Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-биохимические механизмы развития вторичных иммунодефицитных состояний при действии различных экологических факторов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биохимические механизмы развития вторичных иммунодефицитных состояний при действии различных экологических факторов"

РГ6 од

ч л

МОСКАЛЕВА ЕЛИЗАВЕТА ЮРЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ВТОРИЧНЫХ ИММУНОД ЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ Специальность: 03.00.04 - "биохимия"

Автореферат диссертации на соискание ученой стелет доктора биологических наук

Москва - 1998 г.

На правах рукописи УДК 577.24:616_097.612.017_11/12

Работа выполнена во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечении и Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии.

Научный консультант: доктор медицинский наук, академик РАЕН, профессор Караулов А.В.

Официальные опоненты: доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН Кубатыев А.А. доктор биологических наук, профессор Михайлова А.А. доктор биологических наук, профессор Карелин А.А.

Ведущая организация: Институт иммунологии МЗ РФ

Защита состоится 25 июня 1998 года в "_" часов на заседании

Диссертационного совета Д. 171.02.011. при Центре медико-биологических и экологических проблем по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан "_"_ 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

кандидат биологических наук /9Г В.В.Отраднова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акту альность проблемы.

Нарушение иммунологических механизмов защиты организма приводит к появлению инфекционных осложнений, аутоиммунной патологии, развитию злокачественных опухолей и аллергических заболеваний. Вторичная иммунологическая недостаточность часто наблюдается при вирусных, паразитарных и некоторых бактериальных инфекциях, при истощении организма, длительном стрессе, при тяжелых травмах, ожогах, интоксикациях, при лечении онкологических больных химиотерапевтическими средствами и/или с помощью лучевой терапии, при длительном воздействии вредных факторов в процессе профессиональной деятельности или в неблагоприятных экологических условиях. Известно, что причиной развития вторичных иммунодефицитных состояний (ИДС) при генотоксических воздействиях в процессе химио- и радиотерапии является повреждение генетического материала иммунокомпетентных клеток. Механизмы же развития ИДС, наблюдаемых при многих заболеваниях внутренних органов и инфекционных заболеваниях, мало изучены и до сих пор не ясны.

В тоже время нарушение процессов репарации ДНК и повреждение структуры ДНК лимфоцитов под действием эндогенных метаболитов или лекарств также может быть причиной развития вторичных ИДС при различных заболеваниях, так как известно, что наследственные болезни, обусловленные различными дефектами в системе репарации ДНК (пигментная' ксеродерма, атаксия-телангизктазия, анемия Фанкони) сопровождаются глубокими нарушениями в функционировании иммунной системы.

В настоящее время при исследовании иммунного статуса человека заключение о состоянии клеточного звена иммунной системы делается, как правило, на основании фенотипирования лимфоцитов периферической крови, что безусловно, отражает определенную динамику в изменении гомеостаза иммунной системы, но не всегда позволяет адекватно оценить ее состояние. Поэтому исследование механизмов развития вторичных ИДС и разработка новых доступных способов выявления патологических изменений в иммунокомпетентных клетках человека является крайне актуальной

задачей.

В последние годы были развиты новые методические подходы, позволившие предпринять исследование способности лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека к эксцизионной репарации ДНК и структуры ДНК этих клеток у здоровых людей и при изменении эндогенной среды организма при заболеваниях в качестве параметров, определяющих устойчивость этих клеток к повреждающим воздействиям и их способность к полноценному функционированию.

Целью диссертационного исследования явилось: Изучение молекулярно-биохимических механизмов развития вторичных иммунодефицитных состояний при действии различных экологических факторов, а именно: изучение способности лимфоцитов периферической крови человека к репарации ДНК и структуры ДНК лимфоцитов, а в отдельных случаях и гранулоцитов, у здоровых доноров и при широком спектре заболеваний, сопровождающихся развитием вторичных ИДС: при неспецифических заболеваниях легких, остром инфаркте миокарда, рассеянном склерозе, опухолевом процессе, некотрых инфекционных заболеваниях; повреждений ДНК, индуцируемых, используемыми при лечении онкологических заболеваний химиотерапевтическими препаратами, а также изучение роли антигенной нагрузки в формировании генетической нестабильности ЛПК крови при заболеваниях и механизмов этого явления в модельных экспериментах in vitro.

Для достижения этой цели были сформулированы и выполнены следующие задачи:

Основные задачи диссертационного исследования:

1. Разработать экспериментальную модель для оценки способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК.

2. Исследовать способность к репарации ДНК лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и больных при заболеваниях, сопровождающихся развититем вторичных иммунодефицитных состояний.

3. Исследовать уровень повреждений в ДНК лимфоцитов и иммунологические показатели у здоровых доноров и у больных при различных заболеваниях.

4. Исследовать структуру ДНК и молекулярно-биохимические механизмы ее

лабилизации при активации лимфоцитов периферической крови человека in vitro.

5. Изучить уровень повреждений ДНК лейкоцитов периферической крови при генотоксических воздействиях у больных, получающих химиотерапию по поводу онкологических заболеваний.

6. Разработать количественные критерии оценки степени повреждения ДНК лимфоцитов для выявления и диагностики эндогенных генотоксических воздействий и воздействия генотоксических факторов окружающей среды.

Научная новизна и теоретическая ценность полученных результатов.

Впервые изучена способность ЛПК к эксцизионной репарации ДНК и обнаружено ее снижение при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных ИДС.

Впервые показано, что свежевыделенные ядросодержащие клетки крови здорового человека практически не содержат спонтанных разрывов ДНК. Установлены средние значения и пределы варьирования скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гранулоцитов у здоровых доноров.

Впервые обнаружено накопление повреждений в ДНК лимфоцитов при широком спектре заболеваний, сопровождающихся развитием вторичных ИДС и при вакцинации здоровых людей.

Сформулированы представления о роли антигенной нагрузки в развитии вторичных ИДС.

В модельных экспериментах впервые обнаружено, что одним из ранних событий при активации лимфоцитов митогенами in vitro является лабилизация структуры ДНК, регистрируемая по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток.

Обнаружено, что ДНК интенсивно пролиферирующих лимфоидных клеток содержит значительно большее количество щелочелабильных сайтов, чем ДНК покоящихся клеток. Активация лимфоцитов in vitro приводит к быстрому увеличению количества щелочелабильных сайтов до уровня, наблюдаемого в интенсивно пролиферирующих клетках, за несколько часов до начала пролиферации лимфоцитов.

Впервые обнаружено, что лабилизация структуры ДНК при активации лимфоцитов сопровождается понижением концентрации цАМФ и активности олигоАсинтетазы и повышением активности казеинкиназ.

Показано, что поддержание структуры ДНК интактных лимфоцитов обеспечивается высокой внутриклеточной концентрацией цАМФ и олигоаденилатов, а также интерфероном аг и зависит от ресинтеза короткоживущих РНК и белков.

Впервые показано, что в индукции повреждений в ДНК лимфоцитов наряду с генерацией активных метаболитов кислорода важная роль может принадлежать специфическим цитотоксическим факторам, образующимся при активации лимфоцитов суперантигенами (стафилококковым энтеротоксином В, СЭВ).

При активации мононуклеарных лейкоцитов СЭВ впервые обнаружена секреция цитотоксических факторов, индуцирующих на поверхности клеток-мишеней экспрессию РАБ-антигена и появление ОР в их ДНК.

На основе обнаруженных закономерностей сформулированы представления о новых, неизвестных ранее механизмах нарушения функций иммунокомпетентных клеток.

Практическая ценность результатов проведенной работы определяется тем, что:

- Установлены средние значения и пределы варьирования способности лимфоцитов к репарации ДНК и скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови человека, которые могут быть использованы в качестве контрольных уровней в различных медико-экологических исследованиях.

- Разработанные количественные критерии оценки степени тяжести повреждения ДНК лейкоцитов периферической крови человека при заболеваниях, при иммунизации и при химиотерапии онкологических больных могут быть использованы в практической медицине при дифференциальной диагностике эндогенных и экзогенных генотоксических воздействий.

- Установленные параметры оценки степени тяжести повреждения ДНК лимфоцитов по изменению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток могут быть использованы для количественной оценки тяжести иммунотоксических реакций человека.

- Разрабртанные подходы и обнаруженные количественные закономерности могут быть использованы для создания скрининговых тест-

систем для количественной диагностики действия генотоксических факторов.

Апробация диссертационной работы.

Результаты, описанные в диссертации, были представлены на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллин, 1990); на 2-ом Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (15-18 октября 1985 г., Львов); на 1-ом Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987 г.); на 6-ом Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций" (Петрозаводск, 1988 г.); на 3-ей международной конференции по фактору активации тромбоцитов, Токио, Япония 1989; на 1-ом Всесоюзном радиобиологическом съезде (21-27 августа 1989г., Москва); на 1-ом Всесоюзном съезде научного общества иммунологов (15-17 ноября, 1989 г., Сочи); на 1-ом Всесоюзном конгрессе по болезням органов дыхания (9-12 октября 1990 г., Киев); на конференции 1БОВМ (23-27 сентября, Москва); на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки" (Минск, 1990); на Международном симпозиуме "Проблемы иммунофармакологии" (2-6 октября 1990 г., Тбилиси); на 2-ом Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (22-28 октября 1991 г., Самарканд); на Всесоюзном симпозиуме "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и при патологии" (6-8 сентября 1990 г., Новосибирск); на 5-ой Европейской конференции по онкологии (19-25 января, Мерибель-Моттаре, Франция 1997 г.).

По теме диссертации опубликовано 45 работ.

Структура и объем диссертации. Структура диссертации страдиционна. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результаттов и их обсуждения, общих выводов, указателя литературы, включающего 46 отечественных и 255 иностранных

источников. Текст диссертации изложен на _ страницах,

иллюстрирован 37 таблицами и 36 рисунками.

Положения, выносимые на защиту.

1. При заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний, обнаруживается снижение способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК.

2. При различных заболеваниях обнаруживаются повреждения ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови. Их степень

сопоставима с уровнем повреждений ДНК, индуцируемых в ядросодержащих клетках крови онкологических больных при химиотерапии, но существенно ниже этого уровня. Степень изменения показателей клеточного иммунитета у больных коррелировала со степенью повреждения ДНК лимфоцитов.

3. В основе снижения названных выше показателей стабильности ДНК лимфоцитов лежит каскад биохимических событий, индуцируемых в лимфоцитах при взаимодействии с различными антигенами. В индукции повреждений ДНК лимфоцитов и гранудоцитов важная роль может принадлежать как активными метаболитам кислорода, генерируемым гранулоцитами и моноцитами при взаимодействии с антигенами, так и цитотоксическим лимфоцитам и специфическим цитотоксическим факторам, секретируемым активированными лимфоцитами.

4. Лабилизация структуры ДНК лимфоцитов, регистрируемая по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК, является одним из ранних событий при активации лимфоцитов митогенами in vitro. Поддержание структуры ДНК иктактных ЛПК обеспечивается высокими внутриклеточными концентрациями цАМФ и олигоА, интерфероном ai и зависит от ресинтеза короткоживущих РНК и белков.

Содержание диссертации.

В основу диссертационной работы включены результаты исследования способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК у здоровых людей и при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний; исследования структуры ДНК лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров при различных заболеваниях и генотоксических воздействиях; исследования структуры ДНК и молекулярно-биохимических механизмов ее лабилизации при активации лимфоцитов периферической крови человека in vitro.

Для реализации поставленных задач были использованы следующие методы: выделение мононуклеарных лейкоцитов, лимфоцитов и гранулоцитов на основе градиентного центрифугирования и удаление моноцитов с помощью адгезии на пластике; анализ субпопуляции лимфоцитов проводили при помощи проточного цитофлюориметра -анализатора и сортировщика клеток EPICS-C; способность лимфоцитов к репарации ДНК оценивали по соотношению величин индуцирвоанного УФ-

облучением и спонтанного репаративного синтеза ДНК с изспользованием 3Н-тимидина и радиометрических методов; определение количества сестринских хроматидных обменов в лимфоцитах человека проводили с помощью дифференциального окрашивания сестринских хроматид 5-бромдезоксиуридином; структуру ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови человека, а также перевиваемых клеточных линий исследовали с помощью прямого флуориметрического метода с бромистым этидием в качестве флюорофора; интенсивность биосинтеза ДНК определяли по включению 3Н-тимидина, а РНК - 3Н-уридина в кислотонерастворимую фракцию клеток; выживаемость культивируемых клеток после инкубации с различными препаратами или цитотоскическими клетками оценивали с помощью витального красителя МТТ; цитотоксическую активность различных субпопуляций лейкоцитов оценивали по выходу радиоактивного хрома или по выживаемости клеток-мишеней; содержание иммуноглобулинов определяли с помощью спектрофотометрического метода; определение содержания цАМФ в клетках осуществляли с помощью наборов "Amersham"; активность протеинкиназ определяли по включения радиоактивного фосфора АТФ в гистон HI или казеин; активность 2',5'-олигоаденилатсинтетазы определяли после частичной очистки на поли(И)-поли(Ц)-агорозе по включению 3Н-АТФ; секрецию активных метаболитов кислорода клетками крови регистрировали по появлению хемшпоминесценции люминола; статистическую обработку данных по методу Стьюдента и регрессионный анализ проводили с использованием компьютерной программы "Origin".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование способности лимфоцитов периферической крови к репарации

ДНК у здоровых людей и при заболеваниях, сопровождающихся развититем вторичных иммунодефицитных состояний Экспериментальная модель для опенки способности лимфоцитов -периферической крови человека к репарации ДНК.

Для исследования способности ЛПК к репарации ДНК была разработана специальная модель, включающая выбор повреждающего ДНК тест-воздействия для выявления репарационной активности и

количественного метода определения способности лимфоцитов к репарации ДНК. Механизмы эксцизионной репарации повреждений ДНК, возникающих после воздействия УФ-излучения или химических ДНК-тропных агентов, одинаковы и в случае снижения активности этой системы выявляются при обоих типах воздействия. При УФ-облучении максимальная величина репаративного синтеза ДНК обнаруживается уже после доз 20-50 Дж/м2 и сохраняется на уровне плато при дальнейшем увеличении дозы, в то время как при воздействии химических мутагенов обычно наблюдается максимум реакции, после которого при дальнейшем увеличении концентрации действующего вещества происходит угнетение репаративного синтеза ДНК вследствие химической инактивации соответствующих ферментов. Кроме того, уровень репарации, оцениваемой по включению 3Н-тимидина в ДНК после повреждающего ДНК воздействия в присутствии ингибитора репликативного синтеза оксимочевины, в значительной мере зависит от величины эндогенного пула тимидина, который может существенно различаться у разных лиц. На его величину оказывают влияние также различные химические соединения, но не УФ-облучение (В1апсЫ У.е1 а!, 1982). Исходя из этого, в качестве повреждающего ДНК тест-воздействия нами выбрано облучение клеток УФ-излучением в стандартной дозе.

Отношение репаративного синтеза ДНК после тест-воздействия к спонтанному репаративному синтезу принято за меру способности лимфоцитов к репарации ДНК. При гаком подходе нивелируются индивидуальные различия в величине эндогенного пула тимидина в клетках, а кроме того, уровень спонтанного репаративного синтеза ДНК (в случае его повышения) может свидетельствовать о наличии повреждений в ДНК клеток.

В наших условиях расчетная доза 100 Дж/м2 соответствует плато на кривой. При этой дозе выявляются индивидуальные различия как по величине репаративного синтеза, так и по способности лимфоцитов к репарации ДНК.

Изучение сезонных колебаний способности лимфоцитов здоровых доноров к репарации ДНК показало, что в отдельных случаях наблюдались 1,5-2 кратные различия в уровне способности к репарации ДНК, в то время как в других случаях этот показатель был более стабилен. По-видимому, способность лимфоцитов к репарации ДНК детерминируется не только

генетическими, но и эпигенетическими, или экологическими, факторами. При этом не отмечено зависимости этого показателя от пола обследуемых.

При обследовании 39 здоровых доноров способность лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК колебалась от 1,4 до 8,8 ед. Ее среднее значение составило 4,9 ± 0,4 ед. Частота встречаемости различных уровней способности лимфоцитов к репарации ДНК соответствует нормальному распределению и носит унимодальный характер (Рис. 1).

Исхода из полученных данных и биологического значения изучаемого показателя, способность к репарации ДНК менее 2 ед. считали низкой, от 2 до 5 ед. - средней и более 5 ед. - высокой. При использовании такой шкалы низкая способность лимфоцитов к репарации ДНК наблюдалась в 2,6% случаев, средняя - в 56,4% и высокая - в 41% случаев. Полученные данные можно использовать в качестве сравнения при исследовании групп лиц с различным заболеваниями внутренних органов, а также лиц, подверженных воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

С помощью выбранного методического подхода обнаружены 6-кратные индивидуальные различия в способности ЛПК к репарации ДНК. Показано, что даже среди здоровых доноров есть лица с низкой репарационной способностью. Разработанная модель оценки способности лимфоцитов периферической крови человека к репарации ДНК была использована для оценки способности лимфоцитов к репарации ДНК при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний, - при неспецифических заболеваниях легких, остром инфаркте миокарда, рассеянном склерозе и в некоторых других случаях. Исследование способности к репарации ДНК лимфоцитов-периферической крови болытх-при остром инфаркте миокарда.

Острый инфаркт миокарда (ОИМ) сопровождается глубокими изменениями обмена веществ, эндотоксикозом; кардиомиоциты во внеинфарктной зоне под действием этих факторов претерпевают дистрофические изменени. В связи с этим можно было ожидать, что лимфоциты периферической крови больных ОИМ также претерпевают токсическое воздействие эндогенных факторов. Поэтому целью настоящего раздела исследования явилось изучение способности лимфоцитов к репарации ДНК и спонтанного репаративного синтеза ДНК как показателей, отражающих стабильность генома лимфоцитов периферической крови

человека при крупноочаговом ОИМ в сравнении с иммунологическими показателями в динамике заболевания. Обследовано 40 больных ОИМ.

В таблице 1 представлены значения спонтанного репаративного синтеза ДНК и способность лимфоцитов периферической ]фови к репарации ДНК у здоровых и больных ОИМ с различными клиническими особенностями заболевания в первые дни развития инфаркта.

Таблица 1

Спонтанный репаративный синтез ДНК и способность лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК у больных ОИМ в 1-ю неделю заболевания

Группа Число Спонтанный Способность

обследованных обследованных репаративный лимфоцитов

синтез ДНК, % от периферической

нормы крови к

репарации ДНК,

усл. ед.

Здоровые 39 100,08±8,0 4,9±0,4

Больные ОИМ 15 468,0±158,0 1,8±0,4*

В том числе:

с осложнениями 9 449,3±] 20,7* 1,1+0,3*

при поступлении

без осложнений 6 498,0±136,7* 2,3+0,8*

при поступлении

с прединфаркт- 6 800,7±366,7 0,8±0,3*

ным периодом в

анамнезе

без предынфаркт- 9 322,0±41,3* 2,2±0,7*

ного периода в

анамнезе

* - отличия от нормы достоверны (р < 0,05).

Как следует из представленных данных, у больных ОИМ обнаружено 5-кратное повышение спонтанного репаративного синтеза ДНК, что свидетельствует о наличии значительных повреждений в ДНК клеток. Изменения спонтанного репаративного синтеза практически не зависели от клинических особенностей заболевания. Тенденция к нормализации этого показателя наблюдалась ко 2-3-й неделе заболевания. Однако на протяжении всего исследования спонтанный репаративный синтез в лимфоцитах больных приблизительно в 2 раза превышал норму. Одновременно обнаружено глубокое снижение способности лимфоцитов к репарации ДНК. Снижение было более глубоким у больных ОИМ, осложненным пневмонией, отеком

и

легких или перикардитом, а также у больных, в анамнезе которых был прединфарктный период.

У больных крупноочаговым ОИМ на 1-й неделе заболевания отмечалось снижение абсолютного и относительного количества Т-лимфоцитов и теофиллинчувствительных лимфоцитов при повышении абсолютного и относительного количества B-лимфоцитов. На 2 - 3-й неделе инфаркта миокарда усугублялся дефицит как относительного, так и абсолютного количества Т-лимфоцитов, теофиллинчувствительных лимфоцитов. На 4-бй неделе все перечисленные показатели имели тенденцию к нормализации, но контрольного уровня не достигали.

Резюмируя полученные результаты можно заключить, что при ОИМ выявлены глубокие и длительные повреждения генома лимфоцитов, заключающиеся в повреждении ДНК клеток и снижении способности лимфоцитов к репарации ДНК. Нормализация изучаемых показателей после проведения плазмафереза позволяет полагать, что генотоксическое действие оказывают именно эндогенные факторы, содержащиеся в плазме крови больных. Одновременно обнаружены выраженные иммунологические сдвиги, характеризующиеся дефицитом Т-лимфоцитов с глубоким дисбалансом субпопуляций теофиллинчувствительных и

теофиллинрезистентных лимфоцитов. Обнаруженные изменения стабильности генома лимфоцитов должны неизбежно приводить к нарушению различных функций этих клеток. Возможно, именно повреждение генома лимфоцитов под действием эндогенных факторов может быть одной из наиболее важных причин развития иммунологических сдвигов у больных, перенесших ОИМ.

Исследование способности к репарации ДНК лимфоцитов-периферической крови больных рассеяным склерозом.

При рассеяном склерозе (PC) важной значение имеет состояние иммунной системы. В литературе описано нарушение клеточного иммунитета периферического звена при этом заболевании (A.B.Караулов и др., 1980). Исследование способности лимфоцитов периферической крови к эксцизионной репарации ДНК у больных PC проводили в зависимости от длительности и клинической формы заболевания.

Группа из 22 больных PC, госпитализированных в отделение неврологии 1-ой градской больницы, была разнородной по длительности и

тяжести заболевания, частоте и длительности ремиссий. Кроме того, было обследованно 4 больных с диагнозом рассеянного энцефаломиелита. Многие больные ранее получали гормоноальные препараты, а в момент обследования - витамины, цереброзилин, эссенциале, метионин, теоникол, глутаминовую и никотиновую кислоты. Способность лимфоцитов к репарации ДНК в среднем у этих больных была снижена и варьировала от 0,3 до 7 усл. ед. (Таблица 2). Степень снижения способности лимфоцитов к репарации ДНК коррелировала с тяжестью заболевания, но не с его длительностью.

Таблица 2

Способность лимфоцитов периферической крови к эксцизионной репарации ДНК и спонтанный репаративный синтез при рассеянном склерозе

Группа обледованмых Способность к репарации, усл.ед. Спонтанный репаративный синтез, % от нормы

Здоровые доноры 4,9±0,5 (39) 100±9 (39)

Больные рассеянным энцефаломиелитом 3,8±0,8 (4) 84+37 (4)

Больные РС 2,2±0,3* (22) 160±36 (15)

С длительностью заболевания годы: 5 6-10 более 11 1,7±0,4*(<5) 2,7±0,4* (16) 3,1±1,3(3) -

С ремиттирукчцей формой: в период ремиссии в период обострения 4,8±0,6 (2) 2,4±0,4* (15) -

С прогрессирующей формой 1,3±0,3* (5) -

Примечание: в скобках - число обследованных, * - отличия от уровня нормы достоверны.

Уровень спонтанного репаративного синтеза ДНК у больных был несколько выше, чем у здоровых доноров, но у 3 больных РС он превышал контрольные значения в 7-15 раз. Следовательно, по этим данным можно предполагать, что ДНК лимфоцитов больных РС не содержит повреждений, хотя у отдельных больных они имеют место.

Исследование способности к репарации ДНК лимфоцитов-периферической крови больных-при неепецифических заболеваниях легких.

Иммунодефицитные состояния обнаружены при хроническом обстуктивном бронхите и других неспецифических заболеваниях органов дыхания (В.П.Сильвестров и др., 1985). Поэтому у таких больных исследовали способность лимфоцитов к репарации ДНК.

В зависимости от клинической картины заболевания больные получали те или иные антибиотики (бензилпенициллин, полусинтетические пенициллины или тетрацшслины), антигистаминные препараты и муколитические средства по обычной схеме.

Таблица 3

Способность лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК у больных с неспецифическими заболеваниями легких до и после антибиотикотерапии

Группы обследованных Число обследованных Способность лимфоцитов к репарации ДНК, усл. ед. Процент лиц с низкой способностью к репарации ДНК

Контроль (здоровые доноры) 39 4,9+0,4 2,6

Острая пневмония:

при поступлении 14 4,1+0,7 35,7

после окончания лечения 20 1,3±0,3* 80,0

Хронический бронхит и

хроническая пневмония: при поступлении после окончания лечения 10 4 3,5+0,9 0,6+0,2* 40,0 100,0

Объединенная группа с неспецифическими забо-

леваниями легких:

при поступлении 24 3,8±0,4 37,5

после окончания лечения 24 1,2+0,2* 87,5

В том числе:

после лечения бензилпе-

нициллином 6 0,б±0,2* 100,0

после лечения тетрацик-линами (вибрамицин, рондомицин, тетраолеан) 7 1,1±0,5* 85,7

* - р < 0.05

Как видно из таблицы 3, средние показатели способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК при острой пневмонии (4,1±0,7) и хронических заболеваниях легких (3,5+0,9) в момент поступления в клинику статистически не отличаются от показателей у здоровых доноров (4,9±0,4). Однако процент лиц с низкой способностью к репарации ДНК (т.е. менее 2,0) среди больных с неспецифическими заболеваниями легких в 14 раз выше, чем среди здоровых. После окончания курса антибактериальной терапии у больных острой пневмонией и больных хроническими заболеваниями легких отмечалось статистически достоверное глубокое угнетение способности лимфоцитов к репарации ДНК при лечении пенищшшнами и препаратами тетрациклинового ряда. При этом наиболее сильное угнетение способности лимфоцитов к репарации ДНК наблюдалось у больных, получавших бензилпенициллин.

Способность лимфоцитов к репарации ДНК начинает восстанавливаться сразу после окончания курса лечения антибиотиками уже через неделю, причем у больного И. - на фоне продолжения антибактериальной терапии другими препаратами. При хронической пневмонии угнетение способности к репарации ДНК было более длительным и наблюдалось и через 3 недели после начала терапии.

Снижение способности лимфоцитов к репараци ДНК при антибактериальной терапии носит опосредованный характер и может быть обусловлено либо бактериальными продуктами, либо продуктами их метаболизма в организме, либо действием интермедиатов воспаления, либо с побочными явлениями, связанными с биологическим действием антибиотиков. Среди последних наибольшего внимания заслуживает, вероятно, бактериолиз, протекающий с образованием эндотоксинов, и развитие гиповитаминозов или сочетание этих реакций. Влияние бактериальных эндотоксинов, а также гиперэкскреция свободно-радикальных метаболитов кислорода, образуемых фагоцитирующими гранулоцитами и макрофагами, могут вызывать угнетение способности лимфоцитов к репарации и вне действия антибиотиков, но видимо, в значительно меньшей степени, что и обусловливает больший, чем в норме, процент лиц с низкой способностью лимфоцитов к репарации ДНК. При лечении антибиотиками угнетение способности лимфоцитов к репарации

ДНК, как отмечалось, наблюдается у 80-100% больных. Обнаруживаемое с высокой частотой (35-40%) у больных с неспецифическими заболеваниями легких снижение способности лимфоцитов к репарации ДНК и ее угнетение в процессе терапии может вносить существенный вклад в механизмы развития временной или длительной вторичной иммунологической недостаточности.

Нарушение способности лимфоцитов к репарации ДНК при изученых Состояниях может приводить к накоплению таких повреждений в ДНК клеток, выявление которых возможно на хромосомном уровне. Поэтому, у части больных совместно с Н.В.Умновой была изучена частота СХО в лимфоцитах периферической крови при неспецифических заболеваниях легких при поступлении в клинику и после окончания антибактериальной терапии, то есть до введения какого-либо лекарственного препарата, и сразу после окончания антибактериальной терапии (5-7-е сутки после начала введения препарата). Контрольную группу составили здоровые люди соответствующего возраста и пола.

В лимфоцитах больных НЗЛ обнаружено значительное увеличение частоты СХО по сравнению со здоровыми лицами (р<0,01). Частота СХО в лимфоцитах здоровых людей изменялась в пределах 1-17 СХО на клетку, в лимфоцитах больных - в пределах 1-22 СХО на клетку, она возрастала после антибактериальной терапии. Возрастание частоты СХО у больных идет за счет увеличения числа клеток, несущих повышенное число обменов. При этом, обнаружена высоко значимая корреляция между увеличением числа СХО и снижением способности ЛПК к репарации ДНК.

40

;о

Рис.1. Гистограммы частоты встречаемости разных уровней способности лимфоцитов к репарации ДНК и теоретические кривые

распределения этого показателя у здоровых доноров (1) и при заболеваниях (2). По оси абсцисс - способность к репарации ДНК, усл.ед; по оси ординат -частота встречаемости,%.

Завершая анализ изменения способности ЛПК к репарации ДНК при изученных заболеваниях по сравнению с аналогичными параметрами у здоровых доноров следует отметить следующее (Рис. 1). При обработке данных, полученных на всей группе здоровых доноров, обследованных за время проведения данного исследования (152 человека в возрасте от 20 до 46 лет, 78 мужчин и 74 женщины, сплошная линия) средняя величина способности ЛПК к репарации ДНК оказалась такой же, как и при начальном исследовании (4.9+0.4 усл.ед.). При анализе объединенных данных, полученных для всех обследованных групп больных (пунктирная линия) видно, что при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных НДС такой уровень способности к репарации ДНК наблюдается только у 10 % больных, а вся кривая смещена влево, в область низких значений способности к репарации ДНК. Обнаруженное при НЗЛ повреждение ДНК в составе хромосом, выявляемое по повышению частоты СХО, повышение спонтанного репаративного синтеза ДНК и одновременное снижение способности лимфоцитов к репарации ДНК может свидетельствовать о нарушении в ЛПК при изученных заболеваниях механизмов, направленных на поддержание целостности структуры ДНК. Исследованию состояния структуры ДНК лимфоцитов периферической крови здоровых людей и у больных при уже изученных заболеваниях посвящен следующий раздел работы.

Исследование структуры ДНК лимфоцоитов периферической крови у здоровых доноров, при различных заболеваниях и генотоксических воздействиях

Исследование структуры ДНК здоровых доноров.

Для оценки состояния структуры ДНК ЛПК использованли специально разработанный для регистрации ОР ДНК ядросодержащих клеток крови человека прямой флуориметрический метод, основанный на различной интенсивнтсти флуоресценции комплекса бромистого этидия с двунитевой ДНК (дДНК) и однонитевой ДНК (оДНК) или РНК. При использовании этого метода наряду с ОР выявляются и щелочелабильные сайты (ЩЛС) в ДНК, т.е. те повреждения ДНК, которые в щелочных условиях превращаются в ОР. О наличии повреждений в ДНК клеток судили по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов П, оцениваемой по количеству ДНК, остающейся в виде двунитевой ДНК

через 1 час лизиса в стандартных условиях (рН 12.8). Снижение величины О, которая расчитывается по формуле: Э = (Р-В)/(Т-В) х 100%, где Т - полная флуоресценция проб, Р - флуоресценция после ограниченного щелочного лизиса, а В - фоновая флуоресценция, свидетельствует об увеличении скорости щелочной денатурации ДНК и увеличении количества повреждений (ОР или ЩЛС) в ДНК клеток.

При обследовании 40 здоровых добровольцев в возрасте от 25 до 45 лет (25 мужчин и 15 женщин) этот показатель для ЛПК колебался от 69.3 до 98.6%, составляя в среднем 81.9 ± 1.0 %, что свидетельствует об отсутствии эндогенных повреждений в ДНК исследуемых клеток. Частота встречаемости различных значений величины Б у здоровых доноров соответствует нормальному распределению (Рис. 2).

Рис.2. Гистограмма частоты встречаемости разных уровней величины Б для лимфоцитов и теоретическая кривая распределения этого показателя у здоровых доноров. По оси абсцисс - величина Б, усл.ед; по оси ординат -частота встречаемости,%.

Таким образом, свежевыделенные лимфоциты практически не содержат спонтанных разрывов ДНК. Следовательно, свежевыделенные ЛПК могут быть использованы для индикации эндогенных и экзогенных генотоксических воздействий по степени повреждения их ДНК. Исследование структуры ДНК ЛIIК'при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний.

Структура ДНК ЛПК была изучена у больных с острым инфарктом миокарда, с рассеянным склерозом и с неспецифическими заболеваниями легких, т.е. при тех заболеваниях, при которых ранее были обнаружены нарушения способности этих клеток к репарации ДНК. Полученные результаты в сравнении с величиной спонтанного реларативного синтеза,

повышение которого косвенно свидетельствует о наличии повреждений в ДНК клеток, и с данными способности ЛПК к репарации ДНК представлены в таблице 4.

Таблица4

Структура ДНК, спонтанный репаративный синтез и способность ЛПК к репарации ДНК при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичной иммунологической недостаточности

Группа обледуемых Структура ДНК, Б, усл.ед. Спонтанный репаративный синтез, % Способность к репарации ДНК, усл.ед.

Здоровые доноры 81.9±1.0 100.0+18.0 4.9±0.4

Острая и хроническая пневмония 69.1+3.2» 376.0±78.0* 1.2±0.2*

Острый инфаркт миокарда 70.7±1.5* 465.0±157.0* 1.8+0.4*

Рассеянный склероз 73.4±2.4* 160.0+36.0 2.2±0.3*

* - р < 0.05

При изученных заболеваниях обнаружено достоверное снижение величины О ЛПК, что свидетельствует о наличии повреждений (ОР и/или ЩЛС) в ДНК этих клеток. Данные о лабилизации структуры ДНК лимфоцитов при заболеваниях, сопровождающихся вторичными НДС, полученные с помощью прямого флуориметрического метода, подтверждаются и при исследовании величины спонтанного репаративного синтеза ДНК лимфоцитов, который возрастает при изученных заболеваниях в 1.6 - 4.6 раза. Способность лимфоцитов к репарации ДНК при этом снижена. Обнаружена значимая корреляция изменений в структуре ДНК и способности ЛПК к репарации ДНК и с величиной репаратизного синтеза ДНК.

Различия в степени лабилизации структуры ДНК и способности лимфоцитов к эксцизионной репарации ДНК могут в значительной мере определять различия в устойчивости иммунокомпетентных клеток к повреждающим воздействиям и нарушение функции этих клеток. Регистрируемые при заболеваниях изменения в структуре ДНК лимфоцитов и их способности к репарации ДНК могут быть обусловлены токсическими воздействиями эндогенной природы либо индуцироваться при взаимодействии бактериальных, вирусных или аутоантигенов с клеточной

поверхностью. Поэтому были исследованы те же показатели при активации иммунного ответа в процессе вакцинации здоровых доноров-добровольцев. Исследование структуры ДНК ЛПК-при вакцинации добровольцев.

Иммунизация доноров иммунной плазмы стафилококковым анатоксином (CAT) осуществлялась на станции переливания крови Минздрава РФ при трехкратном подкожном введении 1 мл CAT с интервалом в 1 неделю. Венозную кровь у 15 таких доноров брали при обследовании перед очередной иммунизацией и перед проведением плазмафереза и исследовали не позднее, чем через 1 - 2 часа после взятия. Иммунизацию пяти добровольцев вакциной против вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) осуществляли по той же схеме в поликлинике, кровь брали через 1, 5 и 14 суток после иммунизации.

Таблица 5

Структура ДНК и способность ЛПК к репарации ДНК при вакцинации добровольцев

Группа обледуемых Структура ДНК, D, Способность к

усл.ед репарации ДНК, усл.ед.

Иммунизация:

CAT 64.9±2.9* 2.5±0.4*

Вакцина против ВКЭ 75.9±0.5* 2.Ш.4*

* - р < 0.05

Полученные результаты представлены в таблице 5 и они позволяют заключить, что вакцинация человека, по-крайней мере исследованными антигенами, приводит к лабилизации структуры ДНК лимфоцитов иммунизированных доноров. Следует отметить,что количественно эти изменения были очень близки тем, которые наблюдали у больных с острым инфарктом миокарда, рассеянным склерозом, и при неспецифических заболеваниях легких.

Полученные результаты позволяют полагать, что, по-крайней мере, частично наблюдаемые при заболеваниях изменения генетической стабильности ЛПК обусловлены антигенной нагрузкой экзогенной (бактериальные или вирусные антигены) или эндогенной (тканевые аутоантигены при ОИМ и рассеянном склерозе) природы на иммунную систему. Поэтому следующий раздел работы был посвящен изучению

взаимодействия мононуклеарных лейкоцитов периферической крови с различными антигенами и митогенами в модельных экспериментах in vitro. Исследование структуры ДНК и молекулярно-биохимических механизмов ее лабшшзаиии -при активации лимфоцитов -периферической крови человека я vitro.

Анализ структуры ДНК при активации лимфоцитов митогенами.

Развитие иммунного ответа сопровождается дифференцировкой и пролиферацией иммунокомпетенгных клеток под действием антигена. При изучении молекулярных механизмов активации лимфоцитов в качестве модели иммунного ответа in vitro используют стимуляцию мононуклеарных лейкоцитов периферической крови митогенами.

Целью настоящего раздела работы явилось изучение вторичной структуры ДНК лимфоцитов периферической крови при активации митогенами по скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток. Процесс активации контролировали по усилению биосинтеза ДНК и РНК с использованием 3Н-тимидина и 3Н-уридина. В препаратах мононуклеарных лейкоцитов, анализируемых сразу после выделения, доля дДНК при стандартных условиях лизиса составила 79,7±4,0%. Эту величину принимали за 100% при анализе изменений, вызываемых различными воздействиями.

100

Рис. 3. Скорость щелочной денатурации ДНК (0,1, 2) и интенсивность биосинтеза ДНК (Д, 3, 4) и РНК (□, 5, 6) в интактных (1, 3, 5) и активированных Кон А (2, 4, 6) ЛПК человека. По оси абсцисс - время от начала инкубации, сутки; по оси ординат слева - величина О,, усл.ед, справа- индекс стимуляции включения 3Н-тимидина или 3Н-уридина, усл.ед.

Перевод лимфоцитов периферической крови в культуру сопровождается глубокими изменениями в структуре ДНК клеток (Рис. 3, кривая 1). Провоцирующими это явление факторами могло бы быть

митогенное воздействие используемой для культивирования ФБС или БЯ-антигенов моноцитов и В-лимфоцитов при взаимодействии с Т-клеточным рецептором лимфоцитов, так как при работе с мононуклеарными лейкоцитами часто имеет место незначительная спонтанная стимуляция биосинтеза ДНК - в 1,5-2 раза по сравнению с исходным уровнем (Рис. 3, кривая 3). Однако ни замена фетальной сыворотки на аутологичную, ни культивирование клеток на бессывороточной полной среде Ьсоу, ни очистка лимфоцитов от моноцитов и В-клеток не влияли на характер кривой 1. Высокая степень очистки лимфоцитов при этом контролировалась отсутствием стимуляции биосинтеза ДНК через 72 часа после воздействия Кон А.

Активация лимфоцитов периферической крови Кон А вызывает глубокие изменения в структуре ДНК этих клеток в ранние сроки после добавления митогена - снижение Б составляет 15-25% через 1-3 часа по сравнению с интактными клетками (Рис. 3, врезка, кривая 2). Через 18-72 часа отмечены сходные изменения в структуре ДНК как активированных, так и интактньгх лимфоцитов. Различия по величине Б составляют лишь 5 -15 % (Рис. 3, кривые 1 и 2), в то время как по увеличению биосинтеза РНК (кривые 5 и 6) через 18 часов, РНК и ДНК (кривые 3 и 4) через 48 - 72 часа активированные Кон А лимфоциты превосходят интактные клетки в 4 раза и 26 и 10 раз, соответственно. Аналогичные результаты получены при использовании в качестве митогенов ФГА и стафилококкового энтеротоксина А (Таблица 6).

Таблица 6

Скорость щелочной денатурации ДНК люатов лимфоцитов D при их активации in vitro с различными мнтогенами и антигенами__

Активатор Время инкубации, часы Индекс стимуляции

0 3 24

Контроль 80,0+1,7 80,0±1,7 64,8+0,4* 1,0

КонА 10мкг/мл 73,8+3,3 56,5±1,7* 27,9

CAT 1:10000 70,4±2,8 63,5±1,5* 18,0

ФГА 10 мкг/мл 72,0±1,0* 56,2+1,6* 28,0

СЭА 5х10-">М 75,9+2,7 65,3+0,7* 30,4

СЭА 10-Ш - 56,4+1,2* 7,0

СЭА 10*М - 11,4±1,1* 0,7

* - р < 0,05

При действии стафилококкового энтеротоксина А (СЭА) - мощного Т-клеточного митогена - степень повреждения структуры ДНК лимфоцитов была пропорциональна его концентрации и при высоких концентрациях, когда имела место значительная лабилизация ДНК клеток, снижался и индекс стимуляции пролиферации ЛПК, то есть существенно нарушалась функция клеток. Таким образом, одним из ранних событий при активации иммунного ответа является лабилизация структуры ДНК лимфоцитов.

Следует отметить, что степень лабилизации структуры ДНК пропорциональна как интенсивности биосинтеза ДНК, оцениваемой по включению 3Н-тимидина, гак и интенсивности транскрипции, оцениваемой по включению 5Н-уридина, однако при регрессионном анализе значимой корреляции между интенсивностью включения 3Н-тимидина или 3Н-уридина и скоростью щелочной денатурации ДНК не обнаружено. По-видимому, быстрое изменение структуры ДНК при активации лимфоцитов определяется трансмембранной передачей активирующего сигнала в ядро клетки и является одним из ранних этапов активации генома. Для сравнения

структуры ДНК лимфоцитов периферической крови и клеток лимфоидных органов было проведено специальное исследование.

Изучение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови в сравнении со структурой ДНК пролиферирующих лимфоидных и опухолевых клеток по скорости щелочной денатурации ДНК лизатов.

Исследовали структуру ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови человека и лимфоцитов периферической крови и костного мозга, тимоцитов и спленоцитов мышей линии СБА и клеток перевиваемых линий лимфолейкоза мыши ]МК/Ьу и 1Л210 и Т-клеточного лимфолейкоза человека Лигка! и миелолейкоза человека линии К562.

В таблице 7 представлены данные, полученные при исследовании покоящихся и пролиферирующих клеток. Показано, что наиболее медлено при рН 12,8 идет щелочная денатурация ДНК покоящихся лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови. В этих образцах через 1 час щелочной денатурации соответственно 79,9±1,5 и 88,8±4,8% ДНК остаются в форме дДНК, в то время как в делящихся клетках при тех же условиях щелочной денатурации доля дДНК составляет лишь 48,2-20,0%.

Таблица 7

Скорость щелочной денатурации ДНК лизатов лейкоцитов периферической крови и делящихся лимфондных клеток

Клетки D, усл.ед.

Лимфоциты человека 79,9+1,5(33)

Лимфоциты через 4S часов культивирования с ФГА 47,6±1,3 (3)

Гранулоциты человека 88,8±4,8 (36)

Лимфоциты мыши 80,2±1,1 (3)

Костный мозг мыши 39,4±2,8 (6)

Тимоциты мыши 48,2±7,5 (9)

бпленоциты мыши 27,0±2,2 (9)

Асцитные властные клетки: лимфопейкоза мыши L1210 лимфолейкоза мыши NK/Ly 20,0±2,6 (3) 21,4±2,6 (4)

Культивируемые-in vitro клетки: Лимфолейкоз человека Jurkai лог-фаза стационарная фаза Миелолейкоз человека KS62 20,9±2,3(4) 50,9±3,8(4)

лог-фаза стационарная фаза 32,Ш,8 (3) 63,2+2,4 (3)

Таким образом, структура ДНК покоящихся и пролиферирующих клеток существенно различается. Чувствительными к щелочи сайтами в ДНК пролиферирующих клеток могут быть репликативные вилки в клетках, находящихся в 8-фазе, и транскрипционные комплексы в клетках, находящихся в Со —Юг и 01-фазе, и сайты прикрепления ДНК к ядерному матриксу.

Молекулярно-биохимические механизмы изменения структуры ДНК лимфоцитов при активации ЛПК

Целью настоящего раздела исследования явилось изучение содержания цАМФ, активности протеинкиназ и 2',5'-олигоаденилатсинтетазы (ОАС) в процессе активации лимфоцитов митогенами, а также изучение влияния ингибиторов транскрипции и трансляции - актиномицина Д (АМД) и циклогексимида (ЦГИ) на структуру ДНК лимфоцитов периферической крови.

Содержание цАМФ в свежевыделенных лимфоцитах человека в среднем составляет 1,5±0,15 пмоль цАМФ на 1 млн клеток, однако у некоторых доноров эта величина достигала 7 пмоль на 1 млн клеток. Переведение лимфоцитов в культуту сопровождается резким снижением

Рис. 4. Уровень цАМФ (А) и активность КК (Б) в интактных (1) и Кон А-стимулированных (2) лимфоцитах и клетках Т-клеточной лимфомы человека линии 1игка1 (3). По оси абсцисс - время от начала инкубации, сутки; по оси ординат - уровень цАМФ (А), % или КК (Б) пмоль/мин/млн клеток

уровня цАМФ в течение 1-х суток культивирования (рис. 4А). Такие же изменения происходят и в присутствии КонА. На 3-й сутки культивирования содержание цАМФ снижено в 3 - 10 раз по сравнению со свежевыделенными лимфоцитами, что всего в 2 раза превышает содержание цАМФ в опухолевых клетках Т-клеточной лимфомы человека линии Jurkat. В последних содержание цАМФ составляет 0,08±0,02 пмоль на 1 млн клеток.

При исследовании протеинкиназ обнаружено возрастание активности КК при стимуляции клеток к пролиферации (рис. 4Б). Их активность увеличивается в 2-2,5 раза уже в течение 1-х суток культивирования лимфоцитов с Кон Айв пик пролиферации достигает активности этих ферментов в опухолевых клетках Т-лимфомы. В отсутствие митогена активность КК увеличивается в течение 1-х суток после переведения лимфоцитов в культуру, но в последующие сутки она снижается и на 3-й сутки культивирования достигает уровня КК в свежевыделенных лимфоцитах.

Анализируя полученные результаты, следует отметить, что синхронная лабилизация структуры ДНК, снижение концентрации цАМР и увеличение активности КК обнаружены как в нестимулированных лимфоцитах через 1 сутки инкубации в питательной среде in vitro, что может быть связано со спонтанным переходом покоящихся клеток из фазы Go в фазу Gi, так и в Кон А-стимулированных лимфоцитах задолго до начала их пролиферации. Поэтому обнаруженные изменения в структуре ДНК и в системе белкового фосфорилирования можно отнести к ранним событиям перехода клеток от состояния покоя к пролиферации. Синхронность лабилизации структуры ДНК и снижения внутриклеточной концентрации цАМР позволяют предположить, что регуляция лабилизации структуры ДНК при активации покоящихся клеток связана с уровнем цАМР.

Другой важной системой, участвующей в регуляции пролиферации клеток, является система ресинтеза 2'-5'олигоаденилатов - 2'-5'-олигоАсинтетазы (ОАС) и 2'-5'-олигоА-фосфодиэстеразы. Активность ОАС отражает уровень накопления олигоаденилатов в клетке. Ее уровень повышен в ЛПК крови больных при вирусных и бактерильных инфекциях.

При изучении активности ОАС в лизатах лимфоцитов человека, инкубировавшихся в течение 3 суток in vitro в среде или в присутствии Кон А

или ИФаг (1000 ед/мл, Рис. 5), обнаружено снижение активности этого фермента до 14-25% уже через 1 сутки и до 1 -6% от исходного уровня к 3-м

Рис. 5. Активность ОАС в интактных (1) и Кон А-стимулированных (Г) лимфоцитах периферической крови и влияние добавления одного ИФаг (2, 1000 ед/мл) или ИФаг (1000 ед/мл) одновременно с Кон А (10 мкг/мл, 2') к интактным свежедвыделенным лимфоцитам. По оси абсцисс - время инкубации, сутки; по оси ординат - активность ОАС, %.

суткам в контрольных клетках. Активность ОАС в свежевыделенных ЛПК составила 9,0±1,2 нмоль/106 клеток. При инкубации лимфоцитов в присутствии ИФаг активность через 1 сутки была снижена лишь до 80% от исходного уровня, превышала его на 50% на 2-е сутки и снижалась до 50% к 3-м суткам, то есть введение ИФаг в среду инкубации существенно повышало активность ОАС лимфоцитов. При инкубации лимфоцитов с КонА (1') активность ОАС через 1 сутки была лишь на 55% ниже исходных значений, повышалась до исходного уровня ко 2-м суткам и существенно (в 2,2 раза) превышала его к 3-м суткам. Инкубация лимфоцитов при одновременном добавлении ИФаг и Кон А приводила к еще более высокому уровню активности ОАС - до 90, 180 и 280% от исходной на 1, 2 и 3-й сутки соответственно (2'). Следует отметить, что при этих условиях ИФаг блокировал пролиферацию ЛПК индуцируемую Кон А, оцениваемую по включению 3Н-тимидина.

Таким образом, как и в случае цАМФ, обнаружено, что снижение активности ОАС коррелирует с изменением структуры ДНК ЛПК при активации Кон А и что активность ОАС может быть повышена при введении

в среду инкубации клеток ИФаг. Поэтому было исследовано влияние введения в инкубационную среду ЛПК дибутирил-цАМФ (аналога цАМФ, проникающего в клетки), тримера 2',5'-олигоаденилата (АрАрАр) и И Фаг на структуру ДНК культивируемых ЛПК.

Таблица 8

Влияние цАМФ, олигоА и ИФаг на структуру ДНК ЛПК человека при инкубации in vitro. В скобках указаны абсолютные значения величины D

Препарат Скорость щелочной денатурации ДНК, D в % от контроля

В ремя инкубации, час

3 18 72

Интактные ЛПК 1 мМ дб-цАМФ К)-8 олигоА Ю-7 олигоА ИФа2(1000 ед/мл) 100,0±5,0 (79,4±4,0) 117,1±5,8 119,4±5,6 118,6+7,8 87,2±7,6 100,0±5,6 (63,0±4,5) 124,1±1,5* 100,0+7,0 (49,3±5,6) 126,5±9,8*

КонА-стимулиро-ванные ЛПК 1 мМдб- цАМФ Ю-8 М олигоА 107 М олигоА ИФа2(1000 ед/мл) 100±7,0 (46,0+4,3) 145,2±8,9* 140,7+0,9* 155,8±1,8* 105,9±3,4 149,1 ±2,3*

* р<0,05

При инкубации исследуемых веществ с нестимулированными ЛПК обнаружено статистически малозначимое повышение величины D через 3 часа инкубации in vitro с дибутирил цАМФ и олигоА и достоверная стабилизация структуры ДНК при инкубации с ИФа через 18 и 72 часа. При добавлении исследуемых веществ одновременно с КонА наблюдали достоверное повышение величины D, то есть стабилизацию структуры ДНК через 3 часа инкубации, а с ИФа - через 72 часа. Таким образом и ИФаг и соединения, участвующие в реализации его биологического действия -цАМФ и олигоА - участвуют в поддержании стабильности структуры ДНК, а снижение их концентрации при активации пролиферации приводит к лабилизации структуры ДНК до уровня, необходимого для пролиферации.

Важно подчеркнуть, что высокие дозы ИФаг ингибируют лабилизацию ДНК и при этом пролиферация ДНК становится невозможной.

Ивдукция лабилизации структуры ДНК ЛПК при активации может быть обусловлена индукцией синтеза специальных факторов. Для выяснения роли индуцибельных факторов в лабилизации структуры ДНК при активации ЛПК исследовали влияние ингибиторов транскрипции актиномицина D (АМД) и трансляции циклогексимида (ЦГИ) на структуру ДНК. Оказалось, что и АМД и ЦГИ, напротив, не стабилизировали структуру ДНК ЛПК, а усиливали ее лабилизацию. Важно, что этот эффект не зависел от используемых доз препаратов: 0,01-1,0 мкг/мл для АМД и 1-100 мкг/мл для ЦГИ через 3 часа инкубации. Через 18 часов инкубации 1,0 мкг/мл АМД и 100 мкг/мл ЦГИ вызывали глубокую деградацию ДНК. Представленные результаты позволяют полагать, что поддержание структуры ДНК интактных свежевыделенных ЛПК в состоянии, обеспечивающем низкую скорость щелочной денатурации, то есть высокую стабильность ДНК, обеспечивается не только высоким уровнем цАМФ и олигоА, но и некими регуляторными короткоживущими белками, ингибирование синтеза которых приводит к лабилизации ДНК.

Наблюдаемая лабилизация структуры ДНК при активации ЛПК in vitro может быть связана со спецификой организации ядерной ДНК в петлевые структуры в интактных и активированных к пролиферации ДНК лимфоцитах. Действительно, определенные последовательности ДНК, участвующие в организации сайтов прикрепления к ядерному матриксу либо находятся в частично "расплетенном" состоянии, либо имееют неканоническую вторичную структуру (D. Bode, 1992). При изучении фрагментации ДНК покоящихся и пролиферирующихся лимфоцитов с помощью Si и Ва131 нуклеаз, специфичных к однонитевой ДНК, показано, что способ взаимодействия геномной ДНК с ядерным матриксом различен в покоящихся и пролиферирующих ЛПК, и при блоке пролиферации изменяются ДНК-белковые взаимодействия в местах "заякоревания" ДНК (O.V.Iarovaya et al, 1995, S.V.Razin et all995).

Таким образом, обнаружено, что активация ЛПК и их пролиферация сопровождается лабилизацией структуры ДНК, регистрируемой по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК этих клеток, до уровня, наблюдаемого в пролиферирующих клетках лимфоидных органов.

Поддержание структуры ДНК обеспечивается высокими внутриклеточными концентрациями цАМФ и олигоА и интерфероном а. Кроме того, для этого необходим синтез РНК и белка. В то же время активация ЛПК осуществляется при непосредственном участии моноцитов - клеток, способных также как гранулоциты развивать окислительный взрыв. Поэтому было исследовано влияние ряда интермедиатов иммунного ответа, индуцирующих окислительный взрыв при взаимодействии с моноцитами и гранулоцитами.

Повреждение ДНК лейкоцитов периферической крови человека при действии индукторов окислительного взрыва.

Для выяснения механизмов лабилизации структуры ДНК при активации лимфоцитов было проведено изучение влияния ряда интермедиатов иммунного ответа на структуру ДНК ЛПК. Взаимодействие антигенов (или митогенов) с поверхностью клеток, участвующих в развитии иммунного ответа, приводит к выбросу большого числа биологически активных соединений, включая лимфокины, интерфероны, фактор активации тромбоцитов (ФАТ), фактор некроза опухоли (ФНО), лимфотоксины, различные факторы роста кроветворных клеток, метаболиты окислительного взрыва, которые продуцируются при взаимодействии моноцитов, макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов с антигенами. Следует подчеркнуть, что во всех экспериментах, за исключением особо оговоренных случаев в качестве лимфоцитов исследовали фракцию мононуклеарных лейкоцитов, в которых помимо лимфоцитов, присутствуют моноциты, количество которых составляет 10-20%, и которые, как отмечено выше, могут секретировать при активации метаболиты кислорода.

Фактор активации тромбоцитов (ФАТ, 1-0-алкил-зп-глицеро-3-фосфохолин) являющийся одним из хорошо изученых интермедиаторов воспаления, активирующим эозинофилы, нейтрофилы, тромбоциты и макрофаги. Поэтому целью исследования, представленного в настоящем разделе явилась оценка влияния ФАТ и таких суперантигенов как стафилоккоковые энтеротоксины А и В на секрецию АМК моноцитами и оценка степени повреждения ДНК ЛПК ФАТ и пероксидом водорода.

При добавлении ФАТ к суспензии моноцитов наблюдается выброс АМК, количественно оцениваемый по интенсивности люминол-зависимой хемилюминесценции. Гашение люминесценции наблюдали примерно через

три минуты после добавления ФАТ. Интенсивность выброса АМК, оцениваемая по интегральной хемшпоминесценции (ее измеряли по площади пика кривой) была пропорциональна концентрации ФАТ в диапазоне от 1 нМ до 3 мкМ.

При исследовании повреждения ДНК ЛПК под действием АМК мононуклеарные лейкоциты исследовали немедленно после добавления ФАТ или Н2О2 к суспензии клеток, так как разрывы ДНК, индуцируемые АМК быстро восстанавливаются, и через 1 час после добавления, чтобы оценить степень восстановления таких повреждений. Из полученных результатов следует (Рис. 6), что накопление разрывов в ДНК ЛПК наблюдается сразу после добавления пероксида водорода или ФАТ. Увеличение скорости щелочной денатурации ДНК было пропорционально концентрации Н2О2 или ФАТ в диапазоне от 5 до 100 мкМ. Струкута ДНК быстро восстанавливалась при инкубации обработанных Н2О2 или ФАТ клеток в питательной среде, если концентрация Н2О2 или ФАТ не превышала 100 мкМ (Рис. 6), Сравнивая

Рис. 6. Скорость щелочной денатурации ДНК лимфоцитов периферической крови сразу (1) и через 1 час (2) после добавления Н2О2 (О) или ФАТ (Д) и инкубации в питательной среде. По оси абсцисс - концентрация Н2О2 или ФАТ, нМ; по оси ординат - вечинина D, % от исходного уровня.

диапазон концентрации ФАТ, индуцирующих секрецию АМК моноцитами и повреждения ДНК ЛПК человека in vitro, следует подчеркнуть, что

повреждения ДНК наблюдаются при гораздо более высоких концентрациях ФАТ, чем те, при которых достигается индукция максимального выброса АМК и эти результаты демонстрируют принципиальную возможность повреждения ДНК клеток АМК при достижении достаточно высоких концентраций таких метаболитов в межклеточной щели или внутри клетки. Выброс АМК регистрируется и при взаимодействии СЭВ с мембраной моноцитов. Аналогичные данные были получены для СЭА. Лимфоциты, в отличие от моноцитов, не образуют активных метаболитов кислорода при взаимодействии со СЭ, что позволяет индукцию АМК мононуклеарными лейкоцитами целиком связывать с присутствующими в таких препаратах моноцитами.

Высокие дозы СЭ вызывают существенно более сильное повреждение ДНК и ингибирование пролиферации ЛПК (Таблица 6), чем те, которые вызывают максимальную стимуляцию пролиферации. В то же время, как следует из экспериментов с Н2О2, мало вероятно, что повреждения ДНК, индуцируемые при активации ЛПК, являются прямым следствием действия АМК. Более верояным событием, по-видимому, следует считать индукцию апоптоза при действии АМК или влиянии АМК в сочетании с другими регуляторными факторами. Повреждение ДНК ЛПК под действием АМК может иметь реальное значение в очаге воспаления in vivo, когда имеет место инфильтрация ткани полиморфноядерными лейкоцитами, так как гранулоциты (нейтрофилы и эозинофилы) очень интенсивно секретируют АМК в ответ на различные стимулы и при активации фагоцитоза.

Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что АКМ, образуемые моноцитами и полиморфноядерными лейкоцитами могут приводить к повреждению ДНК как самих гранулоцитов, так и лимфоцитов. Исследование механизмов повреждения ДНК клеток-мишеней при межклеточных взаимодействиях, опосредованных суперантигенами СЭА и СЭВ.

Экзотоксины St.aureus энетротоксины А и В (СЭА и СЭВ) являются суперантигенами и активируют до 30% лимфоцитов, индуцируют цитотоксическую активность лимфоцитов и, наконец, специфически связываясь с HLA DR-антигенами клеток делают их мишенью цитотоксических лимфоцитов. Последний механизм получил название СЭ-направленной клеточной ЦТА (СЭ-НЦТА). DR-антиген экспрессируется на

моноцитах, которые составляют до 20% фракции мононуклеарных лейкоцитов, на В-лимфоцитах (до 8% в этой фракции) и на активированных Т-лимфоцитах.

Целью данного раздела исследования явилось изучение различных механизмов действия СЭ-индуцированных цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) в зависимости от особенностей рецепторного аппарата клеток-мишеней.

Для стимуляции пролиферации ЛПК под действием СЭА или СЭВ было необходимо присутствие моноцитов или других антиген-представляющих клеток, так как при выделении ЛПК, очищенных от моноцитов, они были неспособны отвечать пролиферацией на добавление этих СЭ. В то же время при обработке моноцитов, очищенных от лимфоцитов, даже очень низкими концентрациями СЭ, и последующем тщательном отмывании СЭ, при смешивании СЭ-обработанных моноцитов с лимфоцитами в соотношении 1:10 наблюдали стимуляцию пролиферации последних. Таким образом, моноциты выполняют антигенпредставляющую функцию в отношении СЭА и СЭВ.

При исследовании влияния СЭ на пролиферирующие ЛПК обнаружено, что СЭА ингибировал пролиферацию лимфоцитов, причем этот эффект наблюдался уже через 6 часов после добавления токсина. Действие СЭВ было аналогичным. Ингибирование пролиферации КонА-стамулированных лимфоцитов 10 нМ СЭА и СЭВ может быть связано как с токсическими свойствами СЭ, определяемыми присутствием в его структуре в составе С-конца Са2+-независимого функционального аналога кальмодулина, Вас М (У.Уи.А1акЬоу еС а1, 1990), так и с СЭ-НЦТА после его связывания с НЬА БИ-антигеном активированных Т-лимфоцитов (О. Неё1ип<1 еГ а1, 1990).

Для исследования роли СЭ-НЦТА и ЦТА, обусловленной секретируемыми под действием СЭ растворимыми факторами, в реализации цитотоксического действия ЦТЛ, исследовали уровень ЦТА лимфоцитов, индуцируемой СЭ в отношении клеток-мишеней, экспрессирующих и неэкспрессирующих НЬА БК-антиген. Дальнейшие эксперименты были выполнены с СЭВ. В качестве клеток первого типа выбраны клетки В-клеточной лимфомы человека линии Ла^ (НЬА а второго типа - клетки карциномы яичника человека линии БКОУЗ. При анализе уровня экспрессии

Н1А БЯ-антигена на поверхности клеток линии Raji и БКОУЗ с помощью проточной цитофлуориметрии показано, что 100% клеток Яа^ экспрессируют НЬА БЯ, а клетки 5КОУЗ этот антиген не экспрессируют.

При исследовании антигенпредставляющей способности (АПС) клеток Яа^, БКОУЗ и моноцитов показано, что клетки Яа^ и моноциты эффективно представляют СЭВ лимфоцитам, в то время как клетки БКОУЗ практически не обладают АПС что полностью согласуется с отсутствием на поверхности этих клеток БЯ-антигена.

СЭ-НЦТА ЦТЛ изучали в отношении клеток мишений Яа^ (НЬА ОЯ+) и БКОУЗ (НЬА БЯ ) по выходу радиоактивности хрома из клеток-мишененй и по выживаемости клеток-мишеней при ко-культивировании с ЦТЛ. Полученные результаты представлены на Рис.7 А,Б. Из данных, полученных с использованием оценки ЦТА по выходу хрома, следует, что для клеток БКОУЗ отсутствует феномен СЭ-направленной ЦТА, а усиление ЦТА в присутствии СЭВ при ее оценке по выживаемости клеток-мишеней связано с активацией ЦТЛ, присутствующим СЭВ. Для подтверждения этого заключения были поставлены эксперименты с тщательным отмыванием клеток-мишеней БКОУЗ от токсина после инкубации с СЭВ. Полученные результаты позволили заключить, что усиление ЦТА, регистрируемое по выживаемости клеток определяется присутствием СЭВ в среде и связано с активацией ЛПК, а не с СЭ-НЦТА. Поэтому были изучены цитотоксические факторы, генерируемые ЦТЛ при активации СЭВ.

В специально проведенных экспериментах было показано, что в экстракте СЭБ-активированных МЛ не обнаружено мембранотропной активности (не обнаружено усиления высвобождения из клеток-мишеней хрома), но обнаружена высокая ЦТА, фиксируемая по выживаемости клеток (Табл. 9).

Обнаруженный факт, гибели клеток-мишеней под действвием ЦФ, секретируемых активированными МЛ, а не мебранотронных факторов, позволяет предполагать, что в этом случае имеет место индукция програмируемой клеточной гибели клеток карциномы, или апоптоз. Одним из отличительных признаков этого процесса является фрагментанция ДНК клеток на ранних этапах (спустя 6 часов после воздействия). Поэтому исследовали структуру ДНК клеток-мишеней после инкубации с экстрактом или культуральной средой СЭВ-активированных лимфоцитов, полученных

оцениваемая по выходу хрома-51 (I) и СЭ-зависимая ЦТА лимфоцитов периферической крови человека в отношении клеток линии Яа^ (II А) и Б КО УЗ (II Б), оцениваемая по выживанию клеток (II). По оси абсцисс - соотношение эффектор: мишень; по оси ординат - ЦТА, %.

через 18 часов после добавления 0,1 нМ СЭВ к МЛ. При этом было обнаружено, что уже через 6-18 часов после инкубации клеток-мишененй в среде, содержащей лизат или культуральную среду СЭБ-активированных лимфоцитов, происходит повреждение ДНК этих клеток, что регистрируется по увеличению скорости щелочной денатурации их ДНК (т.е. по снижению величины 0) и отражает накопление в ДНК клеток-мишеней однонитевых разрывов ДНК.

Таблица 9

ЦТА экстракта СЭВ-активированных и контрольных мононуклеарных лейкоцитов (МЛ), регистрируемая с помощью разных методов

Мишень Метод ЦТА, %

Экстрат МЛ Экстрат СЭБ-активированных МЛ

SKOV3 выход хрома 0 0

SKOV3 выживаемость клеток-мишеней 13,9 73,9

При исследовании уровня экспрессии FAS-антигена на поверхности клеток SKOV3 показано отсутствие экспрессии FAS на поверхности этих клеток. После инкубации клеток SKOV3 с питательной средой, кондиционированной интактными МЛ, обнаружена экспрессия FAS на поверхности 37%, а с SEB-активированными МЛ - 83% клеток линии SKOV3.

Полученные результаты позволяют заключить, что помимо СЭ-НЦТА, которая реализируется в результате непосредственного контанкта СЭ, клетки-мишени и ЦТЛ, не связана с образованием растворимых ЦФ и развивается в течение нескольких (4 и более) часов, СЭ индуцируют ЦТА, которая вызывает гибель клетки-мишени под действием ЦФ, секрегируемых СЭ-активироваными МЛ. Такая ЦТА развивается в течение нескольких суток (через 18-72 часа) и, по-видимому, определяется индукцией на клетках-мишенях FAS-антигена и последующего апоптоза при взаимодействии этого FAS-антигена с FAS-лигандом активированных Т-лимфоцитов, экспрессированного на поверхности лимфоцитов, или с его растворимой формой.

Эти же механизмы, по-видимому, могут приводить к гибели лимфоцитов под действием СЭ. Для оценки этой возможности исследовали экспрессию активационных антигенов и FAS-антигена при активации MJI СЭВ. При взаимодействии СЭВ с интактными МЛ их активация сопровождается появлением или усилением экспрессии ряда активационных антигенов, в том числе и HLA DR. Такие лимфоциты могут связывать СЭВ и превращать тем самым лимфоцит в мишень для СЭ-НЦТА. Кроме того появление в результате активации фракции лимфоцитов, эксперссирующих FAS-антиген (по нашим даннывм 12%), свидетельствует о готовности части лимфоцитов вступить в апоптоз после взаимодействия с FAS-лигандом.

В то же время следует учесть, что активация ЛПК сопровождается образованием и секрецией многочисленных цитокинов, часть которых способна, как было показано выше, по-крайней мере для ИФа, стабилизировать структуру ДНК активированных клеток. Поэтому, вероятно, значительные повреждения ДНК ЛПК под действием СЭВ регистрируются только при высоких дозах СЭВ.

Таким образом, в модельных экспериментах с использованием культивируемых опухолевых линий клеток человека показано, что СЭВ специфически связывается с рецептором клеточной поверхности (HLA DR-антигеном), что делает их высоко чувствительными к действию ЦТЛ. СЭ-НЦТА обнаружена только в отношении тех клеток, которые экспрессируют HLA DR-антиген. Кроме, того СЭВ стимулирует образование и секрецию растворимых ЦФ, которые индуцируют гибель клеток-мишеней, в том числе, тех которые не связывают СЭВ, причем уровень СЭВ-индуцированной ЦТА лимфоцитов очень высок. Эти же механизмы, по-видимому, лежат в основе индукции повреждения ДНК активированных лимфоцитов при заболеваниях, развивающихся в результате стафилококковой инфекции и тех состояниях, когда происходит активация ЦТЛ - при вирусных инфекциях и опухолевом процессе.

Заключая анализ структуры ДНК при активации лимфоцитов периферической крови человека in vitro можно констатировать следующее: 1) активация лимфоцитов сопровождается ранними (через 1-3 часа после действия активатора) изменениями структуры ДНК, регистрируемыми по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток; 2) структура ДНК пролиферирующих нормальных и опухолевых лимфоидных

клеток существенно отличается от структуры ДНК лимфоцитов периферической крови человека более высокой скоростью щелочной денатурации ДНК; 3) поддержание структуры ДНК покоящихся лимфоцитов обеспечивается высоким содержанием внутриклеточного цАМФ и олигоА и поддерживается интерфероном аг■ Кроме того для поддержания структуры ДНК необходим синтез РНК и белка; 4) индукция выброса АМК при активации окислительного взрыва в моноцитах и полиморфноядерных лейкоцитах может приводить к повреждению ДНК как гранулоцитов, так и лимфоцитов. Последнее явление может иметь место в очаге воспаления; 5) при межклеточных взаимодействиях с участием ЦТЛ при активации последних образуются и секретируются ЦФ, индуцирующие повреждения ДНК в клетках-мишенях. Целью следующего раздела работы явилось изучение структуры ДНК не только лимфоцитов, но и гранулоцитов периферической крови больных при различных, в том числе инфекционных, заболеваниях, сопровождающихся обширными воспалительными процессами, в сравнении с показателями, характеризующими состояние иммунной системы таких больных.

Структура ДНК лимфоцитов и гранулоцитов -периферической крови и иммунный статус больных-при различных заболеваниях.

Структура ДНК лейкоцитов периферической крови и иммунный статус хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями и при некоторых бактериальных инфекциях.

Структура ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови, а также иммунный статус изучены у 23 хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями. При микробиологическом исследовании раневого отделяемого был обнаружен рост бактерий следующих видов: гемолитический эпидермальный стафилококк, негемолитический эпидермальный стафилококк, золотистый стафилококк, зеленящий стрептококк, энтерококк, кишечная палочка, синегнойная палочка, клебсиела окситока и сочетание различных типов перечисленных выше микроогранизмов.

Из сопоставления изменений величины И лейкоцитов периферической крови с показателями клеточного иммунитета при различных формах гнойно-септических осложнений (табл. 10) можно заключить, что большая степень лабилизации структуры ДНК иммунокомпетентных клеток имеет

Таблица 10

Скорость щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гранулоцитов и показатели клеточного иммунитета у хирургических больных с разными формами гнойно-септических осложнений

Диагноз Скорость щелочной денатурации ДНК, Б, усл. ед. Субпопуляция лимфоцитов, %

лимфоциты гранулоциты С02 СБ20 СБ4 СБ8 ИРИ

Местный перитонит (п=6) 72,3±4,7 75,7±2,9 74,5±2,9 8,2±1,5 31,4±4,5 2б,6±2,5 1,5±0,3

ОРГП (п=10) 65,6±4,0* 70,2+5,3* 67,2±5,9 7,9±1,8 32,3±1,7* 23,1±2,2 1,4±0,2

Сепсис (п=4) 57,8+5,4* 54,0±9,1* 74,8±5,0 5,2±1,0* 30,0±4,3* 34,2±4,4 0,9±0,1 *

* - отличия от уровня нормы достоверны (р < 0,05)

место при наиболее тяжелых формах осложнений, сопровождающихся тяжелыми токсическими реакциями и наиболее глубокими изменениями показателей клеточного иммунитета. Так, в случае местного перитонита степень лабилизации струкуры ДНК незначительна. В случае же ОРГП и сепсиса скорость щелочной денатурации ДНК лизатов возрастает и величина D снижается до 66,6 и 57,8 усл.ед., соответственно. У этих же больных отмечено наиболее существенное снижение субпопуляции Т-хелперов (CD4+ -лимфоцитов) и ИРИ. При этом в случае гнойно-септических осложнений обнаружены изменения структуры ДНК не только лимфоцитов, но и гранулоцитов периферической крови больных.

При анализе полученного материала для сопоставления степени повреждения ДНК с тяжестью иммунологических нарушений обследованные больные были разделены на две группы. К 1-й группе отнесены больные, величина D для ДНК лимфоцитов которых была ниже 75 усл. ед., а ко 2-й группе - пациенты, у которых этот показатель был выше 75 усл.ед. Значение D, равное 75 ед,, выбрано как пограничное для деления больных на две группы, т.к. это значение, как было показано выше, соответствует минимальным изменениям величины D лимфоцитов при иммунизации добровольцев и активации лимфоцитов in vitro. Анализ иммунологических показателей и клинического состояния этих больных выявил следующее.

Во-первых, изменения D гранулоцитов больных, отнесенных к 1-й и 2-й группам, полностью коррелировали с изменениями этой величины для ДНК лизатов лимфоцитов, и оба показателя были достоверно ниже уровня нормы в 1-й группе. В этой группе оказались больные с (ОРГП) в реактивной или токсической фазе, сепсисом и местным перитонитом, в то время как во 2-й группе оказались те же больные в период выздоровления, больные хирургического профиля без гнойно-септических осложнений и 2 из 10 больных с ОРГП. У больных и 1-й, и 2-й групп отмечены существенные изменения иммунограммы, позволяющие и ту, и другую группу отнести к больным с иммунодефицитным состоянием (ИДС), но в 1-й группе отмечены более глубокое понижение относительного и абсолютного количества CD4+ -лимфоцитов, ИРИ и повышение концентрации IgG в сыворотне крови.

В случае гнойно-септических осложнений в развитии иммунотоксических реакций особая роль, по-видимому, принадлежит бактериальным токсинам. Полученные результаты позволяют рассматривать

скорость щелочной денатурации ДНК - Б -показатель, используемый для оценки генетической стабильности ДНК лимфоцитов периферической крови, - как важный прогностический признак при оценке иммунного статуса больных с тяжелыми токсическими осложнениями.

Изучен иммунный статус больных хроническим бруцеллезом и структура ДНК лейкоцитов периферической крови этих больных, а так же больных при таких бактериальных инфекциях, как острый циклический и хронических иерсиниоз и острый менингит. При этом у больных хроническим бруцеллезом обнаружена лабилизация ДНК лимфоцитов и, в значительно меньшей степени, гранулоцитов. При остром менингите, остром циклическом иерсиниозе и хроническом иерсиниозе не обнаружено значимых изменений структуры ДНК ни в лимфоцитах, ни в гранулоцитах периферической крови больных. У больных менингитом лабилизацию структуры ДНК лимфоцитов и гранулоцитов наблюдали лишь в отдельных случаях при повторных обследованиях спустя неделю после поступления в клинику. При этом значение Д для лимфоцитов снижалось до 63,3, а для гранулоцитов до 69. Эти данные свидетельствуют о том, что при инфекционном процессе лабилизация структуры ДНК ЛПК индуцируется не столько спетенью интоксикации, сколько локализацией возбудителя и воспалительного процесса и, возможно, особенностями патогенных микроорганизмов и спектра продуцируемых ими токсинов. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови и показатели клеточного иммунитета больных вирусным гепатитом В.

Органом-мишенью при вирусном гепатите В(ВГВ) является печень, однако другие клетки, в том числе и ядросодержащие клетки крови, могут инфицироваться этим вирусом (А.А.МеигаЛ е1 а1, 1990). Поскольку при ВГВ ядросодержащие клетки крови могут быть как непосредственным объектом действия вируса, так и испытывать действие токсических факторов вследствие развития гепатита, целью настоящего раздела работы явилось исследование структуры ДНК ЛПК и гранулоцитов периферической крови больных при разных формах ВГВ - остром ВГВ (ОВГВ), хроническом активном ВГВ (ХАГ), хроническом персистирующем ВГВ (ХПГ) и при циррозе печени (ЦП) - в сравнении с показателями клеточного иммунитета.

Анализ показателей клеточного иммунитета позволяет заключить, что у обследованных нами больных при всех формах ВГВ средние значения

процентного содержания Т-лимфоцитов (СБЗ+) и отдельных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных несколько ниже уровня нормы, хотя достоверных отличий от уровня нормы по этим показателям не обнаружено. В то же время у отдельных больных отмечено изменение иммунограммы, характеризующееся снижением субпопуляции СД8-лимфоцитов. У больных ЦП достоверно снижено абсолютное количество лимфоцитов в периферической крови и, соответственно, снижено абсолютное содержание всех субпопуляций лимфоцитов. Абсолютное содержание В-лимфоцитов достоверно снижено также у больных ОВГВ. Таким образом, при ВГВ по данным средних значений показателей клеточного иммунитета у обследованных нами групп больных обнаружена лишь тенденция к развитию вторичных иммунодефицитных состояний, хотя у отдельных больных нарушения клеточного иммунитета безусловно имеют место, и, возможно, именно они определяют хронизацию процесса.

При исследовании структуры ДНК ядросодержащих клеток крови больных ВГ обнаружено увеличение скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов при ОВГВ, ХПГ и ХАГ, но не при ЦП (таблица 11). При ОВГВ снижение величины О было статистически недостоверно, но оно отмечалось у половины обследованных больных и было более высоким не в разгар заболевания, а спустя три недели после поступления в клинику. Снижение величины О гранулоцитов обнаружено при всех формах ВГВ (при ХПГ мало значимое).

Таблица 11

Скорость щелочной денатурации ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови больных разными формами вирусного гепатита В

Диагноз Структура ДНК, И, усл.ед.

Лимфоциты Гранулоциты

Здоровые доноры 81,9±1,0 88,4+4,8

ОВГВ 72,8+4,3 71,2±2,9*

хпгв 68,9±4,6* 75,2+4,1

ХАВГ 75,7+1,8* 64,9±3,1*

ЦП 78,0±2,2 56,4±5,2*

*-р<0,05

Корреляционный анализ взаимосвязи исследованных показателей позволил заключить, что степень повреждения ДНК лимфоцитов

коррелирует со снижением числа СДЗ+- и СД4+- лимфоцитов, а также со степенью повреждения ДНК гранулоцитов.

Как и при анализе материала, полученного при исследовании структуры ДНК ЛПК хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями, обследованные больные были разделены на две группы: к первой отнесены больные, величина О для ДНК лизатов которых была ниже 75 ед, а ко второй - пациенты, у которых этот показатель был выше 75 ед. Оказалось, что как и при исследовании хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями, в 1-ую группу (Т)<75) попали больные с наиболее низким содержанием Т-лимфоцитов и СД4+-лимфоцитов. Скорость щелочной денатурации ДНК лизатов гранулоцитов была так же увеличена и составила 62,3 ед. У больных второй группы величина О лимфоцитов и показатели клеточного иммунитета не оличались от нормы, а величина Б гранулоцитов была существенно ниже нормы. Полученные данные свидетельствуют о более глубоком поражении гранулоцитов при ВГВ, чем при гнойно-септических осложнениях у хирургических больных. Возможно, это связано с нарушением продукции синтезируемых печенью гранулоцитарно-макрофагальных факторов при гепатитах.

Таким образом, при ВГВ обнаружено увеличение скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гранулоцитов, свидетельствующее о наличии повреждений в ДНК этих клеток. Изменения структуры ДНК коррелировали с уровнем СОЗ+ и СЮ4+-лимфоцитов и с величиной О для гранулоцитов. Наиболее глубокие повреждения ДНК обнаружены в ДНК гранулоцитов при циррозе печени. При ВГВ повреждение структуры ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови в большей степени отражают иммунотоксические процессы, чем обычно используемые показатели состояния клеточного иммунитета. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови больных при раке молочной железы.

У первичных больных раком молочной железы обнаружено изменение распределения величины Д для лимфоцитов: в этой группе она колебалась от 42,0 до 98,0 ед. и со значительно большей частотой наблюдали более низкие значения Б. Так, для лимфоцитов Т)<15 была у 52,0% больных и только у 5,8% здоровых, а для гранулоцитов - у 35% больных и ни у одного из

здоровых доноров. Средние значения Б для лимфоцитов и для гранулоцитов больных раком молочной железы достоверно ниже, чем у здоровых доноров.

Анализ зависимости степени лабилизации ДНК лимфоцитов и гранулоцитов от степени тяжести заболевания (таблица 12) позволяет отметить, что лабилизация структуры ДНК лимфоцитов имеет место во всех группах, но ее степень не зависит от размера опухоли и наличия метастазов в регионарных лимфоузлах. В то же время не обнаружено лабилизации структуры ДНК гранулоцитов у тех больных, у которых отсутствовали метастазы, а степень повреждения ДНК этих клеток была тем больше, чем больше был размер и степень инвазии опухоли.

Таблица 12

Скорость щелочной денатурации ДНК, Б, лизатов лимфоцитов и гранулоцитов здоровых доноров и первичных больных раком молочной железы до химиотерапии перед операцией (в скобках указано число обследованных )

Группа обследуемых Тяжесть заболевания И, усл.ед.

Лимфоциты Гранулоциты

Здоровые доноры (58) 81,9±1,0 88,8+4,8

Больные раком молочной железы до лечения. Все обследованные (38) в том числе (14) (9) (9) Т1-2М0М0 Т1-2>Г1-2М0 ТЗ-4Ы1-2М0 70,3±2,2* 67,3+3,3* 71,9+7,3 70,1±5.4 73,6±2,7* 82,1±3,7 69,2±7,3* 66,0±4,4*

*-р<0,01.

Полученные результаты позволяют полагать, что лабилизация ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови определяется взаимодействием рассматриваемых клеток с опухолью, а не является врожденной особенностью опухоленосителей. Лабилизация структуры ДНК лимфоцитов и гранулоцитиов может быть обусловлена реакцией иммунокомпетентных клеток на опухолевые антигены.

Структура ДНК лейкоцитов периферической крови больных при системной красной волчанке.

Системная красная волчанка относится к аутоиммунным заболеваниям, связанным с нарушением иммунного ответа, приводящим к неконтролируемой продукции антител к собственным клеткам организма и их компонентам, в том числе к ДНК. Поэтому при этом заболевании исследовали структуру ДНК лимфоцитов и гранулоцитов у 26 больных. Полученные результаты свидетельствуют о накоплении повреждений в ДНК лейкоцитов периферической крови больных СКВ в активной фазе заболевания (таблица 13).

Таблица 13

Скорость щелочной денатурации ДНК, О, лизатов лейкоцитов больных системной красной волчанкой в зависимости от фазы заболевания

Группа обследуемых Скорость щелочной денатурации ДНК, Б, усл. ед.

Лимфоциты Гранулоциты

Здоровые доноры 81,9+1,0 88,8±4,8

СКВ, активная фаза 54.2±7.7* 70.6±6.8*

СКВ, ремиссия 85.6±1.7 87.8±1.3

* - р < 0.05

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что многие заболевания сопровождаются накоплением эндогенных повреждений ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови больных. Для того, чтобы оценить степень таких "спонтанных" повреждений, обнаруженных при различных заболеваниях, было проведено исследование структуры ДНК лейкоцитов периферической крови больных, подвергающихся химиотерапии при лечении различных онкологических заболеваний.

Исследование структуры ДНК лейкоиитов больных -после химио- и хияшорадиотератш.

С целью выявления степени повреждения ДНК лейкоцитов периферической крови человека при действии генотоксических соединений исследовали структуру ДНК лейкоцитов больных раком молочной железы сразу и через 1 месяц после окончания курса лечения. Химиотерапию больные получали по схеме Купера (винкристин 1-1,5 мг внутривенно, 5-

фторурацил 750 мг внутривенно, метотрексат 40 мг внутривенно, циклофосфан 1 г внутримышечно в 1, 8 и 15-е сутки), больные получали также преднизолон 30 мг перорально с 1 по 15-е сутки и индометацин по 150 мг перорально с 1-го дня лечения в течение 1 года. Полученные результаты представлены в таблице 13.

Таблица 14

Скорость щелочной денатурации ДНК, D, лизатов лимфоцитов и гранулоцнтов первичных больных раком молочной железы до и после курса химиотерапии

Группа обследуемых D, усл.ед.

Лимфоциты Гранулоциты

До химиотерапии 70,3±2,2 73,6±2,7

Сразу-после химиотерапии 39,0±4,4* 44,б±5,8*

Через 1 месяц-поме химиотерапии 40,5±6,4* 38,7±5,7*

* -р<0,01.

Стратегия терапии миелолейкозов, устойчивых к полихимиотерапии, включает массивную химиотепарию в течение трех суток циклофосфаном (60 мг/кг, ~3,9 г/сутки), затем тотальное гамма-облучение (ТГО) фракциями по 4 Гр/сутки в течение трех дней (всего 12 Гр) с последующей аллогенной миелотрансплантацией 1,4»108 клеток костного мозга донора на кг веса больного на следующий день после завершения курса ТГО.

После окончания курса химиотерапии (на третьи сутки от начала лечения) значения величины О для лимфоцитов колебались от 36,0 до 62,1, составив в среднем 44,6 ед, а после последующего курса ТГО (на седьмые сутки от начала лечения) - от 17,0 до 37,0 ед, составив в среднем 32,6 ед. Величина Б для гранулоцитов после химиотерапии варьировала у различных больных от 10,0 до 45,5, составляя в среднем 30,3 ед, а после ТГО - от 39,4 до 62,8, составляя в среднем 51,6 ед. (таблица 15).

Таблица 15

Скорость щелочной денатурации ДНК, Б, лизатов лимфоцитов и гранулоцитов бальных миелейкозом после курса химиотерапии и химиорадиотерагаш, то есть через 3 и б суток после начала лечения

Группа обследуемых Структура Днк, Д. усл.ед.

Больные миелолейкозом Лимфоциты Гранулоциты

До химиотерапии** 76,6+6,9 79,2±8,2

После химиотерапии 44,6±4,7* 30,3±4,9*

После химио- и радиотерапии 32,6±4,7* 51,6±4,4*

* - р < 0.05

** - это условная норма, так как за 1-2 месяца до госпитализации эти больные уже получали несколько курсов химиотерапия.

Из представленных данных следует, что в процессе химиотерапии в ядросодержащих клетках крови больных накапливаются повреждения ДНК, степень которых существенно превышает уровень "спонтанных" повреждений, обнаруженный при раке молочной железы и других исследованных заболеваниях. Полученные результаты позволяют заключить также, что накопление однонитевых разрывов и щелочелабильных сайтов в ядросодержащих клетках периферической крови человека, регистрируемое по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток, является высокочувствительным тестом для выявления повреждений ДНК и может быть использовано не только для выявления, но и для оценки степени тяжести генотоксических воздействий на человека.

Обсуждение результатов.

Исследование способности ЛПК к репарации ДНК у здоровых доноров и при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний, позволило заключить, что этот показатель варьирует в определенном диапазоне (от 1,4 до 8,8 ед) у здоровых доноров и значительно снижен при многих заболеваниях, что потенциирует их чувствительность к действию генотоксических факторов.

Действительно, снижение способности ЛПК к репарации ДНК при различных заболеваниях сопровождалось повышением спонтанного репаративного синтеза ДНК и повышением СХО, что свитедельствует о том,

что в этих клетках имело место поврждение ДНК, которое затем было успешно репарировано (в случае повышенного уровня СХО) или находится в стадии репарации (в случае повышенного спонтанного репаративного синтеза ДНК). Однако эти два подхода (оценка спонтанного репаративного синтеза ДНК и измерение уровня СХО) недостаточно информативны, так как не позволяют судить о наличии или отсутствии собственно повреждений ДНК клеток в данный момент времени. Поэтому для оценки повреждений ДНК ядросодержащих клеток крови был использован прямой флуориметрический метод с бромистым этидием в качестве флуорофора. Этот метод позволяет оценивать скорость щелочной денатурации ДНК в лизатах клеток по величине D, отражающей долю ДНК, остающейся в виде двунитевой ДНК через 1 час лизиса в щелочных условиях (рН 12,8). Снижение величины D соответствует увеличению скорости щелочной денатурации ДНК и свидетельствует об увеличении количества повреждений (ОР и/или ЩЛС) в ДНК клеток.

С помощью этого метода нами было установлено, что вопреки имевшимся к этому времени литературным данным, лимфоциты, а также гранулоциты здорового человека практически не содержат повреждений ДНК и поэтому могут быть использованы для индикации эндогенных и экзогенных генотоксических воздействий экологических факторов.

У здоровых доноров величина D варьировала от 69,9 до 98,6 ед, составляя в среднем 81,9+1,0. У отдельных больных при различных заболеваниях наблюдали понижение величины D до 20-30 ед, однако наиболее низкое среднее значение D, обнаруженное при сепсисе, составило 57,8+5,4 ед.

При таком мощном генотоксическом воздействии на организм человека как действие цитотоксических препаратов, назначаемых онкологическим больным при химиотерапии (циклофосфан при миелолейкозах или комплекс из антрациклиновых антибиотиков, алкилирующих препаратов и винкристина при раке молочной железы), величина В для ЛПК составила Зб,8±11,8 я 39,0+4,4 у больных миелолейкозом и раком молочной железы, соответственно. Следует отметить, что in vivo у больных никогда не наблюдали столь низких значений Д, которые можно наблюдать in vitro при действии различных

цитотоксических препаратов на клетки человека. По-видимому такие клетки либо быстро элиминируются в организме, либо теряются в процессе выделения лимфоцитов и гранулоцитов из периферической крови.

Для сопоставления степени изменений структуры ДНК, наблюдаемых при разных заболеваниях, с уровнем повреждений, индуцируемых гамма-излучением в клетках человека in vitro при условиях, исключающих возможность репарации, на график зависимости скорости щелочной денатурации ДНК лимфоцитов периферической крови от дозы облучения этих клеток нанесли значения D, наблюдаемые у больных. При этом все значения D были представлены в процентах от уровня нормы.

Оказалось, что величина D, равная 75 ед (или 93% от уровня нормы), выбранная нами как пороговая величина при оценке повреждающих воздействий, в силу того, что такое значение D было обнаружено при иммунизации здоровых добровольцев, соответствует уровню повреждений, индуцируемому в ДНК лимфоцитов при гамма-облучении клеток in vitro в дозе 0,4 Гр (Рис. 8). Такой уровень повреждения ДНК можно ожидаить при различных антигенных воздействиях.

Значения D, наблюдаемые для лимфоцитов при большинстве изученнных заболеваний, соответствовали уровню повреждений, индуцируемых при гамма-облучении в дозах от 0,6 до 1,3 Гр, при сепсисе - в дозе 2,0 Гр, при химиотерапии - в дозе 3,5-3,7 Гр.

Таким образом, проведенный анализ позволяет заключить, что степень лабилизации структуры ДНК лимфоцитов при вторичных иммунодефицитных состояниях существенно ниже, чем при действии цитотоксических препаратов, используемых в процессе химиотерапии опухолей, но сопоставима с уровнем повреждений, индуцируемых в ДНК клеток при действии гамма-облучения в дозах до 1-2 Гр, то есть весьма существенна.

Возможно, что лабилизация структуры ДНК лимфоцитов при заболеваниях определяется взаимодействием различных антигенов с Т-клеточным рецептором в процессе представления антигенов Т-клеткам. Действительно, при контакте Т-клеточных гибридом с иммобилизованными антителами к Т-клеточному рецептору (СОЗ-антитену) наблюдали фрагментацию ДНК клеток (Ch. Odaka et al, 1990). С другой стороны наблюдаемые при вакцинации и заболеваниях изменения структуры ДНК

могут быть лимфоцитов.

следствием первых этапов

активацитонного апоптоза

1 - острая пневмония

2 - инфаркт миокарда

3 - рассеянный склероз

4 - вакцинация CAT

5 - вакцинация ВКЭ

6 - местный перитонит

7 - разлитой гнойный перитонит

8 - сепсис

9 - хронический бруцеллез

10 - ОРВИ

11 - герпес

12 - ОВГВ

13 - ХВГВ

14 - системная красная волчанка

15 - рак молочной железы

16 - химиотерапия, схема Купера

17 - химиотерапия, циклофосфаи

1 1 I '-1-'-1--'-Г

0 1 2 3 4 5 6

Рис. 8. Сравнение скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов периферической крови при различных заболеваниях (указаны цифрами) с ее величиной при гамма-облучении этих клеток in vitro в различных дозах (прямая линия, черные квадраты). По оси асбцисс - доза облучения, Гр; по оси ординат - скорость щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов, D, % от контроля.

Появление апоптозных клеток в периферическом русле при заболеваниях может быть связано и с ограничением иммунного ответа путем элиминации отвечающих клонов цитотоксическими лимфоцитами. Первый механизм - активационный апоптоз, вызванный взаимодействием с антигенами, возможно, в контексте с МНС I и/или МНС II, может иметь место в начале заболевания, второй, связанный с ограничением иммунного ответа, - на его более поздних фазах.

В наших экспериментах впервые обнаружено, что одним из ранних событий активации лимфоцитов in vitro является лабилизация структуры ДНК, регистрируемая по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток, которая наблюдается через 1-3 часа и уже через 24 часа по

количеству ОР и/или ЩДС приближается к структуре ДНК пролиферирующих клеток, хотя биосинтез ДНК в активированных лифоцитах регистрируется лишь после 30 часов от начала стимуляции. Таким образом, активированные лимфоциты длительное время (более 30 часов) находятся в таком состоянии, когда их ДНК содержит значительное количество ОР и/или ЩЛС, определяющихся, по-видимому, особенностям структуры сайтов прикрепления ДНК к ядерному матриксу, которые содержат однонитевую ДНК. Такие структуры будут очень чувствительны к действию повреждающих агентов, в том числе к АМК, что может приводить к образованию ОР. В случае отсутствия или медленной репарации таких ОР именно они могут стать индукторами активационного апоптоза. Действительно, через 18 часов после активации МЛПК таким суперантигеном как СЭВ наблюдали появление РАБ-антигена на поверхности 12% лимфоцитов, что свидетельствует о готовности части клеток к РАБ-опосредованному апоптозу.

При активации ЛПК СЭВ обнаружено, по крайней мере, два механизма их цитотоксической активности в отношении клеток-мишеней: это, во-первых, СЭ НЦТА в отношении клеток, способных связывать СЭВ (клетки В-клеточной лимфомы линии НЬА в наших экспериментах). В реализации СЭ НЦТА на первом этапе важная роль принадлежит повреждению мембраны клетки-мишени, так как СЭ НЦТА обычно регистрируется по усилению выхода радиоактивного хрома из клеток-мишеней. Во-вторых, это действие растворимых ЦФ, секретируемых активированными лимфоцитами. Эти ЦФ вызывают усиление экспрессии РАБ-антигена на клетхах-мишенях, неэкспрессирующих ОЯ-антиген, индуцируют поврждение их ДНК, регистрируемое уже через 6 и 18 часов после добавления к клеткам, и вызывают гибель клеток-мишеней, регистрируемую по выживаемости, но не по выходу радиоактивного хрома, то есть не вызывают повреждения мембраны клетки-мишени. Перечисленные характеристики позволяют заключить, что СЭВ-активированные лимфоциты секретируют факторы, индуцирующие апоптоз в клетках-мишенях. Такой механизм появления повреждений ДНК в ЛПК имеет место, по-видимому, при гнойно-спетических и некоторых других бактериальных и вирусных заболеваниях, в патогенезе которых важная роль принадлежит токсинам, обладающим свойствами суперантигенов.

Обобщая полученные данные можно заключить, что изменение величины Д для ДНК лизатов ЛПК до 75 ед следует рассматривать как настораживающие, до 65 ед - как свидетельствующие о действии дестабилизирующих ДНК факторов эндогенной или экзогенной природы, а ниже 65 - как свидетельствующие, скорее всего, о действии экзогенных генотоксических факторов. Снижение способности ЛПК к репарации ДНК и появление повреждений ДНК в ЛПК, регистрируемое по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток, обнаружено при широком спектре заболеваний. Такие изменения в структуре ДНК приводят к снижению функциональной активности ЛПК, что in vitro выявляется по снижению индекса стимуляции клеток при активации лимфоцитов различными митогенами, и они коррелируют с наиболее глубокими изменениями показателей клеточного иммунитета у больных.

ВЫВОДЫ

1. С помощью разработанной экспериментальной модели исследована способность лимфоцитов периферической крови человека к репарации ДНК у здоровых доноров. Обнаружены значительные межиндивидуальные различия в способности лимфоцитов периферичекой крови к репарации ДНК и установлены пределы колебаний этого показателя у здоровых доноров.

2. Обнаружено снижение способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК и повышение спонтанного репаративного синтеза ДНК при различных заболеваниях, сопровождающихся развититем вторичных иммунодефицитных состояний: при неспецифических заболеваниях легких, остром инфаркте миокарда, рассеянном склерозе. Степень понижения способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК коррелировала с увеличением количества сестринских хроматидных обменов в этих клетках.

3. При исследовании структуры ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови здоровых доноров, оцениваемой по скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток с помощью прямого флуориметрического метода показано, что свежевыд еденные ядросодержащие клетки крови здорового человека практически не

содержат спонтанных разрывов ДНК и могут быть использованы для индикации генотоксических воздействий различных экологических факторов. Установлены средние значения и пределы варьирования скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови здорового человека.

4. При различных заболеваниях, сопровождающихся снижением способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК (неспецифических заболеваниях легких, остром инфаркте миокарда, рассеянном склерозе) обнаружено увеличение скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов, что свидетельствует о накоплении повреждений в ДНК этих клеток.

5. При иммунизации здоровых добровольцев обнаружено увеличение скорости щелочной денатурации ДНК лимфоцитов периферической крови в такой же степени, как при заболеваниях, сопровождающихся снижением способности лимфоцитов к репарации ДНК (острый инфаркт миокарда, рассеянный склероз, неспецифические заболевания легких).

6. В модельных экспериментах обнаружено, что одним из ранних событий при активации лимфоцитов митогенами in vitro является лабилизация структуры ДНК, регистрируемая по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток.

7. Показано, что ДНК интенсивно пролиферирующих лимфоидных клеток содержит значительно большее количество щелочелабильных сайтов, чем покоящиеся клетки. Культивирование интактных и активированных лимфоцитов in vitro сопроводждается изменением структуры ДНК, которая уже через 24 часа по количеству щелочелабильных сайтов приближается к структуре ДНК пролиферирующих клеток лимфоидных органов и культивируеых in vitro опухолевых клеток человека.

8. Показано, что поддержание структуры ДНК интактных лимфоцитов периферической крови человека обеспечивается высокими внутриклеточными концентрациями цАМФ и олигоА, интерфероном &г и зависит от ресинтеза короткоживущих РНК и белков.

9. В модельных экспериментах показано, что в индукции повреждений ДНК лимфоцитов и гранулоцитов важная роль может принадлежать как активным метаболитам кислорода, генерируемым гранулоцитами и моноцитами при взаимодействии с антигенами, так и специфическим

цитотоксическим факторам, образующимся при активации лимфоцитов стафилококковым энтеротоксином В, и СЭ-направленной цитотоксической активности цитотоксических лимфоцитов. Ю.При активации мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека стафилококковым энтеротоксином В in vitro обнаружена секреция цитотоксических факторов, индуцирующих на поверхности опухолевых клеток-мишеней экпрессию FAS-антигена и появление ОР в их ДНК.

11.Обнаружены и количественно оценены повреждения ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови при гнойно-септических осложнениях у хирургических больных, у больных острым и хроническим вирусным гепатитом В, у больных при циррозе печени, у впервые выявленных больных раком молочной железы до операции и химиотерапии, у больных системной красной волчанкой в активной фазе. Степень изменения показателей клеточного иммунитета у этих больных коррелировала со степенью повреждения ДНК лейкоцитов.

12.Показана эффективность прямого флуориметрического метода регистрации повреждений ДНК для выявления и количественной оценки степени повреждения ДНК лимфоцитов и гранулоцитов при действии генотоксических факторов в процессе химиотерапии онкологических больных.

13.На основе анализа степени изменения структуры ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови человека при заболеваниях внутренних органов, инфекционных заболеваниях, при иммунизации, при опухолевом процессе и при химиотерапии онкологических больных разработаны количественные критерии оценки степени повреждения ДНК лейкоцитов для выявления и диагностики как эндогенных генотоксических воздействий, так и воздействиягенотоксических факторов окружающей среды.

Снижение способности лимфоцитов к репарации ДНК и накопление повреждений в ДНК лимфоцитов периферической крови человека при заболеваниях является одним из неизвестных ранее механизмов нарушения функций иммуноккомпетентных клеток, приводящих к формированию временной иммунологической недостаточности у человека.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Федоров H.A., Москалева Е.Ю. - Повреждения ДНК в клетках периферической крови человека при действии эндогенных и экзогенных факторов - Гематология и трансфузиология, 1985, 30, №

6, с. 50-55.

2. Федоров H.A., Боровкова Т.В., Корешкова H.H., Москалева Е.Ю., Паньков В.Н. - Повреждения ДНК лейкоцитов человека в связи с лейкозами и их лечением - Материалы 58 научной сессии ЦНИИ ГПК, М., 1983, с.48-49.

3. Москалева Е.Ю., Илюшина H.A., Захаров В.Н., Федоров А.Н., Караулов A.B., Порошенко Г.Г. - Способность лимфоцитов здоровых доноров к репарации ДНК - Терапевт, архив, 1985, 57, №

7, с.116-119.

4. Алахов В.Ю., Москалева Е.Ю., Клинский Е.Ю., Северин Е.С. -Взаимодействие стафилококкового энтеротоксина с мембранными системами лимфобластоидных клеток человека - Материалы Всесоюзного симпозиума "Биохимия рецепторных систем", Таллин, 1990, с. 2.

5. Сильвестров В.П., Москалева Е.Ю., Илюшина H.A., Караулов A.B., Порошенко Г.Г., - Система репарации ДНК при неспецифических заболеваниях легких - Терапев. архив, 1985,57, № 7, с. 114-116.

6. Боровка Т.В., Корешкова H.A., Москалева Е.Ю., Федоров H.A. и др.

Повреждения ДНК, индуцируемые цитостатиками и ионизирующей радиацией в лейкоцитах крови доноров и больных лейкозами - Тезисы докладов 2-го Всесоюзного съезда гематологов и трансфузиологов (15-18 октября 1985 г., гЛьвов) МЗ СССР, М., 1985, с.204-205.

7. Порошенко Г.Г., Москалева Е.Ю., Умнова Н.В. - Активность эксцизионной репарации ДНК в лимфоцитах периферической крови у здоровых людей, при некоторых заболеваниях и их лечении. -Тезисы стендовых сообщений 5-го Всесоюзного биохимического съезда, г.Киев, М., "Наука", 1985, т. 2, с. 287.

8. Раздевич А.Э., Москалева Е.Ю., Генина В.Я., Клименко Н.И., Порошенко Г.Г. - Повреждение генома лимфоцитов и изменение иммунологических показателей при остром инфаркте миокарда -Советская медицина, 1987, № 2, с.19-22.

9. Дяченко Л.В., Москалева Е.Ю., Миронова С.Б., Федоров H.A. -Изучение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови, пролиферирующих лимфоидных и опухолевых клеток по скорости щелочной денатурации ДНК лизатов, - Тезисы докладов 1-го Всесоюзного рабочего совещания "Биофизика рака", Черноголовка, М., 1987, с. 98.

Ю.Умнова Н.В., Москалева Е.Ю., Порошенко Г.Г. - Участие процессов репарации ДНК в изменении частоты сестринских хроматидных обменов в лимфоцитах периферической крови при воспалительных заболеваниях - Бюлл. экспер. биол. и мед. 1986, 102, № 12, с.743-746.

11. Москалева Е.Ю., Тоболов И.Н., Шумилов В.Г., Демина Т.Н., Горбунов Е.Ф., Федоров Н.А., Караулов А.В. - Снижение способности лимфоцитов периферической крови к эксцизионной репарации ДНК при рассеянном склерозе - Журнал невропатологии и психиатрии, 1988,88, № 7, с.87-89.

12. Москалева Е.Ю., Дувакин И.А., Каневский В.Ю., Алахов В.Ю. -Роль цАМФ и олигоА-синтетазы в регуляции активности моноцитоидных клеток человека линии J-96 - Тезисы докладов 6-го Всесоюзного симпозиума "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций", Петразаводск, 1988, с. 45.

13. Alakhov V.Yu., Moskaleva E.Yu., Rravtzova T.N., Smimov V.V., Duvakin I.A., Loginov B.V., Severin E.S. - The effect of Staphylococcus aureus enterotoxin A on proliferation of lymphoid and nerve cells -Biotechnology and applied biochemistry, 1988,10, p.563-566.

M.Severin E.S., Makarova O.V., Pustynnikov M.G., Moskaleva E.Yu. -The effect of platelet activating factor specific reception on human macrophages functions - Third International Conference on Platelet-Activating Factor and Structurally Related Alkyl Ether Lipids. Sasakawa Hall, Tokyo, Japan. Abstracts, p.138, 1989.

15. Pustynnikov M.G., Porodenko N.V., Makarova O.V., Kozukov A.V., Moskaleva E.Yu., Sokolovsky A.A., Severin E.S. - Platelet-activating factor stimulates receptor-mediated formation of reactive oxygen intermediates in human macrophages - Lipids, 1991, 26, N 12, p.1214-1219.

16. Москалева Е.Ю., Дяченко Л.В., Миронова С.Б., Федоров Н.А. -Изучение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови, пролиферирующих лимфоидных и опухолевых клеток по скорости щелочной денатурации ДНК лизатов - Гематология и трансфузиология, 1989, №4,41-44.

17.Федоров Н.А., Москалева Е.Ю., Дяченко JI.B., Изотов М.В., Спиридонова С.М. - Структура ДНК клеток при действии ионизирующего излучения и радиомиметиков и "спонтанные" изменения структуры ДНК - Тезисы докладов 1 Всесоюзного радиобиологического съезда, Москва, 21-27 августа 1989 г., Пущино, т. 1, с.125.

18.Москалева Е.Ю. - Анализ вторичной структуры ДНК при активации лимфоцитов митогенами - Бюлл. экспер. биол. и мед. 1989,105, №9, с. 335-339.

19.Москалева Е.Ю. - Изменение сруктуры ДНК и снижение способности лимфоцитов к эксцизионной репарации ДНК при активации лимфоцитов и при вторичных иммунодефицитных состояниях - Сборник материалов 1 Всесоюзного съезда научного общества иммунологов, Сочи 15-17 ноября, 1989, т. 2, с. 244.

20. Москалева Е.Ю., Кузьмин И.Ю., Кожевникова Г.Г., Караулов А.В. - Изменения структуры ДНК и способности лимфоцитов к репарации ДНК при заболеваниях легких, сопровождающихся вторичными иммунодефицитами состояниями - Тезисы 1-го

Всесоюзного конгресса по болезням органов дыхания, Киев, 9-12 окт., 1990 г., с.323.

21.Alakhov V.Yu., Moskaleva E.Yu., Klinsky E.Yu. - Activation of cytotoxicity of human peripheral blood mononuclear cells by staphylococcal enterotoxin A - Abstracts. XVIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Moscow, USSR, September, 23-27,1990, p.88.

22.Москалева Е.Ю., Алахов В.Ю., Дувакин И.А., Клинский Е.Ю., Северин Е.С. - Механизм активации пролиферации лимфоидкых и нервных клеток под действием энтеротоксина A St.aureus - Тезисы Всесоюзного симпозиума "Биохимия опухолевой клетки", Минск,

1990, с.23.

23.Москалева Е.Ю. - Влияние лимфокинов на структуру ДНК культивируемых ин витро лимфоцитов человека. Связь с системой цАМФ и олигоА - Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990, 110, № 10, с.417-419.

24.Москалева Е.Ю., Илюшина Н.А. - Повреждения ДНК при действии ионизирующих излучений и их репарация - Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Радиационная биология, 1990, т.9, с.3-113.

25.Москалева Е.Ю., Караулов А.В., Сидоренко И.В., Баранова Е.В. -Регистрация иммунотоксических воздействий по изменению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и способности лимфоцитов к репарации ДНК - Тезисы Международного симпозиума "Проблемы иммунофармакологии", Тбилиси, 2-6 окт. 1990, с.28.

26.Karaulov A.V., Moskaleva E.Yu., Kuzmin I.Yu. - Changes in the lymphocyte DNA structure under the action of mitogenes, bacterial toxins and antigens and their possible role in immunodefcient states -Abstracts. Constituent Congress Internationale Society for Patophysioloy, Moscow, May 28-June 11,1991, Finland, 1991, p.177.

27.Романова Л.К., Москалева Е.Ю., Овчаренко С.И., Мустафин А. -Цитотоксическая активность и иммунодулирующие факторы в бронхо-альвеолярных смывах (БАС) человека - Тезисы 2-го Всесоюзного симпозиума "Теорет. и прикл. аспекты молекул, биол.", Самарканд, 22-28 окт. 1991, Москва, с.165.

28.Москалева Е.Ю., Илюшина Н.А., Тараканова М.П., Чиквашвили Б.Ш. - Оценка степени повреждения иммунокомпетентных клеток человека по накоплению щелочелабильных сайтов в их ДНК при экстремальных воздействиях - Тезисы 2-го Всесоюзного симпозиума "Теорет. и прикл. аспекты молекул, биол.", Самарканд, 22-28 окт.

1991, Москва, с. 138.

29.Караулов А.В., Москалева Е.Ю., Радзевич А.Э., Крехнов Б.В., Калинина JI.A. - Структура ДНК лимфоцитов периферической крови человека и их способность к репарации ДНК при иммунизации и некоторых заболеваниях - Иммунология, 1991, № 2, с.15-17.

30.Москалева Е.Ю., Гроздова И.Д. - Содержание цАМР, активность протеинкиназ и структура ДНК в покоящихся и пролиферирующих

лимфоцитах периферической крови и в клетках Т-лимфомы человека

- Вопросы мед. химии, 1991, 37, № 2, с.62-65.

31.Покровский В.И., Сулейманов А.К., Лебедев В.В., Кизенко O.A., Шмаров Д.И., Москалева Е.Ю., Караулов A.B. Иммунореабилитирующее действие тимогексина при лечении больных хроническим бруцеллезом - Терапевт, архив, 1992,64, №11, с.22-26.

32.Москалева Е.Ю., Коляда Т.И., Пустынников М.Г., Породенко Н.В.

- Характеристика перививаемой линии моноцитоидных клеток J 96 по сравнению с моноцитами периферической крови - Тезисы Всесоюзного симп. "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и при патологии", Новосибирск, 6-8 сент., 1990 г., с.128.

33.Alakhov V.Yu., Klinsky E.Yu., Kolosov E.S., Mauer-Fogi I., Moskaleva E.Yu., Sveshnikov P.G., Schemchukova O.B., Severin E.S. -Identification of functionaly active fragments of staphylococcal enterotoxin В - EurJ.Biochem. 1992, vol. 209, p.823-828.

34.Чегин B.M., Брехов Е.И., Караулов A.B., Брыков В.И., Москалева Е.Ю., Хлюстина Е.М., Безобразова Л.В., Кизенко O.A. -Возможности прогнозирования гнойно-септических осложнений в абдоминальной хирургии - В книге "Гнойно-септические осложнения в неотложной хирургии. Тезисы конф., Черновцы, 1992, с.8-9.

35.11jushina N.A., Reshetnjak Т.М., Moskaleva E.Yu. - DNA damages in peripheral white blood cells with systemic lupus erythematosus -Mut.Res. 1992, v.271, N2, p.138.

36.Сулейманов A.K., Желудков M.M., Кизенко O.A., Шмаров Д.И., Москалева Е.Ю., Караулов A.B. - Показатели клеточного иммунитета и генетическая стабильность ДНК лейкоцитов периферической крови больных хроническим бруцеллезом -Иммунология, 1993, № 1, с.52-54.

37.Тараканова М.П., Москалева Е.Ю., Безобразова Л.В., Семенова О.И., Корнева E.H., Телегин Л.Ю. - Структура ДНК лейкоцитов больных лейкозом в процессе химиотерапии - Вестник РАМН, 1993, №4, с. 17-19.

38.Москалева Е.Ю., Федоров H.A., Кизенко O.A., Караулов A.B. -Повреждения ДНК лимфоцитов и иммунодефицитные состояния -Вестник РАМН, 1993, № 4, с. 12-17.

39.Илюшина H.A., Решетняк Т.М., Москалева Е.Ю., Безобразова Л.В., Алекберова З.С. - Лабилизация структуры ДНК лейкоцитов периферической крови больных системной красной волчанкой -Вестник РАМН, 1993, № 9, с.36-38.

40.Москалева Е,Ю., Илюшина H.A., Тарасов В.Н., Чиквашвили Б.Ш., Летягин В.П., Караулов A.B. - Повреждения ДНК лимфоцитов и нейтрофилов периферической крови при раке молочной железы -Вестник Онкоцентра РАМН, приложение, 1994, с.57-58.

41.Караулов A.B., Москалева Е.Ю., Чегин В.М., Хлюстина Е.М., Безобразова Л.В., Кизенко O.A., Шмаров Д.А., Сидоренко И.В., Ликин В.Ф. - Структура ДНК лейкоцитов периферической крови и

иммунный статус хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями - Клинический вестник, 1994,4, с.33-35.

42.Москалева Е.Ю., Алахов В.Ю., Чистякова Л.Г., Клинский ЕЛО. -Чувствительность опухолевых клеток с высоким уровнем экспрессии гена mdrl к цитотоксическим лимфоцитам, активированным стафилококковым энтеротоксином В - Цитология, 1995, 37, № 4, с.387-388.

43.Караулов А.В., Москалева Е.Ю., Хлюстина Е.М., Чегин В.М., Ликов В.Ф. - Повреждения ДНК лимфоцитов: новый механизм развития иммунодефицитов - Практикующий врач. Приложение к журналу "Медикал Маркет", 1995, 1, с.10-12.

44.Москалева Е.Ю., Родина А.В., Чижов А.О., Зыкова И.Е., Катуков В.Ю., Накашьян Р., Северин С.Е. - Активные компоненты нового иммуномодулятора, стимулирующего противоопухолевую активность - Тезисы 2-го Международного конгресса "Иммунореабилитация и реабилитация в медицине", 1996, № 2, с.288.

45. Moskaleva E.Yu., Ilushma N.A., Letjagin V.P., Karaulov A.V. - DNA damage in peripheral white blood cells of patients with breast cancer before and after chemotherapy - Proc. 5th European winter oncology conference, 19-25 January 1997, Meribel-Mottaret, France, p.56.

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Москалева, Елизавета Юрьевна, Москва

/

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ МЕДИЦИНСКОИ ЭКОЛОГИИ

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ

МОСКАЛЕВА ЕЛИЗАВЕТА ЮРЬЕВНА

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ ВТОРИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ ПРИ ДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ (03.00.04 - биохимия)

На правах рукописи УДК 577.24:616_097.612.017_ 11/12

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант доктор медицинских наук, академик РАЕН, профессор А.В.КАРАУЛОВ

Москва - 1998 г.

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

Список сокращений................................................................................. 4

Введение................................................................................................... 6

Глава I. Обзор литературы

1. Повреждения и репарация ДНК в клетках человека при действии эндогенных и экзогенных факторов........................................................ 14

2. Вторичные иммунодефицитные состояния у человека....................... 53

Глава П. Материалы и методы................................................................ 59

Глава Ш. Результаты исследований и их обсуждение

1. Исследование лимфоцитов периферической крови к репарации

ДНК у здоровых людей и при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных иммунодефицитных состояний 1.1. Экспериментальная модель для оценки способности лимфоцитов

периферической крови человека к репарации ДНК............................... 76

1.2. Исследование способности к репарации ДНК лимфоцитов периферической крови больных при остром инфаркте миокарда................. 81

1.3. Исследование способности к репарации ДНК лимфоцитов периферической крови больных рассеянным склерозом.................................86

1.4. Исследование способности к репарации ДНК лимфоцитов периферической крови больных при неспецифических заболеваниях легких .............................................................................................................88

2. Исследование структуры ДНК лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров, при различных заболеваниях и генотоксических воздействиях

2.1. Исследование структуры ДНК лимфоцитов периферической крови

здоровых доноров.....................................................................................98

2.2.Исследование структуры ДНК лимфоцитов периферической крови при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных иммуноде-фицитных состояний.................................................................................99

2.3. Исследование структуры ДНК ЛПК при вакцинации добровольцев .............................................................................................................102

2.4. Исследование структуры ДНК и молекулярно-биохимических механизмов ее лабилизации при активации лимфоцитов периферической крови человека in vitro............................................................................. 103

2.4.1. Анализ структуры ДНК при активации лимфоцитов мито-генами....................................................................................................... 103

2.4.2. Изучение структуры ДНК лейкоцитов периферической крови в сравнении со структурой ДНК пролиферирующих лимфоид-ных и опухолевых клеток по скорости щелочной денатурации ДНК ли-затов......................................................................................................... 109

2.4.3. Молекулярно-биохимические механизмы изменения структуры ДНК лимфоцитов при активации ЛПК......................................... 111

2.4.4. Повреждение ДНК лейкоцитов периферической крови человека при действии индукторов окислительного взрыва..................... 123

2.4.5. Исследование механизмов повреждения ДНК клеток-мишеней при межклеточных взаимодействиях, опосредованных СЭА и

СЭВ........................................................................................................... 131

2.5. Структура ДНК лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови и иммунный статус больных при различных заболеваниях............... 150

2.5.1. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови и иммунных статус хирургических больных с гнойно-септическими осложнениями и при некоторых бактериальных инфекциях.............................150

2.5.2. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови и показатели клеточного иммунитета больных вирусным гепатитом В........160

2.5.3. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови больных при раке молочной железы...............................................................170

2.5.4. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови больных при системной красной волчанке......................................................171

2.6. Исследование структуры ДНК лейкоцитов больных после химио-

и химиорадиотерапии...............................................................................174

2.6.1. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови больных раком молочной железы после химиотерапии..................................174

2.6.2. Структура ДНК лейкоцитов периферической крови больных миелолейкозом в период химиорадиотерапии и в период восстановления ................................................................................................... 175

3. Обсуждение результатов...................................................................... 186

Выводы..................................................................................................... 198

Список литературы.................................................................................. 201

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМК - активные метаболиты кислорода

АПК - антигенпредставляющие клетки

ВКЭ- вакцина против вируса клещевого энцефалита

др- двунитевые разрывы ДНК

ИДС- иммунодефицитные состояния

ИРИ- иммунорегуляторный индекс

кк- казеинкиназа

лпк- лимфоциты периферической крови

мл, млпк - мононуклеарные лейкоциты периферической крови

М.м. - молекулярная масса

НАД- никотинамидадениндинуклеотид

НАД(Ф)Н - восстановленный никотинамидадентинтринуклеотид

нзл- неспецифические заболевания легких

ОАС - 2' ,5' -олигоадентилатсинтетаза, олигоА-синтетаза

ОВГВ- острый вирусный гепатит В

ОИМ- острый инфаркт миокарда

ОР- однонитевые разрывы ДНК

ПАРП- поли(АДФ-рибоза)полимераза

Ре- рецептор

РС- рассеянный склероз

САТ- стафилококковый анатоксин

СОАК- супероксидный анион кислорода

СЭ- стафилококковые энтеротоксины

СЭ-НЦТА - СЭ-направленная цитотоксическая активность

СЭА - стафилококковый энтеротоксин А

СЭВ- стафилококковый энтеротоксин В

ТГО- тотальное гамма-облучение

ТКР- Т-клеточный рецептор

Топо - топоизомераза

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

УФ- ультрафиолетовое излучение

ФАТ- фактор активации тромбоцитов

ФБС - фетальная бычья сыворотка

ФСБ -ФНО, ЮТ ФРН-ЦТА -ЦТЛ-ХАГ-ХПГ-ЦП-

фосфатно-солевой буфер фактор некроза опухоли фактор роста нервов цитотоксическая активность цитотоксические лимфоциты хронический активный гепатит хронический персистирующий гепатит цирроз печени

ВВЕДЕНИЕ

Врожденная или приобретенная недостаточность иммунологических механизмов защиты организма приводит к нарушению функционирования отдельных звеньев иммунной системы, появлению инфекционных осложнений, аутоиммунной патологии, злокачественных опухолей, аллергических заболеваний. Вторичная иммунологическая недостаточность часто развивается при вирусных, паразитарных и некоторых бактериальных инфекциях, при истощении организма, длительном стрессе, при тяжелых травмах, ожогах, интоксикациях, при лечении онкологических больных химиотерапевтическими средствами и/или с помощью лучевой терапии, при длительном воздействии вредных факторов в процессе профессиональной деятельности или в неблагоприятных экологических условиях. Известно, что причиной развития вторичных иммунодефицитных состояний (ИДС) при генотоксических воздействиях в процессе химио- и радиотерапии или при интоксикациях является повреждение генетического материала иммунокомпетентных клеток. Механизмы же развития ИДС, наблюдаемых при многих заболеваниях внутренних органов и инфекционных заболеваниях, изучены мало и до сих пор не ясны [15, 23-29].

В то же время в 1983 г. О.Нагпв предположил, что причиной развития вторичных ИДС также может быть повреждение структуры ДНК лимфоцитов и/или процессов репарации ДНК под действием эндогенных метаболитов или лекарств, а нарушения функционирования иммунокомпетентных клеток могут быть обусловлены неполноценностью процессов реаранжировки генов иммуноглобулинов, т.к. в этих процессах участвуют те же ферменты, что и в репарации ДНК [141]. Действительно,

известно, что наследственные болезни, обусловленные различными дефектами в системе репарации ДНК, такие как пигментная ксеродерма (нарушена способность репарировать индуцируемые УФ-светом повреждения ДНК), атаксия-телангиэктазия (нарушена способность репарировать индуцируемые гамма-излучением повреждения ДНК), анемия Фанкони (повышена чувствительность к агентам, индуцирующим межнитевые сшивки ДНК) [19], сопровождаются нарушениями в функционировании иммунной системы [2,7].

У гомозиготных по мутации seid животных формируется тяжелое комбинированное ИДС в результате неспособности клеток к точной реаранжировке именно иммуноглобулиновых генов и генов Т-клеточного рецептора в процессе дифференцировки Т- и B-лимфоцитов. В результате эти поверхностные рецепторы не синтезируются и не экспрессируются на клеточной поверхности из-за неправильного функционирования системы рекомбинации, и у мышей seid не обнаруживаются Т- и В-лимфоциты [125]. Миелоидные клетки и фибробласты мышей seid также высоко радиочувствительны [200].

Нестабильность генома лимфоцитов, регистрируемая по увеличению аберраций хромосом в ЛПК, обнаружена при вирусных инфекциях [11, 12]. При инфекционных заболеваниях другой этиологии и различных соматических заболеваниях также, по-видимому, возможно повреждение ДНК лимфоцитов и ингибирование процессов ее репарации под действием эндогенных токсических продуктов, в частности, интермедиатов воспаления.

В тоже время при исследовании иммунного статуса человека функциональные тесты, позволяющие оценить активность иммунокомпетентных клеток, как правило не проводятся, и заключение о

состоянии клеточного звена иммунной системы делается только на основании фенотопирования лимфоцитов периферической крови. При этом в иммунограмме указывают процент лимфоцитов, экспрессирующих тот или иной поверхностный антиген, что безусловно, отражает определенную динамику в изменении гомеостаза иммунной системы, но не всегда позволяет адекватно оценить ее способность к развитию полноценного иммунного ответа. Поэтому исследование механизмов развития вторичных ИДС и разработка доступных способов выявления патологических изменений в иммунокомпетентных клетках человека является крайне актуальной задачей.

В последние годы были развиты новые методические подходы, позволившие исследование способности лимфоцитов периферической крови (ЛПК) человека к эксцизионной репарации ДНК и структуры ДНК этих клеток у здоровых людей и при изменении эндогенной среды организма при заболеваниях как параметров, определяющих устойчивость этих клеток к повреждающим воздействиям и их способность к полноценному функционированию. В связи с этим целью данного исследования явилось изучение молекулярно-биохимических механизмов развития вторичных иммунодефицитных состояний при действии различных экологических факторов, а именно: изучение способности лимфоцитов периферической крови человека к репарации ДНК и структуры ДНК лимфоцитов, а в отдельных случаях и гранулоцитов, у здоровых доноров и при широком спектре заболеваний, сопровождающихся развитием вторичных ИДС: при неспецифических заболеваниях легких, остром инфаркте миокарда, рассеянном склерозе, опухолевом процессе, некотрых инфекционных заболеваниях; повреждений ДНК, индуцируемых, используемыми при лечении онкологических заболеваний химиотерапевтическими препаратами,

а также изучение роли антигенной нагрузки в формировании генетической нестабильности ЛПК крови при заболеваниях и механизмов этого явления в модельных экспериментах in vitro. Для достижения этой цели были сформулированы и выполнены следующие задачи: разработать экспериментальную модель для оценки способности лимфоцитов периферической крови к репарации ДНК; исследовать способность к репарации ДНК лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и больных при заболеваниях, сопровождающихся развититем вторичных иммунодефицитных состояний; исследовать уровень повреждений в ДНК лимфоцитов и иммунологические показатели у здоровых доноров и у больных при различных заболеваниях; исследовать структуру ДНК и молекулярно-биохимические механизмы ее лабилизации при активации лимфоцитов периферической крови человека in vitro; изучить уровень повреждений ДНК лейкоцитов периферической крови при генотоксических воздействиях у больных, получающих химиотерапию по поводу онкологических заболеваний; разработать количественные критерии оценки степени повреждения ДНК лимфоцитов для выявления и диагностики эндогенных генотоксических воздействий и воздействия генотоксических факторов окружающей среды. Резюмируя полученные данные можно заключить, что научная новизна и теоретическая ценность полученных результатов заключаются в следующем: впервые изучена способность ЛПК к эксцизионной репарации ДНК и обнаружено ее снижение при заболеваниях, сопровождающихся развитием вторичных ИДС; впервые показано, что свежевыделенные ядросодержащие клетки крови здорового человека практически не содержат спонтанных разрывов ДНК и установлены средние значения и пределы варьирования скорости щелочной денатурации ДНК

лизатов лимфоцитов и гранулоцитов у здоровых доноров;

впервые обнаружено накопление повреждений в ДНК лимфоцитов при широком спектре заболеваний, сопровождающихся развитием вторичных ИДС и при вакцинации здоровых людей; сформулированы представления о роли антигенной нагрузки в развитии вторичных ИДС; в модельных экспериментах впервые обнаружено, что одним из ранних событий при активации лимфоцитов митогенами in vitro является лабилизация структуры ДНК, регистрируемая по увеличению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток; обнаружено, что ДНК интенсивно пролиферирующих лимфоидных клеток содержит значительно большее количество щелочелабильных сайтов, чем ДНК покоящихся клеток, а активация лимфоцитов in vitro приводит к быстрому увеличению количества щелочелабильных сайтов до уровня, наблюдаемого в интенсивно пролиферирующих клетках, за несколько часов до начала пролиферации лимфоцитов; впервые обнаружено, что лабилизация структуры ДНК при активации лимфоцитов сопровождается понижением концентрации цАМФ и активности олигоАсинтетазы и повышением активности казеинкиназ; показано, что поддержание структуры ДНК интактных лимфоцитов обеспечивается высокой внутриклеточной концентрацией цАМФ и олигоаденилатов, а также интерфероном аг и зависит от ресинтеза короткоживущих РНК и белков; впервые показано, что в индукции повреждений в ДНК лимфоцитов наряду с генерацией активных метаболитов кислорода важная роль может принадлежать специфическим цитотоксическим факторам, образующимся при активации лимфоцитов суперантигенами (стафилококковым энтеротоксином В, СЭВ); при активации мононуклеарных лейкоцитов СЭВ впервые обнаружена секреция

цитотоксических факторов, индуцирующих на поверхности клеток-мишеней экспрессию РАБ-антигена и появление ОР в их ДНК. На основе обнаруженных закономерностей сформулированы представления о новых, неизвестных ранее механизмах нарушения функций иммунокомпетентных клеток.

Практическая ценность результатов проведенной работы определяется следующим. Установлены средние значения и пределы варьирования способности лимфоцитов к репарации ДНК и скорости щелочной денатурации ДНК лизатов лимфоцитов и гранулоцитов периферической крови человека, которые могут быть использованы в качестве контрольных уровней в различных медико-экологических исследованиях. Разработанные количественные критерии оценки степени тяжести повреждения ДНК лейкоцитов периферической крови человека при заболеваниях, при иммунизации и при химиотерапии онкологических больных могут быть использованы в практической медицине при дифференциальной диагностике эндогенных и экзогенных генотоксических воздействий. Установленные параметры оценки степени тяжести повреждения ДНК лимфоцитов по изменению скорости щелочной денатурации ДНК лизатов клеток могут быть использованы для количественной оценки тяжести иммунотоксических реакций человека. Разрабртанные подходы и обнаруженные количественные закономерности могут быть использованы для создания скрининговых тест-систем для количественной диагностики действия генотоксических факторов. Благодаря разработанным в работе количественным критериям, полученные результаты могут быть широко использованы для целей практической медицины.

Результаты, описанные в диссертации, были представлены на Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" (Таллин, 1990); на 2-ом Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (15-18 октября 1985 г., Львов); на 1-ом Всесоюзном рабочем совещании "Биофизика рака" (Черноголовка, 1987 г.); на 6-ом Всесоюзном симпозиуме "Роль циклических нуклеотидов и вторичных посред