Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из генетически различающихся штаммов-продуцентов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из генетически различающихся штаммов-продуцентов"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОМУ НАДЗОРУ РСФСР РОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ „МИКРОБ»

На правах рукописи КОССЕ Людмила Владимировна

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ КАПСУЛЬНОГО АНТИГЕНА ЧУМНОГО МИКРОБА, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИ РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ

03 00 07 г- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соисгашие ученой степени кандидата биологических наук

Саратов 1992

Работа выполнена в Ростовском научно-исследовательском противочумном институте.

Научный руководитель зав. лабораторией генетики микробиологии чумы , канд. мед. наук Лебедева С. А.

Официальные оппоненты:

1. Член-корреспондент РАЕН , д. м. н., профессор Щуб Г. М.

2. Д. м. н., старший научный сотрудник Вейнблат Е И.

Ведущая организация:

Ставропольский научно исследовательский противочумный ин(

на заседании специализированного совета Д 074.32.01 по защи-диссертаций на соискание ученой степени доктора наук П] Российском научно-исследовательском противочумном институ "Микроб'Ч410701,г. Саратов, Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке и»

тута

Защита состоится г?#^УЗ^Г* ¿^ТУ

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совет; доктор биологических наук

Корнеев Г. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы:

Опасность чумной инфекции в' современном мире определяется наличием обширных природных очагов чумы в различных регионах мира , в том числе и на. территории России. Необходимость создания новых' и усовершенствование существующих диагностических и вакцинных препаратов объясняет интерес к изучению видоспецифических антигенов чумного микроба с протективнымн свойствами .

Калсульный антиген чумного «шкроба является главным иммуногеном при чуме (Butler Т, 1983, Chen Т.Н. et al,1972).Однако практически не ивучена возможность использования в качестве молекулярных вакцин препаратов капсульного антигена из нетипичных штаммов- продуцентов, которые получении генноинженерными.методами. • Такой подход к изучению капсульного антигена возбудителя чумы является перспективным, поскольку расширяет набор модельных штаммов с fra-генами для изучения особенностей синтеза и секреции Fi и определения участия генетических элементов чумного микроба в формировании различных структурных и функциональных свойств капсульного антигена.

Считается, что синтез капсульного антигена детерминируется 65 МД плазмидой pYT Y.pestis (Процента O.A. .и др., 1981; Заренков М. И. и др. ,1984). Описаны штаммы чумного микроба, дефицитные по этой плазмиде. Отсутствие капсульного антигена у pYT- штаммов определялось в серологических реакциях с -антителами к 'Fl. В' литературе отсутствуют данные о попытках выделения из pYT-штаммов препаратов,методически аналогично Fl, и изучении их свойств.

По общепринятому мнению, калсульный антиген чумного микроба является строго видоспецифичным. Тем не менее, в литературе имеются данные - об обнаружении Fl у некоторых других микроорганизмов ( Апарин Т. П. и др. ,1989) и антител к нему в сыворотках животных, не контактировавших 'с чумой ( Басова RH и др. ,1982). В одних случаях это связывают с неточной идентификацией чумного микроба, в других- с . возможностью гипердиагностики чумы. Однако до сих пор причины такой возможности не объяснены. 3

Целью работы является определение перспектив использования генно-инженерных штаммов с fra- генами плазмиды pYT Y. pest is, препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных ие них, и монорецепторных сывороток к F1 в практике и научных исследованиях.

Ив поставленной цели вытекают следующие задачи:-

1. Определить уровень продукции капсульного антигена чумного микроба у экспериментальных штаммов-продуцентов с fra-генами и изучить его фиэико-1 химические,иммунохимические и иммуногенные свойства. * '

2. Провести сравнительный анализ свойств капсульного антигена чумного микроба, полученного из Y. pestis EV 76, и препаратов,выделенных ив бескапсульных штаммов чумы методами^аналогичными получению F1. •

3. Выяснить вопросы специфичности детерминант капсульного антигена Y. pestis, используя моцоклон&льные антитела и поливалентный сыворотки к F1 и гетерологичные. сыворотки к антигенным комплексам, полученным аналогично F1 из энтеробактерий.

4. Изучить влияние методов инактивации бактериальной массы.и способов выделения F1 на свойства этого антигена.

Научная новизна." •

Впервые нами были получены - штаммы К. pneumoniae 1017 KL- и С. freundii 19/3808 КМ-1 -продуценты капсульного антигена чумного микроба. Пре'параты fl из трансконъюгантов., характеризовались повышенной серологической активностью и протективностью.

Кз штаммов У. pest js," не содержащих pYT/Fra+ плазмиды, и природных штаммов .некоторых видов энтеробактерий выделены препараты с, серологической специфичностью F1 и сходными с капсульным антигеном Y. pestis < протективными свойствами. Продемонстрировано участие хромосомы чумного микроба в синтеве вещества а диагностической детерминантой капсульного антигена и роль плазмиды pYT в продукции F1. '

Показано наличие в препарате капсульного антигена чумного микроба , по крайней мере, двух эйитопов. Один из них являлся конфэрмациеано-заьисимым и определялся лишь y.Fl из бактерий чу-

мы с полным набором плаэмид. Вторая антигенная детерминанта сохранялась в условиях диссоциации препарата F1 и не являлась специфической для вида Y. pest is. ' '

Моноклональные антитела к F1, как экспериментальные, так и входящие в состав коммерческих диагностикумов, реагируют с общей для некоторых представителей, сем.Enterobacteriaceae антигенной детерминантов Показано, что их использование имеет ограничения в диагностике чумы. ■'..'■'.

Определено влияние антигенных комплексов из бактерий К. pneumoniae на антителообразование 'к некоторым антигенам чумного микроба. Впервые изучена возможность использования препаратов, выделенных из К. pneumoniae, как потенциальных иммуностимуляторов при чумной инфекции.

Практическая значимость: • Штаммы трансконъюгантоэ • К. pneumoniae- 1017-KL и С. freundii 19/3808 КМ-1 могут служить моделями для изучения синтеза , секреции F1 и источниками получения F1 с • повышенной иммуногенностью в безопасных условиях.' Эти штаммы депонированы в музее живых культур института "Микроб". Подана заявка на патентование штамма С. freundii 19/3808 КМ-1.

Для дальнейших исследований предложены препараты антигенов из природного штамма' К. pneumoniae, так .как показаны их адъювантные свойства в отношении некоторых антигенов чумного микроба и тенденция к увеличению эффективности действия вакцины Y. pest is EV 76. . у .

Оформлено рационализаторское предложение по способу дополнительной очистки препарата F1 методом препаративного изоэлектрофо-кусирования для увеличения степени его гомогенности.

На основе полученных данных о наличии общей антигенной детерминанты у капсульного антигена чумного микроба и у антигенных препаратов других бактерий поставлена проблема разработки методических рекомендаций по возможности использования диагностикумов с высокой чувствительностью к F1 в случаях исследования дезинтегрированных клеток микроорганизмов и органов животных. ' . . ,6

Положения, выносимые на защиту: ' 1. Продукция капсульного антигена чумного микроба на поверхность клетки детерминируется плазмидой pYT. Хромосомные гены чумного микроба ответственны ва синтев вещества с серологической специфичностью капсульного антигена.

2. В составе препаратов капсульного антигена чумнлго микроба обнаружены две антигенные детермйначты, которые отличаются структурной организацией и видовой специфичностью. Диагностическая антигенная детерминанта капсульного антигена является общей для не-

4

которых представителей энтеробактерий и реагирует с моноклональ-ными антителами к F1.

3. Антигенный комплекс К. pneumoniae, полученный ивоэлектическим осаждением в pi 4,2, обладает адъювантным действием при совместном введении с некоторыми антигенами Y. pestis.

4. Препарат капсульного антигена чумного микроба , -полученный по-общепринятым методикам, не является гомогенным. Методы инактивации бактериальной массы и.способы выделения препаратов влияют на иммунологические свойства препаратов F1 из чумного микроба.

Апробация работы: -Основные результаты работы доложены на конференции, молодых ученых и специалистов " Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций", (-г. Ростов-на-Дону,-" 1989) ,на научно- практической конференции молодых ученых " Механизмы интеграции биологических систем. Проблема адаптации ",( >. Ставрополь,1989) на ежегодных конференциях молодых ученых и специалистов Ростовского противочумного института.

Структура диссертации:

Материал,И8ложен-на 132 страницах, разделен на 7 глав,' иллюстрирован 12 таблицами и 20 рисунками, список использованной литературы содержит 218 н именований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе было использовано 7 штаммов Y. pestis, рааличездихся по плазмидному составу и фенотипу : EV 76 (pYT+, Fra-»), TS 6- (pYT+ ,Fr >■). 231( pYT+, Fra+), 556 (pYT-, Fra-)'-, TRlt(pYT-, Fra-) ,1230-a

(pYT+, Fra+-)t Б штаммов трансконъюгантов .получивших плазмиду pYT в составе коинтегративнойконъюгативной плаэмиды pLS 769 через промеадточный донорный штамм Y.' pestis TS (pLS7E9) -Е.coli C-l,E.coli X 926-1,К. pneumoniae 1017 KL,С. freundii 19/3808 КМ-1,и исходные реципиентные штаммы Е. coli С, Е. сбИ X 926,' К. pneumoniae 1017, С. freundii 19/3808.

Выращивание бактерий осуществляли при температурах 28* и 37 С и комбинированно на плотных и жидких средах'ЛХАТ, LB в течение различного времени ( от 1 до 3 суток).Для инактивации использовали БХ фенол • я ецетон. '

Препараты антигенов ив бактерий' всех указанных штаммов выделяли по известным методикам получения F1:методу Baker'(1S62) или изоэлектрнческим осаждением, препарат F1 из вакцинного штамма дополнительно очищали с помощью гель-фильтрации и препаративного кзоэлектрофокусмрования. .'• •

Ко всем препаратам ( кроме выделенных И8 трансконъюгантов Е. ooli), были получены экспериментальные кроличьи сыворотки. Для анализа экспрессии Fi у трансконъюгантоз Е. noli иммунизацию животных проводили клетками штаммов С-1. и X 925-1. Общее количество опытных кроликов' составляло 52. Схемы иммунизации варьировали по длительности циклов и использования адъювантов в различных сочетаниях, однако', количество циклов было равно 3, две первые инъекции были проведены на полном и неполном адъюванте Фрейнда соответственно подкожно,последующие внутривенно.

При исследовании адъювантного эффекта антигенного комплекса из К. pneumoniae! для некоторых антигенов, 100 ют этого

препарата смешивали со 100 мкг препаратов F1, *'мышного"токсина и мембранных белков псевдотуберкулеэного микроба. Контролем-служи сыворотки кроликов, полученные от животных, иммунизированных этими же препаратами без смешивания с препаратом КР. Адъюванткый эффект препарата КР сравнивали с действием . полного адъюванта Ярейнда .

Кроме полученных нами экспериментальных сывороток, в работе были использованы 36 коммерческих и экспериментальных. сывороток( лошадей, кроликов) t производства Иркутского и Саратовского-ГШ. 7

Шнохлональные антитела к F1 • были любезно, предоставлены сотрудником лаборатории МКА Ростовского противочумного института ' Колгановой Е. R

Химический состав препаратов определяли используя известные ' методики: наличие белков по методу Lowry (1951) в модификации Dulley (1976), углеводов- по методу Dibous (1956). 'Лиьядные ком' поненты определяли качественно * по окрашиванию Суданом черным,а молекулярную-массу препаратов- по калибровочной кривой после электрофореза по Laeranl 1 (1970) о маркерными "белками фирмы"5егуа". Для . оценки злектрофоретической подвижности нативного препарата антигена электрофорез проводили rio Davis (1968).

Аналитическое изоэлектрофокусирование осуществляли в 5% полиакриламидном геле с 2Z амфолинов диапазона 1/3 рН 3,6-10 и 2/3 рН 3,5-5 согласно рекомендациям Остермана (1983).

Реакции гемагглютинации ( РИГА, Рнат,- Рнаг, РТПГА) проводили микрометодом по общепринятым методикам с"антигенным и антительным поли- и моноклональным диагностикумом производства Среднеазиатского ПЧИ . . •

Реакции диффузионной преципитации ставили . по методу 0uohterlony(1978) в агаре или 1,5 % агарозе на фосфатном буфере, рН 7,3. В работе использовали обычный и модифицированный вариант иммуно диффузии. Суть модификации заключалась в. добавлении к агарозному гелю 0,1% дсдецилоудьфата натрия ( SDS), который присутствовал в сыворотках в той же концентрации и в препарате антигенов в количестве 2%.

1

Классы иммуноглобулинов в сыворотках животных определяли с использованием метода Suzuki (1974) при их обработке 2Ь-меркаптоэтанолом и постановке реакции иммунодиффизии с препаратами F1 в обычных и диссоциирующих условиях, а-также в иммуноблот-тинге с конъюгатами' к определенному классу иммуноглобулинов мыши ( А, М, ,Б) фирмы "Amiirsham" в дот-варианте. Дот- блоттинг и вестерн-блогтинг проводили по методу Towbin( 19V9). ■

Фагоцитарные реакции макроорганизма на введение препаратов антигенов изучали в культуре перитонеальных макрофагов морских свинок in vitro по методике, описанной Куклевой с соавт(1988).

Протективность препаратов антигенов исследовали на белых мышах и морских свинках. Определяли • % выживших животных и средни» продолжительность жизни при введении -200 DCL вирулентного атамма чумного микроба через 21 день после предварительной иммунизации препаратами антигенов.

Для выяснения иммуностимулирующего влияния препарата КР из К. pneumoniae на. действие вакцинного штамма Y. pestis - EV 76 использовали смесь, состоящую из препарата КР или водного экстракта клеток вакцинного штамма, в различных концентрациях, Заражавшая доза вирулентного штамма Y. pestis 231 была равна 200 DCL. Рассчет иммунизирующего эффекта и статистическую обработку результатов вели по формулам, предложенным Ашмариным (1962).

При изучении видовой 'специфичности капсульного антигена чумного микроба оценили динамику накопления антител к. F1 у кроликов посла .их иммунизации препаратами из природных штаммов К. pneumoniae и С. freundii. Кроме того, белых мышей инфицировали бактериями этих штаммоз и бескапсульногоштамма Y. pestis 558 Otten и вакцинного штамма Y, pestis ЕУ 75. Через 21 день после заражения у усыпленных эфиром животных забирали кровь, лимфоузлы, селезенку и печень. Органы гомогенизировали. растиранием а ' ступке к экстрагировали физиологическим раствором. В сыворотке определяли наличие антител к F1, Ь суспензии органов -антиген F1 с помощью гемагглютинационных тестов с поли - и моноклональнын диагнсстш'.умами производства Среднеазиатского ПЧИ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ.

1. Характеристика препаратов капсульного антигена .из. штаммов Y. pestis.

Препарат F1 , который был получен .общепринятыми 'методами.выделения капсульного антигена, был дополнительно очищен методами гель-фильтрации и препаративного изоэлектрофокусирования. Он oita-зался не гомогенным,а еодермал иммунохимичеоки неактивные примеси, в составе которых обнаружены липопротеин и полипептид. Пока- ,е

аано преимущество использования препаративного изоэлектрофокуси-рования в получении высокоочищенных препаратов капсульного анти: гена.

Дополнительно очищенный препарат F1 был подвергнут диссоциации в 2% растворе SDS. Считается, что в этом случае он распадается на мономеры с М 18- ООО Д. В условиях диссоциации препарат оставался иммунохимически активным и образовывал с сывороткой к F1 специфическую полосу преципитации. Наличие шпоры с нативной F1 свидетельствовало о. том, что детерминанты диссоциированной формы находятся и в исходном препарате F1.. Следовательно, нам представляется . возможным существование конформационно-зависимой детерминанты и детерминанты F1- диссоциированной формы.

йммуноблоттинг с МКА и поливалентной сывороткой к F1 показал присутствие нескольких иммунохимически активных компонентов в составе препарата F1 после его обработки 2% SDS с однородными детерминантами. Изменение условий обработки не приводило к исчезновению форм с U 43 ООО и 28 ООО Д, что свидетельствует об их стабильности. В картине-иммуноблоттинга с каждым ив 7 Использованных моноклонов отличий не было. ■ .

Штаммы У. pestis 656(pYT-,'pYV-,pYP+) и Y. pestis TRU (pYT-,pYV-,pYP-) -известны как не продуцирующие F1. Однако методами, аналогичными ..получению капсульного антигена чумного микроба иэ них; , были получены препараты ,обозначенные КББ6 и KTRU соответственно, сходные по иммунохимичеркой активности с F1.'

Независимо' от температуры выращивания, выход препаратов составил 0,26-0,29%, _в отличие от термоиндуцибельного синтеза капсульного антигена. Вероятно, еинтеа этого вещества детерминируется хромосомой чумного микроба.

Препараты К 656 и К TRU представляли собой порошки белого цвета, хорошо растворимы в воде, что отличает их от препаратов F1. Образование агрегатов большой молекулярной массы не было для них 'характерно. В составе Препаратов обнаружено 44Х-бо*белка, 14%~iex полисахарида. При электрофорезе по Лэммли препараты образовывали полосы с 43000,28 ООО и 18000 Д.

Ш В реакциях гемагглютинации с РПГА и РЕ^т) полученные

препараты вступали во взаимодействие с поли- и моноклональным диагностиками к Fl ( производства Среднеазиатского ПЧИ) Их титры были значительны, но не превышали титров с препаратами Fl.

Кроличьи сыворотки, полученные к препаратам К556 и KTRU, вступали в перекрестные реакции в иммунодиффузии с препаратом Fl и между собой , образуя непрерывную полосу преципитации со специфичностью капсульного антигена чумного микроба Протеютвностью для морских свинок препараты не обладали, а для мышей характеризовались ее повышением по сравнению с Fl.

■ 2. Особенности экспрессии и свойства препаратов капсульного антигена чумного микроба, выделенных из рекомбинантных штаммов-продуцентов.

Исследование бактериальной массы рекомбинантных штаммов E.coli С-1 и Е. coli Х-925-1 с плазмидой pYT на наличие капсульного антигена показало, что иммунохимической активностью характе-' ризуется только штамм E.coli Х-925-1. Нам, как и другим авторам (Заренков М.И, и др. 1985), обнаружить Fl в клетках Е. coli С-1 обычными серологическими методами не удалось.

Учитывая неоднозначные данные об экспрессии капсульного антигена в клерках трансконъюгантоь Е. coli, мы попытались обнаружить антитела к Fl у животных в процессе их иммунизации клетками указанных штаммов. Анализ полученных сывороток показал, что антитела к Fl образовывались у кроликов, иммунизированных клетками рекомбинантного штамма E.coli X 925-1. Их титр возрастал от 1/2Б6 после первой инъекции до 1/32 ООО после третьей иммунизации , в реакциях диффузионной преципитации образуется специфическая полоса. В сыворотках", животных, иммунизированных рекомбинантиыми бактериями Е. coli С-1, антитела обнаружены в низких титрах после третьей инъекции, что согласуется с данными дот-иммуноблоттинга . Следовательно, fra- гены плаэниды pYT экспреесировались а клетках трансконъюгинта E.coli С-1, однако уровень выхода детерминируемого ими белка оказался низким. Тагам образом, экспрессия Fl осуществляется и в клетках нетипи'шых хозяев после получения 11

плазмиды pYT чумного микроба

Дополнительно к изучению особенностей экспрессии Fl мы провели сравнительный анализ уровня продукции капсульного антигена в клетках Е. coli Х-926-1 и Y.pestis EV-76. Показано, что по сравнению с EV 76 у рекомбинанта уровень продукции снижен в 5 раз j а секреция капсульного белка практически не выражена. Эти наблюдения позволяют предположить неприспособленность, систем транспорта в клетках Е.coli для капсульного антигена чумного микроба, что могло бы обеспечить • ингибирование процесса биосинтеза конечным продуктом или повреждение регуляторных генов, ответственных за секрецию Fl, .наличие которых недавно продемонстрированноеGalyov. Е. Е. et al, 1991)

Плазмида pYT 75 была передана из промежуточного донорного штамма Y.pestis TS в штаммы К. pneumonies 1017 и С. freund i i 19/3008 в составе коинтеграта pLS759 .Показано, что уровень выхода капсульного антигена для трансконъюгантов ниже, чем у донорского штамма Y.pestis ,в составе которого находится коинтеграт.

По химическому составу препараты Fl являлись гликопротеинами и име}и сходные физико-химические свойства. Однако в серологических тестах препараты из трансконъюгантов имели более высокую иммунохимическую активность.

Препараты капсульного антигена чумного микроба, выделенные из К. pneumoniae (pLS 759) и- С. freund i (pLS 759), обладали протегегивностью для . белых мышей,, зашитая половину животных от * летельности по сравнению с 40 X защиты при использовании Fl из Y. pestis EV 76 и увеличивали время -жизни мышей и морских свинок.Причины этого явления могут быть разными, в. том числе,связанными с особенностями процессинга капсульного антигена в транслирующей системе чужёродных штаммов.

' 3. Характеристика антигенных комплексов К. pneumoniae и С. freund i.

Нами проведено выделение препаратов антигенов из реципиентных 12 штаммов К. pneumoniae и С. freundi (KP и CEF) методами,

аналогичными получению капсульного антигена чумного микроба. Пс химическому составу препараты КР и CBF являлись белковополисахаридными комплексами. В результате электрофореза по Лэммли в них обнаружены компоненты, по молекулярной массе сходные с имеющимися в F1 чумного микроба (18,28,43 кД).В реакциях гемагглютинации препараты КР и CBF вступали во взаимодействие с антительными моно-. и. поликлональными диагностиками производства Среднеазиатского ПЧИ к F1.

Проведение Western-блоттинга с сыворотками и МКА к F1 препаратов КР и CBF показало наличие иммунохимически активных компонентов, характерных и для F1.

Чтобы исключить неспецифическое связывание исследуемых препаратов с сыворотками , полученными к капсульному антигену чумного, микроба, мы провели иммунизацию кроликов калифорнийской породы препаратами КР и CBF и оценили динамику накопления антител к указанным препаратам в реакциях гемагглютинации. Показано, что кривые титров антител, зависящих от времени, для всех препаратов, в' том числе и для F1 чумного микроба имеют, сходный вид.

В связи с тем, что для антигенных комплексов К. pneumoniae известны. адъювантные и. ■ протективные свойства в отношении гнойно-септических инфекций, мы исследовали эти свойства препарата КР в отношении чумной инфекции. При использовании для инъекций капсульного антигена в смеси с препаратом антигенного комплексе КР количество, антител увеличивается в 4-8 раз и приближается к уровню антител при использовании капсульного антигена а смеси с полным адьювантом фрейнда. ■ ■

Одновременное введение клеток вакцинного штамма и антигена КР повышало эффективность вакцинации на 32 При оценке .стимулирующего действия грубого водного экстракта поверхностных антигенов К.pneumoniae, оказалось,что коэффициент эффективности этого вещества ,был равен 12, что подтверждает возможность использования препаратов К. pneumoniae в качестве иммуностимуляторов при вакцинации корпускулярной вакциной и требует дальнейших исследований' по поиску приемов выделения очищенных препаратов капсульного полисахарида К. pneumoniae. 13

4. Исследование специфичности капсульного антигена Y. pestis и антител к нему.

В модифицированном нами варианте иммунодиффуэии было показано, что все препараты Fl, КР, CBF в диссоциирующих условиях с сыворотками,. специфичными к F1 вели себя идентично,что свидетельствует в пользу того, что этот эпитоп, принадлежащий препарату F1, после обработки последнего детергентом SDS, не является видоспецифическим, в то время как конформационно-зависимая детерминанта являлась специфичной лишь для чумного микроба, поскольку • только нативный препарат капсульного антигена чумного микроба образовывал характерную "шпору" как с мономерной формой F1, так и с другими препаратами. Препараты из штаммов чумного микроба, не образующх ' капсулу (К556 и KTRU),способствовали выработке у животных антител ■той же специфичности, что и препараты КР и CBF.

Следовательно, указанные факты свидетельствуют о том, что мономерная форма несет детерминанту, общую для видов и родов неко-торых'штаммов и не является видоспецифической. Поскольку показано, что мадоклональные антитела, как коммерческие , так и экспериментальные взаимодействуют с препаратами KP.CBF и К5Б.6 , то они также не специфичны для чумного микроба. Однако при анализе бактерий разных штаммов, в условиях, когда не происходит разрушения поверхностных структур," а следовательно, не "обнажается" скрытый общий неспецифический эпитоп моноклональные антитела могут исдользоваться с достаточно высокой степенью достоверности. Для доказательства связи гипердиагностики чумы с перенесенными энте-робактериальными инфекциями у исследуемых животных, в том числе и в природных очагах чумы, мы провели модельные испытания специфичности серологических реакций при исследовании животных на наличие капсульного антигена или антител к нему общепринятыми гемагглюти-национными тестами.

В органах животных, перенесших инфекцию бактериями от бесплаз-14 мидного штамма Y. pestis 556( pYT-,Fra-) и исходных штаммов

К.pneumoniat 1017,С. freundii 19/3808, общепринятыми методиками серологической диагностики чумы, обнаружен калсульный антиген.

Антиген со специфичностью F1 не выявлен нами при исследовании органов чистых животных( контроль) и нормальных мышиных сыворотках. В связи с этим,данные Басовой с соавт ( 1982). о нахождении в органах некоторых животных иэ природных очагов чумы антител к F1, которые авторы относят к нормальным антителам,а также факты обнаружения сходного о F1 антигена в селезенке чистых животных Мареев В.И., 1982), можно объяснить перенесенными ранее заболеваниями,вызванными энтеропатогенными микроорганизмами.

• При исследовании сывороток крови белых мышей на наличие антител к F1 , показано, что антитела к капсульному антигену в РПГА обнаруживаются лишь после заражения бактериями чумы, а в • реакциях РНАг у всех животных. . Следовательно,высокая чувствительность используемых методов (РНАт, ИФА, иммуноблотинг) может вносить ошибку в серологические методы исследования на чуму, поскольку неполные антитела не являются видоспецифическими для чумного микроба. Таким образом, наличие общего с энтеробактериями и бесплазмидными штаммами чумного микроба компонента о диагностической детермииантой F1 в препарате капсульного антигена . может влиять на развитие теоретических представлений о биогенезе и структуре капсульного антигена чумнсго микроба. №=• исключено, что синтез F1 детерминируется генами,не связанными ,или не только связанными с плазмидой pYT, а присутствие и полноценность последней мотет влиять на выход этого антигену на поверхность или способствует синтезу комплексного вещестьл более сложного составь. Это объясняет как отсутствие F1 на поверхности у штаммов , лишенных плазмиды ( Y. pestis 666, Y. pest is TRU) . тек и обнаружение Fi после разрушения бактерий, выращенных при 28 С (Езепчук Ю.И. ,1977) поскольку термоиндуцибельная продукция, судя по пьющимся данным, связана с pYT плазтдой, что показано ьами и другими авторами (Siwpson Т. ,et al,1990). :

Дальнейшие исследования покажут какое из нала« предположений верно: отвечают ли плазмидные fга-гены за активный транспорт " хро 16

мосомнсго " Fl антигена или последний является сложным комплексом, синтез которого определяется и плаэмидой pYT и хромосомой чумного микроба.

ВЫВОДЫ.

1. В составе препарата капсульного антигена обнаружены липопротеин и полипептид,которые не являются иммунохимически активными. Препаративное изоэлектрическое фокусирование позволяет очистить препарат F1 от указанных компонентов бее изменения его основных физико-химический свойств.

2. Иммунохимические свойства препаратов капсульного антигена чумного микроба обеспечиваются специфическим высокоагрегиро-ванным белковым компонентом, имеющим конформационно-зависимые де-■ терминанты, которые характеризуются высокой специфичностью и компонентом с общей для сем. Enterobacteriaceae антигенной детерми-нантой.

3. Вещество с серологическими свойствами F1 обнаружено у штаммов чумного микроба , не имеющих капсулы (Fra-,pYT-) и у природных штаммов К. pneumoniae и C.freundii. Его синтез не вависит от температуры культивирования. Используемые в настоящее вцемя серологические методы диагностики чумы (РПГА,РНАт,РДП) .не позволяют обнаружить его йа поверхности клеток указанных штаммов,в отличие от -штаммов Y.pestis (Fra+,pYT+) .Препарат этого вещества, полученный аналогично F1, хорошо растворим,не способен к агрегации, имеет гликопротеиновую природу и иммунохимически активные -компоненты, сходные по молекулярной массе с F1 чумного микроба в условиях диссоциации.

4. Моноклональные антитела, к F1 чумного микроба ., как коммерческие, так и экспериментальные, взаимодействуют с общей антигенной детерминантой сем. Enterobacteriaceae, что ограничивает их использование при исследованиях дезинтегрированных клеток или органов животных в серологической диагностики чумного микроба.

б. Антитела к общей энтеробактериальной детерминанте не яв-16 ляются полными , поэтому положительные данные серологических ре-

акций РНАг- в отсутствии положительных результатов в РПГА требуют подтверждения другими методами диагностики чумы.

6. Продукция капсульного антигена чумного микроба детерминируется . плаэмидой рУТ , в том числе, и в отсутствии специфических хромосомных генов чумного микроба. Трансконъюганты К. pneumoniae (pLS 769), С. freundii (pLG 759) и Е. col i Х-92Б-1, получившие плазмиду pYT являются моделями для изучения регуляции синтеза F1 и продуцентами иммуногенных препаратов F1 чумного микроба Температурная регуляция синтеза капсульного антигена обеспечивается плаэмидой pYT. Хромосома чумногс микроба ответственна за синтез общего для энтеробактерий компонента с иммунохимическими свойствами F1.

7. Препараты F1 из трансконъюгантов имеют сходные с F1 из Y. pestis физико-химические свойства, но обладают повышенной иммуногенностью. Для капсульного антигена чумного микроба из К.pneumoniae (pLS 7Б9) sto связано с присутствием в его составе дополнительных антигенных комплексов, обладающих адъювантными и протективными свойствами.

8. Методы инактивации бактериальной массы и способы выделения влияют на свойства препарата F1. Использование ацетонового высушивания увеличивает иммунохимическую активность препарата.

ОПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Титенко М. М., Косое Л. В. Активность противочумных сывороток в иммунохимическйх реакциях с антигеном " фракция 1" //Механизмы интеграции биологических систем. Проблема адаптации: ' Теэ. докл. конф. мол. 'ученых.- Ставрополь, 1989.-С. 166.

2. Косое Л, Е Лебедева' С, А., Титенко М. М. и др. Изучение про-тективного антигена F1 оболочки чумного .микроба, экспрессирован-ного в трансконъюганте нетипичного хозяина // Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций:- Тез. докл. конф. мол. ученых. - Ростов-на-Дону,1989. - С. £9

3. Титенко М. М. .Сидорова H.R, Новохаюкий А.С. .Косое JLB. и др. Некоторые свойства оболочеЧного вещества чумного микроба// Там же- 0. 48

4. Титенко М. М., Косее Л. Е, Тюменцев С. Н. и др. О природе эпитопов капсульного антигена возбудителя чумы// Там же - С. 98.

5. Титенко М. М., Новохатский А. С. Косое Л. R и др. Новые данные по характеристике препарата F1 капсульного антигена возбудителя чумы // Вестнок Всесоюэн. микробиол. общества. - Ростов-н/Д, 1989.- С. 118-123.

6. Титенко М. М., Коссе Л. В., Заренков М. И. Экспрессия капсульного антигена чумного микроба в клетках кишечной палочки// Бактериальнне плазмиды: Тез. докл.- Нальчик, 1990.- 0.36.

7. Коссе Л. Е .Титенко М.М., Заренков М.И. Особенности экспрессии и свойства капсульного антигана чумного микроба в клетках трансконъюгантов E.coli//BecTH. микробиол. об-ва.- N 2. -Ростов н/Д-1992 ( принято к опубликованию). .

8. Коссе JL В., Лебедева С. А. .Кузнецова Л.О. Рекомбинантный штамм Citrobaoter freundii, продуцирующий капсульный антиген чумного микроба //1 съезд иммунологов России: Тез. докл. -Новосибирск, 1992.-С. 240.

9. Коссе Л.Е, Чернявская А.С., Шикуля НА. и др. Иммуногенные свойства антигенных комплексов Klebsiella pneumoniae в отношении чумной инфекции// Там же .-С.241

10. Коссе Л.Е, Лебедева С. А., Чернявская А.С.Кузнецова Л.С. К вопросу о видовой специфичности капсульного антигена чумного микроба// Организация зпиднадзора при чуме и меры ее профилактики: Tes. докл! конф.-Алма-Ата, 1992 ( подано к печати)

Подписано к печати 16.07.92.Объем I п.л.Тирах 100 экз. Заказ 402. Офсетная печать ГКП "Осгеология".