Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение индукции иммунного ответа лимфоцитов периферической крови человека IN VITRO

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение индукции иммунного ответа лимфоцитов периферической крови человека IN VITRO"

р г 6 ФЙВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Г/,;' На правах рукописи

ДШЯН ТИГРАН КАШЕВЭД

ИЗУЧЕНИЕ ШЩКЦШ ШУВШГО ОТВЕТА ЛИМФОЦИТОВ ПЕЭДФЕИГЗСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА, иг тптно

03.00.15 - генетика

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван- 1993

Работа выполнен в НИИ эпидемиологии, вирусологии и медицинской паразитологии им. А.Б.Алексаняна Минздрава Республики Армения ж в Институте цитологии РАН,

Научные руководители: доктор хадацииских наук, ' члеа-корресловдена Национальной Академии Наук РА

B.Т.АЛЕКСШШ

доктор биологических наук, профессор Т.Н. ИГНАТОВА

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

C.С.ТАШ1Р0В

кандидат биологических наук, доцент Т.Ф.САРКИСЯН

Ведущее учреядение - Институт молекулярной биологии Национальной Академии Наук РА

Защита состоится " -&Т 1993 г. в " " час на

заседании Специализированного Совета КО. 55,01.04 по генетике щ Ереванском Государственном университете по адресу: г.Ереван, " ул.Чаренца, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в (библиотека ЕЕУ.

Автореферат разослан " П * ,(? 8 1993 г.

Учет 2 секретарь Специализированного Совета кандидат биологических наук

'ЛЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■ Актуальность проблема. Изучение способности лимфоцитов к формировании иммунного отзета в культуре является одной из актуальных проблем генетики соматических меток и юлекулярно-клетгчной иммунологии.

Система имяуноксшетентных клеток in vitro представляет значительный интерес для выяснения в контролируемых условиях внг организма молекулярно -клеточных и генетических механизмов первичного и, вторичного ищунного ответа на различные ант ?ены. В этом аспекте значительные возможности открывает модель индукции иммунного ответа лимфоцитов периферической крови "ело^ека (ЛПКЧ) in vitro ( Bounps et al., 1990; Fisher et al., 1991; Pollok et al., 1991). Иммунизация культивируемых лимфоцитов человека создает во-змоаности для проведения работы, по выяснению в условиях генетического контроля силы иммунного отвечу на различные антигены (возбудителей инфекционных болезней, синтетические антигены, вакцин и т.д.). Черезшчайно ценным для ва^танации является подход по предварительно»,./ (до иымунизацп) определении' с эсобности индиввдууи:„ реагировать на данный антиген и внястшго проделай тельности иммунологической памяти па вакцинт-з препараты Р.В.Петров, Р.М.Хаитов, IS88).

•В литературе имеются немногочисленные дгшые, посвященные изучению всзмоякос-ш иммунизации Л1ШЧ в культуре (Huiieta et а., 1939;ölaccy,Koda,1990;Carrol et al.,1990). 3a последние годк был) показано_( что ЛПК*1 обработанные лизосомотпопным агентом - метиловым зфиром Ъ -лейцина Отй-ОМв) , способны отвечать на растворимый антиген в клеточной культуре с образованием клеток, сштези-рущкк а гитела к исьользоваячому антигену С^оггеЪвсск et al., 1987; Borrebaeck, 1938 ). Однако, продолжают ос .аваться недостач точно выясненными механизмы индукции первичного и вторичного зш-мунного ответа культивируемых лшфоц^ов человека, обработав ж. как Лей-О'Ле, так и другим.. биологически г-стивными соединениями. В связи с этим значительный интерес представляет недостаточна изучен нй вопрос о действии цитогоксических препаратов на индукцию иммунного ответ' ЛПКЧ на различшз антт^ш в культуре. ,пля выя нения механизмов регуляции канунного ответа лпг.гТюцитои в культуре представляет большой штерео также изучение взаимодействия аТхректорных клеток, обработанных Лей-О.Мо или ц..готокслчес-

. - - 2 -

кнми препаратами, с культивируемыми мутантными клетками-мишенями, характеризующимися г.шокествешюй лекарственной устойчивостью

СТУ).

Учь-швая большие перспективы использования человеческих моно-клоналышх антител (ЧЖА), получение этих иммуноглобулинов тлеет не только огромный фундаг.. .нгадьный: интерес, но и большое прикладное значение. В этом аспекте весьма ценным методическим подходом является использование' иммунизированных in vitro' лимфоцитов человека для поу^гчения гибридов соиап. веских кле ток, продуцирующих ЧМКА., Однако в литературе имеются лишь единичные работы по изучении возможности иммунизации ЛПКЧ в культуре и юс использованию ДЛЯ получения гибридом, иродуцирувдих ЧМКА. ( Borrebaeck, 1988; Thompson, 1988 ).

Цель исследования. Целью настоящей работы являлось изучение индукции гуморального и клеточного иммунного ответа ЛПКЧ в культуре клеток и п"яснение возмокности использования иммунизированных in vitro JEM для получения гетерогибридом, продуцирущих ЧМКА..

Задачи исследования. В соответствии с целью исследования.: работ' били поставлены следующие задачи: • .

1. Изучить Б03М0ШЮСЯ1 шщугацш in vitro первичного и вторичного иммунного ответе ЛПКЧ,' обработанных Лей-ОМз, на различные

антигещ,

2. рчяс1гнть влияние цитотоксических препаратов (адриамицина и бромистого этидия) на индукцию ищушиго ответа ЛПКЧ, синтез иммуноглобулшов гибридными и миеломными клетками в культуре.

3. Изучить взаимодействие ЖКЧ с родительскими и мутантныш клекшш-шшеняш с фенотипом МНУ.

4. Получить продуцирующие ЧМГЛ гётерогибридощ, исследовать генетическую стабильность этих гибридов и продолжительность продукции ш тноклокальшх антител.

Научная нбвизна. Изучено влияние Лей-ОМе на функциональную активность ЛИ в культуре и показано, что в зависимости от использованной модели шщукцип иммунного ответа in vitro Лей-ОМе проявляет либо тмуносупрессорную активность, подавляя поликло-надьную активацию ЛПКЧ патогеном лаконоса, либо тллуностимудирую-цуп актЕ жостс сталирует вторш-гый иммунный ответ В-лимфоци-гов к вирусу гршша человека.

о

Впервые установлено, что для индукции вторичного иммунного ответа ЖШ в культуре необходимо использовать антиген в растворимой форме.

Впервые обнаружено, что как антигенная, так и митогенная стимуляции ЛПК в культуре усиливается в присутствии клеточных ядов -' адриашцина и бромистого этидия. Бромистый этт'ций стимулировал синтез и секрецию иммуноглобулинов ЛПКЧ и В-клеточгшш п Зрвдо-

№Ш»

Впервые выявлено, что сокультивирование стимулированных што- ■ генами ЛПК" как с клетками мышыых фибробластов ь S29, т°к и о ее оублшшями с фенотипом МЛУ, шдуцирует продолжительную пролиферацию лимфоцитов человека, продуцирующих иммуноглобулины, ростовыэ и цитотоксические факторы. Обнаружено, что эффектор иммунной системы (естественные киллеры, штоген-активировашше дап4оциты> оказывают цитогоксическое действие как на чувствительные к клето- • чшм' яда1л клетки-шпени, так и на их мутантные субклоны с ^елоти-пом ШУ. Мутантные клотки-шппени с фенотипом ШУ более, чувствительны к векторам иммунной системы* чем их", родительские линии.

' Впервые установлено, что использование кл ток мышиной миелош с фенотипом МЯУ обеспечивает высокую эффективность гибрдпзации с лимфоцитами человека и синтез им^;ноглобулшов." Продукция ЧМКА. гетеротебрэдомат,га характеризуется нестабильности вследствие образования быстросегр'егирущих гибридных,ioieток. .

Практическая значимость работы. Ивдукция т.ъупяото ответа человеческих лимфоцитов в.клеточной культуре открывает новые возмо-ниости дая_определения продолжительности иммунологической ламя1^ к вакцинным лретараТ'-ч с целью выяснения сроков и условий ревакцинации населения.

Значительный интерес представляет система человеческих лимфоцитов in v; го для изучения генетического контроля cram ипмугою-го ответа на вакцкчнке препараты с целью разработал принципа индивидуализации вакщш.

Иммунизация лимфоцитов человека in vitro к любым антигенам расширяет возможности получения ЧМКА как метода!® гибрздомной технологии, таи и ие годах,щ генетической инженерии с цельп использования е лас гчтигел для диагностики, • профилактики и лечения болезней человека.

Се ;ергизм в действии цитотоксических препаратов о эффекторами

ищушой системы открывает ноше возможности для иммунотерапии опухолей с множественной лекарственной устойчивостью.

Использование клеток мышиной миеломы sîebr-5 и отбор гибридов в селективной среде HAT + бромистый этвдий, может обеспечить пол} чение монохромосомных гибридов человек-мышь и гибридов с ре-комбинангшш хромосомами человека для анализа генома человека с , целью картирована генов, детершдаругацих наследственные болезни.

Апробация работа. Материалы диссертации докладывались на конференции молодаых ученых НИИ ЭВиШ км, А.Б.Алексаняна (Ереван, 1989), на коафер^адни "Актуальные вонрс -¡ы краевой инфекционной пртологии". (Ереван, 1990), на Всесоюзной конференции "Геном чело-века-90" и "Геном человека-'Л" (Москва, 1990, 1991), на конференции "-..¿гуальные вопросы эпигемиологии", посвященной 100-летию со дня рождения А.Б.Алексаняна Ереван, 1992), на шалабораторном научном семинаре Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 1992) и на заседании * некого совета НШ ЗВиШ им, А.Б.Алексаняна {Ереван, 1992),'

Публикации. По теме диссертация опубликовано II работ.

Объем и с 'руктура работ. Диссертация изложена на стр. . машинописного текста и состоят йз введения, обзора литературы, описали.' материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуадекия, выводов и списка литературы, содержащего 318 публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 1Я рисункам и S таблицами. ,

• ^МАТЕРИШ И МЕТОД! юздшш'

В работе оыли использованы-следующие линии ;щтольно культивируемых клеток; клетки шшшой ийеломы линии sp2/o-AgI4 и ее суб-кл'он SPE3H -5, устойчивы!! к 6 мкг/мл брощотого этидая (Е.В.Береэ-К! а, Т.Н.Игнатова, IS89), линия плазмоциташшх клеток ыышай трансфорглировашне шшпше фибробласты лшии Ь 929 и устойчивые соо вотственно к 3 мкг/мд.и 50 мкг/мл бромистого этидая клоны згой ку.ïbтуры - ЗГс-5 и SÛEi (К.В.С&шшков, 198?); клетки эритро-лейнвмии чеяог ^ка линии К562 и ее субклоны ВЗ и 09 -, устойчивые й 3 мкг/ьиг ацрншицика и'*Н.Игнатова,. 1990, .991); лимфобластовд-ныо гаетха человека линии Hanalva.. ..'

•ШКЧ.выделяла в градиенте плотности îicoll-paque центрифухи-рованяец птц 1?Г0 об/шн 45 ша. ШЛЯ культивировали в среде

1640, содержащей 50 мкМ 2-меркаптй этанола, 80 ымг/мл гентглшадгаа, 2 ¡ü ь-глюгамина, I мМ шрувата иатрш й 10% эмбрионаш: й телячьей сыворотки (ЭТС).

Выделение Т- и В-лкмТшптоя человека проводили с помощью ро-зеткообразоваиия с оритпоциташ барана, обработанными нейрамини-дазой по методике Daniei3son efc al., 1907 '. ^тя удаления Т-супрео-соров обогащенную популяцию Т-лшфоцитов человека облучали на кобальтовом облучателе ЖУ-50 дозой 2000 рад.

Для обработки ЛПКЧ эфирамиг,-лейцина (Лей-ОМе или Лей-Лей-ОМе) использовали стприлыше раствора, сод жащиа 2,5 гЧ Лей-ОМе или , 0,25 мМ Лей-Лсй-ОМе. Обработку ыо.^онуклеаров проводили по описашгой в литературе методике ( Thiele, Lipsky, 1986 ).

Кондиционированные с роды (КС) активированных згогенами икму-нокомгетентчшх клеток получали с помоасыо культивирования нефх-ак-' ционировашшх ЛПКЧ или Т-лицроцитов челе эка в присутствии I мкг/ мл фитогемагглютшшна (ФГА) или 10 мкг/цл штогена лаконоог.. (МЛ) соответственно в тече1ше 72 ч и 24 ч.

. Имц/низацию дпкд. in vitro проводили в 24-лупочшх планшетах (Nunc). ЛЖЧ, обработанные или необработан' :е Лей-ОМе в количестве 3,5«106 ресуспендировпта в среде пин-1640, содерг^чей 50 i.no'.I 2-меркоптоэгаиола, 10% ЭТС, 2Г ДП/ш рокомбдаантшго интер-лейкина-2 (Ш1-2) ( Boheringer Mannhein ), 100 ГЧДш ^-иптеА Jepo-на, 25% супернатанта облученных Т-линфцитой человека, стимулированных МЛ или ФГА-активировшшых ЛПКЧ, антител в концентрации 1-5 мкг/кя и инкубировала в течение :4~? дней при 37° в атмосфере, ' >-дершцей 6% С02. В качестве антигенов при проведении экспериментов по имм^шзащш лимфоцитов человека в, культуре использовал^ дифтерийный анатоксин (ДА), получений из ЦыШ вакцин и шээроток им» И.И.Мечникова, 1шактивирова1..шй ультрафиолетовым облучением-штамм Н4НЯ Н2 вируса гриппа человека типа А, предоставленный Центральным институтом усовершенствования врачей v фикобилин (Фико-эритрин) (sisma). В некоторых экспериментах использовали инакти-вированную сыворотку человека группы копъюгировашшй с.золотистым стафилококком ДА (I ■ -тгсг/fлл)» адриашцин (0,05 мкг/ш) и бромистый этпдий vImkt/ш). Иммунизированные в'культуре ЛПКЧ по-, пользовали в,экспериментах по гибридизации соматических клеток в . культуре, а .дцосадочную жидкость - для определения классов иммуноглобулинов :i специфичности синтезируемых антител. ■.■,-■..

.кгзд/ноферглпнтшп"! анализ' (№М) при опре^елениг классов секре-

тируемых иммуноглобулинов проводили согласно методике Jahn et al., 1986 . ЩА антител к ДА проводили общепринятым методом (Т.Г.Нго, Г.Ленхофф, 1988). В качестве позитивного контроля использовали смесь I, 10 нормальных сывороток человека, а оптическую плотность продуктов ферментативной реакции шраясали в условных единицах относительно контроля (ЗД/ь..).

Отдельные атттителообразущие. клетки (АОК)' выявляли с помощью ЩА па нитроцеллюдозных фильтрах, покрытых исследуемыми антигенами ш описании в литературе методик^ (Holler, Borrebaack, 1985).

Реакцию бласттргчсфорг.адш проводаиш .в 96-луночных кругло-донных микропланшетах. ШШЧ в концентрации 2.10® клеток в ш сре-, да НШ1-1640, содеряащек 1-5 миг/мл МЛ или 2 мкг/мл ФГА, наносили в лунки мшсропланшета п^ 0„2 ш в лунку. Клетки культивировали в т чение 72 т при 37°0 6$С02 и за 18 ч до окончания культивирования добавляли в лунки микропланшета %-тимвдин (0,25 ИЕК/мл). . . Вадиогкишгостт- проб определяли на г цшпшвдионном счетчике

Beckmon.

Реакцию непрямой имлуно(Тшюоресцешдаи (РШФ) для определения популяций и субпопуляций ЛПКЧ проводили согласно описанной методике (Thiele, Lipsky, 1986). Шли использованы моноклональные антитела (В01Щ А1Ш СССР) и меченый' ФИТЦ ангиишуноглобулины мышей к различным поверхностным манерам лгшфоци.ов человека.

Уровень 1Г1тотсд{окческой активности активировшшых ЛПК и их КС определяли калориметрически при длине волны 540 нм по Balooh et al., 1990. В качестве клеток-мишеней (КМ) в цитотоксическом тесте были ..столь зованы шшшые' трансформированные фибробласты линии ' ь929 и мутантные субклоны 3 ьа-5 и 50 L. Цитотоксический индекс (ЦИ) определяли по формуле '

1М - ( т оптическая плотисть в опыте \ . tqq ^ ; .оптическая рлотность в контроле ' .

. Активность естественных киллеров в популяции ШШ определяли в цктотокси.jском тесте с исподез'ЬВанием в качестве КМ клеток ли-е ± К552, ВЗ к С9. КМ инкубиро.вали с 3Н-уридином (0,11 ИШ/мл) в течение 2 ч при 37°С, отмывали центрифуги; ованием' и суспендировали в среде RRü-1640 для культиви'ровштя еще на 2 ч при 37°С. Цитотоксический тест проводили по ранее' описанной методике (МЛ» гцкова и др., 1981) в пластиковых крзтлодонных микроплашетахс :io osoHViEBH сокультивирования ЛПК- И меченых 3Н-уриднноы Kf.!, радвасктпвность проб определит ш сдантилляционнсм счетчике

Весктал. ЦП определяли по формуле

Ш1 в ( I TMCJI°'импульсов в опыте \ , ТОл ■ . . число импульсов в контроле '

Биосинтотическое мочение белков клеток гибридом (шелом) и ЛПКЧ проводили в среде '^vffi¡M, содержащей 0,05 МЕК/мл ^ в-метио-нина. 1й1мунопрецип11тацию ^ s-меченых белков проводили по методике .

ДСН-ПМГ электрофорез иммуноглобулинов меченых ^ s-метиоьи-ном проводили по. методике, опи ашюй Л.Дэйгто и М.Браун, 1990. • По окохгчании электрофореза гель фиксировали, окрашивали Кумаси F250, высушивали и экспоштровали с рентгеновской пленкой при -70°С в течение 7 дней.

' Гибридизации соматических клеток в культур проводили по ; тодаке Jahn efe al., 1989 с к пользованием ПЭГ с мм 1000 (Merk ). В экспериментах по слиянию клеток использовали лишь культур" мышиных миеломшх клеток, не содеряащх ревертгптов, которые имели бы фенот-.ш ГГЗРТ^ и могли бы расти на селективной среде ГАТ. Мие-лог.ше клетки бшш выведены в логарифмическуто фазу роста на седьмой день до слияния клеток. Через 24 ч после проведения слияния клеток в культуры добавляли компоненты ч,элективной среда, ГАТ (0,4 Midi аг.ошоптерщ, 16 мнМ тш/щдин, 100 мкМ гипокоантин). При использовании в. качестве т^юртсотэируздого партнера клеток мышиной шеломы линии spebr-5, в селективную среду ГАТ добавляли такке бромистый зтидий в ковдентращга I mictAv».

lOioiHinogciime и решюнировшгпе гибридов соматических клеток и г 'одуцентов 41,ША осуществляли путем лшитирукщих р, зведоний ("', Дж.Ыаи-Керн, 19ЬЗ). ,'

Клрподог.-^чсстй анализ глетаф^зных пластинов метровых ги<3-ретов соматических: глоток проводили следующим образом: для нако-'плешот мититируюп'лх клеток в среду с клетками добавляли колхицин на 1,5-2 ч в концентрации 0,2 мкг/мл. Затем клетки обрабатывали гдаотошгческим раствором (0,075 U KCl), после чего фиксировали смесью метилового спирта с ледяной уксусной кислотой (3:1). После продолгмтелько-1 шеугашгииш' препаратов при комнатной температуре, хромосомы, предварительно обработайте 0,25$ раствором трипсина, JU-ЕФег лщпально окрагаашш раствором красхси Гимза ча фосфатном буфере (pH G,о). Цдентлфшэдию хрошеом мыши и человека прово/.ли в соответствии со стандартными кг "чю типами ( rresbitfc,

Sronake, 1975; XSCM, 1978 ).

При статистической обработке полученных данных вычисляли . стандартную ошибку ш и доверительный интервал 1-р по формуле: Ipem.tp, гдер критерий Стьвдента при pi0,05.

: РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУДЦВДЕ

I. Влияние метилового эфира I--лейцина на функциональную активность лирл|г гитов человек в культуре.

При изучении действия ЛеЕ-ОМэ на синтез иммуноглобулинов и бласттршгсформацшо ЛИКЧ в культуре нами была избрана модель акта- ■ вации лимфоцитов человек гтгогеном лаконоса (МЛ). Результаты проведенных экспериментов пока: ■ ли, что оптидшгьная концентрация Ш, индуцирующая синтез иммуноглобулинов человек классов М и G составляла 1-2,5 шсг/т. На 7- л день культивирования ЛПКЧ при использовании указанной ■ концентрации МЛ отмечалось увеличение продукции . иммуноглобулинов а 3,5 раза по сравнению с нестшдулкрованыыми культурами. Результаты исследований влияния Jleii-OMe на продукцию . . IgM и igG ЩЬЯ, получешшх от 3 доноров, стимулированных оптимальной концентрацией Ш, представлены в табл.1А. Kaie видно из приведенных данных, предварительная обработка ДНЯ Лей-ОЫе ингибирует синтез lsM и IgG , жвдуцировашшй оптималыг Л дозой ШГ. Следует отметить, что пподу! ¿и ингчбируется в среднем в 2 раза, а

1,5 раза по сравнению с контрольными культурами, необрабо- -таннили Лс'2-OMe,

Результат"! изучения влияния Лей-OJfe на бласттрансформащш ЛПКЧ в культуре приведены в таблДБ,. Как видно из представлешшх данных, обработка Лей-0№ ингибирует реакция бласттрансформащш лимфоцитов человека, сталированных МЛ, "1,5-2 раза. Таким образом, дашшо по исследованию влияния Лей-ОИв на синтез иммуноглобулинов и бласттрансформациго ЛПКЧ в культуре свидетельствуют о способности чанного препарата иигибировать как синтез иммуноглобулинов, так и бласттрансфоршцкю лимфоцитов человека in vitro« Результаты изучения вторичного иммунного ответа обработанных Лай-CWe ЛШ в культура на вирус гриппа человека представлены в табл.IB, Йз приведенных в таблице дадшх видно, что Лей-ОМе сти-ыулкровал вторичный иммунный ответ ЛПКЧ в вирусу гриппа человека л культуре.

Изучали сшо® вдпянде ^еЙ-ОИе на различные популяции иммуяо-

- э -

компетентных клеток с ггомопсью ИР& с использованием моноклонаяг— тшХ антител к поверхностным маркерам человеческих лимфоцитов и ФИТЦ-меченых аншшшшх антител. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблЛГ. Из приведенных данных видно, что на 6-й день после обработки Лей-ОМе в з^ль-урах ли.фоцитов человека обнаруживается уменыг'чие процентного содержания латуральщпс киллеров и цитогоксических супрессорных Т-лим$оцитов. Однако, следует отметить, что при этом не было обнаружено уменьшения со-деркашш В-лимрощгэв и Т-лимфоцитов с фь^отипомСяИ4", обладающих хелперной активностью. На фоне уменьшения количег-ва естественных киллеров и Т-лимфоцитов с фенотипом ст 8* увеличивалось процентное содержание В-клеток и Т-хелперов.

Таблица I

Влияние Лей-ОМе на йункционалыгую активность ЛПКЧ в культура

А, Влитше Лей-О'Ле на синтез иммуноглобз'линов ЛПКЧ, сишулпровэншх МП.

Культура лимфоцитов . Оптическая плотность при

человека - д лне волны 492 нм

igW IgG

жга : 0,385 4 0,076 0/ 75 ± 0,052

ЛШЯ + Лей-ОМе 0,159 ± 0,04Я ",297 ± 0,069

Б. Влпише Лей-ОМе на бласттрансформащю ЖИЛ

Культура лимфоци- Включение Н-ттшдина в ДНК (число in. .ульслз тов человека ffДи?*^0*™ Р33™1»®

-~~- U ....... 1 . ,ь .

ЛПКЧ 720 ± J2 1460* 25 2059 ± 24022 * 53~

ЛЖЧ + Лей-ОМе 32Ö ± 21 891 - 43 . 1361 ± 75 1942 - &£

О

В» Влияние Лей-ОМе на вторичный ищущий ответ ЛПКЧ, к вирусу гриппа человека

Культура лимфоцитов человека

Число АСК аа 1-106 ЛПКЧ

ЛПКЧ + МП 46 ± 12

ЛПКЧ + Ш1 + ъирус гриппа . 192 ^ 20 ЛПК? + "11+ вирус гриппа +

+ Лей-ОМе 298 ± 25

Г. Влияние Лей-ОМе на различные популяции лимфоцитов человека

Культура лимфоци- Естествен-тов ч'ловека ; шпле< - В-кпетки Т~хелперы Т-хелперц/ супрессоры ст*/(Я>з~ спч-Усва*

ЛПКЧ 22£ 8 ЛПКЧ + Лей-ОМе 4 13 £ 4 . 15 * 5 22 * 7 40 ± 6 35 ±.6 : 34' ± 8

Д. Взаимодействие ЛПКЧ, обработавшее Лей-ОЫо с клетками . мчшенями линии К562 и ее су&шний с фенотипом МЛУ (ВЗ и С9)

Клетки-мишени ЛПКЧ ¿ЛКЧ-+ Лей-ОМе .

К562 ВЗ . С9 и £ 17,2 , 41 * 12,8 44,5 t 14,9 6,9*2,75,2 ± 3,4 7,4 £ 2,9

Примечание: цифры в таблице обозначают цитотоксичеагий индекс ЦТ). ■

Ушкшшше процентного оодерканяя естественная киллеров в популяции ЛПКЧ, обработанных Лей-ОМе, коррелирует с уменьшением ак-тшзысти о тих учеток в'цитотокоичзском тесте с клетками-мишенями Лйшей К562 и ее сублингй ВЗ и 09, характеризующееся МЛУ, Как показано в табл.-Д, при использовании в качестве источника естест-ветпгс киллеров ЛПКЧ, обработан*их 1ей-0"е, происходит снижение "II в среднем на 85£ но сравнении с культурами, необработанными 'Дей-Ше. Следовательно, яри о'-^ботке ЛПКЧ Лей-ОМе происходит ка! уманьпеше •роцеитного содержания естественных киллеров в куль-

тура, так с подавление их активности. Приведенные в таблице данные свидетельствуют такяе о том, что клетки-мишени с фенотоы МЛУ не отличаются от родительских клеток по чувствительности к естественным кшшзрам.

На основания проведенных иесждований мокно сделап, зад-шче-ние о том, что Яей-Шв является там5уномодулиру.дим агентом,, способным в зависимости от иепояьзованиой' модели индукции имцулного ответа в культуре подавлять -ли оттитровать иммунный отам»

2. Иццукция гуморального нммушого ответа ДШЛ в культуред

: Как показали результаты проведешшх экспорк :е:.тов, ЛШСЧс культивированные в точение 7 дней в среде, содержащей шактииро-вашшй ультрафиолетовым облучением rnrcrnj н 24НЗц2 вируса газета человека типа А, образовывали AQK в количестве '200 ± 24 ¡.л клеток. В то же время использованные в кач отвэ контроля ЖШ (не стимулированные вирусом гриппа или стимулирование лиш на 7-й день культивирования образовывали / ОК -в количестве мш 20 t 6 на 1*10® клеток. При использовании фильтров, п^крьгащх да-родствешг'ш антигенами (вирус i шшейкоза птиц или ДА ) „ @ ляции ШКЧ, стимулированных вирусом гриппа г.та вирусным 1ятшшом. в сочетании с Ml, формировывались ЛОК лшь в количестве 19 it 7 да I -10® клеток. В супернатанте иммунизированных випусом гриппа ЖИ методом КФА был обнаружен высокий уровень продукции igG. При: зден-ные дшпше. о высоком jpajas продукции IgG. свидетельствуют о наличии'в nor уляцпи ЛПК? iшит тмунологической паыти, ответственных за формирование зтир'-жт jrjrçyœioro ответа к вирусу гриппа человека.

Для., подавления активности клеток, супреесирущих антигенспе-цифнческую активацию В-лимфоцитов, ЛПКЧ обрабатывали Лей-ОМе. Ре* зультаты проведенных экспериментов показали» что после обрабо.кв Jleii-OIvle в популяции ШЛЯ, стиг.улировгипшх вирусом rpinma, rliir -;з:вались АОК в количеств1- 289 t 25 на I.Ï06 клеток. Следует отметить таклз, что, в присутствии Ж число АОК, специфичных к дг тощ антигену, не изменяется кале в случае обработки ЛПКЧ лей-ОМе, т?т: и при ;:cnc„.b30Bainr? необработанное ЛПКЧ.

Обработанные Лел-СМе лимфоциты человек бшта испольг. ваш тагосе для и:;:.уш:зац:г;: in vitro растительным de; "сом фшеобилином. KirЛПКЧ осуисствлл.'Ш дв;тл раг,1Е;;.-л способа-"i. По первому

г

способу к ЛПКЧ добавляли специфический антиген, рекомбинантные лимфокшш (ИЛ-2 и Я-интсрферон) и кондиционированные среды Т-лим-фоцитов "человека, стимулированных 131. По второму способу, к ЛПКЧ добг лили лишь тест-гштиген, Вследствие низкой частоты образования антиг^нспсщфгаеских В-лимфоцитов, продуцирующих иммуноглобулины к тест-антигену в культуре, нами не удалось гыявить различий в продукции антител между первым и вторим способами иммунизации ЛПК? In vitro . Пс ~>тому об антигенспецифической активации ЛПКЧ в культуре оудали после проведения экспериментов по иммортализации иммунизированных ЛПКЧ путем гибридизации их с к атками мышиной ■ м_еломы и выявления ш: ла клонов, продуцирувдих "ЧШ. к фикобили- • ау (гч.йлв2).

Таблица 2

Влияние двух способов им^нпзацииЛПКЧ ±n vitro на содержание клонов-продуцентов ЧМКА к фикобилину '

Способы иммуни- Общее , Эффектив- Число клонов, Число клонов.

зации ЛПКЧ в • число ность ги- - пролтаирузо- продуцируидах .

культуре клонов бридизации идах ЧМКА к . человеческие

клеток,в % факобшшну .. иммуноглобуяи-

ны классов

И G

Первый способ 36 0,3 • 6 / 15 4

Второй способ » :0,Ш 0 I 0

Как вкдно из приведенных данных, не .только общее число расту-„лх клонов в "елективной среде, содержащей ГАТ^. бромистый этидай (эффективность гибридизации), но и количество клонов, синтезирующих антитела к использованному антигену (эффективность иммунизации) , полностью зависят от наличия в среде культивирования реко:,ь бинантных лимфокннов и кондиционированных сред Т-дашфоцитов человека. Гибридные клоны» полученные с использованием лимфоцитов, . нмчунизкрованггх по второму способу, не синтезировали антитела к тее*^антахену. 8 противоположность этому, из 36 гибридных клонов, вояучевша о ирименением ЛПКЧ, иммунизированных в культуре первым V способом, "6 кдонов являлись ангателояродуцентами. Способность 4-х V, та указанных клонов синтезировать'!^ свидетельствует о первичной , бнтггснсдкшг^яче скоЗ актавацвд ЛПКЧ : 1а тг1Ьго. Результаты эксде-рзшэдтовД0 Получению гегерогибрццом \ применением в качестве од-Ч' ' ■ '■'-■■¡Г' • ' .'*: • • . '

ного из партнеров меток мышиной мне -ощ линии вревя-5, а в качестве другого партнера - иммунизированных разпши способами человеческих лимфоцитов в культуре, свидетельств"*^ о том, что ЛПКЧ, обработанные Лей-ОМе, способны формировать первичный иммунный ответ в клеточной культуре на фикобшшн.

Как показали результаты изучения закономерностей индукции гуморального иммунного ответа Лей-ОМе-обработанных ЛПКЧ кд раствори- | мый моновалентдай Ши'иген, шисубация ЛПКЧ с ДА не сопровождается продукцией специфических антител, обнаруживаемых с помощью ИМ. Попытки стимулировать продукцию специфических антител к ДА при совместном инкубировиш антигена и шгогена (МЛ), такне не оказались успешными. Как показано в таблице 3, интенсивность продукт- • щш анти-ДА антител класса 0 обработаны го; Лей-ОМе ЛИЛ при добавлении МЛ- или ФГА-стимулированных супернатантов значительно про- 1 рыиала тленный ответ необработанных Лей-ОМе ЛПКЧ, стимулированных том не антигеном и указанными супернатонтоми. Следует отметить также, что в культурах ЛЛКЧ, обработанных Лой-ОМе, увелг. э-ние продукции анти-ДА антител коррелирует с '-шелом антителообра-зувдих клеток (тябл.З).

Индукция иыглунного ответа к ДА. а культурах, обработанных Лей-ОМе, стимулируется неспецифическими активаторами В-лшфоцитов человек ПЭГ с мм 6000; кондиционированной средой В-л*^фобластоид-дой .линии клеток НаэаЪт, продуцирутадей высокомолекулярный фак- ; тор роста В-клеток памяти; цитотоксичеоким препаратам - адрпамк-цином, стимулирувдим сигтег и секрецию иммуноглобулинов \&-гибри-домами (табл.3). Следует оплетать, что лишь при "использовании ад-риамицина в качестве индуктора'дифферекцировки В-лимфоцитов про-, j ^сходит стимуляция.продукции антится к ДА кшс в обработашшх Лей- ; рме, так и в контрольных культурах. Однако, при добавлении д..ух других вышеуказанных индукторов, а такке, ФГА- или МЛ-кондициони-рованной среды продукция анти-ДА антител наблюдается только после Обработки ЛПКЧ Лей-ОМе (табл.3).

При использовании корпускулярной формы ДА, образовавшегося з результате конъюгации этого антигена о мембранами золотистого '! стафилококка с помощью глютарового альдегида, Лей-ОМе ингис'фует | рмг^унный ответ ЛПКЧ в культуре (табл,3). ■

Следовательно, ЛПКЧ, обработанные Лей-ОМэ, могут быть использованы для индукции иммунного ответа к растворимым антигенам,

Таблица 3

Кцгтгщия вторично, о иммунного б№е?а ЛЙКЧ, обработанных Лей-ОМе, к ДА в культур" -

Культура лимф-цитов человека

К^а^ТШШО Число АОКна МО* ЛПКЧ

ЖЖЧ'+ ДА. 1,56 + 0,47 _

ЛШС7 + Да +' Лей-ОМе • 1,43 ь' 0,35 - ,

ш + да + М . . ••; • . 1,79 С,57 -

ЛПКЧ + ДА. + Ы + Лей-ОМе " 4 , 1,39 + 0,29 -

ЛПКЧ + ДА. + ФГЛ )ш !.У1-;-.онд^д;;с нпроваш1ая ■ - 6,8 • • -

среда • - - 12,0 ± 95 ± 12,5

ЛПКЧ + ПА + Лей-ОМе + ФГА- или' .

кощдацнонг^овшшал среда 70,0 + 213 ±31,6

ЛПКЧ + Лей-ОМе + 1131 ДА . 47,4 ± 17,5 165 ± 21,7

ЖД + ДА + адриа1"циа ' • 65(4 + 13,3 184 ± 25,:

ЛПКЧ4 ДА + адриамицин + Лей-ОМе 13,9 ± 17,8 179 ± 26,7

ЛПКЧ + ДА -1- Лен-Оме + кондиционированная -

среда клеток 52,7 + 14,3 167 ± 35,1

ЛПКЧ + Лей-ОМс + ФГА -среда + корпускуйяр*

ный ДА 47,6 ± 6,6 . 73 ± 12,6

ЛПКЧ + ФГА-сред . + корпускулярный ДА • 96,0 ± 19,5 297 ±39,7

I

Примечание: (-) - эксперимент не проводился.

которые не подвергаются фагоцитозу, а захватываются В-клотками путем пиноцитоза и/или с помощью специфических поверхностных рецепторов - молекул иммуноглобулинов. Обработку JD1K4 Лей-ОМе моя-но использовать и при индукции иммушюго ответа к таким полива- j лентшм корпускуляршм антигенам, как, например, вирус гриппа, ' имиунный ответ- к которым требует лишь наличия интактных В-лимфо-цитов, Т-хелперов и продуктов, образущихся при антигенчой стицу- I ляции тлмунокомпетентных клеток в культуре.

Тшаш образом, ЛПКЧ, обработанные Лей-ОМе, способны отвечать \ продукцией антител к растворимым антигенам in \itro тогда, когда спещзфическая антигенная стимуляция сопрововдается неспецифичео- ! кой' стимуляцией В- и Г-лш4 -дитов факторами роста и дифференцв-ровки тлмунокомпетентных клеток. ./■'... ' .

3. Стимуляция синтеза и секреции иммуноглобулинов гибридо-' ыами и лклфоцитами чг ювека под влиянием адриамшцша и . бромистого этвдия. -'••■;

Для изучения действия адриашщша и брог^стого этцция на синтез и секрецию тащуноглобулинов было исследовано влияние препаратов на культивируемые клетки, характеризующееся конститутивностью (гибридомы/миелош) или индуцибельностью (ЛПКЧ) синтеза. иммуноглобулинов, гетерогенностью (ЛДО) или моноклоналыюстью (гибри- j дош) клеточных'популяций, устойчивостью к датотокси .зским препаратам или чувствительностью к ним.. .. - j

". При изучении влияния адриамицина и бромистого, этидиг на продукцию'иммуноглобулинов в пер^х экспериментах нами были использо- j. ваш' полученные с применением мнеломной линии с фенотипом МПУ. . i клетки гибридош линии iPr,, продуцирующие моноклональныо ентите- I •; да и трансферртшу человека. Резуль'иты проведенных экспериментов !; показали, что обработка клеток гибридом различными концентрациями цитотоксических препаратов усиливает секрецию моиоклоналышх j антител. Так, бромистый этидий в концентрации 5 мкг/мл стимули-.. ровал секрецию антител в 2 раза, а в концентрации XO-I5 мкг/ш -§ раз в течение 72 ч инкубации клеток. В присутствии же адриами-. щша в концентрации 0,05 мкг/ш продукция иммуноглобулинов увели-ч:шается более чем на порядок, ' " ' ' - ■ ■'

В экспериментах по изучешпо продукции иммуноглобулинов клетками мышиной шеломы линии Бр2/о .** его мутантным субклоноы,

-селектированным по устойчивости к 5 шсг/ыл бромистого отндая Ouuiui 3pe3r-5), hai.ni било обнаружено увеличение секреции igG 2b в к^еис ; лшши spebr-5 в 2 раза по сравнении с чувствительными клетками линии Вр2/о.

При изучении влияния адриаыицина и бромистого этидия на про-дущ;ш иммучоглобулшюв в системе лш.фоцитов человека in vitro изучили действие этих чрепаратов на гащукцию гуморального иммуя-4 ного ответа ЛПКЧ jean в модели поликлональной активации 3-лкмфоЦИ-тов о помощью и:,' так и в модели аитигенспецифпческой активации этих клеток под влиянием М. Ацг'ташцин в бромистый стадий стимулируют продукцию igM в мктогенстЕмулировашшх культурах ЛПКЧ в 1,5-2 раза в период до 72 ч инк,,бации ЛПКЧ (табл.4). Увеличение продукции Igi'i г присутствии указанных препаратов коррелирует с увеличением числа АОК.' Так, в присутствии адриаыицина число клеток, продуцирукийа 1сМ человека, составляло 564 * 9S,6 АОК на . 10.10^ ЛПКЧ, тогда vnii в культурах, обработанных лишь Ш, оно составляло 212 - 76,2. Продукция IgM в'шго/енеттулированных культурах ЛПКЧ достает максимальных з.лчешШ уае через 72 ч в присутствии адриамицина и бромистого этодия, тогда как в_контрольных культурах продукция igM достигает тех не значений после 6-7 дней инкубации ЛПКЧ in. vitro . В модели индукции антигенспецифической активации ЛПКЧ к ДА, антигенная стимуляция В-лиг.фоцптов .в прясут-ствии адриамшцша вызывает продуг да тлти-ДА антител на 3-й день шшуивдш клеток. Так, в присутствии адриамицина продукция анти-ДА. антител составляла 55,4 t 19,3, тс-да как в контрольна культура она составляла лишь 1,56 ~ 0,47. ,ЕД/мл. .

Дш* изучения ск-.теза нммуноглобу:тнов в 1. .зтг~х гибридом/ше~ "т01.« и Ж окгпшрованных ЛПКЧ использовали метод радиоиммунной . преципитации -клеточных белков, биоспнтегически меченых .s-мети-онином. Как показали р-зультаты о«?". >рароре *ических исследований и радиоавтогра^дш гелей, адриашцпа зг ^:»шстый отидий стимулируют синтез de novo колою/л иммуноглобулинов в клелидх "ышной шеломы spebr-5 с фенотипог млу и ь клетках родительской линии ствительпой миеломы Вр2/о. Однако, - в резистентных клеточных популяциях синтез ш-тнрглобулпнов под влиянием . ^тотогоических • препаратов выражен значительно¿лтеясшзнее, чем в чувствительных. Адриамицин индуг.руп; также ' синтез. Б-цепей молекул l^i.B-лпмфо-цитами человека.

Таблица 4

Влияние адриаыицииа и бромистого отидия на продукцию 1бМ МИ-СхШ^улированных ЛПКЧ в культуре

Дни культивирования ЛПКЧ в

Концентрация 1п;И (пг/ш) в куль-урах

ЛПКЧ + Ш

ЛПКЧ + ШГ + адриамищш

ЛПКЧ + Ш1 + бромистый этидий

1-й день

2-й день

3-й день

4-й день

5-й день

6-й день

119 ± 29,3 276 ±38,9 312 ± 45,7 412 ± 39,7 467 ± 40,2 493 ± 39,7

312 ± 43,1 401 ± 42,9 524 ± 61,3 411 ± 54,4 264, ± 39,9 116 ± 47,9

459 ± 52,7 343 ± 35,8 354 ± 47,8 2С" ± 29,6 103 ± 19,5 Б7 ± 10,7

Таким образом, клеточше яда адриамищш и бромистый эти,, л! стимулируют синтез и секреции иммуноглобулиновВ-клеточными гиб-рддомами и лимфоцитами человека, а также гуморальный иммунный ответ антиген/митоген стимулированных ЛПКЧ, .Стимуляция продукции иммуноглобулинов как культивируемыми гибридными клетками, так и лимфоцитами человека но обусловлена цитотоксическиг действием клеточных ядов и коррелирует с числом АОК и синтезом икмуноглобу-линов в культивируемых клетках,

4., Индукция длительнойкроли^педш нормальных лимфоцитов человека в культуре, ВзаимодеЙотзие ли/фоцитов человека о клещеамп-шшеилми. .

Как показали результаты проведенных нами исследований, при сокультивировании нормальных лтфоцитов человека с клетками трансформированных фибробластов линии 1929 и клонами этой линии мышиных клеток о фенотипом ШУ наблюдается продолштельная проллфера-ция ЛПКЧ (в точокие 1,5-2месяцев). Наиболее продол-ительная пролиферация ЛПКЧ (более чем в 2,5 месяцев) наблюдалась при использовании мутангшос клонов линии Ь829 (Зьм-э и 50о), устойч. зых к. высоким концентрациям бромистого этидия. Морфология культивируо-шх в течение одного месяца ЛПКЧ характеризовалась образованием типичных для культур лимфолдных клеток агрегатов и клеточных скоплений в зонах роста. Сокультивируемые ЛПКЧ размножались при посевах в концентрации Т.б-г^О6 клеток в мл И клонировались в ков-

централен 1,5.10" клс"ок в мл. Дня индух-ции продолжительной пролиферации ЛПКЧ необходимы юс стимуляция ¡.111 и наличие монослоя трансформированных фибробластов. В экспериментах по клонированию пролифорир^ 1!5Е ЛПКЧ, продуцирующих имг.уно глобулины и цитотокои-ческие факторы, использовали ел с тему соку, ьтивтювания лимфоцитов человека с клоповой культурой 1»929, устойчивой к 50 мкг/мл бюми-стого этцдия. Вцделеннис кланы пролиферирувдк ЛПКЧ были использованы в окспоремонтах пп получении мекиэдошх гибридов соматических клеток в культуре с пртаенешем клеток мшкной шеломы линии ЗРЕВВ-Ь. Для выделения гибридов использовали селективную среду ГЛТ, содержащую I мкг/мл б]юмис.того этвдия. На».® сшш п лучош 20 I аввдошх гибридов (эффективность гибридизации 2-10®), среди которых 5 клонов были продуцентами л^-о- человека, однако 'нп ода из 20 п.оридов но продуцировал цитотоксическис факторг.

Для характеристшси пролиферирукида ЛПКЧ нами были изучены по-пуляциошшй состав, ¡юстоше ха^астс! истр-'и, этих клеток и возможность индукция алтнгеиппсцифпчссшго иммунного ответа. Популяцимь ный состав был изучен методом РШ£5 с использованием ¡.юноклональ-ш антител к поверхностным антигенам различных популяций.лш^ци-тов человека. Результаты анализа-показали, что 62 £ 14,7$ клеток из оби\еН популя^-п культгаируешх им являются Т-лшфцитама, а количество В-лимфоцитов и естественных киллеров составляло соооч вс'.^твенно 18 - 10,2% и 29 * 13,6'». Следовательно, нролгферирую-щие ЛПКЧ представляли собой"гетсрохч :шу. -популяции, состоящую из различных популяции ЛПКЧ. ; .

При изучении ростовых характеристик ЛЩСЧ сравнивалось ллия-ние различных ростовых факторов (ЛС, сыворотка .человека, 11Л-2, кондициош.рованная среда гтпх ке клеток' на про., .фврзтивный от-ве'" Л1ЛЧ, З'.зу.м.таты но включения» ^Н-тимццина в ДНК клеток показали, что наиболее сильной ростстныулирупиеп активностью облада-. ет КС этих яе лимфоцитов. Следователи , продо. капельная пролиферация ЛПКЧ в ку.гьтуре сопровождается продукцией различных факторов, обеспечивающих рост и жизнедеятельность лгафцпточ в культуре.

Возмош: сть антигенспецифическо^.шстивации'В-лшдфоцитов в культуре была изучена чо способности длительно щ. ,лкферируюи;их ЛПК? отвечать продукцией специфических антител в ответ на добавленный антиген - ДА. К'агс показали результаты экспериментов, до-

бавление антигена в культуру длительно щюлпфе; .¡руюда МЛ вызывает образование АОК (239 £ 31,7), продуцирующих специфические антитела класса в к ДА.

При сокулътивироизагап! активированных ЛПКЧ с ъ -клетками происходит такш .разрушение монослоя трансформированных фибробластов. Цитотоксический эффект проявляется ишс при использов иш активированных ЛПКЧ, тш. и их К., однако, цитотоксичесшШ эффект активированных ЛПКЧ значительно превыщает цктотоксическую активность КС (рис.1). Как свидетельствуют данные, привидешше в рис.1, при обработке ЛПКЧ с, п моцью Лей-ОМе, селективно ингибирупцей иктив-ность естественных киллеров, моноцитов и цитотоксичсскях лим^юци-тов, происходит подавление цптотоксической активности ЛПКЧ на 42,6$. При взаимодействии как шстивгцюв^шшх ЛПКЧ, так и продуктов их жизнедеятельности с КМ, наиболее, чувствительными к цито-то" оическому действию указанных факторов оказались клетки с фано-типом МЯУ (рис.1).

Как показано на рис.1, обработка клеток 1.929 актиномицшюм Д, Циклогексимидом, адриамищшом, колх!щщюм и бромистым этидием выбывает повышение вдготоксишюсти КС .ЛПКЧ, активировшпшх МЛ, Аналогичный эффект наблвдается талрге и для гае ток линии Зьм-5 с фенотипом ГШ,

Таким образом, на основании результатов проведенных исследований можно сделать заключение о том, что система сокультдвирова-ния ЛПКЧ с клетками лини" ь929 является довольно сло&юй и включает в себя следующие компоненты: I) индукция продолжительной .. пролиферации нормальных лимфоцитов человека; 2) усиление продукта! лимфоцитами иммуноглобулинов, цитотоксическнх и ростовых факторов; 3) ц-'тотокспческое действие активированных лимфоцит в : продуцируемых' ими факторов на клетки линии Ь929 и ее субклонов о фенотипом МПУ.

5. Получение гибридом человек х мышь , продуцирующих ЧМ.А

Для прлу^ещ! ^.терогибридом, продуцирующих Ъи<А, наш в качестве илтюр^а^вдррзедего партнера .были использованы разные линии мыппщых' миеломтах меток, Д табл.5 предста'лены результаты .. исследований во едяалещ} иазбрдее шдходяп;егя партнера, способного- обеспечивать шсоку» эффективноеть гдбрндизащш илетстс, а таете продукцию человеческих иммуноглобулинов. Из представленных данных оледует, что толы«) одна из чспользованных нами ли'шй

го о

10 П 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Рис.1. Цитотоксический эффект при взаимодействии активированных ЛПКЧ и продуцируемых ими растворимых факторов с К?.1 линии ь929 и ее субклонов с фенотипом ИЛУ.

По вертикали - Щ» По-горизонтали - цитотог.сический эффект активирован-■ ных митогеном ЛПКЧ (2-3; .7), цптотоксический эффект Лей-ОУе-обработанных ЛПКЧ (8), цитотоксш скш! эффект продуктов активированных Ш1 ЛПКЧ (4-6; 9-20). 1,4,9-14 - клетки линии и929; 2,5, 15-20 - клетки линии Зи.л-5; 3, 6-8 - клетки линии 50; 9 и 15 - контроль. 10 и 16 - актпноь-дан Д; II и 17 - циклогексимид; 12 и 18 - адраамицин; 13 л 19 - бромистый этидтгй; 14 и 20 - колхицин.

клеток-субклон линии Зр2/0 (линия ВхаВИ-Б) , отселектированный по устойчивости к 5 мкг/мл бромистого ~ ддаш, обеспечивает образование гибридов с лимфоцитами человека и продукцию иммуноглобулинов. Эффективность гибридизации этой ашии шшинсч миеломы с лимфоцитами человека составляла 1СГе-1СГ^, В дальнейших экспериментах по получению гетерогибрадом, продуцирующих ЧМКД., была использована линия бревй-5 и селективная среда ГАТ, содержащая I мкг/мл брошь , стого этидия. Как показали результаты проведенных исследований, при использовании данной селективной среда, так же, как и обычной • среда ГАТ, эффективность гибридизации при слкг'ши Ш-активирован» них ЛПКЧ с йревв-5 составляла 1«05-1сг6. Однако, при использова- ; нии бромистого, этиднл для отбора гибридов выход последних значи- ; тельно увеличивается. Следует отметить также, что эффективность гибридизация человеческих лимфоцитов с 8реве-5 увеличивается в | 20-30 раз, если используются; ШГ-стимулированные или иммунизированные в культуре ЛПКЧ £табл»2 и 5). Используя эту линию клеток миеломы путем слияния с' Лей-ОМз-обрао'оташгыда ЛПКЧ, имадунизирован-ныш в культуре клеток ДА., наш были получены.два клона, син'^зи-рущие ЧМКА к ДА. Оба клона гибридных клетол продуцировали. человека в болыггх количествах (0,12 мкг/мл на 10° клеток в тече- , ние 18 ч). С помощью иммунизации ЛПКЧ были получены такае гиб-рщцше клоны-продуценты ЧМКА к фжа^бкпйну (табл.2). Однако, в обоих случаях продукция антител продолжалась недолге, Так, наиболее сильный продуцент- клон 1А6,потерял эту способность через две. недели после клонирования, а другой, менее сильный продуцент 2ВЗ- через месяц. Прод/кц..я ЧМКА к фикобиллину продолжалась в течеше 3-х месяцев культивирования. Следует отметитьчто продукция ЧМКА гетерогибридомами, полученным на основе бревн-5, в наши экспериментах наблвдалась дс 4-х месяцев.

Кариолопиеский анализ'дифференциально окрашенных хромовом на о -диски одного гибрида, , полученного при слиянии свекевыделенных лпкч с клетками бреве-Б, не продуцирующих иммуноглобулины человека, показал, что по структуре карйоиша гибридные клеткь близки к вребе-5. Неперестроенные.хромосома человека, :ак правило, отсутствовали. Лишь в одной клетка была обнаружена в натипаом бе-г. де хромосома человека, что доказывает еа гибридное происхо..дение0 Помш.ю этого, в клетках были обнаружены не свойственные родительским клеткам хромосомы, образованные даздаолонительно в результа-

Таблица 5

Использование 'различных шшшшх миеломных лшшй иолучетш го;ерогибридом, продуцирующих ТМСА

Чоловсческнй Число клонов,образукщих- г юло клонов-продуцентов

партнер при сл после слияния с раз- монокл лалышх антител гибридизации ныш линиями мышиной мпелош

ср2/0 spei IÎS-Û Бр2/0 SrSBR-5 iis'

ЛПКЧ + ï"t .. 0 28 2 0 & 0

ЛПКЧ + Лей-OMot-

ДА + МЛ-среда . 2 20 . • 4 0 . 2 0

ЛПКЧ 0 2 . 0 • 0 I 0

те перестроек хромосом мышиного т;ша и предетавлягшдае собой маркеры данных клонов, так icai ' обна.*' тзивалпсь с большой частотой. С , помощью кариолопгческого анализа гибродов, полученных при гибридизации ЛПКЧ с той ::<е лишней шшшшх клеток, продуцирующей человеческие иммуноглобулины класса G, обкгруяена аналогичная карти^ на: кариотип трех проанализированных гибридных клонов был представлен неперест^ )енними хромосомами мышей, маркерами ¿pebr-5 и . маркерами гибридов. Ставда^тные хромосомы человек отсутствовали.

Тшшм образом, пммупизировшшые in vitro лимфощгты человека можно использовать в качестве одного чз партнеров при получении гибридо:,., продуцирувднх ЧЖЛ. Однако, на основании проведенных исследований :ши!о сделать такяе заключение, о то", что несмотря, на высс.лй выход гибридных клеток высокую продукцию иммуноглобулинов, с.лтез ЧМКА гогорогибродомами г, характеризуется стабильностью всле;;.ствт*9 образования бы^тросегрегирутацих гибридов.

ВЫВОДЫ

1. В зависимости от использованной модели шщу:ащи итунного ответа ЛПКЧ in vitro Лей-ОМе проявляет либо пшуносупрессзрную, либо иммуостгглулирукздую ак.шзность,.

2, Для ^узукции гуморального mnç шого ответа на Т-зависише антигены в культуре, необходимо постоянное присутствие растворимого ; [тигена, факторов роста/дифференцировки шдаунокомпетектных клеток в среде кулх ;щ%овауия и удаления клеток, подавляющих ад-.

тигенспецифическую активации В-лим$оцитов чоловега.

3. Установлено, что ШКЧ, обработанные в куль ту ро JIoii-OMo, способны форшрове..ь шлмушшй отлет с образованием AGK на антиген (ДО), находящийся в растворшлой, а не корпускулярной форме.

4. Цитотоксические препараты (адриамщзш и бромистый этидий) стимулируют как конститутивный (шбрздош/мисломы), тале и инду-цибельшй (ЖЖЧ, обработанные штого.иом/шгшгепом) синтез молекул иммуноглобулинов о культуре. ,

5. Сокультивировшшо активировашшх митогеном ЛПКЧ как с iuie-ткаш лишп! L929, гак и с зе муталтишли клонами с фенотипом Ш1У, индуцирует продолжительную пролиферацию лимфоцитов, продуцирутацях иммуноглобулины, цитотоксичешсие i ростовые факторы.

, б. Активировашше митогеном лю-5фоциты человога, продуцируемо шли факторы и естественны- киллеры оказывают цитотоксическоо действие как на чувствительный к клетошшм ядам клетки-мшени, так и на их субклош с фенотипом МЯУ. Клетки-мотюни линии ь929 с фенотипом МЯУ более чувствительны к циготоксическому действию активированных ЛПКЧ и их продуктов по сравнению с клетками родительской линии L929.

7, Использование шпшюй шеломы лязгай spebr-5 с фенотипом МЯУ обеспечивает высокую эффективность гибридизащл с культивируемыми лимфоцитами человека и продукцию иммуноглобулинов, однако синтез ЧМКА геторогибридомами нестабилен вследствие образования быстросегрегирукзцих г^брлда jx клеток.

- Список работ, опубликованных'по теме диссертации:

1. Берсзкина Е.В., Гршчук 1.1.1., Давтян Т.К., Ковалева 3.^., Нисман БД., Паныпина Ю.Т., Сорокина Е.А., Тарунина М.В., Игнатова Т.Н. Быстро сегрегирующие монохромосомные гибрида клеток "Человек х мышь" //Первая Всесоюзная Конференция "Геном человека", Москва, 1990,' С. 36-37,

2. Давтян Т.К., Алексанян Ю.Т., Игнатова Т„Н. Изучение вторичного иммунного ответа лимфоцитов периферической крови человека in vitro к вирусу гриппа человека //Актуальны вопросы краевой инфекционной патологии, вып.П, Ереван, 1990, С. 60-65. ■ .

3. Давтян Т.К., Нисман БД. , Алексанян Ю.Т., Игнатова Т„Н„ .. Об использовании иммунизированных вне организма лимфоцитов чело» века для получения гибридом, продуцпрущих человеческие пнокло-

налыше антитела // Актуальные вопросы краевой инфекционной па- . толог!от, BUH.IX, Ереван, 1990, С..64-67.

Алоксанян Ю.Т,, Давтян Т.К. О проблеме получения'челове- . ческнх монокло: ольных антител //ТЯкцунология, .,г' 3, С. 10-13, 1991.

5. Ддвгян Т.К., Блинова Г.И., Але: ;анян Ю.Т., Игнатова Т.Н. Индукция прс.авферацик нормальных лимфоцитов человека при совместном культивировании с г.^ипшш.ш фибробластами линии L929, устойчивых к бромистому этидию //Биолог.яурн.Армении, Ь 2(44), С. 155157, 1991.

. 6. Дплтян Т.К.,'Нисман БД., .'лексанян Ю.Т., Игнатова Т.Н. О возможности получс!шя человечсстаос моноклоналышх антител с пол«оцью иммунизацзш лимфоцитов периферической крови --эловека in vitro //Еиолог...:урн.Армении, I.' 2(44), С. II5-II9, 1291.

7. Давтян Т.К., Нисман БД., Игнатова Т.Н., Алексанян Ю.Т. Изучение влияния метилового эфира -лейцина на функциональную . активное: . лшфоцито:. периферической крови человек в культуре //Вюлог.ясури,Армении, Д 3(44), С. 235-239, XS9I. '

8. Игнатова Г.'!., Давтян Т.К., 1ринчук Т.М., Блинова Г.И., Бер^зшша Е.В.. Васюхшг В.И., Алексанян Ю.Т. Фежшшческие и кариотппичеекме особенности гибридов (лимфоцит человека х миело-мч кыш), отселектировашшх в среде ГАТ с бромистым этвдием, //Вторая В-есошная конференция "Геном человека", Мосва, IS9I, С. II—12. ;

9. Дав-глн Т.К., Алексанян Ю.Т., Игнатова Т.Н. Изучена« вторичного ишупног" ответа лимфоцитов человека в культуре и возмонно-сги получения человеч jkjcc шноклональдах антител к дифтерийно-у анатоксину.//Актуальные вопросы оттдешологип. Hay лая конференция, поенщеаяая 100 летаю' со дня роздешм А.Б.Алексаняна. Ереван, ISC?, С. 83-,

10. Давт-чгТ.К., Мел.иссетян 1.1.Б., Игнатова Т.Н., Алексанян Ю.Т. Адаптивный отг^т В-клеток в культуре под действием цитоток-сичесгак препаратов, (¡тшг/л ция синтеза и секреции имт^ноглобу-линов гиб-идомаш и лимфоцитами человека под влиянием адриакици-на и брошетого этидия. // Цнтоло1.ш, IS93, т. 35, Je 4, С. 54-60.

11. Давтян Т.К., Смирнова Т.В., Алексанян Ю.Г., Игнатова.Т.Н., Ме^-сетян М.Б. Взаимодействие культивируемых лимфоцитов перпфе-рической крови человека с трансформированными ф.:бробластами мышей //Иммунология, 1993, ft 3, С. 17-21. -