Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование функциональной активности рН 6 антигена Yersinia pestis с помощью наборов изогенных мутантов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование функциональной активности рН 6 антигена Yersinia pestis с помощью наборов изогенных мутантов"

На правах ру кописи

БАХТЕЕВА Ирина Викторовна

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РН 6 АНТИГЕНА YERSINIA PESTIS С ПОМОЩЬЮ НАБОРОВ ШОГЕННЫХ МУТАНТОВ

03 00 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2008

003446635

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Анисимов Андрей Павлович Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Баснакьян Ирина Арташесовна доктор медицинских наук Алеппсин Геннадий Иванович

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится « года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208 046 01 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им ГН Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу 125212, г Москва, ул Адмирала Макарова, д 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского»

Автореферат разослан « ^^ » 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук СЮ Комбарова

Общая харлсгеристика работы Актуальность проблемы.

Возбудитель чумы, Yersinia pestis, является одним из наиболее вирулентных микроорганизмов и относится к грам-отрицательным бактериям рода Yersinia [Хоулт Дж ссоавт,1997] В патогенезе инфекции, вызываемых грамм-отрицательными микроорганизмами, одну из первостепенных ролей играет адгезия бактерий к поверхности клеток хозяина У иерсиний известно несколько белков, обеспечивающих прикрепление патогена к мембране эукариотических клеток адгезии YadA, инвазии, белок Ail и рН 6 антиген

рН 6 антиген (пили адгезии, белок PsaA - дН six antigen) является общим для двух видов Yersinia поверхностным белком, синтезирующимся в виде субъединиц с молекулярной массой 15 кДа, которые затем агрегируют с образованием макромолекулярной капсулы [LE Lindler etal 1990) Экспрессия PsaA кодируется psaEFABC опероном, включающим пять генов psaA, кодирующий синтез структурной субъединицы, psafi и psaC, кодирующие шаперонный и ашерный белки, обеспечивающие доставку структурных субъеднниц из цитоплазмы на поверхность бактериальной клетки, psaE и psaF, отвечающие за температурную и рН-регуляцию синтеза белка PsaA [Yang, Isberg, 1997, Price etal, 1995, Панферцев и др , 1991, Lindler et al, 1990идр]

К моменту начала настоящих исследований рН6 антиген наряду с белками внешних мембран Yops, липополисахаридом, V антигеном и др расценивался как один из обязательных факторов патогенности Y pestis, так как его экспрессия необходима для вирулентности чумного микроба Утрата продукции рН6 антигена в результате делеции гена psaA приводили к 200-кратному снижению вирулентности штамма Y pestis KIM5 [Lindler etal, 1990], а делеции гена psaF - к полной потере вирулентности штамма Y pestis 231 [Панферцев и др , 1991]

Одним из свойств рН6 антигена, привлекшим к нему внимание исследователей, была зависимость его синтеза от рН и температуры окружающей среды - его продукция начиналась при температуре 37 °С и значениях рН ниже 6,4, близких к рН фаголизосом макрофагов или некротического содержимого абсцессов [Ben-Efraim et al, 1961] Эксперименты по активной иммунизации лабораторных животных препаратами PsaA показали, что его выраженная способность индуцировать антителогенез не приводила к протектив-ному эффекту при последующем заражении животных Y pestis [Черепанов и др, 1991,

Водопьянов и др , 1995] Высказывались предположения, что отсутствие протективности может быть связано с особенностями рН регуляции этого фактора его синтез внутри фаголизосом макрофагов или в центре некротизированных тканей абсцессов делает невозможным контакт покрытых рН6 антигеном бактериальных клеток с антителами и иммунокомпетентными клетками макроорганизма [Анисимов, 2002] Однако до сих пор не было приведено доказательств этой гипотезы

Исследования функциональной активности PsaA продемонстрировали, что он обладает целым рядом биологических свойств, каждое из которых может обеспечивать его вклад в вирулентность чумного микроба PsaA+ клетки У pestis и препараты белка PsaA обладали цитотоксической активностью по отношению к перитонеальным [Bichowsky-Slonimsky, Ben-Efraim, 1963] и альвеолярным [Степаншина ссоавт, 1993, Водопьянов с соавт, 1995] макрофагам Однако в экспериментах с мутантным по собственным пи-левым белкам штаммом Pseudomonas aeruginosa клонированные гены Y pestis psaABC восстанавливали доставку цитотоксичного экзоэнзима S в цитоплазму клеток хозяина благодаря восстановлению дефекта пилей, но не кодировали дополнительную цитоток-сическую активность [Sundin et al, 2002]

Публиковались данные об адгезивной активности PsaA Многие исследователи отмечали способность PsaA агглютинировать эритроциты различных видов животных [Bichowski-Slonimski, Ben-Efraim, 1963, Водопьянов, Мишанькин, 1985, Lindler et al, 1990 и др] Кроме того, при развитии псевдотуберкулезной инфекции PsaA выполняет функцию адгезина, способствуя связыванию клеток Y pseudotuberculosis с мембраной эпителиальных клеток [Yang et al, 1996, Marra, Isberg, 1997] Однако позже были опубликованы данные об отсутствии влияния PsaA на способность Y pestis связываться с мембраной макрофагов [Huang, Lindler, 2004] В то же время было показано, что рН6 антиген обладает антифагоцитарной активностью и препятствует захвату клеток чумного микроба макрофагами [Huang, Lindler , 2004]

Таким образом, несмотря на разностороннее изучение функциональной активности PsaA, до настоящего времени нет единого мнения о том, какое из его свойств является определяющим вклад этого фактора в вирулентность Y pestis Анализ публикаций показал противоречивость данных о цитотоксической активности и влиянии рН6 антигена на вирулентность Y pestis Адгезивные свойства PsaA установлены для Y pseudotuberculosis, но не подтверждены для Y pestis До настоящего времени не изуче-

ны механизмы отсутствия протектнвной активности PsaA, нет данных о мнтогенной активности PsaA, присущей другим бактериальным адгезинам В связи с этим для уточнения роли рН 6 антигена в иммунопатогенезе чумы сохраняется актуальность изучения цитотоксических, митогенных и адгезивных свойств белка PsaA, а также определение его вклада в вирулентность чумного микроба

Цель исследования - получение новых данных о функциональной активности рН 6 антигена и его вкладе в вирулентность возбудителя чумы

Задачи исследования:

1 Создать на основе штаммов Yersinia spp коллекцию изогенных нокаутных мутантов по генам оперона psaEFABC

2 На основе созданной коллекции провести комплексную сравнительную оценку биологических свойств PsaA+ и PsaA" штаммов Yersinia spp in vitro

3 Оценить цитотоксические, митогенные и адгезивные свойства белка PsaA

4 Изучить протективные свойства PsaA и его вклад в вирулентность Yersinia spp в экспериментах in vivo

Научная новизна Доказано, что PsaA не обладает цитотоксичностыо Установлено, что PsaA не относится к обязательным факторам патогенности Y pestis Показано, что PsaA обеспечивает адгезию возбудителя чумы к эпителиальным клеткам Выявлена мито-генная активность PsaA, а также его влияние на адгезию и дифференцировку макрофагов Получены штаммы Y pestis со способностью к независимому от рН и температуры среды (конститутивному) синтезу рН 6 антигена и с их помощью проверена и опровергнута гипотеза о том, что отсутствие протективных свойств PsaA определяется особенностями рН-регуляции его синтеза Выявлено, что PsaA+ клетки Y pestis в организме теплокровного хозяина имеют селективные преимущества перед PsaA" бактериями

Практическая значимость. Полученные данные о селективных преимуществах PsaA' клеток Y pestis в организме теплокровного хозяина, объясняющие факт выделения в природных очагах чумы только PsaA+ штаммов, являются основанием для разработки диагностических препаратов, направленных на выявление генов, кодирующих рН 6 антиген возбудителя чумы

В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонированы пять авторских штаммов Y pestis и

Y pseudotuberculosis с мутациями по генам psaA и psaEFABC , которые будут использованы для изучения роли рН 6 антигена У pestis в патогенезе чумы

Депонированы в GenBank нуклеотидные последовательности четырех генов, кодирующих белки Y pestis с предполагаемой адгезивной активностью -YP0I387-YP01388, YP01708, YPO1709-YPO1711 и YPO 4044 (№№ доступа EU637081, EU637083, EU637082 и EU637084 соответственно) [http //www ncbi nlm nih gov/sites/entrez]

Внедрение результатов работы. Результаты исследований послужили основой для составления методических рекомендаций «Изучение взаимодействия патогенных иерсиний с культурами фагоцитирующих и нефагоцитирующих клеток млекопитающих» (Оболенск, 2007)

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета

Положения, выносимые на защиту:ж

1 рН 6 антиген Y pestis не обладает цитотоксической активностью в отношении различных типов эукариотических клеток

2 рН 6 антиген не является обязательным фактором патогенности Y pestis Утрата способности к его продукции не приводит к снижению вирулентности возбудителя чумы, но его присутствие дает селективные преимущества PsaA4" бактериям в организме теплокровного хозяина на ранних стадиях инфекции

3 Большинство присущих белку PsaA биологических эффектов определяется его адгезивной активностью В зависимости от концентрации PsaA либо стимулирует диф-ференцировку и адгезию макрофагов, либо вызывает их аутоагглютинацию

4 Индукция антител к PsaA не обеспечивает защиту при заражении животных штаммами с конститутивной продукцией PsaA, следовательно, отсутствие протективно-сти PsaA не зависит от его синтеза внутри фаголизосом и недоступностью для антител и иммунокомпетентных клеток Отсутствие протективности PsaA в совокупности с феноменом селекции PsaA+ бактерий в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только PsaA+ штаммов У pestis, что позволяет рассматривать PsaA или кодирующие его гены как перспективную мишень для лабораторной диагностики

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 2 апреля 2008 года Материалы диссертации доложены н представлены на 5 международных научных конференциях Н-й Международной научной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (20-21 октября 2005 г, Москва, Россия), Vll-ii Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г, Оболенск, Московская обл ), 9-ом международном симпозиуме по иерсиниям (10-14 октября, 2006, Lexington, Kentucky, USA), межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (25-26 сентября 2007 г, Саратов), 5lh International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, November 15-18, 2007)

Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 56 работ отечественных и 194 работы зарубежных авторов Работа иллюстрирована 26 рисунками и 17 таблицами Содержание работы Материалы и методы исследования

В работе использовали 25 штаммов Y pestis и Y pseudotuberculosis, включая сконструированные в ходе исследования наборы изогенных мутантов, отличающихся по продукции PsaA Для проведения генетических манипуляций использовали штаммы Е coli DH5a, и S17-1 "kpir (все штаммы получены из музея живых культур ФГУН ГНЦ ПБМ)

Штаммы Y pestis выращивали на жидких и плотных питательных средах Хотгингера или ВН1 (Brain Heart Infusion Broth) при значениях pH 7,2-7,4 или 5,8- 6,2 и значениях температуры 28 °С или 37 °С Штаммы Y pseudotuberculosis и Е coli выращивали на жидких или плотных питательных средах Луриа-Бертани (LB) при температуре 37 °С

В работе использовали 8-10 недельных мышей линии Balb/C, нелинейных морских свинок и кроликов из вивариев ФГУН ГНЦ ПМБ

Для проведения экспериментов in vitro использовали перитонеальные макрофаги мыши, перитонеальные и альвеолярные макрофаги морской свинки, лейкоциты крови кролика, лимфоциты и моноциты крови человека, макрофагоподобные мышиные клеточные линии J774 1Аи RAW264 7, линию мышиных фибробластов L929, человеческие промиелоидные линии ТНР-1 и U937, человеческие линии эпителиальных клеток HelaS3 и НЕР-2, которые культивировали в средах DMEM или RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка Все клеточные линии были получены из Российской коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН

Определение нуклеотидных последовательностей генов проводили прямым методом секвенирования без предварительного клонирования геномных фрагментов ДНК на приборе CEQ™ 2000XL DNA Analysis System фирмы Beckman Coulter с использованием набора реактивов CEQ™ DTCS KIT Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, а в качестве праймеров - синтетических олигонуклеотидов, рассчитанных на основании анализа структуры изучаемых генов с использованием базы данных NCBI Полученные нуклео-тидные последовательности анализировали с помощью программы NCBI BLASTn Этот раздел исследований был выполнен совместно с научным сотрудником отдела иммунобиохи-мии ФГУН ГНЦ ГТМБ В А Банновым

Генно-инженерные манипуляции и передачу рекомбинантных плазмид в реципи-ентные клетки выполняли по руководству Mamatis et al [1982] Инактивацию гена psaA и оперона psaEFABC в клетках аттенуированных штаммов Y pestis и в клетках Y pseudotuberculosis проводили методом прямого сайт-направленного мутагенеза с использованием хелперной плазмиды pKD46 [Datsenko, Wanner, 2000] или с помощью суицидных плазмид pCVD442Afwo4 кап и pCVD442Af>saEFABC кап Корректность структуры ДНК полученных мутантов подтверждали в ПЦР

Комплементацию мутантов проводили с использованием плазмиды pJG428, содержащей полный оперон psaEFABC из Y pestis EV [Makoveichuk et al, 2003], клонированный в космиде рНС79 [Hohn, Collins, 1980], а также плазмиды pIGB924Cm, созданной с использованием плазмидного вектора pKS bluescript (Stratagene), содержащего фрагмент ДНК Saul-Clal (psaABC) из плазмиды pJG428 и кодирующего синтез белков PsaA, PsaB и PsaC Плазмида pIGP924cm была сконструирована и любезно предоставлена научным сотрудником отдела иммунобиохимии ФГУН ГНЦ ПМБ Панферцевьш Е А

Экспрессию гена psaA и синтез PsaA оценивали методами RT-ПЦР, иммуноблот-тинга и дот-блоттинга [Tovvbin, 1979] и в реакции диффузной иммунопрецнпитации в геле [Ouchterlony, 1949] Электрофоретическое разделение белков осуществляли по методу U К Laemmli [1970] Определение титра антител в иммунных сыворотках животных проводили с помощью иммуноферментного анализа согласно руководству ТТ Иго и др [1988] Выделение и очистку препаратов рекомбинантного и нативного PsaA из штаммов Е coli DH5apJG428 и У pestis КМ260(11) проводили по методике Е Makoveichuk el al [2003] Выделение «грубого» экстракта клеток У pestis проводили по методу L Bichowski-Slommski [1963] Митогенную активность рН 6 антигена оценивали в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) [Mishell, Shiigi, 1980] Изучение влияния исследуемых препаратов рН 6 антигена на жизнеспособность клеток теплокровных (цитотоксический тест), на прикрепление адгезионных культур клеток теплокровных к абиотическим поверхностям и на клеточную дифференцировку определяли в тесте МТТ [ Mosmann, 1983] Дифференцировку человеческих промиелоидных клеток ТНР-1 и U937 в макрофаги индуцировали добавлением форболмиристилацетата Адгезию бактериальных клеток PsaA+ и PsaA штаммов Yersinia spp и Е coli к поверхности макрофагов и эпителиальных клеток, а также фагоцитоз бактерий макрофагами изучали в соответствии с рекомендациями X-Z Huang, L Е Lindler [2004] В качестве макрофагов использовали мышиные макрофагоподобные клетки J774A1, в качестве эпителиальных - человеческую линию клеток эпителия гортани НЕР-2

Для получения кроличьих моноспецифических антисывороток к рН 6 антигену кроликов иммунизировали рН 6 антигенам подкожно многократно с интервалом 14 дней возрастающим количеством антигена (от 250 до 500 мкг/животное) Для определения протективной активности рН 6 атигена мышей иммунизировали раствором PsaA в PBS в дозе 10 мкг/мышь подкожно двукратно с полным и неполным адъювантом Фрейнда с интервалом 21 сутки На 28 сутки после второй иммунизации проводили заражение мышей Для определения вирулентности PsaA+ и PsaA" штаммов У pestis, У pseudotuberculosis иммунных и интактных мышей заражали подкожно десятикратными разведениями культур У pestis, выращенных при 28 °С или У pseudotuberculosis, выращенных при 37 °С (по 4 мыши на одну дозу) Величины LD50 ImD50 и доверительные интервалы (для вероятности 95 %) вычисляли по методу Karber в модификации И П Ашмарина, А А Воробьева [1962] Для изучения стабильности наследования плазмид рекомбинантными штаммами

Y pestis in vivo у мышей, погибших в экспериментах по определению LD50, выделяли из селезенок бактериальные культуры и определяли у выросших клонов сохранение признака антибиотикоустойчивости и способность к синтезу рН 6 антигена

Результаты исследования

Анализ последовательностей генов адгезинов из штамма у. pestis 231 и конструирование psaa и psaefabc мутантов. Учитывая тот факт, что утрата способности к синтезу рН 6 антигена приводила к различной степени снижения вирулентности двух штаммов Y pestis, 231 и KIM5, было предположено, что эти различия могут быть связаны с неидентифицированными мутациями в генах оперона psa или в генах, кодирующих другие белки с предполагаемой адгезивной активностью Анализ последовательности генома штамма Y pestis С092 [Parkhill, 2001] позволил выявить следующие гены, предположительно кодирующие пилевые и непилевые адгезины YP01301-1305 (psaEFABC), YP01387, YP01388, YP03068, YP01707, YP01708, YP01709, YP01710, YP01711, YP02944, YP02945, YP02950, YP04041, YP04042, YP04044, YP03944, YP01562 Мы определили нуклеотидные последовательности этих генов и сравнили их с аналогичными последовательностями других штаммов Y pestis из базы данных NCBI, в том числе и штамма KIM Оказалось, что все последовательности выбранных для анализа генов

Y pestis 231 полностью гомологичны соответствующим фрагментам геномов всех сек-венированных к настоящему моменту штаммов Y pestis Таким образом, разная степень снижения вирулентности штаммов Y pestis 231 и KIM5 при утрате способности к синтезу PsaA не была связана с неидентифицированными мутационными изменениями в исследованных нами генах

Для определения роли отдельных бактериальных факторов в патогенезе инфекционных заболеваний принято использовать комплекс молекулярно-генетических методов, включающих направленный мутагенез и последующую комплементацию признака с помощью плазмид С использованием сайт-направленного мутагенеза (рис 1) были получены psaA и psaEFABC мутанты на основе атгенуированных и вирулентных штаммов

Y pestis, а также мутантный по гену psaA штамм Y pseudotuberculosis В-6259

Ill Hl H2

typsaf: !>sul'. psaB .

h::

| prafe' /! /ȟ/1' 7

JlUJ

YPOI3QO ч, YPOIS^j

/м»// l/й A/ii

l's.tf'km-i

psaA::Kan /

\ R6K oft

kiTiR \ ж ... ,

(isaE

pCVD442-psaA: :kan

7852 bp

pCVO+^-psaEFABC^kan ff18 bp

Рис. 1. А. Структура и верификация в ПЦР ApsaA::kan и &psaEFABC::kait мутаций

по методу К.А. Datsenko и B.L. Wanner [2000]. Ill и Н2 - короткие участки гомологии генов-мишеней; k 1, к2 - общие тест-праймеры для гена кап; PsaAkm3, PsaAkm4 - локус специфичные праймеры для гена psaA: PsaEkm3, PsaCkm4 - локус специфичные праймеры для оиерона psaEFABC.

Б. Карты плазмид рСVD442,\ps{iA-.-.кап н pCVD442ApsaEFABC::kan.

Оценка продукции белка PsaA клетками мутантных штаммов Y. pestis методами RT-ПЦР и иммуноблоттинга показало, что обе мутации приводят к прекращению синтеза PsaA (рис. 2).

12 3 4 5 6 7 8 9 *

1 2 3 4 5 6 7 8

12 3 4 5 6 7

А

В

Рис. 2. (А) КТ-1ЩР-аиалгп экспрессии мРНК гена ръаА в клетках исходных и му-тантных по гену р$аЛ штаммов К релГк Линии 1 - ЕУ; 2 - ЕУДр5аА::кап: 3 - КМ215; 4 -КМ215Др$аА\\кап\ 5 - КМ260(11); 6- КМ260(11)ДрзаА:.кап\ 1 - положительный контроль (ПЦР-продукт, полученный с плазмидой рЮВ924Ст); 8 - отрицательный контроль (Н20); 9 - маркер молекулярных масс ДНК X /Нт<Ш1 (23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 п.о.).

(Б) ДСН-ПААГ электрофорез и (В) соответствующий иммуноблоттинг с кроличей анти-РэаА сывороткой клеточных лизатов К рех<к. Линии 1, 8 - К.М215, 2, 9 -КМ215ДфаАу.кагг, 3, 10 - ЕУ; 4, 11 - ЕУДршА\:кап\ 5, 12 - КМ260(11); 6, 13 -КМ260(11)Др5аА::кап- 7, 14 - РзаА (2 мкг).

Последующая комплементация ¿\psaEFABC мутации с помощью рекомбинантных плазмид, несущих полный оперон ряаЕЕАВС или локус рзаАВС, восстанавливала синтез РэаА (рис. 3), причем в первом случае восстанавливалась зависимость экспрессии РэаА от температуры и рН среды. В то же время отсутствие регуляторных генов ряаЕ и рлз/7 в рЮВ924Ст приводило к синтезу РваА, независимому от температуры культивирования (в пределах от 28 °С до 37 °С) и рН среды (от 5,8 до 7,2) (рис. 3 - 3, 7, 9).

Рис. 3. Изучение продукции РваА клетками штаммов

У. методом иммунодиффузии в гель (ОисЫеНопу,

Ъ ) Г Д 1 1949].

ч 4 1 У. 231 - 37 °С, рН 5,8;

4 тщ, ' з 2 Г. ре^й 231 Да?аЕРАВС рЮВ924Сга - 37 °С, рН 5,8;

3 У. реьчи 23 \kpsaEFABC рЮВ924Ст - 28 °С, рН 5,8; з 4 У. рет/и 231 Дга,аЕЕАВС р.ГС428 - 37 °С, рН 5,8;

5 рН 6 антиген К. рет/« (положительный контроль);

6 У. ре$Ш 23\ApsaEFABC -37 °С, рН 5,8;

^ 7 7 У. реяШ 23 \ApsaEFABC рЮВ924Ст - 37 "С, рН 7,2;

( 8 У рези* 231 Дма£К4ЯСрГС428 - 37 °С, рН 7,2;

Чу 9 У. рели 231 Ар.чаЕЕАВСрЮВ924Ст - 28 "С, рН 7,2;

10 е ю у. рели 231Дрха£К4ВС р.Ю428 - 28 °С, рН 7,2;

11 У. ре.?/п 231 - 37 "С, рН 7,2;

9 12 У реЛ«231Дрга£/^ВС-37 °С, рН 7,2;

13 — анти-РваА кроличья сыворотка.

Таким образом, в результате комплементации АряаЕРАВС мутации плазмидой

рЮВ924Ст были получены штаммы У. резНя с конститутивным синтезом белка РэаА.

Оценка влияния PsaA на адгезию и фагоцитоз yersinia spp. Учитывая то, что к моменту начала настоящих исследований не было сведений о том, какой адгезин обеспечивает взаимодействие У. pestis с клетками хозяина, были изучены адгезивные и антифагоцитарные свойства изогенньгх штаммов У. pestis, отличающихся по способности к синтезу PsaA (рис. 4). Оказалось, что утрата PsaA приводила к 4-9 кратному снижению адгезии исследуемых бактерий к эпителиальным клеткам гортани человека НЕР-2 и в 4-8 раз увеличивала уровень фагоцитоза иерсиний макрофагами. В то же время присутствие PsaA существенно не влияло на способность иерсиний связываться с поверхностью макрофагов J774.1A. Таким образом, при взаимодействии У. pestis с эпителиальными клетками PsaA выполняет функцию адгезина, а при взаимодействии с макрофагами - антифагоцитарного фактора, но не адгезина. Возможно, вклад PsaA в связывание клеток У. pestis с поверхностью макрофагов несущественен, так как макрофаг обладает большим количеством рецепторов для неспецифического связывания с патогенами.

4,

-

т

ш

EV КМ260(11) КМ215 штаммы У. pestis О родительский штамм H APsaA

В-5962 Y. pseudotuberculosis

KM260UI) штаммы I". pestis О родительский

Рис. 4. Уровни адгезии к эпителиальным клеткам НЕР-2 (А) и фагоцитоза макро-фагоподобными клетками J774.A1 (Б) бактериальных клегок исходных и мутантных по i сну psaA штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis

В ходе исследований было обнаружено, что штамм У. реяЧз КМ215, утративший способность к синтезу двух основных фимбриальных белков, Р1 и РэаА, тем не менее не терял своих адгезивных и антифагоцитарных свойств (рис. 4, А и Б). Вероятнее всего, высокий уровень адгезивной и антифагоцитарной активности бактериальной клетки У. рел/я, утратившей способность к синтезу РэаА и П, сохраняется благодаря экспрессии друго-го(их) фактора(ов), компенсирующих функции РваА. При этом фенотип РзаА+ являлся доминирующим адгезивным и антифагоцитарным фенотипом У. реэс^я. Наши результаты

были подтверждены данными Liu et al [2006], которые также свидетельствуют в пользу существования в У pestis («охарактеризованного ранее адгезина

Изучение цитотоксической, адгезивной и митогенной активностей препаратов PsaA. В классических экспериментах с PsaA были получены данные о цитотоксич-ности «грубых» экстрактов клеток У pestis, выращенных в условиях синтеза PsaA Для оценки цитотоксической активности PsaA в составе «грубого» экстракта были получены «грубые» экстракты из клеток штаммов дикого типа У pestis и их PsaA" мутантов и проведено сравнение их цитотоксичности В качестве клеток-мишеней использовали перевиваемые человеческие и мышиные клеточные линии и первичные культуры мыши и человека Добавление «грубых» клеточных экстрактов У pestis в культуральную среду в диапазоне концентраций от 1,56 до 100 мкг/мл приводило к дозо-зависимому снижению жизнеспособности клеток-мишеней, однако «грубые» экстракты из штаммов дикого типа проявляли цитотоксические свойства в той же степени, что и их PsaA-негативные мутанты, (рис 5) Это предполагает, что цитотоксическое действие «грубых» экстрактов связано не с PsaA, а с другими белками, присутствующими в клеточном экстракте

кониетрация грубого экстракта (по белку) мкг/мл

Рис. 5. Жизнеспособность мышиных макрофагов Л74 1А после 24 ч взаимодействия с «грубыми» клеточными экстрактами из изогениых РзаА+ и РзаА" штаммов К

В связи с этим было изучено влияние высокоочищенных препаратов нативного и рекомбинантного РбэА (со степенью чистоты не менее 95 %) на жизнеспособность адгезионных типов клеток млекопитающих Былор установлено, что РваА в широком диапазоне концентраций (1-100 мкг/мл) не влияет на жизнеспособность клеток при добавлении

к сформированному клеточному монослою (табл 1) В некоторых случаях количество жизнеспособных клеток в присутствии РзаА даже увеличивалось по сравнению с контрольным монослоем, однако эти различия находились в пределах доверительных интервалов

Таблица 1. Жизнеспособность (%) эукариотических клеток мыши и человека после 24 ч воздействия нативного белка РзаА._

Типы перевиваемых клеточных линий Концентрация PsaA, мкг/мл

100 50

J774 1А 95,7 + 8,12 105,3 + 6,24

RA W164 7 87,5 + 7,13 91,3 ±7,49

L929 83,3 ±8,71 91,1 ±8,24

Hela S3 97,1 ±9,47 93,8 ± 5,78

Перитонеальные макрофаги мыши 102,2+10,41 112,8 + 6,78

Перитонеальные макрофаги морской свинки 101,1 ±6,25 102,7 ±9,21

Альвеолярные макрофаги морской свинки 98,2 ± 8,34 93,4 ± 9,78

Лейкоциты кролика 110,7 ± 11,1 122,5 ±7,02

Моноциты человека 112,9 + 8,76 106,2 ±8,31

Одновременно было исследовано влияние РзаА на прикрепление макрофагов и других адгезионных клеточных культур к абиотическим поверхностям (полистиролу) Известно, что прикрепление и распластывание макрофагов и фибробластов к подложке является необходимой предпосылкой их последующей функциональной активности Было показано, что РэаА при его добавлении в среду культивирования на ранних стадиях формирования клеточного монослоя влиял на адгезию эукариотических клеток к абиотическим поверхностям При концентрации выше 25 мкг/мл он препятствовал формированию клеточного монослоя и вызывал аутоагглютинацию клеток с последующей гибелью около 20 % клеток в центре клеточных агрегатов (рис 6, Б) Гибель клеток была следствием нарушения нормальных условий их жизнедеятельности, так как жизнеспособность распластанных клеток не страдала В концентрациях ниже 25 мкг/мл РБаА способствовал адгезии макрофагов к полистиролу и формированию монослоя Этот эффект максимально проявлялся в экспериментах с первичными культурами клеток, в частности, с мышиными перитонеальными макрофагами (рис 7)

в

ШШЩ

и.

л:

»V ? ' V. , ■>

{ V " ' !? П». $» ■"., в-. Г.- V' > ' г

V ■' С?.. . ,>

I1 . , - •. ■

I - >

ЩЪъ I, /ЛУ^ »' .

■

Й|И *

о 7

Ш &'

. а к

Р -

я®

* ■ " Уг

т J

5- у"

О

Рис. 6. Формирование монослоя макрофагов ^74.1А в присутствии РваА (25 мкг/мл). А - контрольный монослой клеток; Б - клеточный монослой, сформированный в присутствии РэаА (25 мкг/мл)

Рис. 7. Адгезия перитонеальных макрофагов мыши к полистиролу после 48 ч воздействия низких доз иативного белка РваА. А - контрольный монослой перитонеальных макрофагов мыши; Б - клеточный монослой, сформированный в присутствии РэаА (6,25 мкг/мл)

Выявленный эффект побудил к изучению влияния РэаА на клеточную дифферен-цировку. Известно, что моноцитарньге и промиелоидные клетки под действием диффе-ренцировочных факторов трансформируются в зрелые макрофаги, приобретая при этом способность к прилипанию и распластыванию на поверхностях. Изучение влияния РзаА на ФМА-индуцированную дифференцировку человеческих промиелоидных линий клеток и937 и ТНР1 показало, что его присутствие существенно увеличивало количество дифференцированных клеток, что свидетельствует о ко-стимулирующем влиянии низких концентраций РваА на дифференцировку макрофагов (рис. 8). Нужно отметить, что влияние РбэА на клеточную дифференцировку проявлялось только в присутствии ФМА, то есть он не являлся самостоятельным фактором дифференцировки, но мог усиливать целевую активность других дифференцировочных факторов. Вероятно, выявленный эффект связан со стимуляцией клеточной адгезии к поверхности, которая играет ключевую роль в процессах дифференцировки монослойных клеточных культур.

концентрация рН6 антигена, мкг/мл

Рис. 8. Количество дифференцированных клеток TIIP1 после ФМА-иидуцироваиной дифференцировки (10 нг/мл ФМА), проведенной в присутствии белка PsaA.

Полученные ранее данные об агглютинирующей активности PsaA и связывании его с pt-галактозильными остатками гликосфинголипидов [Payne D, et al, 1998] предполагают принадлежность PsaA к лектиноподобным веществам Поскольку одним из свойств лектинов является их митогенность, в настоящих экспериментах была изучена митогенная активность PsaA в реакции бластгрансформации на человеческих лимфоцитах, полученных из крови здоровых доноров Полученные данные свидетельствовали, что очищенный PsaA обладает выраженной митогенной активностью, которая в концентрации 10 мкг/мл была сопоставима с митогенным эффектом КонА - индексы стимуляции лимфоцитов здоровых доноров в ответ на конА были в пределах от 8,5 до 18,1, а в ответ на рН6 антиген - в пределах от 11,9 до 17,7

Изучение биологических свойств PsaA в экспериментах in vivo. Завершающим этапом исследований была сравнительная оценка вирулентности полученных изогенных наборов штаммов «дикого» типа, их вариантов с PsaA- фенотипом и штаммов с восстановленным синтезом PsaA, зависимым или независимым от температуры культивирования и рН питательной среды на интактных и иммунизированных PsaA мышах Следует отметить, что в процессе нокаутного мутагенеза штамм Y pseudotuberculosis B-5962ApsaA утрачивал плазмиду вирулентности pCD и не мог быть использован в экспериментах по определению LD50 Поэтому для определения влияния PsaA на вирулентность

Y pseudotuberculosis была применена методика выращивания клеток этого штамма в условиях, оптимальных для синтеза PsaA Клетки Y pseudotuberculosis В-5962 выращенные при температуре 37 °С и значениях рН 5,8 служили «моделью» мутанта с рН-независимой секрецией PsaA

В ходе экспериментов на животных было установлено, что в теплокровном организме клетки рекомбинантных штаммов Y pestis, продуцирующие PsaA, имеют селективные преимущества Ранее было установлено, что рекомбинангные плазмиды, созданные на основе репликона ColEl, не способны стабильно наследоваться в клетках Y pestis без селективного давления антибиотиков [Анисимов и др, 1991] Действительно, проведенный нами анализ пассирования in vitro клеток штаммов У pestis, трансформированных плазмидами pJG428 и pIGB924Cm без антибиотиков показал, что через двадцать генераций при температуре 37° С признак антибиотикоустойчивости сохраняли всего 5-7 % бактериальных клеток Тем не менее, в организме зараженных животных эти плазмиды не элиминировались из клеток Y pestis - 100 % выделенных из селезенок клонов сохраняли антибиотикоустойчивость и способность к продукции PsaA Аналогичные селективные преимущества т vivo Fl+ штаммов Y pestis и рекомбинантных F1* штаммов

Y pseudotuberculosis были показаны Гремяковой [2004] и Бываловым и др [2008]

Чтобы оценить способность PsaA+ и PsaA" вариантов штамма Y pestis 231 выживать и размножаться в организме экспериментальных животных, был определена динамика обсеменения региональных лимфоузлов и селезенок мышей после подкожного заражения 100 КОЕ штамма Y pestis 231 и его мутанта с полной делецией оперона psa Было показано, что через 48 ч после заражения животных штаммом «дикого» типа у них достоверно увеличился вес регионарных лимфоузлов, а через 72 ч уровень обсемененности этих лимфоузлов был на порядок выше (р < 0,05), чем у животных, зараженных PsaA" вариантом (рис 9) Однако эти различия исчезали на более поздних стадиях инфекционного процесса через 96 часов

I I Ljj KOL. 23lApsa£J-"ABC -кслимфоуг-ш. 231

сроки инфицирования . ч

Рис. 9. Средние показатели веса (мг) и обсемененности (КОЕ/г органа) регионарных лимфоузлов мышей, зараженных штаммом К м 231 и его /\psaEFABC, вариантом

Тем не менее, несмотря на тог факт, что в организме животных происходит селекция клеток рекомбинантных штаммов У. рей«, продуцирующих РэаА, утрата способности продуцировать РэаА не влияла на вирулентность ДсиаЛ и АрзаЕРАВС мутантов У. резИя. В наших исследованиях было показано, что абсолютные величины ЬО50 и средние сроки жизни зараженных мышей не зависели от способности к продукции РэаА, даже когда эта продукция была конститутивной (табл. 2).

Таблица 2. Вирулентность экспериментальных штаммов возбудителя чумы при подкожном заражении мышей.___

Штаммы Y. pestis Характеристика LD50, КОЕ Средние сроки гибели, сутки

231 Fra+Ymt+Lcr+PsaA+Pla+Pgm+ ** 1 (1-2) 5,4 + 0,5

231 ApsaEFABC Fra+Ymt+Lcr+PsaA~Pla+Pgm+ 2(1-5) 4,7 + 0,95

23\ApsaEFABC.p5G428 Fra+Ymt+Lcr+PsaA+Pla+Pgm+ 3(1-10) 4,9 ± 0,7

231 ApsaEFA BC'p IG В924С m Fra+Ymt+Lcr+PsaA+P!a+Pgm+ 3(1-10) 5.5 ± 1,5

И-1996 FraTYmt+Lcr+PsaA+Pla+Pgm+ 1 (1-2) 6,2 ± 0,9

И-1996ApsaA Fra+Ymt+Lcr+PsaA~Pla+Pgm+ 4(1-16) 5,7 ± 1,1

И-1996ApsaEFABC Fra+Ymt+Lcr+PsaA~Pla+Pgm+ 3(1-13) 4,9 ± 1,2

H-1996AjDia£F/4BCpIGB924Cm Fra* Ymt4 Lcr4 PsaA+Pla+Pgm+ 1(1-5) 7,1 ±0,9

В то же время, эксперименты по определению роли PsaA в патогенезе инфекции, вызванной другим представителем рода Yersinia, У. pseudotuberculosis, продемонстрировали более высокую вирулентность культуры, выращенной в условиях синтеза PsaA: LD50

при этом снижалась примерно в десять раз (табл 3) Вероятно, в случае утраты PsaA, оставшихся факторов патогенности Y pestis может быть достаточно для поддержания величин LD50 на уровне единичных бактериальных клеток На наш взгляд, в штаммах высоковирулентных патогенов, таких как Y pestis, именно избыточность механизмов и факторов патогенности до какого-то времени компенсирует отдельные мутации, потенциально снижающие способность эффективно размножаться в организме хозяина В то же время, умеренно вирулентный энтеропатоген Y pseudotuberculosis при утрате одного из факторов патогенности (PsaA) снижает свою вирулентность

Таблица 3. Вирулентность Y. pseudotuberculosis В-5962 при подкожном заражении мышей

Условия культивирования штамма LDS0 КОЕ* Средние сроки гибели, сутки

37 °С, РН 7,2 2,9 х Ю6 (7,2 х 105- 1,2 х 107) 8,06 + 0,61

37 °С, РН 5,8 3,1 х Ю5 (7,9 х 104- 1,2 х 10б) 6,00 ± 0,53

В рамках нашей работы была проверена гипотеза о том, что отсутствие протектив-ности РваА может быть связано с особенностями его рН регуляции синтез РяаА внутри фаголизосом макрофагов или в центре некротизированных тканей абсцессов делает РзаА+ бактерии недоступными для контакта с антителами и иммунокомпетентными клетками Чтобы обеспечить презентацию РэаА иммунной системе, мышей иммунизировали белком РваА, а затем заражали штаммами Y ре5Ш с конститутивным синтезом РзаА либо культурой псевдотуберкулезного микроба, выращенной в условиях оптимальных для синтеза РэаА и оценивали протективность сформированного иммунитета Полученные результаты показали, что даже при доступности РБаА+ бактерий факторам и клеткам иммунной системы иммунный ответ на РваА не защищал мышей от чумной инфекции В случае псевдотуберкулезной инфекции иммунные мыши оказались даже более чувствительными к инфекции, чем интактные (табл 4)

Таблица 4. Вирулентность Yersinia spp. при подкожном заражении интактных и иммунизированных белком PsaA мышей._

Штаммы LD5o, КОЕ

интактные мыши иммунные мыши

Y. pestis

231 2(1-7) 2(1-7)

23 lA/wa£7vlBCpIGB924Cm 3(1-13) 2(1-7)

И-1996 5(3-40) 4(1-22)

U-\996ApsaEFABCplGB924Cm 7(4-70) 2(1-7)

Y. pseudotuberculosis

B-5962, 37 °C, PH 5,8 5,7 х 105 (1,6 х 105 - 2,3 X ю6) 1,1 X I05 (1,0 X ю4- 1,5 X ю5)

Таким образом, было показано, что отсутствие протективности PsaA не связано с его синтезом внутри фаголизосом и чумных бубонов, где PsaA+ бактерии недоступны для антител и иммунокомпетентных клеток Для изучения механизма отсутствия протективности PsaA необходимы дополнительные исследования Возможно, опсонизация клеток бактериальных клеток airni-PsaA антителами потенцирует контакт бактериальной клетки с макрофагом за счет взаимодействия антител с Fc рецепторами макрофагов, что, в свою очередь, стимулирует работу системы секреции III типа и усиливает эффекторное действие других факторов пагогенности Y pestis, в частности, белков Yop

Суммируя все полученные данные, можно заключить, что PsaA, являясь адгези-ном с антифагоцитарными свойствами, обеспечивает связывание Y pestis и Y pseudotuberculosis с эпителиальными клетками макроорганизма и препятствует фагоцитарному захвату В зависимости от концентрации PsaA способствует либо процессам распластывания и дифференцировки макрофагов, либо их аутоагглютинации, что может играть важную роль в регуляции локального моноцит-опосредованного воспаления в месте первичного накопления возбудителя В дополнение к известным данным относительно гемагглютинирующей активности PsaA, результаты о PsaA-медиированной агглютинации макрофагов и моноцитов предполагают потенциальную роль PsaA в тромбо-образовании и индукции синдрома диссеминированной внутрисосудистой коагуляции, которая является характерной для чумного сепсиса Отбор PsaA+ клеток в организме хозяина свидетельствует о селективных преимуществах бактериальных клеток, продуцирующих этот адгезии, однако его утрата не влияет на вирулентность Y pestis Это говорит о том, что PsaA не является обязательным фактором патогенности Y pestis, и его наличие не является определяющим для полной вирулентности чумного микроба Отсутствие у него протективных свойств и положительная селекция PsaA+ клеток в организме

21

хозяина объясняют факт выделения в иммунных популяциях грызунов только РзаА+ штаммов У реям, тогда как бескапсульные Р1 штаммы возбудителя чумы выделяются относительно часто Эти особенности позволяют считать Р.чаА и кодирующие его гены перспективной мишенью для иммунодиагностики, что является особенно актуальным для очагов чумы, где выделяются бескапсульные РГ варианты У ре$Нк и диагностика, основанная на детекции капсульного Р1 антигена малоэффективна

Выводы

1 Доказано, что рН 6 антиген не обладает цитотоксической активностью

2 Установлено, что утрата способности продуцировать рН 6 антиген не снижает вирулентность У рех!и- 231

3 Показано, что рН 6 антиген обеспечивает адгезию У ре^и к эпителиальным клеткам и предотвращает бактериальный захват У рев(15 макрофагами, однако не вносит существенного вклада в процесс связывания У рех!п с поверхностью макрофагов

4 Установлено, что рН 6 антиген в зависимости от концентрации стимулирует либо процессы адгезии и дифференцировки макрофагов, либо их аутоагглютинацию, а также обладает митогенной активностью

5 Выявлены селективные преимущества РБаА+ клеток У рея/« в организме теплокровного хозяина, которые проявляются в стабилизации наследования плазмид с генами оперона р.ча и ускорении сроков генерализации инфекции

6 Установлено, что отсутствие протективности рН 6 антигена не связано с недоступностью РзаА+ бактериальных клеток для антител и иммунокомпетентных клеток Отсутствие протективности белка РэаА в совокупности с феноменом положительной селекции РзаА+ бактерий в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только РзаА* штаммов У ре.чПх, что позволяет рассматривать РзаА или кодирующие его гены как перспективную мишень для лабораторной диагностики

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Филиппов А А, Панферцев Е А , Титарева Г М , Бахтеева И.В. и др Исследования рН 6-антигена и других потенциальных адгезинов возбудителя чумы // Молекулярная медицина и биобезопасность Сборник тезисов II-й Международной научной конференции (20-21 октября 2005 г, Москва, Россия) М, 2005, с 275

2 Бахтеева И.В., Титарева Г М , Кравченко Т Б и др Иммуногенная и протективная активности рН 6 антигена Yersinia pseudotuberculosis // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств Материалы VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г, Оболенск, Московская обл ) / Под ред Г Г Онищенко, В В Кутырева, И А Дятлова Протвино Изд-во А-ПРИНТ ЗАО, 2006 - С 137-138

3 Бахтеева И.В., Титарева Г М , Кравченко Т Б и др Биологические эффекты рН 6 антигена Yersinia pestis // Там же - С 112-114

5 Титарева Г М , Бахтеева И.В., Дентовская С В и др Влияние рН 6 антигена на фагоцитоз Yersinia pestis 11 Там же - С 123-124

6 Кравченко Т Б , Левчук В П , Бахтеева И.В. и др Экспрессия рН6 антигена различными штаммами Yersinia pestis в зависимости от условий культивирования // Там же - С 79-80

4 Bakhteeva LV., Titareva G М , Kravchenko ТВ et al Cytotoxic, mitogenic and adhesive activities of Yersinia pestis pH 6 antigen // 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA), S4 1 - American Society for Microbiology, Washington, D С , 2006, B65 - P 55-56

7 Бахтеева И.В., Кравченко T Б , Титарева Г М и др Взаимодействие рН 6 антигена Yersinia pestis с различными типами эукариотических клеток // Проблемы особо опасных инфекций 2007 Вып 94 С 40-44

8 Дентовская С В, Светоч Т Э, Панферцев Е А, Бахтеева И.В. и др Транскомплементация мутаций по отдельным генам psa оперона Yersinia pestis // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ МатериалыУШ Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (25-26 сентября 2007 г, Саратов) / Под ред В В Кутырева. - Саратов ООО «Приволжское издательство», 2007. - С 197-198

9 Ivanov S А, Dentovskaya S V , Svetoch Т Е , Panfertsev Е А, Bachteeva IV. et al Trans-complementation of mutations in the genes of Yersinia pestis psa operon // Program and abstracts of the 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, November 15-18, 2007), p 67

10 Бахтеева И.В., Дентовская CB, Панферцев ЕА и др Вирулентность рН6+ и рН 6~ штаммов Yersinia pestis для мышей // Проблемы особо опасных инфекций 2008 № 1, Вып 95, с 34-36

Список сокращений и условных обозначений

ДСН - додецилсульфат натрия кДа - килодальтон КОЕ - колониеобразующая единица кДНК - комплементарная ДНК

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов

РДП -реакция диффузной иммунопреципитации в гель

РНК - рибонуклеиновая кислота

РРНК - Рибосомальная РНК

ФГУН ГНЦ ПМБ -Федеральное государственное учреждение науки государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии ФМА - форболмиристилацетат

BHI - brain heart mfusion, питательная среда для культивирования микроорганизмов, на основе сердечно-мозговой вытяжки bv - биовар

DMEM - среда Игла, модифицированная Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) - среда для культивирования клеток и клеточных линий животных LB - бульон Луриа-Бертани LD50 -летальная доза для 50% животных

МТТ - (3-(4,5-диметитиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид), NCBI - База данных Национального центра биотехнологической информации США (National Çenter for Biotechnology Information) PB S -фосфатио-со левой буфер

RPMI-1640 - Roswell Park Mémorial Institute - основная среда для культивирования человеческих клеток и клеточных линий

RT-ПЦР - ПЦР в режиме реального времени, определяет экспрессию мРНК

Благодарности

Приношу глубокую благодарность моему научному руководителю д м н А П Анисимову за неизменно высокий интерес к нашим результатам и помощь в формировании научной концепции работы

Приношу искреннюю благодарность заведующей лабораторией микробиологии чумы С В Дентовской за идейное руководство и большую помощь в области молеку-лярно-генетических исследований

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соавторам и сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации

Приношу искреннюю признательность официальным и неофициальным рецензентам настоящей работы за замечания, вопросы и поправки, которые были учтены при ее написании

Подписано в печать 27 08 2008 Формат 60x88 1/16 Объем 1 5 п л Тираж 100 экз Заказ № 728 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г Москва, Ленинские горы, д 1 Главное здание МГУ, к А-102

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Бахтеева, Ирина Викторовна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. АДГЕЗИЯ КАК ЭТАП ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА.

1.2. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПИЛЕВЫХ АДГЕЗИНОВ.

1.3. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ФАКТОРЫ ИНВАЗИИ.

1.4. АНТИФАГОЦИТАРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ 23 ПАТОГЕНОВ.

1.5. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ФАКТОРАХ ПАТОГЕННОСТИ ИЕРСИНИЙ

1.5.1. АДГЕЗИНЫ ЭНТЕРОПАТОГЕННЫХ ИЕРСИНИЙ.

1.5.2. АДГЕЗИНЫ, ИНВАЗИНЫ И АНТИФАГОЦИТАРНЫЕ ФАКТОРЫ 33 Y. PESTIS.

1.5.3. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА рН 6 АНТИГЕНА.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование функциональной активности рН 6 антигена Yersinia pestis с помощью наборов изогенных мутантов"

Актуальность проблемы

Возбудитель чумы, Yersinia pestis, является одним из наиболее вирулентных микроорганизмов и относится к грам-отрицательным бактериям рода Yersinia [Хоулт Дж. с соавт., 1997]. В патогенезе инфекций, вызываемых грамм-отрицательными микроорганизмами, одну из первостепенных ролей играет адгезия бактерий к поверхности клеток хозяина. У иерсиний известно несколько белков, обеспечивающих прикрепление патогена к мембране эукариотических клеток: адгезин YadA, инвазин, белок Ail и рН 6 антиген. рН 6 антиген (пили адгезии, белок PsaA - рН six antigen) является общим для двух видов Yersinia поверхностным белком, синтезирующимся в виде субъединиц с молекулярной массой 15 кДа, которые затем агрегируют с образованием макромолекулярной капсулы [L.E. Lindler etal. 1990]. Экспрессия PsaA кодируется psaEFABC опероном, включающим пять генов: psaA, кодирующий синтез структурной субъединицы; psaB и psaC, кодирующие шаперонный и ашерный белки, обеспечивающие доставку структурных субъединиц из цитоплазмы на поверхность бактериальной клетки; psaE и psaF, отвечающие за температурную и рН-регуляцию синтеза белка PsaA [Yang, Isberg, 1997; Price et al., 1995; Панферцев и др., 1991; Lindler etal, 1990 и др.].

К моменту начала настоящих исследований рН6 антиген наряду с белками внешних мембран Yops, липополисахаридом, V антигеном и др. расценивался как один из обязательных факторов патогенности Y. pestis, так как его экспрессия необходима для вирулентности чумного микроба. Утрата продукции рН6 антигена в результате делеции гена psaA приводили к 200-кратному снижению вирулентности штамма Y.pestis KIM5 [Lindler etal., 1990], а делеции гена psaF - к полной потере вирулентности штамма Y. pestis 231 [Панферцев и др., 1991].

Одним из свойств рН6 антигена, привлекшим к нему внимание исследователей, была зависимость его синтеза от рН и температуры окружающей среды - его продукция начиналась при температуре 37 °С и значениях рН ниже 6,4, близких к рН фаголизосом макрофагов или некротического содержимого абсцессов [Ben-Efraim et al., 1961]. Эксперименты по активной иммунизации лабораторных животных препаратами PsaA показали, что его выраженная способность индуцировать антителогенез не приводила к протективному эффекту при последующем заражении животных Y.pestis [Черепанов и др., 1991; Водопьянов и др., 1995]. Высказывались предположения, что отсутствие протективности может быть связано с особенностями рН регуляции этого фактора: его синтез внутри фаголизосом макрофагов или в центре некротизированных тканей абсцессов делает невозможным контакт покрытых рН6 антигеном бактериальных клеток с антителами и иммунокомпетентными клетками макроорганизма [Анисимов, 2002]. Однако до сих пор не было приведено доказательств этой гипотезы.

Исследования функциональной активности PsaA продемонстрировали, что он обладает целым рядом биологических свойств, каждое из которых может обеспечивать его вклад в вирулентность чумного микроба. PsaA+ клетки Y. pestis и препараты белка PsaA обладали цитотоксической активностью по отношению к перитонеальным [Bichowsky-Slonimsky, Ben-Efraim, 1963] и альвеолярным [Степаншина с соавт., 1993; Водопьянов с соавт., 1995] макрофагам. Однако в экспериментах с мутантным по собственным пилевым белкам штаммом Pseudomonas aeruginosa клонированные гены Y. pestis psaABC восстанавливали доставку цитотоксичного экзоэнзима S в цитоплазму клеток хозяина благодаря восстановлению дефекта пилей, но не кодировали дополнительную цитотоксическую активность [Sundin et al., 2002].

Публиковались данные об адгезивной активности PsaA. Многие исследователи отмечали способность PsaA агглютинировать эритроциты различных видов животных [Bichowski-Slonimski, Ben-Efraim, 1963; Водопьянов, Мишанькин, 1985; Lindler et al., 1990 и др.]. Кроме того, при развитии псевдотуберкулезной инфекции PsaA выполняет функцию адгезина, способствуя связыванию клеток Y. pseudotuberculosis с мембраной эпителиальных клеток [Yang et al., 1996; Marra, Isberg, 1997]. Однако позже были опубликованы данные об отсутствии влияния PsaA на способность Y.pestis связываться с мембраной макрофагов [2004]. В то же время рН6 антиген обладает антифагоцитарной активностью и препятствует захвату клеток чумного микроба макрофагами [Huang , Lindler , 2004].

Таким образом, несмотря на всестороннее изучение функциональной активности PsaA, до настоящего времени нет единого мнения о том, какое из его свойств является определяющим вклад этого фактора в вирулентность Y. pestis. Анализ опубликованных работ показал противоречивость данных о цитотоксической активности и влиянии рН6 антигена на вирулентность Y. pestis. Адгезивные свойства PsaA установлены для Y. pseudotuberculosis, но не для Y.pestis. До настоящего времени не изучены механизмы отсутствия протективной активности PsaA. В связи с вышеизложенным для уточнения роли рН 6 антигена в иммунопатогенезе чумы сохраняется актуальность изучения цитотоксических, митогенных и адгезивных свойств белка PsaA, а также определение его вклада в вирулентность чумного микроба.

Цель исследования - чголучеш!^—н^ьк-данньгх о ^функциональной /> тт ^ —^^ активности рН 6 антигена и его вкдад%#вИрул£нТНость возбудителя чумы. Задачи исследования:

1. Создать на основе штаммов Yersinia spp. коллекцию изогенных нокаутных мутантов по генам оперонаpsa.

2. На основе созданной коллекции провести комплексную сравнительную оценку биологических свойств PsaA+ и PsaA" штаммов Yersinia spp in vitro.

3. Оценить цитотоксические, митогенные и адгезивные свойства белка

PsaA.

4. Из учить протективные свойства PsaA и его вклад в вирулентность Yersinia spp в экспериментах in vivo.

Научная новизна.

Доказано, что PsaA не обладает цитотоксичностью. Установлено, что PsaA не относится к обязательным факторам патогенности Y. pestis. Показано, что PsaA обеспечивает адгезию возбудителя чумы к эпителиальным клеткам. Выявлена митогенная активность PsaA, а также его влияние на адгезию и дифференцировку макрофагов. Получены штаммы Y. pestis со способностью к независимому от рН и температуры среды (конститутивному) синтезу рН 6 антигена и с их помощью проверена и опровергнута гипотеза о том, что отсутствие протективных свойств PsaA определяется особенностями рН-регуляции его синтеза. Выявлено, что PsaA+ клетки Y. pestis в организме теплокровного хозяина имеют селективные преимущества перед PsaA-бактериями.

Практическая значимость. Полученные данные о селективных преимуществах PsaA+ клеток Y. pestis в организме теплокровного хозяина, объясняющие факт выделения в природных очагах чумы только PsaA+ штаммов, являются основанием для разработки диагностических препаратов, направленных на выявление генов, кодирующих рН 6 антиген возбудителя чумы.

В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонированы пять авторских штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с мутациями по генам psaA и psaEFABC , которые будут использованы для изучения роли рН 6 антигена Y. pestis в патогенезе чумы.

Депонированы в GenBank нуклеотидные последовательности четырех генов, кодирующих белки Y. pestis с предполагаемой адгезивной активностью -YP01387-YP01388, YP01708, YP01709-YP01711 и YPO 4044 (№№ доступа EU637081; EU637083; EU637082 и EU637084 соответственно) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez]

Внедрение результатов работы

Результаты исследований послужили основой для составления методических рекомендаций «Оценка влияния рН 6 антигена на адгезию и фагоцитоз Y. pestis» (Оболенск, 2007) и методических рекомендаций «Оценка степени клеточной дифференцировки человеческой моноцитарной линии клеток ТНР-1, стимулированной очищенным препаратом рН 6 антигена» (Оболенск, 2007).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Путинского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. рН 6 антиген Y. pestis не обладает цитотоксической активностью в отношении различных типов эукариотических клеток.

2. рН 6 антиген не является обязательным фактором патогенности Y. pestis. Утрата способности к его продукции не приводит к снижению вирулентности возбудителя чумы, но его присутствие дает селективные преимущества PsaA+ бактериям в организме теплокровного хозяина на ранних стадиях инфекции.

3. Большинство присущих белку PsaA биологических эффектов определяется именно его адгезивной активностью. В зависимости от концентрации PsaA либо стимулирует дифференцировку и адгезию макрофагов, либо вызывает их аутоагглютинацию.

4. Отсутствие протективности рН 6 антигена не связано с его синтезом внутри фаголизосом и некротических очагов и недоступностью для антител и иммунокомпетентных клеток. Отсутствие протективности PsaA в совокупности с феноменом селекции PsaA+ бактерий в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только PsaA+ штаммов Y. pestis, что позволяет рассматривать PsaA или кодирующие его гены как перспективную мишень для лабораторной диагностики.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 2 апреля 2008 года. Материалы диссертации доложены и представлены на 5 международных научных конференциях: II-й Международной научной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (20-21 октября 2005 г., Москва, Россия); VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств» (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.); 9-ом международном симпозиуме по иерсиниям (10-14 октября, 2006, Lexington, Kentucky, USA); межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и, реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (25-26 сентября 2007 г., Саратов); 5th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, November 15-18, 2007).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 56 работ отечественных и 194 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 26 рисунками и 17 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Бахтеева, Ирина Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Доказано, что рН 6 антиген не обладает цитотоксической активностью.

2. Установлено, что утрата способности продуцировать рН 6 антиген не снижает вирулентность Y. pestis 231.

3. Установлено, что рН6 антиген обеспечивает адгезию Y.pestis к эпителиальным клеткам и предотвращает бактериальный захват Y.pestis макрофагами, однако не вносит существенного вклада в процесс связывания Y. pestis с поверхностью макрофагов.

4. Выявлено, что рН 6 антиген в зависимости от концентрации стимулирует либо процессы адгезии и дифференцировки макрофагов, либо их аутоагглютинацию, а также обладает митогенной активностью.

5. Выявлены селективные преимущества PsaA+ штаммов Y.pestis в организме теплокровного хозяина, которые проявляются в стабилизации наследования плазмид с генами оперона psa и ускорении сроков генерализации инфекции.

6. Установлено, что отсутствие протективности рН 6 антигена не связано с недоступностью PsaA+ бактериальных клеток для антител и иммунокомпетентных клеток. Отсутствие протективности белка PsaA в совокупности с феноменом положительной селекции PsaA+ бактерий в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только PsaA штаммов Y. pestis, что позволяет рассматривать PsaA или кодирующие его гены как перспективную мишень для лабораторной диагностики.

БЛАГОДАРНОСТИ

Приношу глубокую благодарность моему научному руководителю д.м.н. А.П. Анисимову за неизменно высокий интерес к нашим результатам и помощь в формировании научной концепции работы.

Приношу искреннюю благодарность заведующей лабораторией микробиологии чумы С.В. Дентовской за идейное руководство и большую помощь в генетической части работы.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность всем моим соавторам и сотрудникам ФГУН ГНЦ ПМБ, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Приношу искреннюю признательность официальным и неофициальным рецензентам настоящей работы за замечания, вопросы и поправки, которые были учтены при ее написании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Каждый из этапов циклического существования Y. pestis обеспечивается множеством уже установленных или еще не известных факторов, которые могут действовать совместно или индивидуально. При этом каждая из бактериальных биомолекул может обладать несколькими активностями, направленными на противодействие различным звеньям системы защиты макроорганизма, однако только в совокупности факторы патогенности обеспечивают "полную" вирулентность Y. pestis, каким бы значительным или незначительным не был их индивидуальный эффект [Анисимов, 2002а, 20026].

К моменту начала наших исследований рН 6 антиген наряду с белками- -внешних мембран (Yop's), V антигеном и другими факторами расценивался как один из обязательных факторов патогенности Y. pestis, опосредующих. ( вирулентность этой бактерии [Perry, Fetherston, 1997; Анисимов, 2002а, 20026; Brubaker, 2006]. рН 6 антиген по совокупности всех сведений о нем * , представляет собой поверхностный адгезин Y. pestis с антифагоцитарными и цитотоксическими свойствами, синтезирующийся при закислении среды [Dubos et al, 1954; Bichowsky-Slomnicki, Ben-Efraim, 1963, Straley et al., 1993]. Оказывая влияние на вирулентность, он, тем не менее, не обладает иммунопротективными свойствами [Водопьянов с соавт., 1995; Titball, Williamson, 2001; Гремякова, 2004]. Анализ опубликованных к моменту начала наших исследований работ по изучению рН 6 антигена показал значительное несовпадение данных по влиянию на вирулентность мутаций по различным генам psa оперона, полученных с использованием отличающихся по вирулентности и выделенных в географически удаленных природных очагах чумы штаммов Y. pestis при различных способах заражения [Lindler et al., 1990; Панферцев с соавт. 1991]. Более того, мы отметили также неоднозначность результатов оценки его цитотоксичности [Bichowsky-Slonimsky, Ben-Efraim, 1963; Водопьянов с соавт., 1995; Sun din et al., 2002]. Были описаны адгезивные свойства рН 6 антигена для Y.pseudotuberculosis [Yang etal., 1996], но не было единого мнения о том, какой адгезин (или адгезины) обеспечивают взаимодействие Y. pestis с клетками хозяина. Не были изучены причины отсутствия у рН 6 антигена протективной активности. Кроме того, в доступной нам литературе мы не нашли публикаций о комплементации данных мутаций и восстановлении вирулентности.

Поэтому в рамках настоящего исследования для определения роли рН 6 антигена в патогенезе чумы мы планировали исследовать цитотоксическую, адгезивную и митогенную активности высокоочищенных препаратов рН 6 антигена, сконструировать изогенные наборы мутантов по отдельным генам, оперона psa на основе аттенуированных и вирулентных штаммов и провести их сравнительную оценку вирулентности , а также уточнить протективность анти-рН 6 антител, с целью определения возможности использования этого фактора патогенности в качестве молекулярной мишени для диагностики, специфической профилактики и терапии чумы.

Чтобы исключить возможное влияние неидентифицированных мутаций на вирулентность Y. pestis, было проведено секвенирование участков хромосомы штамма Y. pestis 231, отвечающих за синтез рН 6 антигена и 16 других предполагаемых фимбриальных адгезинов Y. pestis, и показано, что определенные нами последовательности полностью гомологичны соответствующим фрагментам геномов всех шестнадцати секвенированных к настоящему моменту штаммов Y. pestis.

С помощью сайт-направленного мутагенеза оперона psa были сконструированы изогенные наборы мутантов по генам оперона psa на основе аттенуированных и вирулентных штаммов Y. pestis. Были получены штаммы, мутантные по гену psaA и полному оперону psaEFABC и показано, что оба типа полученных делеций приводили к прекращению синтеза рН 6 антигена. Последующая транс-комплементация мутантов с делецией оперона psaEFABC с помощью рекомбинантных плазмид, несущих либо полный оперон psaEFABC, либо локус структурных генов psaABC, восстанавливала синтез рН 6 антигена. Кроме того, в ходе исследований были подтверждены данные С. Sundin et al. [2002] о том, что psa оперон, лишенный генов psaE и psaF, обеспечивает температуро- и рН-независимый синтез рН 6 антигена в пределах тестируемых температур (от 28 °С до 37 °С) и рН (от 5,8 до 7,2).

На следующих этапах настоящего исследования были изучены цитотоксическая, адгезивная, антифагоцитарная и митогенная активности рН 6 антигена.

Изучение цитотоксических свойств рН 6 антигена показало, что он не обладает собственно цитотоксичностью. Сравнительный анализ "грубых" экстрактов от изогенных PsaA+ и PsaA- штаммов показал, что за их цитотоксичность ответственны другие содержащиеся в клеточном экстракте белки. Однако в высоких концентрациях рН 6 антиген индуцировал агглютинацию эукариотических клеток и тем самым нарушал распластывание и прикрепление клеток к поверхности, что приводило к нарушению условий нормальной жизнедеятельности клеток, и, как следствие, к цитопатическому, (но не цитотоксическому) эффекту.

Было установлено, что при взаимодействии Y. pestis с эпителиальными клетками рН 6 антиген проявляет себя как адгезии, а при взаимодействии с макрофагами - как антифагоцитарный фактор, но не адгезии. Возможно, что вклад рН 6 антигена в связывание клеток Y. pestis с поверхностью макрофагов невелик, так как макрофаг обладает большим количеством рецепторов для неспецифического связывания с патогенами.

В процессе исследованией было обнаружено, что штаммы Y.pestis, утратившие способность к синтезу двух основных фимбриальных белков — F1 и рН 6 антигена - тем не менее не теряют своих адгезивных и антифагоцитарных свойств. Мы полагаем,, что высокий уровень адгезивной и антифагоцитарной активности бактериальной клетки Y.pestis, утратившей способность к синтезу рН 6 антигена и капсулы F1, сохраняется благодаря экспрессии другого(их) фактора(ов), комплементирующего(их) функцию рН 6 антигена. При этом фенотип PsaA+ являлся доминирующим адгезивным и антифагоцитарным фенотипом Y. pestis. Наши результаты совпали с данными F. Liu et а/[2006], которые также подтверждают существование в Y.pestis неохарактеризованного ранее адгезина.

Мы установили, что в зависимости от концентрации рН 6 антиген вначале способствует, а затем препятствует процессам распластывания и дифференцировки макрофагов, необходимым для их дальнейшего функционирования. По нашему мнению, такая двойственная активность играет важную роль в регуляции локального моноцит-медиированного воспаления в месте первичного накопления возбудителя, что обеспечивает его дальнейшее беспрепятственное размножение. рН 6 антиген обладал выраженными митогенными свойствами, сравнимыми с конканавалином А. Вкупе с его способностью агглютинировать эритроциты, это свойство позволяет отнести рН 6 антиген к лектиноподобным веществам бактериального генеза, как и многие из известных бактериальных пилевых и непилевых адгезинов [Finegold etal'., 1968; Goldhar, 1994; Meng etal., 1998; Mitchell etal., 2002]. В дополнение к известным данным относительно гемагглютинирующей активности рН 6 антигена, наши результаты о PsaA-медиированной агрегации макрофагов и моноцитов, предполагают потенциальную роль рН 6 антигена в тромбообразовании и индукции синдрома диссеминированной внутрисосудистой коагуляции, которая является характерной для чумного сепсиса [Finegold et al., 1968].

Завершающим этапом нашей работы была сравнительная оценка вирулентности полученных изогенных штаммов "дикого" типа, вариантов с рН 6~ фенотипом и штаммов с восстановленным синтезом рН 6 антигена зависимым или независимым от температуры культивирования и рН питательной среды на моделях интактных и иммунизированных рН 6 антигеном мышах. Было установлено, что в организме хозяина происходит отбор PsaA+ клеток рекомбинантных штаммов Y. pestis, что свидетельствует о селективных преимуществах бактериальных клеток, продуцирующих этот адгезин. Об определенном преимуществе PsaA+ клеток Y. pestis в организме теплокровных говорит и тот факт, что PsaA+ штамм Y. pestis на ранних сроках инфекции был способен к более эффективному размножению в регионарном лимфоузле по сравнению с PsaA" штаммом, хотя и терял это преимущество на более поздних стадиях инфекционного процесса (см. раздел 6.6).

Тем не менее, утрата способности продуцировать рН 6 антиген не влияла на вирулентность Y.pestis при подкожном заражении мышей. В наших исследованиях на двух изогенных наборах штаммов Y.pestis было показано, что абсолютные величины LD50 и средние сроки жизни зараженных животных не зависели от способности клеток Y. pestis синтезировать рН 6 антиген, даже когда этот синтез не зависел от температуры культивирования и рН питательной среды. В то же время, эксперименты по определению роли рН 6 антигена в патогенезе инфекции, вызванной другим представителем рода Yersinia, Y. pseudotuberculosis, продемонстрировали более высокую вирулентность культуры, выращенной' в условиях синтеза рН 6 антигена.

По нашему мнению, в случае утраты рН 6 антигена, оставшихся факторов патогенности Y. pestis, включая, возможно, и другие пилевые адгезины, может быть достаточно для поддержания величин LD50 на уровне единичных бактериальных клеток. На наш взгляд, в штаммах высоковирулентных патогенов, таких как Y.pestis, именно избыточность механизмов и детерминант вирулентности до какого-то времени компенсирует отдельные мутации, потенциально снижающие способность эффективно размножаться в организме хозяина. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что у умеренно вирулентного энтеропатогена Y. pseudotuberculosis, не обладающего столь широким набором факторов вирулентности, экспрессия оперона psa (настоящее исследование) или cafl [Бывалов с соавт., 2008] не только обеспечивает селективные преимущества в организме инфицированных животных, но и приводит к увеличению вирулентности [Бывалов с соавт., 2008; настоящее исследование] То же касается и аттенуированного штамма Y. pestis KIM5 [Lindler et al., 1990].

В рамках нашей работы была проверена гипотеза о том, что отсутствие протективности рН 6 антигена может быть связана с экспрессией psa оперона только в тех местах, где бактерии недоступны для антител и иммунокомпетентных клеток (фагосома, бубон). Однако полученные нами данные свидетельствуют, что иммунный ответ на рН 6 антиген не защищает мышей от летальной инфекции даже при полной доступности PsaA+ бактерий для контакта с антителами и рецепторами иммунокомпетентных клеток, как это происходит в случае инфицировании животных штаммами,, обладающими способностью к синтезу белка PsaA независимо от рН среды и температуры культивирования. При заражении иммунизированных рН 6 антигеном животных Y. pseudotuberculosis иммунные мыши были более чувствительны к инфекции, чем интактные мыши. Возможно, опсонизация клеток Y. pseudotuberculosis анти-рН 6 антителами потенцирует контакт бактериальной клетки с макрофагом путем взаимодействия антител с Fc рецепторами макрофагов, что, в свою очередь, облегчает "впрыскивание" в макрофаг эффекторных Уор белков с помощью системы секреции III типа и приводит к повышению вирулентности. Во всяком случае, было показано, что отсутствие протективности рН 6 антигена не связано с его недоступностью для антител и иммунокомпетентных клеток.

Завершая обсуждение представленных нами результатов, следует подчернуть, что представленные в настоящей работе данные о необязательности наличия рН 6 антигена в клетках чумного микроба для "полной" вирулентности Y. pestis, а также данные об отсутствии протективного эффекта к рН 6 антигену даже в случае его конститутивного синтеза предполагают неперспективность использования рН 6 антигена в качестве молекулярной мишени для терапии и иммунопрофилактики чумы. Однако, учитывая данные Е.А. Панферцева с соавт. [1991] о полной утрате вирулентности psaF мутантами Y. pestis и отсутствие жизнеспособных psaF мутантов в наших исследованиях, не исключено, что использование гена psaF в качестве мишени для ингибирования вирулентности Y.pestis может быть веема перспективным, но для этого необходимы дополнительные исследования.

С другой стороны, отсутствие протективности рН 6 антигена и селекция PsaA+ клеток Y. pestis в организме теплокровного хозяина объясняют факт выделения в природных очагах чумы только PsaA+ штаммов Y. pestis, позволяет считать рН 6 антиген и кодирующие его гены перспективной мишенью для лабораторной диагностики. Особенно это может быть актуально для очагов чумы, где выделяются бескапсульные штаммы и диагностика по F1 антигену невозможна.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Бахтеева, Ирина Викторовна, Москва

1. Абрамов В.М., Косарев И.В., Васильев A.M. и др. // Проблемы биологиче-ской и экологической безопасности: Международная конференция (Обо-ленск, 22-25 мая 2000 г.). Оболенск, 2000. С. 10.

2. Адо А.Д. Вопросы общей нозологии. М.,1985 - 239 с.

3. Анисимов, А.П.(а)Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1. // Молекулярная генетика. 2002. - № 3. - С. 323.

4. Анисимов А.П., Малахаева А.Н., Черновская Т.В. и др. // Эрдем шинжилгээний бутээл (Байгалийн голомтот халдварт цвчнийг эсэргууцэн судлах тцв). Улаанбаатар, 1999. Дугаар 7. - С. 169-171.

5. Анисимов А.П. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis: Дисс. докт. мед. наук. Саратов, Оболенск, 1999. - 326

6. Анисимов, А.П. (б)Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 2 // Молекулярная генетика. 2002. - № 4. - С. 311.

7. Асеева Л.Е., Мишанькин М.Б., Гончаров Е.К. и др. // БЭБМ. 1995, -№2.-С. 193-195.

8. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - С. 85-104.

9. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса. // Журн. Микробиол. 1999. № 5 - С. 34-9.

10. Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий. // Журн. микробиол. 1994. Приложение - С. 4-13.

11. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я. Бактерионосительство. Екатеринбург, 1996-208 с.

12. Величко Л.Н., Кокушкин A.M. // Материалы научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (16-18 сентября 1997 г.). Саратов, 1997. - Т. 1. - С. 21,

13. Водопьянов С.О., Мишанькин Б.Н. Пили адгезии у Yersinia pestis II Журн. микробиол. — 1985. — .№ 6. — С. 13-17

14. Водопьянов С.О., Попова Г.О., Васильева Г.И. Мишанькин Б.Н. Феномен пилеобразования при взаимодействии Yersinia pestis с макрофагами экспериментальных животных // Журн. микробиол. -1990. № 3. - С. 3-6

15. Водопьянов С.О., Рыбянец А.А., Веркина Л.М. и др. // Журн. микробиол. 1995. - № 5. - С. 26-29

16. Водопьянов С.О., Атарова Г.Т., Олейников И.П. и др. Фибронектинсвязывающая способность Yersinia pestis II Журн. микробиол. 1993. - № 3. - С. 6-12.

17. Галактионов В.Г., Хромых Л.М., Василенко Р.Н. и др. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции (Волгоград, 21-22 октября 1992 г.): Тез. докл. Волгоград, 1992. - С. 85

18. Гремякова Т.А. Структурно-функциональная вариабельность антигенов Yersinia pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов: Дисс. . докт. мед. наук. Москва, 2004. - 320 с.

19. Домарадский И.В. Чума. М.: Медицина, 1998. - 176 с.

20. Захаров А.И. // 12 межреспубликанская научно-практическая конференция противочумных учреждений Средней Азии и Казахстана по профилактике чумы. Алма-Ата, 1985. - С. 16-18

21. Каграманов B.C., Асеева Л.У., Варивода Т.Ю. // Журн. микробиол. -1999. -№3.- С. 13-16.