Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная и генетическая характеристика V антигена Yersinia pestis

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная и генетическая характеристика V антигена Yersinia pestis"

005010226

СВЕТОЧ ТАТЬЯНА ЭДУАРДОВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА V АНТИГЕНА YERSINIA PESTIS

03.02.03-микробиология 03.01.06-биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

9 ОЕЗ Ш

Оболенск - 2012

005010226

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Анисимов Андрей Павлович кандидат медицинских наук Дентовская Светлана Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Гремякова Татьяна Андреевна кандидат биологических наук Воложанцев Николай Валентинович

Ведущая организация:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научноисследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

УуГ

Защита состоится «01» марта 2012 года в ~ ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии».

Автореферат разослан « 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Фурсова Н.К.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. V антиген (LcrV) - полифункциональный фактор патогенности и один из основных протективных антигенов иерсиний [Une, Brubaker, 1982]. Он представляет собой полипептид с молекулярной массой 37 кДа [Price et al., 1989], кодируемый геном IcrV, расположенным на плазмиде вирулентности (кальцийзависимости) патогенных для человека представителей рода Yersinia: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y enterocolitica. Установлено, что V антиген ингибирует хемотаксис нейтрофилов и запускает механизм супрессии провоспалительных цитокинов [Brubaker et al., 1984, Nakajima et al„ 1997]. Этот белок регулирует работу многокомпонентной системы секреции белков третьего типа (type 3 secretion system -T3SS) путем прямого влияния на собственно секрецию эффекторных белков Yop (Yersinia outer proteins) и опосредованно

- на транскрипцию их генов, а также на перенос белков-эффекторов внутрь эукариотической клетки-мишени [Bergman et al, 1991, Price et al., 1991].

Нуклеотидную последовательность гена IcrV из Y. pestis в 1989 г. опубликовал коллектив авторов из Университета Кентукки, США [Price et al., 1989]. Позднее шведские исследователи из Университета Умеа секвенировали аналогичный ген из Y. pseudotuberculosis [Bergman et al, 1991].

По полиморфизму структуры гипервариабельной области на N-конце молекулы в пределах 40-61 а.о. (TLR2 - активный район) V антигены делят на семь классов. Первый из них составляют последовательности белка Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, остальные шесть вариантов найдены только у Y. enterocolitica, причем отдельные структурные варианты отличаются по своей иммуносупрессивной активности [Sink et al., 2005].

V антиген является высококонсервативным белком в эпидемически значимых штаммах Y. pestis основного подвида subsp. pestis [Adair et al., 2000, Motin et al., 1992]. Вариации в нуклеотидных последовательностях гена IcrV описаны для штаммов неосновного подвида Y. pestis ("полевочьи" штаммы): Pestoides F [Adair et al., 2000] и 91001 [Song et al., 2004, Zhou et al., 2004], циркулирующих в Закавказском высокогорном очаге (Азербайджан, Грузия или Армения) и степях Внутренней Монголии (Китай), соответственно.

Большинство исследований, посвященных оценке протективной активности [Burrows, Bacon, 1958, Une, Brubaker, 1982, Lawton et al., 1963, Motin et al., 1994, 1996], способности образовывать олигомеры [Broz et al., 2007, Caroline et al., 2008, Pouliot et al., 2007, Tito et al., 2001], иммуносупрессивной активности [Pouliot et al., 2007, Motin et al., 1996, Sing et al., 2002, Sodhi et al., 2004], а также определение трехмерной структуры [Derewenda et al., 2004] V антигена проведены с использованием молекул LcrV «классического» (описываемого нами как D) типа.

Анализ генетического и структурно-функционального полиморфизма V антигена Y. pestis с привлечением комплекса методов микробиологии, генной инженерии, биохимии, иммунологии и компьютерного моделирования позволит получить новые сведения о роли различных структурных вариантов V антигена в патогенезе и иммуногенезе чумы, а также о степени его изменчивости в ходе микроэволюции

7. pestis у представителей различных внутривидовых групп. Это создаст основу для разработки методологии получения технологичных штаммов-продуцентов с максимальным уровнем продукции высокопротективных вариантов V антигена, необходимую для конструирования экспериментальных вакцин нового поколения.

Цель исследования - структурно-функциональный и генетический анализ V антигена 7. pestis для рационального конструирования субъединич-ных противочумных вакцин.

Задачи исследования:

1. Изучить полиморфизм нуклеотидных последовательностей IcrV генов и аминокислотных последовательностей соответствующих им полипептидов у представителей различных внутривидовых групп Y. pestis и оценить влияние структуры V антигена на избирательную вирулентность "полевочьих" штаммов возбудителя чумы.

2. Провести компьютерное моделирование трехмерной структуры различных вариантов V антигена Y. pestis.

3. Осуществить молекулярное клонирование генов различных структурных вариантов V антигена 7. pestis, провести выделение и очистку рекомбинантных белков.

4. Изучить иммуногенность различных структурных вариантов V антигена

7. pestis.

Научная новизна.

Приоритет в определении нуклеотидной последовательности, кодирующей иммуногенный полипептид LcrV(G1i3), вызывающий защитный иммунный ответ против 7. pestis, и в конструировании рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pETV 13455 - продуцента иммуногенного полипептида LcrV(CH3) защищен патентом на изобретение № 2439155 С1 РФ.

Выявлены три новых структурных типа V антигена 7. pestis. Показано, что LcrV типа D, характерный для эпидемически значимых штаммов 7. pestis subsp. pestis, также широко распространен среди наиболее филогенетически древних штаммов различных биоваров subsp. microtus. Только 39% от изученных «полевочьих» штаммов обладают вариантными структурами LcrV (отличными от типа D).

Установлено, что структурный полиморфизм V антигена 7. pestis не является причиной избирательной вирулентности «полевочьих» штаммов.

Проведено компьютерное моделирование трехмерной структуры V антигена типа А и проведена оценка влияния выявленного структурного полиморфизма V антигена 7. pestis на структуру молекулы.

Показано влияние полиморфизма по отдельным аминокислотным остаткам

V антигена на способность белка к олигомеризации и на его протективную активность.

Пр актическая ценность диссертации.

Депонированы в GenBank последовательности IcrV гена 18 штаммов Y. pestis (номера доступа: EF645809.1, DQ489557.1, EF645806.1, GQ468417.1, DQ489552.1, GQ468423.1, EF645807.1, EF645808.1, DQ489556.1, DQ489555.1, GQ468422.1, GQ468421.1, GQ468420.1, GQ468419.1, DQ489554.1, DQ489553.1, GQ468416.1, GQ468415.1) (международный уровень внедрения).

Депонирован в коллекции "ГКПМ-Оболенск" ГНЦ ПМБ охраноспособный штамм E. coli BL21(DE3)pETV 13455 - продуцент V антигена с повышенной способностью к агломерации и повышенной протективной активностью (федеральный уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях при подготовке магистрантов Пущинского государственного естественнонаучного института и аспирантов ГНЦ ПМБ.

Препараты V антигена, выделенные из сконструированных продуцентов, были использованы для получения моноклональных антител в группе иммунохимии филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Пущино) и в лаборатории молекулярной биологии ГНЦ ПМБ, а также в качестве одного из компонентов экспериментальных чумных вакцин, разрабатываемых в рамках Госконтрактов № 124-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01200905859), №52-Д от 29.06.2010 г. (№ гос. регистрации 01201002280) и № 62-Д от 22.07.2011 г. (№ гос. регистрации 01201174793) с Роспотребнадзором и №Н/3/7/50ф-11-ДГОЗ от 15.04.2011 г. (№ гос. регистрации 01201162945) с Министерством обороны РФ. Кроме того, препараты V антигена применяются в лаборатории биологических испытаний ГНЦ ПМБ для оценки динамики продукции антител у лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков и морских свинок), инфицированных Y. pestis.

Положения, выносимые на защиту:

- Избирательная вирулентность "полевочьих" штаммов Y. pestis не обусловлена структурной вариабельностью V антигена.

- Аминокислотный тип D - широко распространенный и наиболее древний из структурных вариантов V антигена Y. pestis.

- Рекомбинантный штамм бактерий E. coli BL21(DE3)/pETV 13455 -продуцент иммуногенного полипептида LcrV(Gii3), вызывающего защитный иммунный ответ против Y. pestis.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы отдела особо опасных инфекций ГНЦ ПМБ по планам НИР в рамках проекта МНТЦ № 2426 (научный руководитель - к.м.н. С.В. Денговская); проекта РФФИ № 08-04-00405-а (научный руководитель - д.м.н., проф. А.П. Анисимов), договора № 74-Д от 31 декабря 2005 г. (НИР 001-2, № гос. регистрации 01200904237, научный руководитель - д.м.н., проф. И.А. Дятлов) с Роспотребнадзором и Госконтрактов № 124-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01200905859), и № 52-Д от 29.06.2010 г. (№ гос. регистрации 01201002280) и № 62-Д от 22.07.2011 г. (№ гос. регистрации 01201174793) с Роспотребнадзором (научный руководитель - д.м.н., проф. А.П. Анисимов).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образом, с П.Х. Копыловым (ГНЦ ПМБ) и В.Л. Мотиным (Медицинское отделение Техасского университета, Галвестон, Техас, США). На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, в получении которых роль автора была определяющей. В исследованиях также принимали участие сотрудники ГНЦ ПМБ Е.А. Панферцев и М.Е. Платонов. Компьютерное моделирование трехмерной структуры различных вариантов V антигена на основании определенных автором нуклео-

тидных последовательностей проводили B.W. Segelke и A. Zemla из Ливерморской национальной лаборатории им. Э. Лоуренса Министерства энергетики США (Ливермор, Калифорния, США).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: VI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях" (Волгоград, 2005); 2nd FEMS Congress of European Microbiologists (Madrid, Spain, 2006); NIAID Research Conference (Opatija, Croatia, 2006); VH-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств" (Оболенск, Московская обл.,

2006); 9th International Symposium on Yersinia (Lexington, Kentucky, USA, 2006); научно-практической конференции "Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России" (Ставрополь, 2007); 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus,

2007); 9th Symposium of Analytical Microbiology (Beijing, People’s Republic of China,

2007); NATO Science for Peace and Security Programme Advanced Research Workshop “Emerging and Endemic Pathogens: Advances in Surveillance, Detection, and Identification” (Тбилиси, Грузия, 2008); IX Межгосударственной научнопрактической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (Волгоград,

2008); научно-практической конференции, посвященной 75-летию Иркутского НИПЧИ (Иркутск, 2009); П-й научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» (Московская обл., Оболенск,

2009); International Symposium on Bacterial Evolution and Pathogenesis (Zhenjiang, Jiangsu province, China, 2010), Ш-м съезде военных врачей «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия Вооруженных Сил Российской Федерации» (С-Петербург, 2010); Ш-й научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Московская обл., Оболенск, 2011).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании ученого совета ГНЦ ПМБ 9 апреля 2010 г., протокол №4. Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 21 от 27 декабря 2011 г.).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 14 научных публикациях, в том числе в двух статьях, опубликованных в междунарнародных рецензируемых журналах, реферируемых ISI, и в одном патенте на изобретение № 2439155 С1 РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, три главы результатов исследований с их обсуждением, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 16 работы отечественных и 228 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 4 таблицами. Приложения состоят из двух статей, опубликованных по теме диссертации, и описания изобретения к патенту № 2439155 С1 РФ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Для секвенирования гена IcrV использовали 73 штамма чумного микроба, относящихся к различным подвидовым группам (subsp. microtus: (bv. altaica, caucasi-ca, ulegeica, hissarica, talassica) и subsp .pestis (bv. antiqua, medievalis)), выделенные в различных природных очагах чумы России и других стран СНГ, а также на территории Монголии, которые выращивали на агаре Хоттингера с добавлением 1 % гемолизированной крови в течение 48 ч при температуре 28 °С. Геномную ДНК выделяли в соответствии с методическими указаниями МУ 1.3.1794 - 03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности» с использованием комплекта реагентов для выделения ДНК из биопроб производства НПФ «Литех».

Используемые для молекулярного клонирования штаммы E. coli DH5ct, E. coli BL21(DE3) выращивали на жидкой или плотной питательных средах Лу-риа-Бертани (LB) при температуре 37 °С [Miller, 1972]. Отбор трансформантов проводили по фенотипу Арк на плотной питательной среде LB, содержащей ампициллин в концентрации 50 мкг/мл. Для выделения V антигена культуры E. coli BL21(DE3)/pETV 13455 (/pETV 12359, /pETV A1728, /pETV C582, /pETV9) выращивали при температуре 37 °C в жидкой аэрируемой среде LB в лабораторном ферментере New Brunsuik Scientific с рабочим объемом 2 л.

Для клонирования и экспрессии в E. coli рекомбинантных белков использовали рЕТ систему (Novagen, США). Данная система содержит плазмидную векторную ДНК рЕТ32Ь(+) (5899 п.о.) (см. ниже) и подходящие для экспрессии рекомбинантных белков бактериальные штаммы.

В экспериментах с лабораторными животными использовали мышей линии BALB/c (19 + 2) г, морских свинок (275 ± 25) г из вивария ГНЦ ПМБ в соответствии с требованиями к качеству лабораторных животных и условиям их содержания [Лившиц, 1978].

Генно-инженерные манипуляции с ДНК, а также выделение плазмцдной ДНК из £’. coli и элекрофорез в агарозном геле проводили согласно руководству [Маниатис и др., 1984] и рекомендациям изготовителя ферментов (MBI Fermentas, Латвия).

Нуклеотидную последовательность гена IcrV различных штаммов Y. pestis определяли методом секвенирования ПЦР-фрагментов, полученных с использованием секвенирующих праймеров (FI 5'-cag cct саа cat ссс tac ga-3'; F2 5'-gca aaa tgg cat caa gcg ag-3' и R 5'-tag ttc ccc ctc ctt tta gg-3'), без предварительного клонирования. Сиквенс ге-

на IcrV проводили с использованием реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3130 XL (Applied Biosystems, США). Анализ нуклеотидных последовательностей гена IcrV, а также соответствующих аминокислотных последовательностей осуществляли с помощью программного обеспечения Laser gene (Invitrogen Corporation, CILLA) и DNASIS (Hitachi, Япония). Последовательности ДНК сравнивали с представленными в базе данных GenBank с помощью программы BLAST.

Трехмерную модель LcrV для "консенсусного" типа А рассчитали на основе кристаллической структуры LcrV типа D из штамма KIM (код доступа 1R6F в Protein Data Bank) [Derewenda et al., 2004]. Применяли структурную классификацию белков (SCOP - Structural classification of groteias; версия 1.71 (http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.f.bb.b.b.b.html)) [Murzin et al., 1995] и моделирование с использованием метода LGA (Local global alignment) [Zemla, 2003].

Для аналитической индукции синтеза V антигена клоны E. coli BL21(DE3), содержащие рекомбинантные плазмиды, выращивали в жидкой питательной среде LB с ампициллином (50 мкг/мл) в течение ночи при температуре 37 °С. Ночную культуру разводили в 10 раз LB бульоном, содержащим ампициллин (50 мкг/мл), и культивировали 2 ч при температуре 37 °С с аэрацией. Далее в пробирки вносили ИПТГ до конечной концентрации 1 мМ и продолжали культивирование 3,5 ч. По 100 мкл культуры отбирали, клетки осаждали центрифугированием, осадок ресуспендировали в 50 мкл трис-ЭДТА - буфера (pH 7,4) и добавляли 50 мкл лизирующего буфера для белкового электрофореза.

Анализ рекомбинантного V ашигена проводили при помощи электрофореза в полиакриламидном геле [Laemmli, 1970] и весгерн-блот-анализа [Towbin et al, 1979].

Выделение и хроматографическую очистку V антигена осуществляли в три этапа. На первом этапе V антиген очищали с помощью гель-эксклюзивной хроматографии, на втором этапе - с помощью ионообменной хроматографии, на третьем этапе проводили гидрофобную хроматографию [Копылов и др., 2011].

Для изучения некоторых физико-химических свойств растворы антигенов LcrV(W113) из штамма E. coli BL21(DE3)/pETV С582, LcrV(G113) из штамма E. coli BL21(DE3)/pETV 13455 нормировали по концентрации общего белка до величины 1 мг/мл и инкубировали при температуре 45 °С в течение 20 ч [Tito et al, 2001], после чего пробы анализировали при помощи денатурирующего электрофореза в 12 % полиакриламидном геле в нередуцирующих условиях (без добавления 2-меркаптоэтанола), а также в 7 % геле, приготовленном без додецилсульфата натрия. Белки в гелях окрашивали Кумасси G-250.

Титр антител (IgG) к V антигену в сыворотках иммунных мышей определяли методом твердофазного ИФА согласно руководству Т. Ngo et al. [1988]. В качестве адсорбированных антигенов были использованы различные структурные варианты V антигена в концентрации 10 мкг/мл. Оптическую плотность в лунках планшета определяли с помощью Multiscan (Labsystem, Финляндия) при длине волны 492 нм. Титр определяли как величину наибольшего разведения сыворотки, оптическая плотность (ОП) которой в 2 раза превышала ОП в соответствующей контрольной лунке.

Вирулентность штаммов Y. pestis с различными структурными вариантами

V антигена изучали на мышах и морских свинках. Животных заражали подкож-

но введением десятикратных разведений культур У. pestis в физиологическом растворе (0,9 %) в объеме 0,2 мл на животное. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 30 сут. Погибших животных вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию для подтверждения причин гибели.

Для изучения иммуногенной и протективной активности препаратов V антигена Y. pestis с различной аминокислотной последовательностью антигены, выделенных из штаммов-продуцентов на основе E.coli BL21 (DE3), сорбировали на стерильной гидроокиси алюминия в фосфатно-солевом буфере при перемешивании в течение 2 ч при комнатной температуре. Белки предварительно стерилизовали, пропуская через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм. Концентрацию антигена рассчитывали таким образом, чтобы 200 мкл суспензии содержали 10 мкг белка. Иммунизацию и заражение проводили по следующей схеме: 0-й день - иммунизация мышей 10 мкг препаратов антигена, сорбированного на гидроокиси алюминия; 30-й день - повторная иммунизация 10 мкг белка; 62-й день - отбор крови для определения титров антител иммунизированной и контрольной группы; 64-й день - подкожное заражение мышей вирулентным штаммом Y.pestis 231 в дозе от 1 КОЕ до 107 КОЕ;

Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 сут. Погибших животных вскрывали и исследовали бактериологическим методом. Вычисление величин LD50 и доверительного интервала (для вероятности 95 %) проводили по методу Kärber в модификации И.П. Ашмарина и A.A. Воробьева [Ашмарин И А.,Воробьев А.А, 1962].

Напряженность противочумного иммунитета (ИИ), т.е. способность вакцинного препарата (экспериментального образца) предохранять животное от заражения массивными дозами вирулентной культуры, определяли по формуле:

тт„ LDSOumm ...

ИИ=----------, (1)

LDSQmrn

где ИИ - индекс иммунитета; LD50umm - LD50 для животных, иммунизированных экспериментальными образцами препаратов, в дозе 10 мкг, КОЕ; LDSQuHm

- LD50 для интактных животных, КОЕ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Полиморфизм нуклеотидных последовательностей генов IcrV и соответствующих им полипептидов Y. pestis

В настоящей работе используется внутривидовая классификация Y. pestis, приведенная в соответствие с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий. В вид 7. pestis входят два подвида: pestis (включает патогенные для человека биовары intermedium, antiqua, medievalis и orientalis) и microtus (включает непатогенные для человека «полевочьи» биовары altaica, angola, cau-casica, hissarica, qinghaiensis, talassica, ulegeica и xilingolensis) [Платонов, 2010].

К моменту начала наших исследований было установлено, что нуклеотидная последовательность гена IcrV штаммов 7. pestis subsp. pestis консервативна, однако секвенирование IcrV гена трех штаммов, принадлежащих к подвиду micro tus, выявило вариабельность нуклеотидной последовательности гена данного фактора патогенности [Adair et al., 2000; Song et al., 2004]. В связи с этим за-

дачей настоящего раздела исследований явилось изучение полиморфизма нуклеотидных последовательностей гена IcrV и соответствующих им полипептидов у представителей различных подвидов и биоваров У. pestis, выделенных на территории стран СНГ и Монголии. Особое внимание мы уделили изучению V антигена из штаммов У. pestis подвида microtus.

Мы провели секвенирование гена IcrV из 73 штаммов разных внутривидовых групп Y. pestis, выделенных в девяти природных очагах стран СНГ, а также на территории Монголии. Причем, 62 из них принадлежало к биоварам altaica, cauca-sica, hissarica, ulegeica, talassica, которые вместе с биоварами angola, qinghaiensis и xilingolensis входят в состав подвида microtus. Семь последовательностей гена IcrV (штамм subsp. pestis bv. orientalis C092, штамм subsp. pestis bv. medievalis KIM, штамм subsp. pestis bv. antiqua Antiqua, штамм subsp. pestis bv. orientalis CASS-4125; штамм subsp. microtus bv. caucasica Pestoides F, штамм subsp. microtus bv. angola Angola; штамм subsp. microtus bv. xilingolensis 91001) [Parkhill et al., 2001; Deng et al., 2002; Chain et al., 2006; Eppinger et al., 2009; Eppinger et al., 2010; Song et al., 2004], депонированных в GenBank, анализировали in silico. Таким образом, проанализированы нуклеотидные последовательности гена IcrV и соответствующие им аминокислотные последовательности V антигена из 80 штаммов Y. pestis.

Анализ аминокислотных последовательностей позволил сгруппировать все варианты белка LcrV в пять типов в соответствии с проявлением основного группоспецифичного полиморфизма в четырех «горячих точках» с дополнительным штам-мо-специфичным полиморфизмом, выявляемым у представителей отдельных групп. Эти «горячие точки» соответствуют аминокислотным остаткам 18 (К18 —*• N18), 72 (К72 -> R72), 273 (С273 -> S273) и 324-326 (S324-G325-K326 -*■ R324) в последовательности LcrV референс-штамма KIM [Deng et al., 2002], а выявленные типы аминокислотных последовательностей были нами описаны следующими формулами: тип А -N18, R72, S273 и S324-G325- К326; тип В - N18, R72, С273, и S324-G325-K326; тип С - N18, R72, S273 и R324;

тип D - К18, К72, С273 и S324-G325-K326; .

типЕ-К18,К72,С273 HR324, где N - аспарагин, R - аргинин, С - цистеин, S - серин, G - глицин, К - лизин.

Мы показали что, штаммы Y. pestis различных биоваров подвида microtus могут обладать одинаковыми типами LcrV, и различные типы LcrV могут быть свойственны разным популяциям Y. pestis одного биовара (рис. 1). Наиболее важным результатом нашего исследования является установление того факта, что LcrV типа D, характерный для эпидемически значимых штаммов Y. pestis subsp. pestis, также широко распространен среда штаммов различных биоваров subsp. microtus. 61 % штаммов подвила microtus обладали V антигеном этого типа.

Принимая во внимание тот факт, что V антиген D типа наиболее близок по аминокислотной последовательности к аналогичному белку своего "прародителя", У. pseudotuberculosis [номер доступа в Gene Bank ADC 55500.1], а общее отличие от классического типа D для типов Е и С - замена трех С-концевых аминокислот (S324-G325-K326) на одну - (R324), которая является результатом вызванной двумя прямыми повторами (ATGACACG) делеции З'-конца гена IcrV протяженностью 16 пар нуклеотидных оснований [Zhou et al., 2004] можно предположить,

что наиболее молодой ветвью биовара саисавюа является филогенетическая группа, общая для Присеванского горного (очаг 05), Зангезуро-Карабахского горного (очаг 06) и среднегорной степной части Приараксинского низкогорного (очаг 07) природных очагов чумы (ЬсгУ типов Е и С), а наиболее древней - популяция штаммов, циркулирующих в Восточно-Кавказском высокогорном очаге (39) и ди-вергировавшая по данным МЬУА25- типирования1 от клональных кластеров сс4 и сс5-7 до момента разделения последних (ЬсгУ типа О) (рис. 2).

А В С В £ тип LerV

Рисунок 1 - Типы ЬсгУ, характерные для штаммов У.рехиь виЬвр. ппсго1 ия, принадлежащих к различным биоварам.

С учетом клональной теории возникновения и распространения возбудителя чумы в течение трех главных пандемий [АсЫтап е1 а!., 1999, 2004; Беу1^а1, 1951; Ы е( а!., 2009], можно сделать вывод о том, что первый представитель вида У. резйя обладал типом Э аминокислотной последовательности ЬсгУ, сохранившийся у потомков наиболее древних ветвей «полевочьих» штаммов и штаммов основного подвида. С другой стороны ЬсгУ из штаммов У. рея Ия, циркулирующих в популяциях разных видов полевок (М1сШт 8рр.), проявляет все многообразие последовательностей (типы А-Е). Это свидетельствует о том, что в организмах этого рода животных подобные мутации гена 1сгУ являются нейтральными или даже позволяют лучше адаптироваться к новой экологической нише.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена 1с г V и аминокислотных последовательностей V антигена послужили основой для компьютерного моделирования трехмерных структур выявленных вариантов белка ЬсгУ2.

Трехмерную модель ЬсгУ для "консенсусного" типа А рассчитали на основе кристаллической структуры ЬсгУ типа Б из штамма К1М (номер досту-

1 Данные MLVA25-THmipoBaHM предоставлены М.Е. Платоновым (ГНЦ ПМБ).

2 Этот раздел работы выполнен совместно с B.W. Segelke и A. Zemla.

па 1R6F в базе данных SCOP). В соответствии со структурной классификацией белков (SCOP; версия 1.71) V антиген относится к классу мультидоменных протеинов, укладка белка LcrV содержит "а" домен, образованный преимущественно N-концевым участком, и "а+Р" домен. Домены соединены антипараллельно скрученным витком.

Наибольший аминокислотный полиморфизм LcrV, включая замены в не моделированных участках белка, обнаружен в составе N-концевого участка (а.о. 1-146). На трехмерной молекулярной модели LcrV видно, что, за исключением а.о. 273, остальные замены (а.о, 72,84,103,113 и 324) локализованы в составе "а" домена (рис. 3).

Мы попытались спрогнозировать влияние замены аминокислотных остатков LcrV из разных штаммов на значимые изменения трехмерной структуры белка. Кристаллическая структура LcrV из штамма У. pestis KIM лишена целого ряда участков, невидимых на картах электронной плотности [Derewenda et al., 2004], поэтому мы создали более полную модель с использованием метода LGA.

Всего проведен структурный анализ шести вариантов аминокислотных замен в LcrV. Все замены, за исключением одной, выявлены либо в "гибких" участках молекулы, либо на поверхности белка и не приводят к изменению локальных химических свойств (гидрофобности, гидрофильности, амфипатично-сти, заряда) и, вероятно, оказывают минимальное влияние на структуру белка. Напротив, замена триптофана в позиции 113 на глютаминовую кислоту либо глицин должна оказывать значительное влияние на региональную структуру белка, а возможно и функции этого белка. Триптофан характеризуется большими размерами и, в основном, гидрофобностью, хотя и может образовывать одну водородную связь за счет азота в положении s. Триптофан 113 в LcrV практически полностью скрыт в большом гидрофобном участке около центра N-концевого домена. Азот в положении в стабилизирует структуру локальной петли водородной связью с карбонилом аспарагина 110 (рис. 4.5, А).

При замене триптофана глютаминовой кислотой, гидрофобные взаимодействия практически полностью утрачиваются, хотя глутамат и амфипатичен, и Е113 более не может образовывать водородную связь с карбонилом N110. Е113 может образовывать водородную связь с N144, который, в свою очередь, может образовывать водородную связь с карбонилом N110 для стабилизации локальной структуры петли. При замене W113 глицином (G113) утрачиваются все гидрофобные и водородные связи, что, вероятно, дестабилизирует петлю 108-112 и ведет к нарушению ее структуры, а, возможно, и к меньшей стабильности структуры всего белка (рис. 4, С). Действительно, в процессе выделения и очистки различных типов рекомбинантных LcrV было установлено, что антиген из штамма 1-3455 (замена в положении 113 триптофана на глицин) существенно отличался от антигенов из других штаммов.

Суммируя все вышеизложенное можно констатировать, что белки LcrV из штаммов - представителей разных подвидовых групп У. pestis обладают полиморфизмом размера, последовательности и трехмерной структуры.

Одним из основных факторов патогенности рода Yersinia является комплекс продуктов, кодируемых плазмидой pCad, присутствие которых необходимо для проявления вирулентности возбудителя [Portnoy, Falkow, 1981; Кокушкин, 1983]. Мы установили, что белки LcrV штаммов - представителей различных внутривидовых

групп 7. рехШ обладают полиморфизмом аминокислотной последовательности, размера и трехмерной структуры. Можно предположить, что данный полиморфизм оказывает влияние на вирулентность штаммов с различными вариантами ЬсгУ.

-с

гГ

| Strain Isolation date F ssp bv MlVA-flt AspA363 V-

С-254 19.05.1969 07 P MED 355 Leu 0

С-253 23.04.1969 07 P MED 354 Leu D

1146 ND 06 С MIC 74 Ser E

С-582 1984 05 С MIC 99 Ser С

С-67 13.06.1962 06 С MIC 379 Ser E

С-77 05.08.1962 05 с MIC 387 Ser E

- С-68 13.06.1962 06 с MIC 381 Ser E

С-291 19.08.1971 07 с MIC 357 Ser E

С-514 03.09.1982 05 с MIC 369 Ser E

С-663 02.07.1988 05 С MIC 326 Ser E

С-664 05.07.1988 05 с MIC 326 Ser E

С-69 22.06.1962 06 с MIC 382 Ser E

С-666 24,08.1983 05 с MIC 378 Ser E

@ Pestoides F ND 06 с MIC 31 Ser E

С-585 18.08.1934 07 с MIC 100 Ser E

1680 Р- 08.06.1962 07 с MIC 31 Ser E

С-233 22.07.1968 07 с MIC 31 Ser E

С-234 30.08.1968 07 с MIC 31 Ser E

С-235 12.09.1968 07 с MIC 31 Ser E

С-345 20.10.1976 04 с MIC 360 Ser D

С-376 30.09.1958 04 с MIC 362 Ser D

С-564 ND 04 с MIC 98 Ser D

С-98 06.05.1964 04 с MIC 392 Ser D

С-111 21.09.1965 04 с MIC 349 Ser D

С-512 16.08.1982 04 с MIC 368 Ser D

С-346 25.10.1976 04 с MIC 361 Ser D

С-537 13.06.1984 39 с MIC 371 Ser D

С-538 11.06.1984 39 с MIC 372 Ser 0

С-539 14.04.1984 39 с MIC 321 Ser D

С-540 14.04.1984 39 с MIC 321 Ser D

С-669 25.05.1988 39 с MIC 321 Ser D

С-676 24.10.1988 39 с MIC 380 Ser D

С-535 28.08.1984 39 с MIC 320 Ser D

С-715 23.08.1996 39 с MIC 320 Ser D

С-716 23.08.1996 39 с MIC 320 Ser D

@ IP 32953 1990 FR Pstb Pstb 314 Va!

\ ес5-7/ (1.РЕ2а

сс4/

О.РЕ2Ь

► сс39

Рисунок 2 - Распределение типов аминокислотных последовательностей V антигена штаммов У. pestis subsp. caucasica по кластерам NJ (Neighbor-Joining) дендрограммы MLVA25-ninoB исследованных штаммов. "Strain" - название штамма;

- штамм генотипирован in silico; "Isolation date" - время выделения; "F" - номер природного очага; "ssp" - подвид (Р - pestis, MIC - microtus); "bv"- биовар (С - caucasica); MLVA-gt" - MLVA25-THn [Платонов, 2011]; "AspA363" - аминокислота в позиции 363 аспартазы; "V-ag type" - тип V антигена.

Рисунок 3 - Модель структуры LcrV из штамма Y. pestis Angola представлена в виде стереоленточной диаграммы. Различия между нашей моделью и опубликованной ранее кристаллической структурой LcrV из штамма KIM выделены красным цветом. Места точечных различий между восемью использованными в исследовании штаммами представлены с боковыми цепями для каждого а.о. в виде шариков и палочек.

\

Рисунок 4 - Структуры участков трех типов LcrV К pestis, примыкающих к аминокислотному остатку ИЗ. "Консенсусная" последовательность белка LcrV содержит в этом положении триптофан (А), а штаммы 1-2359 и 1-3455 - глютаминовую кислоту (В) или глицин (С), соответственно.

В качестве модели для сравнительной оценки вирулентности “полевочьих” штаммов, продуцирующих различные типы LcrV, использовали мышей и морских свинок (табл. 1).

Все изученные нами штаммы оказались высоковирулентными для белых мышей, что согласуется с данными других исследователей [Anisimov et al., 2004; Zhou et al., 2004b]. При этом независимо от типа синтезируемого LcrV штаммы 7. pestis subsp. microtus были авирулентными для морских свинок (LD50 > 10б КОЕ).

Таким образом, выявленный нами структурный полиморфизм типов LcrV, секретируемых штаммами 7. pestis subsp. microtus, не влияет на их вирулентность для лабораторных животных, и "избирательная" вирулентность “полевочьих” штаммов обусловлена другими факторами.

Конструирование продуцентов V антигена Y.pestis

Работы по конструированию продуцентов V антигена для использования в составе диагностических и профилактических препаратов проводили с учетом полученных данных компьютерного моделирования трехмерной структуры LcrV и

возможного влияния замен по отдельным аминокислотам на физико-химические, иммунохимические и протективные свойства белка. Мы клонировали ген IcrV из штаммов Y. pestis subsp. microtus биовара altaica 1-3455 и 1-2359, caucasica С-582, hissarica А-1728 и штамма Y. pestis subsp. pestis EV НИИЭГ в составе векторной плазмиды рЕТ32Ь(+) в клетках протеазодефицитного штамма E. coli BL21(DE3) (Novagen, США). Рекомбинантные белки LcrV представляют собой пептиды с расчетной молекулярной массой 37,2 кДа.

Таблица 1 - Вирулентность “полевочьих” штаммов Y. pestis, продуцирующих различные структурные варианты LcrV ___________________________________

Штамм Y. pestis Тип LcrV LD50 для лабораторных животных при п/к заражении (КОЕ)

мыши морские свинки

subso. pestis

1-1996 D 1 (0-5)** 8 (2-32)

231 D 2(1-8) 4(3-16)

subsp. microtus

bv. caucasica

C-535 D 12 (3-50) 109

C-376 D 3(1-13) > 106

C-585 Е 6(2-26) > 106

bv. hissarica

1-1249 Е 32(8-158) > 106

bv. ulegeica

1-2422 В 3(1-13) 109

1-2239* D < 10 > 106

1-3189* D 102 > 109

1-3190* D і о2 > 10*

bv. altaica

1-2359 А 50(13-200) >108

1-3259* D 102 >10*

* LDjo согласно паспортным данным.

** В скобках указаны доверительные интервалы для вероятности 95 %.

Аналитическая индукция синтеза V антигена (рис. 6) клетками E. coli BL21 (DE3), содержащими рекомбинантные плазмиды, показала присутствие рекомбинантного белка в виде мажорной полосы в экстракте индуцированных клеток, отсутствующей в экстракте клеток не индуцированных ИГГГГ. Максимальную экспрессию V антигена наблюдали после трех часов индукции 1 мМ ИПТГ, причем целевой белок составлял не менее 50 % всех клеточных белков штаммов - продуцентов.

Выделение и хроматографическую очистку V антигена проводили в три этапа. На первом этапе V антиген очищали с помощью гель-эксклюзивной хроматографии, на втором этапе - с помощью ионообменной хроматографии, на третьем этапе проводили гидрофобную хроматографию. Затем полученный препарат высокоочищеннош V антигена подвергали диализу. Выход V антигена с чистотой не менее 95 % по результатам ДСН-электрофореза в редуцирующих условиях (рис. 7) составлял 35 мг/л.

Специфичность очищенного V антигена, выделенного из рекомбинантных штаммов E. coli, подтвердили в вестерн-блот анализе. В вестерн-блоте моноклональные антитела 2СЗ.ЗС7 и 5G5.E93 реагировали с белком LcrV в регионе, соответствующем 37 кДа (рис. 8). Несмотря на выявленные различия в структуре LcrV из различных штаммов Y. pestis оба моноклона обнаруживали все изучаемые варианты LcrV. В то же время они не реагировали с клеточным лизатом E. coli BL21(DE3).

M-ortjfftv

\ ' -Hind III

- ‘ \\

IcrV

\LNdel - ^77-otommi

l!

Рисунок 5 - Генетическая карта рекомбинантной плазмиды pETV 13455 (плазмиды pETV 12359, pETV С582, pETV Al 728 и pETV9 имеют аналогичную структуру). T7-promoter - промотор бактериофага Т7; T7-terminator - терминатор бактериофага Т7; orí - точка начала репликации векторной плазмиды; bla - ген ß-лактамазы (Арк); lad - ген репрессора /ас-оперона.

Б в . f'V , ■

** i - : •. isr г

* s ÍSjg» Ж

£? 3® Se $ ж »»»•»«; _115_ : : J . ХЕш Ж ff*j gib-

- äS.il

—

.1 в 5

.isHSsifäi ii f 1 .*

Рисунок 6 - ДСН-ПААГ электрофорез рекомбинантных белков LcrV после индукции (окраска Кумасси голубым). (А) Линии: 1 - маркеры молекулярной массы (116,0, 66,2, 45,0, 35,0, 25,0, 18,4 и 14,4 кДа); 2-8 - клеточный лизат E. coli BL21(DE3)/pETV 12359 (2-7 после и 8 до индукции ИПТГ); 9-14 - клеточный лизат E. coli BL21(DE3)/pETV 13455 после индукции ИПТГ. (Б) Линии: 1 - маркеры молекулярной массы; 2-8 - клеточный лизат £. coli BL21(DE3)/ pETV С582 (2-7 после и 8 до индукции ИШТ). (В) Линии: 1-8 - клеточный лизат E. coli BL21(DE3)/pETV А1728 (1-7 после и 8 до индукции ИПТГ); 9 - маркеры молекулярной массы (116,0,66,2, 45,0,35,0,25,0,18,4 и 14,4 кДа).

При изучении некоторых физико-химических свойств антигена мы показали, что прогревание белка LcrV при температуре 45 °С в течение 20 ч способствовало образованию олигомерных форм (рис. 9). Обработка проб перед электрофорезом 2-меркаптоэтанолом приводила к исчезновению высокомолекуляр-

3 Моноклональные антитела 2СЗ.ЗС7 и 5й5.Е9 к ЬсгУ У. реяйз предоставлены сотрудниками группы иммунохимии филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Пущино).

ных полос во всех соответствующих пробах как на нативном геле (рис. 9 Б), так и на геле с додецилсульфатом натрия (рис. 9 А). Таким образом, стабильность агломерированного V антигена поддерживалась дисульфидными связями.

і г і

11« Ша ~

МЯ>а —

ът «•

39 Юв -

Рисунок 7 - ДСН-ПААГ электрофоретический анализ LcrV из штамма E. coli BL21(DE3)/pETV 13455 после хроматографической очистки: Линия 1 - маркер молекулярных масс, линии 2 ,3,4, 5 - 0,5 мкг, 1 мкг, 2 мкг, 5 мкг белка LcrV соответственно.

гСЗ.ЗЯ 5S5.E9

Рисунок 8 - ДСН-ПААГ и соответствующий иммуноблот с МкАТ к LcrV 2СЗ.ЗС7 и 5G5.E9. Линии: 1 - клеточный лизат E. coli BL21(DE3)/pETV А1728 после индукции; 2 - клеточный лизат E. coli BL21(DE3)/pETV С582 после индукции; 3 - клеточный лизат E. coli BL21(DE3)/pETV 12359 после индукции: 4 - клеточный лизат £. coli BL21(DE3)/pETV D455 после индукции; 5 - клеточный лизат E. coli BL21(DE3)/pETV 9 после индукции; 6 - клеточный лизат E. coli BL21(DE3) (отрицательный контроль).

4 і » 4 * I Т I »4« 44 И 41 44 ff ff fr It it Я И П

97хДа

66 кДа ч

и«Ца —ч д g

Рисунок 9 - Электрофоретический анализ V антигенов после термообработки и обработки 2-меркаптоэтанолом. Линии: 1, 2, 9,10,11,12, 21, 22 - полипептид LcrV(Wl 13) из штамма E. coli BL21(DE3)/pETV С582; 3,4, 7, 8, 13, 14, 19, 20 - полипептид LcrV(Gl 13) из штамма E. coli BL21(DE3)/pETV 13455; 2, 4, 7, 9, 12, 14, 19, 21 - антигены прогреты перед иммунизацией при 45 °С в течение 20 ч; 7, 8, 9, 10, 19, 20, 21, 22 - пробы содержат 2-меркаптоэтанол, 1 - маркеры молекулярных масс; 15 - бычий сывороточный альбумин; А - 12 % ПААГ с додецилсульфатом натрия; Б - 7 % ПААГ не содержит додецил-сульфат натрия.

Изучение иммуногенной активности препаратов V антигена У. реяНя с различной аминокислотной последовательностью

По данным компьютерного моделирования, только одно местоположение выявленных нами замен (в позиции 113) может вносить серьезный вклад в формирование локальной структуры и изменение биологических свойств LcrV

- замена триптофана на глютаминовую кислоту (штамм 1-2359) или глицин (штамм 1-3455) (рис. 4).Оценивая влияние полиморфизма аминокислотной последовательности V антигена на его биологические свойства, мы изучили способность препаратов рекомбинантного V антигена с различной аминокислотной последовательностью индуцировать продукцию антител. Для этой цели мы выбрали препараты V антигена, выделенного из штаммов-продуцентов E. coli BL21 (DE3)/pETV 13455, BL21 (DE3)/pETV 12359 и BL21 (DE3)/pETV С582, отличающиеся по аминокислоте в позиции 113.

Способность препаратов рекомбинантного LcrV индуцировать образование анти-LcrV антител (рис. 10) после двукратной иммунизации мышей определяли методом твердофазного ИФА. Наибольшую антигенную активность показал полипептид LcrV(oii3) из штамма 1-3455, титры антител к которому достигали 1 : 254000 (рис. 10). Титры антител к белкам LcrV(wii3) из штамма С-582 и LcrVfEi 13) из штамма 1-2359 не превышали 1 : 15600, то есть они обладали значительно более низкой способностью индуцировать продукцию антител.

Напряженность иммунитета, создаваемого препаратами V антигена с различной аминокислотной последовательностью, определялась по их способности предохранять от гибели белых мышей линии BALB/c после заражения массивной дозой вирулентной культуры 7. pestis 231 и выражалась в LD50 и индексе иммунитета (табл. 2).

о Разведение сывороток

< g g с о

1 I i i | § S

...

. LcrV (W113)

' •" • |4МИг ••••••

♦ LcrV (0113)

' «і

LcrV (E113)

.-„Г, . . ,e

Разведение сывороток, Іп X

Рисунок 10 - Титры анти-ЬсгУ антител (^С) в крови мышей, иммунизированных различными структурными вариантами рекомбинантного V антигена. Измерение проводили при длине волны 492 нм. ЬсгУ^цз), ЕсгУ(0цз), ЬсгУ(ЕИЗ) - V антиген с триптофаном, глицином и глютаминовой кислотой в положении 113.

Согласно полученным данным, двукратное подкожное введение препарата У(онз)/1-3455 обеспечивало 100%-ную защиту животных от подкожного заражения тест-штаммом 7. 231 в дозах от 1 до 107 м.к. Препараты У^ю/С-

582, У(\упз)/А-1728, У(Ецз/1-2359 и У^цз/ЕУ НИИЭГ не обладали протектив-

ной активностью. ЬБзо вирулентного штамма Г. ре.чйя 231 для мышей, иммунизированных данными препаратами, не отличалась от ЬО^о вирулентного штамма для двух контрольных групп мышей (неиммунизированных или после введения гидроокиси алюминия). Индекс напряженности иммунитета препарата У(оиз)/1-3455 превышал аналогичный показатель для препаратов У(№пз/С-582, У(\упз/А-1728 и У(Еиз/1-2359 и У(«из/ЕУ НИИЭГ на 5 порядков.

Таблица 2 - Протективная активность препаратов рекомбинантного ЬсгУ

Препарат V антигена / штамм У. реяйз - источник 1с гУ П35о К 231 для мышей, иммунизированных ЬсгУ, КОЕ Индекс иммунитета (ЬЭ5о для иммунизированных / ЬО30 для ин-тактных животных)

Уаупз)/ С-582 15 (4-59) 5

Угміз>/ А-1728 5(1-19) 1,6

Угріиі /1-2359 15 (4-59) 5

У(0Ш)/1-3455 1,7 х 106 (1,0 х 106-3,2х Юб) 5,7 х 105

У,*„^/ЕУ НИИЭГ 7(1-20) 2,3

Контроль 1 (АЦОН)з) 3(1-12) 1

Контроль 2 (интактные) 3(1-12) 1

Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования препарата У(спз/1-3455 в качестве компонента субъединичных чумных вакцин нового поколения.

ВЫВОДЫ

1. Генетический и структурно-функциональный анализ V антигена Г\pestis позволил выявить пять типов структурных вариантов белка ЬсгУ (три типа впервые), которые отличаются по группо-специфичному полиморфизму в четырех «горячих точках» аминокислотных последовательностей. В состав отдельных аминокислотных типов входят варианты ЬсгУ с дополнительным штаммоспецифичным полиморфизмом аминокислотных последовательностей.

2. Показано, что вариантные структуры ЬсгУ свойственны лишь части “поле-вочьих” штаммов возбудителя чумы, а ЬсгУ типа Б, наиболее близкий по структуре к ЬсгУ возбудителя псевдотуберкулеза, характерен для основного эпидемически значимого подвида и для наиболее филогенетически древних “полевочьих” штаммов.

3. Установлено, что изменчивость структуры V антигена не является причиной избирательной вирулентности “полевочьих” штаммов возбудителя чумы.

4. На основании компьютерного моделирования трехмерной структуры теоретически предсказано, что пять из выявленных нами вариантов аминокислотных замен в V антигене 7. рейи, не приводят к изменению локальных химических свойств белка (гидрофобности, гидрофильности, амфипатичности, заряда) и, вероятно, оказывают минимальное влияние на его структуру. Замена триптофана в позиции 113 на глютаминовую кислоту либо глицин должна оказывать значительное влияние на региональную структуру и, возможно, на функции ЬсгУ возбудителя чумы.

5. Сконструирован набор продуцентов различных структурных вариантов V антигена, проведены выделение и очистка рекомбинантных белков.

6. Экспериментально показано, что замена в аминокислотной последовательности V антигена триптофана на глицин в положении 113 сопровождается повышенной способностью к олигомеризации (агломерации), коррелирующей с усилением протективной активности белка на пять порядков.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Anisimov А.Р., Panfertsev Е.А., Svetoch Т.Е., Dentovskaya S.V. Variability of the protein sequences of LcrV between epidemic and atypical rhamnose-positive strains of Yersinia pestis // Adv. Exp. Med. Biol. - 2007. - V. 603. - P. 23-27. (4 цитирования по данным Web of Science®, 5 цитирований по данным http://scholar.google.com на 22.01.2011 г.).

2. Anisimov A.P., Dentovskaya S.V., Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Kopylov P.Kh., Segelke B.W., Zemla A., Telepnev M.V., Motin V.L. Amino acid and structural variability of Yersinia pestis LcrV protein // Infect. Genet. Evol. - 2010. - V. 10 (1). - P. 137-145. (3 цитирования по данным http://scholar.google.com на 22.01.2011 г.).

б) патенты

3. Пат. №2439155 С1 РФ, МПК C12N15/10, С07Н21/00, C12N15/70, C12N1/21, С12Р21/00. Нуклеотидная последовательность, кодирующая иммуногенный полипептид, вызывающий защитный иммунный ответ против; рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая иммуногенный полипептид; рекомбинантный штамм - продуцент иммуногенного полипептида; полипептид и способ его получения / Копылов П.Х., Бахтеева И.В., Анисимов А.П., Дентовская С.В., Иванов С.А., Киселева Н.В., Левчук

В.П., Панферцев Е.А., Платонов М.Е., Светоч Т.Э., Титарева Г.М. - заявлено 02.06.2010; опуб. 10.01.2012.

в) тезисы научных конференций

4. Анисимов А.П., Панферцев Е.А., Светоч Т.Э., Копылов П.Х., Киселева Н.В., Левчук В.П., Дентовская С.В., Иванов С.А. Конструирование суперпродуцента V антигена Yersinia pestis // Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Материалы VI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева, В.В. Алексеева. Волгоград: Изд-во "Панорама". -2005.-С. 174-175.

5. Panfertsev Е.А., Svetoch Т.Е., Dentovskaya S.V. Sequencing of IcrV genes from representatives of different Yersinia pestis intraspecies groups // Abstracts of the 2nd FEMS Congress of European Microbiologists (July 4-8, 2006, Madrid, Spain), P.VRL.38. - P. 184.

6. Панферцев E.A., Светоч Т.Э., Дентовская C.B. Выявление пяти типов аминокислотных последовательностей белка LcrV Yersinia pestis // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: Материалы Vll-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева, И.А. Дятлова. Протвино: Изд-во А-ПРИНТ ЗАО. - 2006. - С. 118-119

7. Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Dentovskaya S.V. Sequence heterogeneity of the Yersinia pestis LcrV protein // Abstracts of the 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA) A116. - American Society for Microbiology, Washington, D.C. - 2006. - P. 75-76.

8. Киселева H.B., Копылов П.Х., Панферцев E.A., Светоч Т.Э., Дентовская С.В., Левчук В.П. Выделение LcrV Yersinia pestis, экспрессированного в клетках Escherichia сой // Материалы научно-практической конференции "Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России" (Ставрополь, 21-22 марта 2007 г.). - Ставрополь, 2007. - Ч. 1. - С. 172-173.

9. Dentovskaya S., Abbasova S., Bogatyrev V., Brovko F., Dykman L., Ivanov S., Kiseleva N., Kopylov P., Levchuk V., Laman A., Panfertsev E., Platonov M., Shepelyakovskaya A., Sokolov O., Svetoch T. Pla and LcrV specific monoclonal antibodies for detection of Yersinia pestis // Program and abstracts of the 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, November 15-18, 2007). - P. 111.

10. Anisimov A.P., Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Dentovskaya S.V., Segelke B.W., Zemla A., Motin V.L. Amino acid and structural variability of Yersinia pestis LcrV protein // Program and abstracts of the 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus,November 15-18,2007). -P. 112.

11. Копылов П.Х., Киселева H.B., Платонов M.E., Светоч Т.Э., Комбарова Т.И., Иванов С.А., Левчук В.П., Дентовская С.В. Влияние аминокислотной последовательности LcrV белка Yersinia pestis на его протективную активность // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств: Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ: (30 сентября - 2 октября, 2008 г., Волгоград) / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева, В.В. Алексеева. - Волгоград, 2008. - С. 95-96.

12. Платонов М.Е., Киселева Н.В., Копылов П.Х., Светоч Т.Э., Дентовская С.В. Протективная активность различных структурных вариантов V антигена Yersinia pestis // Биологическая безопасность в современном мире: Материалы научнопрактической школы-конференции научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора (21-22 апреля 2009 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова, - Протвино: А-ПРИНТ ЗАО, 2009. С. 224-225.

13. Копылов П.Х., Киселева Н.В., Бахтеева И.В., Шайхутдинова Р.З., Светоч Т.Э., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Протективная активность V и F антигенов У. pestis // Сборник трудов III съезда военных врачей. - Санкт-Петербург, 2010. - С. 283.

14. Платонов М.Е., Иванов С.А., Копылов П.Х., Светоч Т.Э., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Изучение протективной активности смеси V и F1 антигенов Yersinia pestis II Материалы научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора (2011 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г. Г. Онищенко, И. А. Дятлова. - Протвино, 2011. - С. 328-329.

Благодарности

Приношу искреннюю благодарность научным руководителям моей кандидатской диссертации д.м.н., проф. А.П. Анисимову (ГНЦ ПМБ) и к.м.н.

С.В. Дентовской (ГНЦ ПМБ), осуществлявшим научное руководство и оказывавшим методическую помощь на всех этапах работы.

Считаю своим приятным долгом выразить благодарность всем моим соавторам, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации (профессору B.JI. Мотину из Техасского Университета (США), Dr. B.W. Segelke и Dr. A. Zemla из Ливерморской Национальной Лаборатории (США), к.б.н. Ф.А. Бровко из филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Пущино), сотрудникам ФБУН ГНЦ ПМБ к.м.н. Е.А. Панферцеву, к.б.н. П.Х. Копылову, к.х.м. Н.В. Киселевой, к.б.н. С.А. Иванову, к.б.н. М.Е. Платонову, к.м.н. Г.М. Титаревой, к.м.н. И.В. Бахтеевой, Т.И. Комбаровой.

Глубоко признательна директору Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока д.м.н., проф. С.В. Балахонову и директору Ставропольского научно-исследовательского противочумного института д.м.н., проф. А.Н. Куличенко за предоставленные штаммы Г. pestis.

Благодарю директора ФБУН ГНЦ ПМБ чл.-корр., д.м.н., проф. И.А. Дятлова за предоставленную возможность защитить диссертацию в диссертационном совете Д 350.002.01 при ФГУН ГНЦ ПМБ.

Признательна и благодарна всем рецензентам настоящей работы за многочисленные замечания, вопросы и поправки, которые, по возможности, были учтены и, в ряде случаев, помогли уточнить, а иногда и пересмотреть некоторые положения и формулировки.

Заказ № 6573 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Светоч, Татьяна Эдуардовна, Оболенск

61 12-3/577

Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и

безопасности человека Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии"

Структурно-функциональный и генетический анализ V антигена

На правах рукописи

Светоч Татьяна Эдуардовна

Yersinia pestis

03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.м.н., с.н.с., проф. А.П. Анисимов

к.м.н. C.B. Дентовская

Оболенск - 2011

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ........................................................................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ............................................................................................................................................................................8

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................................................................14

1.1 Открытие V антигена, условия биосинтеза, выделение, очистка и физико-химические свойства..............................................................................................................14

1.2 V Антиген как фактор патогености....................................................................................16

1.2.1 Регуляторная функция V антигена....................................................................................16

1.2.2 Иммуномодулирующая функция......................................................................................18

1.2.3 Функция контроля транслокацииУор эффекторов..........................................20

1.3 Генетическое разнообразие и трехмерная структура белка ЬсгУ............21

1.4 Иммуногенная активность V антигена............................................................................24

1.5 V антиген и вакцинопрофилактика чумы......................................................................26

1.6 Заключение по обзору литературы......................................................................................28

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ................................................30

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................................................30

2.1 Штаммы микроорганизмов........................................................................................................31

2.2 Плазмиды....................................................................................................................................................33

2.3 Лабораторные животные............................................................................................................33

2.4 Среды и условия культивирования....................................................................................33

2.5 Секвенирование гена 1сгУ.............................................................................................................34

2.6 Генно-инженерные манипуляции..........................................................................................35

2.6.1 Молекулярное клонирование гена 1сгУ........................................................................35

2.7 Аналитическая индукция синтеза V антигена в клетках штамма-продуцента ............................................................................................................................................................36

2.8 Выделение и очистка ЬсгУ............................................................................................................36

2.9 Изучение физико-химических свойств V антигена................................................36

2.10 Структурный анализ V антигена..........................................................................................37

2.11 Вестерн - б лот анализ V антигена......................................................................................37

2.12 Иммуноферментный анализ........................................................................................................................................37

2.13 Изучение вирулентности штаммов Y. pestis с различными структурными вариантами V антигена................................................... 38

2.14 Изучение иммуногенной активности препаратов V антигена

Y. pestis с различной аминокислотной последовательностью................................39

Глава 3 ПОЛИМОРФИЗМ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ IcrV И СООТВЕТСТВУЮЩИХ ИМ ПОЛИПЕПТИДОВ Y. pestis.................................................................................. 40

3.1 Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей IcrV генов и кодируемых ими аминокислотных последовательностей белков

Y. pestis................................................................................... 40

3.2 Компьютерное моделирование трехмерной структуры различных вариантов V антигена Y. pestis..........................................................................................................51

3.3 Влияние замены аминокислотных остатков на структуру LcrV

Y. pestis....................................................................................................................................................................52

3.4 Вирулентность штаммов Y. pestis с различными структурными вариантами V антигена..................................................................... 54

3.5 Обсуждение........................................................................ 56

Глава 4 КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ V АНТИГЕНА Y. pestis............62

4.1 Молекулярное клонирование IcrV тепа в Е. coli......................................................62

4.2 Аналитическая индукция синтеза, выделение и очистка рекомби-нантного V антигена....................................................................................................................................63

4.3 Изучение некоторых физико-химических свойств V антигена..................65

4.4 Обсуждение................................................................................................................................................68

Глава 5 ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ V

АНТИГЕНА Y. pestis С РАЗЛИЧНОЙ АМИНОКИСЛОТНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ...................................................... 72

5.1 Способность препаратов V антигена Y pestis с различной аминокислотной последовательностью индуцировать продукцию антител..................72

5.2 Изучение протективной активности препаратов рекомбинантного V антигена Y.pestis с различной аминокислотной последовательностью .... 73

5.3 Обсуждение......................................................................... 74

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................. 76

ВЫВОДЫ..............................................................................................................................................................................81

БЛАГОДАРНОСТИ......................................................................................................................................................82

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ............................................................................82

ПРИЛОЖЕНИЯ..................................................................................................................................................................107

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ

а.о. аминокислотный остаток

БСА бычий сывороточный альбумин

ФБУН ГНЦ Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный

ПМБ научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии

ДСН додецилсульфат натрия

ИИ индекс иммунитета - отношение LD50 вирулентного штамма

для иммунизированных к LD5o для интактных животных

ИФА иммуноферментный анализ

ИПТГ изопропилтиогалактопиранозид

кДа (kDa) килодальтон, единица измерения молекулярной массы макромолекул

КОЕ (cfu) колониеобразующая единица (colony forming unit)

ЛПС Липополисахарид

МкАТ моноклональные антитела

МНТЦ Международный научно-технический центр

ОП оптическая плотность

ОФД Ортофенилендиамин

ПААГ полиакриламидный гель

п/к Подкожно

п.н.(Ьр) пары нуклеотидов (base pair)

ПЦР полимеразная цепная реакция

РАН Российская Академия Наук

РКПБ РНИПЧИ Российская коллекция патогенных бактерий при Российском

«Микроб» научно-исследовательском противочумном институте «Микроб»

РНК рибонуклеиновая кислота

РФФИ Российский фонд фундаментальных исследований

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

ApR ампициллинрезистентность

bv Биовар

С Цистеин

CD 14 специфический рецептор из семейства CD на поверхности

иммунокомпетентных клеток F1 капсульный антиген - фракция I (fraction I)

GST глютатион-Б-трансфераза

G Глицин

IL10 интерлейкин 10

INF-y интерферон -у

in vitro эксперимент в пробирке, без использования животных

in vivo эксперимент на животных

К Лизин

LB среда Luria-Bertani

Lcr-эффект low calcium response - подавление синтеза V антигена в при-

сутствии даже небольших количеств ионов кальция в среде культивирования LcrV белок LcrV - V антиген

IcrV структурный ген V антигена

LD50 доза, летальная для 50% экспериментальных животных (dosis

letalis 50) MDa Мегадальтон

N Аспарагин

NCBI База данных Национального центра биотехнологической ин-

формации (National Center for Biotechnology Information) PA протеин A Staphylococcus aureus

pCad(pCDl, 45-47 мегадальтонная плазмида, определяющая зависимость pLcr) роста Y.pestis от ионов кальция, кодирующая систему секре-

ции третьего типа, синтез V антигена, белков внешней мембраны

pFra(pMTl) 60-65 мегадальтонная плазмида, кодирующая синтез капсуль-ного антигена и мышиного токсина

pPst (pPCPl) R

subsp. S

Syc-белки

T3SS TLR

TNF-a

USP

Yop

Ysc - белки

6 мегадальтонная плазмида, кодирующая синтез пестицина,

активатора плазминогена и белка иммунности к пестицину

Аргинин

Подвид

Серин

Specific Yop chaperon белки - белки - шапероны для Yop белков

type 3 secretion system - система секреции третьего типа Toll-like receptors - класс толл-подобных клеточных рецепторов с одним трансмембранным фрагментом, распознающих консервативные группы (лиганды) микроорганизмов и активирующих клеточный иммунный ответ tumor necrosis factor - фактор некроза опухоли United State Pharmacopeia - фармокопея США Yersinia outer-membrane proteins - белки наружной мембраны Yersinia secretion белки - белки, необходимые для секреции белков Yop

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. V антиген (LcrV) - полифункциональный фактор вирулентности и один из основных протективных антигенов иерсиний [224]. Он представляет собой полипептид с молекулярной массой 37 кДа [181], кодируемый геном IcrV, расположенным на плазмиде вирулентности (кальцийзависимости) патогенных для человека представителей рода Yersinia: Y.pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

Установлено, что V антиген ингибирует хемотаксис нейтрофилов и запускает механизм супрессии провоспалительных цитокинов [230, 150]. Этот белок регулирует работу многокомпонентной системы секреции белков третьего типа (type 3 secretion system -T3SS) путем прямого влияния на собственно секрецию эффекторных белков Yop (Yersinia outer proteins) и опосредованно - на транскрипцию их генов, а также на перенос белков-эффекторов внутрь эукариотической клетки-мишени [35, 180].

Нуклеотидную последовательность гена IcrV из штамма Y. pestis KIM в 1989 г. опубликовал коллектив авторов из Университета Кентукки (США) [181]. Позднее шведские исследователи из Университета Умеа секвенировали аналогичный ген из штамма Y. pseudotuberculosis YPIII, а российские ученые из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи - из штамма Y. pseudotuberculosis 995 [35, 147].

По полиморфизму структуры гипервариабельной области на N-конце молекулы в пределах 40-61 а.о. (TLR2 - активный район) V антигены делят на семь классов. Первый из них составляют последовательности белка Y pestis и Y. pseudotuberculosis, остальные шесть вариантов найдены только у Y. enterocolitica, причем отдельные структурные варианты отличались по своей иммуносупрессионной активности [199].

V антиген является высококонсервативным белком в эпидемически значимых штаммах Y. pestis, то есть штаммах основного подвида subsp. pestis [20, 147]. Вариации в нуклеотидных последовательностях гена IcrV были описаны для штаммов неосновного подвида Y.pestis ("полевочьи" штаммы): Pestoides F [20] и 91001 [210, 244], циркулирующих в популяциях полевок в закавказском высокогорном очаге (Азербайджан, Грузия или Армения) и степях Внутренней Монголии (Китай), соответственно.

Большинство исследований V антигена, включая оценку его протективной активности [50, 224, 127, 143, 146], способности образовывать олигомеры [43, 53, 179, 220], иммуносупрессивной активности [179, 146, 201, 208] и определения трехмерной

структуры [74] проведены с использованием молекул LcrV «классического» (описываемого нами как D) типа.

В тоже время единичные эксперименты по оценке свойств препаратов V антигена Y. pestis, отличающихся по аминокислотным последовательностям, свидетельствуют об отсутствии перекрестной протективности. Оба описанных серовара V антигена обладали выраженной протективной активностью в отношении штаммов с гомологичным вариантом V антигена, но не обеспечивали защиты животных при заражении штаммами Y. pestis другого серовара [105, 190].

Анализ генетического и структурно-функционального полиморфизма V антигена возбудителя чумы с привлечением комплекса методов микробиологии, генной инженерии, биохимии, иммунологии и компьютерного моделирования позволит получить новые сведения о роли различных структурных вариантов V антигена в патогенезе и иммуногенезе чумы, а также о степени его изменчивости в ходе микроэволюции Y. pestis у представителей различных внутривидовых групп. Это создаст основу для разработки методологии получения технологичных штаммов-продуцентов с максимальным уровнем продукции высокопротективных вариантов V антигена, необходимую для конструирования экспериментальных вакцин нового поколения.

Цель исследования - структурно-функциональный и генетический анализ V антигена Y. pestis для рационального конструирования субъединичных противочумных вакцин.

Задачи исследования:

1. Изучить полиморфизм нуклеотидных последовательностей IcrV генов и аминокислотных последовательностей соответствующих им полипептидов у представителей различных внутривидовых групп Y. pestis и оценить влияние структуры V антигена на избирательную вирулентность "полевочьих" штаммов возбудителя чумы.

2. Провести компьютерное моделирование трехмерной структуры различных вариантов V антигена Y. pestis.

3. Осуществить молекулярное клонирование генов различных структурных вариантов V антигена Y. pestis, провести выделение и очистку рекомбинантных белков.

4. Изучить иммуногенность различных структурных вариантов V антигена Y. pestis.

Научная новизна

Приоритет в определении нуклеотидной последовательности, кодирующей им-муногенный полипептид LcrY(G113), вызывающий защитный иммунный ответ против Y. pestis, и в конструировании рекомбинантного штамма бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pETV 13455 - продуцента иммуногенного полипептида LcrV(G113) защищен патентом на изобретение №2439155 С1 РФ от 02.06.2010 г. Заявка №2010120197/10(028733). Опубликовано 10.01.2012.

Выявлены три новых структурных типа V антигена Y. pestis. Показано, что LcrV типа D, характерный для эпидемически значимых штаммов Y pestis subsp. pestis, также широко распространен среди наиболее филогенетически древних штаммов различных биоваров subsp. microtus. Только 39 % от изученных "полевочьих" штаммов обладают вариантными структурами LcrV (отличными от типа D).

Установлено, что структурный полиморфизм V антигена Y. pestis не является причиной избирательной вирулентности "полевочьих" штаммов.

Проведено компьютерное моделирование трехмерной структуры V антигена типа А и проведена оценка влияния выявленного структурного полиморфизма V антигена Y. pestis на структуру молекулы.

Показано влияние полиморфизма по отдельным аминокислотным остаткам V антигена на способность белка к олигомеризации и его протективную активность.

Практическая ценность диссертации

Депонированы в GenBank последовательности IcrV гена 18 штаммов Y. pestis (номера доступа: EF645809.1, DQ489557.1, EF645806.1, GQ468417.1, DQ489552.1, GQ468423.1, EF645807.1, EF645808.1, DQ489556.1, DQ489555.1, GQ468422.1, GQ468421.1, GQ468420.1, GQ468419.1, DQ489554.1, DQ489553.1, GQ468416.1, GQ468415.1) (международный уровень внедрения).

Депонирован в коллекции "ГКПМ-Оболенск" ФБУН ГНЦ ПМБ охраноспособный штамм Е. coli BL21(DE3)pETV 13455 - продуцент V антигена с повышенной способностью к агломерации и повышенной протективной активностью (федеральный уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов Пущинско-го государственного университета и аспирантов ГНЦ ПМБ.

Препараты V антигена, выделенные из сконструированных нами продуцентов,

были использованы для получения моноклональных антител сотрудниками группы иммунохимии филиала Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Пущино) и лаборатории молекулярной биологии ГНЦ ПМБ, а также в качестве одного из компонентов экспериментальных чумных вакцин, разрабатываемых в рамках Госконтрактов № 124-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01200905859), № 52-Д от 29.06.2010 г. (№ гос. регистрации 01201002280) и № 62-Д от 22.07.2011 г. (№ гос. регистрации 01201174793) с Роспотребнадзором и № Н/3/7/50ф-11-ДГОЗ от 15.04.2011 г. (№ гос. регистрации 01201162945) с Министерством обороны. Кроме того, препараты V антигена применяются сотрудниками лаборатории биологических испытаний ГНЦ ПМБ для оценки динамики продукции антител у лабораторных животных (мышей, крыс, хомяков и морских свинок), инфицированных Y. pes tin.

Основные положения, выносимые на защиту:

Избирательная вирулентность "полевочьих" штаммов не обусловлена структурной вариабельностью V антигена.

Аминокислотный тип D - широко распространенный и наиболее древний из структурных вариантов V антигена Y. pestis.

Рекомбинантный штамм бактерий Е. coli BL21(DE3)/pETV 13455 - продуцент иммуногенного полипептида LcrV(G113), вызывающего защитный иммунный ответ против У. pestis.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы отдела особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ПМБ по планам НИР в рамках проекта МНТЦ № 2426 (научный руководитель - к.м.н. C.B. Дентовская); проекта РФФИ № 08-04-00405-а (научный руководитель - д.м.н., проф. А.П. Анисимов), договора № 74-Д от 31 декабря 2005 г. (НИР 001-2, № гос. регистрации 01200904237, научный руководитель -д.м.н., проф. И.А. Дятлов) с Роспотребнадзором и Госконтрактов № 124-Д от 11.06.2009 г. (№ гос. регистрации 01200905859), и № 52-Д от 29.06.2010 г. (№ гос. регистрации 01201002280) и № 62-Д от 22.07.2011 г. (№ гос. регистрации 01201174793) с Роспотребнадзором (научный руководитель - д.м.н., проф. А.П. Анисимов).

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве, главным образо