Взаимодействие чумного микроба и его антигенов с клетками крови человека in vitro

Шмелькова, Татьяна Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие чумного микроба и его антигенов с клетками крови человека in vitro
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие чумного микроба и его антигенов с клетками крови человека in vitro"

На правах рукописи

ШМЕЛЬКОВА Татьяна Петровна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЧУМНОГО МИКРОБА И ЕГО АНТИГЕНОВ С КЛЕТКАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

03.00.07 - микробиология 14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2008

003465313

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

доктор биологических наук Кравцов Александр Леонидович

доктор медицинских наук

старший научный сотрудник Щуковская Татьяна Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Игнатов Олег Владимирович доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Саяпина Лидия Васильевна

Ведущая организация:

ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «2Л_>> ¿Уу^^ус-^л 2009 г. в /_£7" часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.078.01 при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан « 41 » „ьур-рлч 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного со""™

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Чума по-прежнему представляет реальную угрозу для мирового сообщества в связи с существованием природных очагов и потенциальной возможностью использования чумного микроба в качестве агента биотерроризма (Грижебовский Г.М., 2006; Топорков В.П. с соавт., 2007; Richard J.L., Grimes D.E., 2008; Smiley S.T., 2008). В этой связи особую значимость приобретает разработка вакцин нового поколения на основе дальнейшего изучения взаимодействия чумного микроба и его антигенов с клетками иммунной системы организма хозяина, внедрение более информативных и адекватных показателей, характеризующих иммунологическую эффективность средств экстренной и специфической профилактики чумы на клеточном уровне (DeLeo F.R., Hinnebusch В J., 2005; Bashaw J. et al., 2007; Parrino J. et al., 2007; Urban C.F. et al., 2008).

Анализ литературы за последнее десятилетие свидетельствует-, что исход взаимодействия чумного микроба с клетками врожденного иммунитета организма хозяина уже не может рассматриваться лишь с позиций определения показателей завершенности или незавершенности лейкоцитарного фагоцитоза. В расщеплении факторов вирулентности и обезвреживании иерсиний (при подкожном заражении возбудителями чумы и псевдотуберкулеза) важную роль играет феномен внеклеточной бактерицидности нейтрофильных 1ранулоцитов (Исачкова JI.M., Плехова Н.Г., 2002; Weinrauch Y. et al., 2002; Egges С. et al., 2004). Однако, возбудитель чумы эффективно подавляет функциональную активацию (секреторную дегрануляцию, хемотаксис, гибель и лизис) нейтрофилов на начальной стадии развития инфекционного процесса (Urban C.F. et al., 2008). Массовую гибель клеток иммунной системы (фагоцитов и лимфоцитов) по типу апоптоза чумные микробы вызывают с помощью несвязанного с фагоцитозом механизма цитотоксичности (Marketon M. et al., 2005; DeLeo F.R., Hinnebusch B.J.. 2005), что лежит в основе современной гипотезы о причине длительной задержки воспалительного ответа организма хозяина при первичной легочной чуме. Аэрогенное заражение устойчивыми к фагоцитозу чумными микробами представляет огромную эпидемическую опасность, поскольку бактерии интенсивно размножаются in vivo без проявления своих реактогенных свойств в течение 48 ч. Характерный для сепсиса системный воспалительный ответ неожиданно развивается на стадии, предшествующей быстрой гибели организма от легочной чумной инфекции, когда концентрация живых бакгерий превышает 109 м.к./г печени и на 1 мл периферической крови (Bubeek S. et al., 2007).

Иммунологическая эффективность противочумных вакцин, поэтому, оценивается в последние годы по способности вакцинации (специфических антител к V-антигену и другим белкам Уор-вирулона чумного микроба) предотвращать цитотоксический эффект устойчивых к фагоцитозу чумных микробов на клетки иммунной системы лабораторных животных в условиях in vivo и/или in vitro. Адекватность сравнительной оценки интенсивности повреждения клеток привитого и не привитого против чумы организма обеспечивается за счет использования метода импульсной проточной цитофлуориметрии, который позволяет быстро регистрировать распределение большой статистической выборки отдельных лейкоцитов по клеточному циклу и определять в гетерогенной лейкоцитарной популяции долю апоптотических клеток, несущих молекулу ДНК на стадии деградации (Bashaw J. et al., 2007; Zauberman A. et al., 2008).

Поскольку люди по устройству и функционированию клеточных механизмов врожденной антибактериальной защиты существенно отличаются от лабораторных животных, необходим переход к детальному изучению антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба в различных экспериментальных системах его взаимодействия in vitro с лейкоцитами крови именно человека. Без проведения таких исследований невозможно успешное решение актуальной проблемы оценки у людей напряженности приобретенного противочумного иммунитета (DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005).

Однако, цитотоксический эффект чумного микроба на лейкоциты крови человека методом проточной цитофлуориметрии не изучался. При моделировании in vitro чумной бактериемии не исследовалась зависимость интенсивности и динамики повреждения лейкоцитов в образцах цельной крови человека от исходной микробной концентрации, от условий выращивания бактериальной культуры и показателен степени неоднородности клеток микробной популяции, от уровня устойчивости бактерий к поглощению фагоцитами и реактивности бактерицидных гранул клеток врожденного иммунитета, а также от степени иатогенности (вирулентности) штаммов чумного микроба для лабораторных животных. Современными методами автоматического цитологического анализа не изучалось влияние вакцинации людей живой чумной вакциной на функциональную активность и интенсивность повреждения лейкоцитов крови в экспериментальной системе их взаимодействия с клетками и антигенами чумного микроба.

Цель исследования - разработка экспериментальной системы для изучения взаимодействия чумного микроба с лейкоцитами цельной крови человека и оценки клеточного противочумного иммунитета у лиц, привитых живой чумной вакциной.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние условий культивирования на синтез в клетках Yersinia pestis ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов. Определить характер распределений отдельных бактерий по клеточному циклу (по содержанию ДНК на клетку) в культурах вирулентного, вакцинного и авирулентпого штаммов чумного микроба, выращенных при температурах 28 " и 37 °С.

2. Изучить антифагоцитарные и цитотоксические свойства клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах 28 0 и 37 °С, в экспериментальной системе их взаимодействия in vitro с лейкоцитами цельной крови человека, а также динамику размножения чумных микробов с различными антифагоцитарными свойствами в крови с температурой 37 °С.

3. Оценить эффективность опсонизации живых клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах 28 ° и 37 °С, термолабильным комплементом и термостабильными IgG сыворотки крови по изменению показателей фагоцитарной активности, секреторной дегрануляции и раннего апоптоза клеток врожденного иммунитета человека.

4. Выявить различия в цитотоксическом эффекте клеток вакцинного EV НИИЭГ (Pgm"; pFra+; pCad+; pPst+), вирулентного 231 (Pgm+; pFra+; pCad+; pPst+) и авирулен гного KM 260(12) (Pgm+; pFra"; pCad"; pPst") штаммов Y. pestis на лейкоциты крови человека.

5. Изучить убитые чумные микробы и их отдельные антигены как индукторы развития процессов дегрануляции и гибели лейкоцитов в крови привитых и не привитых против чумы людей.

Научная новизна. Впервые разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать процесс фагоцитоза, а также процессы секреторной дегрануляции и апоптоза лейкоцитов при непосредственном введении чумного микроба или его очищенных антигенов в образцы цельной крови человека, основанная на измерении методом проточной цигофлуориметрии относительного содержания ДНК и лизосомальных гранул в отдельных лейкоцитах. Показано, что применение разработанной системы позволяет идентифицировать и дифференцировать в крови человека клетки врожденного иммунитета (моноциты и гранулоциты) по внутриклеточному содержанию бактерицидных веществ, локализованных в первичных (азурофильных) гранулах, регистрировать поглощение бактерий (бактериальной ДНК) активными фагоцитами, оценивать функциональную активацию в фагоцитах протеолитических и бактерицидных систем (дегрануляцию), а также определять характер индуцируемой бактериями гибели (фрагментации ДНК) лейкоцитов в экспериментальных условиях, исключающих влияние различных факторов, связанных с выделением клеточных популяций и неспецифической клеточной активацией.

С использованием разработанной, системы впервые изучено взаимодействие с лейкоцитами цельной крови человека чумных микробов, выращенных при температурах 28 0 и 37 °С. Получены новые данные о влиянии условий культивирования на степень устойчивости опсонизированных клеток К pestis к лейкоцитарному фагоцитозу, о способности размножающихся в крови чумных микробов подавлять, в отличие от золотистого стафилококка, секреторную дегрануляцию фагоцитов и их гибель по типу апоптоза на ранней стадии (в течение первых 6-8 ч) взаимодействия с клетками иммунной, системы организма хозяина.

Впервые с использованием метода проточной цитометрии исследован эффект сывороточных опсонинов на исход взаимодействия чумного микроба с клетками врожденного иммунитета человека. Установлено, что развитие в моноцитах и гранулоцитах крови лиц, не привитых чумной вакциной, процессов секреторной дегрануляции и раннего апоптоза зависит от опсонизащш живых чумных микробов, выращенных при температуре 28 °С, сывороточным комплементом и не зависит от термостабильных сывороточных опсонинов (Ig G). Получена информация об устойчивости живых клеток Y. pestis, выращенных при температуре 37 °С, к опсонизации комплементом, подтверждающая на модели клеток крови человека способность факторов вирулентности чумного микроба инактивировать белки сывороточного комплемента.

Впервые изучена динамика гибели лейкоцитов при размножении в крови человека чумных микробов с различными биологическими свойствами, зависимость интенсивности этого процесса от длительности' срока инкубации и исходной микробной концентрации. Установлено, что устойчивые к фагоцитозу чумные микробы вызывают гибель лейкоцитов крови с длительной задержкой по времени (в интервале от 24 до 48 ч инкубации), характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). В отличие от бактерий, выращенных при температуре 28 °С, они не могут вызвать гибели фагоцитов на ранней стадии взаимодействия с клетками крови человека (в течение первых 6-8 ч инкубации).

клетками, липополисахаридом и капсулышм антигеном чумного микроба. Впервые показано, что противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание специфических антигенов У. pestis в периферической крови человека, и оказывает модулирующее воздействие на характер гибели клеток иммунной системы по типу индуцированного апоптоза.

Практическая значимость работы заключается в создании экспериментальной основы для изучения антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба с использованием современного метода цитологического анализа, учитывающего функциональные параметры большого числа индивидуальных клеток в гетерогенных популяциях. Методические приемы, разработанные в процессе выполнения диссертации, нашли применение в научных исследованиях сотрудников РосНИПЧИ «Микроб» и Саратовского Государственного медицинского университета: для сравнительной оценки устойчивости бактерий к лейкоцитарному фагоцитозу и кил лишу полиморфноядерными лейкоцитами крови человека; для изучения факторов, влияющих на развитие апоптоза лейкоцитов в крови человека и лабораторных животных; для прогнозирования осложнений у инфицированных новорожденных в клинических условиях по показателям интенсивности дегрануляции лейкоцитов периферической крови и лейкоцитарного апоптоза.

Полученные в работе экспериментальные данные могут служить основой для дальнейших исследований, направленных на дифференцирование штаммов У. pestis по степени их патогенности и эпидемической опасности для человека, а таюке на разработку эффективного теста оценки in vitro напряженности приобретенного клеточного иммунитета у лиц, привитых чумной вакциной.

По материалам диссертационной работы составлены;

1) методические рекомендации «Экспресс - метод выделения лейкоцитов из цельной крови человека и экспериментальных животных», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 9 от 01.10.99 г. и утверждены директором института «Микроб»;

2) методические рекомендации «Оценка уровня азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека с использованием проточной цигометрии», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб», протокол № 6 от 06.07.01 г. и утверждены директором института «Микроб»;

3) методические рекомендации «Организация работы и обеззараживание материала, содержащего возбудителя чумы при проведении исследований методом проточной цитофлуориметрии», одобрены Ученым советом ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, протокол № 6 от 12.12.08 г. и утверждены директором института «Микроб».

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб».

Апробация работы. Результаты экспериментальной работы были доложены на 2-ой Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998); юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология и ветеринария» (Киров, 1998); научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-

очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999); юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии» (Оболенск, 1999); VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» (Санкт-Петербург, 2000); международной конференции Saratov Fall Meeting 2000: Optical Technologies in Biophysics and Medicine II (Saratov, 2000); международной конференции Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III (Saratov, 2001); научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эниднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Н. Новгород, 2004); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников С11Г (Саратов, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Волгоград, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008), а также на ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2000, 2003, 2005, 2006, 2008 гг.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Информация об антифагоцитарных и цитотоксических свойствах чумного микроба может быть получена в экспериментальной системе, основанной на введении живых бактерий в цельную кровь человека и использовании проточной цитофлуориметрии для измерения в отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания ДНК и бактерицидных (азурофильных) гранул.

2. Взаимодействие чумных микробов с лейкоцитами крови лиц, не привитых чумной вакциной, носит характер незавершенного фагоцитоза: с низкой эффективностью распознавания и поглощения бактерий фагоцитами; с подавлением развития в фагоцитах процесса секреторной дегрануляции; с нарушением защитного механизма быстрой гибели нейтрофилов по типу раннего апоптоза.

3. Интенсивность подавления защитной реакции клеток врожденного иммунитета человека факторами вирулентности Y. pestis и, как следствие, скорость размножения бактерий в крови с температурой 37 "С зависят от условий выращивания исходной бактериальной культуры (температура 28 0 или 37 °С), от степени неоднородности клеток микробной популяции но содержанию ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов.

4. Устойчивые к фагоцитозу чумные микробы индуцируют- гибель лейкоцитов в цельной крови человека но типу позднего апоптоза - с длительной отсрочкой по времени, типичной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Штаммы Y. pestis EV НИИЭГ, 231 и КМ 260(12), относящиеся к различным группам патогенности (опасности), отличаются по способности и характеру индукции в крови позднего цитотоксического эффекта.

5. Противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание антигенов чумного микроба в крови человека, и оказывает модулирующее воздействие на характер развития индуцированного бактериями апоптоза.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 22 научных работы, в том числе 8 статей (2 из которых опубликовано в изданиях по «Перечню ведущих журналов и изданий» ВАК РФ).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 91 отечественный и 173 зарубежных источников. Текст иллюстрирован 23 рисунками и 7 таблицами. Общий объем диссертации составляет 157 страниц.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

В работе использовали следующие штаммы микроорганизмов: вакцинный штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ (Pgm", pFra+, pCad+, pPst+); высоковирулентный штамм Y. pestis 231 (Pgm+, pFra+, pCad+, pPst+); авирулентный штамм Y. pestis KM 260(12) [231] (Pgm+, pFra', pCad', pPst"), являющейся изогенной бесплазмидпой производной вирулентного штамма 231; штамм Staphylococcus aureus 209Р, применяемый в унифицированных методах исследования фагоцитарной и бактерицидной активности лейкоцитов при оценке иммунного статуса пациентов в клинических условиях (Меньшиков В.В., 1987; Мед. лаб. технологии, 2002). А также антигены чумного микроба: липополисахарид и капсульный антиген (Ф1), любезно предоставленные профессором Т.М. Тараненко, ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

В опытах in vitro использовали периферическую кровь, выделенную из локтевой вены лиц, привитых и не привитых живой чумной вакциной (мужчин и женщин в возрасте от 23 до 50 лет).

Микробиологические методы. Клетки исследуемых штаммов К pestis выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) в течение 48 ч при температуре 28 °С (исходные стационарные культуры). Объектом исследования являлись также субкультуры штаммов Y. pestis, полученные путем высева исходных культур на бульон Хоттингера (рН 7,2) в концентрации 107 м.к./мл с последующим их культивировапнем в условиях аэрации при температуре 37 "С в течение 3, 6, 12, 18, 24 и 48 ч. Суточные культуры S. aureus выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) при температуре 37 °С. Взвеси с различной концентрацией бактерий от 10 до 109 м.к./мл в забуференном физиологическом растворе (ЗФР) готовили по стандартному образцу мутности ОСО-42-28-86П с использованием метода последовательных разведений. Убитые клетки Y. pestis EV НИИЭГ получали посредством нагревания бактериальных взвесей в течение 30 мин при температуре 100 °С, согласно СП 1.3.1285-03. Для контроля специфической стерильности 0,1 мл взвеси высевали на агаровые пластинки и бульон Хоттингера (рН 7,2) с последующей инкубацией при температуре 28 °С до 5 сут. Жизнеспособность бактерий, а также динамику размножения/гибели в крови клеток Y. pestis EV НИИЭГ определяли путем высева различных разведений обсемененной микробами крови на чашки Петри с агаром Хоттингера (рН 7,2) и подсчета числа колоний (КОЕ), соответствующих жизнеспособным бактериям. Результаты учитывали через 3, 8, 24 и 48 ч инкубации образцов крови при температуре 37 °С.

Выявление и морфологическую характеристику микробов осуществляли в окрашенных по Граму мазках крови человека с помощью световой микроскопии. Сравнительная характеристика клеток Y. pestis в культурах, выращенных при температурах 28 0 и 37 "С, включала в себя: определение электрофоретического профиля белков во фракциях общих мембран и периплазмы бактерий в полиакриламидном геле с 0,1% SDS по методу U.K. Laemmli (1970);

иммунофлуоресцентный анализ бактерий, окрашенных иммуноглобулинами диагностическими флуоресцирующими чумными адсорбированными лошадиными сухими производства РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов), с помощью люминесцентной микроскопии (Титенко М.М. с соавт., 1984) и проточной цитофлуориметрии (Кравцов А.Л., 1997) для подтверждения изменений в их антигенных свойствах; определение наличия капсулы на поверхности клеток чумного микроба методом электронной микроскопии (Коннов Н.П. с соавт., 1975).

Специфическую окраску ДНК в микробных клетках осуществляли смесью этидиум бромида и митрамицина по методу 81ссп Н.В. е1 а1. (1981), а суммарного белка флуоресцеинизотиоцианатом по методу НиПег К.1 & Е1рс1 Н.Е. (1978). С помощью проточной цитометрии в исследуемых бактериальных культурах определяли характер распределения большой статистической выборки отдельных чумных микробов по клеточному циклу (по содержанию ДНК и белка на клетку), а также оценивали степень неоднородности бактериальных культур по данным показателям в различные сроки роста клеток гетерогенной микробной популяции при температуре 37 "С (Кравцов А.Л.. 1997). Из частотных распределений отдельных бактерий по клеточному циклу получали информацию о процессах репликации ДНК и деления клеток в бактериальных культурах с различными биологическими свойствами (Х1ееп Н.В. й а!., 1982; Ке11 Б. а а1., 1991; АНтап Я. еХ а]., 1993; ЬеЬагоп Р., 1оих Р., 1994).

Иммунологические методы. Кровь (15-20 мл) дефибрмнировали посредством встряхивания со стеклянными бусами в стерильном флаконе в течение 15 мин. Лейкоциты выделяли из крови общепринятым методом, абсолютное количество клеток в 1 мл подсчитывали в камере Горяева (Мед. лаб. технологии, 2002). Для проточно-цитофлуориметрических исследований применяли также экспресс-метод выделения лейкоцитов из микрообъема цельной крови человека (100 мкл), основанный на гипотоническом лизисе эритроцитов с последующим восстановлением осмотического баланса (Ют^оу АХ. с! а1., 2000). Дифференциальный подсчет в цельной крови или в выделенных лейкоцитарных взвесях лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов проводили как унифицированным методом морфологического анализа мазков, так и с помощью быстрого цитохимического метода МЛ. Ме1атес1 й а1. (1972). В сыворотках крови привитых против чумы людей в реакциях РНГА и РТНГА с использованием диагностикума эритроцитарного чумного антигенного производства НИИМ МО РФ (г. Киров) определяли титр специфических антител к капсульному антигену чумного микроба (Самойлова Л.В. с соавт., 1998). Инактивацию сывороточного комплемента проводили путем нагревания нормальной сыворотки крови при температуре 56 °С в течение 30 мин на водяной бане. Осадок клеток (лейкоцитов и эритроцитов) трижды отмывали от сыворотки ЗФР (рН 7,4), а затем смешивали с инактивированной сывороткой для получения крови с инактивированным комплементом (Бобылева Е.В., 2004; Вазвое С.-Ь'., В]егкпез Я., 1984).

Проточно-цитофлуориметрическое исследование лейкоцитов включало: 1) анализ распределений выделенных, фиксированных спиртом и окрашенных смесью митрамицина и этидиум бромида лейкоцитов по клеточному циклу (Ваг1о£1е В. й а1., 1976); 2) детекцию и определение относительного содержания в крови диплоидных лейкоцитов (активных фагоцитов), несущих собственную ДНК плюс ДНК всех поглощенных бактерий (Кравцов А.Л. с соавт., 1994); 3) анализ лейкоцитов, суправитально окрашенных акридиновым оранжевым, для оценки

состояния в отдельных клетках ядерного хроматина и бактерицидных гранул (Melamed M.R. et ah, 1972-1974); 4) определение относительного количества в крови апоптотических клеток (в %), несущих молекулу ДНК на стадии деградации (Telford W. et al., 1994; Козинец Г.И. с соавт., 2002); 5) оценку интенсивности секреторной дегрануляции клеток врожденного иммунитета (фагоцитов крови) по методу Abrains W.R. et al. (1983) непосредственно в образцах цельной крови человека (Kravtsov A.L. et al., 2001; Бобылева Е.В., 2004).

Для учета результатов автоматического цитофлуориметрического анализа использовали 2048 канальный анализатор импульсов ORTHO INSTRUMENTS 2102 (USA). Относительное содержание в клетках ДНК, белка, бактерицидных гранул и специфических поверхностных антигенов выражали в условных единицах специфической флуоресценции - каналах от 0 до 2048. Долю клеток с определенным содержанием биологически активного вещества на клетку рассчитывали с использованием курсора и специального интегрирующего устройства анализатора как отношение площади соответствующего пика к общей площади гистограммы (Кравцов A.JL, 1997). Коэффициенты вариации (KB) частотных распределений бактерий или лейкоцитов по содержанию на клетку измеряемых параметров вычисляли из профилей соответствующих гистограмм по формуле M.J. McCutcheon, R.G. Miller (1979).

Статистическую обработку результатов анализа в группах повторных экспериментов проводили с использованием критерия t Стьюдента. Данные представляли в виде средней арифметической величины (М) и ошибки средней арифметической (±ш). Различия считали достоверными при р<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

В процессе роста бактериальной культуры происходит перераспределение клеток по клеточному циклу, что позволяет за счет измерения содержания ДНК в отдельных бактериях получать информацию об интенсивности процессов репликации ДНК и клеточного деления на разных стадиях роста гетерогенной микробной популяции (Kell D. et al., 1991; Lebaron P., Joux F., 1994). Характер распределения отдельных клеток по клеточному циклу различается в стационарных культурах вирулентных и авирулентных штаммов патогенных бактерий (Tyndall R. et al., 1985; Прозоров A.A., 1995), но сравнительная характеристика штаммов чумного микроба с различными биологическими свойствами по данному показателю не проводилась.

Путем измерения относительного содержания ДНК в больших статистических выборках отдельных бактерий (около 50 000 м.к.) нами впервые был проведен сравнительный анализ частотных распределений их по клеточному циклу (по содержанию ДНК на клетку) в двухсуточных культурах вирулентного, вакцинного и авирулентного (бесплазмидного) штаммов чумного микроба, выращенных при температуре 28 °С, а также в субкультурах этих штаммов, находящихся на различных стадиях роста при аэрации на жидкой питательной среде с температурой 37 °С.

Было установлено, что в стационарных двухсуточных культурах трех исследуемых штаммов чумного микроба, выращенных при температуре 28 °С, присутствуют около 90% бактерий с одинаково низким относительным содержанием ДНК на клетку. После высева таких бактерий из оптически плотных миллиардных взвесей на 100 мл жидкой питательной среды, получали бактериальные популяции с

пониженной исходной концентрацией 107 м.к./мл, в которых к 6 ч культивирования резко увеличивалась доля синтезирующих ДНК клеток (в среднем с 10% до 50-70%, р<0,001). В этот период времени устанавливался максимальный уровень неоднородности по относительному содержанию ДНК на клетку в культурах трех исследуемых штаммов чумного микроба, растущих в условиях аэрации при температуре 37 °С. При дальнейшем культивировании эта неоднородность полностью исчезала к 48 ч роста в культурах клеток вирулентного штамма 231 ив большей степени сохранялась в двухсуточных культурах клеток авирулентного штамма КМ 260(12), чем в культурах клеток вакцинного штамма EV (р<0,01) чумного микроба (рисунок !). Это свидетельствовало о различной рефляции процесса клеточного деления в исследуемых гетерогенных микробных популяциях (Sleen H.B. et al, 1982; Kell D. et al., 1991; Lebaron Р., Joux F., 1994; Alvarez-Barrientos A. et al., 2000), о более быстром (вероятно, синхронном) делении клеток вирулентного штамма Y.pestis на поздней стадии его роста при температуре 37 "С.

Время культивирования при температуре 37 °С, ч

□ штамм Y. pestis 231

3 штамм Y. pestis КМ 260(12)

□ штамм Y. pestis EV

нииэг

0 ч культивирования - показатели, характерные для исходных культур, выращенных при температуре 28 °С в течение 2-х сут. Цифры сверху - это значения КВ ДНК- гистограмм, %.

Рисунок 1. Распределение бактерий по клеточному циклу в культурах вирулентного 231, авирулентного КМ 260(12) и вакцинного ЕУ НИИЭГ штаммов У. ре$Ш, выращенных при температурах 28 ° и37°С.

Поскольку при делении грамотрицатсльных бактерий высвобождаются эндотоксины (мультимолекулярные комплексы липополисахарида с мембранными белками), обладающие в крови человека и животных выраженными цитотоксическими свойствами (НеИтап .1. е! а1., 2000; Винокуров М.Г. с соавт., 2006), нами был изучен цитотоксический эффект трех исследуемых штаммов У. ре^ги с различными биологическими свойствами на начальной и поздней стадиях размножения бактерий в образцах цельной крови человека с температурой 37 °С.

Интенсивность цитотоксического эффекта клеток чумного микроба впервые оценивали в экспериментальной системе in vitro по изменению относительного содержания в крови погибших и поврежденных лейкоцитов (в апоптозе) методом проточной цитофлуориметрии. Проведенные сравнительные исследования показали, что вирулентный штамм чумного микроба, размножаясь в образцах крови человека с температурой 37 °С, вызывает в интервале времени от 24 до 48 ч гибель от 70 до 95% лейкоцитов независимо от исходной микробной концентрации. В тех же условиях наблюдали сравнительно слабый цитотоксический эффект клеток авирулентного штамма КМ 260(12) (р<0,001). Обладающий остаточной вирулентностью вакцинный штамм EV НИИЭГ повреждал лейкоциты только при высокой исходной микробной нагрузке. Его цитотоксический эффект развивался в интервале времени от 8 до 48 ч инкубации постепенно, в отличие от быстро развивающегося эффекта клеток высоковирулентного штамма 231. На начальной стадии размножения в образцах крови человека (через 8 ч инкубации) вирулентный штамм чумного микроба повреждал при высокой исходной микробной нагрузке 5'108 м.к./мл крови (или около 100 м.к. на лейкоцит) в 5 раз меньше лейкоцитов (р<0,001), чем клетки золотистого стафилококка (таблица 1).

Таблица I. Интенсивность апоптоза лейкоцитов крови человека in vitro в ответ на клетки вирулентного, авирулентного и вакцинного штаммов чумного микроба

Относительное содержание

Содержание гиподиплоидных лейкоцитов

Индуктор апоптоза микробных в различные сроки

клеток в мл инкубация крови с индуктором

крови апоптоза при 37 °С, %

(0 ч инкубации)

8ч 24 ч 48 ч

(М±ш) (М±т) (М±ш)

Y. pestis EV 5х108 28,3±1,4 36,6±0,9 73,4±0,2

Y. pestis KM 260(12) 5х108 14,4±0,2 15,0±0,6 23,4±1,2

Y. pestis 231 5х108 12,0±0,1 83,5+1,3 95,1±1,0

S. aureus 5x108 51,6±3,2 62,3±2,1 66,2±4,4

Y. pestis EV 5x104 6,3±0,5 10,6±0,8 9,4±1,2

Y. pestis KM 260(12) 5х104 6,5±0,1 8,6±0,4 13,0±0,1

Y. pestis 231 5x104 7,4±0,2 10,5±0,3 73,8±1,2

S. aureus 5x104 6,0±0,6 9,2±1,0 8,9±0,3

Спонтанный апоптоз _ 5,6±0,21 9,7±0,5 12,3±2,1

(контроль)

Примечание - n = 3

Таким образом, в опытах с клетками цельной крови человека впервые была получена информация, подтверждающая современные представления о различной динамике гибели лейкоцитов при чумной и стафилококковой инфекциях. Считается, что стафилококки активируют, а чумные микробы, наоборот, эффективно подавляют

апоптоз клеток врожденного иммунитета на начальной стадии развития инфекционного процесса. Массовую гибель клеток иммунной системы по типу апоптоза (фагоцитов и лимфоцитов) клетки Y pestis запускают на стадии, предшествующей гибели организма хозяина от чумной инфекции, с помощью несвязанного с фагоцитозом механизма цитотоксичности (Зигангирова Н.А, Гинцбург А.Л., 2004; Marketon М. et al., 2005; Bashaw .1. et al., 2007; Bubeck S. et a!., 2007; Urban F. et al, 2008).

Для доказательства, что способность клеток Y. pestis выживать и размножаться в крови человека зависит от условий выращивания исходной бактериальной культуры и, как следствие, от уровня активации в микробных клетках процессов синтеза ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов, мы использовали при моделировании чумной бактериемии две исходные кулы^ры вакцинного штамма EV чумного микроба, в которых клетки существенно различались по данным показателям - стационарную, выращенную при температуре 28 °С, и экспоненциальную 18-ти часовую культуру, выращенную в условиях аэрации при температуре 37 "С (рисунки 1 и рисунок 2). Далее по тексту мы обозначаем клетки этих двух исследуемых культур соответственно как Y. pestis (28) и Y. pestis (37).

Б„ Ап Бм Ам М

А„ - фракция общих мембран клеток, выращенных при температуре 28 °С; А„- фракция периплазмы клеток, выращенных при температуре 28 °С; Бм - фракция общих мембран клеток, выращенных при температуре 37 °С; Б„ - фракция периплазмы клеток, выращенных при температуре 37 °С; М - маркеры молекулярной массы (кДа).

Рисунок 2. Элсктрофоретический профиль белков во фракциях общих мембран и периплазмы Y. ре51'18 ЕУ НИИЭГ в зависимости от условий культивирования.

С помощью электронной микроскопии подтверждали образование капсулы на поверхности клеток К резШ (37). Активация синтеза белка в бактериях, растущих при данной температуре, приводила к повышению интенсивности их специфической иммунофлуоресценции после окраски диагностическими чумными флуоресцирующими иммуноглобулинами. Доля бактерий с высоким уровнем

содержания на клетку специфических поверхностных антигенов в культурах Y. pestis (37) в 6 раз превышала (р<0,001), по данным метода проточной цитофлуориметрии, относительное содержание таких бактерий в культурах У pestis (28).

Путем подсчета в крови числа жизнеспособных бактерий (КОЕ) было установлено, что при низкой исходной микробной концентрации 104 м.к./мл клетки Y. pestis (28) погибают в образцах крови человека, в отличие от клеток У. pestis (37). При исходной концентрации 108 м.к./мл клетки Y. pestis (28) интенсивно размножались в крови только после 8-и часового инкубационного периода, в то время как рост клеток Y. pestis (37) начинался сразу после их добавления в кровь с температурой 37 °С (рисунок 3). Исходя из результатов проведенных микробиологических исследований, мы предположили, что клетки этих двух исследуемых бактериальных культур обладают различными антифагоцитарными свойствами и, видимо, с различной эффективностью подавляют на начальной стадии размножения антибактериальное реагирование бактерицидных систем клеток врожденного иммунитета человека в условиях in vitro.

Экспериментальное подтверждение этого предположения было получено путем измерения в отдельных лейкоцитах содержания бактерицидных гранул с эластазной и миелопероксидазной активностью. Кровь делили по объему на четыре равные части: один образец инкубировали в отсутствии бактерий (отрицательный контроль); другой с клетками золотистого стафилококка (положительный контроль адекватности антибактериального реагирования бактерицидных систем фагоцитов); а в два оставшихся образца добавляли, соответственно, клетки У. pestis (28) и У. pestis (37), обладающие различной способностью к выживанию и размножению в цельной крови человека. Реакцию бактерицидных систем клеток врожденного иммунитета в образцах крови, обсемененных живыми чумными микробами, оценивали по интенсивности секреторной дегрануляции фагоцитов через каждый час инкубации в течение первых 6 ч, а также через 24 ч. Результаты сравнительного анализа, представленные в виде 32-х характерных гистограмм на рисунке 4, наглядно демонстрируют зависимость антибактериального реагирования бактерицидных систем клеток врожденного иммунитета от вида возбудителя, а также от антифагоцитарных свойсгв клеток У. pestis.

В интервале времени or 3 до 4 ч инкубации клетки S. aureus вызывали при исходных микробных нагрузках более 1 м.к./фагоцит (более 107 м.к./мл крови) полную дегрануляцию около 100% фагоцитов, что свидетельствовало о высокой эффективности киллинга стафилококка в крови человека (Козинец Г.И. с соавт., 2001; Плсхова 11.1'., 2006; Fuchs Т.А. et al., 2007). Однако, в ответ на клетки У. pestis (28) дегрануляция развивалась к 4 ч инкубации при тех же исходных микробных нагрузках только в половине клеток врожденного иммунитета. В интервале времени от 4 до 24 ч ситуация не изменялась. Это свидетельствовало о том, что, размножаясь в крови с температурой 37 "С, клетки Y. pestis EV (28) приобретают через 4 ч способность к полному подавлению процесса секреции бактерицидных веществ из гранул фагоцитов крови человека. Такой характер развития дегрануляции наблюдается, как известно, при незавершенном фагоцитозе и неэффективном киллинге в крови человека клеток Y. pseudotuberculosis (Исачкова JI.M., Плехова Н.Г., 2002), а также при незавершенном фагоцитозе и неэффективном киллинге S.

aureus в образцах крови новорожденных или взрослых людей с иммунодефицитными состояниями (Бобылева Е.В., 2004).

п-104 КОЕ/мл

КОЕ/мл

Время инкубации, ч

А - исходная концентрация У. реяНз ЕМ 104 м.к./мл крови; Б - исходная концентрация У. ЕУ 108 м.к./мл крови.

□ - клетки X рехИя (28): йй) " клетки У. ревЧй (37).

Рисунок 3. Влияние условий культивирования и исходной концентрации клеток У. резШ ЕV НИИЭГ на их способность к размножению в крови человека т уиги.

Поскольку в наших исследованиях у доноров наблюдалась адекватная реакция бактерицидных систем фагоцитов в ответ на клетки золотистого стафилококка, неспособность фагоцитов крови тех же доноров адекватно отвечать секреторной дегрануляцией на клетки У. ре$й$ (28) являлась важным показателем, характеризующим антифагоцитарные свойства чумного микроба. Гистограммы, представленные на рисунке 4, свидетельствуют, что бактерицидные гранулы фагоцитов не реагируют на внедрение клеток У. реяйз (37) в цельную кровь человека. Процесс секреции бактерицидных веществ из клеток врожденного иммунитета подавлялся в этом случае не через 4 ч инкубации, а с момента попадания бактерий в образцы крови, что в состоянии объяснить более высокую жизнеспособность и скорость размножения в крови клеток У резИя (37).

Па каждой из 32-х гистограмм по оси абсцисс - содержание бактерицидных гранул на клетку в условных единицах красной флуоресценции (каналах от 0 до 512), а по оси ординат - количество клеток (от 0 до 1000). Результаты сравнительного анализа лейкоцитов представлены в различные сроки инкубации обсемененной бактериями крови при температуре 37 "С. Исходная микробная нагрузка около 100 м.к./лейкоцит.

Рисунок 4. Различный характер подавления секреции бактерицидных веществ из гранул фагоцитов крови человека клетками У. ЕУ НИИЭГ, выращенными при температурах 28 0 и 37 "С.

Экспериментальные данные, полученные при изучении антифагоцитарных свойств клеток Y. pesíis (37), согласуются с современными представлениями о стратегии, используемой чумными микробами для защиты от бактерицидного эффекта самой многочисленной популяции клеток врожденного иммунитета, ответственной за нейтрализацию факторов вирулентности иерсиний. Ее уникальность состоит не в том, что возбудитель чумы приобретает устойчивость к поглощению и внутриклеточному перевариванию нейтрофилами (такую стратегию используют многие возбудители). При аэрогенном заражении клетками Y. pestis (37) полностью подавляется механизм внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов, необходимый для эффективного киллинга бактерий и развития местного воспаления. В кровь и ткани организма (во внеклеточное пространство) не высвобождаются бактерицидные вещества (extracellular traps), образуемые при секреторной дегрануляции (функциональной активации) и гибели (фрагментации ядерного хроматина) нейтрофилов (Urban C.F. et al, 2008).

Экспериментальная система, разработанная нами для характеристики антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба, основана на добавлении бактерий в цельную кровь человека и измерении в отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания на клетку ДНК и бактерицидных гранул. При использовании этой системы для сравнительной характеристики Y. pestis (28) и Y. pestis (37) было установлено, что процесс гибели (фрагментации ДНК) клеток врожденного иммунитета человека на начальной стадии их взаимодействия с чумными микробами тесно связан с процессом поглощения бактерий активными фагоцитами, а также с развитием в акгивных фагоцитах процесса дегрануляции. Из 32-х ДНК-гистограмм представленных на рисунке 5 видно, что к 6 ч инкубации в крови погибают только активные фагоциты, в которых через 1 и 2 ч инкубации в результате поглощения бактерий (бактериальной ДНК) повышается относительное содержание ДНК на клетку. Процесс фрагментации ДНК клеток врожденного иммунитета (гибели активных фагоцитов по типу раннего апоптоза) запускался, таким образом, через 2 ч после завершения в этих клетках процесса секреторной азурофильной дегрануляции. Поскольку в поглощении и киллинге клеток Y. pestis (28) участвовало вдвое меньше клеток врожденного иммунитета человека, чем в поглощении и киллинге клеток S. aureus (соответственно 44,5±2,5% и 93,0±1,4%, р<0,001), доля погибших фагоцитов в образцах крови, обсемененных клетками чумного микроба и стафилококка, была соответственно около 50% и 100%. Клетки Y. pestis (37), которые не поглощались фагоцитами и не вызывали развития в фагоцитах процесса дегрануляции, не повреждали лейкоциты крови человека в течение суток независимо ог исходной микробной концентрации.

Контроль

S. aureus

Y. peslis (28)

Y. peslis (37)

i ' Ljllli-i

Оч

нШ::'^ i

iVLi-

I . • ,'Г : ■ i| ■:

■ H . .

^J A—

1 4

2 ч

Зч

f'sfi

4ч

JJtii

5 ч

6 ч

I.A

IV ^

—I Li.

24 ч

На каждой из 32-х ДНК гистограмм по оси абсцисс - относительное содержание ДНК на клетку в условных единицах (каналах от 0 до 512), а по оси ординат - количество клеток (импульсов) на единицу измерения (канал). Результаты получены в различные сроки инкубации обсемененной бактериями крови при температуре 37 °С. Поглощение клеток У. pestis (28) и 5. aureus (бактериальной ДНК) вызывает повышение содержания ДНК в активных фагоцитах, а затем фрагментацию ДНК (гибель) активных фагоцитов. Клетки У. pestis (37) не поглощаются фагоцитами и в течение суток не обладают цитотоксическими свойствами.

Рисунок 5. Различия в аитифагоцитарных и цитотоксических свойствах клеток К pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах 28 0 и 37 °С, на фоне адекватной реакции фагоцитов крови человека на клетки S. aureus.

Для доказательства, что разработанная нами экспериментальная система позволяет регистрировать присутствие бактериальной ДНК внутри активных фагоцитов и оценивать фагоцитарную активность клеток врожденного иммунитета человека по отношению к чумному микробу, были проведены исследования с образцами крови, в которых путем нагревания при температуре 56 °С предварительно инактивировали белки сывороточного комплемента (термолабильные опсонины). Кроме того, для создания условий, при которых процесс поглощения бактерий (бактериальной ДНК) невозможен, в образцы цельной

крови добавляли одновременно с микробными клетками известный ингибитор лейкоцитарного фагоцитоза 0,02% ЭДТА (отрицательный контроль). Положительным контролем служили результаты опытов с клетками золотистого стафилококка, поскольку фагоцитарная активность гранулоцитов крови людей с нормальными показателями иммунного статуса по отношению к этому микроорганизму, опсонизированному инактивированной сывороткой, вдвое ниже, чем в крови с активным комплементом, и составляет около 50% (Bassoe C.-F, Bjerknes С.О., 1984).

При добавлении в кровь 0,02% ЭДТА фагоциты не поглощали бактерии (бактериальную ДНК) и мы не наблюдали характерного повышения уровня содержания ДНК в фагоцитах через 1 и 2 ч инкубации, независимо от того какие микробы (S. aureus или Y. pestis) присутствовали в высокой концентрации 5108 м.к./мл в образцах цельной крови. В крови с инактивированным сывороточным комплементом фагоцитарная активность гранулоцитов крови по отношению к S. aureus была двое ниже нормы (снижалась с 93,0±1,4 до 47,8±4,9%, р<0,001), в то время как клетки У. pestis (28), опсонизированные инактивированной сывороткой крови человека, не поглощались фагоцитами и не вызывали развития в фагоцитах процесса секреторной дегрануляции. Это свидетельствовало о том, что в крови лиц, не привитых живой чумной вакциной, нет активных при фагоцитозе специфических антител (термостабильных IgG) к антигенам чумного микроба, но есть специфические антитела к антигенам золотистого стафилококка (Bassoe C.-F, Bjerknes С.О, 1984). Видимо, вследствие отсутствия специфических антител, фагоцитарная активность гранулоцитов крови человека по отношению к клеткам Y. pestis (28) в крови с нормальной сывороткой была вдвое ниже, чем по отношению к золотистому стафилококку. Клетки Y. pestis (37) обладали устойчивостью к

поглощению фагоцитами как в крови с нормальной, так и в крови с инактивированной сывороткой. Они обладали, в отличие от клеток Y. pestis (28), способностью инактивировать сывороточный комплемент, что подтверждается литературными данными (Du Y. et al, 2002; Korhonen Т.К., 2004).

Клетки Y. pestis (37), в отличие от клеток Y. pestis (28), не обладали в используемой нами экспериментальной системе цитотоксическими свойствами в течение суток. Причем, независимо от их исходной концентрации в образцах крови человека. Они повреждали лейкоциты крови (фагоциты и лимфоциты) в интервале времени от 24 до 48 ч - с длительной задержкой, характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). От дозы зависела интенсивность табели лейкоцитов в крови через 48 ч инкубации по типу позднего апоптоза. Доля поврежденных клеток при увеличении концентрации бактерий с 104 до 108 м.к./мл крови повышалась с 10,6±0,8 до 88,3±2,3%. Полученная нами информация, подтверждается литературными данными о динамике гибели лейкоцитов в организме зараженных чумой лабораторных животных. В условиях in vivo возбудитель чумы вызывает при аэрогенном заражении гибель клеток иммунной системы по типу апоптоза, как известно, не ранее 48 ч, что лежит в основе современных представлений о причине длительной задержки воспалительного ответа организма хозяина при первичной легочной чуме (Bubeck S. et al, 2007).

На заключительном этапе выполнения диссертационной работы экспериментальная система, основанная на количественной цитофлуориметрии в отдельных клетках крови относительного содержания ДНК и бактерицидных гранул, была использована нами для оценки влияния противочумной вакцинации на

функциональную активность и интенсивность повреждения лейкоцитов человека при их взаимодействии in vitro с клетками и антигенами чумного микроба.

В образцы цельной крови лиц, привитых и не привитых живой чумной вакциной (ЖЧВ), добавляли живые или убитые нагреванием клетки Y. pestis (28) и Y. pestis (37) в дозе 5108 м.к./мл, а также липополисахарид (ЛПС) или капсульный антиген чумного микроба в концентрациях 100, 500 и 1000 мкг/мл. Функциональную активность и интенсивность повреждения клеток врожденного иммунитета оценивали методом проточной цитофлуориметрии по показателям интенсивности дегрануляции и апоптоза через 2 ч инкубации образцов крови при температуре 37 °С. Кроме того, мы учитывали результаты анализа через 6 ч инкубации, то есть в период, когда у всех не привитых против чумы людей наблюдаются, по данным проточной цитофлуориметрии, выраженные различия в степени реактивности бактерицидных гранул и ядерного хроматина лейкоцитов крови на живые чумные микробы, выращенные при температурах 28 0и 37 °С.

Гранулоциты крови привитых против чумы людей обладали способностью к более эффективному распознаванию специфических антигенов чумного микроба в условиях in vitro. Они отвечали более интенсивной секреторной дегрануляцией на живые, убитые клетки Y. pestis (28), а также на низкую дозу ЛПС чумного микроба. При использовании в качестве антигена убитых клеток Y. pestis (28) дегрануляцию большого числа клеток врожденного иммунитета регистрировали к 2 ч инкубации в образцах крови только лиц, привитых ЖЧВ. Дегенеративные изменения, развивающиеся в лейкоцитах по этому показателю, были более информативны, чем изменения в состоянии ядерного хроматина. Изменения в ядерном хроматине лейкоцитов зависели от срока прошедшего после прививки ЖЧВ, а также от индивидуальных особенностей организма человека. В подгруппе со сроком после прививки от 1 до 4 месяцев они наблюдались лишь у половины обследованных и отсутствовали в ответ на убитые чумные микробы в подгруппе со сроком от 12 до 18 месяцев (таблица 2).

При изучении взаимодействия живых клеток вакцинного штамма чумного микроба in vitro с лейкоцитами крови привитых против чумы людей мы оценивали не только способность противочумной вакцинации активировать апоптоз лейкоцитов на ранней стадии взаимодействия (через 2 и 6 ч инкубации), но и предотвращать поздний цитотоксический эффект устойчивых к фагоцитозу чумных микробов, развивающийся в интервале времени от 24 до 48 ч инкубации. Интенсивность позднего цитогоксического эффекта чумных микробов в образцах крови привитых против чумы людей была достоверно ниже (рисунок 6) при титрах специфических антител к капсулыюму антигену чумного микроба 1:10-1:15.

Таблица 2. Реактивность лейкоцитов крови на убитые клетки У. ЕУ НИИЭГ у различных людей в зависимости от срока, прошедшего после прививки ЖЧВ

Количество Количество

лейкоцитов лейкоцитов с

Образцы крови людей № образца в состоянии поврежденным

дегрануляции, % ядерным

хроматином, %

1 65,0 95,4

2 44,5 92,4

3 35,4 8,7

Через 1 - 4 мес 4 50,1 9,2

после прививки ЖЧВ 5 55,2 25,4

(п = 7) 6 42,6 10,5

7 51,8 9,8

М±т 49,2±3,6** 35,9±15,1

8 33,0 8,0

9 7,5 6,6

Через 12-18 мес после 10 27,9 7,9

прививки ЖЧВ 11 9,7 7,5

(п = 5) 12 23,3 6,5

М±т 20,3±5,9* 7,3±0,4

13 4,5 6,0

14 2,5 10,2

Невакци нированных 15 1,0 5,5

(п = 5) 16 5,1 11,0

17 0,3 3,4

М±т 2,7±1,1 7,2±1,7

Примечание -

1. Результаты учитывали через 2 ч инкубации образцов крови при температуре

37 °С.

2. Достоверность различий с группой невакцинированных р<0,001 (**) и

р<0,05 (*).

0 Невакцинированные Q Вакцинированные

24 48 Время инкубации, ч

Рисунок 6. Влияние противочумной вакцинации на апоптоз лейкоцитов, индуцируемый живыми чумными микробами в крови человека in vitro.

Таким образом, вакцинация активировала клетки врожденного иммунитета (их дегрануляцию, гибель и лизис) на начальной стадии взаимодействия с чумными микробами и снижала интенсивность позднего цитотоксический эффекта бактерий на лейкоциты крови человека.

Выводы

1. Разработана экспериментальная система для получения информации об антифагоцитарных и цитотоксических свойствах чумного микроба, основанная на введении живых бактерий в цельную кровь человека in vitro и использовании проточной цитофлуориметрии для измерения в отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания ДНК и бактерицидных гранул.

2. В двухсуточных культурах вирулентного штамма Y. pestis 231, выращенных на жидкой питательной среде с температурой 37 °С, доля бактерий с относительно низким содержанием ДНК на клетку на 40% выше, чем в культурах авирулентного штамма КМ 260(12), и на 20% выше, чем в культурах вакцинного штамма EV НИИЭГ. Это свидетельствует о более быстром делении клеток вирулентного пггамма в растущей гетерогенной микробной популяции и сопровождается наиболее интенсивным цитотоксическим эффектом этого штамма на лейкоциты крови человека.

3. Способность вакцинного штамма EV НИИЭГ чумного микроба к размножению в образцах цельной крови человека зависит от температурного режима, стадии роста исходной бактериальной культуры и исходной микробной концентрации. При низкой микробной нагрузке 104 м.к./мл в крови погибают к 8-ти ч инкубации клетки стационарной двухсуточной культуры этого штамма, выращенной при температуре 28 °С, и интенсивно размножаются клетки

экспоненциальной (18-ти часовой) бактериальной культуры, выращенной на жидкой питательной среде с температурой 37 °С.

■ 4. Из-за отсутствия специфических антител (активных термостабильных опсонинов) в крови не привитых против чумы людей, фагоцитарная активность гранулоцитов по отношению к чумным микробам, выращенным при температуре 28 °С, вдвое ниже, чем по отношению к золотистому стафилококку. Цитотоксический эффект таких чумных микробов развивается в два этапа - сначала по типу связанного с фагоцитозом раннего апоптоза (через 6 ч инкубации), а затем по типу позднего апоптоза (в интервале времени от 24 до 48 ч).

5. Устойчивая к фагоцитозу популяция клеток чумного микроба может быть получена путем высева клеток двухсуточной культуры У. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температуре 28 °С, на жидкую питательную среду с температурой 37 "С, где бактерии размножаются при аэрации от 6 до 18 ч. Микробная популяция приобретает устойчивость к поглощению фагоцитами крови, утрачивает способность к активации клеток врожденного иммунитета и быстрому повреждению лейкоцитов крови человека, когда становится высоко неоднородной с точки зрения содержания ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов на клетку.

6. Устойчивые к фагоцитозу чумные микробы вызывают гибель лейкоцитов крови но типу позднего апоптоза - с длительной задержкой по времени, характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Штаммы Y. pestis EV НИИЭГ, 231 и КМ 260(12), относящиеся к различным группам патогенности (опасности), различаются по интенсивности цитотоксический эффекта на лейкоциты человека в интервале времени от 24 до 48 ч инкубации образцов крови при температуре 37 °С .

7. Секреторную дегрануляцию и ранний апоптоз клеток врожденного иммунитета человека запускают в образцах цельной крови человека убитые клепки чумного микроба, выращенные при температуре 28 °С, а также препараты липополисахарида и капсульного антигена чумного микроба. У всех лиц, не привитых живой чумной вакциной, наблюдается слабая реакция нейтрофилов периферической крови по данным показателям.

8. Противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета человека, осуществляющих распознавание антигенов чумного микроба, и оказывает модулирующее воздействие на характер развития в крови индуцируемого чумными микробами апоптоза. Интенсивность дегенеративных изменений, развивающихся в лизосомальном аппарате и ядерном хроматине лейкоцитов крови привитых против чумы людей при контакте in vitro с клетками или антигенами чумного микроба, зависит от срока, прошедшего после прививки живой чумной вакциной.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кравцов А.Л., Гребенюкова Т.П.,* Тараненко Т. М., Наумов A.B. Разрушение азурофильных гранул с эластазной активностью в нейтрофилах человека под влиянием эндотоксина Yersinia pestis // Гомеостаз и инфекционный процесс: Матер. 2 Всерос. конф. - Саратов, 1998. - С. 37.

2. Кравцов А.Л., Киреев М.Н., Гребенюкова Т.П.,* Храмченкова Т.А., Кузьмиченко И.А. Оценка состояния генетического аппарата лейкоцитов крови человека в культурах с клетками непатогенных бактериальных штаммов // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология и ветеринария: Матер. Юбил. науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиол. МО РФ. -Киров, 1998,-С. 124.

3. Кравцов А.Л., Гребенюкова Т.П.,* Наумов A.B. Прогочно-цитометрический мониторинг азурофильной дегрануляции полиморфоядерных лейкоцитов в цельной крови человека в ответ на клетки Staphylococcus aureus и Yersinia pestis II Scient. J. -

1999.-№7.-P. 250-252.

4. Кравцов А.Л., Гребенюкова Т.П.,* Наумов A.B. Проточно-цитометрический мониторинг азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека в ответ на клетки Staphylococcus aureus и Yersinia pestis // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: Сб. тез. докл. Юбилейн. научн. конф., поев. 25-лет. ГГЩ прикл. микробиол. - Оболенск, 1999. - С. 82.

5. Кравцов А.Л., Гребенюкова Т.П.,* Тараненко Т. М., Кузнецов О.С., Храмченкова Т.А., Наумов A.B. Проточно-цитофлуориметрический мониторинг за развитием азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека в ответ на эндотоксин Yersinia pestis // Проблемы особо опасных инфекций. - 1999. - № 79.- С. 81-89.

6. Кравцов А.Л., Лянин М.Н., Гребенюкова Т.Г1„* Наумов A.B., Головко Е.М., Малюкова Т.А., Костюкова Т.А., Ежов И.Н. Цитофлуориметрический анализ ДНК некоторых штаммов Vibrio cholera и Yersinia pestis II Проблемы биологической и экологической безопасности: межд. конф. - Оболенск, 2000. - С. 54-55.

7. Гребенюкова Т.П.,* Бобылева Е.В., Кравцов А.Л. Азурофильная дегрануляция как эффектор деградации ДНК апоптозных нейтрофилов // Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика: Матер. VI Российско-Итальян. науч. конф. -Санкт-Петербург, 2000. - С. 66-67.

8. Кравцов А.Л., Киреев М.Н., Куляш Ю.В., Шмелькова Т.П., Бобылева Е.В., Наумов A.B. Роль лейкоцитарной эластазы в антибактериальной защите и развитии патологических процессов при инфекциях // Актуальные вопросы патогенеза, клиники, лечения в инфекционной патологии и организация помощи инфекционным больным. Сб. науч. тр., посвящ. 75-лет. со дня рожд. проф. Н.Р. Иванова. - Саратов,

2000. - С 63-66.

9. Kravtsov A.L., Grebenytikova Т.Р.,* Bobyleva E.V., Golovko E.M., Malyukova T.A., Lyapin M. N., Kostyukova T.A., Yezhov I.N., Kuznetsov O.S. Flow cytofluorometric assay of human whole blood leukocyte DNA degradation in response to Yersinia pestis и Staphylococcus aureus II Proc. SPIE. - 2001. - V.4241. - P. 260-267.

10. Кравцов А.Л., Бобылева E.B., Шмелькова Т.П., Куляш Ю.В. Развитие азурофильной дегрануляции нейтрофилов в крови человека, инфицированной in vitro стафилококком: эффект микробной нагрузки по данным проточной цитофлуорометрии // Актуальные проблемы патологии. Сб. науч. тр., посвящ. 90-летию кафедры патологической физиологии СГМУ. - Саратов, 2001. - С. 102-107.

11. Kravtsov A.L, Bobyleva E.V., Grcbcnyukova T.P,* Kuznetsov O.S, Kulyash Y.V. Flow microfluorometric analysis of phagocyte degranulation in bacteria infected whole human blood cell cultures // Proc. SPIE. - 2002. - V.4707. - P. 395-402.

12. Кравцов A.JI, Шмелькова Т.П., Бобылева E.B, Кузнецов О.С. Оценка уровня азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека с использованием проточной цитометрии // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. -Саратов, 2002.-С. 14-15.

13. Кравцов АЛ, Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н, Кутырев В.В. Проточная цитометрия как новая технология современной клинической микробиологии // Медицинская микробиология - XXI век: Матер. Всерос. научно-практ. конф. - Саратов, 2004. - С. 125-126.

14. Шмелькова Т.П., Кравцов АЛ, Щуковская Т.Н., Видяева H.A., Гаева A.B., Коннов Н.П, Кузнецов О.С, Волков Ю.П, Киреев М.Н. Фагоцитарная активность лейкоцитов крови человека по отношению к клеткам Yersinia pestis EV: оценка in vitro методом проточной цитофлуориметрии // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре й лечении инфекционных заболеваний: Матер, научн. конф, посвящ. 75-летию Нижегор. НИИЭМ. - Н. Новгород, 2004. - С. 178-183.

15. Шмелькова Т.П., Кравцов AJI, Щуковская Т.Н., Ляпин М.Н, Костюкова Т.А, Малюкова Т.А, Головко Е.М, Видяева H.A., Коннов Н.П. Влияние биологических свойств чумного микроба на развитие апоптоза лейкоцитов крови человека в системе in vitro II Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - № 93. - С. 85-89.

16. Кравцов AJI, Шмелькова Т.П., Лоцманова ЕЛО, Клюева С.Н, Щуковская Т.Н. Феномен внеклеточной бактерицидности нейтрофилов и механизмы защиты бактерий от действия лейкоцитарной эластазы // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2007. - № 1. - С. 49-52.

17. Кравцов А.Л, Шмелькова Т.П., Задумина С.Ю, Бугоркова С.А, Клюева С.Н, Щуковская Т.Н. Азурофильная дегрануляция нейтрофилов крови in vitro у лиц, привитых живой чумной вакциной // Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации: Матер. IX съезда Всерос. научно-практ. общества эпидемиол, микробиол. и паразитол.: В 3 Т. Т.1. -Москва, 2007.-С. 71-72.

18. Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л, Шмелькова Т.П., Клюева С.Н, Лоцманова ЕЛО, Кутырев В.В. Роль апоптоза в иммунопатогенезе особо опасных инфекций // Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации: Матер. IX съезда Всерос. научно-практ. общества эпидемиол, микробиол. и паразитол.: В 3 Т. Т.1. - Москва, 2007. - С. 118-119.

19. Кравцов А.Л, Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н. Экспериментальная система для изучения антифагоцитарных свойств возбудителей особо опасных инфекций // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах участниках СНГ: Матер. VIII Межгос. научно-практ. конф. госуд. -участников СНГ. - Саратов, 2007. - С. 232-234.

20. Шмелькова Т.П., Кравцов А.Л, Щуковская Т.Н. Задержка дегрануляции и гибели лейкоцитов крови человека в экспериментальной системе их взаимодействия с устойчивыми к фагоцитозу чумными микробами // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными

заболеваниями на территории государств-участников СНГ: Матер. IX Межгос. научно-практ. конф. госуд. - участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С. 152-154.

21. Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н. Влияние противочумной вакцинации на апоптоз лейкоцитов крови человека // Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Матер. Всерос. научно-практ. конф. - Москва, 2008. - С.67.

22. Щуковская Т.Н., Кравцов А.Л., Шмелькова Т.П., Клюева С.Н. Изучение взаимодействия чумного микроба с клетками крови в модельных системах in vitro // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2008. - С.43.

* - фамилия автора Гребенюкова Т.П. изменена на Шмелькова Т.П.

Подписано в печать 26.12.2008 Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная. Печать трафаретная.

_Объем 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 239_

Типография АВП «Саратовский источник» г. Саратов, ул. Университетская, 42, оф. 106 т. 52-05-93

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шмелькова, Татьяна Петровна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1 РОЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА С КЛЕТКАМИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ОРГАНИЗМА ХОЗЯИНА В ПРОЯВЛЕНИИ МЕХАНИЗМОВ ЕГО ВИРУЛЕНТНОСТИ И ЦИТОТОКСИЧНОСТИ

Глава 2 НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ В ИЗУЧЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ И ДРУГИХ ФАКУЛЬТАТИВНЫХ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПАРАЗИТОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ МЕТОДОВ ПРОТОЧНО-ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА 33 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Материалы

3.1.1 Штаммы микроорганизмов

3.1.2 Антигены и пр епар аты

3.1.3 Флуоресцирующие красители

3.1.4 Цитофлуориметрическое оборудование

3.2 Микробиологические методы

3.2.1 Выращивание бактерий на питательных средах и приготовление бактериальных взвесей

3.2.2 Определение жизнеспособности бактерий, оценка интенсивности их размножения или гибели в образцах цельной крови человека

3.2.3 Световая, люминесцентная и электронная микроскопия бактерий

3.2.4 Электрофоретический метод исследования белков Yersinia pestis

3.2.5 Оценка неоднородности культур Y. pestis по содержанию на клетку ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов

3.3 Иммунологические методы

3.3.1 Взятие крови, выделение лейкоцитов и инактивация сывороточного комплемента в крови

3.3.2 Определение абсолютного и относительного содержания лейкоцитов

3.3.3 Люминесцентная микроскопия и морфологический анализ лейкоцитов

3.3.4 Получение распределений лейкоцитов крови по фазам клеточного цикла

3.3.5 Оценка состояния (структуры) ядерного хроматина лейкоцитов

3.3.6 Определение содержания в фагоцитах бактерицидных гранул с эластазной и миелопероксидазной активностью. Оценка in vitro интенсивности дегрануляции клеток врожденного иммунитета

3.3.7 Определение фагоцитарной активности лейкоцитов и оценка их гибели in vitro по типу апоптоза

3.4 Методы учета и представления результатов цитофлуориметрического анализа

3.5 Статистические методы

Глава 4 ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК В КУЛЬТУРАХ Y. PESTIS, ВЫРАЩЕННЫХ ПРИ ТЕМПЕРАТУРАХ 28 ° и 37 °С

4.1 Акгивация процессов синтеза ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов в клетках Y pestis EV НИИЭГ, растущих на жидкой питательной среде при температуре 37 °С

4.2 Особенности распределений чумных микробов по клеточному циклу в культурах вирулентного и авирулентного штаммов Y pestis

Глава 5 РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ IN VITRO АНТИФАГОЦИТАРНЫХ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЧУМНОГО МИКРОБА

5.1 Сохранение стабильности состояния ядерного хроматина и бактерицидных гранул лейкоцитов в процессе длительной инкубации образцов цельной крови человека

5.2 Сравнительное исследование антифагоцитарных и цитотоксических свойств клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах 28 0 и

5.3 Эффект сывороточных опсонинов на фагоцитариую активность клеток врожденного иммунитета и интенсивность их повреждения in vitro чумными микробами

5.4 Изучение особенностей развития апоптоза лейкоцитов крови человека под влиянием клеток высоковирулентного и авирулентного штаммов чумного микроба

Глава 6 ВЛИЯНИЕ ПРОТИВОЧУМНОЙ ВАКЦИНАЦИИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ И ИНТЕНСИВНОСТЬ ПОВРЕЖДЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ IN VITRO С КЛЕТКАМИ И АНТИГЕНАМИ

Y. PESTIS

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие чумного микроба и его антигенов с клетками крови человека in vitro"

Актуальность проблемы. Чума по-прежнему представляет реальную угрозу для мирового сообщества, о чем свидетельствуют эпидемические осложнения, связанные с активацией ее возбудителя в природных очагах Индии, Мадагаскара и ряда других стран в конце XX - начале XXI веков, а также данные о возможном использовании чумного микроба биотеррористами в качестве ПБА [Онищенко Г.Г., 2003; Кутырев В.В., Куличенко А.Н., 2004; Грижебовский Г.М., 2006; Weir Е., 2005; Calhoun L.N. et al., 2006; Zhou D. et al., 2006; Richard J.L., Grimes D.E., 2008; Smiley S.T., 2008]. Опасность распространения чумы на территории России, а также граничащих с Россией государств, требует решения актуальной проблемы совершенствования средств ее специфической профилактики и лечения.

Создание новых эффективных противочумных вакцин и снижение смертности среди заболевших чумой людей связывают с дальнейшим изучением молекулярных механизмов взаимодействия возбудителя чумы и его антигенов с клетками врожденного иммунитета организма хозяина. На модели чумного сепсиса у мышей, а также в опытах in vitro с лейкоцитами крови лабораторных животных, установлена способность чумного микроба к избирательному подавлению ключевых функций этих клеток (секреция цитокинов, фагоцитоз, ранний апоптоз и другое), лежащих в основе первой линии клеточной антибактериальной защиты, развития местной защитной воспалительной реакции и последующего формирования в организме адаптивного иммунитета [Titball R.W. et al., 2003, DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005; Bosio C.M. et al., 2005].

Анализ литературы за последнее десятилетие свидетельствует, что исход взаимодействия чумного микроба с клетками врожденного иммунитета организма хозяина уже не может рассматриваться лишь с позиций определения показателей завершенности или незавершенности лейкоцитарного фагоцитоза. Необходимо изучение повреждающего эффекта на клетки периферической крови чумных микробов, обладающих устойчивостью при температуре 37 °С к поглощению и киллингу полиморфноядерными лейкоцитами и моноцитами. Взаимодействуя с поверхностью клеток крови организма хозяина, внеклеточно размножающиеся бактерии секретируют в цитоплазму фагоцитов и лимфоцитов цитотоксические белки (Yersinia outer proteins), кодируемые плазмидой вирулентности, что запускает массовую гибель лейкоцитов по типу апоптоза и лейкоцитолиз на стадии генерализации чумного инфекционного процесса. Однако, цитотоксические свойства устойчивых к фагоцитозу чумных микробов недостаточно изучены. Существенные различия в клеточных системах естественной иммунологической защиты у людей и мышей заставляют исследователей задуматься о необходимости изучения антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба на моделях его взаимодействия с лейкоцитами крови человека [Cornells G.R., 2002; Titball R.W. et al., 2003; DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005].

Процессы массивной секреторной дегрануляции и гибели лейкоцитов, запускаемые в крови пациентов токсинами устойчивых к фагоцитозу бактерий, играют решающую роль в генерализации воспаления и в развитии характерных для сепсиса инфекционных осложнений [Маянский А.Н. с соавт., 1999; Козинец Г.И. с соавт., 2002; Casey Н., 2004], особенно при легочных бактериальных инфекциях [Simpson A.J. et al., 2001; Kawabata К. et al., 2002]. Существует гипотеза о ключевой роли этих процессов в развитии тромбогеморрагического синдрома и эндотоксического шока при чуме, основанная на результатах морфологической детекции в ядерном хроматине и цитоплазматических гранулах лейкоцитов крови пациентов интенсивных дегенеративных изменений, предшествующих летальному исходу заболевания в клинических условиях [Исин Ж.М., 1990]. Для подтверждения или опровержения данной гипотезы необходима информация о характере развития процессов секреторной дегрануляции и апоптотической гибели лейкоцитов в цельной крови человека под влиянием чумных микробов с различными биологическими свойствами. Получение такой информации в условиях in vitro является новой, актуальной задачей, решение которой может иметь большое теоретическое и практическое значение.

Клеточная природа иммунитета при чуме не вызывает сомнения [Покровская М.П., Каганова Л.С., 1947; Коробкова Е.И., 1955; Самойлова Л.В., 1963; Самойлова Л.В. с соавт., 1970; Сагимбеков У.А. с соавт., 1986; Васильева Г.И., 1990; Дубровина В.И., 2004; Cowan С. et al., 2005], и все известные на сегодняшний день методы определения in vitro специфической сенсибилизации организма к инфекционному агенту основаны на учете реакций повреждения лейкоцитов крови антигеном [Фрадкин В.А., 1985; Гюлазян Н.М. с соавт., 2006].

Способность вакцинации (специфических антител к V-антигену) предотвращать апоптоз лейкоцитов периферической крови при экспериментальной чуме и в условиях in vitro лежит в основе современного способа оценки напряженности приобретенного противочумного иммунитета у привитых против чумы лабораторных животных [Bashaw J. et al., 2007].

Для определения in vitro уровня напряженности противочумного иммунитета у человека необходимо изучение особенностей взаимодействия чумного микроба и его антигенов с лейкоцитами крови привитых и не привитых против чумы людей с использованием современных методов цитологического анализа, способных адекватно оценивать исход взаимодействия патогенных бактерий с клетками иммунной системы организма хозяина [Кравцов А.Л., 1997].

При изучении фагоцитоза, дегрануляции и апоптоза в последние годы начинают внедряться экспериментальные системы, исключающие влияние на данные процессы неспецифической активации клеток и различных факторов, связанных с выделением популяций лейкоцитов из периферической крови пациентов. Это достигается путем непосредственного введения инфекционного агента или его антигенов в цельную кровь, культивирования образцов крови в оптимальных условиях и использования метода проточной цитофлуориметрии для быстрого определения в микрообъемах культивируемой крови показателей • фагоцитоза, реактивности бактерицидных систем активных фагоцитов и индуцированного апоптоза [Козинец Г.И. с соавт., 2002; Гюлазян Н.М. с соавт., 2006; Abrams W.R. et al., 1983; Bassoe K-F et al., 1984; Cinco M. et al., 1994; Raybourne R.B., Bunnind К J, 1994; Alvarez-Barrientos A. et al., 2000; Kravtsov A.L. et al., 2001-2002].

Эффективность использования метода проточной цитометрии для изучения взаимодействия чумных микробов с организмом хозяина установлена в опытах in vitro с перитонеальными макрофагами [Кравцов А.Л. с соавт., 1994; Кравцов А.Л., 1997], а также с клетками, выделенными из легких и бронхоальвеолярной жидкости лабораторных животных [Bosio С.М. et al., 2005]. Для изучения в условиях in vitro взаимодействия возбудителя чумы и его антигенов с лейкоцитами цельной крови человека этот современный метод оценки взаимодействия патогенных бактерий с клетками иммунной системы организма хозяина не применялся.

Цель диссертационной работы - разработка экспериментальной системы для изучения взаимодействия чумного микроба с лейкоцитами цельной крови человека и оценки клеточного противочумного иммунитета у лиц, привитых живой чумной вакциной.

Основные задачи исследования.

1. Изучить влияние условий культивирования на синтез в клетках Yersinia pestis ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов. Определить характер распределении отдельных бактерий по клеточному циклу (по содержанию ДНК на клетку) в культурах вирулентного, вакцинного и авирулентного штаммов чумного микроба, выращенных при температурах 28 0 и 37 °С.

3. Оценить эффективность опсонизации живых клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах,28 0 и 37 °С, термолабильным комплементом и термоггабильными Ig G сыворотки крови по изменению показателей фагоцитарной активности, секреторной дегрануляции и раннего апоптоза клеток врожденного иммунитета человека.

4. Выявить различия в цитотоксическом эффекте клеток вакцинного EV НИИЭГ (Pgm"; pFra+; pCad+; pPst+), вирулентного 231 (Pgm+; pFra+; pCad+; pPst+) и авирулентного KM 260 (12) (Pgm+; pFra"; pCad"; pPst") штаммов Y. pestis на лейкоциты крови человека.

5. Изучить убитые чумные микробы' и их отдельные антигены как индукторы развития процессов дегрануляции и гибели лейкоцитов в крови привитых и не привитых против чумы людей.

Научная новизна. Впервые разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать процесс фагоцитоза, а также процессы секреторной дегрануляции и апоптоза лейкоцитов при непосредственном введении чумного микроба или его очищенных антигенов в образцы цельной крови человека, основанная на измерении методом проточной цитофлуориметрии относительного содержания ДНК и лизосомальных гранул в отдельных лейкоцитах. Показано, что применение разработанной системы позволяет идентифицировать и дифференцировать в крови человека клетки врожденного иммунитета (моноциты и гранулоциты) по внутриклеточному содержанию бактерицидных веществ, локализованных в первичных (азурофильных) гранулах, регистрировать поглощение бактерий (бактериальной ДНК) активными фагоцитами, оценивать функциональную активацию в фагоцитах протеолитических и бактерицидных систем (дегрануляцию), а также определять характер индуцируемой бактериями гибели (фрагментации ДНК) лейкоцитов в экспериментальных условиях, исключающих влияние различных факторов, связанных с выделением клеточных популяций и неспецифической клеточной активацией.

С использованием разработанной системы впервые изучено взаимодействие с лейкоцитами цельной крови человека чумных микробов, выращенных при температурах 28 0 и 37 °С. Получены новые данные о влиянии условий , культивирования на степень устойчивости опсонизированных клеток К реБИя к лейкоцитарному фагоцитозу, о способности размножающихся в крови чумных микробов подавлять, в отличие от золотистого стафилококка, секреторную • дегрануляцию фагоцитов и их гибель по типу апоптоза на ранней стадии (в течение первых 6-8 ч) взаимодействия с клетками иммунной системы организма хозяина.

Впервые с использованием метода проточной цитометрии исследован эффект сывороточных опсонинов на исход взаимодействия чумного микроба с клетками врожденного иммунитета человека. Установлено, что развитие в моноцитах и гранулоцитах крови лиц, не привитых чумной вакциной, процессов секреторной дегрануляции и раннего апоптоза зависит от опсонизации живых чумных микробов, выращенных при температуре 28 °С, сывороточным комплементом и не зависит от термостабильных сывороточных опсонинов (^ О). Получена информация об устойчивости живых клеток У. резИя, выращенных при температуре 37 °С, к опсонизации комплементом, подтверждающая на модели клеток крови человека способность факторов вирулентности чумного микроба инактивировагь белки сывороточного комплемента.

Впервые изучена динамика гибели лейкоцитов при размножении в крови человека чумных микробов с различными биологическими свойствами, зависимость интенсивности этого процесса от длительности срока инкубации и исходной микробной концентрации. Установлено, что устойчивые к фагоцитозу чумные микробы вызывают гибель лейкоцитов крови с длительной задержкой по времени (в интервале от 24 до 48 ч инкубации), характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). В отличие от бактерий, выращенных при температуре 28 °С, они не могут вызвать гибели фагоцитов на ранней стадии взаимодействия с клетками крови человека (в течение первых 6-8 ч инкубации).

Новой является информация о различном характере реакции in vitro лизосомального аппарата и ядерного хроматина клеток врожденного иммунитета лиц, привитых и не привитых живой чумной вакциной, на контакт с убитыми клетками, липополисахаридом и капсульным антигеном чумного микроба. Впервые показано, что противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание специфических антигенов Y. pestis в периферической крови человека, и оказывает модулирующее воздействие на характер гибели клеток иммунной системы по типу индуцированного апоптоза.

Практическая значимость работы заключается в создании экспериментальной основы для изучения антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба с использованием современного метода цитологического анализа, учитывающего функциональные параметры большого числа индивидуальных клеток в гетерогенных популяциях. Методические приемы, разработанные в процессе выполнения диссертации, нашли применение в научных исследованиях сотрудников РосНИПЧИ «Микроб» и Саратовского Государственного медицинского университета: для сравнительной оценки устойчивости бактерий к лейкоцитарному фагоцитозу и киллингу полиморфноядерными лейкоцитами крови человека; для изучения факторов, влияющих на развитие апоптоза лейкоцитов в крови человека и лабораторных животных; для прогнозирования осложнений у инфицированных новорожденных в клинических условиях по показателям интенсивности дегрануляции лейкоцитов периферической крови и лейкоцитарного апоптоза.

Полученные в работе экспериментальные данные могут служить основой для дальнейших исследований, направленных на дифференцирование штаммов Y. pestis по степени их патогенности и эпидемической опасности для человека, а также на разработку эффективного теста оценки in vitro напряженности приобретенного клеточного иммунитета у лиц, привитых чумной вакциной.

По ма1ериалам диссертационной работы составлены:

1) методические рекомендации «Экспресс - метод выделения лейкоцитов из цельной крови человека и экспериментальных животных», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб», протокол №9 от 01.10.99 г. и утверждены директором института «Микроб»;

2) методические рекомендации «Оценка уровня азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека с использованием проточной цитометрии», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб», протокол №6 от 06.07.01 г. и утверждены директором института «Микроб»;

Основные положения, выносимые на защиту:

3. Интенсивность подавления защитной реакции клеток врожденного иммунитета человека факторами вирулентности Y. pestis и, как следствие, скорость размножения бактерий в крови с температурой 37 °С зависят от условий выращивания исходной бактериальной культуры (температура 28 ° или 37 °С), от степени неоднородности клеток микробной популяции по содержанию ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов.

4. Устойчивые к фагоцитозу чумные микробы индуцируют гибель лейкоцитов в цельной крови человека по типу позднего апоптоза - с длительной отсрочкой по времени, типичной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Штаммы Y. pestis EV НИИЭГ, 231 и КМ 260(12), относящиеся к различным группам патогенности (опасности), отличаются по способности и характеру индукции в крови позднего цитотоксического эффекта.

5. Противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание антигенов чумного микроба в крови человека, и оказывает модулирующее воздействие на характер развигия индуцированного бактериями апоптоза.

Апробация работы. Исследования проведены в рамках плановых НИР, в которых автор являлся соисполнителем: НИР 019-3-03 «Изучение взаимодействия чумного микроба с клетками крови в модельных системах in vitro» на 2003-2007 годы; НИР «Изучение роли биомолекул возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (чумы и холеры) в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток» как раздела ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы.

Результаты экспериментальной работы были доложены на: второй Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (май 1998 г., Саратов); юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология и ветеринария», посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (ноябрь 1998 г., Киров); международной научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999); юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии», посвященной 25-ю ГНЦ прикладной микробиологии (декабрь 1999 г., Оболенск); VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» (декабрь 2000 г., Санкт-Петербург); международной конференции Saratov Fall Meeting 2000:0ptical Technologies in Biophysics and Medicine II (october 2000, Saratov, Russia); международной конференции Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III (october 2001, Saratov, Russia); научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ (октябрь 2004 г., Н.Новгород); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век» (сентябрь 2004, Саратов); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (сентябрь 2007, Саратов); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (сентябрь-октябрь 2008, Волгоград); научнопрактических конференциях РосНИПЧИ «Микроб»: «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2000, 2003, 2005-2008 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 8 статей, из которых 2 - в рекомендованных ВАК изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 91 отечественный и 173 зарубежных источников. Текст иллюстрирован 23 рисунками и 7 таблицами. Общий объем диссертации составляет 157 страниц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шмелькова, Татьяна Петровна

выводы

1. Разработана экспериментальная система для получения информации об антифагоцитарных и цитотоксических свойствах чумного микроба, основанная на введении живых бактерий в цельную кровь человека и использовании проточной цитофлуориметрии для измерения в отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания ДНК и бактерицидных гранул.

2. В двухсуточных культурах вирулентного штамма У. резШ 231, выращенных на жидкой питательной среде с температурой 37 °С, доля бактерий с относительно низким содержанием ДНК на клетку на 40% выше, чем в культурах авирулентного штамма КМ 260(12), и на 20% выше, чем в культурах вакцинного штамма ЕУ НИИЭГ. Это свидетельствует о более быстром делении клеток вирулентного штамма в растущей гетерогенной микробной популяции и сопровождается наиболее интенсивным цитотоксическим эффектом этого штамма на лейкоциты крови человека.

3. Способность вакцинного штамма ЕУ чумного микроба к размножению в образцах цельной крови человека зависит от температурного режима, стадии роста исходной бактериальной культуры и исходной микробной концентрации. При низкой микробной нагрузке 104 м.к./мл в крови погибают к 8-и ч инкубации клетки стационарной двухсуточной культуры этого штамма, выращенной при температуре 28 °С, и интенсивно размножаются клетки экспоненциальной (18-и часовой) бактериальной культуры, выращенной на жидкой питательной среде с температурой 37 °С.

4. Из-за отсутствия специфических антител (активных термостабильных опсонинов) в крови не привитых против чумы людей, фагоцитарная активность гранулоцитов по отношению к чумным микробам, выращенным при температуре 28 °С, вдвое ниже, чем по отношению к золотистому стафилококку. Цитотоксический эффект таких чумных микробов развивается в два этапа - сначала по типу связанного с фагоцитозом раннего апоптоза (через 6 ч инкубации), а затем по типу позднего апоптоза (в интервале времени от 24 до 48 ч).

5. Устойчивая к фагоцитозу популяция клеток чумного микроба может быть получена путем высева клеток двухсуточной культуры У. резИя ЕУ

НИИЭГ, выращенных при температуре 28 °С, на жидкую питательную среду с температурой 37 °С, где бактерии размножаются при аэрации от 6 до 18 ч. Микробная популяция приобретает устойчивость к поглощению фагоцитами крови, утрачивает способность к активации клеток врожденного иммунитета и быстрому повреждению лейкоцитов крови человека, когда становится высоко неоднородной с точки зрения содержания ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов на клетку.

6. Устойчивые к фагоцитозу чумные микробы вызывают гибель лейкоцитов крови по типу позднего апоптоза - с длительной задержкой по времени, характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Штаммы Y. pestls EV НИИЭГ, 231 и КМ260 (12), относящиеся к различным группам патогенности (опасности), различаются по интенсивности цитотоксический эффекта на лейкоциты человека в интервале времени от 24 до 48 ч инкубации образцов крови при температуре 37 °С .

7. Секреторную дегрануляцию и ранний апоптоз клеток врожденного иммунитета человека запускают в образцах цельной крови человека убитые клетки чумного микроба, выращенные при температуре 28 °С, а также препараты ЛПС и капсульного антигена чумного микроба. У всех лиц, не привитых ЖЧВ, наблюдается слабая реакция нейтрофилов периферической крови по данным показателям.

8. Противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета человека, осуществляющих распознавание антигенов чумного микроба, и оказывает модулирующее воздействие на характер развития в крови, индуцируемого чумными микробами апоптоза. Интенсивность дегенеративных изменений, развивающихся в лизосомальном аппарате и ядерном хроматине лейкоцитов крови привитых против чумы людей при контакте in vitro с клетками или антигенами чумного микроба, зависит от срока, прошедшего после прививки ЖЧВ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Прогноз для России по чуме остается на ближайшее время неблагоприятным [Самойлова Л.В., 2007; Топорков В.П. с соавт., 2007], что при отсутствии коммерческой противочумной вакцины, способной защитить человека и животных от первичной легочной чумы, определяет актуальность разработки вакцин нового поколения, а также внедрения новых показателей, характеризующих безвредность и иммунологическую эффективность средств экстренной и специфической профилактики чумы на клеточном уровне в условиях in vivo и vitro [DeLeo F. R., Hinnebusch B.J., 2005; Bashaw J. et al., 2007].

Согласно существующим в России нормативным документам [СП 3.3.2.56196 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских препаратов»; РД 42-28-10-90 «Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы»; РД 42-28-8-89 «Доклинические испытания новых медицинских иммунологических препаратов. Основные положения» и другие] программа испытаний новых вакцин включает доклиническое изучение препарата на лабораторных животных, а также исследование на ограниченной и расширенной группах людей. Для оценки у людей противочумного иммунитета применяется кожная аллергическая реакция. Более безопасный альтернативный способ оценки иммунитета на клеточном уровне (в экспериментальной системе in vitro) на сегодняшний день отсутствует, что осложняет доклиническое испытание новых препаратов [Коровкин А.С., 2008], а также соблюдение правил биологической безопасности, требующих контроля за эффективностью вакцинации лиц, работающих с возбудителем чумы в лабораторных условиях [«Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). Санитарные правила СП 1.3.1285 03 »].

Адекватная оценка взаимодействия патогенных бактерий с клетками организма хозяина - это актуальная проблема современной микробиологии и иммунологии, от решения которой зависит эффективность профилактики, диагностики и лечения инфекционных заболеваний человека и животных. В последние годы проблема решается в клинических условиях путем автоматизации цитологических исследований на основе метода импульсной проточной цитометрии [Alvarerez-Barrientos A. et al., 2000], который является наиболее эффективным методом оценки апоптоза, фагоцитоза и степени реактивности бактерицидных систем клеток врожденного иммунитета [Voyich J., DeLeo F., 2002; Олиферук H.C., Пинегин Б.В., 2007].

Новый подход к оценке напряженности приобретенного иммунитета у привитых против чумы животных (мышей и приматов) учитывает современные достижения в области изучения клеточных механизмов патогенеза чумы и основан на способности противочумной вакцинации предотвращать цитотоксический эффект устойчивых к фагоцитозу чумных микробов на клетки иммунной системы как в условиях in vivo, так и in vitro. На примере химической противочумной вакцины экспериментально доказано, что иммунологическую эффективность ' противочумных вакцин нового поколения (их способность защищать животных от аэрогенного заражения чумой) необходимо оценивать не по титру в сыворотке крови специфических антител к капсульному антигену и/или V-антигену чумного микроба, а по функциональной активности антител на клеточном уровне - по их способности предотвращать при чуме апоптотическую гибель клеток организма хозяина. Для адекватной сравнительной оценки в условиях in vitro интенсивности цитотоксического эффекта бактерий на клетки иммунной системы привитого и не привитого против чумы организма применяется метод проточной цитофлуориметрии, позволяющий быстро регистрировать распределение большой статистической выборки эукариотических клеток по клеточному циклу и определять в гетерогенной лейкоцитарной популяции долю апоптотических клеток, несущих молекулу ДНК на стадии деградации [Bashaw J. et al., 2007].

Использование такого подхода для оценки in vitro напряженности приобретенного иммунитета у привитых против чумы людей требует, по мнению зарубежных специалистов, детального изучения антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба в различных экспериментальных системах его взаимодействия in vitro с лейкоцитами крови именно человека, так как по устройству и функционированию клеточных механизмов врожденной антибактериальной защиты люди существенно отличаются от лабораторных животных [DeLeo F., Hinnebusch B.J., 2005]. Для людей характерен, как известно, гранулоцитарный тип кроветворения и доля гранулоцитов в периферической крови человека около 60%, что вдвое выше, чем в крови мышей и морских свинок [Фрадкин В.А., 1985]. Клетки первой линии антибактериальной защиты (нейтрофилы) содержат у людей вдвое больше бактерицидных гранул, характеризуются более высокой- степенью'зрелости [Кравцов- А.Л. 1997] и отвечают секрецией бактерицидных веществ (секреторной деграиуляцией) на контакт с микробными клетками и бактериальными: антигенами иначе, чем нейтрофилы крови лабораторных животных [Carnlli G. 1996]; Однако, цитотоксический эффект чумного микроба на- лейкоциты, крови человека: методом проточной, цитофлу'ориметрии не изучался. При моделировании in ■ vitro чумной бактериемии не исследовалась зависимость интенсивности и динамики повреждения- лейкоцитов в образцах -цельной крови, человека от исходной микробнойг концентрации, от. условий- выращивания бактериальной культуры и показателей степени неоднородности клеток микробной популяции, от уровня1 устойчивости бактерий. к поглощению фагоцитами: и . реактивности бактерицидных гранул клеток врожденного иммунитета, а -также от степени патогенностиг (вирулентности) : штаммов чумного . микроба для? лабораторных животных. Современными методами автоматического цитологического анализа не . изучалось влияние вакцинации* людей' живой чумной вакциной/ на функциональную активность и интенсивность повреждения лейкоцитов крови в экспериментальной, системе их взаимодействия;: in vitro с клетками, и- антигенами; чумного микроба. • ; " ' . •'• ' . .

В диссертационной работе впервые решались задачи по получению этой, важной информации с целью создания экспериментально-методической; основы для характеристики: in vitro биологических свойств чумного микроба и оценки: у людей приобретенного противочумного иммунитета. Работа, выполнялась на базе лаборатории иммунологии-, РосНИПЧИ «Микроб» ' ПОД руководством Д;б.Ш КраВЦОВа А.Л. И: fliM.H./lj^OBCKOifc, TiH": в; рамках двух завершенных НИР, в которых автор» являлся соисполнителем: «Изучение взаимодействия, чумного микроба с клетками крови в: модельных' системах in vitro»; «Изучение роли биомолекул возбудителей:, особо опасных заболеваний (чумы и холеры) в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток» как раздела ФЦНТП «Исследования и разработки : по приоритетным направлениям науки и техники».

Основой данной работы явился многолетний опыт сотрудников института по применению метода проточной цитофлуориметрии для изучения реактивности бактерицидных гранул и ядерного хроматина клеток иммунной < системы при ■ 122 чумном вакцинном и инфекционном процессах, а также по оценке фагоцитоза и цитотоксических свойств чумного микроба в экспериментальной системе его взаимодействия in vitro с макрофагами лабораторных животных [Кравцов A.JI. с соавт., 1994; Кравцов А.Л., 1997].

Использовали имеющейся в институте коммерческий проточный цитофлуориметр ICP-22 PHYWE (Германия) - первый современный проточный клеточный анализатор, освоенный зарубежной промышленностью. Этот прибор обладает высокой чувствительностью и разрешающей способностью при измерении относительного содержания различных биологически активных веществ в отдельных лейкоцитах крови человека и экспериментальных животных [Gohde W., 1973; Peters D., 1979], а также в отдельных клетках гетерогенной микробной популяции (Кравцов А.Л., 1997). В диагностических лабораториях он применяется с 70-х гг. прошлого столетия. Причем, использованные в диссертации цитохимические методы исследования впервые прошли широкую апробацию в клинических условиях именно на этом цитофлуориметрическом оборудовании [Barlogie В. et al., 1976; Исаков В.Л. с соавт., 1988; Кравцов А.Л., 1997].

Путем измерения относительного содержания ДНК в больших статистических выборках отдельных бактерий (около 50 ООО м.к.) в данной диссертационной работе впервые был проведен сравнительный анализ частотных распределений их по клеточному циклу (по содержанию ДНК на клетку) в стационарных двухсуточных культурах • вирулентного, вакцинного и авирулентного (бесплазмидного) штаммов чумного микроба, выращенных при температуре 28 °С, а также в субкультурах этих штаммов, находящихся на различных стадиях роста при аэрации на жидкой питательной среде с температурой 37 °С.

В результате было установлено, что, независимо от биологических свойств исследуемого штамма, около 90% клеток чумного микроба в исходных стационарных культурах, выращенных при температуре 28 °С, характеризуется относительно низким содержанием ДНК. Высокая степень неоднородности по данному показателю, свидетельствующая об активации в бактериях процесса репликации ДНК, устанавливалась в культурах трех исследуемых штаммов с различными биологическими свойствами через 6 ч роста бактерий при температуре 37 °С. Однако, через 48 ч культивирования при данной температуре она полностью исчезала в популяции клеток вирулентного штамма, но частично сохранялась в популяции клеток авирулентного штамма чумного микроба. Это отражало различный характер деления клеток в гетерогенных микробных , популяциях (Steen H.B. et al., 1982; Kell D. et al., 1991), свидетельствовало о более быстром делении клеток вирулентного штамма на поздней стадии его роста при температуре 37 °С.

При делении клеток грамотрицательных бактерий высвобождаются, как известно, эндотоксины (мультимолекулярные комплексы ЛПС с мембранными белками), обладающие выраженными цитотоксическими свойствами (Hellman J. et al., 2000; Винокуров М.Г. с соавт., 2006). Вероятно поэтому вирулентный штамм чумного микроба оказывал, по нашим данным, в отличие от авирулентного штамма, интенсивный поздний цитотоксический эффект на лейкоциты человека в образцах цельной крови с температурой 37 °С. Было замечено, что по характеру роста на жидкой питательной среде с температурой организма хозяина вакцинный штамм EV чумного микроба занимает промежуточное положение между вирулентным и авирулентным штаммами. Скорость размножения клеток вакцинного штамма EV в образцах крови человека зависела от уровня содержания ДНК, суммарного белка и специфических поверхностных антигенов в отдельных микробных клетках и резко увеличивалась при повышении температуры выращивания исходной бактериальной культуры с 28 0 до 37 °С.

При решении поставленных в диссертации задач учитывали, что в клинических условиях степень тяжести инфекционных заболеваний оценивается в настоящее время на клеточном уровне по двум показателям - по интенсивности дегенеративных изменений в ядерном хроматине и азурофильных гранулах лейкоцитов периферической крови пациентов. По значению индекса дегенерации более 50 (доля поврежденных нейтрофилов более 50%) прогнозируется развитие характерных для сепсиса инфекционных осложнений и высокая вероятность неблагоприятного исхода заболевания [Козинец Г.И. с соавт., 2001]. С другой стороны, по интенсивности секреторной дегрануляции, гибели и лизиса нейтрофилов на начальной стадии инфекционного процесса, либо на начальной стадии взаимодействия бактерий с лейкоцитами крови (в течение первых 3-6 ч) в условиях in vitro, принято оценивать адекватность реагирования клеток врожденного иммунитета человека на внедрение инфекционного агента в кровь и ткани; организмахозяина: [Urban G. et al., 2008;Бобылева E.Bl, 2004]; Благодаря контролю за развитием секреторной дегрануляции в нейтрофильных гранулоцитах была впервые установлена ранее неизвестная: зависимость антибактериального реагирования клеток врожденного иммунитета человека и животных от вида и биологических свойств возбудителя - способность иерсиний (возбудителей чумы и псевдотуберкулеза) подавлять, в отличие от золотистого стафилококка, процесс секреции, бактерицидных веществ из гранул фагоцитов периферической, крови во внеклеточное пространство [Urban С. et ah, 2008]. В: опытах in vitroантифагоцитарные свойства клеток Г. pseudotuberculosis изучались по данному показателю в сравнении с клетками S. . aureus для доказательства, что подавление реакции бактерицидных систем нейтрофиловкровш. человека является важной видовой характеристикой антифагоцитарных свойств возбудителя . псевдотуберкулеза,, а не следствием наличия- в организме доноров врожденного или приобретенного иммуиодефицитного состояния [Исачкова JI.M., ПлеховаН.Г. 2002]. V" '. .':■•.■■■ '■"': ■■■'',. '' л \

Поэтому в диссертационной работе результат взаимодействия чумного микроба с клетками иммунной; системы человека впервые оценивался нами: методом проточной цит офлуориметрии одновременно по двум показателям, а не только по характерному для апоптоза изменению в лейкоцитах внутриклеточного содержания ДНК, причем в ¡условиях адекватного антибактериального реагированияг клеток врожденного иммунитета на внедрение в кровь человека золотистого стафилококка. .

Образец цельной дефибринироваиной крови каждого донора делили по объему на четыре равные части. Одну часть инкубировали при температуре 37° С в отсутствие бактерий (отрицательный' контроль),, другую с клетками S. aureus (положительный контроль), а в два оставшихся образца1 добавляли, соответственно, живые клетки Y. pestis EV, выращенные при температуре 28 °С или 37 9С, которые по данным: предварительно 'проведенных микробиологических исследований различались по содержанию на клетку ДНК, белка, специфических поверхностных антигенов, а также по способности выживать: и размножаться в цельной крови человека. Бактерии добавлялись в кровь в одинаковой исходной концентрации, в пределах от 10J до 109 м.к./мл. Результаты учитывали в 4-х исследуемых образцах крови в динамике, с интервалом времени в 1 ч в течение первых 8 ч инкубации при температуре 37 °С, а также через 24 и 48 ч. Для этого из 4-х образцов крови каждого донора в эти сроки одновременно отбирали по 200 мкл и методом проточной цитофлуориметрии исследовали в микрообъемах цельной крови по 60 ООО отдельных лейкоцитов, измеряя в каждой отдельной клетке относительное содержание ДНК и бактерицидных гранул. Из статистических распределений лейкоцитов по клеточному циклу и по состоянию лизосомального аппарата (гистограмм) определяли в гетерогенной лейкоцитарной популяции относительное содержание: лимфоцитов и фагоцитов; активных фагоцитов с повышенным содержанием ДНК на клетку (2С ДНК фагоцита+ДНК всех поглощенных бактерий); фагоцитов в состоянии секреторной дегрануляции, утративших свои бактерицидные гранулы при взаимодействии с живыми микробами; поврежденных клеток, находящихся на стадии гибели по типу апоптоза и несущих менее 2С ДНК на клетку.

В результате проведенных исследований было установлено, что в экспериментальной системе, основанной на введении живых бактерий в цельную кровь человека и использовании проточной цитофлуориметрии для измерения в v отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания ДНК и бактерицидных (азурофильных) гранул, может быть получена важная информация об антифагоцитарных и цитотоксических свойствах чумного микроба, а также о том влиянии, которое оказывает вакцинация людей живой чумной вакциной на функциональную активность и интенсивность повреждения клеток иммунной системы в условиях in vitro.

Представленные в диссертации экспериментальные данные свидетельствуют, что клетки врожденного иммунитета человека, адекватно реагирующие на внедрение в кровь золотистого стафилококка (активный фагоцитоз бактерий через 1-2 ч, быстрая дегрануляция и гибель активных фагоцитов соответственно к 4 и 6 ч инкубации), абсолютно не реагируют в течение 24 ч (по данным показателям) на внедрение в цельную кровь клеток вакцинного штамма EV чумного микроба, если это клетки экспоненциальной бульонной культуры, выращенной с аэрацией при температуре 37 °С и характеризующейся высокой степенью неоднородности с точки зрения распределения в ней отдельных бактерий по клеточному циклу (по относительному содержанию ДНК на клетку).

Попадая в цельную кровь человека, клетки такой бактериальной культуры запускали дегрануляцию и гибель лейкоцитов с длительной задержкой по времени, характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Причем, с помощью не связанного с фагоцитозом механизма цитотоксичности. В крови полностью отсутствовали активные фагоциты с повышенным содержанием ДНК на клетку, несущие поглощенную бактериальную ДНК. Независимо от исходной i микробной концентрации чумные микробы размножались в крови человека, не проявляя на клеточном уровне своих реактогенных и токсических свойств в течение длительного инкубационного периода (в течение суток). Однако, от дозы зависела интенсивность гибели лейкоцитов (фагоцитов и лимфоцитов) по типу позднего апоптоза в обсемененных живыми чумными микробами образцах цельной крови человека (в интервале времени от 24 до 48 ч инкубации).

При добавлении в кровь убитых клеток чумного микроба из той же экспоненциальной бактериальной культуры, выращенной при температуре 37 °С, не наблюдали развития позднего цитотоксического эффекта. Это согласуется с литературными данными, свидетельствующими, что массовую гибель клеток иммунной системы организма хозяина запускают живые чумные микробы, которые при контакте с поверхностью эукариотических клеток секретируют в их цитоплазму эффекторные белки внешней мембраны (Yops), обладающие цитотоксическими свойствами [Cornelis G.R., 1998; Hueck C.J.,1998].

По мнению Urban C.F. et al. (2008) уникальность стратегии защиты чумного микроба от бактерицидного эффекта самой многочисленной популяции клеток врожденного иммунитета, ответственной за нейтрализацию факторов вирулентности иерсиний, состоит не в том, что он быстро приобретает устойчивость к поглощению нейтрофилами (такую стратегию используют многие возбудители). Возбудитель чумы полностью подавляет необходимый для развития местного воспаления и обеспечения эффективного киллинга бактерий механизм внеклеточной бактерицидности нейтрофильных гранулоцитов - секрецию в кровь и ткани организма (во внеклеточное пространство) бактерицидных веществ («extracellular traps»), образуемых при секреторной дегрануляции (функциональной активации) и гибели (фрагментации ядерного хроматина) нейтрофилов.

Экспериментальные данные, впервые полученные нами на модели взаимодействия чумного микроба с лейкоцитами цельной крови человека, могут иметь большое теоретическое и, в перспективе, практическое значение, поскольку они подтверждают современную гипотезу о причине длительной задержки воспалительного ответа организма хозяина при первичной легочной чуме. Исходя из результатов экспериментов на различных лабораторных животных, эту задержку объясняют в настоящее время, с одной стороны, уникальной способностью возбудителя чумы подавлять защитный механизм функциональной активации, гибели и лизиса нейтрофилов на начальной стадии развития инфекционного процесса, а с другой стороны, его способностью запускать с помощью не связанного с фагоцитозом механизма цитотоксичности массовую гибель фагоцитов и лимфоцитов периферической крови по типу апоптоза на стадии (36-48 ч после заражения), предшествующей гибели животных от чумного сепсиса. Предполагают, что характерные для сепсиса инфекционные осложнения неожиданно быстро развиваются при первичной легочной чуме под влиянием продуктов распада поврежденных клеток организма хозяина [Bubeck S. et al., 2007].

Одним из таких продуктов может быть лейкоцитарная эластаза, которая при массивной дегрануляции и гибели нейтрофилов периферической крови попадает во внеклеточное пространство, вызывая разрушение белков плазмы крови и структурных белков различных тканей организма человека и животных. Динамика повреждения лейкоцитов крови человека устойчивыми к фагоцитозу чумными микробами позволяет нам сделать такое предположение, поскольку при других легочных инфекциях резкое повышение концентрации лейкоцитарной эластазы в плазме крови пациентов неизбежно приводит к быстрому развитию синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдрома) и септического шока [Доценко В.Л. с соавт., 2000; Lengas A. et al., 1994]. Ключевая роль ДВС-синдрома в патогенезе чумы хорошо известна [Исин Ж.М., 1990] и вполне вероятно, что его развитие при чуме зависит от патогенетических аспектов физиологической функции лейкоцитарной эластазы. Пока это только гипотеза, для подтверждения (или опровержения) которой требуются специальные биохимические исследования. Учитывая, что современная стратегия предотвращения генерализации воспалительного процесса у пациентов при острых легочных инфекциях основана на использовании специфических ингибиторов лейкоцитарной эластазы в сочетании с антибиотиками [Simpson A.J., 2001;

128

Kawabata К. е1 а1., 2002], те же ингибиторы могут оказаться эффективными средствами защиты организма человека и от легочной чумной инфекции.

В разработанной нами экспериментальной системе антифагоцитарные и цитотоксические свойства чумного микроба зависели от условий выращивания бактериальной культуры (от температурного режима, питательной среды и длительности срока культивирования). Защитную реакцию клеток врожденного иммунитета вызывали в периферической крови лиц, не привитых живой чумной вакциной, двухсуточные стационарные культуры чумного микроба, выращенные на твердой питательной среде при температуре 28 °С.

В таких культурах, обладающих реактогенными свойствами на ранней стадии взаимодействия с лейкоцитами крови человека, микробные клетки существенно отличались от клеток, присутствующих в экспоненциальных культурах, выращенных при аэрации на жидкой питательной среде с температурой 37 °С. Фактически все бактерии (более 90 %) характеризовались относительно низким содержанием на клетку ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов, что свидетельствовало об очень высокой степени однородности клеток микробной популяции по данным структурным показателям.

Литературные данные подтверждают, что когда для подкожного заражения г или вакцинации) животных используются двухсуточные стационарные культуры чумного микроба, выращенные при температуре 28 °С, на месте внедрения бактерий развивается защитная воспалительная реакция, которая, однако, значительно слабее реакции, вызываемой стафилококками. С точки зрения микробиологии не удается объяснить, почему чумной микроб не вызывает, подобно стафилококкам, интенсивного поражения тканей на месте внедрения, но при этом быстро распространяется в организме хозяина [Домарадский И.В., 1966, 1998].

Важно, что полученные в диссертации новые экспериментальные данные, вероятно, смогут объяснить данный феномен с точки зрения иммунологии, поскольку они согласуются с современными представлениями об иммунной основе инфекционного воспаления, обусловленной зависимостью процессов секреторной дегрануляции, эмиграции и гибели нейтрофильных гранулоцитов от реакции антиген-антитело в стенке сосудов [Исачкова Л.М.; Плехова Н.Г., 2002].

Термостабильные опсонины (специфические ^О), способные активировать фагоцитарную и бактерицидную функцию нейтрофилов крови по отношению к чумному микробу, отсутствовали в сыворотках крови лиц, не привитых живой чумной вакциной, в то время как в тех же сыворотках присутствовали функционально активные специфические антитела,к антигенам S. aureus. Видимо поэтому на раннем этапе взаимодействия с лейкоцитами'крови чумные микробы, выращенные, при температуре 28 °С, активировали и повреждали вдвое меньше клеток врожденного иммунитета человека, чем клетки золотистого; стафилококка. Процессы дегрануляции и гибели лейкоцитов в ответ на; чумные микробы носили .затяжной характер, типичный для не завершенного (дефектного) фагоцитоза, и развивались в крови в два этапа. К 6 ч инкубации чумные микробы успевали повредить, не более 30% суммарного пула лейкоцитов крови (около 50% фагоцитов). Затем их цитотоксический эффект на длительный промежуток времени полностью прекращался, свидетельствуя об изменении биологических свойств бактерий в крови с температурой 37 °С. Основная масса клеток иммунной системы повреждалась устойчивыми к фагоцитозу, чумными микробами в интервале от 24 до 48 ч инкубации, точно также как в случае с исходными культурами, выращенными при температуре 37 °С. ' Динамика повреждения, лейкоцитов крови человека в разработанной нами экспериментальной системе зависела от степени патогенности (вирулентности) штамма чумного микроба для лабораторных -животных. Высоковирулентный штамм оказывал значительно более интенсивный поздний цитотоксический эффект на клетки иммунной системы, чем вакцинный штамм EV НИИЭГ, при фактическом отсутствии в тех же условиях цитотоксического эффекта авирулентного (бесплазмидного) штамма.

Нами установлено, что лейкоциты крови привитых против чумы людей обладают способностью к более эффективному распознаванию специфических антигенов чумного микроба in vitro, так как они отвечаютболее интенсивной секреторной дегрануляцией на низкую дозу ЛПС чумного микроба, а также на убитые или живые чумные микробы, выращенные при температуре 28 °С. Активируя клетки врожденного иммунитета на начальной стадии их взаимодействия с чумными микробами, противочумная вакцинация способствовала предотвращению развития в образцах крови человека позднего цитотоксического эффекта устойчивых к фагоцитозу чумных микробов.

Таким образом, полученные в работе экспериментальные данные согласуются с современными представлениями о молекулярных механизмах, лежащих в основе антиинфекционной резистентности [Исачкова JI.M., Плехова Н.Г., 2002], а также в основе феномена гиперчувствительности при инфекциях, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами [Owen С.А. et al., 1997; Гюлазян Н.М. с соавт., 2006]. Поэтому они создают необходимую экспериментально-методическую основу для дальнейших исследований, направленных на разработку эффективного теста оценки у людей напряженности приобретенного противочумного иммунитета, а также для характеристики и дифференцирования штаммов чумного микроба по степени их патогенности (эпидемической опасности) для человека.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шмелькова, Татьяна Петровна, Саратов

1. Агроскин Л.С., Папаян Г.В. Цитофотометрия Текст. / Л.: Наука, 1977. -295 с.

2. Акимович В.В., Узенцов С.А., Белобородов Р.А. Кожная гиперчувствительность к фракции 1 чумного микроба у морских свинок, сенсибилизированных бактериями чумы Текст. // Пробл. особо опасных инфекций. 1969. - Вып.5. - С. 18-23.

3. Анисимов А.П. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсул Yersinia pestis Текст. / Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Саратов, 2000. - 32 с.

4. Белобородов Р.А., Гиззатуллина С.К., Узенцов С.А., Шанина Л.Н. Аллергический характер местной воспалительной реакции при заражении морских свинок, иммунных к чуме Текст. // Пробл. особо опасных инфекций. 1971. -Вып.1(17). - С.95-101.

5. Белов Л.Г., Девдариани З.Л. ППН у морских свинок, иммунизированных сухой живой вакциной ЕВ и возбудителем псевдотуберкулеза Текст. // Иммунохимия и лаб. диагностика особо опасных инфекций. Саратов, 1985. - С.58 -62.

6. Белоцкий С., Рубинштейн 3. Роль опсонизации Staphylococcus aureus в развитии местного воспаления системного ответа Текст. // Бюл. Эсперим. Биол. и Мед. 1996. - Т. 122, №9. - С.298-300.

7. Бобылева Е.В. Клинико-лабораторный мониторинг за развитием повреждающего воздействия Staphylococcus aureus на лизосомальный и генетический аппараты лейкоцитов крови человека Текст. / Автореф. дисс. . канд. мед. наук Саратов. - 2004. - 23 с.

8. Бухарин О.В., Туйгунов М.М., Зурочка А.В. с соавт. Феномен апоптоза в выживании энтеробактерий в системе паразит-хозяин Текст. // ЖМЭИ. 2002. -№1. - С.79-84.

9. Бывалов А.А., Дармов И.В., Маракулин И.В. с соавт. Роль плазмиды кальцг^йзависимости иерсиний в формировании иммунитета против чумы Текст. // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 2005. - №4. - С.25-29.

10. Бывалов A.A., Дубровин М.Ю., Елагин Г.Д. с соавт. Зависимость между уровнем сероперестройки вакцинированных животных и напряженностью иммунитета к экспериментальной чуме Текст. // Клин. лаб. диагностика. 2007. -№7. - С.48-51.

11. Васильева Г.И. Роль взаимодействия Yersinia pestis с клетками системы мононуклеарных фагоцитов в реализации вакцинного и инфекционного процессов Текст. / Автореф. дисс. . д. м. н. Саратов. - 1990.- 40 с.

12. Васильева Г.И., Киселева А.К., Мишанькин М.Б. с соавт. Апоптоз фагоцитов как один из возможных механизмов патогенетического действия «мышиного» токсина возбудителя чумы Текст. // ЖМЭИ. 2005. - №2. - С.49-52.

13. Видяева H.A., Кутырев В.В., Проценко O.A. с соавт. Экспрессия антигенов чумного микроба, кодируемых плазмидой Ca зависимости Текст. // Молекул, генетика. - 1990. - №6. - С.17-21.

14. Винокуров М.Г., Юринская М.М., Прохоренко И.Р., Грачев С.В. Нейтрализация эндотоксининдуцированных ответов нейтрофилов и моноцитов периферической крови человека липополисахаридом Rhodobacter capciilatus Текст. //Мол. Медицина. 2006. - №4. - С.56-62.

15. Гюлазян Н.М., Давтян Т.К., Пак С.Г. Индуцированный липополисахаридами апоптоз гранулоцитов периферической крови больных, перенесших сальмонеллезную инфекцию Текст. // Клиническая лабораторная диагностика. -2006. №8. - С.25-28.

16. Доклинические испытания новых медицинских иммунологических препаратов. Основные положения. РД 42-28-8-89 Текст. // М., 1989. 31 с.

17. Домарадский И.В. Очерки патогенеза чумы Текст. / М.: Медицина, 1966. -276 с.

18. Домарадский И.В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы Текст. / Саратов, 1993.- 129 с.

19. Домарадский И.В. Чума Текст. / М.: Медицина, 1998. 176 с.

20. Доценко B.JL, Нешкова В.А., Яровая Г.А. Выявление лейкоцитарной эластазы человека из комплекса с плазменным протеиназным ингибитором по ее энзиматической активности с синтетическим субстратом Текст. // Вопросы мед. химии. 1994. - Т.40, № 3. - С.20-25.

21. Доценко B.JL, Спирина А.Я., Макинский А.И. с соавт. Эластаза в плазме крови больных туберкулезом и ее роль в нарушении регуляции процессов свертывания крови Текст. // Вопросы мед. химии. 2000. - Т.46, №2. - С.176-183.

22. Дубровина В.И. Механизмы фагоцитоза и его роль при формировании резистентности организма к возбудителям чумы, псевдотуберкулеза и туляремии Текст. / Автореф. дисс. . докт. биол. наук. Иркутск, 2004. - 43 с.

23. Дятлов И.А., Филиппов А.Ф. Состав внутриклеточного пула аминокислот у чумного микроба при развитии состояний лимитирования и ингибирования роста Текст. // Пробл. особо опасных инфекций. 1994. - Вып.76. - С. 103-112.

24. Желтенков А.И. О чумном токсине, анатоксине, противочумной антитоксической сыворотке и методах стандартизации их на белых мышах Текст. // Вестник микробиологии, эпидемиологии и паразитологии. 1938. - Т. 17, №3-4. -С.272-301.

25. Желтенков А.И. О токсине чумного микроба и антитоксических противочумных сыворотках Текст. // ЖМЭИ. 1946. - №3. - С.81-82.

26. Зеленин A.B., Полетаев А.И., Степанов Н.Г. Флуоресцентная цитохимия нуклеиновых кислот. Состояние и перспективы: к 35-летию метода Текст. // Цитология. 1987. - Т.29, №12. - С.1323-1336.

27. Земсков В.М. Достижения в исследовании физиологии и метаболизма фагоцитов Текст. //ЖМЭИ. 1985. - №12. - С.85-92

28. Зигангирова H.A., Гинцбург A.JI. Роль апоптоза в регуляции инфекционного процесса Текст. // ЖМЭИ,- 2004. №6. - С. 106-113.

29. Зимин Ю.И., Редькин А.П. Значение антител, комплемента и белка А для опсонизации и фагоцитоза золотистого стафилококка Текст. // Иммунология. -1987. №3. - С.62-66.

30. Зюзина В.П., Демидова Г.В., Соколова Е.П. с соавт. Сравнение спектра белков, присутствующих в препаратах липополисахаридов Yersinia pestis, выращенных при 28 ° и 37 °С Текст. // Биотехнология. 2003. - №3. - С.20-24.

31. Иванов B.C. Заболевания пародонта Текст. / М.: Медицинское информационное агентство, 2001. 300 с.

32. Иванова И.А. Yersinia pestis EV как индуктор синтеза цитокинов, регулирующих кооперативное взаимодействие поли- и мононуклеарных фагоцитов в процессе формирования противочумного иммунитета Текст. / Автореф. дисс. . к. б. н. Саратов. - 1998,- 22 с.

33. Исаков В.Л., Пинчук В.Г., Исакова JI.M. Современные методы автоматизации цитологических исследований Текст. / Киев: Наукова Думка, 1988. -213 с.

34. Исачкова JI.M., Плехова Н.Г. К развитию представлений об антиинфекционной резистентности Текст. // Эпидемиология и инф. болезни. -2002. №1. - С.11-15.

35. Исин Ж.М. Патогенез острого инфекционного процесса при чуме Текст. // Совр. аспекты эпиднадзора за особо опасными инф. Алма-Ата, 1990. - С.68-71.

36. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Новые иммунопатогенетические взгляды: апоптотические иммунодефициты Текст. // Иммунология. 1998. - №6. - С.17-18.

37. Козинец Г.И., Высоцкий В.В., Погорелов В.М. с соавт. Кровь и инфекция Текст. / М: Триада-Фарм, 2001. 452 с.

38. Козинец Г.И., Макаров В.А. Исследование системы крови в клинической практике Текст. / М: Триада-Фарм, 1998. 480 с.

39. Козинец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А. с соавт. Клетки крови -современные технологии их анализа Текст. / М.: Триада-фарм, 2002. 535 с.

40. Кокряков В.Н., Ковальчук JLB., Алешина Г.М., Шамова О.В. Катионные противомикробные пептиды как молекулярные факторы иммунитета: мультифункциональность Текст. // ЖМЭИ. 2006. - №2. - С.98-105.

41. Коннов Н.П., Анисимов П.И., Синичкина А.А. Субмикроскопическая структура клеточной стенки возбудителя чумы Текст. // Пробл. особо опасных инфекций. 1975. - Вып. 1(41). - С.78-82.

42. Коробкова Е.И. Кожная аллергическая реакция как показатель иммунитета при чуме Текст. // ЖМЭИ. 1955. - №4. - С.40-47.

43. Коробкова Е.И. О факторах патогенности чумного микроба Текст. // Микробиол. и иммунол. особо опасных инф. Саратов, 1964. - С.330-344.

44. Кравцов A.JL Микрофлуориметрическое исследование в потоке гетерогенных популяций бактерий Yersinia pestis и клеток иммунной системы инфицированных чумой лабораторных животных Текст. / Автореф. дисс. . док. биол. наук. Саратов, 1997. - 58 с.

45. Кравцов А.Л., Костылева Н.И. Результаты цитометрии ДНК бактерий Yersinia pestis в процессе роста на среде, не содержащей и содержащей стрептомицин Текст. // Пробл. особо опасных инфекций. 1994. - Вып.5(75). -С.97-106.

46. Кравцов А. Л., Пилипенко Т. Ю., Коровкин С. А., Наумов А. В. Способ оценки фагоцитоза: А. с. 1522923 СССР, МКИ G 01 № 33/53. № 4014143/14; Заявл. 19. 11. 1985; Опубл. 28. 02. 94., Бюл. № 4 Текст. // Изобретения. 1994. - №4. - С. 187.

47. Кутырев В.В., Куличенко А.Н. Перспективные направления медицинской микробиологии Текст. // Мат. конф. «Медицинская микробиология XXI век». -Саратов: ОАО «Приволжское книжное изд-во», 2004. - С.8-9.

48. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник Текст. / Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. с соавт.; Под ред. В.В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987.

49. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз) Текст. / М: Медицина, 2001. 192с.

50. Мазуров Д.В., Дамбаева С.В., Пинегин Б.В. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитами периферической крови с помощью проточной цитометрии Текст. // Иммунология. 2000. - №2. - С.57-59.

51. Маянский Н.А., Заславская М.И., Маянский А.Н. Апоптоз экссудативных нейтрофилов человека Текст. // Иммунология. 2000. - №2. - С.11-13.

52. Маянский А.Н., Маянский Н.А., Заславская М.И. с соавт. Апоптоз нейтрофилов Текст. // Иммунология. 1999. - №6. - С. 11-20.

53. Медицинские лабораторные технологии: справочник. Т.1. Текст. / Под ред. А.И. Карпищева. СПб.: Интермедика, 2002. - 408 с.

54. Микеров А.Н. Секретируемые белки (Yop), кодируемые плазмидой кальцийзависимости возбудителя чумы: выделение и изучение иммунобиологических свойств Текст. / Автореф. дисс. . канд. биол. наук. -Саратов. 1999. - 22 с.

55. Микеров А.Н., Емельянова Н.В., Назарова Л.С. с соавт. Действие на мышей препаратов белков Yop, кодируемых плазмидой кальцийзависимости Yersinia pestis Текст. // ЖМЭИ. 2000. - №6. - С.70-72.

56. Монцевичюте Эрингене Е.В. Упрощенные математико-статистические методы в медицинской исследовательской работе Текст. // Патол. физиол. и эксперимен. терапия. - 1964. - №4. - С.71-78.

57. Новиков В.В., Барышников А.Ю., Караулов А.В. Растворимые формы мембранных антигенов клеток иммунной системы Текст. // Иммунология. 2007. -№4. - С.249 - 253.

58. Олиферук Н.С., Пинегин Б.В. Определение фагоцитарного числа лейкоцитов периферической крови по отношению к Staphylococcus aureus с помощью проточной цитометрии Текст. // Иммунология. 2007. - №4. - С.236-240.

59. Онищенко Г.Г., Дроздов И.Г. Актуальные аспекты проблемы противодействия биологической опасности Текст. // Вестник Рос. акад. наук. -2004. №5. -С. 14-20.

60. Павлова Л.П. Внутрикожная аллергическая реакция на пестин как показатель иммунитета к чуме Текст. / Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Саратов. - 1964. -16 с.

61. Плехова Н.Г. Бактерицидная активность фагоцитов Текст. // ЖМЭИ. 2006.- №6. С.89-96.

62. Покровская М.П., Каганова Л.С. Цитологический метод изучения механизмов иммунитета Текст. / М.: Медицина, 1947. 92 с.

63. Понякина И.Д., Лебедев К.А. Аутоинтоксикация важный фактор подавления работы иммунной системы и ее выявление на основании оценки апоптоза нейтрофилов Текст. // Медицинская иммунология. - 2002. - Т.4, №2. - С. 159-160.

64. Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. РД 42-28 -10-90 Текст. // М., 1989. 49.

65. Прозоров A.A. Строение генома бактерий: единство или многообразие? Текст. // Генетика. 1995. - Т.31, №6. - С.741-752.

66. Пичугина Л.В., Пинегин Б.В. Внутриклеточные цитокины: проблемы детекции и клиническое значение Текст. // Иммунология. 2008. - Т.29, №1. - С. 55-63.

67. Сагимбеков У.А., Пошевина Г.О., Алимходжаев A.A. Иммуногенные свойства некоторых атипичных штаммов чумного микроба из Муюнкумов Текст. // Иммунология и специф. профилактика особо опасных инфекций. Саратов, 1986.- С.23-25.

68. Самойлова Л.В. Динамика развития иммунитета к чуме после прививки живой вакциной и особенности иммуногенеза при этой вакцинации Текст. / Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Саратов. - 1963. - 16 с.

69. Самойлова JI.B., Кремлев Г.И. Факторы противочумного иммунитета Текст. // Матер. 15 Всесоюзн. съезда эпидемиол., микробиол. и инф. М., 1970. - С.209-210.

70. Самойлова Л.В., Плотникова В.И., Овсянников В.И. с соавт. Использование диффузионных камер для ускоренной лабораторной диагностики чумы Текст. // Лаб. диагн. и генетика вирул. возбуд. особо опасных инф. Саратов, 1990. - С.29-32.

71. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп патогенности (опасности)» СП 1.3.1285-03 Текст. // Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. 2003. Вып. 3 (13). - №9. - С. 61144.

72. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III-IY групп патогенности и гельминтами» СП 1.2.731-99 Текст. / Изд. официальное. М.: Минздрав России, 1999. - 107 с.

73. Санитарные правила «Государственные испытания и регистрация новых медицинских препаратов» СП 3.3.2.561-96 Текст. //М., 1998. 127с.

74. Сидоркина А.Н., Сидоркин В.Г., Преснякова М.В. Биохимические основы системы гемостаза и диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови. -3-е изд., перераб. и доп. Текст. / Н.Новгород: ННИИТО, 2005. 112 с.

75. Сыновец A.C., Левицкий А.П. Ингибиторы протеолитических ферментов в медицине Текст. / Киев: Здоровье, 1985. 110 с.

76. Тараненко Т.М. Углеродосодержащие антигены чумного и псевдотуберкулезного микробов Текст. / Автореф. дис. . д. б. н. Саратов. -1988.-41 с.

77. Титенко М.М., Проценко O.A., Фурсов В.В. с соавт. Информативность люминесцентно-серологического метода диагностики возбудителя чумы Текст. // Генетика и микробиол. природнолчаг. инф. Саратов, 1984. - С.27-32.

78. Туманский В.М. Микробиология чумы Текст. /М: Медгиз, 1948. 159с.

79. Тынянова В.И., Демидова Г.В., Зюзина В.П. с соавт. Что такое токсин чумного микроба? Текст. // Занимательные очерки о деятельности и деятелях противочумной системы России и Советского Союза. М.: Информатика, 1998.-Вып.8. - С.179-206.

80. Тынянова В.И., Зюзина В.П., Демидова Г.В. с соавт. Токсичность препаратов липополисахаридов из культуры Yersinapestis ЕV 76, выращенной при 28 ° и 37 °С Текст. // Биотехнология. 2003. - №6. - С. 10-16.

81. Хамидуллина К.Ф., Самуйлова Т.Л., Климова С.В., Пинегин В.В. Новый подход к оценке фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов Текст. // Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармокологии. 1998. - С.447.

82. Хайдуков С.В. Проточная цитофлуориметрия как современное средство диагностики Текст. // Лаборатория. 1998. - №10. - С.7-10.

83. Федорова В. А., Голова А. Б. Внеклеточная резистентность возбудителя чумы к фагоцитозу Текст. // Вестник РАМН. 2005. - №10. - С. 19-25.

84. Филатов А.В., Храмцов А.В., Сенченков Е.П., Земсков В.М. Кинетика закисления в фагосомах макрофагов по данным проточной цитофлуориметрии Текст. // Цитология. 1983. - Т.25, № 6. - С.707-710.

85. Фрадкин В.А. Диагностика аллергии реакциями нейтрофилов крови Текст. / М.: Медицина, 1985. 176 с.

86. Aasen A., Ohlson К. Release of granulocyte elastase in lethal canine endotoxin shock Text. // Hoppe-Seyler s Z. Physiol. Chem. 1978. - V.359. - P.683-690.

87. Abrams W.R., Diamond L. W., Kane A. B. A flow cytometric assay of neutrophil degranulation Text. //J. Histochem. Cytochem. 1983. - V.31, №6. - P. 734-744.

88. Aepfelbacher M., Zumbihl R., Ruckdeschel K. et al. The tranquilizing injection of Yersinia proteins: a pathogen's strategy to resist host defense Text. // Biol. Chem. -1999. V.380 (7-8). - P.795- 802.

89. Allman R., Manchee R. and Lloyd D. Flow cytometric analysis of heterogeneous bacterial populations Text. // Flow Cytometry in Microbiology. Eds by D. Lloyd, Springer Verlag, 1993. - Chapter 3. - P.27-47.

90. Alonso A., Bottini N., Bruckner S. et al. Lck dephosphorylation at Tyr-394 and inhibition T cell antigen receptor signaling by Yersinia phosphatase Yop H Text. // J. Biol. Chem. 2004. - V.279. - P.4922-4928.

91. Ashe B. M., Zimmerman M. Comparison of the neutral proteinases from polymorphonuclear leukocytes of several experimental animal species Text. // Biochem. Inf. 1982. - V.5. №4. - P.487- 494.

92. Baisch H., Gohde W., Linden W.A. Analysis of PCP-data to determine the fraction of cells in the various phases of cell cycle Text. // Rad. Environm. Biophys. -1975.- V.l.- P.263-268.

93. Baker E., Sommer H., Foster L. et al. Studies on immunization against plague. 1. The isolation and characterization of the soluble antigen of the Past, pestis Text. // J. Immnol. 1952. - V.68, №2. - P. 131-145.

94. Banfi E., Cinco M., Perticarari S., Presani G. Rapid flow cytometric studies of Borrelia burgdorferi phagocytosis by human polymorphonuclear leukocytes Text. // J.Appl. Bacteriol. 1989. - V.67. - P.37-45.

95. Barlogie B., Spidzer G., Hart G. S. et al. DNA histogram analysis of human hemopoetic cells Text. // Blood. 1976. - V.48, №2. - P.245-257.

96. Bashaw J., Norris S., Weeks S. et al. Development of in vitro correlate assay of immunity to infection with Yersinia pestis Text. // Clinical and Vaccine Immunology. -2007. V.14, №5. - P.605-616.

97. Bassoe C.-F., Bjerknes R. The effect of serum opsonins on the phagocytosis of Staphylococcus aureus and zymosan particles, measured by flow cytometry Text. // Acta path. Microbial. Immunol, scand. -1984. Sect.C.,V.92.- P.51-58.

98. Bassoe C.-F., Solberg C.O. Phagocytosis of Staphylococcus aureus by human leukocytes: quantitation by flow cytometric and microbiological methods Text. // Ibid. -P.43-50.

99. Belaaouaj A., Kim K.S., Shapiro S.D. Degradation of outer membrane protein A in Escherichia coli killing by neutrophil elastase Text. // Science. 2000. - V.289. - P. 1185-1188.

100. Bieth J.G. Elastases: catalytic and biological properties Text. // Regulation of Matrix Accumulation / Eds by R. P. Meham. New York, 1986. - P.217-320.

101. Bliska J.B., Black D.S. Inhibition of the Fc receptor-mediated oxidative burst in macrophages by the Yersinia pseudotuberculosis tyrosine phosphatase Text. // Infect. Immun. 1995. - V.63. - P.681-685.

102. Boland A., Cornelis G.R. Role of YopP in suppression of tumor necrosis factor alpha release by macrophages during Yersinia infection Text. // Infect. Immun. 1998.-V.66.-P.1878-1884.

103. Bosio C.M., Goodyear A.W and Dow S.W. Early interaction of Yersinia pestis with APCs in the lung Text. // J. Immunology. 2005. - V. 175. - P.6750-6756.

104. Branger J., van Blin K.B., Weijer S. et al. Anti-inflammatoiy effect of p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor during human endotoxemia Text. // J. Immunol. 2002. - V.168, №8. - P.4070-4077.

105. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C. et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria Text. // Science. 2004. - V.303, №5663. - P. 1532-1535.

106. Brubaker R.R. Factors promoting acute and chronic diseases caused by yersiniae Text. // Clin. Microbiol. Rev. 1991. - V.4. - P.309-324.

107. Brubaker R.R. Interleukin-10 and inhibition of innate immunity to Yersiniae: Roles of Yops and LcrV (V Antigen) Text. // Infect. Immunol. 2003. - V.71 (7). - P. 3673-3681.

108. Bubeck S.S., Cantwell A.M. and Dube P.H. Delayed inflammatory response to primary pneumonic plague occurs in both outbred and inbred mice Text. // Infect. Immunity. 2007. - V.75, №2. - P.697-705.

109. Calhoun L.N., Kwon Y.M. Salmonella based plague vaccines for bioterrorism Text. // J. Microbiol. Immunol. Infect. - 2006. - V.39, №2. - P.92-97.

110. Casey H. Pathways etiology fast-forwarded: the host-bacterial interaction theory and the risk continuum Text. // Contemporary Oral Hygiene. December 2004. - P. 1621.

111. Carulli G. Application of flow cytometry in the study of human neutrophil biology and pathology Text. // Hematopath. Mol. Hematology. 1996. - V.10, №1-2. - P.39-61.

112. Chromy B.A., Perkins J., Heidbrink J.L. et al. Proteomic characterization of host response to Yersinia pestis and near neighbors Text. // Biochem. Biophysic. Res. Communic. 2004. - V.320. - P.474-479.

113. Cole A.M., Shi J., Ceccarelli A. et al. Inhibition of neutrophil elastase prevents cathelicidin activation and impairs clearance of bacteria from wounds Text. // Blood. -2001. V.97, №1. - P.297-304.

114. Cornelis G.R. The Yersinia deadly kiss Text. // J. Bacteriol. 1998. - V.180. -P.5495-5504.

115. Cornelis G.R. The Yersinia YSC Yop "type III" weaponry Text. // Nat. Mol. Cell Biol. Rev. - 2002. - V.3. - P.742-752.

116. Cornelis G.R., Boland A., Boyd A.P. et al. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome Text. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V.62. - P.1315-1352.

117. Cornelius C., Quenee L., Anderson D.,. Schneewind O. Protective immunity against plague Text. // Adv Exp Med Biol. 2007. - V.603. - P.415-424.

118. Cornelis G.R., Wolf-Watz H. The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting eukaryotic cells Text. //Mol. Microbiol. 1997. - V.23. - P.861-867.

119. Cowan C., Philipovsky A.V., Wulff-Strobel C.R. et al. Anti-Lcr antibody inhibits delevery of Yops by Yersinia pestis K/H5 by promoting phagocytosis Text. // Infect.Immun. 2005. - V.73. - P.6127-6137.

120. Crissman H.A., Tobey R.A. Cell cycle analysis in 20 minutes Text. // Science. -1974.-V. 184.-P.1297-1298.

121. Darzynkiewicz Z., Traganos F., Sharpless T., Melamed M.R. Lymphocyte stimulation: a rapid multiparameter analysis Text. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1976. - V.73, №8. - P.2881-2884.

122. DeLeo F.R., Hinnebusch B.J. A plague upon the phagocytes Text. // Nature Medicine. 2005. - V.l 1, №9. - P.927-928.

123. Deleuil F., Mogemark L., Francis M.S. et al. Interaction between the Yersinia protein tyrosine phosphatase YopH and eukaiyotic Cas/Fyb is an important virulence mechanism Text. // Cell. Microbiol. 2003. - V.5, №1. - P.53-64.

124. Döring G. The role of neutrophil elastase in chronic inflammation Text. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1994. - V.150, №6, Pt.2. - P.l 14-117.

125. Dunn J., Spizizen J., Meinke W. Flow microfluorometric analysis of Herpes virus infected BHK-21 and BALB/3T3 cell cultures Text. If J. Histochemistry and Cytochemistry. -1978. V.26, №5. - P.391-400.

126. Du Y.D. Rosqvist R. and Forsberg A. Role of Fraction 1 antigen of Yersinia pestis in inhibition of phagocytosis Text. // Infect. Immun. 2002. - V.70. - P. 1453-1460.

127. Eggers C.T., Murray I.A., Delmar V.A. et al. The periplasmic serine protease inhibitor ecotin protects bacteria against neutrophil elastase Text. // Biochemical J. -2004. V.379. - P.107-118.

128. Ernst J.D. Bacterial inhibition of phagocytosis Text. // Cellular Microbiology. -2000. V.2, №5. - P.379-386.

129. Fields K.A. and Straley S.C. LcrV of Yersinia pestis enters infected eukaryotic cells by a virulence plasmid-independent mechanism Text. // Infect, and Immun. 1999. - V.67, №9. - P.4801-4813.

130. Fowler J.M., Brubaker R.R. Physiological basis of the low calcium response in Yersinia pestis Text. // Infect. Immun. 1994. - V.62. - P.5234-5241.

131. Fuchs T.A., Abed U., Goosmann C., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps Text. // J. Cell Biology. 2007. - V.l76, №2. - P.231-241.

132. Ginsburg I. Tissue injuiy in neutrophilic inflammation Text. // Inflamm. Res. -1998. V.47, №6. - P.237-238.

133. Göhde W. Automation of cytophotometry by use of the impalse-microphotometer Text. // Fluorescence techniques in Cell Biology / Eds A.A. Thaer and M. Sernetz. -Berlin-Heilderberg-New York, 1973. P.79-88.

134. Hakansson S., Bergman T., Vanooteghem J. et al. YopB and YopD constitute a novel class of Yersinia Yop proteins Text. // Infect. Immun. 1993. - V.61. - P.71-80.

135. Hellman J., Loiselle P., Tehan M. et al. Outer membrane protein A, peptidoglican-associated lipoprotein, and murein lipoprotein are released by Escherichia coli bacteria into serum Text. //Infect. Immun. 2000. - V.68. - P.2566-2572.

136. Heushipp G., Spekker K., Brast S. et al. YopM of Yersinia enterocolitica specifically interacts with alpha 1-antitrypsin without affecting the anti-protease activity Text. // Microbiology. -2006. V.152. - P.1327-1335.

137. Holmstrom A., Pettersson J., Rosqvist R. et al. YopK of Yersinia pseudotuberculosis controls translocation of Yop effectors across the eukaryotic cell membrane Text. // Mol. Microbiol. 1997. - V.24. - P.73-91.

138. Holmstrom A., Rosqvist R., Wolf-Watz H., Forsberg A. Virulence plasmid-encoded YopK is essential for Yersinia pseudotuberculosis to cause systemic infection in mice Text. // Infect. Immun. -1995. V.63. - P.2269-2276.

139. Hueck C.J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants Text. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V.62. - P.379-433.

140. Hutter K.J., Eipel H.E. Microbial determinations by flow cytometry Text. // J. Gen. Microbiol. 1979. - V. 113. - P.369-375.

141. Imatura T., Kaneda H,, Nakamara S. New functions of neutrophils in the Arthus reaction: expression of tissue factor, the clotting inhibitor, and fibrinolysis by elastase Text. // Lab. Invest. 2002. - V.82, №10. - P.1287-1295.

142. Kawabata K., Hagio T., Matsuoka S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury Text. //Eur.J. Pharmacol. 2002. - V.451, №1. - P. 1-10.

143. Kell D.B., Ryder H.M., Kaprelyants A.S., Westerhoff H.V. Quntifying heterogeneity: flow cytometry of bacterial cultures Text. // Leeuwenhoek. 1991. -V.60.-P.145-158.

144. Kerschen E.J., Cohen D.A., Kaplan A.M., Straley S.C. The plague virulence protein YopM targets the innate immune response by causing a global depletion of NK cells Text. // Infect. Immun. 2004. - V.72. - P.4589- 4602.

145. Knodler L.A., Celli J., Finlay B.B. Pathogenic trickery: deception of host cell processes Text. //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. - V.2. - P.578 - 588.

146. Kravtsov A.L., Bobyleva E.V., Grebenyukova T.P. et al. Flow microfluorometric analysis of phagocyte degranulation in bacteria infected whole human blood cell cultures Text. // Proc. SPIE. 2002. - Vol.4707. - P.395-402.

147. Kruth H.S. Review flow cytometry: rapid biochemical analysis of single cells Text. // Analytical Biochem. 1982. - V.125. - P.225-242.

148. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the heard of bacteriophage T4 Text. //Nature. 1970. - V.227. - P.680-685.

149. Lathem W.W., Price P.A., Miller W.L., Goldman W.E. A plasminogen -activating protease specifically controls development of primary pneumonic plague // Science. -2007. V.315, №5811. - P.509-513.

150. Lebaron P., Joux F. Flow cytometric analysis of the cellular DNA content of Salmonella typhimiiriwn and Alteromonas haloplanktis during starvation and recovery in seawater Text. //Appl. Environ. Microbiology. 1994. - V.60, №12. - P.4345- 4350.

151. Lee W.L., Downey G.P. Leukocyte elastase Text. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001. - V.164, №5. - P.896-904.

152. Lengas A., Poletti V., Pasifico L. et al. Acute lung inflammation: neutrophil elastese versus neutrophils in bronchoalveolar lavage. Neutrophil elastase reflects better inflammatory intensity Text. // Intensive Care Med. 1994. - V.20, №5. - P.354-359.

153. Leung K.Y., Reisner B.S., Straley S.C. YopM inhibits platelet aggregation and is necessary for virulence of Yersinia pestis in mice Text. // Infect. Immun. 1990. - V.58. - P.3262-3271.

154. Lian C.J., Flwang W.S., Pai C.H. Plasmid-mediated resistance to phagocytosis by Yersinia enterocolitica Text. // Infect. Immun. -1987. V.55. - P.l 176-1183.

155. Liou T.G., Campball E.J. Nonisotropic enzyme-inhibitor interactions: a novel nonoxidative mechanism for quantum proteolysis by human neutrophils Text. // Biochemistry. 1995. - V.34, №49. - P. 16171-16177.

156. Lopez-Boado Y.S., Espinola M., Bahr S., Belaaouaj A. Neutrophil serine proteinases cleave bacterial flagellin, abrogatiting its host response -inducing activity Text. // J. Immunol. 2004. - V.172, №1. - P. 509-515.

157. Lukaszewski R.A., Kenny D.J., Taylor R. et al. Pathogenesis of Yersinia pestis infection in BALB/c mice: effects on host macrophages and neutrophils Text. // Infect. Immun. 2005. - V.73. - P.7142-7150.

158. Maclntyre S., Knight S.D., Fooks L. Structure, assembly and applications of the polymeric Fl antigen of Yersinia pestis Text. // Yersinia Molecular and Cellular Biology/Eds. by Carniel E. and Hinnebusch B.J., 2004.- PII, chapter 18.- P.363-407.

159. Malin-Berdel J., Valet G. Flow cytometric determination of esterase and phosphotase activities and kinetics in hematopoetic cells with fluorogenic substrates Text. // Cytometry. 1980. - V.l, №3. - P.222-228.

160. Marketon M.M., DePaolo R.W., DeBord K.L. et al. Plague bacteria target immune cells during infection Text. // Science. 2005. - V.309. - P. 1739-1741.

161. Martin E., Bhakdi S. Flow cytometric assay for quantifying opsonophagocytosis and killing of Staphylococcus aureus by peripheral blood leukocytes Text. // J. Clin. Microbiol. 1992. - V.30. - P.2246-2255.

162. Matson J.S., Nilles M.L. LcrG-LcrV interaction is required for control of Yops secretion in Yersinia pestis Text. // J. Bacteriol. 2001. - V.183. - P.5082-5091.

163. Mazzini G., Giordano P., Riccardi A., Montecucco C. M. A flow cytometric study of the proidium iodide staining kinetics of human leukocytes and its relationship with chromatin structure Text. // Cytometry. 1983. - V.3, №6. - P.443- 448.

164. McCutcheon M.J., Miller R.G. Fluorescence intensity resolution in flow systems Text. // J.Histochem. Cytochem. 1979. - V.27, №1. - P.246-249.

165. McDonald C., Vacratsis P.O., Bliska J.B. and Dixon J.E. The Yersinia'virulence factor YopM forms a novel protein complex with two cellular kinases Text. // J. Biol. Chem. 2003. - V.278. - P.18514-18523.

166. Melamed M.R., Adams L.R., Traganos F. and Kamenetsky L.A. Blood granulocyte staining with acridine orange changes with infection Text. // J. Histochem. Cytochem. 1974. - V.22, №7. - P.526-530.

167. Melamed M.R., Adams L.R., Traganos F. and Kamenetsky L.A. Initial observations on instrumental differential blood leukocyte counts during chemotherapy of patients with leukemia Text. // Eur. J. Cancer. 1973. - V.9. - P. 181-184.

168. Melamed M.R., Adams L.R., Zimring A. et al. Preliminary evaluation of acridine orange as a vital stain for automated differential leukocyte counts Text. // Am. J. Clin. Pathol. 1972. - V.57. - P.95-102.

169. Miliotis M.D. Acridine orange stain for determining intracellular enteropathogens in HeLa cells Text. // J. Clin. Microbiol. -1991. V.29. - P.830-831.

170. Moir E., Robbie L.A., Bennet B., Booth N.A. Polymorphonuclear leukocytes have two opposing roles in fibrinolysis Text. // Tromb. Haemost. 2002. - V.87, №6. -P.1006-1010.

171. Monack D.M., Mecsas J., Ghori N., Falkow S. Yersinia signals macrophages to undergo apoptosis and YopJ is necessary for this cell death // Proc. Nath.Acad. Sei. USA. 1997. - V.94. - P.10385-10390,

172. Montminy S.W., Khan N., McGrath S. et al. Virulence factors of Yersinia pestis are overcome by a strong lipopolycaccharide response Text. // Nature immunology. -2006. V.7. - P.1066-1073.

173. Morcos M., Zimmerman F., Radsak M. et al. Autoantibodies to polymorphonuclear neutrophil elastase do not inhibit but enhance elastase activity Text. // Am. J. Kidney Dis. 1998. - №6. - P.978-985.

174. Mota L.J. and Cornelis G.R. The bacterial injection kit: type III secretion systems Text. // Ann. Med. 2005. - V.37. - P.234-249.

175. Muirhead K.A., Horan P.K., Poste G. Flow cytometry: present and future Text. // Biotechnology. 1985. - V.3, №4. - P.337-356.

176. Nadel J.A., Takeyama K., Agusti C. Role of neutrophil elastase in hypersecretion in asthma Text. // Eur. Respir. J. 1999. - V.13(l). - P.190-196.

177. Nakagami Y., Ito M., Hara T., Inoue T. Loss of TRF2 by radiation-induced apoptosis in HL60 cells Text. // Radiat. Med. 2002. - V.20, №3. - P.121-129.

178. Nakagava T., Stadler B.M., Heiner D.C. et al. Flow cytometric analysis of human basophil degranulation. Degranulation induced by anti-IgE, antilg4 and calcium ionophore A23187 Text. // Clin. Allergy. 1981. - V.l 1. - P.21-26.

179. Nakajima R. and Brubeker R. Association between virulence of Yersinia pestis and suppression of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha Text. // Infect.Immun. 1993. - V.61. - P.23-31.

180. Naucler C., Grinstein S., Sundler R., Tapper H. Signaling to localized degranulation in neutrophils adherent to immune complexes Text. // J. Leukoc. Biol. -2002. V.71, №4. - P.701-710.

181. Navarre W.W. and Zychlinsky A. Pathogen-induced apoptosis of macrophages: a common end for different pathogenic strategies Text. // Cell. Microbiol. 2000. - V.2 (4). - P.265-273.

182. Neish A.S. Bacterial inhibition of eukaryotic pro-inflammatory pathways Text. // Immunol. Res. 2004. - V.29, №1-3. - P.175-186.

183. Nilles M., Fields K.A., Straley S.C. The V antigen of Yersinia pestis regulates Yop vectorial targeting as well as Yop secretion through effects on YopB and LcrG Text. // J. Bacteriology. 1998. - V.l80. - P.3410-3420.

184. Ohlsson K., Olsson I. The extracellular release of granulocyte collagenase and elastase during phagocytosis and inflommatory processes Text. // Scand. J. Haematology. 1977. - V.l9, №2. - P. 145-152.

185. Ordonez J.V., Wehman N. M. Rapid flow cytometric antibiotic susceptibility assay for Staphylococcus aureus Text. // Cytometry. 1993. - V.14. - P.811-818.

186. Overheim K.A., Depaolo RAV., Debord K.L. et al. LcrV plague vaccine with altered immunomodulatory properties Text. / Infect Immun. 2005. - V.73(8). - P. 51525159.

187. Owen C.A., Campbell M.A., Boukedes S. et al. Cytokines regulate membrane bound elastase on neutrophils: a novel mechanism of effector activity Text. // Am. J. Physiol. 1997. - V.272 (3 Pt.l). - P.L385-393.

188. Panyutich A., Shi J., Boutz P. L. Porcine polymorhonuclear leukocytes generate extracellular microbicidal activity by elastase-mediated activation of secreted proprotegrins Text. // Infect. Immun. 1997. - V.65, №3. - P.978-985.

189. Parck H., Teja K., O' Shea J. and Seigel M. The Yersinia effector protein YpkA induces apoptosis independently of actin depolymerization Text. // J. Immunology. -2007. V. 178. - P.6426-6434.

190. Parrino J., Hotchkiss R.S., Bray M. Preventation of immune cell apoptosis as potential therapeutic strategy for severe infections Text. // Emerging Infec. Diseases. -2007. V.13, №2. - P.191-198.

191. Perry R.D. and Fetherston J.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague Text. // Clinical. Microbiol. Reviews. - 1997. - V.10, №1. - P.35-66.

192. Peters D.C. A comparision of mercury acr lamp and laser illumination for flow cytometers Text. //J. Histichem. Cytochem. 1979. - V.27, №1. - P.241-245.

193. Phillips A.P., Martin K.L. Direct and indirect immunofluorescence analysis of bacterial populations by flow cytometry Text. // J.Immunol.Meth. 1987. - V.101, №2. -P.219-228.

194. Qureshi S.T., Skamene E., Malo D. Comparative genomics and host resistance against infectious diseases Text. //Emer. Infect. Dis. 1999. - V.l, №5. - P.36-47.

195. Reeves E.P., Lu H., Jacobs H.L. et al. Killing activity of neutrophils is mediated though activation of proteases by K+ flux Text. // Nature. 2002. - V.416. - P.291-297.

196. Reisner B.C., Straley S.C. Yersinia pestis YopM: thrombin binding and overexpression Text. // Infect. Immun. 1992. - V.60. - P.5242-5252.

197. Richard J.L., Grimes D.E. Bioterrorism: class A agents and their potential presentations in immunocompromised patients Text. // Clin. J. Oncol. Nurs. 2008. - V. 12(2). - P.295-302.

198. Rietschel E.T., Kirikae T., Schade F. et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function Text. // FASEB J. 1994. - V.8. -P.217-225.

199. Rosen H. Bacterial responses to neutrophil phagocytosis Text. // Curr. Opin Hematol. 2004. - V.ll, №1. - P.l-6.

200. Rosqvist R., Forsberg A., Rimpilainen M. et al. The cytotoxic protein YopE of Yersinia obstructs the primary host defence Text. // Mol. Microbiol. 1990. - V4. -P.657-668.

201. Rosqvist R. Forsberg A., Wolf-Watz H. Intracellular targeting of the Yersinia YopE cytotoxin in mammalian cells induces actin microfilament disruption Text. // Infect. Immun. 1991. - V.59. - P.4562-4569.

202. Ruckdeschel K. Immunomodulation of macrophages by pathogenic Yersinia species Text. //Arch. Immunol. Ther. Exp. 2002. - V.50. - P.131-137.

203. Ruckdeschel K., Roggenkamp A., Schubert S., Heesemann J. Differential contribution of Yersinia enterocolitica virulence factors to evasion of microbicidal action of neutrophils Text. // Infect. Immun. 1996. - V.64. - P.724-733.

204. Sahar E., Lamed R., Ofec I. Rapid identification of Streptococcus pyogenes by flow cytometry Text. //Eur. J. Clin. Microbiology. 1983. - V.2, №3. - P. 192-195.

205. Sarker M.R., Soiy M.-P., Boyd A.P. et al. LcrG is required for efficient translocation of Yersinia Yop effector proteins into eukaryotic cells Text. // Infect. Immun. 1998. - V.66. - P.2976-2979.

206. Sebbane F., Gardner D., Long D. et al. Kinetics of disease progression and host response in a rat model of bubonic plague Text. // Am. J. Pathol. 2005. - V.166. -P.1427-1439.

207. Shi J., Gantz T. The role of protegrins and other elastase-activated polypeptides in the bactericidal properties of porcine inflammatory fluids Text. // Infect. Immun. -1998. V.66, №8. - P.3611-3617.

208. Simonet M., Richard S., Berche P. Electron microscopic evidence for in vivo extracellular localization of Yersinia pseudotuberculosis harboring the pYV plasmid Text. // Infect. Immun. 1990. - V.58. - P.841-845.

209. Simpson A.J., Wallase W.A., Marsden M.E. et al. Adenoviral augmentation of elafin protects the lung against acute injury mediated by neutriphils and bacterial infection Text. // J. Immunology. 2001. - V.167, №3. - P. 1778-1786.

210. Skrzypek E., Cowan C. and Straley S.C. Targeting of the Yersinia pestis YopM protein into HeLa cells and intracellular trafficking to the nucleus Text. // Mol. Microbiol. 1998. - V.3. - P.1051-1065.

211. Skurnick M. My life with Yersinia Text. // The genus Yersinia: from genomics to function / Edited by R.D. Perry and J.D. Fetherston, Lexington, KY, USA, 2007. P.44-73.

212. Smets L.A. Impulsecytophotometric determination of acridine orange binding by human leukocytes Text. // Impulsecytophotometrie / Eds.M. Andreeeff.- New York, Springer-Verlag, 1975. P.38-40.

213. Smets L.A., Milder E., de Waal, F.C. et al. Early responses to chemotherapy detected by pulse cytophotometiy Text. // Br.J.Cancer . 1976. - V.34. - P.153-161.

214. Smiley S.T. Current challenges in the development of vaccines for pneumonic plague Text. // Expert Rev Vaccines. 2008. - V.7(2). - P.209-221.

215. Steen H.B., Boye E. Escherichia coli growth studied by dualparameter flow cytophotometiy Text. //J. Bacteriology. 1981. - V.145, №2. - P.1091-1094.

216. Steen H.B., Boye E, Starsted K. et al. Applications of flow cytometry on bacteria: cell cycle kinetics, drug effects and antibody binding Text. // Cytometry. 1982. - V.2., №4.- P.249 -256.

217. Stohr M., Vogt-Schaden M., Knobloch M. Evaluation of eight fluorochrome combinations for simultaneous DNA-protein flow analysis Text. // Stain Technol.- 1978. V.53. - P.205-215.

218. Straley S.C, Perry R.D. Environmental modulation of gene expression and pathogenesis in Yersinia Text. // Trends Microbiol. 1995. - V.3. - P.310-317.

219. Strohmeier G.R., Brunkhorst B.A., Seetoo K. F. et al. Neutrophil functional responses depend on immune complex valency Text. // J. Leukocyte Biol. 1995. -V.58, №>4. - P. 403-414.

220. Telford W., King L., Fracker P. Comparative evaluation of several DNA binding dyes in the detection of apoptosis-associated chromatin degradation by flow cytometiy Text. // Cytometiy. 1992. - V.13. - P.137-143.

221. Telford W., King L., Fracker P. Rapid quantitation of apoptosis in pure and heterogeneous cell populations using flow cytometry Text. // J. Immunol. Meth. 1994. -V.172.-P.1-16.

222. Titball R.W., Hill J., Lawton D.G., Brown K.A. Yersinia pestis and plague Text. // Biochem. Soc. Trans. 2003. - V.31, №1. - P. 104-107.

223. Tobey R.A., Crissman H.A. Unique technique for cell cycle analysis utilizing mithramycin and flow microfluorometry Text. // Exp.Cell Res. 1975. - V.93. - P.223-239.

224. Torriglia A., Perani P., Brossas J.Y. et al. L-DNAse II, a molecule that links proteases and endonucleases in apoptosis, derives from ubiquitous serpin leukocyte elastase inhibitor Text. // Mol.Cell Biol. 1998. - V.18, №8. -P.4947-4953.

225. Torriglia A., Perani P., Brossas J.Y. et al. A caspase-independent cell clearance program. The LEI / L-DNAse II pathway Text. // Ann. NY Acad.Sci. 2000. - V.926. -P. 192-203.

226. Tyndall R.L., Hand R.E., Mann R.G. et al. Application of flow cytometry to detection and characterization of Legionella spp, Text. // Appl. and Environm. Microbiol. 1985. - V.49, №4. - P.852-857.

227. Urban C.F., Louvido S. and Zychlinsky A. How do microbes evade neutrophil killing? Text. // Cell. Microbiol. 2008. - V.8, №11. - P.1687-1696.

228. Vassalli J.D., Piperno A.G., Griscelli C., Reich E. Specific protease deficiency in polymorphonuclear leukocytes of Chediak-Higashi syndrome and beige mice Text. // J. Exp. Med. 1978. - V.147. - P. 1285-1290.

229. Viboud G.I. and Bliska J.B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis Text. // Annu. Rev. Microbiol.- 2005. V.59. -P.69-89. •

230. Vissers L.G., Hiemstra P., van den Barlselaar M.T. et al'. Role of YpkA in resistance to killing of Yersinia by antimicrobial polypiptides of human 'granulocytes

231. Text. //Infect. Immun. 1996. - V.64. - P.1653-1658.t

232. Voyich J.M., DeLeo F.R. Host pathogen interactions: leukocyte phagocytosis and associated sequelae Text. //Methods Cell Sei. - 2002. - V.24, №1-3. - P.79-90.

233. Weinrauch Y., Drujan D., Shapiro SI D. et al. Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria Text. //Nature. 2002. --V.417. - P.91-94.

234. Weir E. Plague: a continuing threat Text. // Can. Med. Assoc. J. 2005: - V.172, №12. - P.1555.

235. Welkos S.L., Eley S.M.', Griffin K.F. et al. V-antigen of Yersinia pestis inhibits neutrophil Chemotaxis Text. // Microb. Pathog. 1998. - V.24. - P. 185-196.

236. Wesche D.E., Lomas-Neiva J.L., Perl M. et al. Leukocyte apoptosis and its significance in sepsis and shock Text.,// J. Leukocyte Biology. 2005. - V.78. - P.325-337.

237. Yao T., Mecsas J., Healy J.I. et al. Suppression of T and B lymphocyte activationby a Yersinia pseudotuberculosis virulence factor Yop H'Text. // J.! Exp. Medicine. i1999. V.190, №9.* - P.1343-1350.

238. Zanetti M., Litteri L., Gennaro R. et al. Bactenecins, defence polypeptides of bovine neutrophils, are generated from precursor molecules stored in the large grsnules Text.//J. Cell Biol. 1990.- V.lll.-P. 1363-1371.

239. Zauberman A., Cohen S., Mamroud E. et al. Interaction of Yersinia pestis with macrophages: limitations in YopJ-depended apoptosis Text. // Infect. Immun. 2006. -V.74, №6. - P13239-3250.

240. Zeiher B.G., Matsuoka S., Kawabata K., Repine J.E. Neutrophil elastase and acute lung injury: protects for sivelestat and other neutrophil elastase inhibitors as therapeutics Text. // Crit. Care Med. 2002. - V.30 (5Suppl.). - P. S281-287.

241. Zhang C.G., Gonzales A.D., Choi M. et al. Subcellular proteonic analysis of host-pathogen intaracrions using human monocyte exposed to Yersinia pestis and Y. pseudotuberculosis Text. // Proteomics. 2005. - V.5. - P.1877-1888.

242. Zhang Y. and Bliska J.B. Role Eds. by Carniel E. and Hinnebusch B.J., of macrophage apoptosis in the pathogenesis of Yersinia Text. // Curr. Top. Macrobiol. Immunol. 2005. - V.289. - P. 151-173.

243. Zhang Y., Ting A.T., Marcu K.B. and Bliska J.B. Inhibition of MAPK and NF-kappaB pathways is necessary for rapid apoptosis in macrophages infected with Yersinia Text. // J. Immunol. 2005. - V.174. - P.7939-7949.

244. Zhou D., Han Y., Yang R. Molecular and physiological insights into plague transmission, virulence and etiology Text. //Microbes. Infect. 2006. - V.8, №1. - P. 273-284.

245. Zhou H., Monack D.M., Kayagaki N. et al. Yersinia virulence factor YopJ acts as a deubiquitinase to inhibit NF-kB activation Text. // J. Exp. Med. 2005. - V.202. -P.1327-1332.

246. Zimmerman M., Ashe B.M., Yurewicz E., Patel G. Sensitive assay for tripsin, elastase and chymotrypsin using new fluorogenic substrates Text. // Anal. Biochem. -1977.-V.78,№l.-P.47-51.U

Информация о работе

Шмелькова, Татьяна Петровна
кандидата биологических наук
Саратов, 2008
ВАК 03.00.07

Диссертация

Взаимодействие чумного микроба и его антигенов с клетками крови человека in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы