биология клетки в культуре"(Санкт-Петербург,1995), а также на семинарах в Институте Цитологии.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссератацни. Диссератация содержит разделы: введение, обзор литературы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Объем работы составляет 141 страницу. Список литературы включает 257 работ отечественных и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Постоянные клеточные линни. использованные в работе. Объектами исследования служили постоянные клеточные линии, а также их субклоны и сублинии, полученные путем многошаговой селекции на устойчивость к БЭ и АД.

1.Бр2/0-Ад8 . Миелома мыши (ЗЬи1шап,1978). Получена реюто-нированием гибридов от слияния мышиной миеломы X63-Ag8 со сплено-цитами мыши на предмет вторичной утраты синтеза иммуноглобулинов. Однако клетки миеломы Бр2/0 из коллекции культур Института Цитологии РАН стабильно продуцируют ИГ класса в2Ь .

2. 5рЕВЯ-5. Получена субклонированием миеломы Бр2/0, устойчива к БЭ в концентрации 5 мкг/мл (Березкнна, 1994). Обладает множественной лекарственной устойчивостью вследствие повышенной экспрессии гена шс1г1(Липская,1992).

-83. 1F7. Гибридома, получена путем слияния клеток миеломы SpEBR-5 с иммунизированными спленоцитами мыши (Ковалева и др., 1989). Продуцирует моноклональные антитела против трансферри-на человека. Сохранена также продукция миеломных ИГ класса Ig G2b.

4.IF7-EBR. Сублиния гибридомы IF7, устойчивая к БЭ в концентрации 1.5 мкг/ мл (Березкина, не опубликовано).

5.IF7-AD. Сублиния гибридомы IF7, устойчивая к АД в концентрации 0.1 мкг/ мл (Березкина, не опубликовано).

2.Плазмиды. В работе были использованы следующие плазмиды:

1. Плазмида рСу2Ь, содержащая BamHl- Kpnl-фрагмент кДНК константного региона тяжелой цепи ИГ у2Ъ размером 0.9 kb, клонированный в EcoRl сайте плазмиды рМВ9 (Tucker et al., 1979). Плазмида любезно предоставлена проф. Р. Перри (Fox Chase Cancer Center, США).

2. Плазмида pGAPDH, содержащая фрагмент размером 1.2 kb крысиного гена глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (GAPDH), клонированный в Pst 1 сайте плазмиды pBR-322 (Fort et al,1987).

3. Плазмида pDR4.7, содержащая гены множественной лекарственной устойчивости китайского хомячка pgp 1-2 размером 4.7 kb, клонированные в векторе pSP64 по Pstl сайту (Roninson et al.,1986). Любезно предоставлена д-ром И. Ронинсоном (Университет Чикаго, США).

3.Синтетические Олигонуклеотиды. В экспериментах по анализу ДНК-связывающих белков использовали синтетический олигонуклео-тид, состоящий из двух комплементарных цепей с выступающими 5'концами, содержащий октамерную последовательность ATGCAAAT (Imagawa et al.,1987), любезно предоставлен В.И. Воробьевым (Институт Цитологии РАН).

4.Исследование синтеза ИГ. Клетки, обработанные исследуемыми препаратами, биосинтетически метили "Б-Ь-метионином в течение 5-18 ч и лизировали во льду в течение 15 минут в буфере состава : 10 мМ Трис-

НС1, pH7.4, 150шМ NaCl, lmM NaN3, lmM PMSF, 0.5% Тритон-Х-100. 0.5% NP-40. ИГ преципитровали из лизата клеток с помощью белка А, иммобилизованного на сефарозе (Pharmacia) и анализировали путем электрофореза в 10% полиакриламидном геле присутствии SDS в буферной системе Леммли(ЬаештН et al., 1970) в восстанавливающих условиях. После электрофореза гель обрабатывали 20% раствором 2,5-дифенилоксазола и автографировали.

5.Выделение и анализ ДНК и РНК клеток. Тотальную ДНК из клеток для электрофореза выделяли по методу Дюка с соавт. (Duke et al., 1983) и анализировали путем электрофореза по стандартной методи-ке(Маниатис и др.,1984).

Цитоплазматическую фракцию РНК клеток выделяли по методу r>7r¿ca(Gough, 1988), фракционировали путем электрофореза в 1. 2% ага-эозном геле, содержащем 1М формальдегид. РНК переносили из геля на чембрану Hybond N и гибридизовали с меченным з:Р-зондом 48ч в 50% |>ормамиде при 42° С согласно инструкции фирмы- производителя Amersham).

6.Количественное определение фрагментации ДНК проводили по методу Барри и др.(Ваггу et al., 1993).

7.Выделение плазмидиой ДНК проводили методом щелочного ли-иса (Маниатис и др. 1984).

8.Введение радиоактивной метки в ДНК. Пробы для гибридизации го Нозерну метили 32Р-дезоксинуклеотидами методом случайного прайме-ia с использованием набора для меченая ДНК фирмы Fermentas (Литва)

соответствии с инструкциями изготовителя . Пробу для анализа (НК-белковых комплексов методом задержки подвижности в геле [етили 33Р - или 33 Р-дезоксинуклеотидами путем достраивания 3' конов фрагментом Кленова.

9.Выделенне белков ядерного экстракта. Белки ядерного экс-ракта выделяли по методу Баснакьяна с соавт.(Баснакьян и др.,1989), с

модификациями. Для получения экстрактов, содержащих октамер-связываюшие белки, в буфер добавляли NaCl до конечной концентрации 0.42 М . Для получения экстрактов с нуклеазной и топоизомеразной активностью, ядра инкубировали в буфере того же состава, но содержащем 1 М NaCl и 10 тМ ЭДТА. Концентрацию белка в экстрактах определяли по Брэдфорду с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта (Bradford, 1976).

10. Исследование ДНК-белковых комплексов проводили по методу Шрайбера( Schreiber et al.,1985)

П.Нуклеазную активность in vitro определяли по методу Баснакьяна с соавт.(Баснакьян и др., 1989).

12,Определенне активности ДНК-топонзомераз проводили по методу Дюгэ с coaeT.(Dugue et al., 1983). Активность ДНК-топоизомеразы I определяли по релаксации суперскрученной плазмидной ДНК. Активность ДНК -топоизомеразы II определяли по АТФ-зависимому образованию катенанов из суперскрученной формы плазмиды pBR-322. Интенсивность электорфоретических полос, соответствующих различным формам ДНК плазмид определяли путем денситометрирования фотопленок на денситометре.

13.Карнолоп1ческий анализ клеток проводили согласно описанной ранее методике (Гринчук и др. 1994). Статистическую обработку результатов проводили с использованием критериев достоверности Стью-дента и Фишера(Лакин,1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 .Изучение синтеза ИГ клетками мышиных миелом и гибридом в присутствии АД. Анализ синтеза ИГ в клетках миелом Sp2/0 и SpEBR-5, обработанных АД, показал, что препарат индуцирует обратимое усиление синтеза тяжелой, и, в меньшей степени, легких цепей ИГ. Синтез ИГ достигал максимума в течение первых 24 ч. культивирования клеток с АД и снижался до первоначального уровня спустя 48 ч. инкубации с препара-

том. Стимуляция синтеза ИГ возрастала дозозависимым образом вплоть до концентраций АД, не превышающих значения ЬОзо (концентрации препарата, приводящего к 50% снижению выживаемости клеток), составляющих для клеток Бр2/0 и БрЕВЯ-З 0.05 и 1 мкг/мл соответственно. Характерно, что низкие концентрации АД, к которым были устойчивы клетки 5рЕВЛ-5, не оказывали влияния на синтез ИГ, а при значениях ЬОго стимуляция синтеза была выражена сильнее на клетках линии 8рЕВЯ-5(табл.1).

ТАБЛИЦА 1. Усиление синтеза тяжелых цепей ИГ в клетках Бр2/0 и 5рЕВЯ-5, культивировавшихся с АД в течение 24ч (по данным денситометра, в процентах от контроля).

Концентрация

АД,.мкг/мл Бр2/0 БрЕВЯ-5

0. 01 150 100

0. 05 200 100

0.10 *- 130

0.50 - 178

1.00 - 380

*- Гибель клеток через 24 часа

Аналогичные результаты получены также на клетках мышиной В-клеточной гибридомы 1р7 (ЬО50 к АД- 0.1 мкг/мл ) в интервале концентраций АД 0.05- 0. 2 мкг/мл. Индуцируемое АД усиление синтеза ИГ полностью подавлялось 24ч. сывороточным голоданием клеток.

Методом проточно-цитометрического анализа было установлено, что обработка клеток АД в концентрации ЬОзо через 24ч приводила к аккумуляции более чем 50 % клеточной популяции в фазе в: клеточного цикла. Эти данные позволяют полагать, что усиление синтеза тяжелой цепи ИГ сопряжено с остановкой клеточного цикла в фазе С:.. С этим предположением согласуются и данные о подавлении эффекта стимуляции

синтеза ИГ АД при сывороточном голодании клеток (при их переходе i стадию Go).

2.Аналнз экспрессии гена тяжелой цепи ИГ в клетка? миелом и гибридом, обработанных АД. Методом Нозерн-гибридизацш РНК клеток указанных линий с фрагментом константного участка ген; тяжелой цепи ИГ Су2Ь, мы показали возрастание содержания мРНК тя желой у2Ь цепи ИГ в клетках Sp2/0 и SpEBR-5, обработанных АД. Содер жание мРНК достигало максимума через 24ч и снижалось до уровня не обработанных клеток через 48ч инкубации с АД. Из этих данных мы еде-лали вывод, что усиление синтеза тяжелой цепи G2b ИГ обусловленс возрастанием экспрессии у2Ь гена . Усиление экспрессии у2Ь гена, индуцируемое АД, подавляла 8ч предынкубация клеток с циклогексимидом, чтс свидетельствует о зависимости данного феномена от белкового синтеза de novo.

З.Изменення в ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора Oct-2 в клетках миелом и гибридом под воздействием АД. Мы исследовали также воздействие АД на экспрессию ДНК-связывающей фор мы другого белка тканеспецифическим образом экспрессирующегося в клетках В-лимфоцитраного происхождения- транскрипционного фактора Oct-2. Oct-2 специфически взаимодействует с октамерной последовательностью в составе промотора и энхансера тяжелых цепей, промотора легкой к цепи ИГ и является одним из основных транскрипционных факторов, контролирующих транскрипцию генов ИГ. Методом задержки подвижности ДНК-белковых комплексов в геле(ретардации) в клетках исследованных линий мы выявили два конститутивно экспрессирующихся ок-тамер-связывающих фактора: универсальный транскрипционный фактор Oct-1, контролирующий экспрессию генов "домашнего хозяйства" и лим-фоидспецифический фактор -2, по молекулярной массе совпадающий октамер-связывающим фактором Oct-2B из B-клеток человека( рис.1). Обработка клеток как чувствительной, так и устойчивой линий миелом

АД приводила к увеличению содержания ДНК-связываюшей формы Oct-2 в ядерных экстрактах клеток. Содержание ДНК-связываюшей формы белка Oct-1 при этом оставалось неизменным. Кинетика усиления экспрессии белка Oct-2 совпадала с кинетикой усиления экспрессии 72b гена.

РИС.1. Анализ состава октамер-связывающих белков из клеток различных линий методом задержки подвижности ДНК- белковых комплексов в геле.(Схе-ма).1-Не1_а;2-Мата1\лга;3-ЗрЕВР?-5; 4-БрЕВР-5, обработанные АД 24ч.

Эти данные свидетельствуют о том, что усиление экспрессии гена тяжелой цепи ИГ, по крайней мере частично, происходит на транскрипционном уровне, вследствие усиления активности промотора и (или) эн-хансера тяжелой цепи ИГ. Возрастанием экспрессии Oct-2 белка, в частности, можно объяснить и факт незначительного усиления синтеза легких цепей ИГ, поскольку Oct- 2 взаимодействует и с октамерным мотивом в составе промотора к-гена. (Staudt, Lenardo, 1991).

4.Анализ кариотипических изменений в клетках.обработанных АД. Кариологический анализ клеток гибридомы IF7, обработанных АД в режиме, индуцирующем усиление экспрессии у2Ь гена и транскрипционного фактора Oct-2, выявил тенденцию к снижению ка-риотипической гетерогенности: уменьшению разброса числа хромосом, частоты встречаемости атипичных двуплечих хромосом, образованных в результате случайных межхромосомных сцеплений.

-145. Индукция апоптоза в клетках миелом и гибридом под воздействием АД. Дальнейшие исследования показали, что наблюдаемое усиление экспрессии 72b гена и белка Oct- 2 предшествовали апоптоти-ческой гибели клеток, культивировавшихся с АД в указанных выше концентрациях (0.01- 0.05 мкг/мл клеток Sp2/0, 0.2- 1 мкг/мл для SpEBR-5, 0.05-0.2 мкг/мл для IF7). Картина характерной для апоптоза межнуклеосомной фрагментации ДНК наблюдалась уже спустя 48 ч инкубации с АД, параллельно со снижением синтеза ИГ до первоначального уровня. Проточно-цитометрический анализ показал, что спустя 48ч в популяции клеток наблюдается дальнейшее увеличение доли клеток с остановкой в фазе G: и появление апоптотических клеток. Спустя 72 ч около 70% клеточной популяции вывляло характерные морфологические черты апоптотических клеток. Следует отметить, что при обработке более низкими концентрациями АД, не оказывающими влияния на синтез ИГ через 72ч, доля апоптотических клеток не превышала 10%

Таблица 2. Фрагментация ДНК клеток Sp2/0 и SpEBR-5 в культеи-ровавшихся в присутствии АД (мкг/мл) 48ч (в процентах от тотальной ДНК клеток ).

Условия эксперимента Sp2/0 SpEBR-5

АД(0, 05) 74, 2±2, 5 *

АД(0, 10) _ 30, 8±2, 2

АД(0, 50) _ 52, 1±2,0

АД(1, 00) 78, 2±4, 6

АД(0, 05)+ЭГТА(1мМ) ' 76,2 ±6, 8

АД( 1, 00) +ЭГТА (1м М) - 44, 7± 5, 2

*-фрагментацию ДНК не определят

(табл. 2) . Эти данные позволяют предполагать, что усиление экспрессии у2Ь гена, белка Oct-2 и апоптоз являются взаимосвязанными процессами.

Кроме того, мы выявили различия в биохимических механизмах апоптоза, индуцированного АД в клетках чувствительной и устойчивой миелом. Культивирование клеток Sp2/0 с АД в присутствии хелатора ионов кальция ЭГТА не предотвращало апоптотической деградации ДНК клеток , что говорит от независимости апоптотического процесса в этих клетках от внутриклеточного содержания ионов Са2+. В клетках же устойчивой к ядам миеломы SpEBR-5 ЭГТА в значительной степени предотвращал фрагментацию ДНК (табл. 2). Исследование профилей нуклеазной активности ядерных экстрактов клеток Sp2/0 и SpEBR-5, обработанных АД и колхицином, показало, что в клетках чувствительной миеломы Sp2/0 выявляются две формы эндонуклеазной активности: Ca:+-Mg-+ -зависимая эндонуклеазная активность и катионнезависимая нуклеазная актвность при кислых значениях pH. Кислая катионезави-симая нуклеазная активность, согласно литературным данным, соответствует ДНКазе II (Barry et al., 1993). Предполагается, что ДНКаза II активируется при закислении внутриклеточной среды при апоптозе (Stewart,1994). В то же время в ядерных экстрактах клеток SpEBR-5, подвергающихся апоптозу в присутствии АД и колхицина выявлялась лишь Ca2 -Mg2+ -зависимая нуклеазная активность. Отсутствие сколько-нибудь значительной кислой эндонуклеазной актвности в клетках SpEBR-5 отчасти может быть объяснено высокими значениями внутриклеточного pH, характерными для многих клеточных линий с множественной лекарственной устойчивостью (Keizer, Joenje, 1990; Gottesman, Pastan, 1993). Эти результаты позволяют предполагать, что профиль нуклеазной активности, выявляемой при апоптозе, является конститутивной особенностью данной клеточной линии и не зависит от выбора агента, инициирующего апоптоз.

Совокупность представленных данных свидетельствует о том, что усиление экспрессии тканеспецифических белков в клетках мышиных В-клеточных линий, предшествует появлению видимых признаков апопто-за, то есть ассоциировано с его латентной фазой.

6. Анализ экспрессии гена тяжелой цепи ИГ и механизмов лекарственной устойчивости в клетках двух сублиний гибрндомы IF7. устойчивых к БЭ и АД. Мы предприняли также попытку проследить судьбу индуцибельных изменений в экспрессии генов ИГ при кратковременной обработке АД в процессе селекции клеток на устойчивость к АД. С этой целью мы провели анализ экспрессии гена тяжелой цепи ИГ в двух сублиниях гибридомы 1F7, отселектированных на устойчивость к БЭ и АД. Результаты Нозерн -гибридизации РНК клеток с Су2Ь зондом показали, что в клетках гибридомы IF7, устойчивых к АД, конститутивно усилена экспрессия тяжелой цепи(в 3.5 раза по данным денситометра) в сравнении с клетками исходной линии IF7 . Нам, однако, не удалось зафиксировать изменений в ДНК-связывающей активности белка Oct-2 в клетках устойчивой к АД линии.

Кроме того, мы провели сравнительный анализ механизмов лекарственной устойчивости линий IF7-EBR и IF7-AD. В клетках обеих линий мы обнаружили одинаковый уровень экспрессии гена mdrl. В качестве специфической детерминанты устойчивости к АД мы исследовали активность ДНК- топоизомеразы II, основной внутриклеточной мишени АД , в клетках линий Sp2/0 ,1F7 и их устойчивых вариантов. Из табл. 3, видно, что в клетках всех устойчивых вариантов активность ДНК-топоизомеразы II снижена в сравнении с клетками родительских линий. Незначительное снижение активности ДНК-топоизомеразы II в устойчивых к БЭ линиях является, по-видимому, следствием координированной регуляции генов ДНК- топоизомеразы II и mdrl по типу отрицательной обратной связи (Chin et al., 1990), в то время как более значительное (в 4.5 раз) снижение активности ДНК-топоизомеразы II в клет-

ТЛБЛИЦА 3. Активность ДНК-топоизо.нераз(ЕД/мг белка) в ядерных эк-трактах миеломы Sp2/0, гибридомы IF? и их устойчивых вариантов.

Sp2/0 SpEBR-5 IF? 1FTEBR IFjAD

ДНК- топоизмграза 1 2670 2320 2479 2198 2265

ДНК- топоизомераза II 1080 580 1210 610 258

ках IF7 -AD, на наш взгляд, является специфическим компонентом фенотипа устойчивости к АД. Активность ДНК-топоизомеразы I в проанализированных клеточных линиях практически не различалась (табл.1). Таким образом, мы показали, что индуцибельное усиление экспрессии гена тяжелой цепи ИГ в клетках мышиных B-клеточных линий сохраняется в качестве конститутивной черты фенотипа устойчивых к АД клеток. О механизмах координированной регуляции гена тяжелой цепи ИГ и ДНК-топоизомеразы II можно судить лишь предположительно. Известно, в частности, что сайты узнавания ДНК-топоизомеразы II в составе регионов прикрепления хромосом в ядерному матриксу-MARs (matrix attachment regions) фланкируют энхансер тяжелой цепи ИГ и регулируют его активность (Forrester et al.,1994). Изменение топологической конформации различных участков гена тяжелой цепи ИГ вследствие негативной регуляции активности ДНК-топоизомеразы II может существенно, злиять на скорость транскрипции гена (Parin, Sharp, 1993). Кроме того, :нижение активности ДНК-топоизомеразы II в устойчивых к АД клетках чожет приводить к формированию более дифференцированного фенотипа, поскольку негативная регуляция ДНК-топоизомеразы II характерна для процесса днфференцировки нормальных и опухолевых клеток гемопоэтического происхождения (Constantinou et al., 1989; Kaufmann :t al.,1991; Rappa et al.,1991).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Мы рассмотрели изменения в экспрессии тканеспецифических бел ков- иммуноглобулинов и транскрипционного фактора Ой -2 - в клетка) мышиных В-клеточных линий в процессе формирования ответа клеток ш воздействие противоопухолевого антибиотика АД. Мы, в частности, по казали, что усиление экспрессии тканеспецифических белков в В-клетках предшествует появлению видимых признаков апоптоза, и, возможно, ас социировано с его латентной фазой. Факт конститутивного закреплена индуцибельных изменений экспрессии гена тяжелой цепи ИГ в фенотипе устойчивых к АД клеток свидетельствует о его сопряженности с формированием механизмов устойчивости к АД . Мы предполагаем, что таким механизмом может являться негативная регуляция ДНК-топоизомеразы II.

ВЫВОДЫ

1. При кратковременной обработке (24ч.) АД клеток мышиных миелом Бр2/0 и ее сублинии 8рЕВЯ-5, устойчивой к БЭ, в клетках обеих линий наблюдается усиление синтеза тяжелой у2Ь цепи ИГ и, в меньшей степени, легких цепей ИГ. Усиление синтеза тяжелой цепи ИГ обусловлено усилением экспрессии гена тяжелой цепи ИГ и сопровождается увеличением содержания ДНК-связываюшей формы лимфоидспе-цифического транскрипционного фактора Оа-2 в ядерных экстрактах обработанных АД клеток.

2. Усиление экспрессии гена тяжелой цепи ИГ и белка Ос1-2 в клетках Бр2/0 и БрЕВЯ-б под воздействием АД предшествует появлению биохимических и морфологических признаков апоптоза.

3. Индукция апоптоза в клетках Бр2/0 не зависит от внутриклеточного содержания ионов Са3+ и ассоциирована с активацией как Са:+ -Мд3+-зависимой, так и кислой катионнезависимой эндонуклеазы. В

клетках с множественной лекарственной устойчивостью SpEBR-5 наблюдается активация лишь Са:+-К^:"-эндонуклеазы.

4. Многоступенчатая селекция клеток гибридомы IF7 в присутствии АД приводит к образованию вариантов, характеризующихся конститутивно усиленной экспрессией гена тяжелой цепи ИГ. Повышенная экспрессия гена тяжелой цепи ИГ в клетках гибридомы, устойчивых к АД, коррелирует с негативной регуляцией активности ДНК-топоизомеразы II.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Т.К. Давтян, М.Б. Меликсетян, Т.Н. Игнатова, Ю.Т. Алексанян. Адаптивный ответ B-клеток в культуре на действие цитотоксических агентов. I. Стимуляция синтеза и секреции иммуноглобулинов клетками мие-лом, гибридомы и лимфоцитами периферической крови человека под влиянием адриамицина и бромистого этидия.// Цитология .-1993.-Т.35.-N.4.- С.54-60.

2. Т.К. Давтян, М.Б. Меликсетян, Т.Н. Игнатова, Ю.Т. Алексанян. Адаптивный ответ B-клеток в культуре на действие цитотоксических агентов. II. Взаимодействие иммуноглобулинов с адриамицином и бромистым этидием.// Цитология .-1993.-T.35.-N.6/7 С.91-98.

3. М.Б. Меликсетян,Т.К. Давтян, И.В. Иванова, Ю.Т. Алексанян, Т.Н. Игнатова. Адаптивный ответ B-клеток в культуре на действие цитотоксических агентов. III. Возможный механизм влияния адриамицина на синтез иммуноглобулинов клетками мышиной миеломы.// Цитология.-1993.T.35.-N.6/7.- С. 98-102.

4. М.Б. Меликсетян, Е.В. Березкина, М.А.Павленко,И.В.Чиркова, JI.A. Алексеенко, Ю.Т. Алексанян,Т.М. Гринчук. Экспрессия генов иммуноглобулинов в клетках мышиных B-клеточных линий в процессе формирования множественной лекарственной устойчивости при селекции клеток

-гона устойчивость к адриамидину.// Тезисы докл. всеросийскго совещания "Биология клетки в культуре"(С-Петербург, 1995).

5. М.Б. Меликсетян, И.В. Чиркова, Ю.Т.Алексанян. Нуклеазная активность ядер чувствительных и устойчивых к цитотоксическим препаратам клеток мышиной миеломы sp2/0, подвергающихся апоптозу в присутствии адриамицина // Цитология (в печати).

6. М.В: Melixetian, Yu.T. Alexanyan Adriamycin-resistant hybridoma cells display higher levels of immunoglobulin gene expression compared to parental drug sensitive line.// In: "Abstracts of the Joint AACR Conference "Modern Developments in Cancer Therapeutics" (Taipei, Taiwan, 1994).

7. M.B. Melixetian, I.V. Chirkowa, Т.К. Davtyan, Yu.T. Alexanyan. Enhancement of immunoglobulin synthesis in mouse myeloma cells following adriamycin treatment precedes programmed cell death// In: "Abstracts of the XHI-th Meeting of European Association for Cancer Research (Berlin, Germany, 1994)."