Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональная вариабельность антигенов Y. pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная вариабельность антигенов Y. pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов"
Направахрукописи
гремякова Татьяна Андреевна
структурно-функциональная вариабельность
антигенов УггзЬтареБйБ и методология
конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов
03.00.07 - микробиология 03.00.23 - биотехнология
Автореферат диссертации насоисканиеученой степени доктора медицинских наук
Москва - 2004
Работа выполнена в Федеральном государственном предприятии Государственном научном центре прикладной микробиологии
Научный консультант: профессор, дм н , ¡Константин Иванович Волковой) Официальные оппоненты:
Г Б Смирнов, член-корреспондент РАМН, профессор, д.м.н. Б.Н. Мишанькин, профессор, д м н , засл. деятель науки РФ И.К. Мазурова, дм н
Ведущая организация Ставропольский противочумный научно-
исследовательский институт МЗ России
Защита состоится 2004 г. в 10 00 на заседании диссертационного совета
Д 208 046 01 при Московском Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им Г. Н Габричевского по адресу. 125212, г. Москва, ул. адм. Макарова, д 10.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Г. К Габричевского.
Автореферат разослан "_" января 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного Совета, к.б н.
2004-4 24343
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
АКТУАЛЬНОСТЬ
Чума является актуальной проблемой инфекционной патологии человека, реальность угрозы которой резко возросла в связи с возможностью использования возбудителя в качестве потенциального агента биотерроризма. После событий 11 сентября 2001 года в Нью-Йорке составлен список наиболее вероятных и опасных патогенов. В одном ряду с возбудителями оспы, сибирской язвы, вирусами Эбола и Марбурга отмечен чумной микроб. Именно поэтому вопросам защиты от биотеррроризма, в том числе разработке специфических и неспецифических средств защиты и профилактики особо опасных инфекций, уделяется столь пристальное внимание. За рубежом ведутся крупномасштабные разработки вакцинных препаратов нового поколения против чумы, сибирской язвы, сапа, мелиоидоза [Anderson et al., 1996; Forsberg et al., 1998].
Возбудитель чумы (Yersinia pestis) - один из наиболее патогенных для человека микроорганизмов. Значительная вспышка бубонной чумы, охватившая, по данным ВОЗ (WHO Medical Bulletin, 1994), жителей 15 деревень индийского штата Махарашта, зарегистрирована в августе-сентябре 1994 года. В средствах массовой информации сообщается о вспышке чумы на Мадагаскаре в марте-апреле 1998 года. Спорадические случаи болезни регистрируются ежегодно во многих странах мира.
Применяемые в настоящее время противочумные вакцины были разработаны в 30-40-е годы прошлого столетия. В Англии, США и других западных странах используют преимущественно убитые вакцины из высоковирулентного штамма Y. pestis 195P [Butler, 1983]. В России для вакцинопрофилактики чумы в течение многих десятилетий применяется живая вакцина на основе аттенуированного штамма Y.pestis EV НИИЭГ [Коробкова, 1956].
Важным аспектом, требующим серьезной концептуальной проработки при определении стратегии конструирования чумных вакцинных препаратов нового поколения, является определение целевого вакцинируемого контингента, так как подходы и препараты для плановой вакцинации населения по эпидемиологическим показателям, очевидно, разнятся от тех, которые понадобятся при применении Y. pestis в качестве биологического оружия.
ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ
Получить структурно-функциональные характеристики белковых (FI, рН6) и липоолиго-сахаридных компонентов Y. pestis, а также выявить особенности формирования протективного иммунитета, создаваемого антигенами при различных способах их доставки и презентации.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:
1. Создать коллекции R специфических фагов, авирулентных и природных штаммов Y. pestis, R вариантов энтеробактерий, R и S штаммов Y. pseudotuberculosis, разработать методические приемы фагового и электрофоретического скрининга и на их основе предложить систему для изучения липоолигосахаридов (ЛОС) возбудителя чумы.
2. Установить химическую структуру кора и липида А липоолигосахаридов Y. pestis, определить молекулярную природу их изменчивости.
3.Разработать новые и усовершенствовать имеющиеся методы иммунохимического анализа липоолигосахаридов, приемов их химической модификации и презентации, способов истощения и конкурентного торможения с целью изучения антигенной специфичности препаратов, синтезируемых клетками возбудителя чумы при различной температуре.
гос. национальная! БИБЛИОТЕКА |
4.Изучить иммунохимические и иммунобиологические свойства липоолигосахаридов У. pestis, синтезированных в определенных условиях культивирования штаммами, которые выделены из различных природных очагов.
5. Создать рекомбинантные штаммы-продуценты капсульного антигена, в том числе и штаммы аттенуированных сальмонелл, стабильно экспрессирующих FT антиген in vitro и in vivo. Сконструировать молекулярные и рекомбинантные вакцинные препараты, обладающие способностью индуцировать защиту от чумы в ранние сроки после иммунизации.
6.Изучить иммуногенность и протективность FI и рНб антигенов при использовании различных систем доставки и презентации иммунокомпетентным клеткам.
7.Выбрать антигены чумного микроба, перспективные для последующего конструирования иммунопрофилактических препаратов, и определить формы их презентации.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
Впервые выявлена взаимосвязь между чувствительностью клеток У. pestis с разной под-видовой и географической принадлежностью к липополисахарид (ЛПС)-специфическому фагу FP1.
Приоритетно определение последовательности моносахаридов в коре ЛОС У. pestis, который по своей структуре относится к несальмонельному типу. Показано, что в коре имеется структурно-консервативный участок, общий для большинства изученных препаратов, и вариабельный участок, структура которого меняется от штамма к штамму и зависит от температуры культивирования бактерий. ЛОС (25 °С)' является гетерогенным в отношении строения олиго-сахарида кора и представлен четырьмя основными гликоформами, которые отличаются присутствием различных терминальных моносахаридов. Установлены отличия в молекулярной организации кора ЛОС штамма У. pestis subsp. caucasica 1146 от штаммов основного подвида.
Впервые показано, что олигосахаридный участок ЛОС возбудителя чумы имеет отчетливо выраженную температуро- и штаммозависимую иммунохимическую вариабельность. Для препаратов ЛОС, синтезированных при температуре 37 °С, показана более узкая штаммовая иммунохимическая специфичность.
Установлена температуроопосредованная вариабельность липида А возбудителя чумы, результатом чего является изменение биологических свойств липоолигосахаридов. Выявлена связь между химической структурой липоолигосахаридов У. pestis subsp. pestis и subsp. caucasica и иммунобиологической активностью данных препаратов.
Сформулирована концепция противодействования возбудителя чумы запуску и функционированию механизмов ранней неспецифической резистентности млекопитающих путем модификации липоолигосахаридов, что позволяет патогену минимизировать развитие защитных реакций.
Впервые определена возможность конструирования молекулярных и рекомбинантных вакцинных препаратов, обладающих способностью индуцировать защиту от чумы в ранние сроки после иммунизации.
Создана коллекция аттенуированных штаммов сальмонелл, которые экспрессируют кап-сульный антиген чумного микроба. Установлено, что рекомбииантные клетки аттенуирован-ных сальмонелл, синтезирующих нативный иммуногенный капсульный антиген, при парентеральной и оральной иммунизации способны индуцировать у мышей протективный иммунитет в отношении чумы различной степени напряженности. Получены штаммы, обеспечивающие
1 ЛОС (25 °С) и ЛОС (37 °С) - препараты, синтезированные в условиях культивирования при температуре 25 °С или 37 "С.
защиту от высоких заражающих доз с первого дня после иммунизации (Патент №2046145, приоритет от 29.07.1992).
Показано, что рНб антиген при выраженной антигенности (авторское свидетельство №1797351, МКИ GO1N33/53 приоритет от 5.11.90) и важной роли в патогенезе, не обладает протективностью для лабораторных животных. Путем термической и химической модификаций антигена, сопровождавшихся изменением степени агрегации, антигенных и биологических свойств рН6 антигена, получен ряд препаратов с различным спектром иммунобиологической активности. Высокомолекулярные агрегированные нативные формы рНб антигена не обладали протективностью, а при совместном введении с капсульным антигеном снижали протективные свойства последнего. Иммунизация деполимеризованными препаратами рНб антигена индуцировала у животных иммуносупрессию.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Основные теоретические итоги проделанной работы заключаются в расшифровке молекулярной организации липоолигосахаридов возбудителя чумы, идентификации молекулярных основ вариабельности их углеводного и жирнокислотного состава, определении роли выявленных особенностей организации липоолигосахаридов в патогенезе заболевания и адаптации возбудителя к существованию в различных условиях окружающей среды. Вскрыт первый пласт в изучении изменчивости липоолигосахаридов возбудителя чумы, как явления уникального, позволяющего по-иному взглянуть на процесс взаимодействия патогена и хозяина, меняющего общепринятую точку зрения на механизмы реализации вирулентности микроорганизмов.
Определена методология конструирования иммунопрофилактических противочумных препаратов, которая учитывает вариабельность основных протективных антигенов чумного микроба, обладающих способностью защиты от чумы в самые ранние сроки после вакцинации. Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию тонких молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия возбудителя чумы с организмом хозяина, что, в свою очередь, открывает перспективы разработки новых стратегий противодействия патогену.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Создана коллекция препаратов ЛОС, выделенных из различных штаммов Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, E. coli, S. minnesota, а также их детоксифицированных производных. Полученные препараты были использованы для изучения химической структуры ЛОС возбудителя чумы (Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН, Москва), молекулярных механизмов воздействия ЛОС на альвеолярные макрофаги (Институт инженерной иммунологии, п. Любучаны Московской обл.), молекулярной организации ЛОС Y. pestis и их иммунобиологических свойств (ГНЦ прикладной микробиологии, п. Оболенск).
Получен набор антисывороток и создана коллекция моноклональных антител к капсуль-ному антигену и ЛОС, используемых в ГНЦГГМ для тестирования соответствующих препаратов. Создана коллекция штаммов-продуцентов капсульного антигена чумного микроба. На штамм S. minnesota R595pFSl, депонированный в РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов), получен Российский патент на изобретение № 2046145. Этот штамм используется для получения высокоимму-ногенных препаратов капсульного антигена. Сконструирован штамм S. typhimurium SL3261pFSl, стабильно наследующий рекомбинантную плазмиду in vitro и in vivo. Штамм используется для определения эффективности различных систем доставки капсульного антигена при формировании протективного противочумного иммунитета.
Изучена чувствительность к бактериофагам вирулентных и авирулентных штаммов К pestis из коллекций живых культур ГНЦПМ, РосНИПЧИ «Микроб», НИПЧИ Сибири и Даль-
него Востока, что выявило их популяционную гетерогенность в отношении ЛОС. H основании данных о варьировании чувствительности штаммов возбудителя чумы, изолированных в различных природных очагах, к бактериофагам, предложены дополнительные методы для внутривидовой дифференциации патогена.
Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов:
1. Методика лабораторная способа использования стандартного инокулята для проверки ростовых качеств плотных питательных сред Утверждена 27.04.1990 зам. директора ВHИИПМ проф. Волковым В.Я. (учрежденческий уровень внедрения).
2. Методика лабораторная по усовершенствованию питательной среды для периодического глубинного культивирования с аэрацией в колбах вакцинного штамма чумного микроба EV HИИЭГ при температуре 27 °С. Утверждена 30.07.1990 зам. директора ВHИИПМ проф. Боровиком Р.В.
3. Методика лабораторная оценки качества жидких питательных сред с помощью рефе-ренс-инокулята. Утверждена 21.05. 1990 зам. директора ВHИИПМ проф. Волковым В.Я.
Методические приемы, разработанные в ходе работы над диссертацией, штаммы-продуценты, очищенные препараты антигенов, антисыворотки и моноклональные антитела, а также диагностические системы в настоящее время применяются в микробиологических, генетических, молекулярно-биологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий гаЦПМ (Оболенск), РоШИПЧИ "Микроб" (Саратов), HИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (Иркутск), ИОХ им. H. Д. Зелинского РAH (Москва), ИБХ им. ММШемякина и Ю.А.Овчинникова РAH (Москва).
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.
Материалы диссертации доложены и представлены на итоговых научных конференциях Го^ИИПМ (Оболенск, 1986, 1987, 1989, 1990); межведомственной научной конференции "Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний" (Киров, 1991); XIV научно-практической конференции Го^ИИ ПМ "Hовые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы" (Оболенск, 1991); IV Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов Нижний ^вгород, 1991), Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992); Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993), межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы "Профилактика и меры борьбы с чумой" (Алматы, 1994); I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994); межгосударственной научно-практической конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний" (Ставрополь, 1994); международной конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1996), 3rd John Humphrey Advanced Summer School "Cell and molecular biological aspects of immunology" (Пущино, 1996); VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); 4-°* конференции по бактериальной защите (Munich), Germany, 1997); совместном Американо-Российском семинаре в USAMRIID (Fort Detrick, USA, 1997), International Workshop in the Institute for Experimental Medicine and Biosciences (Borstel, Germany, 1998), 7th International Congress on Yersinia (Nijmcgcn, the Netherlands, 1998), 4th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Пущино, 1998); 8th International Congress on Yersinia (Turku, Finland, 2002), Carbohydrate Workshop -Rostock,
Germany, 2003); XIIth European Carbohydrate Symposium (Grenoble, France, 2003); 2-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003).
Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научной конференции ГНЦ ПМ 5 мая 2003 г. (протокол № 1).
ПУБЛИКАЦИИ
Основное содержание работы отражено в 55 научных публикациях (из которых 11 в центральной печати и 14 в материалах международных конференций и симпозиумов), в том числе в авторском свидетельстве на изобретение и патенте. Список публикаций приводится в конце автореферата.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ
Работа состоит из введения; обзора литературы в трех главах; описания собственных исследований в пяти главах, включающих результаты и их обсуждение, экспериментальную часть и заключение; выводов; списка литературы из 501 цитируемых работ. Общий объем диссертации составляет 320q страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 38 таблицами и 77 рисунками.
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ
1.Разработанная схема типирования штаммов чумного микроба по их чувствительности к липополисахарид-специфическому фагу FP1 дополняет внутривидовую характеристику и является дифференцирующим критерием изолятов Y. pestis.
2.Температуроопосредованные композиционные и структурные различия кора и липида А липоолигосахаридов штаммов чумного микроба, изолируемых в отдельных природных очагах России, определяют изменения их иммунобиологических свойств и вирулентности для грызунов и человека.
3.Предложена концепция реализации патогены ости возбудителем чумы путем уклонения микроба от неспецифических и специфических механизмов защиты хозяина, в том числе и с помощью модификации коровой и липидной части липоолигосахаридов Y. pestis.
4 Разработаны новые принципы методологии и биотехнологии получения нативных и модифицированных белковых и липоолигосахаридных антигенов, плазмид, векторных штаммов аттенуированных сальмонелл, штаммов-продуцентов, а также их презентации, которые учитывают вариабельность основных протективных антигенов Y. pestis и перспективны для конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов нового поколения.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы бактерии. В работе использовали 105 штаммов Y. pestis из коллекций живых культур ГНЦПМ и РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов), НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (Иркутск), один штамм Y. enterocolitica, четыре штамма Y. pseudotuberculosis, шесть штаммов S. minnesota (любезно предоставлены Dr. О. Hoist, Германия), один штамм S. typhi, шесть штаммов S. typhimurium (любезно предоставлены Dr. В. Stocker, США), четыре штамма Е. coli (любезно предоставлены Dr G. Schmidt, Германия). R-слецифические бактериофаги - FP3, FP1, С21 (любезно предоставлены Dr. О. Hoist, Германия).
Методы. В разделе содержится описание микробиологических методов, использованных при выделении, культивировании и изучении свойств возбудителя чумы, молекулярно-
биологических методов конструирования плазмид и рекомбинантных штаммов, биохимических методов выделения и характеристики FI, рНб, ЛОС антигенов, химических и физических (ядерный магнитный резонанс (ЯМР), масс-спектром етрия) методов анализа кора и липида А ЛОС возбудителя чумы, иммунохимических и иммунобиологических методов анализа изучаемых соединений, а также методов определения протективности разрабатываемых вакцинных композиций и штаммов. Статистическую обработку результатов, вычисление величин ImDso (доза вакцинного штамма, предохраняющая от гибели 50 % экспериментальных животных) и доверительного интервала проводили по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина и
A. А. Воробьева [1962]. Доверительный интервал вычисляли для вероятности 95 %.
Фаговый скрининг природных изолятов Y. pestis проведен совместно с О. В. Горшковым, Ю. А Поповым, О. П. Плотниковым, Н. А. Виноградовой, Е. П. Савостиной (РосНИПЧИ "Микроб", Саратов), С. В. Балахоновым, С. А. Бельковой (НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока, Иркутск). Электрофоретический анализ ЛОС выполняли с Р. 3. Шайхутдиновой и Т. Б. Кравченко, изучение иммунобиологических свойств ЛОС - при содействии Г. М Титаревой, И. В. Бахтеевой, Р. 3. Шайхутдиновой, С. В. Дентовской (ГНЦПМ, Оболенск). Данные по электронной микроскопии получены совместно с Е. Л. Жиленковым и
B. М. Фомченковым (ПЩПМ, Оболенск). Анализ структурных особенностей кора и липида А ЛОС осуществляли совместно с лабораторией углеводов ИОХ им. Н. Д. Зелинского РАН под руководством Ю. А. Книреля. Генно-инженерные работы по конструированию рекомбинантных штаммов проводили с А П. Анисимовым, Н. К Фурсовой, А. П. Алимовым, В. М. Красильниковой, Л. В. Ремневой, плазмиды любезно предоставлены А. В. Карлышевым, П. А. Черепановым, А. П. Анисимовым (ГНЦПМ, Оболенск). Моноклональные антитела получены совместно с С. С. Ветчининым (ГНЦПМ, Оболенск). Молекулярно-биологические, иммунобиологические и протективные свойства рНб антигена, а также нативного и серологически атипичного FI антигена и изучали совместно с В. Н. Степаншиной, А. П. Анисимовым, О. В. Коробовой, В. В. Амельченко, В. Д. Потаповым, Ю. Н. Ковалевым, Л. В. Михиной (ГНЦПМ, Оболенск).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Детальные исследования факторов патогенности и иммуногенности чумного микроба позволили установить их молекулярную организацию и начать изучение роли отдельных антигенов в патогенезе и иммуногенезе чумной инфекции. Особую роль в реализации вирулентности Y. pestis играют секретируемые белковые компоненты. К ним, в первую очередь, следует отнести капсульный антиген, обладающий антифагоцитарным действием [Burrows, 1963; Шанина, 1967; Brubaker, 1972; Meyer, 1974; Дальвадянц, 1991а; Бывалов и др., 1994, 1997; Perry, 1997, Черепанов и др., 1990, 1991а; Galyov et al, 1990, 1991; Karlyshev et al., 1992, 1994 и др.], рНб антиген - цитотоксический антифагоцитарный белок [Ben-Efraim et al., 1961; Menigh, Brubaker, 1993; Lindler et al, 1990; Панферцев и др., 1991; Черепанов и др., 1991], секретируе-мые белки (Yops) и V антиген - регулятор синтеза Yops и мощный иммуносупрессивный антиген [Burrows, Bacon, 1956; Lawton etal, 1963; Perry et al, 1986, 1987; Mulder etal, 1989; Price etal, 1989; Bergman eta.l, 1991; Motin etal, 1992; Nakajima etal, 1995; Comelis, Walf-Watz, 1997; Cornells et al, 1998; Holmstrom, 1998, Brubaker, 2003 и др.]. Именно эти компоненты образуют первую линию реагирования чумного микроба с клетками макроорганизма, результатом чего может быть полное подавление иммунных механизмов последнего. Другой компонент, привлекающий пристальное внимание исследователей, - поверхностный липополисахаридный или, точнее, липоолигосахаридный комплекс, играющий важную роль в температуроопосредо-ванных изменениях клеточной стенки чумного микроба и обладающий широким спектром
биологических свойств, включая с одной стороны токсичность и пирогенность, а с другой стороны - способность активировать иммунную систему макрорганизма ЛОС входит в состав всех изученных мембранных компонентов чумного микроба, протективных для морских свинок (ОСА, Б антиген) [Дальвадянц, 1968, Боровикова, 1972, Hartley et al, 1974, Bordet et al, 1977, Тараненко, 1985, Darveau et al, 1986, Бахрах и др, 1972, Грибоедов, Барабаш, 1985, Та-раненко и др, 1985, Бывалов и др, 1997]
Именно эти компоненты мы выбрали для дальнейшего изучения их молекулярной организации, иммуногенности и перспективности использования при разработке иммунопрофилак-тических препаратов
В последнее десятилетие значительно активизировались работы по созданию иммуно-профилактических препаратов нового поколения против чумы, лишенных недостатков существующих вакцин При этом основные усилия сосредоточены на следующих направлениях.
• оптимизация схемы вакцинации и способов презентации антигенов (использование им-муномодуляторов, антигистаминных препаратов, "упаковка" антигенов в липосомы и тд) [Alving, Richards, 1990, Alving, 1995, Schneerson et al, 1991, Harding et al, 1992, Snider, Segal 1987, Golding, Scott, 1995],,
• прецизионная аттенуация штаммов йерсиний [Маракулин и др, 1992, Валенцев и др, 1994, Wren et al, 1994a, 1994б, Guselman et al, 1996, Oyston et al, 1996, Lindler et al., 1990, Панферцев и др, 1991, Portnoy, Falkow, 1981, Кокушкин, 1983, Кугырев и др, 1989, Кутырев, 1992],
• генно-инженерное повышение продукции иммунодоминантных антигенов в аттенуиро-ванных штаммах иерсиний [Лнисимов и др, 1995, Анисимов, 1999],
• использование бактериальных векторов, не относящихся к роду Yersinia [Павлов и др, 1991, Никифоров и др, 1993, Leary et al., 1994, Oyston et al, 1995,Titbal, et al, 1997],
• разработка молекулярных белковых вакцин (FI, V) [Burrows, Baker, 1958, Lawton et al, 1963, Brubaker et al, 1985, 1987, Motin et al, 1994, Nakajima et al, 1995, Anderson et al, 1996, Голубинский и др , 1984, Simpson et al, 1990, Andrews et al, 1996 и др] и молекулярных глико-протеиновых вакцин (иммунодоминантные белки (FI, V) + адъювант полисахаридной природы (ОСА, детоксифицированный (дефосфорилированный, дезацилированный) ЛОС из Y. pestis и Y pseudotuberculosis ), монофосфорилированный липид А из штаммов с Re формой ЛОС и др ) [Дальвадянц и др, 1991, Тараненко и др, 1990, Гремякова и др, 1991-1998, Бывалов и др, 1984, 1997],
• создание ДНК-вакцин [Noll et al, 1988],
• конструирование антиидиотипических вакцин [Давдариани и др., 1993,1997] Традиционно в России особое место уделяется изучению протективности полисахарид-
ных антигенов возбудителя чумы Идентифицирован и охарактеризован полисахаридный про-тективный антиген микробной клетки патогенных йерсиний — Б антиген По сути, Б антиген во многом схож с ОСА, охарактеризованным С М. Дальвадянцем [Дальвадянц, Дробышева, 1977, Дальвадянд и др , 1991] Его иммуногенность изучается, но существенным недостатком данного препарата, также как и ОСА, является многокомпонентность и отсутствие полной характеристики всех компонентов комплекса
Одним из перспективных компонентов для разработки противочумной вакцины нового поколения может быть ЛОС Y pestis, компонент Б антигена и ОСА, детоксифицированный дефосфорилированием или дезацилированием Для понимания взаимодействия факторов пато-генности возбудителя чумы важны данные, свидетельствующие о том, что LcrV, один из наиболее перспективных протективных антигенов, осуществляет свое действие путем ингибирова-ния TNFa (tumor necrosis factor а, фактор некроза опухолей) и IFNy (Interfero®,интерферон
и индукции синтеза IL10 (Interleukin 10, интерлейкин 10), инактивируя тем самым NF-кВ (фактор транскрипции) [Nakajima et al, 1995; Nedyalkov et al., 1997], а также взаимодействует с TLRs (loll-like receptors - толл-подобные макрофагальные рецепторы) ЛПС, препятствуя запуску механизмов повышения неспецифической резистентности макроорганизма [Sing et al., 2002]. Проблема заключается в выборе препарата ЛПС для включения его в состав вакцинных композиций и методе детоксификации, который позволяет сохранить все его положительные свойства.
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЛИПООЛИГОСАХАРИДОВ Y.pestis
В ходе изучения ЛОС возбудителя чумы определился круг вопросов, требующих своего решения:
• изменяется ли ЛОС чумного микроба при варьировании температуры культивирования клеток;
• соответствуют ли эти изменения тому, что происходит in vivo;
• зависят ли эти изменения от природы штамма.
Впервые зависимость состава ЛОС от температуры выращивания клеток Y. pestis и наличия в них плазмид исследовал R. P. Darveau с соавторами в 1983г. Авторы показали, что ЛОС синтезированный клетками при температуре 37 °С, содержит меньшее количество Kdo (3-Дезокси^-манно-окт-2-улозоновая кислота), а также имеет меньшее молярное соотношение фосфат/Kdo и более высокую подвижность в SDS-PAAG [Darveau et al., 1983,1986]. Изменение степени фосфорилирования молекул ЛОС существенным образом влияет на их токсичность, заряд и иммунохимические свойства [Portnoy, Martiner, 1985; Ovodov, Gorshkova, 1988; Кни-рель, Кочетков, 1993]
В ходе исследований был проведен электрофоретический скрининг ЛОС десятков природных и лабораторных штаммов различных подвидов возбудителя чумы, что позволило выявить однотипные электрофоретические различия ЛОС Y. pestis subsp. pestis (рис. 1, треки 1, 2) из клеток чумного микроба, выращенных при различных температурах культивирования. Они визуализировались как увеличение подвижности ЛОС, синтезированных при более высоких температурах.
1 2 3 4 5
Рисунок 1. Электрофореграмма ЛОС Y. pestis: 1-КМ218 (25 °С), 2- Y. pestis КМ218 (37 °С), 3 -Y. pestis EVI IM (25 °С), 4 - Y. pestis EVI IM, 5 -Y. pestis 1146 (37 °C)
ЛОС штамма Y.pestis subsp. caucasica 1146 не имел отчетливых температуропосредо-ванных электрофоретических различий, а подвижность ЛОС EVI1M при обеих температурах синтеза имела одинаковые значения и была максимальной среди всех исследованных препара-
10
тов, что свидетельствует о различиях степени редуцированности молекулы ЛОС чумного микроба.
Электрофоретические различия ЛОС нашли подтверждение при изучении лизиса природных изолятов У. ЛПС специфическим фагом FP1 [Горшков и др, 1999, Балахонов и др., 2001] Из данных, представленных в табл 1, следует, что чувствительность к литическому действию фага зависит от природы штамма, а отсутствие лизиса при температуре 37 °С не связано с экранированием поверхности клеток капсулой Как показали исследования с варьированием температуры культивирования клеток штамма УEV от +8 °С до +28 °С, температура 26 °С является критической для литического действия фага FP1 Увеличение температуры выращивания клеток выше 26 °С приводило к формированию у чумных бактерий устойчивости к литическому действию фага, а уменьшение сопровождалось повышением чувствительности клеток к действию фага и увеличению размеров пятен лизиса Становятся понятными результаты предыдущих исследований об отсутствии изменений ЛОС возбудителя чумы, выделенных из клеток, которые выращивали при температуре 28 °С и 37 °С
Таблица 1 Лизис бактериальных клеток R-спедяфическими бактериофагами
Штаммы Фаг FP1 Фаг FP3
микроорганизмов 25 °C 37 T 25 <C 37 T
Е coh F470 (Ra) в/о + h/O
Е coh F588 (Rd,) h/O h/o +
Е coh F583 (Rdj) h/o - h/o +
E coh F51S (Re) h/o - h/o +
S minnesota SF1112(Ra) h/o - h/o -
S minnesota SFl 127(Rb) h/o + h/o -
S minnesota SF 1119(Rc) h/o + h/o
S minnesota SFl 121 (Rdi) h/o + h/o +
S minnesota SFl 118(Rdj) h/o + h/o +
S minnesota SFl 167(Re) h/o - h/o +
Y pestis EV + - -
Y pestis KM215 + - - -
Y pesfuKM218 + - -
Y pestts KM260(11) + - -
Г pestis Tjiwida + - - -
Y pestts Java + - - -
Y pestis 1146 + + - -
Y pestis 358/12p~ + - - •
Y pestts 231 - + H/O h/O
Y pseudotuberculosis 8412 R + - - -
Y pseudotuberculosis 8412 S - - -
Y pseudotuberculosis 9532 R +
Y pieudotuberculosts 9532 S - - -
Y pestis C-527 + + H/O h/o
Y perns АЛт + + h/o h/o
Г pestis A-436 + + h/o h/o
Y pestis C-533 • + h/o h/o
Y pestis C-534 - + h/o h/o
Примечание «+»наличиелизиса,«-»отсутствиелизиса, н/о-неопределяли.
Изученные R варианты Y. pseudotuberculosis (табл. 1) обладали аналогичной основному подвиду возбудителя чумы чувствительностью к действию фага FP1 - клетки лизировались при температуре культивирования 25 °С и были резистентными при более высокой температуре выращивания, что указавает на наличие общего, по крайней мере, для двух видов йерсиний -Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, механизма блока синтеза полноценного кора.
При тестировании чувствительности природных вирулентных штаммов Y. pestis было выявлено, что среди основной массы штаммов, чувствительных к фагу при 25 °С (Y. pestis subsp.pestis (9 штаммов), Y.pestis subsp. altaica (15 штаммов), Y.pestis subsp. hissarica (7 штаммов)), клетки некоторых штаммов лизировались как при температуре 25 °С, так и при температуре 37 °С (Кpestis 1146, С-527, А-1108, А-436), обладали обратной чувствительностью (Кpestis 231, С-533, С-534), либо демонстрировали устойчивость при обеих температурах тестирования (Y. pestis subsp. ulegeica (4 штамма)). Прослеживается взаимосвязь между чувствительностью клеток Y. pestis к фагу FP1, подвидовой и географической принадлежностью возбудителя чумы. Полученные результаты позволили предложить дополнительные критерии типи-рования выделяемых из различных природных очагов штаммов возбудителя чумы и явились базой для выбора штаммов (КМ218, EV11M, КМ260 (11), 1146), с целью последующего изучения молекулярной организации ЛОС Y. pestis.
Впервые был определен состав и последовательность моносахаридов в коре ЛОС Y.pestis (рис. 2, табл. 2), который, как выяснилось, относится к несальмонельному типу [Виноградов и др., 2002, Knirel et al, 2003].
Установлено, что в коре ЛОС Y. pestis имеется структурно-консервативный участок, общий для трех из изученных штаммов (Кpestis KM260 (11), КМ218, KIMD1), и вариабельный участок, структура которого меняется и зависит от температуры культивирования бактерий. Было показано, что ЛОС (25 °С) является гетерогенным в отношении строения олигосахарида кора в представлен четырьмя основными гликоформами, которые отличаются присутствием различных терминальных моносахаридов. Напротив, ЛОС (37 °С) представлен только одной из этих гликоформ и, таким образом, структурно значительно более гомогенен. Повышение температуры культивирования оказывало неблагоприятный эффект на включение в состав кора галактозы и октулозоновой кислоты (Ко).
Таблица 2. Распределение структурных вариантов олигосахаридов в ЛОС различных штаммов Y. pestis с полным кором. _____
1 Варьируемые компоненты кора Мол. вес KM218 1146 КМ 2 60 KIMD1
25'С 37 'С 25 *С 37 "С 25 «С 37 "С 25'С 37-С
я Н P-Gal p-GlcNAc 1341.43 ++ ± + + +
Ь а-Ко P-Gal (KJlcNAc 1577.48 ++ + ++ + ++
с Н а-DDHep p-GlcNAc 1371.44 ++ -н- + ++ ++ -Н-
d а-Ко а-DDHep P-GlcNAc 1607.49 -н- ± -н- + ++ +
е Н a P-GlcNAc 1179.38 +
Г а-Ко Н (3-GlcNAc 1415.43
R Н p-Gal H 1138.36 + + + + +
h а-Ко P-Gal II 1374.40 + -н- ++ ++
i Н а-DDHep H 1168.35 + ++ + + ++ +
I а-Ко а-DDHep H 1404.41 + ++ ++
k Н H H 976.30 +
1 а-Ко H H 1212.35
ДОС (25 °С) К реях КМ218, КМ260 и КДУ1Р1
£-1>-а1срНЛс -(1 -» 3)-Ь-а-0-Нч>р-(1-> 3)-Ь-в - Р-Нер ;>-(!-► 5)-1Мо
7 4 4
Г т т
1 1 2
- Р — 0!ср а*К6ор
р-0-01срЫАс -(1-» 3)-Ь-а-0-Нерр-(1-» 3) - Ь - в _ о - Нер р - (1 -» 5)- К<1о
7 4 4
Г
1 1 2
О -а - Э-Нер/>-(1 7)-Ь-а - 0*Нер/> д-о-аор а - К4ор
р - О - «с рНЛс -0-»3)-1--а-1Э - Нетр - (1 -» 3) - Ь- о - О - Нер р - (1 5) - К<1о
7 4 4
т 1 т
I 1 2
- Нер р Р - й - Окр а - Кор
У? - Э - Ос^^Ав — (1—*3) — Ь — а — й- Нер р — л - Ц - Нер р - <1->3)-К4>
7 4 4
т т 1 т 2
Э -а-Э •Нер/> •(!-+ 7)-Ь-а-й-Нсрр Р-О-Оср а - Кор
ЛОС (37 "О К ^гяи КМ218, КМ260 н МШИ
Р - О - СИе yNAo — (1-*3) — Ь-а-Б- Нер р — (1 -» 3) - I в-О - Нер р - (1 -» 5) - Ша
7 4 4
т 1 * 1 т 2
С . а - О - Нер р - (1 -* 7} - Ь- а ■ й - Нер р р -Т> - 0|е р а • К(1о р
ЛОС (25 °а К реях 1146
р - Э - (Ие^ЫАг - (1 -» 3) - I. - а - Й - Нер/> - I." а - Р- Нерр - (1 -» 5) - КЛо
7 4 4
1 т
1 1 2
Р-Ь- С1ср а - КАор
р-О-&срИАя - (1 -» 3) - 1, - а - В - Нер р -1 - а -V - Нер р - (1 5) - КЛо
7 4 4
1 т \ г
/!. 0-С«1р-(] -> 7)-1_-0Г-О-Нерр Р-П- Иер а - Кор
ЛОС (37 °С) К />«Ги 1146
/I - О - ОкрЫАо -(1-»3)-Ь-а-0-Нерр- а-»з>- (Г-Р-Нерр- (1-» 3)- КЛо
7 4 4
т
1 1 2
Ь-а • Р- Нер/> Р-0-С\ср а-КЛор
Рисунок 2. Структуры основных гликоформ кора в ЛОС (25 °С) и ЛОС (37 °С) штаммов Г.рет/и КМ218, КМ260 и К1М01, 1146. Обе основные гликоформы кора ЛОС (25 °С) штамма 1146 содержат глицин в неизвестном положении.
Нам удалось установить молекулярную природу отличий кора ЛОС представителя подвида caucasica, Y. pestis 1146, от ЛОС подвидаретйз. Наиболее значимое отличие заключалось в отсутствии D-глицеро-сВ-манно-гептозы (DDHep) в ЛОС Y. pestis 1146 и замене ее при температуре 37 °С на Gal (Galactose, галактоза). Дополнительная гетерогенность и отличительная черта данного штамма связана с наличием глицина в ЛОС Y. pestis 1146, выращенного при температуре ° 25 °С, но не 37 °С, причем включение глицина зависит не только от температуры культивирования, но и от состава питательной среды. Дальнейшего выяснения требует вопрос - является ли это общей закономерностью для «полевочьих» штаммов или эта уникальная. структура присуща только данному представителю подвида?
Как оказалось, клетки лабораторного штамма Y. pestis EV11M продуцируют укороченный кор, ограниченный внутренним дисахаридом, который состоит из двух остатков Kdo (3-дезокси^-манно-окт-2-улозоновая кислота) или остатков Kdo и Ко. Таким образом, этот штамм является наиболее глубоким R-мутантом из всех исследованных штаммов возбудителя чумы. Другая характерная особенность этого штамма - обратная температурная зависимость включения Ко.
С повышением температуры культивирования происходят изменения не только кора, но и липидного участка ЛОС (липида А) возбудителя чумы, выражающиеся в уменьшении содержания жирных кислот и 4-амино-4-дезоксиарабинозы (Ara4N) (рис. 3, табл. 3). Эти данные были нами получены одновременно с группой К. Kawahara [2002]. Степень температуроопосредо-ванного дезацилирования липида А зависит также от состава культуральной среды, в результате чего может происходить синтез не тетраацильных производных липида А, а триацильных вариантов. Возвращаясь к результатам электрофоретических исследований, можно заключить, что увеличение подвижности препаратов ЛОС (37 °С) по сравнению с ЛОС (25 °С) обусловлено не только увеличением степени редуцированности кора, но и уменьшением степени ацили-рования липида А.
Таолица 3. Отличия структуры липида А в штаммах У- ре.г/«, выращенных при различных темпера тур ах. _ ______ __________ _
Тип липида А КМ218 KIMD1 КМ260 1146 EVUM
25 °С 1 37 °С 25 °С | 37 "С 25 °С | 37 °С 25 'С | 37 "С 25 -С 1 37 "С
Относительное содржиние О-ациящ рованных вариантов (%>
Тетраацильныс варианты (4 х 3-ОНС14.0) 70 100 85 81 95 100 52 93 88 81
Пснтаацильные варианты (тетраацильныс +С 12:0 или+С16:0) 15 следы 11 19 5 42 7 12 19
Гсксаацильныс варианты (тетраацильные +С 12:0 +С1б:1) 15 4 следы 6
Относительное содержание Ara4N (%)
ди-Ага4М варианты 92 27 72 16 76 43 93 94 42 61
MOHO-Ara4N варианты 8 35 28 45 24 45 7 6 42 27
Варианты, не содержащие Ara4N 38 39 12 16 12
Примечания С12:0 ■ додсканоная (лаурипопая) кислота; С 16.0 - гсксадеканиная (пальмитииоиая) кислота; С16.1 - гсксадецсноная (гшьмиталсинсшаи) кислота, VOHCHO - З-гидроксигетралскаиовая (3-гидр"кси-миристшюаая) кислота
Рисунок 3. Структура липида А ЛОС У. рехйи КМ218 при различных температурах синтеза Пунктирные линии на рис. 37 °С обозначают несгехиомеггрическое замещение Ага4К
Из результатов, представленных на рис. 3, можно заключить, что штаммы Y. pestis КМ218, КМ260 и KIMD1 (subsp pestis) образуют одну группу «типичных» представителей вида, которые обладают четкой системой контроля структуры ЛОС в зависимости от температуры и состава окружающей среды. Вероятнее всего, вариабельность ЛОС, продемонстрированная в данном исследовании, находится под контролем двухкомпонентной PhoQP-системы передачи сигналов [Hitchen et al., 2002], которая участвует в контроле условий внешней среды и экспрессии целого ряда белков, в том числе и ферментов биосинтеза ЛОС. Штамм Y. pestis 1146 не способен продуцировать один из компонентов кора (DDHep) и контролировать включение Ara4N в состав липида А, тогда как механизм регуляции содержания Gal, Ко и Kdo в коре, а также степени ацилирования липида. А у него такой же, как у штаммов subsp. pestis. Наи-
большие потери отмечены для штамма У.резШ ЕУ11М, он лишен большей части кора, имеет измененный жирнокислотный состав липида А и не способен контролировать температуроза-висимые изменения в структуре ЛОС. Вероятно, мутация в этом штамме в значительной степени затрагивает РЬс^Р-систему передачи сигналов.
ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАЛОС У.реШэ
Результаты изучения структурной организации ЛОС возбудителя чумы были дополнены данными об их иммунохимической вариабельности (рис. 4, табл. 4). Следует подчеркнуть, что только применение комплекса иммунохимических методов (РДП (реакция диффузионной преципитации), РНГА (реакция непрямой гемагтлютинации), РТНГА (реакция торможения непрямой гемагглютинации), ИФА (иммуноферментный анализ)), различных приемов презентации ЛОС для получения антительных препаратов, химической модификации ЛОС (дезацили-рование, дефосфорилирование), применение методов истощения и конкурентого торможения позволило получить действительно объективную информацию об иммунохимических особенностях ЛОС У.реяИя.
Так, МКАТ, полученные иммунизацией ЛОС У. резШ ЕУ (25 °С), очень слабо реагировали с деацилированными препаратами ЛОС из клеток штамма У.резШ К1МБ1 (25 °С) и не реагировали в РНГА с эритроцитами, сенсибилизированными деацилированными препаратами ЛОС, что позволяет сделать вывод о том, что тестируемые антитела направлены против кон-формационных эпитопов липида А, важную роль в формировании которых имеют эфирносвя-занные жирные кислоты.
Результаты теста конкурентного ингибирования РНГА (рис. 4) эритроцитов, сенсибилизированных ЛОС У.резИз (25 °С), подтвердили гетерогенность антигенных детерминант ЛОС, выделенных из клеток различных штаммов чумного микроба, выращенных при указанной температуре.
лпс
Рисунок 4. Конкурентное ингибирование РНГА с использованием эритроцитов, сенсибилизированных ЛОС, Y. pestis (25 °С), с гомологичными антисыворотками. Светлые столбцы - гомологичная EV НИИЭГ (25 °С) система, темные столбцы - гомологичная У. pestis 231 (25 °С) система. 9532 - У. pseudotuberculosis 9532 (R), У.е.- У. enterocolitica ОЗ (37 °Q, Ra - Е. coli F470, S. minnesota SF11I2; Rb - S. minnesota SF1127; Rc - S. typhi Ty21A, S. minnesota SF1119; Rdi -E. coli F588, S. minnesota SF1121; Rd2 - E. coli F583, S. minnesota SF1118; 231" - Y. pestis 231 (рСасГ). 231 - К pestis 231, EVt - Y. pestis EV НИИЭГ(37 °C), EV - Y. pestis EV НИИЭЦ25 °C). 358/12 - Y. pestis 358/12, 1146- Y. pestis 1146, TWJ-Y.pestis Tjiwidej, Java- Y. pestis Java.
При исследовании взаимодействия антисыворотки к клеткам штамма Y. pestis EV НИИЭГ (37 °С) с эритроцитами, сенсибилизированными гомологичным ЛОС (37 °С), были получены результаты, свидетельствующие об их большей специфичности (табл. 4). Ни один из исследованных ЛОС Y. pestis Tjiwidej, Java, 1146, 260(11), КМ218, Y. pseudotuberculosis 8412R, 9532R (25 °C и 37 °C), кроме гомологичного ЛОС Y. pestis EV (37 °C), не тормозил РИГА. Препараты ЛОС R мутантов S. minnesota и Е. coli также не обладали ингибирующей активностью (данные не приводятся).
В соответствии с обнаруженными структурными особенностями ЛОС Y. pestis 1146 (37 °С) в этом. же тесте была выявлена его высокая иммунохимическая специфичность (табл. 4). Критичным для формирования столь узкой специфичности является сочетание двух факторов - отсутствие DDHep и включение в кор Gal при обеих температурах культивирования. Поскольку штамм К pestis 1146 относится к subsp. caucasica, эта особенность может быть присуща и другим представителям данного подвида. Еще одним выявленным примером уникальной специфичности является ЛОС Y. pseudotuberculosis 9532 R (37 °C) (табл. 4).
Таблица 4. Специфичность РТНГА с использованием эритроцитов, сенсибилизированных различными препаратами ЛОС иерсиний (37 °С), с антисывороткой к ияактивированным гомологичным клеткам К резйг (37 °С).
Штамм-продуцент ЛОС для конкурентного ингиби-рования■
Г. pseudotuberculosis 9532 R (25 °С) Y. pseudotuberculosis 9532 R (37 °С) Y. pestis Java (25 °С) Y. pestis Java (37 °С) Y. pestis 1146 (25 °C) Y. pestis 1146(37 °C) Y. pestis Tjiwidej (37 °C) Y. pestis EV (37 °C) Y. pestis EV (25 °C) Y. pestis KM218 (25 °C) Y. pestis KM218 (37 °C) Y. pestis EV (260(11)) (25 °C) Y. pestis EV (260(11)) (37 °C)
К pestis EV
Специфичность РТНГА эритроцитов, сенсибилизированных ЛОС (37 °С)
Y. pestis КМ218
+ + + +
+
^tS. +
У. pestis 260(11)
+ +
Г* " . +
+ +
••+ -+ +-
Y. pseudotuberculosis 9532R
; _ + « " ■
У. pestis 1146
+ ,
Примечание. Вщелены положительные результаты конкурентного ингибирования
Таким образом, впервые показано, что олигосахаридный и липидный участки ЛОС У. pestis имеют отчетливо выраженную температуре- и штаммозависимую вариабельность. Для препаратов ЛОС изучаемой группы штаммов, синтезированных при температуре 37 °С, показана более узкая штаммовая иммунохимическая специфичность. На основании полученных результатов нами был сделан вывод о том, что иммунизация ЛОС чумного микроба индуцирует синтез антител, по меньшей мере, четырех различных типов специфичности, расположенных ниже в порядке уменьшения их доминирования:
1. Антитела к липиду А, перекрестно реагирующие с ЛОС энтеробактерий, в формировании которых важную роль играют эфирносвязанные жирные кислоты липида А (транзиторные полосы в РДП (реакция диффузионной преципитации), потеря активности моноклональных анти-
тел после мягкого щелочного дезацилирования тестируемых ЛОС), определяя родоспецифиче-ское узнавание.
2. Антитела к дезацилированным вариантам липида А (видоспецифические, продуцируются в ответ на иммунизацию препаратами ЛОС Y. pestis, синтезируемым при температуре 37 °С).
3. Антитела к консервативным структурам кора (перекрестные реакции ЛОС, синтезированных при низких температурах культивирования, видоспецифические).
4. Антитела к вариабельным структурам кора (штаммовая специфичность, отсутствие перекрестных реакций в условиях синтеза ЛОС при температуре 37 °С).
Отсутствие перекрестной протективности ЛОС различных штаммов Y. pestis легко объясняется композиционными различиями изучаемых препаратов, индикатром которых является чувствительность к фагу FP1. Широко используемый в работах вирулентный штамм Y. pestis 231, обладает реверсивной фаговой чувствительностью, то есть лизис наблюдается при температуре 37 °С, но не 25 °С, тогда как ЛОС вакцинного штамма Y. pestis EV - типичной. Очевидны различия в ЛОС применяемых штаммов. Структуру ЛПС штамма Y. pestis 231 предполагается изучить в ближайшее время.
Обнаруженный нами феномен вариабельности ЛОС Y. pestis стимулировал проведение блока исследований, охватывающих изучение влияния температуроопосредованных изменений на биологические свойства ЛОС. Располагая данными об уменьшении степени ацилирования липида А возбудителя чумы при повышении температуры культивирования бактерий, можно было ожидать изменений в биологической активности липида А (37 °С) в сторону уменьшения его токсичности, резистентности к бактерицидному действию сыворотки и индукции синтеза провоспалительных цитокинов.
Как показали результаты экспериментов, клетки штаммов Y. pestis KM218, КМ260(11), KIMD1, выращенные при температуре 25 °С и 37 °С, обладали резистентностью к бактерицидному действию 80 %-ной человеческой сыворотки (рис. 5).
В противоположность этому, клетки штаммов 1146 и EV11M оказались высокочувствительными к действию комплемента сыворотки. Более того, клетки штамма 1146, выращенные при температуре 37 °С, погибали при инкубации с интактной сывороткой, то есть были еще
более чувствительны к действию комплемента, чем клетки того же штамма, культивируемые при 25°С
Бактерии всех изученных штаммов возбудителя чумы вне зависимости от температуры культивирования оказались резистентными к бактерицидному действию нормальной мышиной сыворотки, разведенной до 80 % (рис. 6) Таким образом, "полевочьи" штаммы, а представителем их в данном исследовании являлся штамм 1146, ЛОС которого отличался от всех остальных электрофоретически, иммунохимически и структурно, устойчивы к действию комплемента мышиных сывороток, но чувствительны к системам комплемента человека
По нашим и литературным [Ong, Mattes, 1989; Ong et al., 1992] данным, продемонстрированная устойчивость объясняется тем, что уровень комплемента у лабораторных мышей, впрочем, также как и у диких, находится на очень низком уровне по сравнению с таковым у людей, крыс, морских свинок и других млекопитающих (у лабораторных мышей в 80-90 раз меньше, чем у людей) Штамм 1146 Y.pestis подвида caucasica, который циркулирует в популяциях полевок [Кокушкин, 1995], является высоко вирулентным для полевок и лабораторных мышей, но авирулентен для морских свинок и людей. Это дает возможность предположить, что различные концентрации комплемента в крови хозяев могут быть одной из основных причин избирательной вирулентности штаммов Y. pestis данного подвида. Вполне вероятно, что в процессе эволюции низкий уровень комплемента в крови естественного хозяина (полевок) вызвал ряд адаптационных изменений ЛОС, а возможно и белковых компонентов, ответственных за взаимодействие с системой комплемента, в связи с ненадобностью указанных биологических функций. Если предположить, что снижение резистентности клеток штамма Y.pestis 1146 к бактерицидному действию сыворотки определяется только ЛОС, то ответственен за эти изменения коровый участок ЛОС (уменьшение содержания Gal и отсутствие DDHep при 37 °С), так как липидный участок ЛОС данного штамма не имеет значимых отличий от липида А трех «типичных» штаммов - Y.pestis KM218, КМ260 (11), KIMD1. Сравнительный анализ химической структуры ЛОС из штаммов, отличающихся по чувствительности к бактерицидному действию человеческой сыворотки позволил локализовать в составе кора остатки гептозы, пред-
положительно обеспечивающие универсальную вирулентность штаммов основного подвида возбудителя чумы.
Из данных, представленных на рисунках 7, 8 прослеживается связь между разницей в химической организации препаратов ЛОС различных подвидов У. и в обусловливаемой ими индукции синтеза провоспалительных цитокинов и вирулентностью клеток возбудителя чумы для млекопитающих.
Препараты ЛОС, синтезируемые бактериями чумы при температуре 25 °С, за исключением КМ260(11) для NO, KM218 и КМ260(11) - для ТЩмх, индуцировали синтез этих соединений в большей степени, чем ЛОС (37 °С). Наименьшей индуцирующей активностью обладали более редуцированные формы ЛОС (37 °С) штаммов 1146 и EV11M. Дезацилированный
мягким щелочным гидролизом ЛОС Y. pestis KIMD1 (25 °С) индуцировал включение механизмов неспецифической резистентности в достоверно меньшей степени, чем исходный препарат или ЛОС (37 °С).
Изучение токсичности ЛОС на модели мышей, сенсибилизированных актиномици-ном D, показало, что значения данного параметра для ЛОС (37 °С) всех изученных штаммов, кроме К pestis EV11M, была достоверно ниже, чем у ЛОС (25 °C), минимальной активностью при обеих температурах синтеза обладали препараты ЛОС Y. pestis 1146 и 11М
Взятый в качестве контроля ЛПС F. tularensis, который лишен гептоз кора, содержит в составе лилида А только четыре ацильных остатка вместо шести, не имеет фосфатных групп [Perry et at, 2003], по индукции синтеза TNF-a соответствовал ЛОС Y. pestis 1146 и 11М, показатели продукции N0 у него были достоверно ниже, чем у ЛОС возбудителя чумы, а уровень токсичности соответствовал химически дезацилированному ЛОС штамма KIMD1.
TNF-a относится к цитокином, играющим ключевую роль в формировании иммунного и воспалительного ответа в ответ на инфекцию. Секретируемый, в основном, макрофагами, он воздействует на различные типы клеток, вовлеченные в защитные реакции хозяина. Уровни синтеза TNF-a у мышей, инфицированных вирулентными клетками Y. pestis гораздо ниже, что, в основном, обусловлено имуносупрессорным действием белков LcrV, YopP/YopJ [Cornelis et al., 1998]. Однако, возбудитель чумы, как показано в данном исследовании, обладает также механизмами регуляции синтеза ЛОС, способность которого индуцировать синтез по-
нижена при температуре тела хозяина сообразно иммуносупрессорной активности белков, кодируемых плазм идой pCad.
Таким образом, наличие или отсутствие DDHep в коре и степень его редуцированности (Кpestis 1146 и 11М), а также температуроопосредованное частичное дезацилирование липи-да А оказывают влияние на синтез NO и TNF-a. В дальнейшем мы планируем провести дополнительный цикл исследований in vivo для определения влияния изменений жирнокислотного состава липида. А на иммунобиологические свойства ЛОС возбудителя чумы.
РОЛЬ ЛОС В РЕАЛИЗАЦИИ ПАТОГЕННОСТИ Y. pestis
Располагая представленной выше информацией по молекулярной организации, иммуно-химической и биологической активности препаратов ЛОС Y. pestis, можно попытаться оценить биологическую значимость его вариабельности. ЛОС возбудителя чумы, наряду с кодируемыми плазмидами температурозависимыми белками, оказывается прецизионным инструментом регулирования взаимодействия патогена с постоянно меняющимися факторами внешней среды, существованию в организмах различных хозяев и переносчиков, координируя присущую им разноплановую биологическую активность с белковыми факторами патогенности чумного микроба:
1.Взаимодействие с белковыми факторами патогенности чумного микроба. Уменьшение цитокининдуцирующей активности ЛОС, синтезированного при температуре тела теплокровного хозяина согласуется с иммуносупрессорной активностью Yops [Cornellis et al., 1998]. Отсутствие О-полисахаридных цепей в клетках возбудителя чумы усиливает свойства Pla, связанные с вирулентностью микроорганизма [Lang etal., 2002]. В недавней работе Е.П. Соколовой [2002] показано, что in vitro мышиный токсин и ЛОС возбудителя чумы могут взаимодействовать между собой с образованием высокотоксичного комплекса. При этом количества мышиного токсина и ЛОС, сублетальные для белых мышей и свинок по отдельности, проявляют синергидную токсичность.
2. Угнетение способности индуцировать механизмы врожденного иммунитета хозяина. Отсутствие О-специфических боковых цепей и синтез редуцированных R форм ЛОС возбу-
дителем чумы определяют устойчивость к комплементзависимому лизису бактерий [Porat et al, 1995], что является необходимым условием для выживания и роста в крови и важным в плане трансмиссии патогена между двумя хозяевами - млекопитающими и блохами [Brubaker, 2000, Домарадский, 1993, Perry, Fetherston, 1997, Анисимов, 2002], а также устойчивость к катион-ным антимикробным пептидам, которые являются ключевыми компонентами врожденного иммунитета [Bengoechea, 1998, Dimopoulos, 2003] "Ранняя защита", возникающая обычно после введения ЛПС как период толерантности к гомологичному или гетерологичному ЛОС и резистентности к бактериальным, вирусным и паразитарным инфекциям [Greisman, 1973, Warren, Chedid, 1987], опосредуется цитокинами, важнейшими из которых являются TNF-a и IL-1 [Greisman, 1973, Warren, Chedid, 1987] Результаты наших исследований свидетельствуют о наличии температурропосредованной штаммозависимой модификации кора и липида А ЛОС Y pestis, результатом которой является подавление способности запускать механизмы врожденного иммунитета хозяина. Стратегия борьбы с защитными силами макроорганизма путем угнетения синтеза TNF-a присуща не только Yersinia, но также Brucella spp [Сагоn et al, 1994], Listena monocytogenes [Demuth et al, 1996], Bacillis anthracis [Hoover et al, 1994], Mycobacte-num avium [Sarmento, Appelberg, 1995], Leishmama donovani [Descoteaux, Matlasshewski, 1989], вирусам, что свидетельствует о ее широком использовании патогенами
3 Уход от механизмов специфического иммунного ответа При попадании чумного микроба в организм млекопитающего посредством укуса блохи эпитопы кора ЛОС экспонированы на поверхности и не экранированы секретируемыми и мембранными белками, синтез которых является температурозависимым Происходит запуск иммунного ответа на консервативные и вариабельные иммунодоминаытные антигенные детерминанты кора, специфичные для ЛОС (25 °С), тогда как эпитопы, специфичные для ЛОС (37 °С), по нашему мнению, или экранированы стерически или еще отсутствуют - налицо направление иммунного ответа «по ложному следу» Далее происходит синтез коровых структур, которые не опознаются антителами, индуцированными ЛОС (25 °С), и уход от защитных иммунных механизмов хозяина Наличие значительной серовариабельности кора объясняет отсутствие протективности в опытах с использованием гетерологичных ЛОС возбудителя чумы или ЛОС-специфических антител Антитела к иммунодоминантным участкам (эпитопам), локализованным в липиде А, не представляют угрозы для патогена in vivo, так как эти эпитопы расположены внутри бактериальной мембраны и не экспонированы для взаимодействия с иммуноглобулинами Кроме того, липид А в сыворотке крови может появиться на терминальных стадиях инфекционного процесса при распаде клеток, когда исход заболевания уже предрешен, но не ранее
4 Обеспечение адаптационной пластичности для персистенции микроба в различных природных ареалах, хозяевах и переносчиках, о чем свидетельствуют уникальные результаты, полученные в ходе выполнения данной работы Биохимические особенности хозяина, такие как низкий уровень комплемента в крови естественного хозяина (полевок), способны вызывать адаптационные изменения структуры кора ЛОС в связи с ненадобностью указанных биологических функций
Многие компоненты возбудителя чумы, экспрессируемые при температуре организма млекопитающего, обладают ярко выраженными имуносупрессорными свойствами [Schesser et al, 1998, Muller et al, 1998] и препятствуют запуску каскада защитных реакций организма, в том числе и путем предотвращения индукции синтеза таких провоспалительных цитокинов, как IL-8, TNF-a [Schesser et al, 1998] Эти данные проясняют стратегию вирулентности возбудителя чумы - разноплановое подавление реакций иммунной системы хозяина в ответ на внедрение чужеродного организма на самых ранних стадиях инфекции, смена иммунохимической парадигмы и затем безудержный рост микроба Один из уникальных механизмов, работающих
для реализации этой стратегии, - температуроопосредованная модификация ЛОС в направлении смены иммунохимической специфичности, а также уменьшения их способности индуцировать синтез провоспалительных цитокинов и вызывать повышение неспецифической резистентности макрорганизма.
Обнаруженный феномен изменчивости ЛОС возбудителя чумы по значимости превосходит факт наличия вариабельности капсульного FI и V антигенов в силу его масштабности. Новые данные о ЛОС возбудителя чумы позволяют разработать методы дополнительной внутривидовой дифференциации патогена, понять особенности молекулярной организации и механизмов вирулентности различных подвидов возбудителя чумы, а также ставят новые вопросы о масштабах я формах их изменчивости, роли вариабельности в персистенции патогена в природе, адаптации к смене хозяев и переносчиков.
ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТОВ FI И РН6 АНТИГЕНОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ ИХ ПРЕЗЕНТАЦИИ
Поскольку к моменту начала исследований уже было установлено, что способ иммунизации, степень агрегации, доза, способ презентации антигенов существенным образом меняют их иммуногенность и тип индуцируемого иммунитета, то в данном исследовании все вышеуказанные факторы были по возможности учтены. Мы изучали иммуногенность капсульного и рН6 антигена в виде агрегатов и отдельных субъединиц, в комплексе с МФЛА (монофосфорил-липид А), экспрессируемыми бактериальными векторами. В качестве бактериальных векторов для экспрессии капсульного антигена выбраны аттенуированные варианты сальмонелл, в частности, S. typhimuruim SL3261, S. minnesota R595, S. typhiTy21a.
Показано, что МФЛА в комплексе с капсульным белком способен повысить его протек-тивные свойства в ранние сроки после иммунизации (рис. 9). Введение МФЛА накануне белковой иммунизации приводит к достоверному снижению протективных свойств капсульного белка. Аналогичным образом предварительное введение МФЛА влияет на протективность живой чумной вакцины, снижая ее приживляем ость и способность к персистенции в организме мышей и морских свинок (табл. 5).
Наибольшее потенциирующее действие МФЛА реализуется в ранние (3-14 сутки) сроки после иммунизации, когда протективность препаратов FI, комплексированных с МФЛА достоверно выше, чем у других исследованных образцов. Отсутствие влияния МФЛА на пике иммунитета можно объяснить тем, что FI сам по себе в высокополимеризованной форме является сильным иммуногеном и интенсивность формируемого иммунитета в эти сроки находится на пике возможностей иммунной системы.
Таблица 5. Протективность тестируемых препаратов для контрольных и праймированных МФЛА мьппей на 21 сутки после иммунизации._
Иммунизирующий агент Индексы иммунизации Средние сроки гибели (сутки)
МФЛА за сутки, ЕV (105 КОЕ) 10 8,5+0,6
EV (105 КОЕ) 1000 8,4+1,0
МФЛА за сутки, FT 10 8,4f0,9
ПхМФЛА 850 9,3±U
FI 700 9,4±1,6
Контроль 16 5,510,7
3 7 14 2 1 30 60 90. 180 сутки
Рисунок 9. Протективная активность различных препаратов капсульного антигена в сравнении с живой чумной вакциной ЕУ, представленная как ^ ЕЙ». К - неиммунная группа; П У.р -капсульный антиген, выделенный из вакцинного штамма У. рейк ЕУ; ЕУ - вакцина живая чумная коммерческая; РТ Б.т - капсульный антиген, выделенный из рекомбинантного штамма Я- ттпезМа 11595; ПхМФЛА - капсульный антиген, выделенный из рекомбинантного штамма 5. minnesota 11595, комплексированный с МФЛА.
Кроме того, комплексирование FI антигена с МФЛА приводило к повышению его им-муногенности, что выражалось в повышении титров FI антител и регистрации их в более ранние сроки. МФЛА, комплексированный с FI белком, становится, в свою очередь, более имму-ногенным, индуцируя выработку специфических антител (рис. 10). Препараты капсульного антигена, содержащие в своем составе ЛОС или МФЛА, более активно стимулировали клеточный иммунитет при ревакцинации животных первично иммунизированных живой чумной вакциной, чем один FI антиген.
Рисунок 10. Динамика титров антител к И антигену К ршй при иммунизации различными антигенными препаратами. П-Бт - рекомбинантный капсульный белок из штамма 5. ттпезоХа 11595 рР81, П-МФЛА - рекомбинантный капсульный белок из штамма 8. тЫпезМа Я595 рРБ1, комплексированный с МФЛА, П коммерч - капсульный белок чумной коммерческий, вакцина ЕУ - вакцина живая чумная на основе штамма К реу/й ЕУ линии НИИЭГ.
На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что МФЛА в составе белко-волипидного липосомального комплекса с капсульным антигеном Y. pestis способен существенно усиливать его протективные свойства в ранние сроки после иммунизации путем инициации неспецифической резистентности, более быстрой и интенсивной индукции синтеза специфических FI антител и формирования напряженного иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации.
Аналогичный эффект был получен при иммунизации мышей убитыми клетками штамма S. Minnesota R595 pFSl (рис. 11, табл. 6). Такая иммунизация индуцировала развитие ранней резистентности к последующему заражению высокими дозами клеток вирулентных штаммов возбудителя чумы. Этот факт особенно важен с точки зрения разработки иммунопрофилакти-ческих препаратов для экстренной профилактики контингентов, находящихся под угрозой заражения.
Важный для конструирования иммунопрофилактических препаратов итог изучения молекулярной организации /га оперона, кодирующего синтез капсульного антигена, состоит в том, что нарушения еа/1Ы гена приводят к появлению серологически атипичного капсульного антигена с измененными иммунохимическими и протективными свойствами [Анисимов и др., 1991-1997, Гремякова и др, 1993]. Эти данные необходимо учитывать при выборе генетической конструкции, предназначенной для создания штамма-продуцента. Учитывая то обстоятельство, что нарушения са/М области приводят к формированию атипичных вариантов FI, во всех наших исследованиях, которые связаны с конструированием и изучением иммунопрофо-
лактических и диагностических препаратов, мы использовали структуры только с полнымfra опероном.
Изучали группу aro мутантов, любезно предоставленных проф. В. Stacker (США), S. typhimurium SL3261, S. typhimurium SL7207. Выбор штаммов определялся тем, что они являются общепринятой в мире моделью, с помощью которой проверяется экспрессия гетероло-гичных белков, стабильность наследования рекомбинантных плазмид, иммуногенность продуцируемых антигенов и особенности формирования иммунитета [Dougan, 1994; Oystoa 1995]
Рекомбинантный клон aro мутанта - S. typhimurium SL3261 pFSl синтезировал FI антиген в секретируемой форме. Практически весь белок (около 90 %) тестировали в культуральной среде, синтез его носил температурозависимый характер. Согласно результатам РДП, РНГА, РТНГА, ИФА все проверенные нативные чумные и рекомбинантные препараты FI антигена были иммунохимически идентичны. Синтез FI антигена в клетках 51 typhimurium SL3261 pFSl штамма тестировали на уровне (20+5) мкг/10' КОЕ. Плазмида pFSl стабильно сохранялась в клетках штамма S. typhumurium SL3261 in vitro в течение трех пассажей без селективного давления антибиотиков. Количество выросших колоний на чашках с ампициллином после переноса с чашек без ампициллина составляло 100 %. Однако, после второго пассажа уровень синтеза FI антигена уменьшался (рис. 12 (В)).
На рис. 12 (В) представлены данные, характеризующие уровень экспрессии капсульно-го антигена во время персистенции рекомбинантных клеток S. typhimurium SL3261pFSl in vivo. На 1,3,7 сутки после иммунизации в супернатанте культур рекомбинантных клонов, выделенных из печени и селезенки, методом РНГА определяли содержание FI антигена. Результаты представлены как средние значения логарифмов титров РНГА по 3-5 клонам, суспендированным до концентрации, соответствующей
Мы не обнаружили уменьшения уровня синтеза FI антигена in vivo. Более того, можно полагать, что селекция в печени и селезенке идет различными путями и приводит к отбору в селезенке клонов с более высоким уровнем синтеза FT антигена, тогда как в печени уровень синтеза постоянен. Для определения стабильности наследования плазмид in vivo мышей инфицировали внутрибрюшинно клетками рекомбинантного штамма, на 1, 3, 7, 14 дни осуществляли высев бактерий из печени и селезенки, подсчитывали количество плазмидосодержащих бак-
термальных клеток (табл. 7). Дополнительной обработки животных антибиотиками не проводили.
Результаты опыта, представленные в виде процента выживших животных, свидетельствуют о более высокой эффективности внутрибрюшинной иммунизации (50 % выживших животных), по сравнению с группой, иммунизированной дважды орально (рис. 13). Все мыши в контрольной неиммунной группе пали. Тем не менее, оральная вакцинация обеспечивала защиту 20 % иммунных мышей.
Таблица 7. Динамика высева антибиотикорезистентных (арк) бактерий S. lyphimurium SL3261pFSl из органов мышей, иммунизированных внутрибрюшинно
Сроки после им-
Уровень антибиотикорезистентных клеток S. lyphimurium SL3261pFSl Обсемененность селезенки Обсемененность печени
всего арк (%) всего арк (%)
1 5,3х102 2,lxl0z 40,0 3,1x10' 4,4х102 14,0
3 1,5x10' 9,4х103 54,5 9,4x103 9,9x102 10,5
7 1,6x10' 1,0x10' 63,4 4,3x10' 9,2х102 21,4
Рисунок 13. Эффективность защиты мышей, иммунизированных бактериями рекомби-нантного штамма 5. typhimurium SL3261pFSl при экспериментальной чуме. ¡р. - однократная внутрибрюшинкая иммунизация, per os - двукратная оральная иммунизация, Control - контрольная неиммунная группа животных.
В результате проведенной работы получен ряд молекулярных и рекомбинантных клеточных препаратов, обладающих высокими протективными свойствами при экспериментальной чуме в ранние и отдаленные сроки после иммунизации, а также на пике иммунного ответа. Используя различные способы презентации капсульного антигена, такие как корпускулирова-ние с МФЛА, экспрессия в аттенуированных сальмонеллах, можно конструировать иммуно-профилактические препараты для решения конкретных проблем практического здравоохранения.
В ходе выполнения следующего этапа работы охарактеризован рекомбинантный рНб антиген, выделенный из штамма Е. coli GM83 pYG824, показана их идентичность рНб белку штаммов Y.pestis. Выявлены различия в биологической активности внутри- и внеклеточных форм рН6 антигена. Схожесть молекулярной организации оперонов, кодирующих оба "кап-сульных" антигена чумного микроба - рН6 и FI, а также биологической организации белков позволяют с достаточно высокой вероятностью прогнозировать необходимость использования полноценного psa оперона, а не только структурного гена для экспрессии антигенно-специфического, функционально активного полимера рНб антигена. Можно полагать, что экспрессия только гена, кодирующего синтез белковой субъединицы рНб антигена в составе ре-
комбинантных плазмид, слитных белков и т д. приведет к получению серологически атипичных, функционально неактивных мономеров, как это показано для капсульного FI антигена.
Путем химической (формалинизация) и термической обработки был получен ряд производных рНб антигена различной степени полимеризации с варьирующими биологическими свойствами (цитотоксичность, способность вызывать воспаление при внутрикожном введении и агглютинировать эритроциты). В результате изучения протективности полимеризованных и деполимеризованных форм рНб антигена на морских свинках и мышах получены данные, свидетельствующие об отсутствии у данных препаратов протективных свойств для обеих лабораторных моделей животных (рис. 14) Полимеризованные формы, способные презентироваться по МНС1 и МНСП путям, индуцируя как клеточный, так и гуморальный ответ, способны защитить морских свинок от 2 ИЭя>, а мышей от 8 1ЛЭзо вирулентных клеток чумного микроба Де-полимеризованные препараты, презентирующиеся по МНСИ пути (индукция гуморального иммунитета), обладали иммуносупрессирующим действием и повышали восприимчивость животных к летальной инфекции.
Рисунок 14 Сравнительные данные по протективности препаратов рНб антигена для мышей и морских свинок рНб - нативный рНб антиген, рНб (56) - рНб антиген, прогретый при температуре 56 °С, рНб (100) - рНб антиген, прогретый при температуре 100 °С, рНб* - натив-ный рНб антиген, введенный за сутки до иммунизации. Иммунизирующая доза для мышей и морских свинок - 20 мкг на животное.
Таблица 8. Протективностъ капсульного и рНб антигенов при раздельной и совместной иммунизации мышей с последующий заражением на 21 день иммунизации вирулентными клетками
Иммунизирующие дозы (мкг) Иммунизирующий антиген
рНб FI рНб+FI рНб +ЛПС (10 мкг)
100 8/10 1/10 5/10 9/10
20 8/10 1/10 7/10 10/10
4 8/10 6/10 5/10 10/10
0,8 7/10 6/10 7/10 10/10
Контроль (неиммунные животные) 9/10
Примечание Павшие/живые
Исследование иммуногенности капсульного FI и рН6 антигенов для мышей при их совместной иммунизации (табл. 8) показало, что введение рН6 антигена в состав двухкомпонент-ной иммунизирующей смеси снижает протективность капсульного антигена. Совместное введение рН6 антигена с нативным ЛПС F. tularensis приводило к большему падежу животных в иммунной группе, нежели в контрольной.
В результате анализа собственных экспериментальных и литературных данных, мы пришли к выводу, что использование рНб антигена для разработки иммунопрофилактических препаратов нового поколения неперспективно, так как в высокополимеризованном виде он обладает низкой протективностью, в виде мономеров - иммуносупрессивен.
Вариабельность ЛОС, капсульного FI и V антигенов, установленная как в ходе выполнения данной работы, так и известная по литературным источникам, делает проблему конструирования иммунопрофилактических препаратов против чумы более сложной, а возможно, потребует создания нескольких вариантов вакцин, предназначенных для разных контингенту.
Изменчивость структуры ЛОС чумного микроба свидетельствует о необходимости дальнейшего изучения данного явления и в случае экспериментального подтверждения однотипности структуры кора штаммов У. pestis подвидаpestis (вирулентного для человека) дает возможность включения его монофосфорилированного варианта в составе вакцинного препарата в комплексе с капсульным антигеном или дезацилированного препарата ЛОС (37 °С) в виде гли-копротеинового конъюгата с V антигеном. Преимущества такой формы презентации двух антигенов очевидны — повышается иммуногениость обоих компонентов, уменьшается иммуносу-прессивное действие V антигена, оба соединения являются охарактеризованными и стандартными. Недавно выявленная антигенная вариабельность V антигена и отсутствие защиты животных при заражении штаммами К pestis другого серовара [Worsham, 1998, Griffin, 1998; Roggenkamp, 1997] предполагает целесообразность включения в состав вакцинных препаратов, всех антигенных вариантов V антигена, особенно если речь идет о предотвращении последствий биотерроризма.
выводы.
1.Создана уникальная коллекция R специфических фагов (FP1, FP3, С21), R и S вариантов энтеробактерий, включающая 4 штамма Е. coli, 7 штаммов S. minnesota, 4 штамма У. pseudotuberculosis, 105 природных изолятов, лабораторных штаммов и их производных, относящихся к различным подвидам Y. pestis, разработан оригинальный комплекс методических приемов для фагового и электрофоретического скрининга штаммов и липоолигосахаридов, что стало основой детального изучения молекулярной организации липоолигосахаридов возбудителя чумы, разработки методов дополнительной подвидовой и географической дифференциации штаммов, выявления новых молекулярных механизмов адаптационной изменчивости возбудителя чумы.
2.Впервые установлены полные структуры кора и липида А липоолигосахаридов штаммов У. pestis биоваров antiqua, medicvalis и orientalis основного подвида (subsp. pestis), а также штамма, относящегося к подвиду caucasica, и определена природа их гетерогенности, объяснена иммунохимическая вариабельность и отсутствие перекрестного протективного иммунитета при иммунизации липоолигосахаридами или моноклинальными антителами к препаратам, синтезированным при температуре 25 °С. Найдены особенности молекулярной организации липо-олигосахаридов штаммов Y. pestis subsp. caucasica, которые определяют их высокую вирулентность для полевок и лабораторных мышей и низкую - для большинства грызунов и человека.
3.Разработан оригинальный комплекс методических приемов для проведения иммуно-химического анализа липоолигосахаридов У. pestis. Методическая схема включает способы
тестирования - реакцию диффузионной преципитации, реакцию непрямой гемагглютинации и конкурентого торможения, иммуноферментный анализ, различные приемы презентации липо-олигосахаридов, истощение антисывороток, химическую модификацию липоолигосахаридов (дезацилирование, дефосфорилирование).
4. Впервые показано существование опосредованного липоолигосахаридами механизма противодействия возбудителя чумы запуску и функционированию механизмов специфической и неспецифической резистентности млекопитающих. Липоолигосахариды, синтезированные при температуре тела млекопитающих изменяет антигенную специфичность кора, в меньшей степени индуцируют синтез провоспалительных цитокинов и развитие неспецифической резистентности макрорганизма. Этот механизм позволяет патогену минимизировать развитие воспалительных защитных реакций организмом хозяина и избежать опсонизации специфическими антителами.
5.Рекомбинантные штаммы аттенуированных сальмонелл, экспрессирующие иммуно-генный нативный капсульный антиген чумного микроба, обеспечивают защиту лабораторных животных от высоких заражающих доз с первых дней после парентеральной иммунизации (штамм S. minnesota R595 pFSl, патент № 2046145 от 29 07.1992), протективны при оральных способах иммунизации (штамм S typhimurium SL3261 pFSl).
6.Детоксифицированные производные липида А грамотрицателышх бактерий оказывают выраженное иммуномодулирующее влияние на процесс вакцинации. Образование комплекса монофосфорил липида А с капсульным FI антигеном повышает защитные свойства последнего в ранние сроки иммунизации.
7.рНб антиген при выраженной антигенности (АС. 1797351. (СССР) МКИ G01N33/53), митогенности и важной роли в патогенезе чумы не обладает протективностью для лабораторных животных при использованных способах представления. Химическая (формалинизадия) и термическая обработка рНб антигена сопровождается изменениями степени его полимеризации, антигенных и биологических свойств, а также способа презентации, но это не придает ему протективных свойств.
8.Изменение способа презентации секретируемых белковых антигенов чумного микроба, используемых в комбинациях с детоксифицированными производными липополисахаридов, их экспрессия в аттенуированных сальмонеллах, позволяет получать препараты, которые обладают протективностью в ранние и отдаленные сроки после иммунизации. Разработана биотехнология конструирования молекулярных и рекомбинантных иммунопрофилактических препаратов я получены новые экспериментальные препараты для экстренной и плановой профилактики чумы (патент 2046145 от29.07.1992).
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. АС. 1797351. (СССР) МКИ G01N33/53. Способ получения диагностикума для выявления I антигена чумного и псевдотуберкулезного микробов //Гремякова Т. А, Степаншина В. Н., Волковой К. И. 3 л., приоритет от 5.11.90.
2. Гремякова Т. А, Анисимов А. П, Степаншина В. Н , Говорунов И Г. Экспрессия кап-сульного антигена чумного микроба в микроорганизмах с S- и R- формами липополисахаридов // Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний: Мат. докл. Межведом, науч. конф. 26-28 марта 1991 г. - Киров, 1991. - С. 198-199
3. Гремякова Т. А, Степаншина В. Н., Мицевич Е. В, Негрий В. Ф. Антигенная структура и ростовые свойства клеток чумного микроба в средах различного состава при 37°-ном культивировании // Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний: Мат. докл. Межведом, науч. конф. 26-28 марта 1991 г.- Киров, 1991. - С. 194-195.
4. Степаншина В. Н., Гремякова Т. А., Анисимов А. П., Коробова О. В., Кудрявцева Т. Ю. Сравнительная характеристика препаратов капсульного антигена возбудителя чумы, выделенных из штаммов-продуцентов с R-формами липополисахаридов // Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний: Мат. докл. Межведом, науч. конф. 26-28 марта 1991 г,-Киров, 1991.-С. 197-198.
5. Гремякова Т. А, Анисимов А П., Степаншина В. Н., Кудрявцева Т. Ю., Коробова О. В., Говорунов И. Г. Новый штамм-продуцент капсульного антигена Yersinia pestis II Новые технологии и биосистемы. Мат.. докл. XIV науч.-практ. конф. 21-23 мая 1991 г.- Оболенск, 1991. - С. 7375.
6. Алимов А. П., Гремякова Т. А, Ковалев Ю. Н., Анисимов А П. Клонирование и экспрессия капсульного антигена чумного микроба в клетках Salmonella typhi Tu21a и Salmonella minnesota Re 595 // Новые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы. Мат. докл. XIV науч.-практ. конф. 21-23 мая 1991 г. - Оболенск, 1991. - С. 6-8.
7. Гремякова Т. А., Анисимов А П., Говорунов И. Г. Секреция капсульного антигена возбудителя чумы в энтеробактериях // Новые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы: Мат. докл. XIV науч.-практ. конф. 21-23 мая 1991 г., - Оболенск, 1991. - С. 9-11.
8. Гремякова Т. А., Степаншина В. Н., Шулюпин О. К. Поиск зависимости между антигенной структурой, ростовыми свойствами и составом питательных сред для клеток вакцины чумного микроба // Новые технологии и биосистемы. Мат. докл. XIV науч.-практ. конф. 21-23 мая 1991 г.- Оболенск, 1991. - С. 68-70.
9. Степаншина В. Н., Гремякова Т. А, Анисимов А П. Биологическая активность натив-ного и модифицированного рН6 антигена чумного микроба // Новые технологии и биосистемы. Мат. докл. XIV науч.-практ. конф. 21-23 мая 1991 г.- Оболенск, 1991. - С. 11-13.
10. Степаншина В. Н., Гремякова Т. А, Анисимов А П., Потапов В. Д. Выделение и свойства рН6 антигена чумного микроба // Новые технологии и биосистемы. Мат. докл. XIV науч.-практ. конф. 21-23 мая 1991 г. - Оболенск, 1991а. - С. 78-80.
11. Гремякова Т. А, Степаншина В. Н., Благодатских А Я. Влияние условий культивирования штамма Y. pestis EV НИИЭГ на антигенный состав и выход биомассы // Мат. докл. 6-ой Всесоюзн. науч. конф. Рос. Общ. Микробиол. (Т. 2). 1991г. - Нижний Новгород, 1991. - С. 78-80.
12. Гремякова Т. А, Шулюпин О. К., Мицевич Е. В., Фролов Б. Ф. Компоненты питательных сред, влияющие на конечный выход биомассы чумного микроба // Мат. докл. 6-ой Всесо-юзн. науч. конф. Рос. Общ. Микробиол. (Т. 2). 1991г. Нижний Новгород, 1991. - С. 61-62.
13. Гремякова Т. А, Степаншина В. Н., Коробова О. В., Анисимов Г. А Изучение возможности создания молекулярной противочумной вакцины // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ // Мат. Рос. науч. конф. 1992. - Волгоград, 1992 - С. 63
14. Гремякова Т. А, Степаншина В. Н., Коробова О. В., Анисимов Г. А Протективная активность рекомбинантного штамма Salmonella minnesota R595/GSA. синтезирующего капсуль-ньга антиген чумного микроба при экспериментальной чуме мышей // Ж. Мол. Биол. Ген. Виру-сол.-1993.-^ 1.-С. 23-30.
15. Гремякова Т. А, Степаншина В. Н., Шулюпин О. К., Мицевич Е. В., Негрий В. Ф. Экспрессия основных антигенов Yersinia pestis в питательных средах различного состава при температуре 37 °С // ЖМЭИ - 1993.- N. 1. - С. 16-20.
16. Амельченко В. В., Гремякова Т. А, Ковалев Ю. Н. Изучение феномена гетерологичной защиты, обусловливаемой R-мутантами грамотрицательных бактерий при чуме // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Мат. Рос. науч. конф. 21-23 сентября 1993 г. - Саратов, 1993. - С. 20-21.
17. Гремякова Т. А, Орлов М. Ф., Ковалев Ю. К, Анисимов А. П. Изучение гуморального иммунитета при экспериментальной чуме у мышей // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Мат. Рос. Научн. Конф. 21-23 сентября 1993 г. - Саратов, 1993. -С. 20-21.
18. Гремякова Т. А., Степаншина В. Н., Коробова О. В., Анисимов Г. А., Негрий В. Ф. Про-тективность продуцента капсульного антигена чумного микроба Salmonella minnesota R595 pFSl при экспериментальной чуме у мышей // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Мат. Рос. Научн. Конф. 21-23 сентября 1993 г. -Саратов, 1993. - С. 143-144.
19. Гремякова Т. А., Степаншина В. Н, Михина Л. В., Коробова О. В., Анисимов Г. А. Динамика фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов мышей, иммунизированных экспериментальными чумными вакцинными препаратами // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Мат. Рос. науч. конф. 21-23 сентября 1993 г. -Саратов, 1993.-С. 17-18.
20. Гремякова Т. А., Фурсова Н, К, Ковалев Ю. К, Анисимов Г. А. Экспрессия капсульного антигена чумного микроба штаммами-продуцентами на средах различного состава // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Мат. Рос. науч. конф. 21-23 сентября 1993 г. - Саратов, 1993. - С. 167-168.
21. Михина Л. В., Гремякова Т. А., Степаншина В. Н., Коробова О. В., Анисимов Г. А Изучение макрофагальных механизмов поствакцинального иммунитета при экспериментальной чуме // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Мат. Рос. науч. конф. 21-23 сентября 1993 г. - Саратов, 1993. - С. 30-31.
22. Степаншина В. Н., Гремякова Т. А., Анисимов А. П., Потапов В. Д. Физико-химическая и биологическая характеристика рНб-антигена Yersiniapestis, выделенного иммуносорбционным методом // ЖМЭИ. - 1993. - № 3. - С. 12-17.
23. Анисимов А. П., Гремякова Т. А, Амельченко В. В. Изучение протективности "химической" и убитой экспериментальных вакцин серовара FI-3 в отношении гомологичного штамма Y. pestis II Профилактика и методы борьбы с чумой: Мат. межгосударственной науч. конф. поев. 100-летию открытия возбудителя чумы. 6-7 сентября 1994 г. - Алма-Ата,- С. 59-60.
24. Гремякова Т. А, Степаншина В. Н., Негрий В. Ф., Коробова О. В., Анисимов Г. А, Аполлонии А В., Лиходед В. Г. Сравнительная характеристика препаратов капсульного антигена Fl Yersinia pestis, полученных из штаммов-продуцентов с различной структурой липополиса-харидов // ЖМЭИ. -1994. - № 3. - С. 10-14.
25. Анисимов А П., Гремякова Т. А, Андрющенко Б. Н., Амельченко В. В. Протективная активность препаратов серологически атипичных вариантов капсульного антигена в отношении возбудителя чумы с атипичной капсулой //Проблемы особо опасных инфекций. - 1994. - Вып. 4 (74).-С. 210-218.
26. Фурсова Н. К Алимов А П., Гремякова Т. А Особенности экспрессии и наследования плазмид, кодирующих синтез протгктивных атнигенов Yersinia pestis в клетках гетерологичных реципиентов //Генетика. - 1994. - Т. 30 (Приложение) - С. 168.
27. Гремякова Т. А, Амельченко В. В., Анисимов Г. А. Ранняя защита при экспериментальной чуме животных, иммунизированных рекомбинантной чумной вакциной // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 1995. -№ . 1. - С. 54-57.
28. Гремякова Т. А, Анисимов А. П., Захарова Н. М. Взаимосвязь способности к экспрессии различных серовариантов капсульного антигена Yersinia pestis со степенью редуцированности липополисахарида бактериальных клеток//ЖМЭИ. - 1995. - №. 1. - С. 3-6.
29. Степаншина В. Н., Гремякова Т. А., Коробова О. В., Анисимов Г. А Взаимосвязь между составом капсульного антигена Yersiniapestis и его протективной активностью // ЖМЭИ. 1995. -№2.-С. 124.
30. Патент на изобретение №2046145 Р.Ф., МКИ C12N15/31,1/21//C12R1:42 (C12N1/21). Заявка №5057015/13. Приоритет изобретения 20.10.95. Рекомбинантный штамм Salmonella minnesota R595 pFSl - продуцент капсульного антигена чумного микроба / Степаншина В. Н., Гремякова Т. А., Анисимов А П., Анисимов Г. А, Коробова О. В., Ежов И.Н., Лиходед В.Г.,
(РФ)
31. Гремякова Т. А., Анисимов А. П. Серологическая активность антигена "фракция I" Yersiniapestis определяется его белковым компонентом // Гомеостаз и инфекционный процесс: Мат. докл. Международ науч конф. 1996 г. - Саратов, 1996. - С. 319.
32. Гремякова Т. А, Фурсова Н. К, Фомченков В. М, Волковой К. И. Сравнительная характеристика физических и биологических свойств ЛПС Yersinia pestis и R-мутатнов энтеробак-терий // Микробиология. - 1996. - Т. 65. - № 6. - С. 763-767.
33. Гремякова Т. А., Ремнева Л. В., Титарева Г. М, Бахтеева И. В. Изучение in vivo и in vitro рекомбинантного штамма AroA S. typhimurium SL3261, стабильно наследующего плазмиду pFSl, кодирующую синтез капсульного антигена Y. pestis II Мат. науч.-практ. конф. посвященной 100-летию образования противочумной системы (Том I) 1997 г. - Саратов, 1997. - С. 28.
34. Фурсова Н. К, Красильникова В. М, Гремякова Т. А. Особенности генетической передачи, наследования и экспрессии плазмид, содержащих fa-оперон чумного микроба, в клетках аттенуированных сальмонелл // Мат. науч.-практ. конф., посвенные 100-летию образования противочумной системы (Том II) 1997 г. Саратов, 1997.- С. 145.
35. Фурсова Н. К., Красильникова В. М., Гремякова Т. А. Рекомбинантные плазмиды, содержащие Fra-оперон чумного микроба особенности генетической передачи, наследования и экспрессии в клетках аттенуированных энтеробактерий //Веста. Акад. Мед Наук.- 1997. - № 6. -С. 11-16.
36. Шмелев В. А., Гремякова Т. А., Амельченко В. В. Иммуномодуляция протективной активности рекомбинантного капсульного антигена Y. pestis цитокинами // Мат. науч.-практ. конф. посвященной 100-летию образования противочумной системы (Том I) 1997 г. Саратов, 1997.-С. 258.
37. Anisimov A. P., Amelchenko V. V.» Andruschenko В. N., Gremyakova Т. A CaflM-mutant Yersinia pestis variant avoids immunity induced by its own subunit or killed vaccine preparations // Ned-erlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. -1998. - V. 6. - SII. - S. 35.
38. Anisimov A. P., Gremyakova T. A LPS structure determines the serovariant of epitopcs of capsular antigen in enterobacteria carrying CalfM-damaged Fra operon from Yersiniapestis II Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. -1998. - V. 6. - SII. - S. 17.
39. Gremyakova T. A. Fursova N. K, Remneva L P., Shaihutdinova R. A., Zilenkov E. L. Temperature restricted ryses of Yersiniapestis cells by enterobacterial R-lipoporysaccharide specific FP1 phage // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SII. - S. 19.
40. Gremyakova T. A., Stepanshina V. N., Anisimov A. P., Potapov V. N. Characterization of native and modified pH6 antigen of Yersinia pestis II Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. -1998. - V. 6. - SII. - S. 19.
41. Gremyakova T. A, Titareva G. M., Bakhteeva I. V., Remneva L. V., Krasilnikova V. M. Aro A Salmonella typhimurium S13261 expressing Yersiniapestis capsular FI antigen: plasmid maintenance and protectivity // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology -1998. - V. 6. - SII. - S. 17.
РОС. НАЦИОНАЛЬНА)! j БИБЛИОТЕКА С.Петср£ург « ОЭ 300 tn (
t
42. Gremyakova T. A, Modulation of the protective properties of plague vaccine preparations by monophosphoryl lipid A // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. - 1998. - V. 6. - SII. -S. 36.
43. Gremyakova T. A., Shaihutdinova R. A. Antigenic shift of Yersiniapestis lipopolysaccharides expressed at various cell growth temperature // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. -1998. - V. 6. - SII. - S. 17.
44. Жиленков Е.Л, Фомченков B.M., Новиков И.А., Садомов В.Э., Оборотов M.B., Гремя-кова Т.А Изучение взаимодействия фагов микроорганизмов с использованием методов флюо-риметрии и электроориентационной спектроскопии // Вест. Рос. Акад. Мед. Наук. 1999. - N. 12. -С. 24-29.
45. Горшков О. В. Попов Ю. А. Плотников О. П., Виноградова Н. А., Гремякова Т. А. Саво-стина Е. П. Микробиологические свойства коллекционных штаммов Yersinia pestis II Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: Мат. докл. Юбилейная науч. конф. посвященная 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии (14-15 декабря 1999 г., Оболенск). - Оболенск, -С. 48.
46. Балахонов С. В. Белькова С. А, Шайхутдинова Р. 3. Гремякова Т. А., О возможности внутривидового типирования Yersinia pestis бактериофагов FP1 и FP3 // Матер.межрегиональной научно-практич.конференции "Актуальные аспекты природно-очаговых болезней", посвященной 80-летию Омского НИИ природно-очаговых инфекций МЗ России. - Омск, 16-17 окт.2001 г. -С.170-172.
47. Виноградов Е. В., Линдлер В., Кочарова Н. А., Сенченкова С. Н., Шашков А С, Кни-рель Ю. А., Холст О., Шайхутдинова Р. 3., Гремякова Т. А, Анисимов А П. // Структура коровой части липополисахаридов чумного микроба. Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера. Вторая науч. конф. с международным участием. Новосибирск, 29-31 мая, 2002 г. - С. 217-218.
48. Gremyakova Т. A, Vinogradov Е. V., Lindner В., Kocharova N. A, Senchenkova S. N.. Shashkov A S., Knirel Yu. A, Hoist O., Shaikhutdinova R. Z., Anisimov A. P. Influence of growth temperature on the core structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis strain KM218 //8"1 International Symposium on Yersinia (September 4-8, 2002, Turku, Finland). - Turku, 2002. - P. 67-68.
49. Shaikhutdinova R. Z., Gremyakova T. A, Zhilenkov E. L., Dentovskaya S. V., Anisimov A.P. Phage-susceptibility testing and LPS-electrophoretic mobility analysis of different Yersinia pestis "subspecies"//^4 International Symposium on Yersinia (September 4-8, 2002, Turku, Finland). - Turku, 2002.-P. 71.
50. Vinogradov E. V., Lindner В., Kocharova N. A, Senchenkova S. N.. Shashkov A S., Knirel Y. A, Hoist O., Gremyakova T. A, Shaikhutdinova R. Z. and Anisimov A P. The core structure of the lipopolysaccharide from the causative agent of plague, Yersinia pestis //Carbohydrate Research. 2002. -V. 337. - P. 775-777.
51. Gremyakova T. A , Vinogradov E. V., Lindner B., Kocharova N. A , Senchenkova S. N., Shashkov A S., Knirel Y. A , Hoist O. , Shaikhutdinova R. Z., Anisimov A. P. The core structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis strain KM218. Influence of growth temperature // In M. Skurnik, J.A Bengoechea, К Granfors (eds), The genus Yersinia: Entering the functional genomic era, Advances in experimental medicine and biology, vol. 529. Kluwer Academic / Plenum publishers, New York. - 2003. - P. 229-232.
52. Knirel Y.A., E. Vinogradov, S.N. Senchenkova,N.A Kocharova, B. Lindner, O. Hoist, R.Z. Shaikhutdinova, Anisimov АР., Т.А Gremyakova Structural variability of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis //The Carbohydrate Workshop 2003 (March 27-30, 2003, GOstrow-Rostock, Germany).
53. Knirel Y. A, Vinogradov E. V., Senchenkova S. N.. Kocharova N. A., Lindner В., Holst O., Shaikhutdinova R.Z., Anisimov A. P. Gremyakova T. A. Temperature-dependent variations in the lipopolysaccharide structure of Yersinia pestis //XII1* European Carbohydrate Symposium (Jury 6-11, 2003, Grenoble, France). - Grenoble, 2003. - P. 120.
54.Анисимов А.П., Книрель Ю.А, Виноградов Е.В., Линднер Б., Кочарова Н.А, Дентовская С.В., Фурсова Н.К., Бахтеева И.В., Титарева Г.М, Шашков АС, Шайхутдинова Р.З., Сенченкова С.Н., Гремякова Т.А., Холст О. // Липоолигосахарид (ЛОС) Yersinia pestis -один из основных факто-ров патогенности и возможная мишень для химиотерапии. Биотехнология: состояние и перспективы развития: Матер. 2-го Московского международного Конгресса (10-14 ноября 2003 г., Москва). М.: ЗАО "ПИК "Максима", РХТУ им. Д.И. Менделеева. С. 15.
55.Anisimov A P., Vinogradov E.V., Lindner В., Shaikhutdinova R.Z., Dentovskaya S.V., Fursova N.K., Bakhteeva I.V., Titareva G.M., Kocharova N.A, Senchenkova S.N., Hoist O., Gremyakova T.A, Pier G.B., Knirel Y.A. Temperature-dependent variations in the lipoporysaccharide structure and biological properties of Yersinia pestis ///JBC. - (submitted).
СПИСОК ДОКУМЕНТОВ О ВНЕДРЕНИИ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ В ПРАКТИКУ
4. М 15.234 — 90. Методика лабораторная способа использования стандартного инокулята для проверки+ ростовых качеств плотных питательных сред. Утверждена 27.04.1990 зам. директора ВНИИПМ проф. Волковым В.Я. (учрежденческий уровень внедрения).
5. МЛ 15. 272.-90. Методика лабораторная по усовершенствованию питательной среды для периодического глубинного культивирования с аэрацией в колбах вакцинного штамма чумного микроба EV НИИЭГ при температуре 27 °С. Утверждена 30.07. 1990 зам. директора ВНИИПМ проф. Боровиком Р.В.
6. М 15.233 - 90. Методика лабораторная оценки качества жидких питательных сред с помощью референс-инокулята. Утверждена 21.05. 1990 зам. директора ВНИИПМ проф. Волковым В.Я.
7. Гремякова Т.А., Степаншина В.Н., Анисимов А.П., Ежов И.Н. Штамм Salmonella minnesota KM1 - продуцент капсульного антигена FI Yersinia pestis. Справка о депонировании охраноспособного штамма в Российской коллекции патогенных бактерий "Микроб" от 27.02.92 г.
8. Акт внедрения бактериофага FP1 от 26 марта 1999 г., РосНИПЧИ «Микроб», Саратов. Утвержден директором РосНИПЧИ «Микроб» Кутыревым В. В.
9. Акт внедрения рекомбинантного штамма Salmonella minnesota R595 pFSl (продуцент капсульного антигена FI Yersinia pestis) от 26 марта 1999 г. Утвержден директором РосНИПЧИ «Микроб» Кутыревым В.В.
10. Акт внедрения бактериофагов FP1 и FP3 от 18 марта 2003 г. НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока. Утвержден директором НИПЧИСДВ проф. Голубинским Е.П
11. Акт внедрения препарата рекомбинантного капсульного антигена Cafl Y. pestis. # 59 от 16 апреля 2003 г. АООТ "Институт инженерной иммунологии" РАО "Биопрепарат". Утвержден директором АООТ Пчелинцевым СЮ.
12. Акт внедрения препарата липополисахарида К pestis. # 60 от 16 апреля 2003 г. АООТ "Институт инженерной иммунологии" РАО "Биопрепарат". Утвержден директором АООТ Пче-линцевым СЮ.
БЛАГОДАРНОСТИ
Моя искренняя признательность моему научному консультанту - профессору Константину Ивановичу Волковому, за постоянное внимание и интерес к проводимой работе, возможность логического обобщения и завершения проделанного большого этапа работы.
Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соавторам - сотрудникам ГНЦ прикладной микробиологии РАО "Биопрепарат" (Оболенск, Московская обл.), ИОХ им. Н. Д. Зелинского РАН (Москва), РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов), НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (Иркутск), принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.
Благодарю директора ГНЦПМ д.ф-т.н., проф. В. Я. Волкова, за создание условий для проведения экспериментов, представленных в настоящей работе, и директора МНИИ ЭМ им. Г. Н. Габричевского дм.н., проф. В. А. Алешкина за предоставленную возможность защитить диссертацию на Специализированном Совете Д 208.046.01 по присуждению ученой степени доктора медицинских наук
Пользуясь случаем, приношу искреннюю признательность всем рецензентам настоящей работы за многочисленные замечания, вопросы и поправки, которые, по возможности, были учтены и, в ряде случаев, помогли уточнить, а иногда и пересмотреть некоторые положения и формулировки.
Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 434, тираж 120 экз. Подписано в печать 12.01.2004 г.
Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zakaz@stprint.ru тел 939-3338 Заказ № 434, тираж 120 экз. Подписано в печать 12.01.2004 г.
»-'113?
РНБ Русский фонд
2004-4 24343
Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Гремякова, Татьяна Андреевна
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ, ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.:.
ВВЕДЕНИЕ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.1.
ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ АНТИГЕНЫ ЧУМНОГО МИКРОБА.
1.1. КАПСУЛЬНЫЙ АНТИГЕН Ш.
1.2. V АНТИГЕН.
1.3. БЕЛКИ ВНЕШНИХ МЕМБРАН.
1.4. рН6 АНТИГЕН.
1.5. МЫШИНЫИ ТОКСИН
1.6. ЛИПООЛИГОСАХАРИДЫ.\.
1.7. ОСНОВНОЙ СОМАТИЧЕСКИЙ АНТИГЕН.
1.8. Б АНТИГЕН.1.
1.9. АКТИВАТОР ПЛАЗМИНОГЕНА.
ГЛАВА 2. ИММУНОПРОФИЛАКТИКА ЧУМЫ: ИТОГИ И СОВРЕМЕННОЕ
СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ.
2.1. ИСТОРИЯ ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИ.
2.2. ХАРАКТЕРИСТИКА СУЩЕСТВУЮЩИХ ПРОТИВОЧУМНЫХ ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ. 2.3. ОСНОВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ
ПРОТИВОЧУМНЫХ ИММУНОПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ.:.
2.3.1. ЖИВЫЕ АТТЕНУИРОВАННЫЕ ПРОТИВОЧУМНЫЕ ВАКЦИНЫ
2.3.2. ПРОТИВОЧУМНЫЕ ВАКЦИННЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПРЕПАРАТЫ, БАЗИРУЮЩИЕСЯ НА ИСПОЛЬЗОВАНИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВЕКТОРОВ.
2.3.3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВАКЦИНЫ.
2.3.3.1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ V АНТИГЕНА.
2.3.3.2. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ И АНТИГЕНА.
2.3.3.3. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ СЛИТНЫХ БЕЛКОВ
2.3.3.4. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВАКЦИНЫ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЕ ДРУГИЕ 82 АНТИГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ.
ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО
ИММУНИТЕТА ПРИ ЧУМЕ.
3.1. РОЛЬ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ЧУМЕ.
3.2. РОЛЬ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ФОРМИРОВАНИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ЧУМЕ.
3.3. ЛАБОРАТОРНЫЕ МОДЕЛИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ЧУМЕ.
3.4. ИММУНОГЕННОСТЬ И ПРОТЕКТИВНОСТЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ ИХ ДОСТАВКИ И
ПРЕЗЕНТАЦИИ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная вариабельность антигенов Y. pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов"
А К Т У А Л Ь Н О С Т Ь П Р О Б Л Е М Ы Правительства многих развитых стран в течение последних лет увеличивают финансирование научных разработок в области разработки эффективных средств диагностики, профилактики и терапии особо опасных бактериальных и вирусных инфекций, мотивируя это возрастанием угрозы биотерроризма [Friedlandler etal, 1995; Inglesby etal, 1999, 2000].Последние события в США осенью 2001 года подтверждают актуальность и правильность решений этой проблемы правительством США Интенсификация данных исследований наблюдается в последние десять лет в Англии (Porton Down), Германии (Munich), Швеции (Umea) [Williamson etal., 1995, Walf-Watz; 1998, Forsberg et al., 1994]. В США ведутся интенсивные разработки вакцинных препаратов нового поколения против чумы, сибирской язвы, сапа, мелиоидоза [Anderson etal.,1996; Forsberg etal, 1998]. После событий 11 сентября 2001 года в Нью-Йорке, составлен список наиболее вероятных и опасных патогенов. В одном ряду с возбудителями оспы, сибирской язвы, вирусами Эбола и Марбурга отмечен чумной микроб. Именно поэтому вопросам защиты от биотеррроризма, в том числе разработке специфических и неспецифических средств защиты и профилактики особо опасных инфекций уделяется столь пристальное внимание.Возбудитель чумы (Y. pestis) - один из наиболее вирулентных для человека микроорганизмов. Восприимчивость человека к чуме чрезвычайно велика В организм человека возбудитель попадает при укусе инфицированной блохи или через поврежденные кожные покровы. В этих случаях развивается бубонная или септическая форма чумы, которые при своевременной антибиотикотерапии и отсутствии осложнений в виде вторичной легочной пневмонии не представляет большой эпидемической опасности. Последняя вспышка бубонной чумы, охватившая, по данным ВОЗ [WHO Medical Bulletin, 1994], жителей 15 деревень индийского штата Махараштра, зарегистрирована в августе-сентябре 1994г. [Butler etal., 1994; Panda etal., 1994; Chakrabarty et al, 1994; Lurie etal., 1994; Carniel., 1995].Усугубляют ситуацию сообщения об антибиотикорезистентных природных штаммах возбудителя чумы [Dennis, Hughes, 1997; Galimand et al, 1997].Эпидемии легочной чумы возникают при передаче возбудителя воздушно-капельным путем от больного чумной пневмонией (первичной или вторичной). Характерными особенностями таких эпидемий являются чрезвычайно высокая контагиозность, скоротечность (одни-пять суток) и летальность (без антибиотикотерапии - 95-100 %). Возникновение эпидемий трудно прогнозировать, но сочетанное влияния климатических, экологических и социальных факторов способно привести к крупным эпидемиям проявления чумы. Примером служит последняя эпидемия легочной чумы, охватившая в сентябре-октябре 1994 г. ряд штатов и городов западной части Индии. По данным ВОЗ [WHO Medical Bulletin, 1994], только за пять дней от момента появления первого больного легочная форма чумы диагностирована у 452 человек, 41 из которых умерли в эти же сроки.Применяемые в настоящее время чумные вакцины были разработаны в 30е годы прошлого столетия. В Англии, США и других западных странах используют преимущественно убитые вакцины, приготовленные на основе высоковирулентного штамма Y. pestis 195/Р [Perry, Fetherston, 1997]. В России для вакцинопрофилактики чумы в течение многих десятилетий применяются живая вакцина, приготовленная на основе аттенуированного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ [Наумов и др., 1992; Бактерийные, сывороточные ..., 1998]. Они вызывают глубокую и разностороннюю иммунную перестройку практически по всем иммуногенам чумного микроба. Обладая умеренной реактогенностью, обе вакцины обеспечивают создание достаточно напряженного иммунитета, в связи с чем используются для проведения вакцинации по эпидемическим показаниям.Следует отметить, что пик иммунной перестройки при вакцинации живой культурой EV приходится на первые три месяца, после чего наступает заметное снижение напряженно-сти иммунитета. В связи с этим возникает необходимость ревакцинации, эффективность которых нередко оказывается сниженной из-за слабого приживления клеток вакцинного штамма и, как следствие, недостаточного синтеза температуроиндуцируемых протективных антигенов Y. pestis. Возникает ситуация, когда уровень поствакцинального иммунитета не способен противостоять инфекции, но в то же время достаточен для ингибирования процесса размножения живых вакцинных бактерий [Дальвадянц, 1991а; Наумов и др., 1992]. В ряде стран (США, Англия, Франция, Индия и др.) живую вакцину не применяют из-за опасения возможной реверсии вирулентности вакцинного штамма, особенно при иммунодефицитных состояниях и при неблагоприятных экологических условиях, а также ее вирулентности для низших приматов [Meyer et al, 1974а]. До сих пор между Российскими учеными и их западными коллегами ведутся споры о том, какая из вакцин более эффективна и менее опасна Обе стороны имеют доводы за и против. Истина, скорее всего, заключается в том, что обе вакцины были приемлемы для своего времени (ЗСТ8 годы XX века). Однако в настоящее время оба препарата морально устарели. Очевидна необходимость разработки вакцинных препаратов нового поколения: молекулярных, состоящих из композиции высокоиммуногенных протективных антигенов, или рекомбинантных, в которых протективный антиген экспрес-сируется в векторной бактериальной клетке, доставляющей антиген иммунокомпетентным клеткам. Такие рекомбинантные штаммы могут дополнительно нести маркеры антибиоти-коустойчивости, позволяющие проводить иммунопрофилактику на фоне экстренной профилактики и терапии химиопрепаратами.Предпринятые в 50-90"6 годы беспрецедентные усилия по изучению молекулярной организации возбудителя чумы привели к открытию основных факторов патогенности и им-муногенности, а также генов, определяющих их синтез. Охарактеризованы их основные физико-химические и иммунобиологические свойства Вирулентность чумного микроба определяется совокупностью его свойств, получивших название "детерминанты вирулентности".К числу "классических" детерминант T.W. Burrows [1963] относил способность клеток сорбировать экзогенные красители и гемин (Pgm), синтез V и W антигенов, "мышиного" токсина (Тох), капсульного антигена FI (Fra), синтез пестицина (Pst) и способность синтезировать экзогенные пурины (Pur). К настоящему времени этот перечень претерпел определенные изменения. W антиген предан забвению, но вместо него в качестве факторов патогенности рассматривается целый ряд белков Yops. Показано, что продукция пестицина не оказывает влияния на вирулентность возбудителя чумы, но синтезируемый вместе с ним активатор плазминогена Р1а обладает целым рядом свойств, необходимых для реализации патогенности Y. pestis. Список детерминант, связанных с вирулентностью чумного микроба постоянно расширяется [Мишанькин, 1996; Sodeinde etal, 1992; Perry, Fetherston, 1997; Cornells, 1998; Cornells et al, 1998; Анисимов, 1999].На наш взгляд, накопленных к настоящему времени знаний по пато- и иммуногенезу чумы явно недостаточно для того, чтобы разработать эффективную противочумную вакцину. Однако можно наметить перспективные направления разработки иммунопрофилактиче-ских препаратов нового поколения. Подытоживая результаты собственных исследований, а также данные отечественных и зарубежных коллег, мы пришли к выводу, что чумные имму-нопрофилактические препараты, предназначенные для защиты угрожаемых контингентов от биотерроризма, не могут базироваться только на капсульном и V антигенах, как это предлагается западными специалистами. В последние годы установлено, что капсула и V антиген обладают значительной антигенной вариабельностью, причем различные варианты не обладают перекрестной протективной активностью [Черепанов и др., 1990; Анисимов, Захарова, 1992; Анисимов и др., 1992, 1994а, 19946, 1999; 1997; Griffin etal, 1998; Roggenkamp etal, 1997; Worsham, Hunter, 1998; Анисимов, 1999; Анисимов, Маркова, 1999]. В случае применения конфликтующими государствами, а также террористами биологического оружия на основе возбудителя чумы следует опасаться, скорее всего, именно таких нетипируемых вы-соковирулентных штаммов Y. pestis. В качестве прототипов таких штаммов могут быть применены не только бескапсульные варианты, но и штаммы чумного микроба, образующие серологически атипичные капсулы.Известно, что многократная иммунизация глубоко диссоциированными бесплазмидными чумными штаммами (например TRV) [Волковой, личное сообщение], или штаммами возбудителя псевдотуберкулеза [Домарадский, I960, 1962, 1962а, 1970; Маракулин, 1991; приводит к формированию у мышей и морских свинок протективного противочумного иммунитета, не уступающего по напряженности иммунитету, формируемому коммерческими вакцинами при использовании общепринятых схем иммунизации. Поэтому при конструировании вакцин нового поколения особое внимание следует уделить композициям кодируемых хромосомой антигенов, которые могут оказывать иммуномодулирующее действие и обусловливать синергидный эффект.Одним из альтернативных путей повышения эффективности противочумных вакцин является использование для доставки чумных протективных антигенов в иммунокомпетент-ные клетки бактериальных векторов. В качестве таких векторов использовались вакцинные штаммы Y. pseudotuberculosis 164/84 [Маракулин и др., 1991], К tularensis 15 [Павлов и др, 1991].Конструирование иммунопрофилактических чумных препаратов представляет собой достаточно сложную задачу. Существует круг взаимосвязанных проблем. В связи с тем, что чума является особо опасным заболеванием, работы по изучению патогенеза и иммуногенеза в значительной степени затруднены. Публикуется большое количество работ, посвященных клонированию тех или иных генов, характеристике кодируемых ими белков, изучению их локализации. Однако, работ посвященных изучению вклада индивидуальных антигенов (кроме FT, V, Ymt и Pla) в пато- и иммуногенез чумы чрезвычайно мало. Все это приводит к сложностям при выборе протективных антигенов, определении способа их доставки и пре-зентации, решении вопроса, какой собственно тип иммунитета нужно стимулировать - гуморальный, секреторный, или клеточный. Еще одной проблемой является то, что до сих пор не подобраны лабораторные животные, на которых было бы можно корректно моделировать пато- и иммуногенез чумы у людей. Приматы дорогостоящи и гетерогенны по чувствительности, их использование оправдано лишь на стадии доклинических испытаний перспективных препаратов. Наиболее доступными моделями являются мыши и морские свинки.Причем, количество антигенов, индуцирующих иммунитет у морских свинок, гораздо больше, чем у мышей [Бывалов и др., 1997]. Препараты, зарекомендовавшие себя положительно на мышах, далеко не всегда протективны для морских свинок. Только в случае положительного протективного эффекта вакцинной композиции для обоих видов грызунов можно рассчитывать на эффективность препарата для людей. Тем не менее, практически все работы американских и английских исследователей выполняются только на мышиной модели и экстраполируются на людей [Anderson et al., 1996, 1997, Nakajima, et al, 1994].ЦЕЛЬ Н А С Т О Я Щ Е Г О И С С Л Е Д О В А Н И Я - получить структурно-функциональные характеристики белковых (FI, рН6) и липоолигосахаридных компонентов 7 pestis, а также выявить особенности формирования протективного иммунитета, создаваемого антигенами при различных способах их доставки и презентации.ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ И С С Л Е Д О В А Н И Я 1. Создать коллекции R специфических фагов, авирулентных и природных штаммов 7. pestis, R вариантов энтеробактерий, R и S штаммов 7. pseudotuberculosis, разработать методические приемы фагового и электрофоретического скрининга и на их основе предложить систему для изучения липоолигосахаридов (ЛОС) возбудителя чумы.2.Установить химическую структуру кора и липида А липоолигосахаридов 7. pestis, определить молекулярную природу их изменчивости.3.Разработать новые и усовершенствовать имеющиеся методы иммунохимического анализа липоолигосахаридов, приемов их химической модификации и презентации, способов истощения и конкурентного торможения с целью изучения антигенной специфичности препаратов, синтезируемых клетками возбудителя чумы при различной температуре.4.Изучить иммунохимические и иммунобиологические свойства липоолигосахаридов Y. pestis, синтезированных в определенных условиях культивирования штаммами, которые выделены из различных природных очагов.5.Создать рекомбинантные штаммы-продуценты капсульного антигена, в том числе и штаммы аттенуированных сальмонелл, стабильно экспрессирующих FI антиген in vitro и in vivo. Сконструировать молекулярные и рекомбинантные вакцинные препараты, обладающие способностью индуцировать защиту от чумы в ранние сроки после иммунизации. б.Изучить иммуногенность и протективность FI и рНб антигенов при использовании различных систем доставки и презентации иммунокомпетентным клеткам.7.Выбрать антигены чумного микроба, перспективные для последующего конструирования иммунопрофилактических препаратов, и определить формы их презентации.Установлена температуроопосредованная варабельность липида А возбудителя чумы, . результатом чего является изменение биологических свойств липоолигосахаридов. Выявлена связь между химической структурой липоолигосахаридов Y. pestis subsp. pestis и subsp. caucasica и иммунобиологической активностью данных препаратов.Сформулирована концепция противодействования возбудителем чумы запуску и функционированию механизмов ранней неспецифической резистентности млекопитающих путем модификации липоолигосахаридов, что позволяет патогену минимизировать развитие защитных реакций.Впервые определена возможность конструирования молекулярных и рекомбинантных вакцинных препаратов, обладающих способностью индуцировать защиту от чумы в ранние сроки после иммунизации.Создана коллекция аттенуированных штаммов сальмонелл, которые экспрессируют капсульный антиген чумного микроба. Установлено, что рекомбинантные клетки аттенуированных сальмонелл, синтезирующих нативный иммуногенный капсульный антиген, при парентеральной и оральной иммунизации способны индуцировать у мышей протективный иммунитет в отношении чумы различной степени напряженности. Получены штаммы, обеспечивающие защиту от высоких заражающих доз с первого дня после иммунизации (Патент №2046145, приоритет от 29.07.1992).Показано, что рНб антиген при выраженной антигенности (авторское свидетельство №1797351, МКИ G01N33/53 приоритет от 5.11.90) и важной роли в патогенезе, не обладает протективностью для лабораторных животных. Путем термической и химической модификации антигена, сопровождавшихся изменением степени агрегации, антигенных и биологических свойств рНб антигена, получен ряд препаратов с различным спектром иммунобиологической активности. Высокомолекулярные агрегированные нативные формы рНб антигена не обладали протективностью, а при совместном введении с капсульным антигеном снижали протективные свойства последнего. Иммунизация деполимеризованными препаратами рНб антигена индуцировала у животных иммуносупрессию.Определена методология конструирования иммунопрофилактических противочумных препаратов, которая учитывает серовариабельность основных протективных антигенов чумного микроба, обладающих способностью защиты от чумы в самые ранние сроки после вакцинации. Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию тонких молекулярных механизмов, которые лежат в основе взаимодействия возбудителя чумы с организмом хозяина, что, в свою очередь, открывает перспективы разработки новых стратегий противодействия патогену.ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ Д И С С Е Р Т А Ц И И Создана коллекция препаратов ЛОС, выделенных из различных штаммов Y.pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, E. coli, S. minnesota, а также их детоксицированных производных. Полученные препараты были использованы для изучения химической структуры ЛОС возбудителя чумы (Институт органической химии им. Н. Д. Зелинского РАН, Москва), молекулярных механизмов воздействия ЛОС на альвеолярные макрофаги (Институт инженерной иммунологии, п. Любучаны Московской обл.), молекулярной организации ЛОС Y. pestis и их иммунобиологических свойств (ГНЦ прикладной микробиологии, п. Оболенск).Получен набор антисывороток и создана коллекция моноклональных антител к капсульному антигену и ЛОС, используемых в ГНЦПМ для тестирования соответствующих препаратов. Создана коллекция штаммов-продуцентов капсульного антигена чумного микроба. На штамм S. minnesota R595pFSl, депонированный в РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов), получен Российский патент на изобретение № 2046145. Этот штамм используется для получения высокоиммуногенных препаратов капсульного антигена. Сконструирован штамм S. typhimurium SL3261pFSl, стабильно наследующий рекомбинантную плазмиду in vitro и in vivo. Штамм используется для определения эффективности различных систем доставки капсульного антигена при формировании протективного противочумного иммунитета.Изучена чувствительность к бактериофагам вирулентных и авирулентных штаммов Y.pestis из коллекций живых культур ГНЦПМ, РосНИПЧИ «Микроб», НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока, что выявило их популяционную гетерогенность в отношении ЛОС. На основании данных о варьировании чувствительности штаммов возбудителя чумы, изолированных в различных эндемичных очагах, к бактериофагам, предложены дополнительные методы для внутривидовой дифференциации патогена.Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов: 1 .Методика лабораторная способа использования стандартного инокулята для проверки ростовых качеств плотных питательных сред. Утверждена 27.04.1990 зам. директора ВНИИПМ проф. Волковым В.Я. (учрежденческий уровень внедрения).3.Методика лабораторная оценки качества жидких питательных сред с помощью референс-инокулята. Утверждена 21.05. 1990 зам. директора ВНИИПМ проф. Волковым В.Я. Методические приемы, разработанные в ходе работы над диссертацией, штаммыпродуценты, очищенные препараты антигенов, антисыворотки и моноклональные антитела, а также диагностические системы в настоящее время применяются в микробиологических, генетических, молекулярно-биологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий ГНЦПМ (Оболенск), РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов), НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (Иркутск), ИОХ им. Н. Д. Зелинского РАН (Москва), ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (Москва).ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ 1.Разработанная схема типирования штаммов чумного микроба по их чувствительности к липополисахарид-специфическому фагу FP1 дополняет внутривидовую характеристику и является дифференцирующим критерием изолятов Y. pestis.2.Температуроопосредованные композиционные и структурные различия кора и липида А липоолигосахаридов штаммов чумного микроба, изолируемых в отдельных природных очагах России определяют изменения их иммунобиологических свойств и вирулентности для грызунов и человека.3.Предложена концепция реализации патогенности возбудителем чумы путем уклоне- . ния микроба от неспецифических и специфических механизмов защиты хозяина, в том числе и с помощью модификации коровой и липидной части липоолигосахаридов Y. pestis.4.Разработаны новые принципы методологии и биотехнологии получения нативных и модифицированных белковых и липоолигосахаридных антигенов, плазмид, векторных штаммов аттенуированных сальмонелл, штаммов-продуцентов, а также их презентации, которые учитывают серовариабельность основных протективных антигенов Y. pestis и перспективны для конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов нового поколения.АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертации доложены и представлены на: итоговых научных конференциях ГосНИИПМ (Оболенск, 1986, 1987, 1989, 1990); межведомственной научной конференции "Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний" (Киров, 1991); XIV научно-практической конференции ГосНИИПМ "Новые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы" (Оболенск, 1991); IV Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991); Российской научной конферен-ции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992); Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993); межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы "Профилактика и меры борьбы с чумой" (Алматы, 1994); I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994); межгосударственной научно-практической конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний" (Ставрополь, 1994); международной конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1996); 3 r d John Humphrey Advanced Summer School "Cell and molecular biological aspects of immunology" (Пущино, 1996); VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); 4"ои конференции по бактериальной защите (Munich), Germany, 1997); совместном Американо-Российском семинаре в USAMRIID (Fort Detrick, USA, 1997); совместном семинаре в Institut for Experimental Medicine und Biologie (Borstel, Germany, 1998); 7th International Congress on Yersinia (Nijmegen, the Netherlands, 1998); 4th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Пущино, 1998), Germany, 1998); 8th International Congress on Yersinia (Turku, Finland, 2002); Carbohydrate Workshop (Gustrow-Rostock, Germany, 2003); XIIth European Carbohydrate Symposium (Grenoble, France, 2003); 2-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003).Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научной конференции ГНЦПМ 5 мая 2003 г. протокол №. 1.П У Б Л И К А Ц И И Основное содержание работы отражено в 55 научных публикациях, в том числе авторском свидетельстве и патенте. Список публикаций приведен в автореферате.СТРУКТУРА И ОБЪЕМ Д И С С Е Р Т А Ц И И Работа состоит из введения; 3 глав обзора литературы; 6 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований, экспериментальную часть, анализ факторов патогенности возбудителя чумы, обеспечивающих его персистенцию в природе, по литературным данным и собственным наблюдениям; заключения; выводов; списка литературы, включающего 501 цитируемых работ. Общий объем диссертации составляет 320 страниц. Текст иллюстрирован 38 таблицами и 77 рисунками.БЛАГОДАРНОСТИ На протяжении многих лет выполнения настоящей работы неоценимую помощь мове-тами и заинтересованным участием в обсуждении результатов мне оказывали многочисленные друзья и коллеги. Прежде всего, я хотела бы поблагодарить сотрудников бывшего отдела генетики, которых теперь разбросала жизнь, с которыми мы вместе начинали эту работу и сделали большую ее часть. Среди них - В.Н. Степаншина, О.В. Коробова, В.М. Красильникова, Е.В. Мицевич, В.В. Амельченко, П.А. Черепанов, Б.А. Григорьев, В.В. Фурсов, Н.К. Фурсова, Т.Б. Кравченко, В.И. Кравченко, Т.Ю. Кудрявцева, А.П. Алимов, Н.М. Захарова и Е.А. Панферцев.Пользуясь случаем, приношу искреннюю признательность всем рецензентам настоящей работы за многочисленные замечания, вопросы и поправки, которые, по возможности, были учтены и, в ряде случаев, помогли уточнить, а иногда и пересмотреть некоторые положения и формулировки. Особая благодарность А.П. Анисимову и Ю.М. Помыткину за поддержку, информационную помощь, рецензирование данной работы.Формированием научных интересов я прежде всего обязана ныне покойному профессору Константину Ивановичу Волковому, моя признательность ему за веру в меня, за постоянное внимание и интерес к проводимой работе, за возможность логического обобщения и завершения проделанного большого этапа работы. Я благодарна А.В. Степанову за его уме-ние решать сложные вопросы и брать на себя ответственность в критические моменты, а также консультационную и организационную помощь.Слова благодарности всем начальникам бывшего отдела микробиологии чумы, лояльно позволявшим не ограничиваться только плановыми работами, но и заниматься инициативными исследованиями, которые были мне наиболее интересны - А.А. Нарыжных, И.М. Нахабину, покойным Г.А. Анисимову и В.Ф. Негрию. Мои слова признательности начальнику отдела особо опасных инфекций А.Н. Носкову и всем сотрудникам отдела, -Л.И. Маринину, Н.А. Старицину, В.М. Павлову, Г.М. Титаревой, И.В. Бахтеевой, Н.А. Шишковой и Г.Н. Андреевой за практическую помощь, дружескую поддержку, доброжелательность. Отдельные слова искренней признательности моим бывшим подчиненным -Л.П. Ремневой, Р.З. Шайхутдиновой, Н.К. Фурсовой и Л.В. Шевченко за кропотливую и добросовестную работу, энтузиазм, терпение, понимание и веру.Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю признательность коллегам из ИОХ им. Зелинского, РосНИПЧИ «Микроб», НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока, Иркутск, за возможность выполнения совместных исследований.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гремякова, Татьяна Андреевна
ВЫВОДЫ
1. Создана уникальная коллекция R специфических фагов (FP1, FP3, С21), R и S вариантов энтеробактерий, включающая 4 штамма Е. coli, 7 штаммов S. minnesota, 4 штамма Y. pseudotuberculosis, 105 природных изолятов, лабораторных штаммов и их производных, относящихся к различным подвидам Y. pestis, разработан оригинальный комплекс методических приемов для фагового и электрофоретического скрининга штаммов и липоолигосахаридов, что стало основой детального изучения молекулярной организации липоолигосахаридов возбудителя чумы, разработки методов дополнительной подвидовой и географической дифференциации штаммов, выявления новых молекулярных механизмов адаптационной изменчивости возбудителя чумы.
2.Впервые установлены полные структуры кора и липида А липоолигосахаридов штаммов Y. pestis биоваров antiqua, medievalis и orientalis основного подвида (subsp. pestis), а также штамма, относящегося к подвиду caucasica, и определена природа их гетерогенности, объяснена иммунохимическая вариабельность и отсутствие перекрестного протективного иммунитета при иммунизации липоолигосахаридами или моноклональными антителами к препаратам, синтезированным при температуре 25 °С. Найдены особенности молекулярной организации липоолигосахаридов штаммов У. реяН.? БиЬзр. саисазюа, которые определяют их высокую вирулентность для полевок и лабораторных мышей и низкую - для большинства грызунов и человека.
3.Разработан оригинальный комплекс методических приемов для проведения иммунохимического анализа липоолигосахаридов У. резИз. Методическая схема включает способы тестирования - реакцию диффузионной преципитации, реакцию непрямой гемагглютинации и конкурентого торможения, иммуноферментный анализ, различные приемы презентации липоолигосахаридов, истощение антисывороток, химическую модификацию липоолигосахаридов (дезацилирование, дефосфорилирование).
4.Впервые показано существование опосредованного липоолигосахаридами механизма противодействия возбудителя чумы запуску и функционированию механизмов специфической и неспецифической резистентности млекопитающих. Липоолигосахариды, синтезированные при температуре тела млекопитающих изменяет антигенную специфичность кора, в меньшей степени индуцируют синтез провоспалительных цитокинов и развитие неспецифической резистентности макрорганизма. Этот механизм позволяет патогену минимизировать развитие воспалительных защитных реакций организмом хозяина и избежать опсонизации специфическими антителами.
5.Рекомбинантные штаммы аттенуированных сальмонелл, экспрессирующие иммуногенный нативный капсульный антиген чумного микроба, обеспечивают защиту лабораторных животных от высоких заражающих доз с первых дней после парентеральной иммунизации (штамм & тгппе$о1а 11595 рББ!, патент № 2046145 от
-2625.29.07.1992), протективны при оральных способах иммунизации (штамм S typhimurium SL3261 pFSl).
6.Детоксифицированные производные липидаА грамотрицательных бактерий оказывают выраженное иммуномодулирующее влияние на процесс вакцинации. Образование комплекса монофосфорил липида А с капсульным FI антигеном повышает защитные свойства последнего в ранние сроки иммунизации.
7.рН6 антиген при выраженной антигенности (A.C. 1797351. (СССР) МКИ G01N33/53), митогенности и важной роли в патогенезе чумы не обладает протективностью для лабораторных животных при использованных способах представления. Химическая (формалинизация) и термическая обработка рН6 антигена сопровождается изменениями степени его полимеризации, антигенных и биологических свойств, а также способа презентации, но это не придает ему протективных свойств.
8.Изменение способа презентации секретируемых белковых антигенов чумного микроба, используемых в комбинациях с детоксифицированными производными липополисахаридов, их экспрессия в аттенуированных сальмонеллах, позволяет получать препараты, которые обладают протективностью в ранние и отдаленные сроки после иммунизации. Разработана биотехнология конструирования молекулярных и рекомбинантных иммунопрофилактических препаратов и получены новые экспериментальные препараты для экстренной и плановой профилактики чумы (патент 2046145 от29.07.1992)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
С приходом эры антибиотиков в 30-40 годы нашего столетия чума, казалось бы, перестала быть глобальной опасностью для человечества. Однако уже тогда возбудитель чумы использовался военными для разработки нового типа оружия - биологического. С принятием в 1972 году Женевской конвенции о запрещении разработок в области химического, бактериологического и токсинного оружия, объемы работ сократились, но потенциальная возможность разработок биологического оружия сохранилась в некоторых из развивающихся стран, таких как Ирак, Иран, Китай, Северная Корея. Неконтролируемость ситуации и доступность возбудителя чумы вследствие того, что чума является зоонозом, имеющим ареалы обитания на всех материках, кроме Австралии, делает Y. pestis весьма доступным и заманчивым объектом для биотерроризма.
Основную угрозу в настоящее время представляют нетипичные по иммунохимическим и генетическим признакам штаммы Y. pestis. Надо сказать, что на протяжении всей истории исследования чумного микроба, белковая капсула была основным компонентом для иммунодиагностики, идентификации, а также, что наиболее важно - для иммунопрофилактики данного заболевания. Все существующие вакцины -убитая клеточная USP, живая аттенуированная EV, молекулярные, - содержат капсульный FI антиген в качестве непременного компонента. Причем, считается, что количество капсульного антигена в вакцинных препаратах во многом определяет их протективность. Выделение и описание вирулентных природных и генетически измененных штаммов чумного микроба, лишенных капсулы или имеющих иммунохимически атипичную капсулу, в этой ситуации, подобно разорвавшейся бомбе [Абдурахманов с соавт., 1974; Захаров., 1985; Классовский с соавт., 1972; Козлов., 1979; Кудинова, 1968; Пунский, Адаменко, 1982; Сагимбеков с соавт., 1980, 1981; Топорков с соавт., 1987; Phillips et al., 1988; Welkos et al., 1995; Williams etal., 1978, 1983; Williams, Cavanaugh, 1984; Winter tal, 1960]. Существующие методы иммунодиагностики и и!Дмунопрофилактики чумы оказываются полностью неэфффективными. Использование именно иммунохимически атипичных штаммов чумного микроба в качестве основного объекта, наиболее вероятное направление биотерроризма.
Такого поворота событий опасаются в США, где в последние десять лет усиленно финансируются работы в области конструирования чумных молекулярных вакцинных препаратов нового поколения, несмотря на сокращение и свертывание работ по многим другим направлениям. Основной упор при разработке вакцин нового поколения в лабораториях США и Англии делается уже не на капсульный антиген, а на другие антигены чумного микроба - белки внешних мембран. В начале нынешнего года завершился цикл исследований по конструированию и испытанию молекулярных вакцинных композиций на основе двух белков - капсульного FI и V антигена, представленных либо в смеси, либо в виде слитного белка. К сожалению, приходится констатировать, что методические приемы и стратегические подходы к разработке концепции конструирования чумных вакцинных препаратов американскими коллегами слабо проработаны.
Актуальность ревизии и переосмысления подходов к конструированию и разработке чумных иммунопрофилактических препаратов подтверждается и последними данными немецких и американских коллег об обнаружении сероварибельности V антигена чумного микроба, второго базового компонента молекулярных вакцинных препаратов, разрабатываемых на западе. Использование в качестве объекта биотерроризма штаммов, атипичных сразу по FI и V антигенам, сводит на нет многолетние усилия наших зарубежных коллег. В настоящее время в США готовится новая программа по конструированию вакцинных молекулярных чумных препаратов.
В России также существуют программы по разработке профилактических препаратов для защиты населения. Выполнение работ по программам "Защита" и "Поковка" отслеживаются Советом безопасности России, хотя многие направления ввиду отсутствия финансирования заморожены.
Представленные в настоящем исследовании данные имеют общебиологическое значение и посвящены характеристике поверхностно локализованных антигенов чумного микроба, изучению возможностей получения препаратов с высокой иммуногенностью, изучению возможности разработки новых методов диагностики и иммунодиагностики типичных и атипичных штаммов чумного микроба и иммунопрофилактике вызываемой этими штаммами чумной инфекции Отсутствие положительных результатов в разработке противочумной молекулярной вакцины указывает на то, что настоящему времени определены лишь некоторые иммуногенные компоненты чумного микроба. Поскольку возбудитель чумы лишен белковых секретируемых токсинов, пристальное внимание должно быть уделено поверхностно локализованным мембранным структурам, как белковым, так и полисахаридсодержащим. Основное внимание в данной работе было сконцентрировано на изучении молекулярно-биологической организации и иммуногенности капсульного и рН6 антигенов при различных способах их экспрессии и презентации.
Параллельно в данной работе изучали поверхностно-локализованные компоненты клеточной стенки возбудителя чумы, синтез которых кодируется бактериальной хромосомой Это то направление, которое достаточно продуктивно разрабатывается в России - иммунизация бесплазмидными штаммами возбудителя псевдотуберкулеза по эффективности защиты от чумы не уступающая эффективности живой чумной вакцины штаммами возбудителя псевдотуберкулеза [Домарадский, 1970, Дармов, 1997] На молекулярном уровне из изученных в этом плане компонентов известны пока лишь полисахаридсодержащие антигены - ОСА, протективный для морских свинок [Дальвадянц и др., 1970-1985], Б антиген - протективен для морских свинок и приматов, одним из основных компонентов которого является ЛПС [Бывалов и др., 1997]. Проблема состоит в том, чтобы правильным образом модифицировать полисахаридные компоненты, при необходимости, провести детоксикацию, и представить их в наиболее иммуногенной форме, способной индуцировать напряженный системный долгосрочный иммунитет. Неудача наших Саратовских коллег, предложивших двухкомпонентную вакцину, состоящую из капсульного антигена и ОСА, в первую очередь связана с тем, что при верной теоретической предпосылке была выбрана неправильная форма презентации полисахаридных антигенов, не обеспечивающая индукции клеточного иммунитета и формирования иммунологической памяти.
Большая часть исследований, представленых в главе 5, посвящены изучению особенностей структрной организации кора и липида А ЛОС У. pestis. В ходе выполнения данной работы нами были выявлены однотипные электрофоретические различия чумных ЛПС, полученных из клеток У. pestis, выращенных при различных температурах культивирования, установлена температурная зависимость способности клеток чумного микроба лизироваться ЛПС специфическим фагом FP1. Выявлена взаимосвязь между чувствительностью клеток У. pestis к фагу FP1, подвидовой и географической принадлежностью возбудителя чумы. Полученные данные позволили ввести дополнительные критерии типирования выделяемых из различных природных очагов штаммов возбудителя чумы и явились базой для выбора штаммов для последующего изучения молекулярной организации корового и липидного компонента ЛОС У. pestis.
Дополнительный отбор композиционно гетерогенных по ЛПС штаммов осуществляли электрофоретически. ЛОС У. pestis (37 °С), имели большую электрофоретическую подвижность по сравнению с гомологичными препаратами, выделенными из культур У pesiis (25 °С), что свидетельствовало в пользу увеличения степени редуцированности чумного ДОС и наличия дополнительных механизмов температуроопосредованной генетической регуляции и фенотипической изменчивости возбудителя чумы.
Используя совокупность аналитических методов оганической химии был определен состав и последовательность моносахаридов в коре ДОС У. pesiis. Установлено, что в коре JIOC Y. pesiis имеется структурно-консервативный участок, общий для трех изученных ЛОС (Y. pesiis КМ260, КМ218, KEMD1) и вариабельный участок, структура которого меняется и зависит от температуры культивирования биомассы. Повышение температуры культивирования оказалось неблагоприятным для включения в состав кора Gal и Ко кислоты. Были установлены отличия в молекулярной организации кора ЛОС представителя подвида «полевочьих» штаммов У. pestis 1146 от ЛОС из штаммов подвида pestis. Наиболее значимое отличие этого штамма заключалось в отсутствии DDHep и замене ее при температуре 37 °С на Gal. Дополнительная гетерогенность и отличительная черта ЛОС данного штамма связана с наличием глицина в ЛПС У. pestis штамма 1146. Дальнейшего выяснения требует вопрос - является ли это общей закономерностью для «полевочьих» штаммов или это уникальная структура присуща только данному штамму?
Установлено, что с повышением температуры культивирование происходят изменения молекулярной структуры липидного отдела ЛОС возбудителя чумы, выражающиеся в деацилировании жирных кислот и изменении степени гликозилирования, что приводит к изменению биологических свойств препаратов ЛОС.
Впервые показано, что олигосахаридный участок ЛОС возбудителя чумы имеет отчетливо выраженную температуро- и штаммозависимую иммунохимическую изменчивость ЛОС. Для препаратов ЛОС, полученных из штаммов, выращенных при температуре 37 °С, показана более узкая штаммовая иммунохимическая специфичность.
Определена связь между изменением химической структуры ЛОС Y. pestis subsp. pestis КМ218 и subsp. caucasica и иммунобиологической активностью данных препаратов. Показано, что резистентность к действию комплемента, N0 и а-ФНО-индуцирующая активность препаратов ЛОС зависела также и от температуры культивирования штамма-продуцента ЛОС и от природы штамма. ЛОС штаммов subsp. caucasica 1146, отличались от всех остальных достоверно более низкой резистентностью к действию комплемента, индукцией синтеза N0 и а-ФНО. Прослеживается явная связь между разницей в молекулярной организации препаратов ЛОС различных подвидов в обусловливаемой ими резистентности к действию систем комплемента различных хозяев, индукции синтеза воспалительных цитокинов и вирулентностью клеток возбудителя чумы для этих млекопитающих.
Наряду с кодируемыми плазмидами температурозависимыми белками, ЛОС возбудителя чумы оказывается прецизионным инструментом регулирования взаимодействия патогена с постоянно меняющимися факторами внешней среды, существования в организмах различных хозяев и переносчиков, координирующим присущую им разноплановую биологическую активность с белковыми факторами патогенности чумного микроба:
Основные свойства и эффекты ЛОС могут быть сформулированы следующим образом:
1. Взаимодействие с белковыми факторами патогенности чумного микроба. Уменьшение цитокининдуцирующей активности ЛОС, синтезированного при температуре тела теплокровного хозяина согласуется с иммуносупрессорной активностью Yops [Cornelis etal., 1998]. Отсутствие О-полисахаридных цепей в клетках возбудителя чумы усиливает свойства Pia, связанные с вирулентностью микроорганизма [Lang et al., 2002]. В недавней работе Е.П. Соколовой [2002] показано, что in vitro мышиный токсин и ЛОС возбудителя чумы могут взаимодействовать между собой с образованием высокотоксичного комплекса.
2. Угнетение способности индуцировать механизмы врожденного иммунитета хозяина. Отсутствие О-специфических боковых цепей и синтез редуцированных R форм ЛОС возбудителем чумы определяют устойчивость к комплементзависимому лизису бактерий [Porat étal, 1995], что является необходимым условием для выживания и роста в крови и важным в плане трансмиссии патогена между двумя хозяевами - млекопитающими и блохами [Brubaker, 2000; Домарадский, 1993; Perry, Fetherston, 1997; Анисимов, 2002], а также устойчивость к катионным антимикробным пептидам, которые являются ключевыми компонентами врожденного иммунитета [Bengoechea, 1998; Dimopoulos, 2003]. Результаты наших исследований свидетельствуют о наличии температуроопосредованной штаммозависимой модификации кора и липида А ЛОС У. pestis, результатом которой является подавление способности запускать механизмы врожденного иммунитета хозяина.
3. Уход от специфического иммунного ответа. При попадании чумного микроба в организм млекопитающего посредством укуса блохи эпитопы кора ЛОС экспонированы на поверхности и не экранированы секретируемыми и мембранными белками, синтез которых является температурозависимым. Происходит запуск иммунного ответа на консервативные и вариабельные иммунодоминантные антигенные детерминанты кора, специфичные для ЛОС (25 °С), тогда как эпитопы, специфичные для ЛОС (37 °С), по нашему мнению, или экранированы стерически или еще отсутствуют - налицо направление иммунного ответа «по ложному следу». Далее происходит синтез коровых структур, которые не опознаются антителами, индуцированными ЛОС (25 °С), и уход от защитных иммунных механизмов хозяина. Наличие значительной серовариабельности кора объясняет отсутствие протективности в опытах с использованием гетерологичных ЛОС возбудителя чумы или ЛОС-специфических антител.
4. Существование адаптационной пластичности для персистенции микроба в различных природных ареалах, хозяевах и переносчиках, о чем свидетельствуют уникальные результаты, полученные в ходе выполнения данной работы. Биохимические особенности хозяина, такие как низкий уровень комплемента в крови естественного хозяина (полевок), способны вызывать адаптационные изменения структуры кора ЛОС в связи с ненадобностью указанных биологических функций.
Многие компоненты возбудителя чумы, экспрессируемые при температуре организма млекопитающего, обладают ярко выраженными имуносупрессорными свойствами [Schesser etal., 1998; Muller etal., 1998] и препятствуют запуску каскада защитных реакций организма, в том числе и путем предотвращения индукции синтеза таких провоспалительных цитокинов, как IL-8, TNF-a [Schesser etal., 1998]. Эти данные проясняют стратегию вирулентности возбудителя чумы - разноплановое подавление реакций иммунной системы хозяина в ответ на внедрение чужеродного организма на самых ранних стадиях инфекции, смена иммунохимической парадигмы и затем безудержный рост микроба. Один из уникальных механизмов, работающих для реализации этой стратегии, - температуроопосредованная модификация ЛОС в направлении смены иммунохимической специфичности, а также уменьшения их способности индуцировать синтез провоспалительных цитокинов и вызывать повышение неспецифической резистентности макрорганизма.
Обнаруженный феномен изменчивости ЛОС возбудителя чумы по значимости превосходит факт наличия вариабельности капсульного FI и V антигенов в силу его масштабности. Новые данные о ЛОС возбудителя чумы позволяют разработать методы дополнительной внутривидовой дифференциации патогена, понять особенности молекулярной организации и механизмов вирулентности различных подвидов возбудителя чумы, а также ставят новые вопросы о масштабах и формах их изменчивости, роли вариабельности в персистенции патогена в природе, адаптации к смене хозяев и переносчиков.
В главе VIII представлены новые данные о молекулярной организации и иммунобиологических свойствах рН6 антигена. Проанализировано сходство рН6 антигена с субъединицами капсульного антигена Y.pesíis. Охарактеризованы рекомбинантные формы рНб антигена, показана их идентичность рНб белку из чумных штаммов. i.
Выявлены различия в биологической активности внутри- и внеклеточных форм рНб антигена, что также объединяет его с капсульным антигеном.
Схожесть молекулярной организации оперонов, кодирующих оба "капсульных" антигена чумного микроба - рНб и FI, а также биологической организации белков позволяют с достаточно высокой долей вероятности прогнозировать необходимость использования полноценного psa оперона, а не только структурного гена для экспрессии антигенноспецифического, функционально активного полимера рНб антигена. Можно полагать, что экспрессия только гена, кодирующего синтез белковой субъединицы рНб антигена в составе рекомбинантных плазмид, слитных белков и т.д. приведет к получению серологически атипичных, функционально неактивных мономеров, как это показано для капсульного FI антигена. Косвенно в пользу такого предположения свидетельствует факт, что отсутствие psáE и psaF локусов сопровождается изменением фенотипа клетки, что наблюдается и для капсульного антигена при делеции или инактивации caflM гена [Yang et al, 1996].
Путем химической и термической обработки получен и изучен ряд производных рНб антигена различной степени полимеризации с варьирующими биологическими свойствами. В результате изучения протективности полимеризованных и деполимеризованных препаратов рНб антигена на морских свинках и мышах получены данные, свидетельствующие об отсутствии у них выраженных протективных свойств для обеих лабораторных моделей животных. Выявлены различия в раннефазной реакции лабораторных животных на рНб антиген.
В результате анализа собственных экспериментальных и литературных данных, мы считаем, что использование рНб антигена для разработки иммуно профилактических препаратов нового поколения неактуально, так как в высокополимеризованном виде он обладает низкой иммуногенностью, в виде мономеров - иммуносупрессивен, а клонирование его в составе рекомбинантных плазмид, несущих только структурный ген рНб антигена, вероятнее всего будет сопровождаться синтезом антигенноатипичных, биологически неактивных форм, подобно тому, что показано, для капсульного антигена.
В главе IX изучена иммуногенность капсульного антигена, экспрессированного в различных штаммах сальмонелл, охарактеризовано влияние детоксицированного производного липида А грамотрицательных бактерий МФЛА на вакцинный чумной процесс. Во всех наших исследованиях, связанных с конструированием и изучением иммунопрофолактических и диагностических препаратов, мы использовали конструкции только с полным fra опероном, что обеспечивало синтез нативного капсульного антигена в секретируемой высокоиммуногенной форме.
Использование векторных сальмонеллезных штаммов на практике требует решения ряда проблем. Первая - это выбор способа аттенуации. Возможно, Aro мутанты являются не самыми лучшими бактериальными векторами из известных на сегодняшний день. В главе 2.2. обзора литературы приведены основные пути, по которым осуществляется аттенуация сальмонелл. Но именно этот штамм S. typhimurium SL3261 является в настоящее время своего рода референсным штаммом, позволяющим сравнивать результаты исследований, проводимых различными группами ученых.
Необходимо отметить еще одну проблему, связанную с увеличением степени аттенуации клеток сальмонелл после их трансформации рекомбинантными плазмидами, кодирующими синтез гетерологичных протекгивных белков. Плазмидные векторы, стабильно наследующиеся в клетках различных гетерологичных реципиентов, теряют способность к стабильному наследованию при введении в их состав генов, кодирующих синтез гетерологичных антигенов, как это было, в частности, с делеционными вариантами pPst плазмиды У. pestis, которые после встраивания в них fra оперона теряли способность к стабильному наследованию в клетках сальмонелл и Е. coli.
Еще одна сложность связана с трудностями экстраполяции результатов, полученных на одних видах микроорганизмов и животных, на другие виды микроорганизмов и иммунитет, индуцируемый у других видов животных и человека. Тем не менее, использование таких моделей и их изучение являются необходимыми звеньями в конструировании вакцин нового поколения.
Изучена протективность МФЛА в комплексе с капсульным белком. Наибольшее потенциирующее действие МФЛА реализуется в ранние (3-14 сутки) и поздние (3-6 месяцев) сроки иммунизации, когда протективность комплексированного с МФЛА капсульного антигена достоверно выше, чем у других исследованных вакцинных препаратов. Отсутствие его влияния на пике иммунитета можно объяснить тем, что FI сам по себе в высокополимеризованной форме является сильным иммуногеном, и интенсивность формируемого иммунитета в эти сроки находится на пике возможности иммунной системы. МФЛА в составе белковолипидного липосомального комплекса с капсульным антигеном У. pestis способен существенно усиливать его протекгивные свойства в ранние и отдаленные сроки иммунизации путем инициации неспецифической резистентности на ранних сроках после иммунизации, более быстрой и интенсивной индукции синтеза специфических FI антител и формирования напряженного иммунитета в отдаленные сроки после вакцинации.
Аналогичный эффект был получен при иммунизации мышей убитыми клетками штамма S. minnesota R595 pFSl, экспрессирующими капсульный антиген чумного микроба. Такая иммунизация индуцировала развитие ранней резистентности к последующему заражению высокими дозами клеток вирулентных чумных штаммов. Этот факт особенно важен с точки зрения разработки иммунопрофилактических препаратов для экстренной профилактики угрожаемых контингентов.
Вариабельность капсульного FI, V антигенов и ЛОС, установленные как в ходе выполнения данной работы, так и известные по литературным источникам, делает проблему создания иммунопрофилактических препаратов против чумы более сложной, а возможно потребует создания нескольких вариантов вакцин.
Полученные данные о вариабельности структуры JIOC чумного микроба свидетельствуют о необходимости дальнейшего изучения данного явления и в случае экспериментального подтверждения однотипности структуры кора штаммов Y. pestis подвида pestis (вирулентного для человека) дает возможность включения дефосфорилированного МФЛА в составе вакцинного препарата в комплексе с капсульным антигеном или дезацилированного препарата ЛОС (37 °) в виде химического конъюгата с V антигеном. Капсульный FI антиген, являясь полимером, не подходит для химического конъюгирования с полисахаридами, да этого и не требуется при его высокой иммуногенности.
Достижения последних лет позволили наметить рациональные пути получения иммуногенных вакцинных препаратов на основе полисахаридных компонентов. Наиболее перспективно химическое конъюгирование полисахаридных антигенов с белками, что позволяет получать вакцинные препараты, стимулирующие В и Т отделы иммунной системы [Robbins, Schneerson, 1989, 1990]. Преимущества такой формы презентации двух антигенов очевидны - повышается иммуногенность обоих, уменьшается иммуносупрессивное действие V антигена, оба соединения являются охарактеризованными и стандартными. Недавно выявленная антигенная вариабельность V антигена - и отсутствие защиты животных при заражении штаммами Y. pestis другого серовара [Worsham, 1998; Griffin, 1998; Roggenkamp, 1997] предполагает целесообразноть включения в состав вакцинных препаратов, всех антигенных вариантов V антигена, особенно если речь идет о предотвращении последствий биотерроризма.
Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию тонких молекулярных механизмов, которые лежат в основе взаимодействия возбудителя чумы с организмом хозяина, что, в свою очередь, открывает перспективы разработки новых стратегий противодействия патогену.
Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Гремякова, Татьяна Андреевна, Москва
1. Абгарян Г.П. Характеристика некоторых штаммов чумного микроба, выделенных на Армянском нагорье от обыкновенных полевок: Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1966. - 16 с.
2. Анисимов АП. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis: Дисс. . докт. мед. наук. Саратов, Обо лен ск, 1999.-326 с.
3. Анисимов АП. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы В экосистемах природных очагов. // Молекулярная генетика 2002. -№ 3. - С. 3-23.
4. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы В экосистемах природных очагов. // Молекулярная генетика. -2002а. -№ 4. С. 3-11.
5. Анисимов А.П., Ежов И.Н., Захарова Н.М. и др. Изучение функциональной организации /га-оперона pFra возбудителя чумы методом направленного мутагенеза // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Волгоград, 1992. - С. 6.
6. Анисимов АП., Захарова Н.М. Серовариация капсульного антигена возбудителя чумы // Молекул, генетика. 1992. - № 9-10. - С. 26-29.
7. Анисимов АП., Малахаева А.Н., Черновская Т.В. и др. Капсулообразование у F1" и Fl± штаммов возбудителя чумы // Эрдем шинжилгээний бггээл (Байгалийн голомтот хал-дварт евчнийг эсэргууцэн судаахтев). Улаанбаатар, 1999. Дугаар 7. - С. 169-171.
8. Анисимов АП., Маркова В.Ю. Изменчивость антигенной специфичности капсулы Yersinia pestis и ее влияние на персистенцию бактерий в организме иммунного хозяина // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. Вып. 1, юбилейный. Алматы, 1999. -С. 13-18.
9. Анисимов А.П., Никифоров А.К., Еремин С.А и др. Конструирование штамма Yersiniapestis с повышенной протективностью // БЭБМ. 1995. - № 11. - С. 532-534.
10. Анисимов А.П., Фомченков В.М., Фурсова Н.К. и др. Электрокинетический потенциал клеток Yersinia pestis и Escherichia coli с интактным или дефектным геном усаА (caflM)/га-оперона возбудителя чумы // Генетика. 1994. - Т. 30. - № 9. - С. 1160-1165.
11. Анисимова Т.И. Стандартизация системы методов лабораторной оценки безопасности и иммуногенности чумных вакцин: Дисс. . докг. мед. наук. Саратов, 1985. - 407 с.
12. Апарин Г.П, Голубинский Е.П. Микробиология чумы. Руководство. Иркутск, Иркутский государственный университет, 1989. - 92 с.
13. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - С. 85-104.
14. Бактерийные, сывороточные и вирусные лечебно-профилактические препараты. Аллергены. Дезинфекционно-стеризизационные режимы поликлиник: Справочник практического врача / Под ред. Н.А. Озерецковского, Г.И. Останина Санкт-Петербург: Фолиант, 1998. 366 с.
15. Бахрах Е.Э., Вейнблат В.И Соматические полисахаридсодержащие антигены чумного микроба//Журн. микробиол. 1972. -№ 3. - С. 12-16.
16. Бахтеева И.В., Титарева ГМ., Гремякова Т.А Митогенная активность нативных и дефосфорилированных препаратов ЛПС Y. pestis И Мат. науч.-практ. конф. поев. 100-летию образования противочумной системы (Том I) 1997 г. Саратов. - 1997. - С. 198.
17. Боровикова Т.А. Характеристика специфических полисахаридсодержащих комплексов субкультур штамма ЕВ чумного микроба: Автореф. дисс. канд. биол. наук. Саратов, 1972. - 13 с.
18. Бургасов П.Н., Анисимова Т.И., Кузнецова О.Р. и др. Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба (методические указания) / Утверждены зам. министра здравоохранения СССР А.И. Бурназяном 8 марта 1974 г. Саратов, 1976. - 34 с.
19. Бывалов А А, Евстигнеев В.И., Дубровин М.Ю. и др. Зависимость уровня невосприимчивости лабораторных животных к чуме от титра сывороточных антител к протекгив-ным антигенам Yersinia pestis II Там же. С. 193.
20. Бывалов АА, Евстигнеев В.И., Пименов Е.В. и др. Использование комплексного препарата, включающего антигены Ф1 и Б, для иммунизации экспериментальных животных против чумы // Там же. С. 194.
21. Бывалов А А, Паутов В.Н., Чичерин Ю.П и др. Эффективность ревакцинации павианов гамадрилов чумной живой сухой вакциной НИИС и фракцией 1 чумного микроба // Журн. микробиол. 1984. - № 4. - С. 74-76.
22. Васильев AM., Яканкин В.Г., Спирина Г.В. и др. Структурно-функциональные свойства рекомбинантных FI и I антигенов чумного микроба // Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний: Тез. докл. Киров, 1991. С. 163-164.
23. Васильева Г.И., Пустовалов B.JL, Киселева АК. и др. Оценка вирулентности штаммов Yersinia pestis по индексу завершенности фагоцитоза // Журн. микробиол. 1987. -№ 6. - С. 117.
24. Вейнблат В.И., Палагин А.Ю., Веренков М.С. и др. Иммунобиологические свойства препаратов фибринолизина чумных микробов // Биотехнология, иммунология и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1989. - С. 14-19.
25. Водопьянов С. О., Мишанькин Б.Н. Пили адгезии у Yersinia pestis II Журн. микро-биол. 1985. -№ 6. - С. 13-17.
26. Водопьянов С.О., Рыбянец АА, Веркина Л.М. и др. Изучение протективной активности пилей адгезии Yersinia pestis II Журн. микробиол. 1995. - № 5. - С. 26-29.
27. Гинсбург H.H. Живые вакцины. М.: Медицина, 1969. - 336 с.
28. Голубинский Е.П., Рублев Б.Д., Герасюк Л.Г. и др. К характеристике иммуноген-ности конъюгированных антигенов чумного микроба // Совр. аспекты профилакт. зоон. инфекций. Иркутск, 1984. - Ч. 2. - С. 20-21.
29. Гремякова Т. А., Амельченко В. В., Анисимов Г. А. Ранняя защита при экспериментальной чуме животных, иммунизированных экспериментальной рекомбинантной чумной вакциной // Бюлл. эксп. биол. и мед. 1995. -№. 1. - С. 54-57.
30. Гремякова Т. А., Анисимов А П. Серологическая активность антигена "фракция I" Yersinia pestis определяется его белковым компонентом // Гомеостаз и инфекционный процесс: Тез. докл. Международ, науч. конф. 1996 г. Саратов, 1996. - С. 319.
31. Гремякова Т. А, Анисимов А. П., Говорунов И. Г. Секреция капсульного антигена возбудителя чумы в энтеробактериях // Новые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы: Тез. докл. XIV науч.-практ. конф. 21-23 мая 1991 г., Оболенск, 1991. - С. 9-11.
32. Гремякова Т. А., Анисимов А П., Захарова Н. М. Взаимосвязь способности к экспрессии различных серовариантов капсульного антигена Yersinia pestis со степенью редуцированности липополисахарида бактериальных клеток//ЖМЭИ. 1995. -№. 1. - С. 3-6.
33. Гремякова Т. А., Степаншина В. Н, Коробова О. В., Анисимов Г. А., Изучение возможности создания молекулярной противочумной вакцины // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ // Мат. Рос. науч. конф. 1992. Волгоград, 1992 - С. 63.
34. Гремякова Т. А, Степаншина В. Н., Степанов А. В, Коробова О. В., Амельченко
35. B. В., Бахтеева.И. В., Шмелев В. А Модуляция иммунобиологических свойств чумных вакцинных препаратов монофосфорил липидом А //Биотехнология. 1997.-№.11-12. -С.18-32
36. Гремякова Т. А, Фурсова Н. К., Фомченков В. М., Волковой К. И. Сравнительная характеристика физических и биологических свойств ЛПС Yersinia pestis и R-мутантов энтеробактерий // Микробиология. 1996. - Т. 65. -№.6. - С. 763-767.
37. Гремякова Т.А Чумные рекомбинантные вакцины // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции (21-23 сентября 1993 г., Саратов). Саратов, 1993. - С. 8-9.
38. Гремякова Т.А., Амельченко В.В. Ранняя защита при экспериментальной чуме животных, иммунизированных экспериментальной рекомбинантной чумной вакциной // Бюлл. экс. биол. и мед. 1993. -№ 1. - С. 10-13.
39. Гремякова Т.А, Анисимов А.П., Захарова Н.М. Взаимосвязь способности к экспрессии различных серовариантов капсульного антигена Yersinia pestis со степенью редуцированности липополисахарида бактериальных клеток // Журн. микробиол. 1995. - № 1.1. C. 3-6.
40. Гремякова Т.А, Волковой К.И., Шайхутдинова Р.З., Степанов AB. Температуро-зависимые изменения иммунохимических свойств липополисахарида // Вестник Рос. Акад. Мед. Наук. 1999. - № 12. - С. 32-34.
41. Гремякова Т.А., Степаншина В.Н., Негрий В.Ф. и др. Сравнительная характеристика препаратов капсульного антигена FI Yersinia pestis, полученных из штаммов-продуцентов с различной структурой ЛПС // Журн. микробиол. 1994,- № 3. - С. 10-14.
42. Грибоедов A.B., Барабаш Г.П. "Основной" соматический антиген или антиген, получаемый по методу Буавена-Месробеану из Yersinia pestis И Журн. микробиол. 1985,- № 3. -С. 108-115.
43. Дальвадянц С.М., Дробышева Т.М. Сравнительное изучение напряженности противочумного иммунитета у белых мышей, привитых "химической", убитой и живыми чумными вакцинами // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1977. - Вып. 6 (58). -С. 31-33.
44. Добрица В.П., Стогов В.И., Гавршпок О.В. и др. Некоторые итоги и перспективы разработки нативных и модифицированных вакцин к Y. pestis // Там же. С. 88-89.
45. Домарадский И.В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы. Саратов: Саратовский медицинский институт, 1993. 130 с.
46. Домарадский И.В. Чума М.: Медицина, 1998. - 176 с.
47. Домарадский И.В., Калмыкова А.П., Кротова В.А. и др. Некоторые данные по проблеме "химической" вакцины против чумы // Доклады Иркутского противочумного института Вып. 3. - Хабаровск, 1962. - С. 18-25.
48. Домарадский И.В., Колесник Р.С., Клец Э.И. и др. Попытка иммунизации против чумы псевдотуберкулезными микробами в комбинации с чумными // Проблемы особо опасных инфекций, 1970. Вып. 5 (15). - С. 12-16.
49. Дробков В.И, Маракулин И.В., Погорельский И.П. и др. Спектр антител при введении чувствительным животным бактерий Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis II Журн. микробиол. 1996. - № 2. - С. 81-85.
50. Дроздов И.Г., Ежов И.Н., Самойлова С.В. и др. Оценка биологических свойств бескапсульных вариантов возбудителя чумы // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1993. - Вып. 1-2 (71-72). - С. 154-159.
51. Дроздов ИГ., Ежов И.Н., Самойлова С.В. и др. Способ получения бескапсульных вариантов возбудителя чумы // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1993. -Вып. 3 (73). - С. 187-195.
52. Дудина С.И. О роли "мышиного" токсина в иммуногенезе при чуме // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 1976. - Вып. 3 (49). - С. 17-20.
53. Евстигнеев В.И., Чичерин Ю.В., Бывалов А.А. и др. Иммуногенная активность "мышиного" токсина чумного микроба в эксперименте на животных // Журн. микробиол. -1981. № 3. - С. 39-42.
54. Жуков-Вережников Н.Н. Иммунология чумы (Основы специфической терапии и профилактики бубонной и легочной чумы). M.-JL: Медгиз, 1940.
55. Ю4.Иванов Н.Р., Исупов И.В., Ленская Г.Н. и др. К характеристике экспериментального противочумного иммунитета после прививок живыми вакцинами // Проблемы особо опасных инфекций. 1968,- Вып. 3. - С. 18-22.
56. Классовский ЛН., Степанов В.М., Мартиневский И.Л. и др. Наставление по изучению свежевыделенных штаммов возбудителя чумы. Алма-Ата, 1972. - 36 с.
57. Книрель Ю.А, Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А // Биохимия. -1993. Т. 58. - С. 166-201.
58. Ю.Козлов М.П. Чума (природная очаговость, эпизоотология, эпидемиологические проявления). М.: Медицина, 1979. 192 с.
59. Ш.Кокушкин А.М. Социальные и биологические аспекты эпидемиологии чумы: Дисс. докт. мед. наук. Саратов, 1995. - 392 с.
60. Кокушкин А.М. Трансформирующая активность плазмид чумного микроба: Дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1983. - 183 с.
61. Комитет экспертов ВОЗ по чуме. 4й доклад. Женева, 1971,- С. 19.
62. Коробков Г. Г. Некоторые особенности развития противочумного иммунитета // Доклады Иркутского противочумного института: Материалы научной конфер. посвященной 50-летию Читинской противочумной станции. Вып. 6, Чита, 1963. - С. 94-95.
63. Коробкова Е.И. Вакцинация против чумы в зарубежных странах и в СССР. Эффективность вакцинации против легочной чумы // Проблемы особо опасных инфекций. -1968.-Вып. 3. С. 147-156.
64. Коробкова Е.И Живая противочумная вакцина М.: Медгиз, 1956.
65. Коссе Л.В., Лебедева С.А, Кузнецова Л.С. и др. Новые данные, относящиеся к специфичности и генетическому контролю капсульного антигена (Fl) Yersinia pestis И Журн. микробиол. 1997. - № 2. - С. 29-33.
66. Кудинова Т.П. Свойства штаммов чумного микроба, выделенных осенью 1963 года в Или-Каратальском междуречье: Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Алма-Ата, 1968. -18 с.
67. Куклева Л.М., Карасева З.Н., Кондрашин Ю.И. Фагоцитоз штаммов чумного микроба перитонеальными макрофагами интактных и иммунизированных животных // Вопросы генетики, молекулярной биологии и микробиологии чумы и холеры. Саратов, 1985. -С. 42-48.
68. Кутырев В.В. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителя чумы: Дисс. д-ра. мед. наук. Саратов, 1992. 332 с.
69. Кутырев В.В., Попов Ю.А, Проценко О.А. Плазмиды патогенности чумного микроба (Yersinia pestis) // Молекул, генетика. 1992. - № 6. - С. 3-11.
70. Кутырев В.В., Филиппов АА., Шавина Н.Ю. и др. Генетический анализ и моделирование вирулентности Yersinia pestis II Молекул, генетика. 1989. - № 8. - С. 42-47.
71. Лобанов В.Н. Патологическая анатомия и патогенез чумы у человека. М.: Государственное издательство медицинской литературы, 1956. 175 с.
72. Мартиневский ИЛ. Гладкие формы возбудителя чумы // Карантинные и зооноз-ные инфекции в Казахстане. Вып. 1, юбилейный. Алматы, 1999. - С. 211-212.
73. Медуницин Н.В. Вакцинология. М.: Триада-Х, 1999. - 272 с.
74. Метлин В.Н. Роль мышиного токсина в вирулентности и иммуногенности чумного микроба: Дисс. канд. мед. наук. Саратов, 1968. - 265 с.
75. Мишанькин Б.Н., Лопатина Н.В. Противочумная вакцина: прошлое, настоящее и будущее // Биотехнология. 1996. - № 4. - С. 3-9.
76. Назарова Л.С., Тараненко Т.М., Исупов ИВ. Стимуляция клеточного иммунитета ЛПС Yersinia pestis // Журн. микробиол. 1994. - № 5. - С. 85-86.
77. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов ИГ. Иммунология чумы. Саратов, 1992.172 с.137.'Никифоров АК. Конструирование штаммов-суперпродуцентов капсульного антигена Yersinia pestis'. Дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1995. - 143 с.
78. Николаев II.К Чума (клиника, диагностика, лечение и профилактика). М.: Медицина, 1968.-240 с.
79. Николаев Н.И., Пономарев Н.Г., Филиппов А.Ф. и др. Вакцинопрофилактика чумы // Профилактика чумы в природных очагах: Материалы конференции (Март 1973 г., Саратов). Саратов: Издательство Саратовского университета, 1991. - С. 129-139.
80. Оводов Ю.С., Горшкова Р.П. Липополисахариды псевдотуберкулезного микроба // Химия природных соединений. 1988. -№ 2. - С. 163-171.143.0стерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.
81. Павлова Л.П., Тихомирова Е.И., Горькова АВ., и др. Миграция из костного мозга полипотентных стволовых кроветворных клеток у иммунизированных против чумы мышей// Иммунол. и специф. профилакг. особо опасныхинф. Саратов. - 1986. - С. 3-9.
82. Петрова Б.Ю., Шалаева А.Ф. Роль капсулы в иммуногенности живой противочумной вакцины // Специфич. профилакг. особо опасных инфекций. Саратов, 1964. -С. 133-138.
83. Проценко О.А., Анисимов П.И., Можаров О.Т. и др. Выявление и характеристика плазмид чумного микроба, детерминирующих синтез пестицина 1, антигена фракция 1 и экзотоксина "мышиного" токсина// Генетика. 1983. - Т. 19. - № 7. - С. 1081-1090.
84. Проценко О.А., Кузьмиченко И.А., Кутырев В.В. и др. Генетический контроль синтеза фосфолипазы D Yersinia pestis // Генетика. 1994. - Т. 30. - Приложение. - С. 128.
85. Пунский Е.Е., Адаменко Н.И. Эпизотологическое значение атипичных по синтезу фракции 1 штаммов возбудителя чумы // Медико-географические проблемы аридной зоны. -Ашхабад, 1982. С. 36-38.
86. Пустовалов В.Л., Васильева Г.И., Киселева А.К. Определение антифагоцитарной активности антигенов чумного микроба // Патологическая физиология, иммунол. и аллер-гол. ООН. Саратов, 1984. - С. 8-12.
87. Руководство по профилактике чумы / Под ред. АВ. Наумова, Л.В. Самойловой. -Саратов, 1992.-278 с.
88. Руководство по профилактике чумы // Под ред. Н.И. Николаева Саратов, 1972. - С. 134-153.
89. Сагимбеков У.А, Пошевина Г. О. К вопросу о механизме саморегуляции эпизоотии чумы в Муюнкумах // Проблема изучения механизма энзоотии чумы: Тез. докл. на Всесоюзной конференции / Под ред. П.И. Анисимова. Саратов, 1980. - С. 39-44.
90. Самойлова Л.В., Белобородов Р.А, Тараненко Т.М. Действие некоторых факторов на патогенные свойства штамма EV в организме животных // Проблемы особо опасных инфекций. 1968. - Вып. 3. - С. 23-27.
91. Самойлович Д. Избранные произведения. М., 1949.
92. Сердобинцев Л.Н. Полиморфизм капсульного антигена чумного микроба: Дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1984. - 165 с.
93. Соколова Е.П. Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба: : Автореф. дисс. канд. мед. наук. Ростов-на-Дону, 2002. - 18 с.
94. Степаншина В. Н., Гремякова Т. А., Анисимов А. П. Биологическая активность нативного и модифицированного рН6 антигена чумного микроба // Новые технологии и биосистемы. Тез. докл. XIV науч.-практ. конф. 21-23 мая 1991 г.- Оболенск, 1991. С. 11-13.
95. Степаншина В. Н., Гремякова Т. А., Анисимов А. П., Потапов В. Д. Выделение и свойства рН6 антигена чумного микроба // Новые технологии и биосистемы. Тез. докл. XIV науч.-пракг. конф. 21-23 мая 1991 г. Оболенск, 1991. - С. 78-80.
96. Степаншина В. Н., Гремякова Т. А., Анисимов. А. П, Поталов В. Д. Физико-химическая и биологическая характеристика рНб-антигена Yersinia pestis, выделенного им-муносорбционным методом // ЖМЭИ. 1993. - № 3. - С. 12-17.
97. Степаншина В.Н., Гремякова Т.А, Коробова О.В., Анисимов Г.А. Взаимосвязь между составом капсульного антигена Yersinia pestis и его протективной активностью // ЖМЭИ. ЖМЭИ 1995. - №2. - С. 124.
98. Степаншина В.Н., Гремякова Т.А., Коробова О.В. и др. Изучение взаимосвязи между химическим составом капсульного антигена чумного микроба и его протективной активностью // Журн. микробиол. 1995. - № 6 - С. 47.
99. Тараненко Т.М., Вейнблат В.И. Современные представления о структуре О-соматического антигена чумного микроба // Иммунохимия и лабораторная диагностика особо опасных инфекций Саратов, 1985. - С. 10-17.
100. Тараненко Т.М., Ермакова Г.В., Андреева И.П. и др. Структурно-функциональное изучение гликолипидного токсина чумных и псевдотуберкулезных иерсиний // Микробиология, биохимия и специфическая профилактика карантинных инфекций. Саратов, 1990. -С. 49-51.
101. Топорков В.П., Подсвиров АВ., Яшкулов К.Б. Эколого-эпидемиологический мониторинг за предикторами экстремальных эпидемических ситуаций в природно-очаговом по чуме регионе Северо-западного Прикаспия. Элиста, 1999. - 126 с.
102. Фурсова Н. К. Алимов А П., Гремякова Т. А. Особенности экспрессии и наследования плазмид, кодирующих синтез протективных атнигенов Yersinia pestis в клетках ге-терологичных реципиентов // Генетика. 1994. - Т.ЗО (Приложение) - С. 168.
103. Ценева Г.Я., Бондаренко В.М., Воскресенская Е.А и др. Протекгивная активность антигенов Yersinia pseudotuberculosis II Журн. микробиол. 1994. - № 4. - С. 45-48.
104. Черепанов П.А, Михайлова Т.Г., Каримова Г.А и др. Клонирование и детальное картирование /га->та/-области плазм иды pFra Yersinia pestis II Молекул, генетика. 1990. -№ 12. - С. 19-26.
105. Шанина JI.H. Характеристика вариантов чумного микроба, не продуцирующих капсульного антигена и "мышиного" токсина: Дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1967. -199 с.
106. Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир, 1987. - 566 с.
107. Шмелев В.А, Носова Л.Ю., Галеев В.-С. К, Ставицкий С.Б., Лупщков С.Б., Попов С.Г., Герасимов В.Н. Гетерогенность музейных штаммов Yersinia pseudotuberculosis и их молекулярно-биологические свойства// Микробиология. 1991. - № 5 - С. 4-8.
108. Achtman M., Zurth KL, Morelli G. et al. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999. - V. 96. - P. 14043-14048.
109. Ada G.L. What to expect of good vaccine and how to achieve it // Vaccine. 1988. -V. 6 - P. 77-79.
110. Alving C.R Liposomal Vaccines: Clinical Status and Immunological presentation for humoral and cellular immunity // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1995. - V. 754. - P. 143-152.
111. Alving C.R, Richards R.L. Liposomes containing lipid A* a potent nontoxic adjuvant for a human malaria sporozoite vaccine // Immunol. Lett. 1990. - V. 25. - P. 275-280.
112. Angerman C., Eisenstain T. Comparative efficacy and toxicity of a ribosomal vaccine, acetone-killed cells, lipopolysaccharide and a live cell vaccine prepared from Salmonella typhi-murium//Infec. Immunity. 1978. -V. 19. - P. 575-582.
113. Anisimov A P., Dyatlov I. A. A novel mechanism of antibiotic resistance in plague? // J. Med. Microbiol. 1997. - V. 46. - P. 887-889.
114. Aussei L., Therisod H., Karibian D., etal., Novel variations of lipid A structures in strains of different Yersinia species // FEBS Lett. 2000. - V. 465. - P. 87-92.
115. Bacon G.A., Burrows T.W., Yates M. The effect of biochemical mutation on the virulence of Bacterium typhosurrv. the virulence of mutants // Brit. J. Exp. Path 1950. - V. 32. - P. 714724.
116. Baker E.E., Sommer H., Foster L.E. etal. Studies on immunization against plague. I. The isolation and characterization of the soluble antigen of the Pasteurella pestis // J. Immunol. -1952. -V. 68. P. 131-145.
117. Ben-Efraim S., Aronson M., Bichowsky-Slomnicki L. New antigenic component of Pasteurella pestis formed under specific conditions of pH and temperature // J. Bacterid. 1961. -V. 81. - P. 704-714.
118. Bennet L.G., Tomabene T.G. Characterization of the antigenic subunits of the envelope protein of Yersinia pestis // J. Bacteriol. 1974. - V. 117. - P. 48-55.
119. Bergman T., Hakansson S., Forsberg A et al. Analysis of the V antigen IcrGVH-yopBJD operon of Yersinia pseudotuberculosis: evidence for a regulatory role of LcrH and LcrV // J. Bacterid. 1991. - V. 173. - P. 1607-1616.
120. Beuscher H.U., Rodel F., Forsberg A. et al. II Bacterial evasion of host immune defense: Yersinia enterocolitica encodes a suppressor for tumor necrosis factor alpha expression // Infec. Immunity. 1995. - Y. 63. - P. 1270-1277.
121. Bi Z., and C. S. Reiss. Inhibition of vesicular stomatitis virus infection by nitric oxide // J. Virol. 1995. V. 69. - P. 2208-2213.
122. Bichowsky-Slonimsky L., Ben-Efraim S. Biological activities in extracts of Pasteurella ■pestis and their relation to the "pH6 antigen" // J. Bacteriol. 1963. - V. 86. - P. 101-111.
123. Birnboim H.C., Doly I. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. - V. 7. - P. 1515-1523.
124. Bliska J.B., Black D.S. Inhibition of the Fc receptor-mediated oxidative burst in macrophages by the Yersinia pseudotuberculosis tyrosine phosphatase // Infec. Immunity. 1995. - V. 63. -P. 681-685.
125. Bordet C., Bruneteau M., Michel G. Lipopolysaccharides d'une souche a virulence <xt~ tenuee de Yersinia pestis II Eur. J. Biochem. 1977. - V. 79. - P. 443-449.
126. Borrelli S, Altmann K, Jansson P. E, Lindberg A A // Binding specificity for four monoclonal antibodies recognizing terminal Gal alpha l~>4Gal residues in Haemophilus influenzae lipopolysaccharide. Microb Pathog. 1995. - Vol. 19. -N. 3. - P. 139-157.
127. Bowe F., O'Gara P., Maskell D. et al. Virulence, persistence and immunogenicity of Yersinia enterocolitica 0:8 aroA mutants // Infec. Immunity. 1989. - V. 57. - P. 3234-3236.
128. Brade H., Rietschel E.T., a-2->4-Interlinked 3-deoxy-D-ma««o-octulosonic acid disaccharide. A common constituent of enterobacterial lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem -1984.-V. 145.-231-236.
129. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantification of microgramm quantities of protein. Utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem 1976. - V. 72. -P. 248-254.
130. Bretscher P.A., Wei G., Menon J. et al. Establishment of stable, cell-mediated immunity that makes "susceptible" mice resistant to leushmania major // Science. 1992. - V. 257. - P. 539542.
131. Brubaker R.R. Factors promoting acute and chronic diseases caused by Yersiniae // Clin. Microbiol. Rev. -1991. V. 4. - P. 309-324.
132. Brubaker R.R. Growth of Pasteurella pseudotuberculosis in simulated intracellular and extracellular environment // J. Infec. Dis. 1968. - V. 117. - P. 293-302.
133. Brubaker R.R. Interleukin-10 and inhibition of innate imunity to Yersinia: roles ofYops and Lcr (V antigen) // Infect. Immun. 2003. - V. 71. - N. 7. - P. 3673-3681.
134. Brubaker R.R. Mutation rate to nonpigmentation in Pasteur ella pestis II J. Bacteriol. -1969. -V. 98. P. 1404-1406.
135. Brubaker R.R The Genus Yersinia: Biochemistry and Genetics of virulence // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1972. - V. 57. - P. 111-158.
136. Brubaker R.R. The V antigen of yersiniae: an overview // Contrib.Microbiol.ImmunoL -1991. -V. 12. P. 127-133.
137. Brubaker RR The Vwa virulence factor of yersinia: molecular basis of the attendant nutritional requirement for Ca2+ // Rev. Infec. Dis. 1983. - V. 5 (Suppl.). - P. S748-S758.
138. Brubaker R.R., Beesley E.D, Surgalla M.J. Pasteurella pestis: role of pesticin I and iron in experimental plague // Science. 1965. - V. 149. - P. 422-424.
139. Brubaker RR, Sample A.K., Yu D.Z. et al. Proteolysis of V antigen from Yersinia pestis II Microb. Pathog. 1987. - V. 2. - P. 49-62.
140. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis // Nature. 1957. - V. 179. - P. 12461247.
141. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis and immunogenicity to plaque // Ergeb. Mikrobiol. Immun Exp. Ther. 1963. - V. 37. - P. 59-113.
142. Burrows T.W., Bacon G.A. The effects of loss of different virulence determinants on the virulence and immunogenisity of strains of Pasteurella pestis // Brit. J. Exp. Pathol. 1958. - V. 39. -P. 278-291.
143. Burrows T.W., Bacon G.A V and W antigens in strains of Pasteurella pseudotuberculosis II Br. J. Exp. Pathol. 1960. - V. 41. - P. 38-44.
144. Burrows T.W., Bacon G.A., The basis of virulence in Pasteurella pestis: an antigen determining vitulence // Br. J. Exp. Pathol. 1956. - V. 37. - P. 481-493.
145. Butler G., de Graof P., Vandewijk J. Plague in Madagascar // Lancet. 1994. - V. 343.- P. 536.
146. Carniel E. Evolution of Pathogenic Yersinia, some dark in the light // Proc. 8th Int. Symp. On Yersinia. Sept. 4-8. 2002. - P. 15.
147. Camiel E. World situation of Yersinia pestis infections I I Medicine et Maladies-Infectieuses. 1995. V. 25. P. 675-679.
148. Caron E., Peyrard T., Kohler S. et al. Live Brucella spp. fail to induce tumor necrosis factor alpha excretion upon infection of U937-derived phagocytes // Infect.Immun. 1994. - V. 62.- P. 5367-5274.
149. Carter P.B., Zachorchak R.J., Brubaker R.R. Plague virulence antigens from Yersinia enterocolitica II Infec. Immunity. 1980. - V. 28. - P. 638-640.
150. Carty S.M., Sreekumar K.R., Raetz RH. Effect of cold shock on lipid A biosynthesis in Escherichia coli. Induction at 12 °C of an acyltransferase specific for palmitoleoyl-acyl carrier protein// J. Biol. Chem 1999. V. 274. - P. 9677-9685.
151. Cavanaugh DC., Randall R The role of multiplication of Pasteurella pestis in mononuclear phagocytes in the pathogenesis of fleaborne plague // J. Immunol. 1959. - V. 83. - P. 348-371.
152. Chakrabarty T.A, Chandra H.S., Seshu-Kumar G. et al., Human plague India // Weekly Epidemiological Record. 1994. - V. 43. - P. 722-723.
153. Chapman D., Chernovskaya Т., Zav'alov V. et al. Structural and functional analyses of the periplasmic chaperone involved in assembly of the Yersinia pestis Fl capsule // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - Sil. - P. S68.
154. Charles I., Doug an G. Gene expression and development of live enteric vaccines // Trends Biotechn. -1990. -V. 8. P. 117-121.
155. Charnetzky W.T., Shuford W.W. Survival and growth of Yersinia pestis within macrophages and on effect of the loss of the 47-megadalton plasmid on growth in macrophages // J. Infect. Immun. 1985. - V. 47. - P. 234-241.
156. Chatfield S.N., Strugnell RA, Dougan G. Live Salmonella as vaccines and carriers of foreign antigenic determinants // Vaccine. 1989. - V. 7. - P. 495-498.
157. Chen C.H., Johnson C., Kasai N. et al. Heterogeneity and biological activity of en-dotoxic glycolipid from Salmonella minnesota R 595 // J. Infec. Dis. 1973. - V. 128S. - P. 43-51.
158. Cherepanov P.A, Rosqvist R., Forsberg A Regulation of pH6 expression in Yersinia pestis И Ibid. P. S8. - (O-IO).
159. Cohen S.N., Chang AC.Y. Recircularization and autonomous replication of a sheared R-factor DNA segment in Escherichia coli transformants // Proc. Natl. Acad. Sei 1973. - V. 70. -P. 1293-1295.
160. Cooper NR., Morrison D.C. Binding and activation of the first component of human complement by the lipid A region of lipopolisaccharide // 1980. -V. 120. P 1892-1868.
161. Cornelis G.R. Molecular and cell biology aspects of plague // Proc. Natl. Acad. Sei. 2000. -V. 97. P. 8778-8783.
162. Cornelis G.R The Yersinia deadly kiss // J. Bacterid. 1998. - V. 180. - P. 5495-5504.
163. Cornelis G.R. Yersinia pathogenicity factors // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994. -V. 192. - P. 245-263.
164. Cornelis G.R, Boland A, Boyd AP. etal. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1998. V. 62. - P. 1315-1352.
165. Cornelis G.R, Wolf-Watz H. The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting eukaryotic cells // Mol. Microbiol. 1997. - V. 23. - P. 861-867.
166. Cryz S.J. Jr. Live attenuated bacterial vaccine vector systems // Vaccine. 1996. - V. 14. - P. 676-680.
167. Curtiss R, Kelly S.M. Salmonella typhimurium deletion mutants lacking adenylate cyclase and cyclase receptor protein are avirulent and immunogenic // Infect. Immun. 1987. -V. 55. -P. 3035-3043.
168. Cuitiss R, Kelly S.M., Gulig P.A etal. Selective delivery of antigens by recombinant bacteria// Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 1989. V. 146. - P. 35-54.
169. Dalla VeneziaN., Minka S., Bruneteau M. etal. Lipopolysaccharides from Yersinia pes-tis. Studies on lipid A of lipopolysaccharides I and II // Eur. J. Biochem 1985. - V. 151. - P. 399404.
170. Davies K.J.D., Fritz D.L., Pitt M.L. etal. Pathology of experimental pneumonic plague produced by FI-positive and FI-negative Yersinia pestis in African green monkeys (Cercopithecus aethiops) II Arch. Pathol. Lab. Med. 1996. - V. 120. - P. 156- 163.
171. Demerec M., Adelberg E.A, Clark A J. et al. A proposal for a uniform nomenclature in bacterial genetics // Genetics. 1966. - V. 54. - P. 61-79.
172. Demuth A, Goebil W., Beuscher H.U., Kuhn M. Differential regulation of cytokine and cytokine receptor mRNA expression upon infection of bone marrow-derived macrophages with Listeria monocytogenes II Infect.Immun. 1996. - V. 64. - P. 3475-3483.
173. Dennis D.T., Hughes J.M. Multidrug resistance in plague // N. Engl. J. Med. 1997. -V. 337. - P. 702-704.
174. Descoteaux A, Matlashewski G. c-fos and tumor necrosis factor gene expression in Leishmania donovani-mfected macrophages //Moll Cell. Biol. 1989. - V. 9. - P. 5223-5227.
175. Devignat R. Variétés de l'espèce Pasteurella pestis. Nouvelle hyphothèse II Bull. OMS. -1951.-V. 4. P. 247-263.
176. Dimopoulos G. // Insect immunity and its implication in mosquito-malaria interactions. Cell Microbiol. 2003. - Vol. 5. -N. 1. - P. 3-14.
177. Dorman C. J., Chatfield S.M., Higgins C.H., Hayward C., Dougan G. Characterization of porin and ompR mutants of avirulent strain of Salmonella typhimurium-. omp mutants are attenuated in vivo II Infect. Immun. 1989. - V. 57. - P. 2136-2140.
178. Dougan G. The molecular basis for the virulence of bacterial pathogens: implications for oral vaccine development // Microbiology. 1994. - V. 140. - P. 215-224.
179. Dougan G., Maskell D., O'Callaghan D. et al. Oral vaccination // Anton. Leeuwenhoek Int. J. Gen. M. 1988. - V. 54. - P. 447-451.
180. Drozdov I.G., Anisimov AP., Samoilova S.V. et al. Virulent non-capsulated Yersinia pestis variants constructed by insertion mutagenesis // J. Med. Microbiol. 1995. - V. 42. - P. 264268.
181. Du Y., Cherepanov P., Forsberg A Murine toxin of Yersinia pestis shows phospholipase D activity. Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - Sil. - P. S.9. - (O-15).
182. Ehrenkranz N.J., Meyer K.F. Studies on immunization against plague. VIII. Study of three immunizing preparations in protecting primates against pneumonic plague // J. Infec. Dis. -1955.-V. 96.-P. 138-144.
183. Evans, T.J. Bioassay for tumor necrosis factors-a and -b II Mol. BiotechnoL 2000 -V. 15. P. 243-248.
184. Feodorova V.A, Devdariani Z.L. Characterization of Yersinia pestis lipopolisacharide using monoclonal antibodies // //8th International Symposium on Yersinia (September 4-8, 2002, Turku, Finland). Turku. - 2002. - P. 67.
185. Feodorova V.A., Devdariani Z.L. Exresion of acid-stable proteins and modified lipopo-lisaccharide of Yersinia pestis in acidic growth medium // J. Med. Microbiol. 2001. Vol. 50. -P. 979-985.
186. Fields A.K., Straley S.C. Intracellular delivery of Yersinia pestis V antigen // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SIL - P. S6. - (0-5).
187. Fine R.M. Complement system activation by contrast media. // Int J Dermatol. 1977. -Vol. 10.-P. 830.
188. Forsberg A., Rosquist R., Wolf-Watz H. Regulation and polarized transfer of the Yersinia outer membrane proteins (Yops) involved in antiphagocytosis // Trends Microbiol. 1994. -V. 2-P. 14-19.
189. Friedlander AM., Welkos S.L., WorshamP.L. et al. Relationship between virulence and immunity as revealed in recent studies of the Fl capsule of Yersinia pestis II Clin. Infec. Dis. 1995. - V. 21 (Suppl. 2). - P. S178-S181.
190. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. A new method for the extraction of the R-lipopolysaccharide // J. Biochem 1971. -V. 19. - P. 143-152.
191. Galanos C., Rietschel E.T., Luderitz O. et al. Biological activity of lipid A complexed with bovin-serum albumin // Eur. J. Biochem 1972. - V. 31. - P. 230-233.
192. Galimand M., Guiyoule A, Gerbaud G. et al. Multiple antibiotic resistance in Yersinia pestis mediated by a self-transferable plasmid // N. Engl. J. Med. 1997. - V. 337. - P. 677-680.
193. Galyov E.E., Hakannson S., Wolf-Watz H. Characterization of the operon encoding the Ypk Ser/Thr protein kinase and the YopJ protein of Yersinia pseudotuberculosis II J. Bacterid. -1994. . y. 176. P. 4543-4548.
194. Galyov E.E., Smirnov O.Yu., Karlishev AV. et al. Nucleotide sequence of the Yersinia pestis gene encoding Fl antigen and the primary structure of the protein. Putative T and B cell epitopes // FEBS Lett. 1990. - V. 227. - P.230-232.
195. Garcia E. Investigation of the evolutionary relationship between Yersinia-pseudotuberculosis and Yersinia pestis through whole-genome comparative sequencing // Proc. 8th Int. Symp. On Yersinia Sept. 4-8. 2002. - P. 16.
196. Gieni RS., Yang X., Hayglass T. Allergen-specific modulation of cytokine synthesis patterns and IgE responses in vivo with chemically modified allergen // J. Immunol. 1993. - V. 150. -P. 302-310.
197. Girard G. L'immunité dans l'infection pesteuse // Biologie Medicale. 1963. - V. 52. -P. 403-703.
198. Golding B., Scott D.E. Vaccine strategies: targeting helper T cell responses // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1995,-V. 754. - P. 126-137.
199. Greisman S.E., Young E.J., Du Buy B. Mechanisms of endotoxic tolerance // J. Immunol. 1973. - V. 111. - P. 1349-1360.
200. Gremyakova T. A, Modulation of the protective properties of plague vaccine preparations by monophosphoryl lipid A // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. -1998.-V. 6. SIL - S. 36.
201. Gremyakova T. A, Shaihutdinova R. A Antigenic shift of Yersiniapestis lipopolysaccharides expressed at various cell growth temperature // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SIL - S. 17.
202. Gremyakova T. A, Stepanshina V. N., Anisimov A P., Potapov V. N. Characterization of native and modified pH6 antigen of Yersinia pestis // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SIL - S. 19.
203. Griffin K.F., Hill J., Murray K. etal. Protective efficacies of the V antigen variants in Yersinia //Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SII. - P. S35.
204. Gustafson G.L., Rhodes M.J. A rationale for the prophylactic use of monophosphoryl lipid A in septic schock // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. - V. 182. - P. 269-275.
205. Hanski C., Naumann M., Grutzkau A et al. Humoral and cellular defense against intestinal murine infection with Yersinia enterocolitica II Infec. Immunity. 1991. - V. 59. - P. 11061111.
206. Harding C.V., Collins D., Unanue E.R. Processing of liposome-encapsulated antigens targeted to specific subcellular compartments // Res. Immunol. 1992. - V. 143. - P. 188-191.
207. Hartley J.L., Adams G.A., Tornabene T.G. Chemical and physical properties of lipopoly-saccharide of Yersinia pestis //J. Bacterid. 1974. -V. 118. -N. 3. - P. 848-854.
208. Heath D.G., Anderson G.W. Jr., Mauro J.M et al Protection against experimental bubonic and pneumonic plague by a recombinant capsular Fl-V antigen fusion protein vaccine // Vaccine. 1998. V. 16. - P. 1131-1137.
209. Hein J., Bohn E., Kempf V. et al. Crucial role of Thl cytokines for protection against Yersinia enter ocolitica II Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SII. -P. S10. - (0-21).
210. Hill J., Leary S.E.C., Griffin K.F., Williamson E.D., Titball R.W. Immunogenicity of V-antigen fragments of Yersinia pestis II Abstracts of the 96th General Meeting of the American Society of Microbiology. New Orlean, LA ASM, 1996. P. 195. - (B-222).
211. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // J Bacterid. 1983. - V. 154. - P. 269-277.
212. Hoiseth S.K., Stocker B.AD. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are nonvirulent and effective as live vaccines // Nature. 1981. - V. 291. - P. 238-239.
213. Holmgren A, Branden C.-I. Crystal structure of chaperone protein PapD reveals an immunoglobulin fold//Nature.- 1989. V. 342. - P. 248-251.
214. Holmstrom A, Petterson J., Hill J. et al. LcrV of Yersinia pseudotuberculosis is required for Yop expression and cytotoxicity of infected eucariotic cells // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SII. - P. S6. - (0-4).
215. Homma J.Y., Matsuura M., Kumazawa Y. Studies on lipid A the active center of endotoxin structure-activity relationship // Drugs Future. 1989. - V. 14. - P. 645-665.
216. Janeway C.A., Bottomley K Signals and signs for lymphocyte responses // Cell. 1994. - V. 76. - P. 275-285.
217. Janssen W.A., Lawton W.D., Fukui G.M. etal. The pathogenesis of plague. I. A study of the correlation between virulence and relative phagocytosis resistance of some strains of Pas-teurella pestis II J. Infect. Dis. 1963. - V. 113. - P. 139-143.
218. Johns M.A, Bruins S.C., McCabe W.R. Immunization with R mutants of Salmonella minnesota. II. Serological response to lipid A and thr lipopolysacchrides of Re-mutants // Inf. Immun. 1977.-V. 17. -P 9-15.
219. Johnson AG., Tomai M., Solem L. etal. Characterization of a nontoxic monophos-phoiyl lipid A // Rev. Infec. Dis. 1987. V. 9S.- P. S512-S516.
220. Johnson K.J., Charles I.G., Miller I.A., Pickard D., O'Goara P., Costa G., All T., Hor-maeche C.E. The role of a stress-response protein in Salmonella typhimurium virulence // Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. - P. 401-407.
221. Kaca W, Literacka E, Sjoholm AG, Weintraub A Complement activation by Proteus mirabilis negatively charged lipopolysaccharides // J Endotoxin Res. 2000;6(3):223-34.
222. Kagan B.L., Selsted M.E., Ganz T. etal. Antimicrobial defensin peptides form voltage-dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes // Proc. Nat. Acad. Sei. USA -1990. -V. 87. P. 210-214.
223. Karamian N.A, Waters P.F. Novel colorimetric method for determination of lipopolysaccharides // J. Pharm Sei. 1977. - V. 66. - P. 723-724.
224. Karlyshev A., Galyov E., Smirnov O. et al. Structure and regulation of a gene cluster involved in capsule formation of Y. pestis II Biological membranes: structure, biogenesis and dynamics.
225. NATO ASI Series. Series H: Cell Biology, V. 82 / Jos A.F. Op den Kamp (ed.). Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1994. - P. 321-330.
226. Karlyshev A.V., Galyov E.E., Abramov V.M. et al. CaflR gene and its role in the regulation of capsule formation of Yersinia pestis // FEBS Lett. 1992. - V. 305. - P. 37-40.
227. Karlyshev AV., Galyov E.E., Smirnov O.Yu. et al. A new gene of the fl operon of Yersinia pestis involved in the capsule biogenesis // FEBS Lett. 1992. - V. 297. - P. 77-80.
228. Kawahara K., Tsukano H., Watanabe H., Lindler B., et al. Modification of the structure and activity of Lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature // Infect. Immun.- 2002. V. 70. - N. 8. - P. 4092-4098.
229. Kienle Z., Emody L., Svanborg C. et al. Adhesive properties conferred by the plasminogen activator of Yersinia pestis // J. Gea MicrobioL 1992. - V. 138. - P. 1679-1687.
230. Kopp E., Medzhitov R A plague on host defense // J. Exp. Med. http://www.iem.org/cgi/doi/1084/iem.20021311.
231. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.
232. Lahteenmaki K., Virkola R., Saren A et al. Expression of plasminogen activator Pia of Yersinia pestis enhances bacterial attachment to the mammalian extracellular matrix // Infect. Immun.- 1998. -V. 66. P. 5755-5762.
233. Lawton W.D., Erdman RL., Surgalla M. J. Biosynthesis and purification of V and W antigen in Pasteurella pestis II J. Immunol. 1963. -V. 91. - P. 179-184.
234. Lawton W.D., Fukui G.M., Surgalla M.J. Studies on the antigens of Pasteurella pestis and Pasteurella pseudotuberculosis H J. Immunol. 1960. - V. 84,- P. 475-479.
235. Leary S.E.C., Williamson E.D., Griffin K.F. et al. Active immunization with recombinant V antigen from Yersinia pestis protects mice against plague // Infect. Immun. 1995. - V. 63. -P. 2854-2858.
236. Leung K.Y., Straley S.C. The YopM gene of Yersinia pestis encodes a released protein having homology with the human platelet surface protein GBPIba// J. Bacterid. 1989. - V. 174. -P. 4623-4632.
237. Lian C.J., Hwang W.S., Pai C.H. Plasmid-mediated resistance to phagocytosis in Yersinia enterocolitica // Infec. Immunity. 1987. - V. 55. - P. 1176-1183.
238. Lindler L.E., Klempner M.S., Straley S.C. Yersinia pestis pH 6 antigen: genetic, biochemical, and virulence characterization of a protein involved in the pathogenesis of bubonic plague // Infec. Immunity. 1990. - V. 58. - P. 2569-2577.
239. Lindler L.E., Tall B.D. Yersinia pestis pH 6 antigen forms fimbriae and is induced by intracellular association with macrophages// Mol. Microbiol. 1993. -V. 8. - P. 311-324.
240. Liu Y, Yao X. Ensemble learning via negative correlation // Neural Netw. 1999. -Vol. 12. -N. 10. P. 1399-1404.
241. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem 1951. - V. 193. - P. 265-270.
242. Luderitz O., Galanos C., Rieschel E.T., et al. Lipid A: relationship of chemical structure and biological activity // In: Friedman H., Szentivanyi A, Nowotny A. eds. Immunobiology of endotoxins. NY: plenum Publishing. 1986. - P. 65-74.
243. Lundberg S., Cherepanov P., Forsberg A et al. Characterisation of membrane receptors for Yersinia pestis pH6 antigen // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. -V. 6. - SIL - P. S20. - (P-20).
244. Lurie R La peste Humaine en 1992 // Weekly Epidemiological Record. 1994. - V. 69. -N. 2. - P. 8-9.
245. Mackett M., Yilma T., Rose J.K. et al. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle // Science. 1985. - V. 227. - P. 433-435.
246. Makoveichuk E., Cherepanov P., Forsberg A, et al. Lipid-mediated interaction of Y.pestis pH6 antigen with plasma lipoprotein and macrophages in vitro II Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SII. - P. S22. - (P-22).
247. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y., Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
248. Mannel D.N., Northoff H., Bauss F. etal. Tumor necrosis factor: a cytokine involved in toxic effects of endotoxin // Rev. Infec. Dis. 1987. - V. 7. - P. S603-S606.
249. Marshall J.D., Bartelloni P.J., Cavanaugh D.C. et al. Plague immunization. II. Relation of adverse clinical reactions to multiply immunizations with killed vaccines // J. Infec. Dis. 1974. -V. 129 (SuppL). - P. S19-S25.
250. Menigh RJ., Brubaker RR. Major stable peptides of Yersinia pestis synthesized during the low-calcium response// Infec. Immunol. 1993. -V. 61. - P. 13-22.
251. Meyer K.F. Effectiveness of live or killed plague vaccines in man // Bull. WHO. 1970. -V. 42. - P. 653-666.
252. Meyer K.F. Newer aspects on the pathology of plague observed in susceptible nonhuman primates // Abstracts of the VIII Int. Congress on tropical medicine and malaria. Teheran. Iran. 1968. - P. 523-524.
253. Meyer K.F., Cavanaugh D.C., Bartelloni P.J. et al. Plague immunization. I. Past and present trends // J. Infect. Dis. 1974. - V. 129. - P. S13-S17.
254. Meyer K.F., Foster L.E. Measurement of protective serum antibodies in human volunteers inoculated with plague prophylactics // Stanford. Med. Bull. 1948. - V. 6. - P. 75-79.
255. Meyer K.F., Hightower J.A, McCrumb F.R, Plague immunization. VI. Vaccination with the fraction I antigen of Yersinia pestis // J. Infect. Dis. 1974. - V. 129. - P. S41-S45.
256. Meyer K.F., Smith G., Foster L., Brookman M., Sung M. Live attenuated Yersinia pestis vaccine: virulent in nonhuman primates, harmless to guinea pigs // J. Infect. Dis. 1974a. - V. 129. -P. S85-S120.
257. Miller S.I., Kukral A. M., Mekalanos J. J. A two-component regulatory system (phoP phoQ) controls Salmonella typhimurium virulence // Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1989. - V. 86. -P. 5054-5058.
258. Miller S.I., Loomis W.P., Alpuehe-Aranda C. et al. The phoP virulence regulon and live oral Salmonella vaccines II Vaccine. 1993. - V. 11. - P. 122-125.
259. Minka S, Bruneteau M. Isolation and chemical characterization of type R lipopolysaccharides of a hypovirulent strain of Yersinia pestisH Can J. Microbiol. 1998. Vol. 44. -N. 5. - P. 477-481.
260. Mishankin M., Vasileva G., Kozlowsky V. et al. The computer analyses of amino acid sequence of Yersinia pestis "murine" toxin // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. -1998. V. 6. - SII. - P. S19. - (P-15).
261. Mishell B.B., Shiigi S.M. Selected methods in cellular immunology. W.H.Freeman and Company. - San Francisco. - 1980.
262. Montie. T.C. Properties and pharmacological action of plague murine toxin // Pharmacol. Ther. 1981. -V. 12. - P. 491-499.
263. Morrison D.C., Betz S.J., Jacobs D.M. Isolation of a lipid A-bound polypeptide responsible for "LPS-initiated" mitogenesis of C3H/HeJ spleen cells // J. Exp. Med. 1976. - V. 144. -P. 840-846.
264. Morrison D.C., Kline L.F. Activation of the classical and properdin pathways of complement by bacterial LPS//J. Immunol. 1977. -V 118. P 362-368.
265. Motin V.L., Nakajama R, Smirnov G.B. et al. Passive immunity to yersinia mediated by anti-recombinant V antigen and protein A-V fusion peptide // Infec. Immunity. 1994. - V. 62. -P. 4192-4201.
266. Motin V.L., Nedialkov Y.A., Brubaker RR V antigen-polyhistidine fusion peptide: binding to LcrH and active immunity against plague // Infect. Immun 1996. - V. 64. - P. 43134318.
267. Mulder B.T., Michiels T., Simonet M. etal. Identification of additional virulence determinants on the pYV plasmid of Yersinia enterocolitica W227 // Infec. Immunity. 1989. - V. 57. -P. 2534-2541.
268. Müller K, Burdack S., Rollinghoff M., Beuscher H.U. Recombinant YopB blocks TNF-a production through binding to murine macrophages // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SIL - P. S25.
269. Nakajima R, Brubaker RR Association between virulence of Yersinia pestis and suppression of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha // Infec. Immunity. 1993. - V. 61. -P. 23-31.
270. Nakajima R., Motin V.L., Brubaker RR Suppression of cytokines by protein A-V antigen fusion peptide and restoration of synthesis by active immunization // Infec. Immunity. 1995. -V. 63. - P. 3021-3029.
271. Nakajima R, Motin V.L., Brubaker RR. Active immunity to Yersiniae and inhibition of cytokine synthesis in vivo mediated by a protein A-V antigen fusion peptide // 6th International symposium on Yersinia. September 26-28. Rome. Italy. 1994. P. 39.
272. Nedyalkov Y.A., V.L., Brubaker R.R. Resistance to LPS mediated by the Yersinia pestis V antigen-polyhystidine fusion peptide:mplification of interleukine-10 // Infec. Immunity. 1997. -V. 65.-P. 1196-1203.
273. Noll A., Bucheler N., Autenrieth I.B. Immunity against Yersinia enterocolitica by vaccination with Yersinia-HSP-60 // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. -V. 6.-SII.-P. Sil.-(0-23).
274. Novik R, Clowes R, Cohen S. etal. Uniform nomenclature for bacterial plasmids: a proposal// Bacteriol. Rev. 1976. - V. 40. - P. 168-189.
275. Ong G. L, Baker A E, Mattes M. J. Analysis of high complement levels in Mus hortulanus and BUB mice// J. Immunol Methods. 1992. - V. 154. - P. 37-45.
276. Panda S.K., Nanda S.K., Ghosh A. et al. Human plague-India // Weekly Epidemiological Record. 1994. V. 43. - N. 1. - P. 689-691.
277. Paul W.E., Seder R.A Lymphocyte response and cytokines // Cell. 1994. - V. 76. -P. 241-251.
278. Perry M.B., Vinogradov E., Conlan J.W. LPS in conjugate vaccines // IV International on Tularemia. (September 15-18, 2003, Bath. UK). Bath. - 2003.
279. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague // Clin. Microbiol. Rev. - 1997. - V. 10. - P. 35-66.
280. Perry KD., Haddix P., Atkins E.B. etal. Regulation of expression of V antigen and outer membrane proteins in Yersinia pestis II Contrib. Microbiol. Immunol. 1987. - V. 9. - P. 173178.
281. Perry R.D., Harmon P.A, Bowmer W.S. et al. A low-Ca2+ response operon encodes the V antigen of Yersinia pestis II Infec. Immunity. 1986. - V. 54. - P. 428-434.
282. Phillips A.P., Morris B.C., Hall D. etal. Identification of encapsulated and non-encapsulated Yersinia pestis by immunofluorescence tests using polyclonal and monoclonal antibodies // Epidemiol. Infect. 1988. - V. 101. - P. 59-73.
283. Pierson V., Worsham P., Strachan S.D. FI-negative variants of Y.pestis C092 II Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SIL - P. S9. (0-17).
284. Pitt M.L., Estep J.E., Welkos S.L. et al. Efficacy of killed whole-cell vaccine against a lethal aerosol challenge of plague in rodents I I Abstracts of the 94 th General Meeting of the American
285. Society for Microbiology 1994. Washington, D.C.: ASM, 1994. P. 151. (E-45).1 1
286. Playfair J.H., DeSouza I.B. Recombinant gamma interferon is a potent adjuvant for a malaria vaccine in mice // Clin. Exp. Immunol. 1987. - V. 67. - P. 5-10.
287. Porat R, McCabe W.R., Brubaker R.R. Lipopolysaccharide-associated resistance to killing of Yersinia by complement I I J. Endotoxin. Res. 1995. - V. 2. - P. 91-97.I
288. Portnoy D.A, Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and
289. Yersinia pestis II J. BacterioL 1981. - V. 148. - P. 877-8931
290. Portnoy D.A, Martiner R.J. Role of a plasmid in the pathogenicity of Yersinia species //
291. Curr. Top. Microbiol Immunol. 1985. -V. 118. P. 29-51.i
292. Price S.B., Cowan C., Perry R.D. etal. The V antigen is a regulator protein necessary for the Ca2+-dependent growth and the maximal expression of low Ca2+- response virulence genes in
293. Yersinia pestis II J. Bacterid. 1991. - V. 173. - P. 2649-2657. /i 1
294. Price S.B., Leung K.Y., Barve S.S. etal. Molecular analysis of IcrGVH, the V antigen operon of Yersinia pestis II J. Bacterid. 1989. - V. 171. - P. 5646-5653.
295. Prior J.L, Parkhill J, Hitchen P.G, Mungall K.L, Stevens K, Morris H.R, Reason A.J,l i
296. Prior J.L, Titball R.W. Monoclonal antibodies against Yersinia pestis lipopolyaccharide detect bacteria cultured at 28 °C or 37 °C// Molecular and Cellular Probes. 2002. - V. 16. -P. 251-256.
297. Pullen J.K., Anderson G.W. Jr., Welkos S.L. et al. Analysis of Yersinia pestis V protein for the presence of linear antibody epitopes // Infec. Immunity. 1998. - V. 66. - P. 521-527.
298. Ravindranaugh M.H., Brazeau S.M., Morton D.L. Efficacy of tumor cell vaccine after incorporating monophosphoryl lipid A (MPL) in tumor cell membranes containing tumor-associated gangliosides // Experientia. 1994. - V. 50. - P. 648-653.
299. Reisner B.S., Straley S.C. Yersinia pestis YopM: thrombin binding and overexpression// Infec. Immunity. -1992. V. 60. - P. 5242-5252.
300. Rietschel E.T., Brade L., Branderburg K. etal., Chemical structure and biological activity of bacterial and synthetic lipid A// Rev. Infect Dis. 1987. V. 9 (Suppl.5). - P. 527-536.
301. Robbins J.B., Schneerson R Polysacharide-Protein Conjugates: A new Generation of Vaccines // J. Infec. Dis. 1990. - V. 161. - P. 821-832.
302. Rodrigues C.G., Carneiro C.M., Barbosa C.T. etal. Antigen FI from Yersinia pestis forms aqueous channels in lipid bilayer membranes // Braz. J. Med. Biol. Res. 1992. - V. 25. -P. 75-79.
303. Roggenkamp A, Geiger AM., Leitrritz L. etal. Passive immunity to infection with Yersinia spp. mediated by anti-recombinant V antigen is dependent on polymorphism of V antigen // Infec. Immunity. 1997. - V. 65. - P. 446-451.
304. Roggenkamp A, Leitritz L., Sing A etal. Anti-recombinant V antigen serum promotes uptake of Yersinia enterocolitica serotype 08 by macrophages // Med. Microbiol. Immunol. (Berl). 1999-V. 188.-P. 151-159.
305. Rosquist R, Magnusson K.-E. Wolf-Watz H. Target cell contact triggers expression and polarized transfer of Yersinia YopE cytotoxin into mammalian cells // EMBO. J. 1994. - V. 13. -P. 964-972.
306. Rosqvist R, Forsberg A, Wolf-Watz H. The cytotoxic protein YopE of Yersinia obstructs the primary host defence // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - P. 657-667.
307. Rudolph AE., Stuckey J.A, Zhoa Yi etal. Expression, characterization, and mutagenesis of the Yersinia pestis murine toxin, a phospholipase D superfamily member // J. Biol. Chem. -1999. -V. 274. P. 11824-11831.
308. Samoilova S.V., Samoilova L.V., Yezhov I.N. etal. Virulence of pPst+ and pPstf strains of Yersinia pestis for guinea-pigs // J. Med. MicrobioL 1996. - V. 45. - P. 440-444.
309. Sarmento A.M., Appelberg R Relatioship between virulence of Mycobacterium avium strains and induction of tumor necrosis factor alpha production in infected mice and in vtro cultured mouse macrophages // Infect. Immun. 1995. -V. 63. - P. 3759-3764.
310. Sato K., Nakajama R, Hara F. et al. Preparation of monoclonal antibody to V antigen from Yersinia pestis II Contrib. MicrobioL Immunol. 1991. - V. 12. - P. 225-229.
311. Schmidt G., Jann B., Jann K. Immunochemistry of Rlipopolysaccharides of Escherichia coli. Studies on R mutants with an incomplete core, derived from£ coli 08:K27 // Eur. J. Biochem 1970.-V. 16.-P. 382-392.
312. Schutze H. Studies in Bacterium pestis antigens. I. The antigens and immunity reactions of B. pestis II Br. J. Exp. Pathol. 1932. - V. 13. - P. 284-288.
313. Schutze H. Studies on Bacterium pestis antigens. III. The prophylactic value of the envelope and somatic antigens of B. pestis II Br. J. Exp. Pathol. 1939. - V. 19. - P. 293-298.
314. Selkirk M.E. Ability of delivery systems to influence TH-l/TH-2 type responses and MHC class 1/class II antigen presentation // Vaccine. 1996. - V. 14. - N. 7. - P. 668-671.
315. Shaikhutdinova RZ., Gremyakova T.A, Zhilenkov E.L., Dentovskaya S.V., Anisimov A.P. Phage-susceptibility testing and LPS-electrophoretic mobility analysis of different
316. Yersinia pestis "subspecies"/^* International Symposium on Yersinia (September 4-8, 2002, Turku, Finland). Turku. - 2002. - P. 71.
317. Simonet M., Richard S., Berche P. Electron microscopic evidence for in vivo extracellular localization of Yersinia pseudotuberculosis harboring the pYV plasmid // Infect. Immun. 1990. - V. 58. - P. 841-845.
318. Simpson W.J., Thomas R.E., Schwan T.G. Recombinant capsular antigen (fractionl) from Yersinia pestis induces a protective antibody response in BALB/C mice // Am J. Trop. Med. Hyg. 1990. - V. 43. - P. 380-396.
319. Sing A., Rost D., Tvardovskaya N., et al., Yersinia V-antigen exploits toll-like receptor-2 and CD14 for interleukin 10-mediated imunosuppression// J. Exp. Med. 2002. - V. 196. -P. 1017-1024.
320. Skrzypek E., Straley S.C. Differential effects of deletions in lcrV on secretion of V antigen, regulation of the low-Ca2+ response, and virulence of Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1995. -V. 177. - P. 2530-2542.
321. Skurnik M., Bolin I., Heikkenen H. et al. Virulence plasmid associated autoagglutination in Yersinia species // J. BacterioL 1984. - V. 158. - P. 1033-1036.
322. Smith H., Packam L.P. A filtered non-toxic plague vaccine which protects guinea pigs and mice// Brit. J. Exp. Pathol. 1966. - V. 47. - P. 25-34.
323. Smith P.N. Pneumonic plague in mice: modification of the infection by antibody against specific components of Pasteurella pestis H J. Infec. Dis. -1959. V. 104. - P. 85-91.
324. Snider D.P., Segal D.M. Targeted antigen presentation using crosslinked antibody heteroaggregates // J. Immunol. 1987. - V. 139. - P. 1609-1616.
325. Sodeinde O.A, Subrahmanyam Y.V., Stark K. et al. A surface protease and the invasive character of plague// Science. 1992. - V. 258. - P. 1004-1007.
326. Straley S.C. Adhesins in Yersinia pestis II Trends. Microbiol. 1993. - V. 1. - P. 285286.
327. Straley S.C., Bowmer W.S. Virulence genes regulated at the transcriptional level of Ca2+ in Yersinia pestis include structural genes for outer membrane proteins // Infec. Immunity. 1986. -V. 51. - P. 445-454.
328. Straley S.C., Cibill M.L. Differential clearance and host-pathogen interaction of YopE-and YopKTYopLf Yersinia pestis in DALB/c mice // Infec. Immunity. 1989. - V. 57. - P. 12001210.
329. Straley S.C., Skrzypek E., Piano G.V. etal. Yops of Yersinia spp. pathogenic for humans //Infec. Immunity. 1993. - V. 61. - P. 3105-3110.
330. Surgalla M.J. Properties of virulent and avirulent strains of Pasteurella pestis II Ann. N.Y. Acad. Sei. 1960. - V. 88. - P. 1136-1145.
331. Surgalla M.J., Beesley E.D. Congo red agar plating medium for detecting pigmentation in Pasteurella pestis H App. MicrobioL 1969. -V. 18. - P. 834-837.
332. Swierzko A, Brade L., Paulsen H., et al. Specificity of rabbit antisera against the rough lipopolisaccharide of Salmonella minnesota R4 (Chemotype Rd2P") I I Infect. Immun. 1993 - V. 61. -N. 8.-P. 3216-3221.
333. Takada H., Kotani S. Structure-function relationships of lipid A // In: Morrison D.C., Ryan J.L.,(ed). Bacterial endotoxic Iipopolysaccharides. Molecular biochemistry and cellular biology. CRC Press, Boca Raton, Fla. - 1992. -V. 1. - P. 107-134.
334. Tang D.C., Devit M., Johnston S.A. Genetic immunization in a simple method for eliciting an immune response//Nature. 1992. - V. 139. - P. 1609-1616.
335. Tihomirova E.I., Tihomirova L.A., Gerasimova K.I. Antiplague vaccination: effect on functional state of human immune system // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. -1998. V. 6. - Sil. - P. S 4. - (P-85).
336. Tsai C.M., Frash C.F. A sensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in Polyacrylamide gels // Anal. Biochem 1982 472.Une T„ Brubaker RR. Ro,-V. 119. P. 115-119,1es of V antigen in promoting virulence and immunity in
337. Yersinia II J. Immunol. 1984. - V. 133J-P. 2226-2230.
338. Une T., Nakajima R., Brubaker R.R. Roles of V antigen in promoting virulence in Yersinia II Contrib. Microbiol. Immunol. 1986. - V. 9. - P. 179-185.I
339. VidyaevaN.A., Gaeva AY., Protsenko O.A., Kutirev V.V. Comparative electrophoretic analysis of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis five subspecies and Yersinia pseudotuberculosis II Proc. 8th Int. Symp. On Yersinia Sept. 4-8. 2002. - P. 72.
340. Vinogradov E.V., Knirel Y.A, Thomas-Oates J.E. et al. The structure of the cyclic enterobacterial common antigen (ECA) from Yersinia pestis // Carbohydr. Res. 1994. - V. 20. -P. 223-232. |
341. Vodopyanov S.O., Oleinikov I.P., Romanova L.V., Mishankin B.N. Yersinia pestis Gro EL-protein immunization does not protect mice against experimental plague // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SIL - P. S85. - (P-85).
342. Vogel F.R. Immunologic adjuvants for modern vaccine formulations // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1995. - V. 754. - P. 153-161.
343. Vorontsov E.D., Dubichev AG., Serdobintsev L.N. et al. Association-dissociation processes and supermolecular organization of the capsule antigen (protein 1) of Yersinia pestis 11 Bio-med. Sei. 1990. -V. 1. - P. 391-396.
344. Walf-Watz H. Interaction between Yersinia and its target cell // Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SII. - P. S4 - (K-l).
345. Warren H.S., Chedid L.A Strategies for treatment of endotoxemia: significance of the acute-phase response // Rev. Infec. Dis. 1987. -V.l.- P. S630-S637.
346. Weiler R, Kewitz B. The marker for nitric oxide synthase, NADPH-diaphorase, co-localizes with GABA in horizontal cells and cells of the inner retina in the carp retina // Neurosci. Lett. 1993. - Vol. 20. -N. 158(2). -. P. 151-154.
347. Welkos S.L., Davis K.M., Pitt L.M. et al. Studies on the contribution of the Fl capsule-associated plasmid pFrato the virulence of Yersinia pestis // Contrib. Microbiol. Immunol. 1995. -V. 13.- P. 299-305.
348. Welkos S.L., Friedlander AM., Davis KJ. Studies on the role of plasminogen activator in systemic infection by virulent Y. pestis strain C092 // Microb. Pathog. 1997. - V. 23. - P. 211223.
349. Westphal O., Jann K Bacterial lipopolysaccharides: extraction with phenol-water and further application of the procedure // Methods in carbohydrate chemistry / Roy L. Whistler (ed.). New York: Academic Press. Inc., 1965. V. 5. - P. 83-91.
350. Williams J., Cavanaugh D. Cryptic infection of rats with nonencapsulated variants of Yersinia pestis II Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1974. - V. 69. - P. 171-172.
351. Williams J.E., Cavanaugh D.C. Chronic infections in laboratory rodents from inoculation of nonencapsulated plague bacilli (Yersinia pestis) // Experientia. 1983. - V. 39. - P. 408-409.
352. Williams J.E., Cavanaugh D.C. Potential for rat plague from nonencapsulated variants of the plague bacillus (Yersinia pestis) II Experientia 1984. - V. 40. - P. 739-740.
353. Williams J.E., Harrison D.N., Quan Th J. et al. Atypical plague bacilli isolated from rodents, fleas and man// Amer. J. Public Health. 1978. - V. 68. - P. 262-264.
354. Wilhams J.E., Hudson B.W., Turner R.W. et al. Plague in Central Java, Indonesia // Bull. WHO. 1980. - V. 58. - P. 459-468.
355. Williams R.C., Gewürz H., Quie P.G. Effects of fraction 1 from Yersinia pestis on phagocytosis in vitro II J. Infec. Dis. 1972. - V. 126. - P. 235-241.
356. Williamson E.D., Eley S.M., Griffin KF. et al. A new improved sub-unit vaccine for plague: the basis of protection// FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. - V. 12. - P. 223.
357. Winter C., Cherry W., Moody M. An unusual strain of Pasteurellapestis isolated from a fatal human case of plague II Bull. WHO. 1960. - V. 23. - P. 408-409.
358. Worsham P.L., Hunter M. Characterization of pestoides F, an atypical strain of Yersinia pestis II Nederlands Tijdschrift Voor Medische Microbiology. 1998. - V. 6. - SII. -P. S34-35.
359. WorshamP.L., Stein M.-P., Welkos S.L. Construction of defined Fl negative mutants of virulent Yersinia pestis // Contrib. Microbiol. Immunol. 1995. - V. 13. - P. 299-305.
360. Wren B.W., Olsen AL., Stabler R. et al. A PCR-based strategy for the construction of a defined Yersinia enterocolitica 08 htr mutant // Abstracts of 6th International Symposium on Yersinia (September 26-28,1994, Rome, Italy). Rome, 1994a - P. 25.
361. Yang X., Gieni RS., Mosmann T.R. et al. Chemically modified antigen preferentially elicits induction of THl-like cytokine synthesis pattern in vivo // J. Exp. Med. 1993. - V. 178. -P. 349-353.
362. Yang Y,, Isberg R.R. PsaEF regulate the expression of the thermoinducible binding op-eron in Y. pseudotuberculosis II Abstracts of the 96th General Meeting of the American Society of Microbiology. New Orlean, LA: ASM, 1996. P. 35 - (B-231).
363. Yersin A Bacille de la peste // Ann. Inst. Pasteur. 1894. - V. 8. - P. 666.
364. Yersin A. La peste bubonicque ä Hong-Kong // Ann. Inst. Pasteur. 1894. - V. 8. -P. 662-667.
-
Гремякова, Татьяна Андреевна
-
доктора медицинских наук
-
Москва, 2004
-
ВАК 03.00.07
- Исследование функциональной активности рН 6 антигена Yersinia pestis с помощью наборов изогенных мутантов
- Структурно-функциональная и генетическая характеристика V антигена Yersinia pestis
- Моноклональные антитела к F1 и V антигенам Yersinia Pestis для выявления возбудителя чумы
- Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis
- Экспериментальное обоснование преимуществ сочетанной специфической и экстренной профилактики чумы
