Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование в гибридомной технологии стимулированных in vitro антигенами чумного микроба лимфоцитов человека

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Использование в гибридомной технологии стимулированных in vitro антигенами чумного микроба лимфоцитов человека"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Ростовский ордена Дружбы народов медицинский институт

рг а од

На правах рукописи

ЕРМОЛЕНКО Татьяна Дмитриевна

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ГИБРИДОМНОЙ ТЕХНОЛОГИИ СТИМУЛИРОВАННЫХ IV ПИЮ АНТИГЕНАМИ ЧУМНОГО МИКРОБА ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

03.00.07 - микробиология

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 1993

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону.государственном научно-исследовательском противочумном институте ГОСКОМИТЕТА ПО САН-ЭПИДНАДЗОРУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

АЛЕКСЕЕВА Л.П.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

ГАМЛЕШКО Х.П.

доктор .медицинских наук, профессор

ПОЛЯК А.И.

Ведущая организация:

Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб". Автореферат разослан " МШклЗр^ 1993 г.

Защита состоится ОС/ИхН. ¿Р'Д. 1993 г. в 13 часо!

на заседании специализированного совета Д 084.53.01 при Ростовском ордена Дружбы народов медицинском институте (344700, г.Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер. 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского медицинского института.

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Н.Я.К0РГАН0В

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. В последние десятилетия успехи в области клеточной им",-,,"\*огии достигнуты благодаря исследованиям, проведенным на клеточных культурах. Широкое внедрение этой модели в практическую работу началось с 70-х годов, когда Мишелл и Даттон разработали культуральнуго систему, позволяющую индуцировать образование антител in vi-tro в суспензии спленоцитов неиммунизирован^ ных мышей. Г -°годняшнему дню известно достаточно много систем и их модификаций, используемых для иммунизации иммунокомпетентных клеток животных (Валякина Т.И.,1988;в*ггеЬавск с.д.к. 1986; De Beer И. 1987; Hell emana A.L. 1988; Gavaüendo-Cowlej $988).

Несмотря на общие принципы организации иммунной;системы у млекопитающих, даже у близкородственных видов наблюдаются отличия в тонкой организации функций иммунокомпетентных клеток. Поэтому нам представляется, что изучение механизмов индукции и развития иммунного ответа на модели иммунокомпетентных клеток человека является более адекватным и приближенным к процессам, происходящим в макроорганизме под воздействием антигенов, чем их оценка в культуре клеток животных. Иедукция антителообразования в культуре клеток человека связана со многими трудностями и нерешенными проблемами (Климович В.Б.,1985; Алексанян Ю.Т.,1991; Saaoilevioh s. 1987; Reading с.1. 1982). В то же время разработка такой модели приобретает первостепенное значение для оценки иммуногенности различных биологически активных препаратов, ввиду ограниченной возможности иммунизации человека любым выбранным антигеном. Актуальность этого направления обусловлена бурным развитием гибридомной технологии получения человеческих моноклональных антител, где способ иммунизации лимфоцитов in vitro открывает широкие возможности для исследовательской работы (0 Нате M.J. 1987; Keith J.

1987; HUlette C.l!. I987;Grunow H. 1988; iherien H.M. 1990).

Несмотря на то, что в настоящее время в изучении клеточных основ регуляции иммуногенеза инфекционных заболеваний достигнуты значительные успехи и разработаны современные информативные методы, изменения в системе иммунокомпетентных 1 гок человека под влиянием антигенов чумного микроба исследованы, однако, недостаточно. Мы располагаем небольшим количеством работ, посвященных изучению пролиферативного ответа лимфоцитов человека с использованием различных методических подходов или оценке иммунологической перестройки в организме вакцинированных людей (Саянина Л.В., 1985; Герасимова К.И.,1990; Ледванов М.Ю.,1990). Практически отсутствуют сведения по участию отдельных категорий клеток в индукции и развитии иммунного ответа на антигены чумного микроба, не. изучена их функциональная активность, влияние лимфокинов и других иммуномодуляторов на этот процесс. Важные вопросы, касающиеся использования лимфоцитов человека, иммунизированных in vivo или in vitro антигенами Y.peetiB в гибридомной технологии, вообще не освещались, t < '

Цель работы. Исследование процесса первичной и вторичной иммунизации лимфоцитов человека антигенами чумного микроба в куль-туральной системе in vitro и возможности последующего использования специфически-стимулированных В-лимфоцитов в гибридомной технологии получения культур-продуцентов МКА.

Основные задачи исследования:

1. Разработать культуральные условия для антигенспецифичес-кой стимуляции В-лимфоцитов человека iQ vitro с целью их дальнейшего использования в технологии получения гибридом.

2. Оценить эффективность первичной иммунизации ИКК человека антигенами чумного микроба с учетом изменений жизнеспособности,

г

содержания основных популяций клеток (макрофагов, Т- и В-лимфоцитов), регуляторннх субпопуляций лимфоцитов (Т-хелперов и Т-суп-рессоров), пролиферативной активности, генерации АОК и уровня секреции специфических антител.

3. Изучить функциональную активность иммунокомпетентных кло-ток доноров, вакцинированных против чумы, для выяснения антиген-специфической активации лимфоцитов при их вторичной стимуляции антигенами чумного микроба la vitre

4. Оценить влияние различных соотношений макрофагов, Т- и В-лимфоцитов в культуре клеток на уровень пролиферативного ответа, индуцированного антигенами чумного микроба in vitro .

5. Разработать условия получения гибридом, продуцирующих моноклональньге антитела к антигенам чумного микроба на основе стимулированных in vitro В-лимфоцитов. Оценить различные методические подходы в технологии получения гибридом, включающие выбор источника иммунокомпетентных клеток и использование различных опухолевых партнеров.

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

В итоге экспериментальной работы установлены оптимальные условия для антигенспецифической стимуляции иммунокомпетентных клеток человека в условиях in vitro . Показано, что, качество и источник получения сыворотки является определяющим параметром для выживания клеток in vitro . Отмечена различная потребность клеток в дополнительных ростостимулирующих компонентах в зависимости от процентного содержания сыворотки в среде культивирования.

Впервые на модели иммунокомпетентных клеток человека было проведено детальное изучение первичного иммунного ответа in vitro на антигены чумного микроба с использованием как традиционных, так и современных иммунологических методов. Получены результаты количественных изменений на популяционном и субпопуляционном

- б -

уровнях в зависимости от природы и дозы антигена с использованием метода мембранной иммунофлуоресценции. Обнаружено, что капсул] ный антиген и микробная взвесь Y.pestie кт 76 в процессе первичной иммунизации иммунокомпетентных клеток в условиях in Tltro не индуцировали секрецию специфических антител, незначительно активировали пролиферацию и образование АОК.

Изучено формирование антигензависимого пролиферативного ответа в культурах с различным количественным соотношением основных популяций ИКК. Установлено, что культура клеток, имеющая соог, ношение макрофагов, Т- и В-лимфоцитов, равное 0,3:2:1, отвечала значительным усиление»пролиферации на совместное действие микробной взвеси YopeBtie EV 76 и митогена лаконоса.

Нобыми являются данные об участии макрофагов в развитии как первичных, так и вторичных иммунных реакций в культуре иммунокомпетентных клеток человека, а также обязательного присутствия антигена и проявления хелперных свойств монокинов в культуральной системе.

Вторичная стимуляция лимфоцитов, вьщеленных от вакцинированных против чумы доноров, сопровождалась повышением антигензависи-мой бласттрансформации клеток и продукцией специфических иммуноглобулинов. Впервые было установлено, что дополнительная стимуляция лимфоцитов в условиях in vitro антигенами чумного микроба в присутствии неспецифических активаторов клеточного роста является эффективным приемом обогащения клеточного пула антигенспецифи-ческими В-лимфоцитами.

Данные по иммортализации В-клеток, ввделенных от вакцинированных доноров, дают полезную информацию о формировании иммунного ответа и об антигенах, которые вызывают выработку защитных антител.

Практическая ценность работы. Предложенная модель клеток может быть использована для оценки иммуногенных свойств различных антигенов* иммунологической безопасности новых производственных серий или усовершенствованных вакцин, а также биологически активных веществ, обладающих антигенностыо. Культура иммунокомпетент-ных клеток человека 1л vitro как тест-система применяется в научных исследованиях многих лабораторий РПЧИ.

Оптимизированы этапы процесса иммунизации лимфоцитов человека in vitro , включая условия культивирования, конкретный набор антигенов, источник вьщеления иммунокомпетентных клеток, применение иммуномодуляторов, клеточный ансамбль, участвующий в формировании ответа. Разработанный метод предложен для проведения иммунизации лимфоцитов человека в условиях ia vitro любыми антигенами . '

По материалам исследований составлены методические рекомендации "Вццеление, культивирование и иммунизация лимфоцитов человека in vitro ", которые обсуждены и одобрены Ученым советом РПЧИ Iпротокол Мб от 26.12.1990 года).

Определены эффективные подходы по созданию человеческих гиб-ридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам различных возбудителей.

Метод иммунизации лимфоцитов человека la vitro успешно применяется в практической работе. На его основе созданы гибри-домы, продуцирующие иммуноглобулины человека к поверхностным антигенам возбудителя лептоспироза, что подтверждено соответствующими актами о депонировании гибридных штаммов.

Основные положенияt выносимыеназадиту:

I. Культуральные условия и факторы, необходимые для сохранения жизнеспособности, оптимальной пролиферации, дифференцировки

и последующей продукции антител иммунокомпотентными клетками человека in Titro .

2. Комплексный способ оценки эффективности первичной стимуляции иммунокомпетентных клеток человека антигенами чумного микроба по показателям жизнеспособности и функциональной активности клето! определяемой по экспрессии поверхностных рецепторов на основных популяциях иммунокомпетентных клеток и регуляторных субпопуляциях Т-лимфоцитов, пролиферации лимфоцитов, образованию АОК и синтезу специфических иммуноглобулинов В-лимфоцитами.

3. Функциональная активность примированных иммунокомпетентныэ клеток человека при их вторичной стимуляции антигенами чумного микроба в условиях in Titro

4. Изменение интенсивности антигенспецифической бласттранс-формации лимфоцитов в культурах с количественной рекомбинацией основных популяций иммунокомпетентных клеток.

5. Сравнительный анализ продуктивности процедуры получения гибридом на основе иммунизированных in vitro В-лимфоцитов, выделенных из различных источников, и миеломных линий мыши и человека. Условия выделения и сохранения синтетической активности продуктивных гибридом путем оптимизации параметров их выращивания, включающие определенную посевную плотность гибридизуемых клеток и использование в качестве фидера различных клеточных культу]

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции "Иммунокоррекция при инфекционной патологии", Ленинград, 1988 г.; на научных конференциях молодых ученых Н1ЧИ в 1988,1989,1991 гг.; на Всесоюзном семинаре но монокло-нальным антителам, Ростов-на-Дону, 1988,1989 гг.; на Всесоюзной конференции по иерсиниозам, Владивосток, 1989 г.; на Всесоюзной

научной конференции "Эпидемиология, микробиология, иммунология бактериальных и вирусных инфекций", Ростов-на-Дону, 1989 г.; Всесоюзном совещании "Культивирование клеток животных и человека", Пущино, 1990 г.; на Всесоюзном совещании ^Современная реабилитация иммунной системы", Цхалтубо, 1990 г.; Международном симпозиуме "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и патологии", Новосибирск, 1990 г.; I съезде иммунологов РСФСР, Новосибирск, 1992 г.

Структ^ра_диссертациил Диссертация изложена на f$s странице« машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания маториалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 73 отечественных и 181 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 13 рисунками, 21 таблицей.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

Исследования проводили на мононуклеарной фракции клеток периферической крови, селезеночной и тонзиллярной ткани невакцини-рованных доноров, а также клетках, выделенных из крови вакцинированных против чумы сотрудников РПЧИ.

В качестве иммунизирующих препаратов применяли антигены чумного микроба: фракцию I, пили адгезии, липополисахарид, чумную живую сухую вакцину, микробную взвесь ï.pestis ïV 76 . Неспецифическими активаторами клеточного роста служили конканавалин А, митоген лаконоса, фитогемагглютинин, липополисахарид s.oeli OUI В4.

В культуре иммунизируемых иммунокомпетентных клеток определяли количество и функциональную активность макрофагов, Т-лимфо-цитов (Т-хелперов, Т-супрессоров) и В-лимфоцитов методом непря-

- lu -

мой иммунофлуоресценции (Kupper н. ,1986) с использованием моно-клональных антител против СДПв, СД4, СД5, СД8, СД22 и 1а/4 рецепторов и меченных ФИТЦ и ТРИТЦ Рав-фрагментов антивидовых иммуноглобулинов, любезно предоставленных доктором Фибихом X.(Германия ).

Для изучения пролиферативной активности клеток была применена реакция бласттрансформации лимфоцитов (Хоробрых В.В., 1983).

Определение количества антителообразующих клеток проводили методом иммуноферментных зон "ЭЛИСПОТ" по оригинальной методике, предложенной Russell P.H» (1987).

Наличие антител в культуральных супернатантах иммунокомпетентных клеток регистрировали твердофазным иммуноферментным методом с помощью меченных пероксидазой хрена кроличьих антител против человеческих иммуноглобулинов классово и M ("sigma США).

В гибридизациях были использованы следующие клеточные партнеры: мышиная миелома РЗ-Х63/Аа8.653, гетеромиелома CB-F7 ( Grunew R. )t человеческая лимфобластоидная линия UO-729(Röaen А

Слияния проводили с помощью полиэтиленгликоля (Feгrak 1500) по методике amnew R. (1988).

Статистическую обработку результатов проводили по И.П.Ашма-рину и А.А.Воробьеву (19621

Построение графиков. Графическую обработку данных проводили на компьютере M-29U фирмы " Olivetti " с использованием графического пакета "ОгаГ-bex " в интерактивном режиме.

' РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Располагая сведениями о многих существенных моментах, необходимых для воспроизведения иммунного ответа in vitre , в первую очередь, представлялось важным подобрать условия культивирования

- клеток, включающие отбор сывороток с хорошими ростовыми свойствами, определение её процентного содержания в питательной среде, внесение дополнительных ростостимулирующих добавок.

Результатом исследований явилось создание модельной клеточной системы, позволяющей проводить долгосрочные эксперименты без резкого снижения жизнеспособности и иммунореактивности иммуноком-петентньк клеток. Развитие ответных реакций в культуре клеток на антигены, не обладающие собственной митогенной активностью, требует присутствия модулятора В-лимфоцитов. Этими модуляторами могут быть митогенные лектины. Одновременное введение нескольких митогенов может значительно усилить гуморальный ответ как in т1тв , так и in Titre .

Основным направлением в изменении пролиферации лимфоцитов вакцинированных доноров под влиянием комбинаций из двух митогенов (митоген лаконоса+конканавалин А; митоген лаконоса+декстран сульфат; митоген лаконоса+ЛПС oeli OUI В4) бьшо увеличение, превышающее уровень отдельно используемых^ клеточных активаторов. Изменения касались как выраженности, так и динамики изучаемых процессов. Количественные сдвиги ДНК-синтезирующих клеток наступали несколько раньше (со 2-го дня наблюдений) и, как правило, регистрировались более длительное время (до 8-го дня культивирования). Одновременно было установлено, что показатели АОК-образо-вания изменялись в зависимости от сочетаний различных митогенов. Согласно экспериментальным данным совместное применение митогена лаконоса и ЛЛС В. oeli OUI В4 приводило к значительному усилению генерации антигенспецифических АОК в культуре клеток. Таким образом, смесь этих митогенов оказалась наиболее эффективной в получении пула В-лимфоцитов, пригодных для проведения гибридизаций.

Взаимодействие В-лимфоцитов с антигеном является существенным, но недостаточным для пролиферации сигналом. Требуются допол-

нительные факторы, обеспечивающие развитие выраженного антиген-специфического ответа и, тем более, его длительное поддержание

Мы изучали влияние активных факторов ковдиционироваНных сре различных клеточных линий на пролиферацию лимфоцитов, индуцирова ную субоптимальными концентрациями митогена лаконоса. Обнаружены колебания изучаемого параметра в зависимости от процентного соде жания культуральных супернатантов в ростовой среде. Установлена способность медиаторов культуральных надосадков ФГА-стимулирован ной линии " Л1гкегЬ " активировать интактные свежеввделенные лимф циты крови, стимулировать пролиферацию, вызванную митогеном,а та же играть роль "примирующего" фактора, усиливающего действие пол клонального активатора. В случае использования кондиционированно среды мйтогенактивированной мононуклварной фракции тонзиллярных клеток или надосадков моноцитарной линии и-937/Р выявлена тольк умеренная пролиферация лимфоцитов в присутствии митогена лаконос что свидетельствует о незначительной биологической активности ис пытуемых супернатанТов.

Нами исследованы параметры функциональной активности иммуно компетентных клеток человека под влиянием антигенов чумного микроба для понимания механизмов индукции и развития иммунного отве та в условиях 1п П-Ыо .

При взаимодействии лимфоцитов крови невакцинированных доноров (таблица I) с микробной взвесью и капсульным антигеном У.роз

четко выраженных изменений в показателях пролиферативной активности и секреции специфических антител выявлено не было. От мечено лишь, что при тестировании лимфоцитов в "ЭЛИСПОТ", взятых после иммунизации Ti.tr* небольшими дозами микробной взвеси Х.регЗДз IV 76, имеет место увеличение доли ЛОК-формирующих кле ток. Объективные данные, свидетельствующие о вовлечении основных

Таблица I

Показатели функциональной активности иммуновомпетентных влетов человека, первично стимулированных антигенами чумного микроба 1п узлго

Антигены ЗенотипироЕание клеточных популяций по .•тигооресценций мембранных маркеров (%) Ы + т Пролиферация по включению 3Н-тимидина Ы + т КоличествОс АОК • 10ь живых клеток Показатели оптической плотноетл в

! М + т ПФА

СД11в | СД5 СД4 | СД8 СД22 имп/мин |ИС

Микробная Езвесь У.реа4;1а ЕУ76 (1.10 м.кл/мл) 31+2,1 73+1,3 53+2,1 22+1,1 15+3,7 2830^08* - 170 + 64* 0,35 + 0,2

10 мкг/мл 19+5,3 52+2,5 46+3,9 28+2,3 11+1,6 1360+285 - 108 + 56* 0,30 + 0,1

Р1А I мвг/мл 21+3,7 65+1,4 42+4,3 17+1,7 12+1,8 1043+540 - 112 + 58* 0,25 + 0,1

пили адгезии (Юмкг/мл) 33+4,5 55+2,3 60+3,4 37+2,6 25+1,2 5022+1416* 3,3 90 + 24* 0,15 + 0,08

ЛПС 50 мкг/мл У.резПа ЕУ (ХУШо) I мвг/мл 35+4,5 25+2,0 50+3,2 52+2,0 32+2,7 35+1,9 31+3,5 24+1,3 5+2,8 24+2,5 1557+450 - 72 + 25. 4868+953* 3,0 134 + 54* 0,09 +0,03 0,29 +0,1

Контроль (без антигена) 28+3,0 67+2,0 44+3,0 27+3,0 I? '.2,0 1547+604 64 + 30 0,19 + 0,07

со I

Примечание: Звездочкой отмечены статистичеоки достоверные изменения показателей между опытом и контролем (Р0,05).

популяций и регуляторных субпопуляций клеток в Иммунобиологические процессы были получены с использованием метода мембранной иммунофлуоресценции. Выявлены сдвиги в перераспределении популя-ционного состава клеток в сторону некоторого увеличения относительного содержания Т-хелперов и В-лимфоцитов под влиянием микробной взвеси ï.pestis ET 76 .В популяции макрофагов отмечено значительное увеличение экспрессии антигенных маркеров СДПв на клеточных мембранах. Данные МИФ-анализа показали количественное увеличение популяций макрофагов, Т- и В-лимфоцитов при взаимодей вии иммунокомпетентных клеток с пилями адгезии; макрофагов и Т-супрессоров в образцах мононуклеарных клеток, инкубированных с большими дозами ЛПС Yepesti6 KV 76 . Под влиянием антигенов чумного микроба наблюдалось изменение функциональных характеристик макрофагов и лимфоцитов - возрастало количество активированных клеток, идентифицируемых с помощью двойного маркирования кле точных мембран (фенотипирование клеточноспецифических антигенов и рецептора 1а/4, ассоциированного с активацией).

, Одним из наиболее распространенных способов повышения иммун ного ответа на слабоактивные антигены является дополнительная cti муляция лимфоцитов в условиях in Titre.

В процессе ивдукции вторичного иммунного ответа нами выявле на зависимость пролиферативного ответа и секреции специфических антител от дозы антигена и наличия в культуральной системе неспецифических активаторов. В культурах, инкубированных с небольшими дозами антигенов, уровень ответа, как правило, был выше, чем при использовании больших концентраций антигенов. Увеличение числа активно пролиферирующих клеток было отмечено при вторичной стимуляции лимфоцитов микробной взвесью, капсульным антигеном и ЛПС ïopeetis SV 76 . Взаимодействие иммунных В-лимфоцитов с микроб-

ной взвесью и капсульным антигеном также- сопровождалось спещф ческой антителопроцукцией в условиях 1п т11;г» .

Можно полагать, что обнаруженное нами увеличение числа ДШ синтезирующих и иммуноглобулинсекретирующих клеток является еле вием интенсификации анаболических процессов (пролиферация, синч антител) в лимфоцитах, развивающихся в процессе формирования вп ричного иммунного ответа 1п т11;го на антигены чумного микроба.

Для выяснения роли отдельных категорий иммунокомпетентных клеток в развитии иммунного ответа важной представляется инфорк ция, полученная в опытах на культурах с измененным количествен соотношением основных клеточных популяций. Суммарные результать исследований показали (рисунок I), что культура с модифицироваь ньтм составом клеток, имеющим соотношение макрофагов : Т-лимфощ* тов : В-лимфоцитов, как 0,3 : 2 : I, отвечала усилением пролифе рации на действие микробной взвеси У.ров-иэ ВУ 76 . Наиболее значительно этот показатель увеличивался в случае совместного внесения в культуру клеток иммуногена и митогена.

Возможность получения в условиях 1п тИ;гв пула стимулироЕ ных В-лимфощтов послужила основанием для проведения гибридизаций с целью создания гибридом, продуцирующих моноклональные ат тела к антигенам чумного микроба.

На сегодняшний день в практике получения человеческих гиС ридом не рещена проблема источника миеломных клеток. При сравь нии эффективности гибридизаций, проведенных с использованием ра личных миелом (таблица 2), наиболее четко выраженная разница выявлена между показателями, соответствующими мышиной и чeлoвe^ кой линиям. С наибольшей частотой слияние происходило между кле ками сходного гистогенеза, о чем свидетельствует высокий процеь полученных клонов при участии человеческой лимфобластоидной лиь

Я

Рис. I . Пролиферативная активность различных комбинаций МНК человека в присутствии микробной взвеси "У. рез1;1з ЕУ

К - 10^ имп/мин.

Таблица 2

Результаты гибридизаций В-лиыфоцитов, выделенных из различных лоточников, а клетками опухолевых партнеров мыши я человека

Источник Подготовка к гибридизациям . ... .. ...-- рз-хбз А§а.б53 СВ - Р7 ис - 729/6

получения И К К человека иммунизация эййек- ТЙВ- - 1в - ¡секре- стабильность, ыео эсГхбек- ТЙБ- 1в -'севре- стабильность, нес эпйев-ТЙВ- Третирующие" ~ влонн, ста-бнль--ность, ыео

1 1п | 1п У1УО : УЛ1;РО ность гибри-дозац! /О !тирую-- !щие 1И!клоны, ! % нооть ¡тирую-гибри-!щие " дизадяй нлоны, /о ! % яооть гибридизации

М Н К перифери- + 8 0 0 7 0 0 5 0 0

+ 29 2 . 1-2 39 7 3-4 57 3 0-4

ческой крови + + 14 I 0-1 24 15 2-6 34 3 0-2

ННК тонзиллярной ткани + 13 0 0 46 ■л 6 20 4 3

и н К селезеночной + 20 4 0-2 13 3 0-1 28 5 0-1

ис~?29/6 • Для мышиной миеломы P3-x63i.Ag8.653 характерны низкие показатели выхода гибридов независимо от источника выделения лимфоцитов. Определенная тенденция к увеличению количества слива' мых клеток отмечена в гибридизациях с гетеромиеломой СВ-Р7, гено! которой содержит три хромосомы человека. Общий выход гибридных клонов в слияниях между СВ-Р7 и тонзиллярными лимфоцитами даже превышал показатели, полученные с участием ис~729/6 . Согласно литературным данным, линии клеток миелом, сливающиеся с максимал ной частотой, далеко не всегда эффективны в плане получения на и основе продуцентов моноклональных антител. В наших экспериментах имело место несоответствие между общим выходом гибридных культур и'количеством клонов, секретирующих специфические антитела. Сопо тавление результатов гибридизаций, проведенных с использованием качестве доноров В-лимфоцитов крови и миндалин показало примерно одинаковую частоту выхода гибридных клонов. Однако при этом наблюдалась четкая зависимость выхода продуктивных гибридом от выра женности антигенспецифической стимуляции лимфоцитов. Гибридизаци миеломных клеток с первично иммунизированными 1п тНго лимфоцитами периферической крови, миндалин или селезеночной ткани не об печили эффективного получения гибридом, секретирующих моноклонал ные антитела. Небольшое число позитивных гибридом, характеризующихся низким уровнем продукции иммуноглобулинов,указывает на нед таточную степень антигенспецифической стимуляции В-лимфоцитов. П вышение количества гибридом-продуцентов получали в слияниях при пользовании дополнительно стимулированных антигенами чумного мик роба в условиях 1п т11;гв В-лимфоцитов крови вакцинированных доно ров. Оптимальным опухолевым партнером для создания иммуноглобули секретирующих гибридных культур является гетеромиелома СВ-Г7.

Подводя итог всему сказанному, необходимо подчеркнуть, что

для получения гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам чумного микроба, по нашему мнению, предпочтение следует отдать иммунокомпетентным клеткам, выделенным из крови вакцинированных доноров с титрами специфических антител не ниже 1:80 - 1:160. Прием вторичной стимуляции клеток антигенами в условиях 1п Yl.tr» способствует накоплению в общем пуле клеток иммуноглобулинсекре-тирующих В-лимфоцитов, что расширяет возможности получения гибридом к интересующим нас антигенам. Для проведения более эффективных иммунизаций лимфоцитов в условиях 1п Yi.tr« следует учитывать особенности клеточного состава крови и характер антиген-инцуцированных изменений функционального состояния клеток. Предложено использовать модель клеток с определенным количественным соотношением макрофагов, Т- и В-лимфоцитов. Успешное развитие ответных реакций 1п Yitr• также зависит от дополнительного внесения в культуральную систему митогенов и биологически активных факторов роста и созревания клеток.

Дальнейшее проведение исследований по повышению продуктивности и стабильности получаемых гибридных культур позволит, как очевидно, решить вопросы получения моноклональных антител в количествах, необходимых для практического использования.

ВЫВОДЫ:

1. Факторы, определяющие успех антиген-индуцированной стимуляции лимфоцитов человека в условиях 1я vltг• , включают наличие аутологичной сыворотки в среде культивирования, внесение митогенов и медиаторов, способствующих росту и созреванию иммунокомпе-тентных клеток.

2. Первичная стимуляция иммунокомпетентных клеток человека

1п vitr• антигенами чумного микроба характеризуется низким уров-

нем пролиферации и отсутствием секреции специфических антител, что свидетельствует о слабых иммуногенных свойствах изучаемых антигенов.

3. Эффективным приемом обогащения популяции иммунокомпетент-ных клеток крови вакцинированных доноров иммуноглобулинсекретиру щими В-лимфоцитами является их вторичная стимуляция антигенами

чумного микроба в условиях 1а т!Лго . При этом кратность вакцинаций доноров не имеет решающего значения для повышения уровня отвечаемости лимфоидных клеток 1п ПЛго.

4. Установлено, что количественная рекомбинация основных популяций иммунокомпетентных клеток сопровождается увеличением ан-тйгензависимоого пролиферативного ответа лимфоцитов человека

1п т1-Ьго«

5. Показано, что слияния вторичностимулированных 1п тг1**о лимфоцитов крови вакцинированных доноров с клетками гетеромиело-мы СВ-Р7 позволяют добиться максимального выхода гибридом-проду-центов моноклональных антител к антигенам чумного микроба. Первичная стимуляция антигенами Т^ревЗДв XV 76 иммунокомпетентных клеток человека, выделенных из крови, тонзиллярной и селезеночной ткани, обеспечивает низкую эффективность гибридизаций и небольшой выход позитивных клонов.

6. Максимальному выживанию получаемых гибридов на ранних этапах культивирования и продлению их продуктивного периода способствует низкая посевная плотность клеток и использование в качестве фидера клеток эндотелия пуповины человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Исследование взаимодействия антигенов чумного микроба с иммунокомпетентными клетками периферической крови человека и спленоцитов животных/ Демидова Г.В., Алексеева Л.П./. -//Иммунокор-рекция при инфекционной патологии: Тез. докл. конф. -Ленинград, 1987. - С.28.

2. Влияние антигенов чумного микроба на пролиферативнуго активность и синтез антител иммунокомпетентными клетками периферической крови человека и спленоцитов животных/ Демидова Г.В., Алексеева Л.П./. -//Деп. в ВИНИТИ 25.04.88, '¿3658-В88, 4 с.

3. функциональная гетерогенность клеток системы мононук-леарных фагоцитов/ Веркина Л.В., Васильева Г.И./. -//Эпидемиология, микробиология, иммунология бактериальных и вирусных инфекций:. Тез.докл. конф. -Ростов-на-Дону, 1989. - С.64-66. •

4. Бласттрансформирующая активность пилей адгезии/ Водопы -нов С.О., Демидова Г.В./. -//Всесоюзная конференция по иерси-ниозам:Тез. докл. конф. -Владивосток, 1989. -С.16-17.

5. Использование клеточной модели 1а для получения человеческих гибридом/ Алексеева Л.П./. -//Современная реабилитация иммунной системы: Тез. 2 Всесоюз. совещ. - Цхалтубо, 1990.-С.135.

6. Культура иммунокомпетентных клеток человека как тест-система для оценки иммуногенных свойств антигенов чумного микроба/ Алексеева Л.П., Николенко О.Б./. -/Дам же. - С.190. 1

7. Человеческие монокяональные антитела к антигенам возбудителя чумы. Методические подходы в их получении/ Алексеева Л.П., Николенко О.Б./. -//Биотехнология. -1991. -'¿4. - С.19-22.

8. Использование лимфоцитов периферической крови для получения человеческих гибридом к антигенам возбудителя чумы/ Алексеева Л.П., Николенко О.Б., Веркина Л.В./. -//Биотехнология 1991. - Jffi. - С. 15-17.

9. Взаимодействие мышиных иммунокомпетентных клеток с ант1 генами чумного микроба в присутствии моноклональных антител определенной специфичности/ Алексеева Л.П., Щербакова Е.В./. -//

I съезд иммунологов РСФСР: Тез. докл. - Новосибирск, 1992. -С.156.

10. Влияние моноклональных п -чл на иммунизацию тонзилля^ ньтс лимфоцитов человека антигенам!! много микроба в условиях la vitro /Алексеева Л.П./. -//I съе--'ч иммунологов РСФСР: Тез. докл. - Новосибирск, 1992. - СЛ55.

11. Анализ 0-антигенных детерминант возбудителя холеры с помощью моноклональных антител в модельной системе иммунокомпетентных клеток человека/ Алексеева Л.П., Николенко О.Б., Бурла-кова О.С./. -// Иммунология.-1992. - i4. - С.25-28.

12. Разработка способа получении пилей адгезии (лектина) чумного микроба/ Водопьянов О.С., Мишанысин Б.Н., Олейников И.А. Сальникова О.И./. -//Биотехнология. - 1992. -j'M. - С. 18-20,