Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к поверхностным антигенам чумного микроба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к поверхностным антигенам чумного микроба"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Ростовский государственный медицинский институт

РГб од

¡1 и - " И и ¡1

На правах рукописи

БНЧУЛЬ Ольга Константиновна ИОН<?КЛОНАЛЫШЕ АНТИТЕЛА К ПОВЕРХНОСТНЕЙ АНТИГЕНА» ЧУМНОГО МИКРОБА

03.00.07 - цикробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 1993

г-

• ^ -/1x4,

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте ГОСКОМИТЕТА САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

НОВОХАТСКИЙ А.С.

АЛЕКСЕЕВА Л. П.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

РЫЖКО И. В.

кандидат медицинских наук, старвий научный сотрудник

ЯГОБКИН Э.А.

Ведущая организация: Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится "^декабря_ 1993 г.в часов

на заседании специализированного совета Д 084.53.01 при Ростовской государственном медицинском институте (344700, г.Ростов-на-Дону, Нахичеванский пер., 29)

Автореферат разослан ' ЦЬ- КС&с)Ьлк 1993

г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского медицинского института

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Н. Я. К0РГАН0В

общая характеристика работы

Актуальность там. Несмотря на то, что чума в современных условиях не имеет значительных эпидемических проявлений, существование обширных природных очагов в. различных регионах земного вара, в том числе на территории нашей страны, сохраняет опасность заражения "людей чумной инфекцией. Для своевременного проведения в природных очагах чумы первичных противоэпидемических мероприятий, направленных на снижение вероятности заражения человека и исключения антропонозного распространения инфекции, большое значение имеет раннее выявление возбудителя чумы, а также меры профилактики среди населения. С этой цельп разрабатываются различные диагностические и вакцинные препараты Шалецкая О.В.. 1987; Тениралиева Г.А., 1988; Marschall G.C.. 1974; Mayer К.К.. 1974; Reisnan R.E., 1970).

Особое внимание при создании диагностических препаратов уделяется изучению поверхностных структур чумного микроба, так как серологическими исследованиями установлено . что к ним относится большая часть видо- и группоспецифических антигенов (Анисимов П.И., 1985; Пустовалов В.Л.. 1986; Butler Т.. 1983). Серодиагностика возбудителя чумы, в настоящее время, главным образом, базируется на обнаружении поверхностного каг.сульного антигена ( FI ) или же антител к нему,выявляемых в сыворотках животных. Однако хорошо известно, что наличие капсульного антигена на поверхности микробной клетки не является постоянным признаком, так как зависит от температуры культивирования возбудителя, наличия 65 МД рУТ плазмиды и ряда других факторов (Орлова Т. М., 1963; Burrows Т. W., 1962). Кроме того, в природных очагах чумы наряду с типичными капсулообразующими штаммами нередко выделяются бескапсульные варианты чумного микроба, что создает определенные трудности при их диагностике ( МетлинВ.Н.. 1970; Кондрашкина К. И., 1971; Бибикова В. а. ,1972). В последнее время появились также сообщения об обнаружении FI у других микроорганизмов и антител к нему в сыворотках животных не контактировавших с Y.pestls (Басова H.H.. 1982; Маре-ев В.И., 1982; Анисимов П.И., 1983;Апарин Т.П.. 1989). Обычно это объяснялось неточной идентификацией чумного микроба или возможной его гипердиагностикой. Однако сравнительный анализ специфичности

капсульного антигена и препаратов, выделенных аналогичными методами из природных штаммов других представителей семейства Еп1егоЬасьег1асеае. позволил выявить общую для некоторых энтеро-бактерий антигенную детерминанту с имыунохимическиш свойствами Р1 (Косое Л.В.. 1992). Это обстоятельство, как считают авторы, также может ограничить использование антикапсульных диагностику-мов для обнаружения возбудителя чумы.

Существующие в настоящее время диагностические препараты, созданные на основе других поверхностных антигенов чумного микроба. в отличие от антикапсульных, позволяют выявить типичные и атипичные формы возбудителя, однако не дифференцируют его с другими близкородственными микроорганизмами (Дьяков С.И.,1972; Щербаков А. Л., 1984: Баканурская Т. П., 1992).

Связанные с диагностикой чумы трудности определяют необходимость поиска новых поверхностных видоспецифических антигенов с целью создания на их основе гест-систем, позволяющих выявить возбудитель чуш независимо от его способности синтезировать П.

Наряду с диагностической значимостью исследование поверхностных антигенных субстанций весьма перспективно в плане изучения иммуногенеза при чумной инфекции и выявления антигенов, стимулирующих защитные реакции макроорганизма, так как известно, что в целом иммуногенность микробной клетки, определяется не только иммунохимическими свойствами входящих в ее состав специфических антигенов, но и степенью их доступности для распознающих систем макроорганизма (Ляиенко В.В.,1982).

Таким образом, дальнейшее изучение поверхностных антигенов чумного микроба представляет определенный интерес в плане создания диагностических препаратов, а также определения роли антигенов возбудителя чумы и антител, полученных к ним,' в развитии инфекционного процесса при чуме. Для решения этих вопросов в настоящее время требуется привлечение новых методов исследования. Одним из наиболее перспективных направлений в этом отношении является гибридомная технология,открывшая новые возможности для выполнения исследований подобного рода.

Цель работы. Получение коллекции моноклональных антител к поверхностным антигенам чумного микроба, изучение их функциональных свойств, выявление и использование видоспецифических моноклональных антител для диагностики типичных и атипичных штаммов

Y. pestls и дифференциации их с другими представителями семойстаа Enterobacterlaceae.

Задачи работы:

1. Разработать шяимальные условия получения гибридом, сек-ретирующих ыонюкломальше антитела к поверхностным антигенам чумного микроба.

2. Создать коллекции гибридом, стабильно вырабатывающих мо-ноклональные антитела к антигенным детерминантам поверхностных структур возбудителя чумы.

3. Охарактеризовать свойства полученных моноклональных антител. определить их антигенную направленность, исследовать активность МКА в различных серологических реакциях, изучить иммунобиологические свойства моноклональных антител в условиях "in vivo" и "in vitro".

4. Изучить эффективность использования коллекции МКА для выявления типичных и атипичных штаммов чумного микроба независимо от их способности синтезировать капсульный антиген.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В результате проведенных исследований получен набор гибридом, продуцируя-щих моноклональные антитела к поверхностным антигенам Y. pestls.

Получено две группы гибридом, секрегируюцих. ИКА IgG и IgM. выявляющие видоспецифические и родоспецифические , детерминанты, экспрессированные на поверхности микробной клетки возбудителя чумы, а также гибридомы . продуцирующие МКА к эпитопам, обусловливающим перекрестные реакции с близкородственными микроорганизмами.

Установлено, что I группа ИКА выявляет поверхностный антиген чумного микроба, представленный в иммуноблоттинге двумя зонами, соответствующими фракциям с М.м. 23 ООО и 46 ООО Д. Вторая группа МКА направлена к антигену FI возбудителя чумы.

С помощью полученных МКА проведен антигенный анализ типичных и атипичных музейных штаммов чумного микроба, .выделенных в природных очагах чумы, а так*е штаммов, полученных в генетических эксперимента^.

Установлено, что МКА к FI чумного микроба с большей эффективностью, чем существующие коммерческие диагностикумы, выявляют антиген FI. а также итаммы, синтезирующие капсульный антиген, как. ,при 37 °С, так и при 28 °С.

Определено, что МКА I группы выявляют бактерии возбудителя чумы, выраженные при 37 0 С и 28 0С, независимо от плазмидного состава, способности синтезировать капсульный антиген, а такие фазы диссоциации.

Показана возмоиность с помоцьо ИКА I группы проведения дифференциальной диагностики типичных и атипичных штаммов чуююго микроба, выращенных при 28 0 С, с другими близкородственными микроорганизмами, включая У.pseudotuberculosis.

Установлено, что количество данного антигена, синтезируемое на поверхность микробной клетки, зависит от фазы диссоциации возбудителя, его инвазипности, а такие температуры выращивания.

Изучена функциональная активность МКА, направленных к различным антигенам чумного микроба. В опытах "in vivo* получены даннае, указывающие на способность МКА в комплексе с антигеном оказывать модулирующее действие на иммунный ответ. В опытах н1п vitro" показано,что стимуляция защитных свойств макроорганизма происходит за счет индукции ишунокомплексоы МКА-антиген иммунного ответа лимфоцитов, а такзе снижения антифагоцитарных свойств микроорганизма.

Изучен эффект совместного действия МКА различной специфичности. Установлено, что смесь разных ИКА обладает большей активностью, чем каждое МКА в отдельности. Показано, что эффект про-тективности зависит от специфичности и концентрации НКА.

Практическая ценность работы. Полученная коллекция стабильных гибридных культур, продуцирующих МКА к поверхностным антигенам Y.pestls, использована в качестве источника стандартных моноспецифических иммуноглобулинов для разработки усовершенствованных диагностических препаратов.

Получены и испытаны диагностический препараты МКА, конъюги-рованные с ФИТЦ для диагностики и идентификации пташов Y.pestis. синтезирующих капсульный антиген. Полученные препараты . в отличие от существующих коммерческих, обладают большей чувствительностью и позволяют выявлять шта),1мы чумного микроба со сниженной продукцией PL

Получены и испытаны диагностические препараты МКА для выявления штаммов чумного микроба независимо от их плазмидного.состава, температуры культивирования и способности синтезировать капсульный антиген. Показана возможность использования их для диффе-

ренциации методом непрямой иммунофлуоресценции возбудителя чумы с другими представителями семейства Еп1егоЬас1ег1асеае при текшера-туре культивирования 28 °С.

Результаты исследований легли, в основу "Методических рекомендаций по использованию моноклональных антител для выявления типичных 4 и атипичных штаммов чумного микроба и дифференциации их с другими представителями семейства Еп1егоЬасЬег1асеае". утвержденных Ученым Советом Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института 31 июля 1992 г., протокол N 11; "Научно-технической документации по изготовлению и контролю .набора моноклональных антител к антигену У. ревиз для использования в иммунологических реакциях", утвержденная Ученым Советом Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института 25 декабря 1991 г.. протокол N 16.

Испытания препаратов на основе МКА проведены на базе Ростовского и Волгоградского научно-исследовательских противочумных институтов.

Препараты МКА используются в научно-исследовательских разработках различных лабораторий Ростовского-на-Дону противочумного института. 4 ч

Гибридные клеточные линии ГЧ-В8/Е5 и Е6/Н8-ГЧ, синтезирующие моноклональные антитела соответственно к антигену Р1 и поверхностному антигену чумного микроба, синтез которого не зависит от температуры культивирования и плазмидного состава штаммов, депонированы во Всесоюзной Специализированной коллекции перевиваемых клеточных культур под номерами ВСКК(П) 384Д и ВСКК(П) 434Д.

Основные положения, выдвигаемые на защиту:

1. Гибридомы, полученные путем соматической гибридизации иммунных спленоцитов с клетками ыиеломы мыши, продуцируют моноклональные антитела к поверхностным структурам чумного микроба, обладающих различной специфичностью: I группа МКА выявляет поверхностный антиген чумного микроба , синтез которого не зависит от температуры культивирования и плазмидного состава штаммов, II группа направлена к Р1 возбудителя чумы.

2. МКА I группы выявляют капсульные и бескапсульные формы' чумного микроба, выращенные при 28 °С и 37 °С. независимо от их плазмидного состава и фазы диссоциации.

3. С помощью МКА I группы Е6/Н8. И1/Т5 возможно проведение'.

дифференциальной диагностики типичных и атипичных штаммов чумного микроба с другими близкородственными микроорганизмами при температуре культивирования 28 0С методом непрямой иммунофлуоресцен-ции.

4. МКА II группы, полученные к капсульному антигену возбудителя чумы, с большей эффективностью, чем существующие коммерческие диагностикумы, выявляют антиген FI в культурах, выращенных как при 37 °С. так и при 28 °С, что позволяет использовать их для обнаружения штаммов чумного микроба со сниженной продукцией кап-сульного антигена.

5. В опытах "In vivo" и "In vitro" установлена способность ША в комплексе.с антигеном оказывать влияние на кинетику иммунного ответа.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научных конференциях молодых ученых РПЧИ в 1988 и 1991 гг., на Всесоюзных семинарах по МКА в 1988 и 1989 гг.. Ростов-на-Дону; на Всесоюзной научной конференции "Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций". Оболенск, 1989 г.; на 2-й Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов", Москва. 1990 г.; на 1-м съезде иммунологов РСФСР, Новосибирск, 1992 г.; на Всесоюзной научной конференции "Организация эпиднадзора при чуме и меры ее профилактики", Алма-Ата, 1992 г.. Материалы диссертации обсуждены на общеинститутской конференции РПЧИ в 22 июня 1993 г.

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации отражены в 11 опубликованных научных работах.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего работы 117 отечественны* и 130 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 6 рисунками, 22 таблицами и 4 фотографиями.

собственные исследования

Материалы и методы

Бактериальные штаммы и антигены. В работе были использованы 110 природных штаммов чумного микроба; 16 экспериментальных -штаммов У. pestis, полученных в генетических экспериментах по передаче

ДНК 65 МД плазмиды Y.pestls 76 или ее реконструированных вариантов другим штаммам возбудителя чумы; 60 штаммов Y.pseudotubercu-losls; 20 штаммов Y.enterocolltica; штаммы других представителей рода Yersinla и семейства Enterobacterlaceae; а также препараты ЛПС, FI, "мышиного" токсина, пилен адгезии и V фракции чумного микроба, полученных сотрудниками лабораторий РПЧИ по методикам Вейнблата В.И,. (1974); Baker Е.Е. et al., (1952); Montle Т.С. et al.,(1968); Водопьянова С.0., (1992); Бохко Н.В..(1972), соответственно.

Клетки. Использованы клетки шинной миеломы P3-X63/Ag. 653.

Животные. Использовали инбредных мышей линии Balb/c с массой 16-20 г.

Иммунологические реакции. Метод непряной иммунофлуоресценции осуществляли на фиксированных мазках, приготовленных из I млрд. суспензии бактериальных клеток.

Иммуноферментный анализ проводили на твердой фазе сорбированных в лунках полистироловых панелей цельных клеток бактериальных штаммов или препаратов очищенных антигенов.

Конкурентную реакцию пар МКА для определения индекса аддитивности проводили согласно методике, .предложенной Fríquent В. et al.. (1983). \

Оценку специфической активации лимфоцитов в опытах "1п vi tro" выполняли иммуноферментным методом двух разновидностей: твердофазным иммуноферментным методом и методом иммуноферментных зон (ELISA-SPOT) по методике Russell Р.Н. et al.. (1987).

Изучение протектипной активности МКА и реакцию фагоцитоза "1п vlt.ro" проводили по общепринятым методикам.

Иммуноблоттинг и элетрофорез осуществляли методом Barnette W.N. et al., (1981).

Определение класса иммуноглобулинов, продуцируемых гибридо-мами. проводили с помощью иммуноферментного изотилирующего набора фирмы Calblochem (Швейцария) по инструкции изготовителя.

Статистическую обработку результатов серологических анализов выполняли по Ашмарину И.П. и Воробьеву А.А., (1962).

Построение графиков. Графическую обработку данных проводили на компьютере М-290 фирмы "Ollvetty" с использованием графического пакета "Graí-in-the-Box" в интерактивном режиме.

Р№№№ ИССЛЕДОВАНИЙ

Получение гибркдй^Х- Клонов, продуцирующих ИКА к поверхностным антигенам Y.pestls. В результате проведенных гибридизаций, клеток мыииной миеломы Х-653 со спленоцитами1 мышей, иммунизиро»-ванных бактериальными клетка»,in Y.pestls EV 76, выращенных при 37 и 28 °С. и клетками1 бесплазмидного штамма Y. pestls Yawa, выращенного при 28 0 С. в общей сложности была поручено и исследовано на антителообразующую активность 1610 гибридных культур. При первичном тестировании обнаружено Í04Ó антителшродуцентов, сек-ретируюцИх иммуноглобулины íc пОверхНйСТйй* антигенам чумного микроба. В процессе культивирования гибридом было установлена, что 25% гибридных кул'ьтур нестабильны по антителообразующим свойствам.

Свойства моноклональных антител, полученных к поверхностным антигенам1 чумного микроба. Исследования, выполненные на атэммай чумного мироба с различным набором ллазмид и итаммах близкородс-•túC'HriiJx микроорганизмов, позволили разделить имеющийся набор МКА по бЯбффсчности на три группы. Экспериментальную работу проводили с двумя первыми группами гибридных клонов, представлявшими наибольший интерес с диагностической точки зрения.

Отличительной особенностью МКА I группы была способность вступать й специфические Взашэдействие со штаммами чумного микроба Независимо от их плазшднсго состава, температуры культивирования а способности синтезировать капсульный антиген(табл. П.-Методом конкурентного ИФА с использованием препаратов очищенных антигенов была установлена антигенная специфичность МКА этой группы. Наиболее высокие показатели t ингибиции связывания антител tí опыте отмечались при взаимодействии МКА с' препаратом V Фракции возбудителя чуш , что позволило достоверно установить специфичность МКА к антигенным детерминантам atoro препарата,

Элек-фофоретическое разделение и изучение белковых профилей ' препарата V фракция Методом иммуноблотТйНГа показало, что МКА I группы специфически связываются . с двумя зонами, разделенного электрофоретически антигена, М. м. 23 ООО И 46 ООО Д.

Изучение специфической активности МКА этой Группы методом НИМФ на штаммах семейства Enterobacterlaceas, имеющих, как известно; перекрестно реагирующие антигены, установило, что с их поМОщЬю выявляются общие антигенные детерминанты лишь у штаммов

Таблица 1

Исследование специфичности коноклональных антител

¡методой недрякод дмнунофлуоресценцки на штаммах ■y.ipeaUs ,в зависимости от ж плазхилного состава я температуры культивирования

;Плаэхидннй • ¿состав игаююв Всего ис-СЛЗДОЕЗКО итаююв Из них

ж продуцирует фракцию I Реагируя: с Ш при текпературе выращивания '

37 °С 22 '"е

Y.peaUs

р¥Р\;рУГ,рУ'Ги 24

pyP~.;pVV^.pY Г" 21

pYP^.pYV.pYT* 4

pYP*,pYV\pYT~ 1

pYp-.pYV~.pYr 1

pYP\pYV-,pYT~ 2

pYP-.pYY-.pYT~ 1

0 ' О

1 \0

Ъ 1

л-,+

& & & *

"+"-1юложительная ихмунофлуоресцения, свзчвниз с яркостур

*) - критические плазмиды разной колекулярнся кассы

PYP - 6 МД плазкида, ответственная за пестщин

PYV - 47 МД плазкида, ответственная за YOP-белки, Са+-зависи-

иость, v-анткген и другие свойства pyt - 65 мд плазкида. связанная с продукцией фракции i и "мши-

Ч

кого" токсина.

У.pestls и У, pseudotuberculosis, но в отличие от штаммов чумного микроба определить эти детерминанты у последнего удается только при температуре культивирования 37 °С. Выращивание штаммов псевдотуберкулеза при 28 0С приводило к потери способности бактериальных клеток к специфическому взаимодействию с МКА . Однако использование в этих целях более чувствительного метода ИФА позволило обнаружить определяемый антиген на поверхности бактериальных клеток этого возбудителя; с другими гетерологичными микроорганизмами. взятыми в исследование, специфическое взаимодействие не отмечалось.

Таким образом, отсутствие положительной иммунофлуоресценции 28°-культур Y.pseudotuberculosis объясняется резким снижением синтеза антигена при этой температуре и низкой, по сравнению с ИФА, чувствительностью метода непрямой иммунофлуоресценции. Используя особенности синтеза определяемого антигена у чумного и псевдотуберкулезного микробов в зависимости от температуры культивирования, оказалось возможным проведение дифференциации методом НИМФ этих возбудителей с помощью полученных МКА.

Принимая во внимание диагностическую ценность полученных МКА, дальнейшее изучение проводили на штаммах чумного и псевдотуберкулезного микробов, отобранных с учетом фазы диссоциации бактерий.

Как известно, существует две формы диссоциации чумного и псевдотуберкулезного микробов (шероховатая-R и гладкая-S), отличающиеся меиду собой по вирулентности, устойчивости к фагоцитозу и антигенному составу. Возникающие в процессе диссоциации изменения затрудняют дифференциацию возбудителей, поэтому сравнительное изучение различных свойств, в частности антигенного состава чумного и псевдотуберкулезного микробов в зависимости, от формы диссоциации. представляет значительный интерес при создании диагностических препаратов.

Исследования, выполненные методом НИМФ, установили преимущественный синтез определяемого антигена независимо от температуры культивирования у штаммов чумного микроба, образующих шероховатые колонии. Обработка МКА штаммов чумного микроба в S-, SO-формс и штаммов пссвдотуберкулеза в R-форме сопровождалась уменьшением специфической активности МКА, однако ео уровень при взаимодействии с последними был значительно ниже. В свою оче-

редь, штаммы псевдотуберкулеза в S-, SO-форме приобрели способность к специфической иммунофлуоресценции лишь при температуре культивирования 37 0С.

Оценка специфической активности МКА на исследуемых штаммах позволила определить рабочее разведение антител, в котором они не вызывают специфической иммунофлуоресценции бактериальных клеток V.pseudotuberculosis, но сохраняют способность выявлять штаммы чумного микроба независимо от их плазмидного состава и фазы диссоциации. Было определено два гибридных клона Е6/Н8 и G11/F5. обладающих высокой диагностической ценностью. С помощью МКА этих Гибридомвозможно проведение дифференциальной диагностики методом чумного микроба с другими представителями семейства Enterobacteriaceae, включая все штаммы псевдотуберкулеза в S-, SO-форме и большинство штаммов в R-,RO-форме выращенных при 28 0С (табл. 2).

Изучение особенностей синтеза определяемого антигена у штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов в зависимости от вирулентности, температуры культивирования и фазы диссоциации возбудителей с использованием конкурентного ИФА установило, что его максимальный синтез имеет место у R-форм микроорганизмов, в большей степени у инвазивных форм У. pestls. Причем, у представителей каждой группы количество антигена на поверхности клетки значительно увеличивается после культивирования при 37 0С (рис.1).

Характер синтеза антигена в зависимости от вида микроорганизма, формы диссоциации и температуры культивирования (максимальный синтез при 37 °С - температуре тела теплокровного животного), а также преимущественный синтез его у инвазивных форм возбудителя чумы позволяют предположить участие данного антигена а адаптации возбудителя к условиям макроорганизма, а также в развитии инфекционного процесса при чумной инфекции.

Исследование гибридных клонов II группы на штаммах чумного микроба, выделенных из разных источников в различных природных очагах чумы и их вариантах, полученных в генетических экспериментах, показало, что они подуцируют МКА к фракции I чумного микроба и реагируют как с целыми бактериальными клетками, так и с очищенным препаратом. Однако уровень специфической активности МКА при взаимодействии с бактериальными клетками был значительно выше, чем с очищенным препаратом FI. Связано это, судя по всему, с тем.

Таблица 2

Исследование с помощью коноклоналышх антител кетодоы не пряной имыунофлуорасценцни штаммов чумного и псевдогуберкулезного микробов, находящихся в различных фазах диссоциации и выращенных при температуре 28 °С

Вид бактерий и яиссоцкатшш форма юс роста Всего исследовало штаммов ША, их разведение

Еб 611* •Ш F3 A3 В2 С4 * D4 А6- 612 A3 В2 С4* D4 Аб 612

:6000 1:25000

У.pestis

S-, so- 8 * ■ + -

li-, RO- 40 + ♦ +

Y. pseudotuberculosis 20 -

ft- 10 - -

1 ♦ -

0L~ 5 - -

"♦"-положительная иммунофлуоресценция, свечение с яркостью 3+Д+

"-"-отрицательная имкунофлуоресценция. свечение с яркость« 2+Д-+ - результаты испытания отдельных гибридом в каэдея группе идентичны

Рис. I Ингибирум:;ая активность разлитых .групп

, микроорганизмов при дозе антигена-конкурента

0,3х106 м.к./мл

По оси'абсцисс - группы" штаммов

1. у.репНв, н-^орла -40 штаммов

2, у.ревиз, з-форла - 8 штаммов ' з. У.р8еиаоЫЪегси1оз1а,Н-$01Ш - 16 ШТЭШ0В

4. у.роеиаогиЬегои1оз1э,з-$01ма - 20 штаммов По оси ординат - % инги<5ищш связывания моноклональншс антител антигеном-конкурентом

что в процессе очистки антигена воздействие химических и фивичес-ких факторов приводит к изменению структуры взаимодействующего эпитопа. Проявление антигенной специфичности, но на более низком уровне, можно объяснить тем, что формирование комплекса антиген-FI-антигело обусловлено наличием в структуре фракции I многократно повторяющихся идентичных антигенных детерминант. В процессе очистки они частично подвергаются разрушению и остается лишь незначительное число повторов детерминант, сохраняющих способность взаимодействовать с МКА. Установленный факт ставит под сомнение равнозначность иммунизации бактериями и препаратом очищенного антигена.' Наряду с этим, изменение структура иммунологически активных эпитопов антигена может исказить результаты, полученные при изучении серологической, иммунологической и протективной активности FI.

С помощью полученных МКА антиген FI выявлялся не только при 37 °С, но и при 28 °С, причем с большей эффективностью, чем существующие коммерческие диагностикумы на FI. Обработка МКА в НИМФ 28° -культур возбудителя чумы характеризовалась наличием в исследуемых мазках на фоне основной массы негативно реагирующих клеток единичных клеток с интенсивным специфическим свечением. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что одной из причин уменьшения количества FI при 28 0С является не снижение уровня синтеза антигена всеми клетками популяции, а выключением его у большей части при конститутивном синтезе антигена единичными клетками на уровне, который обнаруживается при 37 °С.

Способность препаратов МКА II группы более эффективно выявлять клетки, продуцирующие FI при 28 °С, по сравнению с коммерческими препаратами, является их преимуществом и укаьыгаот на высокую специфичность иммуноглобулинов. В перспективе этс свойство может быть использовано при необходимости быстрого тестирования бактерий в отсутствие специально выращенной 37° -культуры, а так-ве штаммов со сниженной продукцией FI.

При изучении иммунобиологической активности моноклональных антител I и II группы в опытах "ln vivo" получены данные, указывающие на способность МКА в комплексе с антигеном оказывать модулирующее действие на иммунный ответ. Установлено, что используемые МКА проявляют протективную активность при заражении »квотных вирулентным штаммом чумного микроба. Отмечена зависимость защит-

. ных свойств Ш от их концентрации, антигенной специфичности и сочетания ККА. Наибольшей протективной активностью обладали антитела, полученные к калсульному антигену возбудителя. Однако смесь ККА различной антигенной направленности обеспечивала защиту животных в большей степени, чем каждое MRA в отдельности. Представленные результаты говорят о необходимости комплексного воздействия на чумной микроб иммуноглобулинов различной специфичности для обеспечения более полной защиты макроорганизма от инфекции.

Механизм действия антител в регуляции иммунного ответа в настоящее время до конца не выяснен; однако определен ряд причин, обусловливающих реализацию этого механизма,которые правомерно использовать, как нам кажется, для объяснения наших результатов. К ним относятся агрегация антигена н блокирование детерминантных групп антигена специфическими антителами, уменьшение или увеличение антителолродуцирующих клеток в периферических лимфоидных органах в зависимости от концентрации вводимых антител, вовлечение комплексом антиген-антитело в регуляцию иммунного ответа макрофагов, а такае выработка на определенный ндиотип вводимого антитела антиидиотипических антител, которые обладают способностью влиять на иммунокомпетентные клетки и в зависимости от конкретных условий (например, концентрации идиослецифических антител) могут способствовать реализации двух противоположных эффектов: стимуляции или супрессии иммунного ответа (Кульберг А.Я.. 1986).

Изучение механизма иммуностимулирующего действия МКА, выполненное в опытах "In vitro", позволило установить, что стимулйция . защитных свойств макроорганизма происходит за счет индукции имму-нокомплексом МКА-антиген иммунного ответа лимфоцитов, а также снижения антифагоцитарных свойств микроорганизма.

Представленные данные, помимо теоретического, имеют практическое значение, так как демонстрируют возможность применения комплексов антитело-антиген для усиления гуморального ответа на слабоиммуногенные антигены нумного микроба, а также при разработке синтетических противочумных вакцин. Согласно концепции бифункциональных вакцин в состав последних," наряду с антигенной детер-минантой. должен входить стимулятор B-лимфоцита, то есть компонент. способствующий началу мембранных процессов во время превращения лимфоцитов в антителообразующие клетки. По-видимому, роль такого модулятора, в данном случае, выполняют полученные нами мо-

ноклональные антитела.

ВЫВОДЫ

1. Получено li стабильных гибридных культур, продуцирующих МКА к поверхностным антигенам чумного микроба. По антигенной специфичности МКА разделены на две группы: I группа МКА выявляет поверхностный антиген чумного микроба, синтез которого не зависит от температуры культивирования и плазмидного состава штаммов; II группа МКА специфически взаимодействует с капсульным антигеном У. pestls.

Z~. Поверхностный антиген чумного микроба, выявляемый I группой МКА, представлен в иммуноблоттинге двумя зонами, соответствующими фракциям с М.м. 23 ООО и 46 ООО Д.

3. Показано, что МКА I группы выявляют капсульные и бескап-сульные формы чумного микроба, выращенные при 37 °С и 28 °С. независимо от плазмидного состава штаммов и их диссоциации.

4. С помощью МКА I группы Е6/Н8 и G11/F5 оказалось возможный проведение дифференциальной диагностики методом НИМФ штаммов чумного микроба с другими близкородственными микроорганизмами (включая все штаммы псевдотуберкулеза в S-. SO-форме и большую часть их в R-. RO-форме) при температуре культивирования 28 °С.

5. Установлено, что экспрессия антигена, выявляемого МКА I группы, на поверхность микробной клетки Y.pestls и Y.pseudotuberculosis зависит от фазы диссоциации, инвазивности и температуры культивирования возбудителей. Максимальный уровень экспрессии отмечается при 37 °С у R-форм микроорганизмов, причем у . возбудителя чумного микроба в большей степени чем у У.pseudotuberculosis.

6. МКА. полученные к капсульному антигену чумного микроба, с большей эффективностью, чем существующие коммерческие диагносги-кумы, выявляют антиген FI, а также штаммы, синтезирующие капсуль-

. ный антиген, как при 37 °С, гак и при 28 °С.

7. В опытах "In vivo" показано, что полученные МКА способны обеспечить защиту животных при заражении вирулентным штаммом чумного микроба. Изучение механизма иммуностимулирующего действия МКА в опытах "In vitro" позволило установить, что специфические иммуноглобулины в комплексе с антигеном активируют процесс формирования антителообразующих клеток, а также спивают антифагоцитар-

ные свойства микроорганизма.

8. Установлено, что проявление защитных свойств исследуемых МКА зависит от их концентрации, антигенной специфичности и сочетания МКА. Для обеспечения более полной защиты макроорганизма от чумной инфекции показана необходимость комплексного воздействия на чумной микроб иммуноглобулинов различной специфичности.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние различных химических веществ на клонообразование плазмоцитому/ Алексеева Л. П.. Бурлакова 0. С., Козловский В. Н./. -.//Материалы IX научно-практической конференции "Актуальные вопро-СьГ'иммунологии и иммунопатологии в медицине и курортологии": Тез. докл. конф. - Пятигорск, 1987. - С. 175.

2. Обнаружение "фракции I" чумного микроба при помощи моноклональных антител/Алексеева Л.П., Фецайлова О.П., Гвозденко Н.П./.-//Проблемы медицинской и санитарной микробиологии города: Тез докл. конф, - Ростов-на-Дону, 1987. - С. 17-18.

3. Получение моноклональных антител к антигену "фракцияГ' чумного микроба и их использование для тестирования природных и экспериментальных ■ птаммоо иерсиний / Лебедева С. А., Алексеева Л.П., Васильева Е. А. /. -//Микробиология, лабораторная диагностика и специфическая профилактика карантинных инфекций. - Саратов, 1989. - С. 44-49.

4. Применение моноклональных антител" для дифференциальной диагностики типичных и атипичных штаммов чумного микроба/ Лебедева С. А., ■ Алексеева Л. П.. Иванова В. С. /. -// 2-я Всесоюзная конференция "Современные направления создания медицинских диагности-кумов".: Тес, докл. Всесоюз. конф. - М., 1990. -С. 14.

5. Диагностика капсульной бескалсульной формы чумного микроба с помощью моноклональных антител/Лебедева , С. А., Алексеева Л. П., Васильева Е. А., Иванова В. С. /. -//Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций: Тез. докл. Всесоюз. конф. - Оболенск, ¡990. - С. 71.

6. Влияние ростостимулирующих добавок на пролиферативную и клонообразующую способность миеломных клеточных линий/Алексеева Л. П.. Козловский В. Н., Бурлакова 0. С./.-//Известия Сев.-Кав. научного центра Высшей школы.-Ростов-на-Дону, 1991.- N3.- С. 115-120.

7. Сравнение протективной активности моноклональных антител,

полученных к различным антигенам чумного микроба/ Чернявская a.B. Лебедева С.А.. Алексеева Л.П./.// Организация эпиднадэора при чуме и меры ее профилактики: Маг. межгосударственной научно-практ. конф. - Алма-Ата, 1992. - С. 87-89.

8. Использование моноклональных антител для дифференциальной диагностики S- и R-форм чумного и псевдотуберкулевного микробов / Лебедева С.А., Иванова B.C., Алексеева Л.П. /.-// Организация зпиднадвора при чуме и меры ее профилактики:Мат. межгосударственной научно-практ. конф. - Алма-Ата. 1992.- С. 84-86.

9. Роль мышиных моноклональных антител различной специфичности в формировании иммунитета при чумной инфекции / Чернявская A.B., Лебедева С.А., Алексеева Л.П./.// 1-съе8Д иммунологов РОХСР: Тез.- Новосибирск. 1992. - С. 50-51.

10.'Влияние специфических моноклональных'антител на фагоцитоз чумного микроба б культуре макрофагов ин витро/ .// I съезд иммунологов PQDCP: Гее. - Новосибирск. 1992. - 50 с.

11. Изучение ' иммуномодудирующей функции чумных моноклональных антител в культуре мышиных спленоцитов "In vltro''/Ермоленко Т.Д..Алексеева Л.П./.-//Иммунология и специфическая профилактика оообо опасных инфекций:Мат.Рос.научи.конф.-Саратов,1993.-С. 7-8.

Подписано к печати //. 95 г.

tojwar Oy маги 60. х 84. I/I6; Бумаге офовтнэя. Начать ,о{согизя, Лвч. лист - /

Заказ -145И тираж -SOO Гии. РОДШИ