Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к F1 и V антигенам Yersinia Pestis для выявления возбудителя чумы

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к F1 и V антигенам Yersinia Pestis для выявления возбудителя чумы"

На правах рукописи

ИВАЩЕНКО ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К Fl И V АНТИГЕНАМ YERSINIA PESTIS ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехиологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 я НОЯ Z013

Оболенск- 2013

005540490

005540490

Работа выполнена в Федеральном «Государственный научный центр биотехнологии» Роспотребнадзора

оюджетном учреждении науки прикладной микробиологии и

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Шемякин Игорь Георгиевич Белова Елена Валентиновна

Официальные оппоненты:

Афанасьев Станислав Степанович, заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, заместитель директора по биотехнологии

Ерусланов Борис Васильевич, доктор медицинских наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии

Ведущая организация:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Защита состоится 20 декабря 2013 г. в 15 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан /^ноября 2013 г.

Учёный секретарь _ /

диссертационного совета ---Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Возбудитель чумы (Yersinia pestis) - один из наиболее вирулентных для человека микроорганизмов и единственный представитель бактерий, относящийся к возбудителям первой группы патогенности (Weekly epidemiological record, 2010).

В настоящее время возбудитель чумы обнаружен более чем в 200 видах диких грызунов, обитающих в очагах чумы на всех континентах, кроме Австралии и Антарктиды (Cui et al., 2008). Люди подвергаются инфицированию, вступая в контакт с зараженным животным. Чума может передаваться человеку при употреблении в пищу мяса инфицированных животных или при обращении с мясом инфицированных животных (Eppinger et al., 2010).

Патогенез чумы начинается с прикрепления бактерий к поверхности клеток-хозяев. После адгезии возбудитель очень быстро размножается. Бактерии в большом количестве вырабатывают факторы проницаемости, подавляющие фагоцитоз, такие как Fl, V, рНб-Аг. Массивная антигенемия, выброс медиаторов воспаления, в том числе и шокогенных цитокинов, ведёт к развитию микроциркуляторных нарушений, ДВС-синдрома с последующим исходом в инфекционно-токсический шок (Bartra et al., 2008).

В связи с вышесказанным, быстрая индикация возбудителя способствует оперативной организации и своевременному проведению противоэпидемических мероприятий, а при необходимости - выбору правильной стратегии лечения.

Лабораторная диагностика чумы построена на детекции возбудителя и его дифференциации от других представителей рода Yersinia. Для этого в основном используются микробиологические, серологические и биохимические методы исследования. Однако нередко возникают проблемы детекции возбудителя чумы и его дифференциации от близкородственного возбудителя Yersinia pseudotuberculosis (Лебедева и др., 2010; Попов и др., 2009).

В связи с этим возникает необходимость в разработке новых экспрессных методов диагностики, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении надёжности и лёгкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности.

Видоспецифическим антигеном чумного микроба, на выявлении которого базируется диагностика чумы, является капсульный антиген F1. Однако хорошо известно, что в природе существуют штаммы Y. pestis не продуцирущие F1 антиген, но при этом сохраняющие вирулентность (Winter et al., 1960; Schofield et al., 2012). Данный признак указывает на то, что F1 антиген не всегда является идеальной мишенью для определения возбудителя. Другой антиген чумного микроба - V антиген (LcrV), представляющий собой полинептид с

молекулярной массой 37 кДа, кодируемый геном IcrV в составе оперона IcrGVH, расположенного на плазмиде кальцийзависимости pCad, присутствующей у всех патогенных для человека иерсиний (Anisimov et. al., 2010). У возбудителя чумы и псевдотуберкулеза эта генетическая структура имеет высокую степень гомологии (Roggenkamp et al., 1997; Bergman et al., 1991), но при этом выявлены как небольшие видовые, так и внутривидовые различия в ее структурной организации и фенотипическом проявлении (Сухоносов И.Ю. Автореф. дис. ... канд. мед. наук, 2008). V антиген является высококонсервативным белком в эпидемически значимых штаммах Y. pestis (Светоч Т.Э. Автореф. дис. ... кавд. биол. наук, 2012) и может служить хорошей мишенью для индикации патогена.

Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Иммуноанализы на основе антител наиболее часто используемый тип диагностических тестов и остающийся одной из быстро развивающихся технологий при анализе биомолекул.

Одним из ведущих направлений в области совершенствования диагностических иммунотестов является введение в их состав моноклональных антител (МКА), обеспечивающих наиболее высокую чувствительность, специфичность и необходимый уровень стандартизации препаратов (Andreotti et al., 2003). Использование МКА в диагностических тест-системах в сравнении с поликлональными антителами обеспечивает получение более стабильных результатов при сохранении высокой чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МКА является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов в достаточно больших количествах (Абелев, 1998).

Цель исследования - создание высокочувствительных иммунодиагностических тест-систем для выявления возбудителя чумы на основе специфичных МКА.

Задачи исследования

1. Получить панели гибридом, стабильно продуцирующие высокоспецифичные МКА к V и F1 антигенам Y. pestis.

2. Изучить специфическую и перекрестную активность полученных МКА и оценить их диагностическую значимость в различных форматах иммуноанализа: непрямого ИФА, «сэндвич-ИФА», дот-блот анализа.

3. Разработать систему специфической визуализации взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне в реальном времени при идентификации Y. pestis.

4. Сконструировать диагностические тест-системы в формате латекс-агглютинации, иммуноферментного анализа и хМАР-технологии.

Научная новизна

Получена и охарактеризована панель МКА к V и FI антигенам чумного микроба. Подобраны диагностически значимые пары антител и показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем чумы.

Впервые с помощью метода атомно-силовой микроскопии разработана система специфической визуализации взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях при идентификации Y. peslis.

Впервые в России получены и охарактеризованы системы на основе МКА в формате латекс-агглютинации и хМАР технологии для идентификации F1 антигена Y. pestis и ИФА для обнаружения V антигена Y. pestis.

Теоретическая и практическая значимость работы

1. Получены и депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ - ОБОЛЕНСК») штаммы гибридных клеток - продуценты МКА к V и F1 антигенам Y. pestis.

2. На основе МКА сконструированы высокоспецифичные лабораторные образцы диагностических тест-систем в формате латекс-агглютинации и хМАР-технологии.

3. Изготовлены экспериментальные образцы иммуноферментной и латекс-агглютинационной тсст-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания,

4. Получены 4 Патента на изобретение - № 2460787 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 10G4 - продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F1 антигену Yersinia pestis»; № 2460788 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 13F8 — продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F1 антигену Yersinia pestis»; № 2478704 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2В8 - продуцент мопоклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis»; № 2478703 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 -продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis».

Методология и методы исследования

В работе использовались различные методы исследования: микробиологические (культивирование штаммов микроорганизмов), гибридомная технология, методы иммунохимии (ИФА, латекс-агглютинация, иммуно-блот), микроскопические.

Положения, выносимые на защиту

1. Полученные МКА к V и F1 антигенам Y. pestis являются перспективными иммунореагентами и могут быть использованы в различных иммунологических тестах детекции возбудителя чумы.

2. Использование метода атомно-силовой микроскопии позволяет визуализировать специфическое взаимодействие антиген-антитело на молекулярном уровне при выявлении Y. pestis.

3. Латекс-агглютинационная тест-система способна выявлять F1 антиген Y. pestis в чистых культурах чумного микроба в концентрации от 1x10s м.к./мл до 2х106 м.к./мл и выше и 4 нг/мл водорастворимого F1 антигена Y. pestis, что подтверждает диагностическую эффективность набора.

4. Разработанная тест-система иммуноферментная моноклоналыгая для выявления V антигена V. реьШ характеризуется высокой чувствительностью детекции V антигена 2 нг/мл и не выявляет клетки гомологичных микроорганизмов в концентрации 108 м.к./мл и ниже.

5. Разработанная тест-система в формате хМАР технологии детектирует капсульный Р1 антиген как в буферном растворе (до 6 пг/мл), так и в сыворотке крови (до 32 пг/мл), а также клетки возбудителя чумы в концентрации до 1х102м.к./мл.

Степень достоверности и апробация результатов

Материалы диссертации изложены и представлены на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» ФБУН ГНЦ Г1МБ, (Оболенск, 2010); III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2011г) (3-место в конкурсе молодых ученых); III научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов НИО Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», ФБУН ГНЦ ПМБ, (Оболенск, 2011); IV Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2012г); 7-м Европейском конгрессе по тропической медицине и международному здравоохранению (Барселона, Испания, 2012г); V Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2013г).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 25 марта 2010 г., протокол №3, с изменениями, утвержденными Ученым советом от 11 сентября 2013 г., протокол №7.

Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ГНЦ ПМБ 4 июля 2013 г., протокол № 31.

Публикации

Результатом научной работы являются 11 публикаций по теме диссертации, включающие одну статью, опубликованную в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК, четыре Патента РФ на изобретение: №2460787 С1 РФ и № 2460788 С1 РФ от 28.07.2011; № 2478703 С1 РФ и № 2478704 С1 РФ от 20.12.2011) и 7 тезисов.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 217 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования с их обсуждением, заключение, выводы, список сокращений и список литературы, приложения Работа иллюстрирована 15 рисунками и 18 таблицами. Приложения состоят из одной статьи, опубликованной по теме диссертации, четырех Патентов и протокола технических испытаний.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Штаммы микроорганизмов

В работе были использованы 32 штамма возбудителя чумы и 46 штаммов близкородственных и гетерологичных микроорганизмов, полученных из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ-Оболенск») ФБУН ГНЦ ПМБ, из коллекции музея живых культур ФКУЗ Иркутского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора и из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора (г. Саратов).

Для повышения продукции капсулыюго антигена Fl культуры Y. pestis выращивали на агаре Хоттингера (pH 7,2) с добавлением 3 % дефибринированной крови при температуре 37 °С в течение 72 часов. Для секреции LcrV культуры Y. pestis и близкородственных иерсиний индуцировали в условиях низкой концентрации кальция (< 2 мМ) на питательной среде для определения потребностей чумного микроба в ионах кальция (пр-во ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, регистрационное удостоверение ФСР 2011/11609), pH 7,2, содержащей MgCl2 в количестве 4 г/л, - аналоге среды Хигучи-Смита - в течение 48 ч при температуре 37 °С.

Получение гибридом

Мышей линии BALB/c иммунизировали рекомбинантными антигенными препаратами V и Fl, любезно предоставленными д.мл. Дентовской С.В. (ФБУН ГНЦ ПМБ). Иммунизацию проводили по следующей схеме: 0 день - 100 мкг антигена в ФСБ, эмульгированного в ПАФ подкожно; 21 день - 50 мкг антигена в ФСБ, эмульгированного в НАФ подкожно; 51 день - 100 мкг антигена в ФСБ внутривенно; 58 день - 100 мкг антигена в ФСБ внутривенно. Проверку титра специфичности антител у иммунизированных мышей проводили твердофазным ИФА по методу Егорова A.M. (Егоров и др., 1991). Гибридизацию проводили по стандартной методике (Catty et al., 1991). Первичный скрининг полученпых гибридом, продуцирующих специфические антитела, проводили в ИФА. Мышей линии BALB/c обрабатывали приставом («Sigma», США) и вводили интраперитонеально по Ю10 гибридных клеток.

Выделение МКА из асцитной жидкости проводили на колонке Protein G Sepharose согласно рекомендации производителя («Pharmacia Biotech», Швеция). Чистоту препаратов антител оценивали в SDS-PAGE электорофорезе в 10% геле в денатурирующих условиях по методу Laemly (Laemly, 1970). Количество белка оценивали спектрофотометрически при длине волны 278 нм (спектрофотометр SmartSpecPIus, «Bio-Rad», США).

Определение специфической и перекрестной активности МКА в отношении клеток Y. pestis, а также близкородственных и других видов микроорганизмов проводили методом дот-блот анализа.

Определение подклассовой принадлежности проводили с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител («Envirologix», США).

Подбор пар МКА проводили в двухсайтовом дот-блот анализе. Биотинилирование антител проводили по методу Duk М. (Duk, 1994) при помощи биотин-Ы-гидросукцинимидаого эфира («Sigma», США).

Визуализацию взаимодействия антиген-антитело проводили на атомно-силовом микроскопе Nanoscope Illa (Digital Instruments, США) в режимах постоянного и прерывистого контакта. При измерениях в контактном режиме сканирования использовали коммерческие кантилеверы из нитрида кремния (Si3N4) с жёсткостью 0,06, 0,32, 0,58 и 0,12 Н/м. Для измерений в режиме прерывистого контакта на воздухе использовали коммерческие кантилеверы из кремния с номинальной жесткостью 42 Н/м. Резонансная частота сканирования лежала в диапазоне 280-310 кГц. Измерения в жидкости проводили с использованием жидкостной ячейки (Digital Instruments, США) для режима прерывистого контакта, применяя коммерческие кантилеверы из нитрида кремния жесткостью 0,58 Н/м, при частоте сканирования 8-10 кГц.

Приготовление чумных иммунопероксидазных конъюгатов

Коньюгаты получали методом перйодатного окисления по Nakane (Nakane & Kavvaoi, 1974). Рабочий титр и чувствительность иммунопероксидазных конъюгатов определяли по методике M.Clark, A. Adams (Clark & Adams, 1977) в «сэндвич»-варианте ИФА, используя микропланшеты для иммунологических реакций.

Для конструирования латекс-агтлютинацнонной тест-системы в

качестве твердого носителя МКА использовали полиакролеиновые частицы марки А-63-22, синтезированные в Институте биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Иммобилизацию МКА на латексных частицах осуществляли согласно инструкции производителя. Реакцию латекс-агглютинации проводили в 96-луночных планшетах с V-образным профилем лунок (Greiner Bio-one, Германия).

При разработке тест-системы в формате иммуноферментного анализа для выявления V антигена Yersinia pestis использовали полученную ранее пару МКА 5G6 и 2В8 к V антигену Y. pestis, проявивших наибольшую активность в отношении V антигена в дот-блот анализе. Чувствительность и специфичность тест-системы исследовали путем постановки ИФА с использованием штаммов чумного микроба и близкородственных микроорганизмов в восьмилуночных стрипованных планшетах с сорбированными на их поверхности МКА к V антигену Y. pestis. Образующийся комплекс антитело-антиген выявлялся с помощью пероксидазного коньюгата на основе МКА 5G6 по появлению голубого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора. При помощи микропланшетного спектрофотометра измеряли ОП каждой лунки планшета при длине волны 450 нм через 5 минут после добавления стоп-

реагента. Положительным считали образец со значением ОП в 2 и более раз превышающим значение ОП отрицательного контроля.

При конструировании тест-системы в формате хМАР-технологии в качестве твердого носителя МКА использовали флуоресцентно окрашенные полистироловые микросферы №50, содержащие на своей поверхности карбоксильные группы (Bio-Rad, США). В качестве связывающих антител использовались МКА 13F8 к Fl антигену Y. pestis. В качестве детектирующих -биотинилированные МКА 10G4.

Иммобилизацию МКА осуществляли с помощью кита «Bio-Plex Amine coupling Kit» согласно прилагаемой инструкции. Анализ проводили в 96-ти луночных планшетах с фильтрующим дном. Предел обнаружения тест-системы оценивали, используя в качестве исследуемых образцов суспензию инактивированных микробных клеток Y. pestis и препарат рекомбинантного Fl антигена Y pestis в заданных концентрациях в двух модельных системах (в ФСБ и в сыворотке крови мышей). Учет результатов производили с помощью системы Био-Плекс 200 (Bio-Rad, США).

Результаты исследований и обсуждение

Получение и отбор перспективных МКА

Наиболее важным этапом работы являлся отбор гибридных клеток с перспективой дальнейшего использования полученных МКА в качестве компонентов иммунодиагностических тест-систем.

В результате гибридизации с использованием миеломной клеточной линии X63-Ag8.653 и спленоцитов мышей было получено около 250 гибридов к Fl антигену Y. pestis и около 200 гибридов к V антигену У. pestis.

По результатам первичного скрининга для дальнейшей работы были отобраны 6 наиболее продуктивных, генетически стабильных гибридом -13F8, 11G11, 9Е8, 11F5, 10G4 и 9С6 к Fl антигену К pestis и 3 гибридомы -1Е8, 2В8 и 5G6, продуцирующие МКА к V антигену Y. pestis.

С целью отбора клонов гибридом, перспективных в качестве источников МКА для разработки иммунодиагностических тест-систем, была проведена проверка специфической активности МКА методом дот-блота с использованием штаммов возбудителя чумного микроба и близкородственных микроорганизмов.

Исследование специфической активности МКА к Fl антигену Y. pestis показало, что все полученные МКА обладали выраженными видоспеспецифичными свойствами и давали положительную реакцию только с культурами Y. pestis, связывая капсульный Fl антиген, секретируемый только штаммами чумного микроба, и не вступали в реакцию с другими антигенами тестируемых микроорганизмов. Но наиболее активными оказались МКА гибридом 13F8 и 10G4, которые выявляли все 17 использованных в анализе штаммов Y. pestis в концентрации 107- 106 м.к./мл (табл. 1).

Таблица 1 - Исследование специфической и перекрестной активности

МКА к антигену К реж/и методом дот-блот анализа_

_ МКА к Б1 антигену _

10С4 | 1Ш11 1 9Е8 1 11Р5 | 9Сб 113Р8

Штаммы микроорганизмов минимальная выявляемая концентрация

микроо зганизмов (M.t :./mji)

Y. pestis И-2377 106 10' 10s Ii)' - 106

Y. pestis И-2422 106 10' 108 10' 108 106

Y. pestis И-1988 106 10' - 10' - 106

Y. pestis И-2638 10' 10' - 10' - 10"

Y. pestis 1559 106 10' - 10' - 10"

Y. pestis И-2359 106 10' - 10' 108 10'

Y. pestis И-2705 10' 10' - 10' - 107

Y. pestis 403 10' 10' - 10' - 106

Y. pestis И-3546 10" 10' - 10' - 10"

Y. pestis EV НИИЭГ (F1+) 10' 10' - 10' - 10'

Y. pestis 262-264 107 10' 10" - 10' 10'

Y. pestis И-3558 10' 108 10s - 10' 10'

Y. pestis И-3562 106 10; 108 - 10' 106

Y. pestis 1371 106 10; 10s 108 10' 10"

Y. pestis И-3551 10" 10' 10й 108 10' 10"

Y. pestis И-3554 . 106 10s 108 108 10' 10°

Y. pestis И-3557 10" 10" 108 108 10' 10"

Y. pseudotuberculosis И-722 — — - - -• -

Y. pseudotuberculosis И-53 — - - - - -

Y. pseudotuberculosis И-716 - - - - - -

Y. pseudotuberculosis И-748 - - - - - -

Y. pseudotuberculosis 185 — - - - - -

Y. enterocolitica И-131 - - - - - -

Y. enterocolitica И-76 — - - - - -

S. Oranienburg 595 - - - - - -

S. typhimurium 21 - - - - - -

К coli 1257 - - - - - -

К coli 3912/41 — - - - -

Примечание: (-) - отсутствие реакции

Таким образом, реакционная способность и активность МКА 13Р8 и 1(Ю4 позволяет считать их потенциально пригодными для использования в качестве средства контроля за Б1 антигеном чумного микроба.

Поскольку получение высокоспецифических МКА к липополисахариду Y. pestis — чрезвычайно сложная задача ввиду его низкой иммуногенности (Priop & Titball, 2002), то в наших исследованиях в качестве дополнительной мишени при получении МКА мы использовали V антиген.

Как уже было отмечено выше, все три вида патогенных для человека иерсиний (К pestis, Y. pseudotuberculosis, и Y. enterocolitica) содержат 70 kb плазмиду вирулентности (pYV) с гомологичной нуклеотидной последовательностью от 55 до 90 % (Roggenkamp et al., 1997; Portnoy & Martinez, 1985). Поэтому дифференциация двух близкородственных и высокогомологичных видов рода иерсиний - чумного микроба (I группа патогенности) и значительно менее опасного возбудителя псевдотуберкулеза (III группа патогенности) важна при мониторинге природных очагов чумы.

В связи с этим для подтверждения диагностической ценности МКА к V антигену тестировали на расширенной панели штаммов близкородственных микроорганизмов, подготовленных сотрудниками лаборатории микробиологии чумы ФКУЗ Иркутского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора.

МКА, продуцируемые гибридомами 5G6 и 2В8, активно взаимодействовали с 24 индуцированными штаммами Y. pestis в концентрациях 106 и 107 м.к./мл, что указывает на их достаточную активность по отношению к искомому возбудителю. Положительный сигнал с бесплазмидной культурой К pestis И-2377 (LcrV~) в дот-ИФА не регистрировался.

По результатам дот-блот анализа МКА 5G6 и 2В8 не взаимодействовали с клетками гомологичных микроорганизмов в концентрации 108 - 106 м.к7мл (табл. 2), а при увеличении концентрации микробных взвесей близкородственных микроорганизмов до 109 м.к./мл и выше наблюдался слабый положительный сигнал. Из полученных результатов можно предположить, что уровень выработки V антигена гомологичными микроорганизмами во много раз ниже, чем у возбудителя чумы.

Определение подклассовой принадлежности показало, что все полученные в ходе работ гибридомы продуцируют иммуноглобулины подклассов G. Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях. Молекулярные массы тяжелых цепей МКА 2В8 и 10G4 составляют 53 кДа, МКА 13F8 и 5G6 - 52 кДа. Молекулярные массы легких цепей МКА 2В8 и 10G4 составляют 26 кДа, МКА 13F8 и 5G6 - 23 кДа (рис. 1).

Таблица 2 - Исследование специфической и перекрестной активности МКА к V антигену У. pestis

№ п/п Штаммы микроорганизмов MKAKV антигену № п/п Штаммы микроорганизмов МКА к V антигену № п/п Штаммы микроорганизмов МКА к V актигену

1Е8 | 2BS | 5G6 1Е8 | 2В8 | 5G6 1E8 ] 2B8 | SG6

мшшм. выявляемая концентрация микроорганизмов (м.к/мл) миним. выявляемая хондапрация микроорганизмов (м.кУмл) миним. выявляемая концентрация микроорганизмов (м.кУмл)

1 У. pestis EV НИИЭГ 10" 10' 10' 22 У. pestis И-3556 - 10* 10' 43 У. pseudotuberculosis 1158 - 10* 10*

2 У. pestis И-262-264 ю" 10'' 10' 23 У. pestis И-3557 - 10' 10' 44 У. pseudotuberculosis И-40 - 10* 10*

3 У. pestis И-2422 - 10' 10" 24 У. pestis И-3559 - 10' 10' 45 У. pseudotuberculosis И-52 - 10* 10*

4 У. pestis И-1988 - 10' 10" 25 У. pestis И-2377 - - - 46 У. pseudotuberculosis И-90 - 10* 10*

5 У. pestis И-2638 ю" ю4 ю1' 26 У. pseudotuberculosis И-53 - 10a 10* 47 Y. pseudotuberculosis И-159 - 10* 10*

6 У. pestis 1559 - 10ь ю' 27 У. pseudotuberculosis 19 - 10й 10* 48 У. pseudotuberculosis И-185 - 10* 10*

7 Y.peslis И-2359 - 10' ю' 28 У. pseudotuberculosis И-594 - 10* 10* 49 У. pseudotuberculosis И-711 - 10* 10'

8 У. pestis И-2705 - ю1' ю' 29 У. pseudotuberculosis 58 (pCad") - 10* 10* 50 У. pseudotuberculosis И-716 - 10* 10*

9 К peslií И-403 - 10' 10' 30 У. pseudotuberculosis Л-926 - 10* 10* 51 У. pseudotuberculosis И-718 - 10* 10'

10 У. pestis 1528 - ю1' 10' 31 У. pseudotuberculosis 629-3290 - 10* 10* 52 У. pseudotuberculosis И-722 - 10* 10"

11 У. pestis 1464 - 10' 10" 32 У. pseudotuberculosis 58 (pCad*) - 10* 10* 53 У, pseudotuberculosis И-748 - 10* 10'

12 Y. pestis И-3546 - 10'' 106 33 У. pseudotuberculosis 1384 - 10* 10* 54 У. enteroeolitica И-131 - 10* 10"

13 У. pestis И-3561 - ю4 10' 34 У. pseudotuberculosis 33 - 10* 10* 55 У. enteroeolitica И-76 - 10* 10*

14 У. pestis И-3563 - 10ь 10" 35 У. pseudotuberculosis 37 - 10* 10* 56 У. enteroeolitica 10 - 10* 10*

15 К pestis И-3567 - 106 10' 36 У. pseudotuberculosis 87 - 10* 10* 57 У. enterocolitica Серотип 0:3 pCad" - 10* 10*

16 У. pestis И-3568 - 10° 10' 37 Y. pseudotuberculosis 448 - 10* 10* 58 У. enterocolitica Серотип 0:9 pCad+ - 10* 10*

17 Y.peslis 1371 - 10" 10' 38 Y. pseudotuberculosis 455 - 10* 10* 59 У. enterocolitica pCad+ - 10* 10»

18 У. pestis 625(44) - 104 10' 39 У. pseudotuberculosis 460 - 10* 10* 60 Esherihia coli 3912/41 - 10* 10*

19 У. pestis 1680Р- - 10' 10' 40 У. pseudotuberculosis 465 - 10* 10* 61 E. coli 1257 - 10* 10*

20 У. pestis И-3455 - ю' 10' 41 У. pseudotuberculosis 763 - 10* 10* 62 & oranienburg 595 - - -

21 У. pestis И-3555 - ю' ю' 42 У. pseudotuberculosis 1143 - 10' 10' 63 5. iyphimurium 21 - - -

Примечание: (-) - отсутствие реакции

SDS-PAGE электрофорез МКА

Подклассы МКА

55 кДа

26 кДа

Г

13FS 10G4 М 2BS 5G6

13F8 юсч :В8

В

Рисунок 1 - Характеристика моноклональных антител.

А - Определение молекулярной массы легких и тяжелых цепей, (М -маркер молекулярного веса); В - Определение подклассов МКА с помощью иммунохроматографических стрипов

Основной задачей при разработке тест-систем являлось получение и селекция специфичных пар антител, пригодных для применения в том или ином формате иммуноанализа. Подбор диагностически значимых пар МКА осуществляли методом двусайтового дот-блот анализа. В результате было установлено, что пары МКА гибридных клонов 2В8, 5G6 и 10G4, 13F8 являются оптимальными при совместном использовании и могут быть использованы в качестве компонентов для создания тест-систем.

Для визуализации специфического взаимодействия антиген-антитело использовали метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), основанный на принципе механического сканирования образцов без применения предварительного напыления металлов и облучения фотонами и электронами.

Для специфической визуализации взаимодействия антиген-антитело МКА 10G4 к F1 антигену Y. pestis были иммобилизованы непосредственно на твердой подложке через связывание антител белком G. Белок G специфически узнает и связывает Fc-фрагменты антител.

Для исследования использовали клетки У. pestis штамма И-2422 с концентрациями Ю4 м.к./мл, 107 м.к./мл и 105 м.к./мл.

На рисунке 2 представлены АСМ изображение клеток Y. pestis после их предварительной инактивации и профиль клетки.

Причем единичные клетки визуализировались вплоть до концентрации исходного препарата 103 м.к./мл.

0 1 2 3 4 5 dX. 2.5l713jjm dY: 320.285 nm

Рисунок 2 - ACM изображение клеток У. pestis и их размеры (профиль).

А - Активированная в тлеющем разряде слюда (0,2 мА, 1 мин.) - белок G (10 мклОЛ г/л, 10 мин, затем промывка в 100 мкл воды)-МКA 10G4kF1 антигену Y. pestis (10 мкл 0.1 г/л, 10 мин) - клетки Y. pestis 109 м.к./мл (затем промывка погружением в трис-HCl буфер, высушивание и промывка каплей воды); В -График расчета физического размера объектов взаимодействия

Для изучения специфического связывания фрагментов бактерий с аффинной поверхностью нами была предложена следующая структура этой поверхности: активированная слюда - белок С - антитело 1004. Активированная в тлеющем разряде слюда улучшает адсорбцию на нее белка С, который в свою очередь увеличивает степень адгезии на него антител (в силу их специфического взаимодействия). На рисунке 3 показана специфическая визуализация Р1 антигена У. ре-у/лу.

0 0.4 0.8 1.2 Line: 367 dX: 1.08108 |jmdY:

А В

Рисунок 3 - Специфическая визуализация И антигена К ре.«/«.

А - Активированная в тлеющем разряде слюда (0,2 мА, 1 мин.) - белок О (10 мкл 0.1 г/л, 10 мин, затем промывка в 100 мкл воды) - МКА 10С4 к Р1 антигену У. реяйя (10 мкл 0.1 г/л, 10 мин) - Р1 антиген (белок) (10 мкл 0.05 г/л, 10 мин) (затем промывка погружением в трис-НС1 буфер, высушивание и промывка каплей воды); В - График расчета физического размера объектов взаимодействия

Нам также удалось показать наличие специфического связывание антигена с антителами в системе, где сначала на подложке фиксировали антиген, а затем добавляли антитело (рис. 4).

Рисунок 4 - Специфическая АСМ визуализация взаимодействия антиген - антитело.

Активированная в тлеющем разряде слюда (0,2 мА, 1 мин.) - антиген (белок) (10 мкл 0.1 г/л, 10 мин, затем промывка в 100 мкл воды) - МКА 10G4 к F1 антигену Y. pestis (10 мкл 0.01 г/л, 10 мин, затем промывка в капле воды)

Белые точки на рисунке 4 - это антитела, специфически связавшиеся с подложкой из антигена. Их размер составляет около 10 нм, что соответствует их истинной величине.

Таким образом, в ходе проведенных работ было показано, что полученные МКА к F1 и V антигенам Y. pestis обладают характеристиками, позволяющими использовать их с высокой эффективностью в качестве компонентов современных иммунодиагностических тест-систем для выявления микробных клеток данного возбудителя.

Конструирование диагностических тест-систем

Разработка новых универсальных, высокоэффективных и чувствительных способов ранней диагностики чумной инфекции является актуальной проблемой здравоохранения.

Таким образом, важность представленной диссертационной работы обусловлена необходимостью повышения достоверности, чувствительности и скорости выявления возбудителя. В данной работе внимание было сосредоточено на разработке тест-систем на основе МКА в формате латекс-агглютинации, иммуноферментного анализа и хМАР технологии.

Разработка латекс-агглютинационной тест-системы для выявления капсульного F1 антигена Yersiniapestis

По результатам дот-блот анализа для конструирования латексной тест-системы были выбраны МКА 10G4, которые специфически взаимодействовали с F1 антигеном Y. pestis и не давали перекрестных реакций с другими микроорганизмами. Оптимальная нагрузка МКА 10G4 на латексных частицах составила 20 мкг на 50 мкл исходной латексной суспензии. Полученный диагностикум апробировали в реакции латекс-агглютинации (РЛА), использовав обеззараженные взвеси микроорганизмов. В качестве положительного контроля использовали рекомбинантный F1 антиген и клетки штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, выращенные при температуре 37 °С. Таким образом, были выявлены чувствительность и специфичность латексного диагностикума. В результате проведенной РЛА установлено, что латексные частицы с иммобилизованными МКА 10G4 выявляют F1 антиген в концентрации 0,004 мкг/мл. Активность диагностикума с типичными штаммами возбудителя чумы, выращенными при 37 °С, составила 7,4x105 м.к./мл. Полученный латексный препарат не выявлял культуры близкородственных и гетерологичных микроорганизмов в концентрации 5 х 107 м.к./мл и ниже (рис. 5).

3

4

5

6

7

8 9

Рисунок 5 - Определение чувствительности и специфичности полученного диагностикума в реакции латекс-агглютинации.

1 - капсульный F1 антиген Y. pestis, 2 - Y. enterocolitica 287, 3 - Y. pestis EV НИИЭГ (37°C), 4 - Y. pseudotuberculosis III, 5 - E. coli ATCC 25922, 6 - 5". enteritidis Gartneri 30, 7-5. paratyphi «В» 61951, 8 - Sh. flexneri 8516, 9 - Sh. dysenteriae 38

Для увеличения срока хранения полученного диагностикума латексная суспензия с иммобилизованными МКА 10G4 была лиофилыю высушена.

Установлено, что по чувствительности и специфичности лиофилыю высушенный латексный препарат не уступает исходной жидкой латексной суспензии с иммобилизованными МКА 10G4, и может быть использован в качестве компонента набора реагентов для определения F1 антигена Yersinia pestis в реакции латекс-агглютинации.

На основании выполненной работы был разработан и утвержден комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению и технические условия (ТУ 9388-136-78095326-2011) на диагностикум «Набор реагентов для определения капсулыюго F1 антигена Yersinia pestis в реакции латекс агглютинации».

Комиссионные испытания экспериментальных образцов сконструированного латексного диагностикума были проведены на базе ФКУЗ Иркутского и Ставропольского научно-исследовательских противочумных институтов Роспотребнадзора. Чувствительность и специфичность латексного чумного диагностикума определяли в РЛА, используя 11 штаммов Y. pestis, 5 штаммов близкородственных микроорганизмов рода Yersinia и 2 штамма микроорганизмов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae. В качестве положительного контроля использовали препарат капсулыюго F1 антигена Y. pestis, входящий в комплект латексного чумного диагностикума. Результаты исследования чувствительности и специфичности полученного чумного латексного диагностикума представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты определения чувствительности и специфичности латексного чумного диагностикума в реакции латскс-агглютинацин______

Минимальная

№ п/п Наименование штамма выявляемая Результаты

концентрация микроорганизмов (м.к./мл) реакции латекс-агглютинации

1 Y. pestis И-2377 105 ++++

2 Y. pestis И-2422 2x106 +++

3 Y. pestis И-1988 5х105 ++++

4 Y. pestis И-2638 2^106 +++

5 Y. pestis 1559 106 ++++

6 Y. pestis И-2359 2x10" +++

7 Y. pestis И-2705 2х106 +++

8 Y. pestis 403 2x106 +++

9 Y. pestis И-3546 2хЮ6 +++

№ п/п Наименование штамма Минимальная выявляемая концентрация микроорганизмов (м.к./мл) Результаты реакции латекс-агглютинации

10 Y. pestis EV F1+ 2хЮ6 +++

11 Y. pestis EV F Г 1х109 Не выявляет

12 Y. pseudotuberculosis И-722 1хЮ9 Не выявляет

13 Y. pseudotuberculosis И-53 1хЮ9 Не выявляет

14 Y. pseudotuberculosis И-716 1хЮ9 Не выявляет

15 Y. enterocolitica И-131 1хЮ9 Не выявляет

16 Y. enterocolitica И-76 lxlO9 Не выявляет

17 E. coli 3912/41 lxlO9 Не выявляет

18 S. typhimuirium 21 lxlO9 Не выявляет

В результате проведенного анализа установлено, что лиофильно высушенная латексная суспензия с адсорбированными МКА выявляет исследованные штаммы возбудителя чумы в концентрациях от 105 м.к./мл до 2х106 м.к./мл и выше и не имеет перекрестной активности с близкородственными и гетерологичными микроорганизмами. Предел обнаружения капсульного F1 антигена составил 0,004 мкг/мл (4 нг/мл).

Конструирование тест-системы в формате хМАР технологии

С целью обнаружения антигена чумного микроба, представленного в сыворотке крови в более низких концентрациях, чем это возможно определить другими иммунологическими методами, нами был проведен анализ с применением технологии хМАР. Разрабатываемая тест-система на основе хМАР технологии является разновидностью «сэндвич»-варианта ИФА метода, в котором связывающие антитела иммобилизованы на твердом носителе -полистирольных гранулах (микросферах) диаметром 5,6 мкм. При разработке тест-системы использовали карбоксилированные микросферы, имеющие спектральный адрес 50. Оптимальная нагрузка МКА 13F8 к F1 антигену Y. pestis на полистироловых микросферах составила 50 мкг. Эффективность иммобилизации МКА на микросферах проверяли с помощью антивидовых (антимышиных) антител, меченых фикоэритрином (Sigma, США) по сигналу флуоресценции.

В качестве тестируемого материала использовали сыворотку крови мыши с экспериментально внесенным F1 антигеном Y. pestis. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку без добавления F1 антигена.

Параллельно проводили анализ с использованием в качестве образцов растворы рекомбинантного F1 антигена Y. pestis в ФСБ для сравнения

чувствительности тест-системы в буферном растворе и биологическом материале.

Учет результатов проводили с помощью проточного флуориметра Био-Плекс 200. Результаты анализа представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Результаты определения Р1 антигена К рс\йх в буферном растворе и в биологическом материале __

Концентрация F1 антигена (на мл) Определение F1 антигена в буферном растворе, значение MFI Определение F1 антигена в сыворотке крови, значение MFI

0,5 мкг 324,5 180

0,1 мкг 263,0 127,5

0,02 мкг 89,5 59,5

4 нг 39,5 29,5

0,8 нг 28,0 22,0

160 пг 27,0 19,5

32 пг 23 16,5

6,4 пг 19 12

КГ 5,5 10

Условия проведения иммунофлуоресцентного анализа позволили достичь предела обнаружения F1 антигена возбудителя чумы при использовании в качестве исследуемых образцов биологического материала (сыворотки крови животных) 32 пг/мл. Чувствительность данной тест-системы в отношении F1 антигена в буферном растворе составила 6,4 пг/мл.

Значения сигналов флуоресценции, соответствующих данной концентрации F1 антигена, не менее чем на 5 ед. инт. превышают значение отрицательного контроля.

Эти показатели значительно ниже уровня, требуемого в клинических испытаниях, в которых концентрация F1 антигена в положительном образце сыворотки часто достигала нескольких микрограммов на миллилитр [Cao et al., 1995].

Для определения чувствительности тест-системы в отношении микробных клеток Y. pestis, использовали в качестве исследуемого материала суспензию инактивированных клеток штамма Y. pestis И-1988, получая суспензии с концентрацией 1х107, lxlO6, 1хЮ5, 1><104, 1*103, lxlO2, lxlO1 (м.к./мл), (табл. 5).

Таблица 5 - Результаты определение предела обнаружения тест-системы в отношении суспензии инактивированных микробных клеток У. рез(к__

Концентрация Y. pestis, (м.к./мл) Значение MFI

1хЮ7 2540

lxlO6 1654

1x10s 635

lxlO4 398

lxlO1 233

lxlO2 197

lxlO1 80

56,5

В результате анализа установлено, что предел обнаружения клеток возбудителя чумы методом иммунофлуоресцентного анализа достоверно составляет 1х102 м.к/мл. Значения сигналов флуоресценции, соответствующих данной концентрации микробных клеток Г. резИх не менее чем на 5 ед. инт. превышают значение отрицательного контроля.

Для изучения перекрестной активности тест-системы использовались рекомбинантные поверхностные антигены возбудителей особо опасных инфекций, полученные в ходе предыдущих работ, а также инактивированные культуры штаммов гомологичных и гетерологичпых микроорганизмов (табл.6).

Таблица 6 - Результаты определения перекрестной активности тест-системы с поверхностными антигенами возбудителей особо опасных инфекций, близкородственными непатогенными бациллами и

Исследуемые культуры Сигнал флуоресценции, ассоциированный с микросферами № 50 (средн. ед. инт.)

Y. enterocolitica И-76 15

Y. pseudotuberculosis И-53 15

Y. pseudotuberculosis И-748 16

Y. pseudotuberculosis 185 15

Y. pseudotuberculosis И-722 15

S. typhimurium 21 15

E. coli 1257 17

V антиген Y. pestis 16

К — 14 ед.инт.

В результате анализа установлено, что тест-система не обладает перекрестной активностью в отношении поверхностных антигенов возбудителей особо опасных инфекций, близкородственных и гетерологичных микроорганизмов, так как сигнал флуоресценции, ассоциированный с капсульным F1 антигеном не превышает более чем на 5 ед. инт. значение отрицательного контроля (К" равен 14).

По данным зарубежных исследователей средний уровень F1 антигена в крови пациентов, переболевших бубонной формой чумы, составлял 275 нг/мл, а количество клеток Y. pestis во время бактериемии достигало уровня от 106 до 108 м.к./мл (Tomaso et al., 2007). Полученные в данном исследовании показатели чувствительности хМАР тест-системы дают исследователю возможность ее использования для ранней диагностики чумной инфекции.

Разработка тест-системы иммуноферментной моноклональной для выявления V антигена Yersinia pestis

На основании проведенной работы по конструированию иммуноферментной тест-системы был разработан и утвержден комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению и технические условия (ТУ 9388-171-78095326-2012, ОКП 938890).

Были проведены межлабораторные медицинские испытания тест-системы иммуноферментной моноклональной для определения V антигена Y. pestis на базе ФКУЗ Иркутского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора в сооответствии с разработанной программой и инструкцией по применению тест-системы иммуноферментной для выявления V антигена Yersinia pestis и проектом ТУ 9388-171-78095326-2012.

Чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы определяли с использованием 9 штаммов Y. pestis, 7 штаммов близкородственных микроорганизмов рода Yersinia и 4 штаммов микроорганизмов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae (табл. 7). В качестве положительного контроля использовали рекомбинантпый препарат V антигена Y. pestis.

Таблица 7 - Определение чувствительности и специфичности тест-

№ п/п Наименование штамма Минимальная выявляемая концентрация микроорганизмов (м.к./мл)

1 Y. pestis 262-264 6*107

2 Y. pestis И-1988 Зх106

3 Y. pestis И-2638 2х106

4 Y. pestis 403 1,25хЮ8

5 Y. pestis EV НИИЭГ 1,25хЮ6

№ п/п Наименование штамма Минимальная выявляемая концентрация микроорганизмов (м.к,/мл)

6 Y. pestis 1528 1,25хЮ8

7 Y. pestis И-2359 6x10'

8 Y. pestis 1464 2x10"

9 Y. pestis И-2422 6x10'

10 Y. pseudotuberculosis 159 10у

11 Y. pseudotuberculosis И-53 10"

12 Y. pseudotuberculosis 185 10*

13 Y. pseudotuberculosis И-748 10у

14 Y. enterocolitica И-127 10у

15 Y. enterocolitica И-76 10"

16 Y. enterocolitica 10 10*

17 E coli 1257 Не выявляет

18 E coli 3912/41 Не выявляет

19 S. typhimurium 21 Не выявляет

20 S. Oranienburg 595 Не выявляет

В результате проведенной работы было установлено, что тест-система иммуноферментная для определения V антигена Y. pestis чувствительна и выявляет V антиген в концентрации до 2 нг/мл, а также микробные клетки девяти опытных культур Y. pestis в концентрации от 2* 10б м.к./мл до 1,25х108м.кУмл. Тест-система не выявляет клетки близкородственных микроорганизмов в концентрации 108 м.кУмл и ниже, и не обладает перекрестным взаимодействием с гетерологичными микроорганизмами.

Известно, что подавление провоспалительного ответа критично для патогенеза инфекции, вызванной Y. pestis. Для прогрессирования инфекции и супрессии TNF-a — ключевого фактора в патогенезе чумы, концентрация V антигена в биологических жидкостях должна достигать 50 иг/мл (Gomes-Solecki et al., 2005).

Проведенные исследования позволили составить диагностические наборы реагентов лабораторного образца тест-системы иммуноферментной моноклональной для определения V антигена Yersinia pestis.

Разработанная тест-система может быть использована для выявления клеток возбудителя чумы в дополнение к другим диагностическим методам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в рамках настоящей работы были получены МКА к F1 антигену чумного микроба, специфичные в отношении клеток У. pestis.

Учитывая факт, что у трех видов патогенных иерсиний наблюдается большая степень родства между отдельными детерминантами патогенности (> 90 %) (Ценева и др., 2002), то в данном случае, говоря об отсутствии у МКА к V антигену Y. pestis перекрестных реакций с гомологичными микроорганизмами в концентрации 10s м.к./мл и ниже, можно предположить, что речь идет о меньшей удельной продукции белка LcrV клетками Y. pseudotuberculosis и У. enterocolitica.

На основе полученных результатов с целью выявления возбудителя чумы разработаны и испытаны с использованием МКА латекс-агглютинациионная, иммуноферментная тест-системы, а также тест-система нового поколения — в формате хМАР технологии, позволяющая обнаруживать антиген чумного микроба, как в чистых культурах, так и в биологических пробах.

Полученные диагностические препараты могут применяться в лабораторной и клинической практике для осуществления эффективного эпиднадзора и предупреждения заболеваемости людей чумой.

ВЫВОДЫ

1. Получены и депонированы в государственную коллекцию ФБУН ГНЦ ПМБ штаммы гибридных клеток-продуценты МКА к V и F1 антигенам Y. pestis.

2. Получены и охарактеризованы МКА к возбудителю чумного микроба, характерные отсутствием перекрестных реакций с близкородствешшми микроорганизмами. Определены подклассы и подобраны диагностически значимые пары антител, показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем чумы.

3. Методом АСМ показаны взаимодействия инактивированных клеток У. pestis и рекомбинантного F1 антигена с моноклональными антителами 10G4 на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях.

4. На основе отобранных МКА сконструированы диагностические тест-системы в формате иммуноферментного анализа, латекс-агглютинации и хМАР технологии. Проведены исследования их чувствительности и специфической активности. Иммуноферментная и латекс-агглютинационная тест-системы успешно прошли комиссионные испытания и могут быть использованы для выявления клеток возбудителя чумы в качестве альтернативы или в дополнение к другим диагностическим методам.

5. Наибольшей чувствительностью определения чумного микроба обладает тест-система в формате хМАР технологии, детектирующая

капсульный Fl антиген Y. pestis как в чистых культурах (до 32 пг/мл), так и в биологических жидкостях (до 6 пг/мл), а также клетки возбудителя чумы в концентрации 102 м.к./мл и выше. Данный факт является основанием для рассмотрения вопроса о внедрении тест-системы в практику здравоохранения и использования в научных исследованиях.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

а) статьи в журналах, рекомендованных ВАК

1. Иващенко. Т.А. Разработка латекс-агглютинационной тест-системы для выявления капсулыюго антигена Fl Yersinia pestis / Т.А. Иващенко, E.B. Белова, C.B. Дентовская, С.А. Белькова, C.B. Балахонов, И.Г. Шемякин // Биотехнология. — 2012. — №6. — С. 76-85.

б) патенты

2. Пат. 2460787 Российская Федерация, МПК C12N 5/16, С07К 16/28, С12Р 21/08, А61К 39/00. Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 10G4 - продуцент моноклональных антител, специфичных к капсулыюму Fl антигену Yersinia pestis / Белова Е.В., Иващенко Т.А.. Игнашина E.H., Шемякин И.Г.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. -№ 2011131563/10; заявл. 28.07.11; опубл. 10.09.12, Бюл. № 25. - 14 с.

3. Пат. 2460788 Российская Федерация, МПК C12N 5/18, С12Р 21/08, С07К 16/21, G01N 33/569. Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 13F8 - продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному Fl антигену Yersinia pestis / Белова Е.В., Иващенко Т.А.. Игнашина E.H., Шемякин И.Г.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. - № 2011131566/10; заявл. 28.07.11; опубл. 10.09.12, Бюл. №25. - 15 с.

4. Пат. 2478704 Российская Федерация, МПК C12N 5/16, С12Р 21/08, С07К 16/28. Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2В8 -продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis / Белова Е.В., Иващенко Т.А.. Куценко А.К., Шемякин И.Г.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. -№ 2011151804/10; заявл. 20.12.11; опубл. 10.04.13, Бюл. №10.-15 с.

5. Пат. 2478703 Российская Федерация, МПК C12N 5/16, С12Р 21/08, С07К 16/28. Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 -продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis / Белова Е.В., Иващенко Т.А., Куценко А.К., Дятлов И.А., Шемякин И.Г.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение

науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. - № 2011151803/10; заявл. 20.12.11; опубл. 10.04.13, Бюл. №10. -15 с.

в) тезисы научных конференций

6. Иващенко Т.А. Получение моноклональных антител для обнаружения капсульного F1 антигена Yersinia pestis I Т.А. Иващенко, C.B. Дентовская, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Росгготребнадзора (25-27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. - Протвино: A-ПРИНТ ЗАО,

2010.-С. 322-323.

7. Иващенко Т.А. Получение моноклональных антител к V- и F1 антигенам Yersinia pestis и перспектива их применения в качестве компонентов диагностических тест-систем / Т.А. Иващенко, C.B. Дентовская, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Инфекционные болезни: Материалы III Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням (28-30 марта 2011 г., Москва) / Под ред. В.И. Покровского, -

2011.-С. 147.

8. Иващенко Т.А. Выявление капсульного F1 антигена Yersinia pestis методом иммуноферментного анализа / Т.А. Иващенко, C.B. Дентовская, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы III научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнддзора (31 мая -2 июня 2011 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. — Протвино: А-Принт ЗАО, 2011.-С. 187-188.

9. Иващенко Т.А. Конструирование латексного диагностикума на основе моноклональных антител для определения капсульного F1 антигена Yersinia pestis / Т.А. Иващенко, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Инфекционные болезни: Материалы IV Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням (26-28 марта 2012 г., Москва) / Под ред. В.И. Покровского. - Москва, 2012. — С. 161.

10. Shemyakin I.G., Development of diagnostics for determination of V- and F1 antigens of Yersinia pestis / Shemyakin I.G., Belova E.V., Ivaschenko T.A.. LunevaN.M. // Abstracts of the 7th European Congress on Tropical Medicine and International Health (3-6 October 2011, Barcelona, Spain). - Barcelona 2011. -№16.-P.248.

11. Иващенко T.A., Конструирование тест-системы иммуноферментной моноклональной для выявления V антигена Yersinia pestis / Т.А. Иващенко, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Инфекционные болезни: Материалы V

Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням (25-27 марта 2013 г., Москва) / Под ред. В.И. Покровского. - Москва, 2013. - С. 170.

Список сокращений, используемых в тексте

АСМ - атомно-силовая микроскопия

ГКПМ - Государственная коллекция патогенных микроорганизмов

ДВС—диссеминированное внутрисосудистое свёртывание

ИФА - иммунофементный анализ

кДа — килодалътон

м.к. - микробные клетки

МКА - моноклональные антитела

НАФ - неполный адъювант Фрейнда

ОП — оптическая плотность

ПАФ - полный адъювант Фрейнда

PJIA - реакция латекс-агглютинации

ФКУЗ РосНИПЧИ - Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт ФСБ - фосфатно-солевой буфер

BALB/c - популяция лабораторных мышей — альбиносов IcrV— структурный ген V антигена

MFI - mean fluorescence intensity (средняя интенсивность флуоресценции) pCad - 45-47 MDa плазмида, определяющая температурную зависимость роста иерсиний от ионов кальция, синтез V антигена и белков внешней мембраны TNF-a - tumor necrosis factor alfa (фактор некроза опухоли-альфа) Kb - kilobase (тысяча пар нуклеотидов)

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность своим научным руководителям д.б.н., профессору Шемякину И.Г. и к.б.н. Беловой Е.В. за оказание методической помощи при выполнении данной работы, а также за общую организацию и координацию работы.

Глубоко признательна заведующей лабораторией микробиологии чумы ФБУН ГНЦ ПМБ д.м.н. Дентовской C.B., с.н.с. отдела особо опасных инфекций, к.б.н. Шайхутдиновой Р.З. за консультации по проведению исследований и предоставленные материалы.

Выражаю искреннюю благодарность директору ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, д.м.н., профессору Балахонову C.B., а также с.н.с. лаборатории микробиологи чумы ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, к.б.н. Бельковой С.А. за предоставленные штаммы микроорганизмов и помощь в поведении испытаний разработанных тест-систем.

Приношу искреннюю признательность заведующему лабораторией нанобиотехнологии ФБУН ГНЦ ПМБ, д.б.н. Игнатову С.Г. за помощь при проведении экспериментов на разных этапах работы.

Благодарю всех сотрудников лаборатории молекулярной биологии, оказывавших помощь в проведении экспериментов.

Благодарю директора ФБУН ГНЦ ПМБ чл.-корр. РАМН, д.м.н., профессора Дятлова И.А. за предоставленную возможность защищать диссертацию в диссертационном совете Д 350.002.01 при ФБУН ГНЦ ПМБ.

Глубоко признательна ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, вопросы и рекомендации.

Подписано в печать:

18.11.2013

Заказ № 9152 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 \v\vw. аШ:огеГсга1. ги