Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость липополисахарида Yersinia pestis
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость липополисахарида Yersinia pestis"
На правах рукописи
ДЕНТОВСКАЯ СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЛИПОПОЛИСАХАРИДА YERSINIA PESTIS
03.02.03 - микробиология 03.01.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
1 5 НОЯ 2012
Москва - 2012
005055015
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор Анисимов Андрей Павлович доктор химических паук, профессор Книрель Юрий Александрович
Официальные оппоненты:
Несвижский Юрий Владимирович - доктор медицинских наук, профессор, декан медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоц-развития России
Царев Виктор Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Минздравсоцразвития России
Вертиев Юрий Викторович - доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России
Ведущая организация:
Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Защита состоится «06» декабря 2012 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора по адресу 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10
Автореферат разослан «_»_2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук О. Ю. Борисова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
В настоящее время полидетермшшровшшость вирулентности патогенных микроорганизмов является общепризнанной. При этом каждая из биомолекул (факторов патогенности) может обладать несколькими активностями, направленными на преодоление различных звеньев системы защиты хозяина. Реализация патогенных свойств возбудителя чумы в организме восприимчивого хозяина требует присутствия у Yersinia pestis целого набора факторов патогенности различной функциональной направленности и систем регуляции, обеспечивающих их координированную экспрессию (Burrows T.W., 1963; Мишанъкин Б.Н., 1987; Brubaker R., 1991; Репу В., Fetherston J.D., 1997; Анисимов АЛ., 2002). Детальный анализ каждого из этих факторов лежит в основе системного подхода при изучении патогенности Y. pestis и разработки эффективных методов профилактики и лечения чумы.
Один из "классических" факторов патогенности грамотрицательных бактерий - липополисахарид (ЛПС, эндотоксин) - обладает целым рядом свойств, традиционно связываемых со способностью бактерий к размножению в организме хозяина (Rietschel Е.Т. et al., 1996; Raetz C.R. et al., 2002; Brandenburg K., Wiese R., 2004). ЛПС расположен на поверхности грамотрицательных бактерий и участвует во взаимодействии с различными биологическими системами, включая иммунную систему. ЛПС Y. pestis обладает всеми классическими свойствами эндотоксинов, включая: токсичность для лабораторных животных; пирогенность; способность вызывать у кроликов местный или генерализованный феномен Швартцмана (Albi-zo J.M. et al., 1970). ЛПС обеспечивает устойчивость Y. pestis к бактерицидному действию катионных антимикробных пептидов (КАМП) и нормальной человеческой сыворотки (НЧС), определяет функциональную активность другого факюра патогенности - активатора плазминогена Pia (Bengoechea J.A. et al., 1998; Kukkonen M. et cü., 2004; Porat R. et al., 1995; PouUlot F. et al., 2005). Особешгостью ЛПС Y. pestis является вариабельность его структуры, являющаяся защитным механизмом, препятствующим распознаванию иммунной системой (Гремякова ТА.; Montminy S.W. et а!., 2006). Существует мнение, что "сам патогенез чумы в любой ее форме представляет собой собственно стадии развития" инфекционно-токсического шока (Дмитровский A.M., 1994).
Основные сведения о ЛПС Y. pestis получены в последние годы. Установлена полная структура олигосахарида кора ЛПС Y.pestis (Vinogradov E.V. et al., 2002). Обнаружена зависимость строения и биологических свойств липидной части ЛПС (липидаА) от температуры культивирования бактерии (Kawahara К. et al., 2002). Показана роль двухкомпонентной системы передачи сигналов PhoPQ в контроле за синтезом кора ЛПС Y. pestis (Hitchen P.G. et al., 2002) и выявлено, что включение в липид А катионного моносахарида 4-амино-4-дезоксиарабинозы, обеспечивающего устойчивость возбудителя чумы к полимиксину В (ПМВ), моделирующего действие КАМП, также находится под контролем системы PhoPQ (Rebeil R. etal, 2004).
В серии экспериментов, проведенных до начала настоящего исследования на ограниченном наборе штаммов, нами выявлена взаимосвязь структуры ЛПС с
чувствительностью к бактерицидному действшо ПМВ и НЧС у иодвидов Y. pestis, различающихся по эпидемиологическому значению и выращенных при температурах тела млекопитающего (37 °С), блохи (25 °С) или животных в период зимней спячки (6 °С). В то же время установление точной роли отдельных структурных компонентов ЛПС в обеспечении устойчивости Y. pestis к КАМП и НЧС и их вклада в вирулентность штаммов требовали дальнейшего изучения. Оставались невыявленными и неохарактеризованными гены, участвующие в биосинтезе кора ЛПС Y. pestis, - потенциальные молекулярные мишени для терапии чумы.
Возбудитель чумы утратил способность к синтезу О-боковых цепей ЛПС, образуя R-форму ЛПС. Наиболее вероятным предшественником Y. pestis является Y. pseudotuberculosis серовара О:lb (Skurnik М. et al., 2000). По строению генома и антигенным свойствам Y. pseudotuberculosis и Y. pestis имеют значительное сходство, однако если псевдотуберкулез - это преимущественно кишечная инфекция с относительно легким течением, то чума является острой генерализованной инфекцией с высокой летальностью (Brubaker R., 1991).
К моменту начала наших исследований были установлены структуры О-полисахаридов лишь некоторых сероваров Y. pseudotuberculosis. Однако строению кора и липида А этого микроорганизма уделяли мало внимания (Bruneteau М., Minka S., 2003; Hoist О., 1999). Строение липида A Y. pseudotuberculosis изучали с помощью плазменной и лазерной масс-спектрометрии (Therisod Н. et al., 2002), но полученные результаты не были подкреплены данными химического анализа и представляются ненадежными. Изучение строения кора ЛПС К pseudotuberculosis современными методами до начала наших исследований не проводили. Для выяснения возможных причин принципиальных различий в вирулентности Y. pestis и его менее вирулентного прародителя, Y. pseudotuberculosis, требовалась сравнительная оценка структуры их ЛПС.
Цель исследования - получение новых сведений о структурной организации и генетическом контроле биосинтеза ЛПС Y. pestis, функциональной значимости его структурных компонентов в иммуно- и патогенезе чумы, конструирование экспериментальных вакцинных штаммов со сниженной реактогенностью.
Задачи исследования
1. Установить структуры ЛПС дикого типа представителей различных внутривидовых групп Y. pestis и прародителя возбудителя чумы - Y. pseudotuberculosis.
2. Изучить щтзкин-индуцирующую активность и летальную токсичность ЛПС штаммов Y. pestis — представителей различных внутривидовых групп, а также их устойчивость к бактерицидным катионным пептидам и литическому действию системы комплемента
3. Провести in silico анализ опубликованных полногеномных последовательностей Y. pestis и выявить гены, предположительно отвечающие за биосинтез ЛПС.
4. Создать коллекцию изогенных штаммов Y. pestis, образующих различные структурные варианты ЛПС, и на их основе получить эффективную систему для комплексной сравнительной оценки биологических свойств возбудителя чумы, опосредованных ЛПС.
5. Выявить роль конкретных компонентов ЛПС и температурозависнмых вариаций в структуре ЛПС в патогенезе чумы.
6. Определить потенциальные молекулярные мишени для разработки высокоспецифичных и эффективных препаратов для терапии чумы.
7. Обнаружить клеточный рецептор для бактериофага фА1122.
8. Разработать методологию конструировшшя экспериментальных вакцинных штаммов со сниженной реактогенностъю с учетом полученных данных о молекуляр-но-генетических механизмах образования ЛПС Y. pestis.
Научная новизна
В ходе исследований уточнена структура ЛПС К pestis subsp. pestis и установлено, что глицин присоединяется в одно из свободных положений остатка LD-Hepl. Выявлено, что при повышенной температуре (37 °С) происходит замена одного из остатков Ara4N на фосфатную группу с образованием пирофосфатной группы, то есть повышение температуры культивирования К pestis сопровождается не только уменьшением положительного заряда на поверхности клетки за счет снижения содержания катионного моносахарида Ara4N в липиде А, но и увеличением отрицательного заряда путем дополнительного фосфорилирования. Полученные данные расширяют представления о структурном разнообразии и характере температурозависнмых вариаций ЛПС Y. pestis.
Впервые определена структура ЛПС представителей Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica, altaica, hissarica и ulegeica и показано, что ЛПС Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica, altaica и hissarica отличается от ЛПС Y. pestis subsp. pestis и ЛПС subsp. microtus bv. ulegeica отсутствием DD-Hep в любой из гликоформ олигосахарида.
Впервые установлена полная структура олигосахарида кора ЛПС представителей четырех сероваров Y. pseudotuberculosis (0:1а, О: lb, 0:2b, 0:2с, 0:3, 0:4Ь) и обнаружены температурозависимые вариации строения кора и липида А. Сопоставление с ранее полученными данными для ЛПС Y. pestis не выявило существенных различий в строении и вариациях кора, тогда как высокотемпературные варианты липополисахарида К pseudotuberculosis отличались включением в состав липида А пальмитоильной группы, отсутствующей у возбудителя чумы.
Определены новые структуры и уточнены ранее предложенные структуры О-полисахаридов Y. pseudotuberculosis, в результате чего впервые получены данные о строении всех сероваров, входящих в серогруппы от 0:1 до 0:4. Уточнения коснулись положений замещения моносахаридов, находящихся в узле разветвления О-полисахаридов. Для серовара 0:3 установлена структура биологического повторяющегося звена, полимеризацией которого осуществляется синтез высокомолекулярного О-полисахарида. Сопоставление структур О-полисахаридов серог-рупп 0:1-0:4 подтвердило роль конфигурации 3,6-дидезоксигексозы в сероспеци-фичности бактерий и выявило сходства и различия в строении основной цепи О-полисахаридов различных сероваров Y. pseudotuberculosis.
Показано, что культивирование при температуре 6 °С, характерной для грызунов в период зимпей спячки, приводит к повышению чувствительности возбудителя чумы к бактерицидному действию катионных пептидов и сыво-
ротки. Изменение чувствительности к факторам врожденного иммунитета сопровождается изменением структуры ЛПС.
С помощью сайт-направленного мутагенеза сконструированы наборы изоген-ных мутантов на модели аггенуированного штамма Y. pest is по 14 одиночным генам биосинтеза ЛПС: waaE (YP00054), waaA (YP00055), waaC (YP00056), waaF (YP00057), wabC (YP00186), ivabD (YP00187), waaQ (YP00416), waaL (YP00417), hldE (YP00654), IpxM (YP02063), arnT (YP02421), IpxP (YP03632), wecA (YP03866), yhjW (YP04013), а также по четырем парам генов: YP00186/YP00417 (wabChvaaL), YP00187/YP00417 (wabD/waaL), YP00186/YP00187 (wabC/wabD) и YP00416/YP00417 waaQhvaaL)\ на модели вирулентного штамма Y. pestis по 6 генам биосинтеза ЛПС: waaE (YP00054), wabD (YP00187), waaQ (YP00416), waaL (YP00417), hldE (YP00654), IpxM (YP02063). С использованием масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением установлено строение ЛПС генерированных мутантных штаммов Y. pestis с единичными мутациями по генам гликозилтрансфераз и ацилтрансфераз и четырех двойных мутантов по генам гликозилтрансфераз в каждом штамме. Полученные данные позволили выяснить последовательность переноса моносахаридов при сборке олигосахарида кора ЛПС.
Впервые выявлены взаимосвязи между отдельными структурными элементами ЛПС и биологическими свойствами Y. pestis, раскрывающие новые молекулярные механизмы патогенеза чумы. Показано, что структура ЛПС определяет устойчивость к действию полимиксши В и системы комплемента, а поэтапное укорочение кора ЛПС ведет к снижению и затем исчезновению фибринолитической и плазмокоагулазной активностей Pia, тогда как уменьшение степени ацилирования липида А не влияет на их проявление. Установлено, что мутанты Y. pestis с двумя и менее остатками Сахаров в коре ЛПС не только чувствительны к КАМП и мем-брано-атакующему комплексу системы комплемента, но и авирулентны для лабораторных животных. Эти данные позволяют предложить гены waaC, hldE и waaA и/или кодируемые ими белки в качестве потенциальных молекулярных мишеней для ингибиторов вирулентности Y. pestis.
Установлено, что рецептор для фага <рА1122 включает остатки НерП и Не-pl, а также остаток Glc, связанной с HepI, присоединенные к липиду A Y. pestis через Kdo/Ko.
Показано, что ДIpxM вариант высоковирулентного штамма, способного вызвать клинически выраженное заболевание при инокуляции малого числа бактериальных клеток, может индуцировать эндотоксический шок, несмотря на образование менее токсичных форм ЛПС, в то время как менее вирулентные бактерии для проявления этой активности нуждаются в синтезе высокотоксичных форм ЛПС. IpxM мутация приводила к снижению остаточной вирулентности аттенуиро-ваш1ых штаммов Y. pestis, но не снижала вирулентность штамма Y. pestis 231 дикого типа. IpxM мутанты вакцинного штамма EV обладали пониженной реакто-генностью, сочетавшейся с повышенной протективностью.
Теоретическая значимость
Определена функциональная значимость генов, ответственных за биосинтез ЛПС чумного микроба, и выявлены молекулярные патогенетические механизмы действия ЛПС У. pestis. Научно обоснована и разработана концепция поэтапной сборки ЛПС чумного микроба из остатков Сахаров и жирных кислот.
Полученные новые данные о структуре ЛПС У. pestis, генетической детерминированности его биосинтеза и влиянии изменений его структуры на биологические свойства бактерий позволили предложить потенциальные молекулярные мишени для поиска ингибиторов вирулентности возбудителя чумы, открывающие новые перспективы в разработке методов противодействия этому особо опасному патогену.
Выявлена степень филогенетической близости ферментов биосинтеза ЛПС У. pestis гомологичным ферментам близкородственных (Yersinia spp.) и отда-леннородственных бактерий (Serratia proteamaculans, Klebsiella pneumoniae, Erwinia carotovora, Burkholderia spp., Photorhabdus luminescens, Legionella pneumophila, Shigella dysenteriae, Escherichia coli и Salmonella enterica), что расширяет представления о роли горизонтального переноса генов в ходе эволюционирования микроорганизмов.
Практическая значимость
Сконструировано два набора изогенных мутантов чумного микроба, отличающихся по степени редуцированности ЛПС, которые позволяют получать достоверные данные о роли отдельных структурных компонентов ЛПС У. pestis в проявлении патогенных и иммуногенных свойств возбудителя чумы. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск Московской обл.) депонировано 24 штамма У. pestis.
Разработана методология направленного конструирования лишенных маркеров антибиоттсоустойчивости неревертирующих AlpxM мутантов У. pestis, сочетающая прямой сайт-направленный мутагенез, клонирование мутантной аллели ЫрхМ-.cat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in •vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск Московской обл.) депонированы: штамм Е. coli DH5-Xpirl рС VD442-A//wA/: : cat, продуцирующий суицидный вектор pCVD442-ДlpxM::cat, и донорный штамм К coli S17-lpir/pCVD442-AlpxM::cat, предназначенный для конъюгативной передачи суицидного вектора при создании кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной степенью ацилирования липида А на основе любых атгенуированных штаммов У. pestis.
Внедрение результатов исследования
В базе данных Bacterial Carbohydrate Structure DataBase (Bacterial CSDB) version 3 DELTA (http://csdb.glycoscience.nl/bacterial/mdex.html) депонировано 50 структур молекул ЛПС Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. Номера доступа к структурам (Structure IDs): 101, 673, 675, 3722, 3723, 3724, 3725, 3726, 3727, 3728, 3729, 3730, 3731, 3914, 4230, 6782, 6783, 6784, 7353, 7354, 7355, 7356, 7357, 7358, 7359,
7360, 7361, 7362, 7439, 7567, 7568, 7569, 7668, 7669, 7670, 7671, 7672, 7691, 8397, 8401, 8402, 8403,8647,8648, 8649, 8650, 8651, 8652, 8653,8654.
В базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geabank/) депонировано девять нуклеотидных последовательностей различных аллелей гена wabC из штаммов подвида microtus Y. pestis (регистрационные номера: JX262141, JX262142, JX262143, JX262144, JX262145, JX262146, JX262147, JX262148, JX262149) и одна - гена ail из штамма 1146 У. pestis microtus bv. caucasica (регистрационный номер GenBank FJ447341).
Разработанные методические приемы, сконструированные плазмиды, штаммы и выделенные из них препараты ЛПС в настоящее время применяются в микробиологических, генетических, молекулярно-биологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск, Московская обл.), ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб", Ростовского НИПЧИ и ФИБХ РАН.
Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного естественно-научного института, кафедры молекулярной биологии Филиала Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова в г. Пущино и аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработанный комплекс методических приемов и сконструированная коллекция изогенных штаммов У. pestis, отличающихся по степени редуцированности ЛПС, являются основой для проведения микробиологического, биохимического, биофизического и генетического изучения роли ЛПС в патогенезе и иммуногенезе чумы.
2. ЛПС - основной полифункционалъный фактор патогенности Y. pestis, структура которого определяет способность к уклонению от распознавания иммунной системой организма хозяина, устойчивость к сыворотке крови и антимикробным катионным пептидам, ферментативную активность фактора распространения - активатора плазминогена, а также (после неконтролируемого размножения Y. pestis в организме хозяина) развитие эндотоксического шока и гибель, необходимую для дальнейшей передачи Y. pestis блохами.
3. Наличие полной структуры кора ЛПС (восемь остатков Сахаров) необходимо для максимальной ферментативной активности активатора плазминогена. При количестве остатков в составе олигосахарида кора менее пяти фибриноли-тическая и плазмокоагулазная активности не выявляются.
4. Полный рецептор фага фА1122 включает остатки НерИ и HepI, а также остаток Glc, связанной с HepI, присоединенные к липиду A Y. pestis через Kdo/Ko.
5. Отсутствие в клетках IpxM мутанта вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ гексаацилированных молекул ЛПС вызывает сочетанное снижение остаточной вирулентности и повышение протективной активности. По сравнению с исходным штаммом, величина LD50 мутанта EVAlpxM при подкожном заражении мышей возросла в 4,6 раз, а протективная активность выросла на 2 порядка.
6. Разработанный комплекс методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов обеспечивает контролируемое конструирование лишенных маркеров лекарственной устойчивости IpxM мутантов Y. pestis - кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью.
Апробация работы
Диссертация апробирована на межлабораторной научной конференции ФБУН ГНЦ ПМБ 13 июля 2012 г. протокол № 25.
Основные положения диссертациогаюй работы доложены и представлены на 28 конгрессах, симпозиумах и конференциях, в том числе на 8th, 9th, 10th International Symposiums on Yersinia (2002, Turku, Finland; 2006, Lexington, USA; 2010, Recife, Brazil); 2-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (2003 г., Москва); 104th, 105й1 и 106й1 ASM General Meetings (2004, New Orleans, USA; 2005, Atlanta, USA; 2006, Orlando, USA); VI-й, VII-Й, VIII-ой и IX-ой Межгосударственных научно-практических конференциях государств-участников СНГ (2005, Волгоград; 2006 г., Оболенск, Московская обл.; 2007 г., Саратов; 2008 г., Волгоград); Международных конференциях "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (2004 г., 2005 г., Санкт-Петербург); Международной конференции "Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний" (2004 г., "Сосновка", Новосибирская область, Россия); INTAS strategic workshop, Bacterial glycoconjugates in prevention and diagnostics of emerging pathogens: 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates (2004, Wroclaw, Poland); 2006 NIAD Research Conference (2006, Opatija, Croatia); Пятой научно-практической конференции "Инфекционные болезни и антимикробные средства" (2007 г., Москва); Annual Conference of the Society for Glycobiology. (2007, Boston, USA); 50th AB-SA Annual Biological Safety Conference (2007, Nashville, USA); Vaccine Congress (2007, Amsterdam, The Netherlands); IV-ой Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (2008 г., Санкт-Петербург); Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (2008 г., Минск); XXIV International Carbohydrate Symposium (2008, Oslo, Norway); 1st annual Biosafety Association for Central Asia and Caucasus conference "Biosafety and Bacterial-Viral Zoonotic Diseases" (2009, Almaty, Kazakhstan); 46th Oholo Conference "The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms - Mechanism of Virulence and Novel Medical Countermeasures" (2009, Eilat, Israel);: П-ой научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасное™» (2010 г., Оболенск, Московская обл.); Ш-ей Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (2011 г., Санкт-Петербург); IV-ом Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекциошшм болезням (2012 г., Москва).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 65 научных работ, в том числе, 18 - в рецензируемых изданиях (из них 6 - в отечественных, 6 - в международных и 6, цитированных в международных базах PubMed, Scopus); 2 главы - в коллективной международной монографии; 7 - в других научных изданиях; 3 - в сборниках научных трудов; 35 - в материалах конференций.
Объем и структура диссертации
Работа состоит из введения; 1 главы обзора литературы; 7 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований, экспериментальную часть, заключение; выводов; списка литературы, включающего 537 цитируемых работ (46 работ отечественных и 491 работа зарубежных авторов). Общий объем диссертации составляет 311 страниц. Текст иллюстрирован 21 таблицей и 31 рисунком.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования
Материалы
Объектами исследования служили 100 штаммов Y. pestis, 16 штаммов Y. pseudotuberculosis, 6 штаммов Y. enterocolitica, 5 штаммов Escherichia coli, полученных из коллекций Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока, Ставропольского НИПЧИ и РосНИПЧИ "Микроб", 26 плазмид, три линии клеток: мышиная макрофагоподобная линия J774.1A, человеческая промиелоидная линия U937 и линия мышиных фибробластов L929, а также мыши нелинейные породы Swiss Webster, линейные BALB/c (19 ± 2) г и морские свинки (275 ± 25) г.
В работе использовали бактериофаги диагностические чумные J1-413C, Покровской, произведенные в РосНИПЧИ "Микроб", и <рА1122, полученный из Унивеститета г. Хельсинки, Финляндия.
Микробиологические методы
Бактерии выращивали на жидких или плотных питательных средах Luria Bertani и Хоттингера с добавлением необходимых антибиотиков . В экспериментах по анализу адсорбции бактериофагов и определению эффективности бляшкообразования для выращивания бактериальных жидких культур использовали триптиказо-соевый бульон. Для выделения ЛПС штаммы выращивали с аэрацией при температурах 6 °С, 25 °С или 37 °С для Y. pestis и температурах 22 °С или 37 °С для Y. pseudotuberculosis в ферментере New Brunswick Scientific с рабочим объемом 10 л в жидкой среде следующего состава: гидролизат рыбной муки (20-30 г/л), дрожжевой автолизат (10 г/л), глюкоза (3-9 г/л), К2НР04 (6 г/л), КН2Р04 (3 г/л) и MgS04 (0,5 г/л) при рН 6,9-7,1.
Определение основных фенотипических характеристик исследованных штаммов проводили согласно МУ 3.3.1.1113-02 "Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба" (2002) или "Наставлению по изучению свежевыделен-ных штаммов возбудителя чумы" (Классовский JI.H. и др., 1972). Определение фиб-ринолишческой и плазмокоагулазной активностей проводили с использованием до-
юрской плазмы человеческой крови в соответствии с рекомендациями (Руководство но профилактике чумы, 1972) при температуре 37 °С и 28 °С, соответственно.
Определение МИК додецил сульфата натрия (ДСП), новобиоципа, поли-миксина В (все - AppliChem GmbH, Germany), генциан-виолета и мастопарана (Sigma, Germany) проводили, как описано ранее (Hitchen P.G. et al., 2002). Бактерицидные свойства сывороток определяли по опубликованному протоколу (Barnes M.G. etal. 2001).
Анализ адсорбции бактериофага фА1122 и определение эффективности бляшкообразования проводили по Kiljunen М. et al. (2011). Для анализа кинетики адсорбции и устранения эффекта обратимой адсорбции использовали протокол, предложенный ранее (Adams М.Н., 1959). Для определения природы фагового рецептора бактериальные клетки обрабатывали протеиназой К и перйодатом натрия.
Биохимические методы
Препараты ЛПС из сухой бактериальной массы диких и мутантных штаммов Y. pestis экстрагировали смесью фенол-хлороформ-петролейный эфир (Galanos С. et al., 1969) и очищали последовательным ферментативным расщеплением нуклеиновых кислот и белков с повторным ультрацентрифугированием (105000 х g, 4 ч). Содержание белка в препаратах ЛПС оценивали методом гель-электрофореза, а присутствие нуклеиновых кислот определяли, как описано ранее (Knirel Y.A. et al., 2005).
Препараты ЛПС из сухой биомассы штаммов Y. pseudotuberculosis выделяли методом экстракции горячим водным фенолом (Westphal О., Jann К., 1965) и очищали ультрацентрифугированием (105000 х g, 4 ч). Мягким кислотным гидролизом ЛПС разделяли на углеводную и липидную компоненты. Углеводную часть (О-полисахарид, коровый олигосахарид или кор с присоединенным повторяющимся звеном О-полисахарида) фракционировали колоночной хроматографией на геле Sephadex G-50.
Бпофгаические методы
Масс-спектры ион-циклотронного резонанса с ионизацией элекгрораспыле-нием и Фурье-преобразованием (ESI FT-ICR MS) получали, регистрируя анионы, как описано ранее (Knirel Y.A. et al., 2005), на приборе ApexII (Bruker Daltonics, Биллерика, Монтана, США), оснащенном активно-экранируемым магнитом 7Т и источником Apollo. Масс-спектры получали и обрабатывали с использованием стандартных экспериментальных последовательностей, предоставленных производителем. Точность определения массы проверяли с помощью внешней калибровки. Образцы (-10 нгмкл""1) растворяли в смеси изопропанола, воды и триэти-ламина (50:50:0.001, о/о/о) и распыляли со скоростью потока 2 мклмин"1. Напряжение на входе в капилляр составляло 3,8 кВ, температура газа-осушителя 150 СС. Для облегчения отнесения сигналов в масс-спектрах (Knirel Y.A. et al., 2008) использовали диссоциацию на капиллярном скиммере за счет увеличения напряжения на выходе из капилляра от -100 В до -350 В. Спектры, содержавшие сигналы ионов с различным зарядом, подвергали деконоволюции по заряду, и приведенные значения представляют собой массы моноизотопных нейтральных молекул.
Для установления строения О-полисахаридов использовали двумерную корреляционную ЯМР-спектроскопию ROESY, выявляющую пространственную близость протонов, и спектроскопию 'Н/13С НМВС, коррелирующую протоны и атомы углерода, разделенные двумя и тремя связями. Оба метода позволяют коррелировать атомы, принадлежащие различным моносахаридным остаткам, то есть являются инструментами анализа как связей между моносаха-ридными остатками, так и их последовательности. Предварительное отнесение сигналов ЯМР (1)Н и (13)С проводили с помощью двумерных экспериментов COSY, TOCSY и (1)Н/(13)С HSQC.
Иммунологические методы
Клеточные линии культивировали в среде DMEM, содержащей 2 мМ глутамина и 10 % фетальной сыворотки, при температуре 37 °С в присутствии 5 % С02. Для индукции TNF-a in vitro и in vivo препараты ЛПС, вьщеленные из изучаемых штаммов, добавляли к монослою клеток J774A.1 и U937 или вводили с актиномицином Д (10 мкг/мышь) внутрибрюшинно 8-10 недельным мышам линий BALB/c. Цитоток-сическую активность TNF-a в супернатанте стимулированных клеток J774.A1, U937 и сыворотке мышей оценивали методом иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы Bender MedSystems и как описано ранее (Ruff М., Gifford J, 1980).
Молекулярно-биолопгческие методы
Для получения препаративных количеств плазмидной ДНК из штаммов Е. coli и Y. pestis использовали щелочной метод (Birnboim Н.С., Doly I., 1979). Рестрикционно-лигазную технику выполняли по общепринятым методикам (Maniatis Т. et al. 1982). Передачу рекомбинантных плазмид в штаммы Е. coli осуществляли "кальциевым" методом трансформации (Cohen S.N., Chang A.C.Y., 1973), а в клетки Y. pestis методами криотрансформации (Кокушкин A.M., 1995) или электростимулируемой трансформации (Еремин С.А. и др., 1991). ПЦР проводили по стандартным методикам. Использовали реактивы и ферменты производства MBI "Fermentas" (Литва).
Поиск генов, ассоциироваштк с ЛПС, проводили с использованием анно-тировшшых геномных последовательностей штаммов Y. pestis (http://v\wv.ericbrc.org/porta!/cric/yersiniapestis?¡d=enteropathogens&subid=yersinia pestis). При отсутствии соответствующей информации в качестве шаблонов для поиска ортологов в геномной последовательности штамма Y. pestis С092 (Parkhill J. et al., 2001) с помощью сетевого сервиса BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) использовали гены других бактерий, функции которых установлены ранее. Для обозначения генов применяли номенклатуру для генов биосинтеза бактериальных полисахаридов (Reeves P.R., 1996).
Дизайн праймеров осуществляли с использованием программы Vector NTI 8.0 (InforMax, Inc., США). Первичный компьютерный анализ последовательностей ДНК и аминокислот, а также сравнение полученных результатов с известными нуклеотидными и аминокислотными последовательностями осуществляли с помощью программы Bionumerics 5.1 (Applied-maths, Inc., Бельгия).
На модели аггенуированных штаммов Y. pesíis мутанты с делециями внутри рамок считывания хромосомных генов получали с помощью аллелышго обмена с использованием кассет устойчивости к канамицину (ген устойчивости к не-омицину, nptll) или хлорамфениколу (cat), ограниченных короткими фланкирующими областями, гомологичными целевой ДНК Y. pesíis (Datsenko К., Wanner В., 2000). Хромосомные делеции внутри рамок считывания генов ЛПС вирулентного штамма Y. pesíis 231 проводили с использованием набора плазмид, сконструированных на основе суицидного вектора pCVD442 (Donnenberg M.S., Kaper J.B., 1991). Комплементацию ЛПС-мутантов осуществляли с помощью плазмид на основе сконструированного низкокопийного экспрессиругощего вектора pAE-gfp.
Мутант вакцинного штамма Y. pesíis EV линии НИИЭГ, в котором кодирующая последовательность гена IpxM была заменена на кассету устойчивости к хлорамфениколу, получали методом одноэтапной инактивации хромосомных генов с помощью ПЦР-продукгов (Datsenko К., Wanner В., 2000). Фрагмент хромосомы созданного штамма, содержащий мутантную аллель A¡pxM::cat, ам-плифицировали в ПЦР и клонировали в суицидный вектор pCVD442, предварительно гидролизованный Smal. Созданную рекомбинантную плазмиду рС VD442-A//WM- : cat клонировали в штамме К coli DH5ar Apir, а затем вводили в штамм Е. coli S17-1 Apir для последующего конъюгативного переноса в реци-пиентные штаммы иерсиний. После гомологичной рекомбинации интегрированный суицидный вектор удатяли и селективный отбор клонов Y. pestis EV НИИЭГ с инактивированным геном и кассетой антибиотикоустойчивости проводили на агаре Хоттингера в присутствии 5 % сахарозы. Удаление кассеты устойчивости к хлорамфениколу в инактивированном гене проводили с помощью плазмиды рСР20, которую затем элиминировали из полученного штамма Y. pestis EV НИИЭГ bdpxM, культивируя штамм при температуре +40 °С.
Для демонстрации того, что все подвергнутые мутациям фрагменты ДНК имеют ожидаемую структуру, использовали ПЦР. Для определения нуклеотвдной последовательности генов IpxM, IpxMv.cat на этапах конструирования и участка ДIpxM полученного штамма Y. pestis EVAIpxM, а также гена wabC (YP00186) из девяти штаммов Y. pestis subsp. microtus использовали прямой метод секвенирова-ния без предварительного клонирования геномных фрагментов ДНК.
Биологические методы
Очистку популяций штаммов Y. pestis от клонов, вирулентность которых могла снизиться в процессе хранения в глицериновых стоках или в результате генно-инженерного вмешательства, проводили путем пассажа на мышах (Самойлова C.B., 1991).
Легальную токсичность препаратов ЛПС определяли титрованием на ип гакт-ных и актиномицин Д-сенсибилизированных мышах (Дентовская C.B. и др., 2008).
Для определения вирулентности штаммов У. pestis при подкожном заражении бактерии выращивали в течение 48 ч при температуре 28 "С. Заражение проводили введением под кожу бедра десятикратных разведений культуры Y. pestis в изотоническом растворе NaCI (0,9 %) в объеме 0,2 мл на животное.
Определение остаточной вирулентности проводили в соответствии с МУ 3.3.1.1113-02 "Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба" (2002). Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 сут. Погибших и выживших животных вскрывали и подвергали бактериологическому исследованию.
Для определения протективной активности (ImD50) беспородных белых мышей иммунизировали подкожно суспензиями двухсуточных культур испытуемых штаммов Y. pestis, приготовленных в 0,9 %-ном растворе NaCl, в дозах от 105 до 10® КОЕ на животное. В качестве контроля во всех экспериментах по иммунизации животных использовали маточную культуру вакцинного штамма EV линии НИИЭГ (ФГБУ Научный центр экспертизы средств медицинского применения), используемую для приготовления коммерческой вакцины чумной живой сухой. Через 21 сут после иммунизации мышей подкожно заражали аналогично приготовленной суспензией штамма Y. pestis 231 из расчета 7 х 10s LD50 (4,2 х Ю6 КОЕ) на животное. Наблюдение за мышами осуществляли в течение 30 сут с момента заражения.
Статистическая обработка результатов и программное обеспечение Математическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерных программ Statistica для Windows версии 5.0 и Microsoft Office Excel 2007, рассчитывая среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической, доверительный интервал. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием критерия Стьюдента (р < 0,05). Вычисление величин LD50 и ImD50, а также доверительных интервалов (для вероятности 95 %) проводили по методу Karber (Ашмарин И.П., Воробьев А. А., 1972).
Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве с сотрудниками лаборатории микробиологии чумы ФБУН ГНЦПМБ к.б.н. Шайхутдиновой Р.З., к.м.н. Титаревой Г.М., к.б.н. Платоновым М.Е. и к.б.н. Агеевым С.А.. Эксперименты по получению ДIpxM мутанта на модели вирулентного штамма Y. pestis 231 и его оценке выполнены совместно с Панькиной JI.H. (РосНИПЧИ "Микроб", Саратов).
Масс-спектрометрию препаратов ЛПС проводила Кондакова А.Н., а ЯМР-спектроскопию выполнял Шашков А.С. (ИОХ им. Зелинского РАН, г. Москва). Эксперименты по поиску клеточного рецептора для бактериофага срА1122 проводили совместно с сотрудниками лаборатории Skurnik М. (University of Helsinki, Finland).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Структурное разнообразие и температурозависимые вариации строения ЛПС представителей различных внутривидовых групп Y. pestis и Y. pseudotuberculosis
До последнего времени большинство исследований возбудителя чумы проводили на генетически гомогенных штаммах subsp. pestis bv. orientalis, укоренившихся в природных очагах Юго-Восточной Азии, Южной Африки и на американском континенте в ходе третьей пандемии чумы (Anisimov А.Р. et а!., 2004; Cui Y. et al., 2008; Li Y. et al., 2009; Morelli G. et al., 2010; Riehm J.M. et
al., 2012). При выполнении настоящей работы уточнена структура ЛПС у штаммов Y. pestis основного подвида, вирулентных для многих видов млекопитающих и человека, и определена структура ЛПС у представительного набора маловирулентных для людей и морских свинок «полевочьих» штаммов subsp. microtus (рис. 1, табл. 1), что позволило охарактеризовать практически все внутривидовое многообразие чумного микроба. Для всех представителей вида установлено, что глицин присоединяется в одно из свободных положений остатка LD-HepI. Показано, что фосфоэтаноламин может включаться в состав кора ЛПС не только при культивировании бактерий при пониженной температуре (6 °С), но и при обычной температуре (25 °С). Обнаружено, что при повышенной температуре (37 °С) происходит замена одного из остатков Ara4N на фосфатную группу с образованием пирофосфатной группы.
Таким образом, Y. pestis реагирует на повышение температуры культивирования не только уменьшением положительного заряда на поверхности клетки за счет снижения содержания катионного моносахарида Ara4N в липиде А, но и увеличением отрицательного заряда путем дополнительного фосфорилирова-ния.
С помощью масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением, примененной к интактному высокоочищенному ЛПС, изучено строение липополисахаридов Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica, bv. altaica и bv. hissarica, а также bv. ulegeica (табл. 1). Показано, что основным отличием ЛПС Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica, altaica и hissarica с одной стороны от ЛПС Y. pestis subsp. pestis и subsp. microtus bv. ulegeica с другой стороны является отсутствие терминального моносахарида DD-Hep в любой из гликоформ корового олигосахарида. Молекулярная основа данного феномена заключается в паличии мутаций со сдвигом рамки считывания в гене wabC, кодирующем DD-Hep-трансферазу. Эта мутация приводит к синтезу белка размерами не 326 аминокислот, как у штаммов основного подвида, а 192 аминокислоты в случае биоваров caucasica и hissarica или 34 аминокислоты у изолятов биоваров altaica и talassica.
Выявлено, что у штаммов Y. pestis subsp. pestis 10-35 % коровых олигосахари-дов лишены терминального остатка GlcNAc, и для всех изученных штаммов subsp. microtus, кроме 1146 (bv. caucasica), данный показатель также составляет 6-32 %. Основываясь на факте отсутствия О-антигена в ЛПС возбудителя чумы, мы предположили, что GlcNAc является первым и, следовательно, акцепторным сахаром утраченного О-антигена. Сравнение нуклеотидных последовательностей кластеров генов О-антигена Y. pseudotuberculosis О: lb и К pestis выявило почти 100 % идентичность всех генов, за исключением wzx генов для транспортера О-единиц (флип-пазы), представленных в »'^'-зависимом пути сборки О-антигена (Raetz C.R., Whitfield С., 2002), идентичных лишь на 90,4 % (Skurnik М. et al., 2000). Таким образом, у Y. pestis измененная флиппаза способна транспонировать коровый олигосахарид с присоединенным GlcNAc, а не единицу О-антигена, как у Y. pseudotuberculosis.
В ходе настоящего исследования найдено, что как и в ЛПС одного из изученных нами ранее штаммов Y. pestis subsp. pestis, в ЛПС-25 и ЛПС-37 subsp. microtus bv. caucasica (три штамма) и bv. altaica (два штамма), но не bv. hissarica, присутству-
ет в нестехиометрическом количестве глицин, присоединенный к Hepl (табл. 1). Впервые обнаружено фосфорилирование фосфоэтаноламином в ЛПС, выделенных из 25-градусных культур К pestis subsp. microtus bv. altaica, bv. hissarica и bv. ulegei-ca. Установлено, что в ЛПС-25, как и в ЛПС-б, фосфоэтаноламин является компонентом только Ко-содержащих гликоформ кора, наиболее вероятно расположенным в таком же положении 8 латерального остатка Ко.
Рисунок 1 - Структурные варианты олигосахарида кора ЛПС Y. pestis Примечание: (А) DD-Hep+Kdo-содержащая гликоформа, сшпезируемая при температуре 37 °С; (Б) Gal+Ко-содержащая гликоформа, доминирующая при температуре (20-28) °С (одновременно присутствуют DD-Hep+Kdo-содержащая и две смешанные глиюоформы); (В) DD-Hep+EtNP-Кочядсржждая гликоформа синтезируемая при температуре 6 °С (присутствует также Gal+Ко-содержащая гликоформа, лишенная EtNP). Пунктирной линией обозначено пестехиометрическое содержание GlcNAc. Глицин, присутствующий на остатке LD-HepI в ппнкоформах А и Б, не показан.
Обнаружено, что, как и у штаммов Y. pestis subsp. pestis, содержание галактозы в ЛПС из штаммов subsp. microtus bv. caucasica и bv. altaica снижается с повышением температуры культивирования, и изменения в относительном содержании Kdo и Ко носят такой же отчетливо выраженный температурозависимый характер (табл. 1).
Таблица 1 - Относительное содержание (%) варьирующихся компонентов ЛПС у штаммов К хиЬхр. ткгойк, культивированных
Варьирующиеся формы и компоненты ЛПС caucasica altaica hissarica ulegeica
1146 1680р~ С-585 И-2377 И-2359 А-1249 А-1725 И-2422
25 °С | 37-С 25 °С 25 "С 25'С 1 37 °С 25 "С 25 "С 25 °С 25 "С
Ацильиые варианты липида А
Триацильный вариант (ЗхЗН014:0) 0 0 7 6 0 8 7 44 0 следы
Тетраацилышй вариант (4хЗН014:0) 52 93 82 74 56 92 84 34 68 90
Пентаацильный вариант (тетраацильный + С 12:0) 42 7 8 11 35 0 9 16 23 7
Гексаацильный вариант (тетраацильный + 12:0 + 16:1) 6 0 3 9 9 0 0 6 9 следы
Варианты с различным содержанием Лга4Ы
Вариант с двумя остатками Ага4Ы 93 94 91 94 62 29 80 0 24 18
Вариант с одним остатком Ага4Ы 7 6 9 6 38 47 20 0 76 54
Вариант, ие содержащий Лга4Ы 0 0 0 0 следы 24 0 100 0 28
Терминальные моносахариды кора, фосфоэтаноламин и глицин
Kdo (гликоформы 1 и 2) 12 100 16 14 38 100 46 23 71 28
Ко (гликоформы 3 и 4) 88 0 84 86 62 0 54 77 29 72
Htn/1 (гликоформа 6) 0 0 0 0 13 0 0 33 следы 25
Нер (гликоформы 1 и 3) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 87
Gal (гликоформы 2 и 4) 100 42 100 100 100 10 100 100 100 13
GlcNAc 13 47 81 58 73 83 94 85 82 79
Gly 38 28 19 0 18 7 14 0 0 0
Ранее было показано, что Y. pseudotuberculosis, в отличие от Y. pestis, продуцирует S- и SR-формы ЛПС, содержащие длинную О-полисахаридную цепь или одну О-едшшцу, связанные с кором, соответственно. В ходе нашей работы впервые установлены (0:2b, 0:4Ь), уточнены (0:1а, 0:1Ь, 0:2с, 0:4а) или подтверждены (0:3) структуры О-антигенов Y. pseudotuberculosis (табл. 2). Структуры О-полисахаридов Y. pseudotuberculosis сероваров 0:1с и 0:2а определены без нашего участия. Отметим, что в О-полисахаридах всех изученных сероваров Y. pseudotuberculosis в боковой цепи находятся необычные моносахариды - 3,6-дидезоксигексозы, и именно их конфигурация определяет серологическую специфичность штамма и, соответственно, его принадлежность к ТОМу или иному серовару. Так, паратофураноза характерна для серогруппы 0:1, абеквоза - для серогруппы 0:2, паратопираноза - для серогруп-пы 0:3 и тивелоза - для серогруппы 0:4. Иммунодоминирующий характер 3,6-дидезоксигексоз объясняется их положением в боковой цепи О-полисахаридов, что делает их наиболее доступными для взаимодействия с иммунной системой организма-хозяина. Наряду с 3,6-дидезоксигексозами в состав О-полисахарвдов сероваров 0:1а и 0:4Ь входит еще один редко встречающийся моносахарид - б-декозси-D-манно-тетоза. Сероспецифичиость сероваров внутри серогрупп определяется различиями в строении основной цепи О-полисахаридов, включая число моносахарид-ных остатков в повторяющемся звене, которое в основной цепи варьируется от двух в сероварах 0:1а и 0:4Ь до трех в сероварах 0:2Ь и 0:3 и четырех в сероварах 0:1Ь, 0:2с и 0:4а.
При анализе ЛПС серовара 0:3, наряду с молекулами, содержащими полное повторяющееся звено, обнаружены молекулы с повторяющимся звеном на разной стадии достройки, что позволило выяснить последовательность переноса моносахарид-ных компонентов. В частности определено, что остаток GalNAc является первым моносахаридом биологической О-едшшцы, чей перенос на липидный носитель инициирует биосинтез О-ангигепа. Следующие компоненты - фукоза, манноза и параго-за - последовательно переносятся на GalNAc. Транслокация через мембрану с последующим лигированием к кору неполных О-единиц обнаружена нами впервые.
Впервые продемонстрировано, что кор R-форм ЛПС исследованных нами штаммов Y. pseudotuberculosis сероваров 0:1-0:4 не имеет существенных отличий от изученного нами ранее кора ЛПС Y. pestis subsp. pestis, включая подобный характер температурозависимых структурных вариаций (рис. 1). Кроме того, температурозависимые изменения в степени ацилирования липида А также подобны у возбудителей чумы и псевдотуберкулеза (рис. 2), за исключением того, что Y. pestis потеряла способность включать в липид А группу 16:0 при высокой температуре культивирования вследствие мутации в гене pagP.
Таким образом, видообразование Y. pestis на основе одного из клонов Y. pseudotuberculosis в ходе перехода на облигатный жизненный цикл «блоха-грызун-блоха» сопровождалось потерей О-полисахарида и пальмитиновой кислоты в липиде А. Появление DD-Нер-дефицитных хемотипов кора может отражать последующую редуктивную эволюцию генома патогена в ходе микроэволюции для адаптации к новым экологическим нишам — циркуляции в популяциях некоторых видов полевок.
Таблица 2 - Установленные (0:2b, 0:4b), уточненные (0:1а, 0:1b, 0:2с, 0:4а) и подтвержденные (0:3) структуры О-антигенов
Серовар Структура повторяющегося звена Примечания
0:1а P-Par/-(l->3)-p-D-6dmanHep/? i 1 4 ->3)-a-D-Galp-(l-»3)-P-D-GlcpNAc-(l-> уточнена
0:1Ь Р-Par/ i i 3 ->2)-P-D-Manp-(l->4)-a-D-Maiv-(l-»3)-a-L-Fucp-(l->3)-a-D-GlcpNAc-(l-> уточнена
0:2Ь a-Abe/; i i 3 ->2)-a-D-Manp-( 1 ->3)-a-L-Fucp-( l->3)-P-D-GalpNAc-( 1 -> установлена впервые
0:2с a-Abe/) i i 3 ->6)-u-D-Manp-(l->2)-a-D-Manp-(l->2)-P-D-Manp-(l->3)-a-D-GalpNAc-(l-> уточнена
0:3 p-Parp i l 4 ->2)-a-D-Marv5-(l->3)-a-L-Fucp-(l->3)-a-D-GalpNAc-(l-> подтверждена
0:4а a-Tyv/; i i 3 ->6)-a-D-Manp-(l->2)-a-D-Manp-(l->2)-P-D-Manp-(l->3)-a-D-GalpNAc-(l-> уточнена
0:4Ь a-Ty vp-( l->3)-P-D-6dmanHep/> i 1 4 ->3)-a-D-Galp-(l->3)-P-D-GIcpNAc-(l-> установлена впервые
Y. pestis LPS-37
R1 = H, P or (M.-Arap4N-(1->
R2 = R3 = H
Y. pseudotuberculosis LPS-37 R1 = p-L-Arap4N-(1-> R2 = H. R3 = H or 16:0
Y. pestis LPS-25, Y. pseudotuberculosis LPS-20/LPS-28 R1 = p-L-Arap4N-(1 R2 = H or 12Л, Rs = H or 16:1 Рисунок 2 - Структура липида А в ЛПС Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, выращенных при разных температурах
Примечание: Показано одно из двух возможных положений (Therisod Н. et al., 2002) пальмитоильной группы 16:0 в ЛПС-37 Y. pseudotuberculosis. В случае, когда заместители при фосфатных группах отличаются, их точное распределение неизвестно.
Полученные в настоящем разделе результаты явились основой для проведения исследований по оценке вклада отдельных структурных компонентов ЛПС в биологические свойства Y. pestis, определяющие патогенез чумы.
Внутривидовые и температурозависпмые вариации некоторых биологических свойств ЛПС F. pestis
ЛПС — основной компонент наружного слоя наружной мембраны грамотрица-тельных бактерий, способный инициировать в макроорганизме протективный системный воспалительный ответ. Избыточный ответ на ЛПС может быть вреден для организма хозяина, вследствие развивающегося эндотоксического шока. Мы оценили TNF-a-индуцируюшую активность препаратов ЛПС Y. pestis, используя мышиную макрофагоподобную клеточную линию J774A.1. Показана высокая активность ЛПС из культур Y. pestis subsp. pestis (КМ218, КМ260(11) и KIMD1), выращенных при температуре 25 °С (табл. 3), коррелирующая с более высокой степенью ацилиро-вания низкотемпературных ЛПС, в частности, с присутствием в них гексаацшшро-ванных форм липида А, которые отсутствовали в высокотемпературных препаратах. Эти результаты согласуются с данными других исследователей (Kawahara К. et ей.,
20
2002; Rebeil R. et al, 2004), полученными на мышиных и человеческих макрофагаль-ных линиях. Цитокин-шщуцирующая активность ЛПС Y. pestis bv. caucasica 1146 и 1680Р", а также Y. pestis bv. altaica И-2377 была достоверно ниже, чем у штаммов основного подвида. При этом сохранялось различие в уровне индукции TNF-a низкотемпературными и высокотемпературными ЛПС, что согласуется с особешюстями химического строения их липида А - одновременным присутствием тетра- и более высокоацилировшшых форм в первых и лишь тетраацилированной формы во вторых. Можно предположить, что различие в строении кора ЛПС представителей основного и неосновных подвидов, а именно, отсутствие в последних терминального остатка DD-Hep, является причиной различной конформации липида А, которая в конечном счете и определяет эндотоксическую активность ЛПС.
Источник ЛПС Температура культивирования,^ TNF-ar, пкг/мл" LD50, MKT6
Y. pestis ¥Мт 25 1243,73 ±142,79 0,79 (0,20-3,16)
37 721,38 ±141,92 5,01 (1,26-19,95)
Y. pcjíí'.íKIMDl 25 1139,13 ±99,26 0,13 (0,03-0,50)
37 533,28 ±95,7 7,94(1,99-31,62)
Y. pestis КМ260(11) 25 1117,1± 104,8 1,99 (0,50-7,90)
37 607,8 ± 49,5 12,59(3,10-50,12)
Y. pestis 1146 25 859,2 ±113,3 0,079(0,02-0,30)
37 495,1 ±49,7 1,26 (0,30-5,00)
Y. pestis 1680P" 25 689,6 ±67,1 0,05 (0,01-0,21)
37 459,2 ± 19,4 1,30 (0,33-5,16)
Y. pestis \\-2ЪП 25 700,2 ±78,5 0,36 (0,09-1,42)
37 502,1 ±34,2 1,79 (0,45-7,12)
Y. pseudotuberculosis EV11M 25 521,4 ±70,1 0,32 (0,08-1,25)
37 409,6 ±59,7 0,50 (0,12-1,99)
F. tularensis 15/10 37 234,7 ±66,1 >1000,00
Примечание:
" Уровни TNF-ar в супернатанте мышиных макрофагов J774A.1 после стимуляции препаратами ЛПС (100 нг/мл);
6 95 % доверительный интервал представлен в круглых скобках.
Показано отсутствие строгой корреляции между индукцией TNF-a в клетках мышиной макрофагоподобной клеточной линии J774A.1 в ответ на стимуляцию ЛПС in vitro и летальной токсичностью ЛПС in vivo (табл. 3). Препараты ЛПС, выделенные из двух штаммов subsp. pestis с наивысшей TNF-a-индуцирующей активностью - KIMD1-25 и КМ260(11)-25, проявляли значительные различия в уровне LD50. Более того, TNF-a-индуцирующая активность глубокого ЛПС мутанта Y. pseudotuberculosis EV11М in vitro сопоставима с активностью нетоксичного ЛПС F. tularensis, но при этом его летальная токсичность для мышей практи-
чески не отличалась от препаратов из штаммов К pestis с ЛПС "дикого" типа, проявляющих in vitro наибольшую способность к индукции TNF-a. Эти наблюдения согласуются с опубликованными данными (Amura C.R. et al, 1998; Luchi M., Morrison D.C., 2000) для препаратов ЛПС из других представителей грамотрица-тельных бактерий. Таким образом, моделирование такого сложного явления как септический шок на изолированных клетках животных, культивируемых в питательных средах вне организма, позволяет изучать тонкие механизмы взаимодействия эндотоксинов с отдельными эукариотическими клетками. В то же время это является весьма упрощенной моделью изучаемого процесса в целом, и поэтому сопоставление результатов, полученных в опытах in vivo и с изолированными эукариотическими клетками, требует серьезной критичной оценки.
Бактерицидные катионные пептиды являются важными компонентами системы врожденного иммунитета, защищающего макроорганизм от бактериальных инфекций (Fjell C.D. et al., 2011). Мы оценили чувствительность к ПМВ штаммов Y. pestis, отличающихся по эпидемическому потенциалу и географическому происхождению при разных температурах культивирования. При температуре 25 °С устойчивостью к бактерицидному действию ПМВ обладали штаммы Y. pestis subsp. pestis, а также штаммы subsp. microtus биоваров ulegeica и talas-sica (МИК = 100-200 мкг/мл) (табл. 4). В то же время по одному штамму Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica и bv. hissarica, а также два свежевыделен-ных штамма subsp. microtus bv. altaica были чувствительны к ПМВ (МИК = 1,56-50 мкг/мл). При температуре 37 °С устойчивость штаммов всех изученных подвидов к бактерицидному действию ПМВ была достоверно ниже. Полученные данные подтверждают, что штаммы Y. pestis subsp. pestis, представляющие три пандемичных биовара возбудителя, высокоустойчивы к ПМВ при температуре 25 °С, в то время как подъем температуры культивирования до 37 °С или ее понижение до 6 °С ведет к почти 30-60-кратному снижению устойчивости (табл. 4). Устойчивость штаммов к ПМВ коррелирует с содержанием ка-тионного компонента Ara4N, присоединенного к фосфатным группам липида А, определяющим устойчивость к КАМП у представителей Enterobacteriaceae (Gunn J.S. et al., 1998; Trent M.S. et al., 2001). По нашим данным ЛПС с остатком EtNP в коре, продуцируемый при 6 °С, не содержит катионного моносахарида 4-амино-4-дезоксиарабинозы в липиде А независимо от степени ацилирования, а ЛПС-37 характеризуется относительно низким содержанием Ara4N при фосфатных группах. В проведенном исследовании устойчивость к ПМВ находилась в корреляции и с содержанием в коровой части ЛПС другого катионного компонента — глицина. Биологическая роль данного компонента ЛПС до настоящего времени не установлена, однако предполагают, что наряду с Ara4N глицин может играть ключевую роль в снижении проницаемости наружной мембраны бактерий для КАМП путем уменьшения ее отрицательного заряда (Molinaro A. et al. 2008). Несмотря на сравнимое содержание Ara4N в ЛПС-25 и ЛПС-37 штамм У. pestis subsp. microtus bv. caucasica 1146 был в ~8 раз устойчивее к ПМВ при 25 °С. Именно высокое содержание глицина в ЛПС-25 штамма 1146 может обеспечивать повышенный уровень устойчивости при данной температуре.
Таблица 4 - Устойчивость представителей различных внутривидовых
Штамм Биовар МИК полпмиксина В, мкг/мл°
6°C I 25°C 1 37 °C
Y. pestis subsp. pestis
КМ260(11) antiqua 6,25 200 6,25
КМ218 orientalis 6,25 400 6,25
KIMD1 medievalis 3,13 200 3,13
Y. pestis subsp. microtus
И-2359 altaica и.о.5 200 3,13
И-2377 и.о. 200 6,25
1191 H.O. 25 6,25
1121 H.O. 3,13 1.5
A-1249 hissarica H.O. 3,13 6,25
A-1725 и.о. 200 12,5
C-585 caucasica H.O. 100 50
1680P" H.O. 100 1,5
1146 12,5 50 6,25
И-2422 ulegeica H.O. 200 6,25
A-1820 talassica H.O. 100 1,5
" по результатам трех независимых экспериментов; "и.о., не определяли.
Другим ключевым компонентом, поддерживающим энзоотический цикл трансмиссии чумы, является устойчивость микроорганизма к бактерицидной активности сыворотки крови млекопитающих. Все изученные штаммы Y. pestis subsp. pestis и subsp. microtiis биоваров altaica, hissarica, ulegeica и talassica, выращенные при температурах 25 °C и 37 °C, обладали способностью переживать бактерицидное действие комплемента НЧС. Среди 57 исследованных представителей subsp. microtus bv. caucasica только два штамма - 1680Р" и 1146 - обладали фенотипом, чувствительным к НЧС (табл. 5). Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica циркулирует в популяциях обыкновенных полевок и вирулентен для мышей, но при этом обладает пониженной вирулентностью для морских свинок и человека (Anisimov А.Р. et al., 2004). Обнаруженная нами ранее устойчивость штамма bv. caucasica 1146 к комплементу нормальной мышиной сыворотки позволяет предположить, что основные хозяева штаммов Y. pestis bv. caucasica - Microtus arvalis - также отличаются невысокой концентрацией компонентов системы комплемента в крови. На начальном этапе исследования предположили, что чувствительность к сыворотке штамма 1146 связана с отсутствием в ЛПС гликоформ олигосахарида кора, содержащих DD-Hep, и с более низким содержанием GlcNAc. Однако, по мере расширения числа штаммов с полностью охарактеризовашюй структурой ЛПС, обнаружили, что отсутствие DD-Hep является общей чертой, определяющей принадлежность изолята ко всем биоварам неосновного подвида, кроме bv. ulegeica, обладающим
23
устойчивым к сыворотке фенотипом. Содержание GlcNAc в качестве другого предположительного маркера чувствительности к сыворотке было выбрали на основании того, что ЛПС найденных к тому моменту чувствительных к НЧС штаммов - Y. pestis subsp. pestis КМ218, выращенного при температуре 6 °С, и Y. pestis subsp. mi-crotus bv. caucasica 1146 - характеризовались низким уровнем данного моносахарида. Кроме того, во всех устойчивых к сыворотке штаммах, таких как представители subsp. pestis КМ218, КМ260(11) и KIMD1, subsp. microtus bv. caucasica C-585, bv. altaica И-2377 и И-2359, bv. hissarica A-1249 и A-1725, bv. ulegeica И-2422, выращенных при температуре 25 °C, а некоторых и при 37 °С, содержание GlcNAc было относительно высоким. Однако при этом уровень данного моносахарида в ЛПС-25 штамма bv. caucasica 1680Р", чувствительного к действию сыворотки, был сопоставим с перечисленными выше устойчивыми штаммами.
Таблица 5 - Чувствительность к бактерицидной активности комплемента сыворотки крови представителей К ра^и"____
Штамм Биовар Число жизнеспособных бактерий после 1 ч инкубации, lg КОЕ'мл
6°С 25 °С 37 °С
НЧС тНЧС НЧС тНЧС НЧС I тНЧС
К nestis subsr». vestís
КМ260(11) antiqua ЗД±0,19 6,9±0,26 6,5±0,25 7,3±0,62 7,0+0,7 7,6+0,9
КМ218 orientalis 2,7±0,15 6,9±0,21 6,9±0,38 7,5±0,5 7,1±0,57 7,7±0,77
KIMD1 medieval is 2,3±0,12 6,9+0,14 6,6±0,43 7,4±0,55 7,1±0,6 7,7±0,7
Y. nestis subso. microtus
И-2359 altaica Н.О." н.о. 6,7±0,1 6,6±0,1 6,4±0,4 6,1±0,1
И-2377 Н.О. н.о. 6,3 ±0,3 7,0±0,9 5,6±0,2 6,1±0,7
A-1249 hissarica н.о. н.о. 6,6±0,2 6,7±0,0 6,0+0,4 6,5±0,2
A-1725 Н.О. н.о. 6,7±0,1 6,7±0,2 6,6±0,7 6,4+0,7
C-585 caucasica н.о. н.о. 6,6±0Д 6,5+0,1 5,8±0,4 6,1±0,5
C-376 н.о. н.о. 6,9±0,1 7,0±0,2 6,1±0,8 6,2±0,4
1680P~ н.о. н.о. 2,1±0Д 6,9+0,7 2,3+0,4 6,7±0,5
1146 и.о. н.о. 1,9±0,19 7,4±0,26 1,4±0,25 6,9+0,62
И-2422 ulegeica н.о. н.о. 6,5+0,2 6.5+0,1 6,1±0,2 6,2+0,5
A-1820 talassica н.о. н.о. 6,5±0,5 6,2±0,2 6,2+0,3 6,4±0,6
Примечание:
° по результатам трех независимых экспериментов; "и.о., не определяли.
Настоящий раздел исследования выявил корреляцию температурозависи-мых изменений в структуре ЛПС представителей различных внутривидовых групп У. реЕШ с токсичностью препаратов ЛПС, а также частичную корреляцию между температурозависимыми и внутривидовыми особенностями строения ЛПС и способностью Y. pestis выживать и размножаться в присутствии ПМВ и комплемента сыворотки крови человека. Биологическую значимость
некоторых других температурозависимых изменений структуры ЛПС, описанных для возбудителя чумы, еще предстоит выяснить. При этом нельзя забывать, что выращивание бактерий в лабораторных условиях не может полностью отразить условия in vivo. Только нокаутный мутагенез генов, включенных в биосинтез ЛПС, с последующей комплементацией, может пролить свет на вклад отдельных частей молекулы в устойчивость к действию факторов врожденного иммунитета и вирулентность. Более того, понимание природного разнообразия структуры и функции таких факторов патогенности, как ЛПС, особенно среди штаммов возбудителя из наиболее древних природных очагов чумы, послужили основой для следующего этапа исследования, посвященного определению и анализу отдельных генов, ответственных за биосинтез этой макромолекулы.
Генетический контроль биосинтеза ЛПС Yersinia pestis
Основываясь на анализе химической структуры ЛПС сконструированных де-леционных мутантов, выращенных при температурах б °С или 25 °С, охарактеризовали гены, участвующие в биогенезе кора, и несколько генов, отвечающих позднее ацилирование и декорирование липида А К pestis. Проведенные в комбинации биоинформационный анализ полностью секвенированного генома штамма Y. pestis С092 и мутагенез показали, что гены биосинтеза ЛПС возбудителя чумы распределены по нескольким регионам хромосомы (рис. 3). Пять генов, консервативных для энтеробактерий, расположены в ограниченном генами аденилтранс-феразы фосфопантетеина (CoaD) и 2-амино-З-кето-бутират-коэнзим А лигазы (КЫ) локусе 1. На основании высокого уровня гомологии, продукт гена YP00058 идентифицировали как АИР-П-глш/еро-^-и-манно-гетоза 6-эпимераза. Четыре остальных гена (YP00054-YP00057) ответственны за сборку внутреннего кора путем последовательного добавления двух остатков Kdo к липиду А с помощью бифункционального фермента Kdo трансферазы (WaaA) с последующим переносом двух отстатков LD-Hep гептозилтрансферазами I и II (WaaC и WaaF) и присоединением остатка глюкозы к LD-HepI глюкозилтрансферазой (WaaE).
Из двух открытых рамок считывания (ORF), присутствующих в локусе 3, YP00416 является гомологом гена, кодирующего гептозилтрансферазу III (WaaQ), которая присоединяет остаток LD-HepIII к LD-HepII и тем самым завершает сборку внутренней области кора. Вторую ORF, YP00417 предположительно идентифицировали как waaL - ген, кодирующий лигазу, которая присоединяет к кору О-антиген, а в случае Y. pestis -единичный остаток GIcNAc.
Локус 2, расположенный за геном тауриндиоксигеназы (TauD), содержит две ORF, YP00186 и YP00187, предположительно соответствующие новым глико-зилтрансферазам. Эти гены назвали wabC и wabD, и показали, что они отвечают за присоединение Х)-глицеро-ХУ-манно-те.то-ш (DD-HepIV) или галактозы к остатку LD-HepIII, соответственно.
Гены, предположительно участвующие в синтезе липида А, включая гены, отвечающие за позднее ацилирование лаурилтрансферазой (YP02063, IpxKÍ) и паль-митолеинилтрансферазой (YP03632, IpxP), гликозилирование остатком Ara4N (YP02421, arnT) и фосфорилирование (YP01276, IpxT), а также гены синтеза Hep (YP00654, hldE) и ундекапринилдифосфата GIcNAc (YP03866, wecA) найдены в
25
других частях хромосомы (рис. 3). В результате дополнительного Blast поиска в геноме штамма }'. pestis С092 выявили ортолог для гена eptB (yhjW), кодирующего EtNP трансферазу у Е. coli (Reynolds С.М. et cd., 2005) (рис. 3). Но гомолог для гена wbnG, кодирующего глицинтрансферазу у S. dysenteriae (Feng L. et al., 2004), не обнаружили, по-видимому, вследствие значительности различий между ферментами, которые присоединяют глицин к аминогруппе у 5. dysenteriae и к гидроксильной группе у У. pestis.
SSLm-YTO»» ' ™ft " -«' _ \ К «™г ' ш" Г " #w >
ïïS>i»wo«i« ' N> "фЕЗЯШ фШЯ • "-oom . I
locus 3
YPOíM 1 (>-YP00417
Ъшшф
"и[«тЛВ^> ! »«hjrBNA У
esiáJ В
ft» J
Nr-----'
■Ыд
Mv-.uj
rj'osœi
I <......„te?_
Рисунок 3 - Расположение некоторых генов биосинтеза ЛПС в хромосоме У.
Примечание: Гены и>аа в локусах 1 и 3, гены м>аЬ в локусе 2 обозначены светлосерым, серым и черным цветом, соответственно.
С учетом полученных данных сконструировали 14 одинарных и 4 двойных мутанта по генам биосинтеза ЛПС на основе авирулентного штамма КМ260(11) (рис. 4, 5) для подтверждения их функции и оценки влияния отдельных структурных компонентов ЛПС на ряд факторов патогенности чумного микроба, в том числе и на взаимодействие со специфичным для У. pestis бактериофагом фА1122. Вирулентный штамм «дикого типа» 231 использовали для получения шести одинарных мутантов, необходимых для изучения взаимосвязи структуры ЛПС с вирулентностью У. реьИь в отношении лабораторных животных.
EptBj
OD-Hép-al/Г
7 ! 4 i 4 ;
GteNAc-(S1^S-Hep-<d-|»3-Hep-a1^5-Kd(s-a2-V6-GIoNRrp1-»6-GloNR2-«1-»P-j-P
( LpxP)
Рисунок 4 - Структура ЛПС Y. pestis и роль трансфераз в биосинтезе ЛПС
Примечание: Ферменты, кодируемые генами waa в локусах 1 и 3 и генами wab в ло-кусе 2, обозначены светло-серым, серым и черным цветом, соответственно. R обозначает 3-гидроксимиристоил. В культурах, выращенных при 25 °С, DD-HepIV и Gal, KdoII и Ко присутствуют в виде альтернирующих пар, в то время как при 37 °С доминируют DD-HepIV и KdoII. Дифосфат в липиде А экспрессируется при 37 °С и заменяется на Ara4NP при 25 °С. Глицин, присоединенный к Hepl, не показан.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Рисунок 5 - ДСН-ПААГ препаратов ЛПС, выделенных из штамма У. pestis КМ260(11) и полученных ЛПС-мутантов
Примечание: Линии: 1, 7, 13, 16 и 22, дикий тип ЛПС; 2, AwabC; 3, AwabD; 4, AwecA; 5, AwaaL; 6, AwabC/AwaaL; 8, AwabD/AwaaL; 9, AwaaQ; 10, ДwaaE; 11, AwaaF, 12, AwaaC; 14, AhldE; 15, ДwaaA; 17, Y. pseudotuberculosis EV11M; 18, AarnT; 19, ДIpxM; 20, AIpxP; 21, AeptB. Y. pseudotuberculosis EV11M обладал структурой кора ЛПС, подобной мутантам waaC и hldE Y. pestis КМ260(11), а липид А отличался присутствием пальмитоильной группы.
Изучение химической структуры ЛПС сконструированного набора нокаут-ных мутантов У. pestis по генам биосинтеза ЛПС позволило установить порядок присоединения отдельных компонентов кора в ходе биосинтеза ЛПС. Первым на цитоплазматической поверхности внутренней мембраны собирается липид А (Raetz C.R., Whitfield С., 2002). При этом, как и у остальных энтеробактерий, процесс сборки липида A Y. pestis. завершаемый в случае возбудителя чумы путем присоединения вторичных ацильных заместителей - остатков пальмито-олеиновой и лауриновой кислот, заканчивается только после предварительного присоединения Kdo к остатку GlcNII липида А, осуществляемого Kdo-трансферазой WaaA. Подтверждением этого служит установленная структура ЛПС AwaaA мутанта, лишенного Kdo и состоящего только из липида А с четырьмя (основной вариант) или тремя (минорный вариант) группами ЗН014:0. Затем гептозилтрансфераза I, кодируемая геном waaC, переносит остаток LD-HepI на собранный Мо2-липид А, после чего гептозилтрансфераза II, коди-
руемая геном waaF. присоединяет остаток LD-HepII к остатку LD-HepI. Обнаруженное отсутствие Glc в waaF мутанте подтверждает, что ее присоединение к кору, опосредуемое глюкозилтрансферазой WaaE. происходит только после предварительного присоединения остатка LD-HepII к LD-HepI. Отсутствие в ЛПС waaE мутанта одновременно Glc и LD-HepIII показывает, что включение LD-HepIII в кор, являющееся функцией WaaQ, требует предварительного присоединения остатка Glc к LD-HepI. Последующее добавление терминальных остатков DD-Hep (HepIV) или Gal к LD-HepIII осуществляют ферменты гепто-зилтрансфераза IV (WabC) и галактозилтрансфераза (WabD), соответственно. Процесс сборки кора завершается после его транслокации на периплазматиче-скую поверхность внутренней мембраны добавлением остатка GlcNAc, опосредуемого лигазой WaaL.
Установление функций генов, участвующих в биосинтезе ЛПС Y. pestis, позволило перейти к выявлению роли конкретных компонентов липополисаха-рида в патогенности возбудителя чумы, включая устойчивость бактерии к различным антимикробным факторам, и определению биологической роли темпе-ратурозависимых вариаций в структуре ЛПС.
Роль отдельных компонентов ЛПС в патогенезе чумы
Результаты изучения биологических свойств сконструированных неполярных мутантов, связанные с вирулентностью Y. pestis представлены в табл. 6.
Выращенные при температуре 25 °С мутанты waaQ, waaQ/waaL, waaE, waaF, waaC, hldE, waaA со значительно укороченным или полностью отсутствующим ко-ром ЛПС (табл. 6) оказались в 64-267 раз чувствительнее к бактерицидному действию полимиксина В (МИК < 3,13 мкг/мл), чем исходный штамм Y. pestis (МИК = 200 мкг/мл) (р < 0,05 для сравнения результатов устойчивости исходного штамма и каждого из указанных выше мутантных штаммов). Как и ожидалось, полученный нами я/tí 7-мутант Y. pestis subsp. pestis КМ260(11), не содержащий Ara4N, высокочувствителен к полимиксину В, так же как и а/лГ-мутанты некоторых других бактерий (Nizet V., 2006).
Не удалось установить предел устойчивости исходного штамма и штаммов, дефектных по синтезу WabC, WabD, WecA, WaaL, WabC/WabD, WabC/WaaL и WabD/WaaL, EptB, LpxP, LpM к мастопарану - а-геликсному КАМП, выделяемому из яда осы Polistes jadwagae (МИК > 50 мкг/мл). Штаммы с мутациями в генах waaE, waaF, waaC, hldE и waaA, образующие значительно укороченный кор или полностью лишенные его, а также не содержащий Ara4N arnT-мутант оказались чувствительны к данному КАМП (МИК = 12,5 мкг/мл).
Таблица 6. Биологические свойства штамма Y. pestis «дикого типа» и полученных ЛПС-мутаитов
Мутация в гене (кодируемый фер!иент) Структура олигосаха-рида кора и липида А" МИК ПОЛИМИ- ксина В (мкг/мл) Число живых бактерий (^ КОЕ'мл) после ] ч инкубации в Активность Р1а Вирулентн мышей ость для морских свинок
НЧС тНЧС коагула-зная фибрино-литическая LD5O (КОЕ) средняя продолжительность жизни (сут) LD» (КОЕ) средняя продолжительность жизни (сут)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Дикий штамм Gaí/DO-Hap-Hen GÍC Ко 1 ! I 200 / 3,13е 7,0 ± 0,81 7,2 ± 0,73 ++ ++ 2(1-4) 4,7 ±1,23 7(2-27) 8,5 ±0,8
YP001S6 (HepIV трансфераза WabC) Gal-Нор Glc Ко GteNAc-Hnp-Hep-Kdo-LA 400 6,4 ± 0,65 6,8 ± 0,43 ++ ++ и.о.* и.о. и.о. и.о.
YP00187 (Gal транс-фераза WabD) DО-Нер-Нир DJc Ко 1 ( 1 GIcNAc-Hep-He|>-K(¡C!~tA 200 6,3 ± 0,51 6,1 ± 0,72 ++ ++ 8(1-32) 4,2 ±0,73 и.о. и.о.
YPOO 186/YPOO187 (Нер1Утрансфераза/Gal трансфераза WábC/WabD) Hep Glc Ко 1 1 1 GlcNAc — Hep - Hep - Kda - IA 200 6,4 ± 0,65 6,8 ± 0,43 ++ ++ но. н.о. 11 0. н.о.
YP03866 (GlcNAc-1-Р трансфераза VVecA) ÜBÍ/DI>-H«p-H«p Glc Ко 1 i t Нер-Нер-КйоЧА 200 6,9 ± 0,71 7,1 ± 0,83 + + и.о. н.о. но. н.о.
YP00417 (лигаза WaaL) GWüü-Het>-Hí!P Glc Ко 1 1 1 Нер-Неа-KOO-lA 100 6,3 ± 0,.71 6,8 ± 0,62 + + 13 (2-50) 4,5 ±0.80 32 (8-126) 9,0 ± 1,5
YPOO186/YP00417 (HepIV трансфераза / лигаза WabCAVaaL) G^I-HüP CIc Ко i I 1 Hop-Hf^-Kiib-LA 100 6,4 ± 0,91 6,5 ± 0,56 + + но. н.о. но. н.о.
YPOO 187/YP00417 (Gal трансфераза / лигаза WabD/WaaL) П&-Нер-Нйр Otó Ко Hcp-Hep-Kdo-tA 100 6,4 ± 0,35 6,5 ± 0,74 + + но. и.о. н.о. н.о.
YP00416 (Heplll трансфераза WaaQ) GIC Ко 1 1 GlcriAc~Ht;p-H0P-ftao~LA 3,13 3,6 ± 0,53 6,7 ± 0,70 + + 5(1-16) 4,3 ±0.91 15(4-58) 10,0 ± 1,1
Продолжение таблицы 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
YP00416/YP00417 (НсрШ трансфераза / лигаза WaaQ/WaaL) Glc Ко 1 1 Hep-Hep-Kdo-LA 3,13 3,6 ± 0,53 6,7 ± 0,70 + + и.о. H.O. и.о. 1I.O.
YP00054 (Glc трансфераза WaaE) Ко 1 G)cNAc~Hap-Hep-Kdo-LA 3,13 3,5 ± 0,24 6,8 ± 0,46 + + 32 teñe) 7,9 ± 0.80 >104 >21
YP00057 (HepII трансфераза WaaF) Ко i Hop-Kdtt-UV 3,13 2,3 ± 0,19 6,1 ± 0,56 - - H.O. и.о. H.O. H.O.
YP00056 (Hepl трансфераза WaaC) Ко 1 Krio-LA 1,5 2,0 ± 0,33 6,5 ± 0,52 - - H.O. H.O. H.O. H.O.
YP00654 (D-p-D-Нер-7-Р киназа / D-P-D-Hep 1 -Р аденилтрансфсраза HldE) Ко кж-Я-А 1,5 2,2 ± 0,18 6,6 ± 0,85 - - 2.0x1o5 (5,0» 104-7,9xl05) 11,5 ±0,53 >104 >21
YP00055 (Kdo трансфераза WaaA) LA 0,75 0 5,3 ± 0,71 - - и.о. и.о. H.O. и.о.
YP02421 (Ara4N трансфераза AmT) GnltoO-HoD-Hop ею КО 1 1 4 * GlcNAc--H«p-H0p-K£lo~iA 3,13 6,5 ± 0,55 6,7 ± 0,71 ++ ++ и.о. и.о. и.о. 11 O.
YP04013 (PEtN трансфераза EptB) Cá!/DÜ-Hfif>-Hop Glc Ко* i l 1 GIcNAc—Hftp-Hííp-Kílo-LA 200 6,7 6,9 + + H.O. и.о. и.о. H.O.
YP02063 (лауроил-трансфераза LpxM) Gíil'OO-Hep-Hori Glc Ко 1 1 1 4 GieNAc-Hea-Hsp-Kdo-tA 200 6,9 7,1 ++ ++ H.O. 11.0. H.O. H.O.
YP03632 (пальмито-лсоил трансфераза LpxP) Gal/OO-Hep-He? Glc Ко ill. acNAc-Hep-Hep-Kdo-LA 200 6,3 6,8 ++ ++ но. и.о. и.о. H.O.
Примечание:
0 обозначения в структуре ЛПС: LA, липид А штамма «дикого типа»; LA*, липид А, не содержащий Ara4N, лауроильной (12:0) или пальмитолеоильной (16:1) группы. Ко*, кор, не содержащий PEtN. Пунктирные линии обозначают нестехиометрическое количество GlcNAc. Когда присутствуют как DD-HepIV, так и Gal, один из этих остатков присоединяется к невосстанавливающему концу. Во всех штаммах терминальный остаток Ко частично заменяется на терминальный остаток Kdo. Значительные изменения в биологических свойствах выделены жирным шрифтом. 6 МИК ПМВ при температуре 6 °С; "и.о., не определяли.
Показано, что полный внутренний кор Y. pestis, состоящий из шести моносахаридов (Kdol, KdoII или Ко, HepI, HepII, НерШ и GIc), необходим для устойчивости к КАМП - полимиксииу В и мастопарану in vitro. Однако наблюдаемый эффект скорее всего носит непрямой характер. Повышение чувствительности к КАМП, наблюдавшееся в серии сконстрированных нокаутных мутантов по генам гликозилтрансфераз с уменьшающимся кором скорее всего связано с обнаруженным одновременным снижением содержания Ara4N в липиде А из-за неэффективности ее переноса на молекулы ЛПС с недостроенной углеводной частью. Кроме того, возможно, что укорочение ЛПС приводит к дестабилизации белков наружной мембраны, играющих важную роль в устойчивости к антимикробным пептидам и выживанию бактерий in vivo. Это косвенно подтверждается выявленной чувствительностью лишенных гептоз ЛПС-мутантов к гиброфобно-му антибиотику новобиоцину и ДСН (данные не приводятся). Неудача в поиске гена, кодирующего глицинтрансферазу, не позволила подтвердить высказанное нами ранее предположение о потенциальной роли глицина - еще одного катион-ного компонента ЛПС Y. pestis - в устойчивости к катионным антимикробным агентам. Устойчивость одинарных и двойных мутантов У. pestis subsp. pestis с инактивированными генами, отвечающими за присоединение терминальных моносахаридов кора (wabC, wabD, waaL), к действию полимиксина В позволяет предположить, что отсутствие способности включать DD-HepIV в состав ЛПС в штамме 1146 не является причиной его чувствительности к полимиксину В. Для выяснения механизма чувствительности части штаммов неосновного подвида Y. pestis к КАМП необходимы дальнейшие исследования.
Наши данные по ЛПС мутантам Y. pestis показывают, что для обеспечения устойчивости к НЧС необходим полный внутренний кор, состоящий из шести моносахаридов (Kdol, KdoII или Ко, HepI, HepII, НерШ и Glc), в то время как моносахариды внешнего кора (DD-HepIV, Gal и GlcNAc) не играют существенной роли. Молекулярный механизм участия кора пока не выяснен; возможно, оно опосредуется влиянием ЛПС на правильность фолдинга и тем самым на функциональную активность белка наружной мембраны Ail (OmpX), играющего ключевую роль в устойчивости Y. pestis к сыворотке (Bartra S.S. et al., 2008; Kolodziejek A.M. et al., 2010).
Полученные результаты по фибринолитической и плазмокоагулазной активности Pia в штаммах Y. pestis с постепенным укорочением размеров кора позволяют предположить, что все восемь моносахаридов в коре штаммов Y. pestis «дикого типа» являются необходимыми для максимальной ферментативной активности Pia. Кор, включающий от пяти до семи моносахаридов, продолжает обеспечивать фибринолитическую и плазмокоагулазную активности, хотя и в заметно меньшей степени, тогда как дальнейшее укорочение кора инактивирует Pia.
Показано, что мутанты wabD, waaL, waaQ штамма Y. pestis subsp. pestis сохранили вирулентность и для мышей, и для морских свинок на уровне исходного штамма (табл. 6). Таким образом, отсутствие в ЛПС терминальных моносахаридов не является причиной избирательной вирулентности штаммов подвида microtus. Только сокращение размеров кора до пяти остатков вызывало заметное снижение
вирулентности Y. pestis subsp. pestis при подкожном заражении морских свинок (LDso > 103). Дальнейшее уменьшение размеров кора до двух Сахаров полностью подавляет вирулентность, как для мышей, так и для морских свинок.
В итоге, нокаутные мутанты Y. pestis с двумя или менее моносахаридами в коре ЛПС не только чувствительны к КАМП и НЧС, но и являются авирулентны-ми на моделях мышей и морских свинок. Этот факт показывает, что структура ЛПС играет ключевую роль в летальности при заболевании чумой, и гены waaC, hldE и waaA или кодируемые ими белки могут считаться потенциальными кандидатами на роль молекулярных мишеней для специфических ингибиторов вирулентности Y. pestis (Магга А., 2004). Поскольку идентичность соответствующих ферментов гомологичным белкам других видов не превышает 89 %, возможна разработка ингибитора для каждой из мишеней, который не будет влиять на нормальную условно-патогенную микрофлору хозяина-млекопитающего. Кроме того, полученные данные об аттенуации для белых мышей и морских свинок hldE-мутанта высоковирулентного штамма Y. pestis 231, пе способного синтезировать Hep и обладающего кором, ограниченным дисахаридом Kdo-»Kdo или Ко—»Kdo, свидетельствуют в пользу перспективности направления дальнейших исследований по получению вакцинного штамма возбудителя чумы, прецизионно аттенуи-рованного за счет делеции существенного для вирулентности гена hldE. Наблюдаемая длительность персистенцни мутанта hldE в организме морских свинок (22 дня) вполне достаточна для формирования напряженного иммунитета,
Кор ЛПС Y. pestis является рецептором для бактериофага <рА1122
В качестве рецепторов на клеточной поверхности бактериофаги могут использовать ЛПС или белки наружной мембраны (Koebnik R. et al., 2000; Wright A. et al., 1980). Бактериофаг фА1122 инфицирует Y. pestis при температурах (2037) °C, a Y. pseudotuberculosis - только после культивирования при температуре 37 "С (Garcia Е. et al., 2003). Нами обнаружено, что фаг адсорбируется на штаммах Y. pestis с «диким типом» ЛПС - D27, КМ260(11), а также на лишенном О-полисахарида штамме Y. pseudotuberculosis PBlAwb, выращенных при 20 °С и 37 °С. При этом штамм Y. pseudotuberculosis РВ1 с О-антигеном чувствителен к фагу лишь при температуре 37 °С. Это подтверждает, что при 20 °С О-полисахаридная цепь стерически блокирует фаговый рецептор. Согласно полученным данным перйодат натрия, а не протеиназа К, способен разрушить фаговый рецептор, что подтверждает его углеводную природу. Таким образом, наиболее вероятным рецептором является ЛПС, так как общий энтеробактериальный антиген вследствие особенностей своего строения не может быть разрушен при обработке перйодатом натрия (Kuhn Н.-М. et al., 1988). Этот вывод был ожидаем, так как известно, что близкородственные фаги Т7 и ТЗ используют кор ЛПС К coli в качестве рецептора (Kriiger R. et al., 1981).
Структуры кора ЛПС Y. enterocolitica и Y. pestis подобны, но не идентичны (Bruneteau М., Minka S., 2003; Oertelt С. et al., 2001; Vinogradov E. et al., 2002). Ни один из исследованных нами штаммов Y. enterocolitica, а также их производные, лишенные О-антигена или наружного кора, не адсорбировали фаг срА1122. Веро-
ятно, фаговый рецептор Y. pestis и Y. pseudotuberculosis включает уникальный компонент - Ко, отсутствующий в структуре кора ЛПС у Y. enterocolitica. Ген Kdo-деоксигеназы Y. pestis, ответственной за превращение Kdo в Ко, недавно обнаружен (Chung H.S., Raetz C.R., 2011). Гомолог данного гена у Y. enterocolitica является псевдогеном.
Для поиска фагового рецептора использовали сконструированный на основе штамма Y. pestis КМ260(11) набор мутантов с последовательным укорочением коровой части ЛПС. Анализ результатов эффективности бляшкообразования и эффективности адсорбции фА1122 для исходного и мутантных штаммов Y. pestis позволил доказать, что полный рецептор шА1122 включает остатки
Примечание: Пунктирный овал ограничивает участок кора Y. pestis, необходимый для адсорбции бактериофага срА1122.
Конструирование экспериментальных вакцинных штаммов чумного микроба со сниженной реакгогенностью
Применяемая в настоящее время в странах СНГ чумная живая вакцина на основе аттепуировашюго пггамма Y. pestis EV стимулирует напряженный и эффективный поствакцинальный иммунитет. Однако эта вакцина имеет значительные ограничения в применении из-за ее высокой реактогенности (Наумов и др., 1992), связанной с наличием ЛПС в составе клеточной стенки Y. pestis (Raetz, 1990).
Степень ацилировшшя лшшда А зависит от активности поздних ацилтрансфе-раз (Raetz C.R., Whitfield С., 2002). Гомолог гена IpxKl (msbB), кодирующего лаурил-трансферазу LpxM (MsbB) (идентификационный код YP02063), обнаружен нами в геноме К pestis С092. Анализ in silico показал, что указанный ген не является частью какого-либо оперона (рис. 3). Для определения функциональной активности ген подвергли сайт-направленному мутагенезу в трех аттенуированных штаммах Y. pestis КМ218, KIMD1, КМ260(11), одном вакцигаюм - EV линии НИИЭГ и одном вирулентном штамме 231.
Летальная токсичность препарата ЛПС из штамма КМ218 для нелинейных белых мышей Swiss Webster, сенсибилизированных к ЛПС актиномицином Д, (LDso = 5 мкг, 95 %-ный доверительный интервал - от 1 мкг до 21 мкг) в 10 раз превышала токсичность препарата из КМ21 SAlpxM: :прШ (LD50 = 53 мкг, 95 %-ный доверительный интервал - от 13 мкг до 337 мкг).
Показано, что ДIpxMv.nptll вариант высоковирулентного штамма, способного вызвать клинически выраженное заболевание при инокуляции малого числа бактериальных клеток, может индуцировать эндотоксический шок, несмотря на образование менее токсичных форм ЛПС. В то же время менее вирулентные бактерии для проявления этой активности нуждаются в синтезе высокотоксичных форм ЛПС. Так, IpxM мутация не снижала вирулентность штамма У. pestis 231 дикого типа К pestis, но приводила к 2,5-16-кратному снижению остаточной вирулентности аттенуиро-ванных штаммов возбудителя чумы (табл. 7).
Таблица 7 - Вирулентность исследуемых штаммов У. pestis
Штамм Способ введения LD5o (КОЕ) Средние сроки гибели (сут)
231 п/к 6 (1-22)" 4,9 ±0,87(3,9/
2ЪШрхМ::прШ 9 (2-38) 5,12 ±0,62 (3,8)
ЕУНЙИЭГ 6,3 х Ю7 (1,5 х 107- 3,1 х 108) 4,29 ±0,55 (3,6)
ЕУНИИЭГ AlpxM::nptII 2,9 х 108 (9,2 х 107- 2,9 х 109) 4,0 ± 0,36 (3,5)
ЕУНИИЭГ в/б с актиномицином Д (10 мкг/мышь) 1,6 х 105 (4,0 х 104- 6,3 х 105) 3,38 ±0,77 (1,6)
ЕУНИИЭГ AIpxM::nptII 4,0 х 105 (1,0 хЮ5- 1,6 х 10б) 3,18 + 0,64(1,5)
КМ218 6,3 х 105 (1,5 х 10s-2,5 х 106) 3,09 ±0,69 (1,5)
КМ21 SAIpxM: :nptll 4,0 х 106 (1,0 х Ю6- 1,6 х 107) 2,37 ± 0,66 (1,5)
KIMDl 1 х 105 (2,5 х 104- 4,0 х 105) 3,5 ±0,7 (1,5)
KIMD1 AlpxM: :nptll 1,6 х 106 (4,0 х 105- 6,3 х 106) 3,77 ± 1,05 (1,7)
Примечание:
" — 95% доверительный интервал указан в круглых скобках; 6 — первый и последний день падежа представлены в круглых скобках
Согласующееся с этим десятикратное уменьшение токсичности для акти-номицин Д-сенсибилизированных мышей препарата ЛПС, выделенного из 1рхМ::прШ мутанта КМ218, позволило предположить, что снижение вирулентности Д 1рхМ мутантов аттенуированных штаммов опосредуется снижением токсичности их ЛПС.
В серии предварительных экспериментов оценивали влияние ДIpxM мутации на протективную активность вакцинного штамма EV. Все мыши, иммунизированные подкожно вакцинным штаммом EV линии НИИЭГ в дозах от 103 до 109 КОЕ и зараженные 7 * 105 LD50 (4,2 х 10б КОЕ) вирулентного штамма Y. pestis 231, пали от чумной инфекции, в то время как 57 % животных, вакцинированных аналогичными дозами штамма EVAlpxMwnptlI, выжили. При указанной заражающей дозе рассчитанная величина ImD50 для иммунизированных мышей составила > 109 КОЕ для вакцинного штамма EV и 3,4 х 107 КОЕ (95 % доверительный интервал 8,6 х Юб-1,36 х Ю8КОЕ) для штамма EVAIpxM::nptII. Иммунизация штаммом E~VAlpxM::nptII вела к 1,7-кратному увеличению средней продолжительности жизни мышей по сравнению с вакцинацией исходным штаммом EV линии НИИЭГ (р < 0,05). При 20-кратном снижении заражающей дозы вирулентного штамма Y. pestis 231 до 3,5 х 104LD50 (2,1 х Ю5КОЕ) подкожное введение 2,4 х Ю3 КОЕ вакцинного штамма EV линии НИИЭГ (95 % доверительный интервал 9,0 х Ю2-1,6 х Ю4КОЕ) было способно предотвратить гибель от чумной инфекции 50 % иммунизированных мышей. Достоверное повышение протективной эффективности ДIpxMwnptll мутанта вакцинного штамма по сравнению с исходным наблюдали только при заражении большими дозами вирулентного штамма Y. pestis 231.
Наличие в геноме штамма гена, определяющего устойчивость к антибиотику, не позволяет рассматривать его в качестве кандидата в вакцинный штамм (Frey J., 2007; Hooke А.М. et al., 1985). Поэтому мы разработали методологию направленного конструирования лишенных маркеров антибиотикоустойчивости нереверти-рующих AlpxM мутантов Y. pestis, сочетающая прямой сайт-направленный мутагенез, клонирование мутантной аллели ДIpxMv.cat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику. Разработанный комплекс методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов обеспечивает контролируемое конструирование лишенных маркеров лекарственной устойчивости IpxM мутантов Y. pestis - кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью, а также может быть легко адаптирован для других грамотрицательных бактерий.
Сконструированный штамм Y. pestis EVAlpxM с делетированным геном IpxM, лишенный маркера антибиотикоустойчивости, синтезировал ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-a. При этом степень снижения провоспалительной активности ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis EVAlpxM, была значительно выше в тестах на клетках-мишенях человека по сравнению с мышиной моделью (рис. 7). In vivo на модели мышей линии BALB/c, сенсибилизированных актиномицином Д, установлено, что уровни сывороточного TNF-or после введения ЛПС исходного вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ достоверно превышали аналогичный показатель для препарата ЛПС EVAlpxM (р < 0,05).
Кроме того, внутрибрюшинное введение препарата ЛПС Y. pestis EVAlpxM мышам линии BALB/c, сенсибилизированным актиномицином Д (10 мкг/мышь), продемонстрировало пятикратное снижение его токсических
35
свойств (ЬО50 - 2,5 мкг, 95 %-ный доверительный интервал - от 0,6 мкг до 9,8 мкг) по сравнению с препаратом, выделенным из исходного штамма ЕУ линии НИИЭГ (1ЛЭ5о = 12,3 мкг, 95 %-ный доверительный интервал - от 3,1 мкг до 49,1 мкг). И, наконец, проведенная оценка безвредности штамма ЕЧЫрхМ для белых мышей линии ВЛЬВ/с и беспородных мышей по сравнению с исходным штаммом ЕУ НИИЭГ также выявила снижение его токсических свойств. Подкожное введение от 102 до 107 КОЕ мутантного штамма 'ЕЧЫрхМ мышам не вызывало гибели животных, тогда как инокуляция эталонного штамма ЕУ НИИЭГ в дозах 105 и 107 КОЕ на мышь приводила к гибели 10-40 % животных.
-EVM.PXM
й
с 15000
1 10 100 1000 ллр. нп/ш
• Е. ccíí 055:6S
■ F.iularcnsis
Б J
х—*""'Т t. / /_ г.
д /1 и
// // и
0.1
1 10 100 1000 ППС. нг/мл
Рисунок 7 - Уровни TNF-a в супернатанте макрофагоиодобных мышиных клеток J774.1A (А) и мопоцнтарных клеток человека U937 (Б) после стимуляции препаратами JIIIC из штаммов Y. pestis EV НИИЭГ и EVAIpxM
Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования разработанного комплекса методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов для контролируемого конструирования лишенных маркеров лекарственной устойчивости IpxM мутантов Y. pestis - кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной рсактогенностью.
выводы
1. Установлены особенности строения ЛПС Y. pestis subsp. pestis: глицин присоединяется в одно из свободных положений остатка LD-HepI в коре ЛПС; при повышенной температуре (37 °С) происходит замена одного из остатков Ara4N в липиде А на фосфатную группу с образованием пирофосфатной группы; фосфорилирование кора фосфоэтаноламшюм обнаружено в культурах Y. pestis, выращенных при температуре 25 СС; входящий в ЛПС остаток N-ацетилглюкозамина является не составной частью кора, а единственным сохранившимся компонентом утраченного О-антигена, выполнявшего в нем роль первого акцепторного моносахарида О-единицы.
2. Определена структура ЛПС представителей биоваров caucasica, altaica, hissarica и ulegeica Y. pestis subsp. microtus, филогенетически наиболее близких к прародителю чумного микроба - Y. pseudotuberculosis, общей чертой которых, кроме bv. ulegeica, является отсутствие одного из терминальных моносахаридов кора - DD-Hep, не являющееся причиной их избирательной вирулентности.
3. Установлено ранее неизвестное строение О-полисахаридов серова-ров 0:2Ь и 0:4b Y. pseudotuberculosis', уточнены структуры О-полисахаридов сероваров 0:1а, 0:1Ь, 0:2с и 0:4а и подтверждена структура О-полисахарида серовара 0:3; впервые определено строение кора ЛПС сероваров 0:1-0:4.
4. Найдено, что остаток GalNAc является первым моносахаридом биологического повторяющегося звена, присоединение которого к липидному носителю инициирует биосинтез О-аптигена Y. pseudotuberculosis серовара 0:3. Определена последовательность переноса на GalNAc других компонентов О-единицы — фукозы, маннозы и паратозы - и впервые обнаружена транслокация через мембрану недостроенных О-единиц с последующим переносом на олиго-сахарид кора.
5. Сконструирован набор нокаутных мутантов У. pestis с дефектами в одном или двух генах, участвующих в биосинтезе ЛПС. Установлены структуры мутантных ЛПС и на их основании определены функции генов всех глико-зилтрансфераз и двух ацилтрансфераз, а также порядок присоединения отдельных компонентов кора в ходе биосинтеза ЛПС.
6. • Получены данные, свидетельствующие о том, что ЛПС является одним из основных факторов патогешюсти Y. pestis-. укорочение кора в ЛПС-мутантах значительно уменьшает устойчивость бактерий к КАМП и НЧС, снижает ферментативную активность активатора плазминогена, что сопровождается снижением вирулентности ЛПС-мутантов для мышей и морских свинок.
7. Определено, что укорочение кора ЛПС чумного микроба до двух моносахаридов полностью подавляет вирулентность для морских свинок и мышей при подкожном заражении - гены waaC, hldE и waaA или кодируемые ими белки, ответственные за синтез внутренней области кора ЛПС, являются перспективными мишенями для поиска ингибиторов вирулентности Y. pestis.
8. Установлено, что полный рецептор бактериофага фА1122 находится во внутренней области кора ЛПС и включает остатки HepII и HepI, а также связанный с HepI остаток Glc, присоединенные к липиду А через остаток Kdo/Ko.
9. Показано, что препараты ЛПС, выделенные из IpxM мутантов Y. pestis с нарушенным синтезом ацилтрансферазы, отвечающей за включение в липид А лауриновой кислоты, в 5-10 раз менее токсичны, чем их исходные варианты, что приводит к 2,5-16-кратному снижению остаточной вирулентности аттенуированных штаммов Y. pestis, но не влияет на вирулентность штамма Y. pestis 231 дикого типа. Мутанты по гену IpxM вакцинного штамма EV обладают пониженной реактогенностью и повышенной протективностью.
10. Предложено при конструировании живых чумных вакцин для аттенуа-ции вирулентных штаммов К pestis использовать мутагенез генов waaC, hldE и waaA, а для снижения реактогенности вводить в штаммы мутацию по гену IpxM.
Практические рекомендации
1. При проведении паспортизации свежевыделенных штаммов Y. pestis следует определять нуклеотидные последовательности генов wabC и ail, являющиеся дополнительными критериями внутривидовой идентификации культур чумного микроба.
2. При изучении структурной организации ЛПС из штаммов Y. pestis следует использовать масс-спектрометрию высокого разрешения с ионизацией электрораспылением, примененную к интактному высокоочищенному липопо-лисахариду, позволяющую получать информацию как об олигосахариде кора, так и о липиде А чумного микроба.
3. При конструировании штаммов-продуцентов биологически активных веществ на основе грамотрицательных бактерий необходимо использовать мутантные штаммы, синтезирующие тетраацилированный ЛПС, что позволит исключить этап очистки конечного препарата от примесей эндотоксина.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Дентовская, С. В. Штаммовые отличия Yersinia pestis по чувствительности к бактерицидному действию сыворотки / С. В. Дентовская, Г. М. Титарева, Р. 3. Шайхутдинова, А. П. Анисимов // Успехи современного естествознания. - 2003. - № 10. - С. 63.
2. Шайхутдинова, Р.З. Биологические свойства msbB мутантов Yersinia pestis / P. 3. Шайхутдинова, А. Н. Мокриевич, С. В. Дентовская. А. П. Анисимов // Успехи современного естествознания. - 2003. - № 10. - С. 108.
3. Анисимов, А. П. Липоолигосахарид (ЛОС) Yersinia pestis - один из основных факторов патогенности и возможная мишень для химиотерапии / А. П. Анисимов, Ю. А. Книрель, Е. В. Виноградов, Б. Линднер, Н. А. Кочарова, С. В. Дентовская Н. К. Фурсова, И. В. Бахтеева, Г. М. Титарева, А. С. Шашков, Р. 3. Шайхутдинова, С. Н. Сенченкова, Т. А. Гремякова, О. Холст // Биотехнология: состояние и перспективы развитая: Матер. 2-го Московского международного Конгресса (10-14 ноября 2003 г., Москва). - М.: ЗАО "ПИК "Максима", РХТУ им. Д.И. Менделеева. - С. 15.
4. Титарева, Г. М. Штаммовые и подвидовые отличия в устойчивости Yersinia pestis к бактерицидному действию сыворотки / Г. М. Титарева, С. В. Дентовская. С. В. Балахонов, Р. 3. Шайхутдинова, А. П. Анисимов // Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, НИИ микробиологии МО РФ, 2003. - С. 121-122.
5. Титарева, Г. М. Анализ депозиции и деградации СЗ компонента комплемента на поверхности клеток Yersinia pestis / Г. М. Титарева, С. В. Дентовская. Р. 3. Шайхутдинова, А. П. Анисимов II Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, НИИ микробиологии МО РФ, 2003. - С. 122-123.
6. Шайхутдинова, Р. 3. Получение msbB мутантов Yersinia pestis / P. 3. Шайхутдинова, А. Н. Мокриевич, С. В. Дентовская, А. П. Анисимов // Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. -Киров, НИИ микробиологии МО РФ, 2003. - С. 136-137.
7. Анисимов, А. П. Изменения структуры и биологических свойств липополисахарида Yersinia pestis / А. П. Анисимов, Е. В. Виноградов, В. Lindner, Р. 3. Шайхутдинова, С. В. Дентовская, Н. К. Фурсова, И. В. Бахтеева, Г. М. Титарева, Н. А. Кочарова, С. Н. Сенченкова, О. Holst, Т. А. Гремякова, G. В. Pier, Ю. А. Книрель // Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review (12-15 июля 2004 г., Санкт-Петербург). - С.-П.: Институт особо чистых биопрепаратов. - С. 14-15.
8. Анисимов, А. П. Структура липополисахарида Yersinia pestis / А. П. Анисимов, Ю. А. Книрель, Б. Виноградов, Б. Линднер, Р. 3. Шайхутдинова, Н. А. Кочарова, С. Н.Сенченкова, С. В. Дентовская, Н. К.Фурсова, И. В. Бахтеева, Г. М. Титарева, С. В. Балахонов, О. Хольст, А. С. Шашков, Д. Б. Пиер, Т. А. Гремякова // Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний: Тезисы докладов международной конференции (8-10 сентября 2004 г., Со-сновка, Новосибирская область, Россия). - ЦЭРИС, Новосибирск, 2004. - С. 43-44.
9. Анисимов, А. П. Изучение структуры и биологических свойств ли-пополисахарида Yersinia pestis / А. П. Анисимов, Е. В. Виноградов, В. Lindner, Р. 3. Шайхутдинова, С. В. Дентовская, И. В. Бахтеева, Г. М. Титарева, Н. А. Кочарова, С. Н. Сенченкова, H. Visser, О. Holst, G. В. Pier, Ю. А. Книрель // Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review (10-13 октября 2005 г., Санкт-Петербург). - С.-П.: Институт особо чистых биопрепаратов. - С. 24-28.
10. Дентовская, С. В. Конструирование вакцинных штаммов гра-мотрицательных бактерий со сниженной реактогенностыо / С. В. Дентовская, Р.З. Шайхутдинова, Ю.А. Книрель, А.П. Анисимов // Молекул, генетика. - 2006. - № 2. - С. 3-8.
11. Дентовская, С. В. Длина кора липополисахарида Yersinia pestis определяет функциональную активность активатора плазминогена / С. В. Дентовская, М. Е. Платонов, И. В. Бахтеева, А. П. Анисимов // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: Материалы УП-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Оншценко, В.В. Кутырева, ИА. Дятлова. - Протвино: Изд-во А-ПРИНТ ЗАО, 2006. - С. 96-97.
12. Шайхутдинова, Р. 3. Получение штаммов Yersinia pestis, чувствительных к полимиксину В, методом инсерционного мутагенеза / Р. 3. Шайхутдинова, Г. М. Титарева, В. А. Баннов, С. В. Дентовская, О. В. Коробова, О. В. Быстрова, Ю. А. Книрель, А. П. Анисимов // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: Материалы VH-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Оншценко, В.В. Кутырева, ИА. Дятлова - Протвино: Изд-во А-ПРИНТ ЗАО, 2006. - С. 130-131.
13. Дентовская, С. В. Конструирование вакцин на основе грамотрица-телъных бактерий с генно-инженерно детоксицированным липополисахаридом / С. В. Дентовская, А. П. Анисимов // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: Материалы VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Оншценко, В.В. Кутырева, ИА. Дятлова. - Протвино: Изд-во А-ПРИНТ ЗАО, 2006. - С. 142-144.
14. Дентовская. С. В. Наличие полной структуры кора липополисахарида необходимо для активации плазминогена возбудителем чумы / С. В. Дентовская, M. Е. Платонов, И. В. Бахтеева, А. П. Анисимов // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - Вып. 93. - С. 49-51.
15. Федорова, В. А. Изучение молекулярных механизмов повышенной иммуногенности IpxM мутанта вакцинного штамма К pestis EV НИИЭГ / В. А. Федорова, JI. Н. Панькина, Е. П. Савостина, Р. 3. Шайхутдинова, С. В. Дентовская, А. П. Анисимов // Российский аллергологический журнал. - 2007. - № 3 (приложение № 1). - С. 315.
16. Дентовская, С. В. Генетический контроль синтеза кора липополисаха-рида Yersinia pestis / С. В. Дентовская, А. Н. Кондакова, В. Lindner, Р. 3. Шайхутдинова, Н. А. Кочарова, С. Н. Сенченкова, В. П. Левчук, С. А. Иванов, Ю. А. Кни-рель, А. П. Анисисмов // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Материалы \ТП Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (25-26 сентября 2007 г., Саратов) / Под ред. В. В. Кутырева. - Саратов: ООО "Приволжское издательство", 2007. - С. 195-196.
17. Копылов, П. X. Получение препарата белков наружных мембран Yersinia pestis, содержащего липополисахарид, для иммунохимических исследований / П. X. Копылов, Н. В. Киселева, С. В. Дентовская. А. П. Анисимов // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Материалы VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (25-26 сентября 2007 г., Саратов) / Под ред. В. В. Кутырева - Саратов: ООО "Приволжское издательство", 2007. - С. 224-225.
18. Копылов, П. X. Протеолиз рекомбинантного активатора плазминогена при ренатурации в присутствии липополисахарвдов Yersinia pestis / П. X Копылов, Н. В. Киселева, М. Е. Платонов, Р. 3. Шайхутдинова, С. В. Дентовская. А. П. Анисимов // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Материалы VIII Межгосударственной паучно-практической конференции государств-участников СНГ (25-26 сентября 2007 г., Саратов) / Под ред. В. В. Кутырева.
- Саратов: ООО "Приволжское издательство", 2007. - С. 226-227.
19. Шайхутдинова, Р. 3. Влияние структуры кора липополисахарида Yersinia pestis на чувствительность бактерий к литическому действию бактериофагов / Р. 3. Шайхутдинова, С. В. Дентовская. 10. А. Книрель, А. П. Анисимов // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Материалы VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (25-26 сентября 2007 г., Саратов) /Под ред. В. В. Кутырева.
- Саратов: ООО "Приволжское издательство", 2007. - С. 311-312.
20. Дентовская, С. В. Структурное разнообразие и эндотоксическая активность липополисахарида Yersinia pestis / С. В. Дентовская, И. В. Бах-теева, Г. М. Тнтарева, Р. 3. Шайхутдинова, А. Н. Кондакова, О. В. Быстро-ва, Б. Линднер, Ю. А. Книрель, А. П. Аписисмов // Биохимия. - 2008. - Т. 73.
- № 2. - С. 237-246.
21. Панькина, Л. Н. Модификация синтеза липополисахарида (ЛПС) и иммунодоминантных антигенов AlpxM мутанта Yersinia pestis EV НИИЭГ, ин-
дуцирующего повышенный уровень иммунитета к чуме у мышей и морских свинок /Л. Н. Панькина, В. А. Федорова, Е. П. Савостина, Л. В. Саяпина, С. В. Дентовская. Р. 3. Шайхутдинова, С. А. Агеев, Б. Линднер, А. Н. Кондакова, Н.
A. Комарова, С. Н. Сенченкова, Ю. А. Книрель, А. П. Анисисмов, В. Л. Мотин // Материалы четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.). - Санкт-Петербург, 2008. - С. 98.
22. Кондакова, А. Н. Строение липополисахарида и биологические свойства Yersinia pseudotuberculosis 02а и мутантов с нарушенным биосинтезом б-дезокси-о-манно-гептозы - компонента О-антигена / А. Н. Кондакова, О.
B. Быстрова, Р. 3. Шайхутдинова, С. В. Дентовская, Н. Хо, Б. Линднер, К. Крецене, А. П. Анисимов, Ю. А. Книрель // Международная научная конференция «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (2-6 июня 2008 г.). - Минск, 2008. - Т. 1. - С. 318-320.
23. Деитопская, С. В. Укорочение кора липополисахарида снижает вирулентность Yersiniapestis 1 С. В. Дентовская, Р. 3. Шайхутдинова, М. Е. Платонов, Т. И. Комбарова, Г. М. Титарева, И. В. Бахтеева, С. А. Иванов, А. П. Анисимов // Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ: Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств (30 сентября - 2 оюгября, 2008 г., Волгоград). / Под ред. Г.Г. Оншценко, BJB. Кутырева, В.В. Алексеева - Волгоград, 2008. - С. 66-67.
24. Дентовская, С. В. Укорочение кора липополисахарида снижает вирулентность Yersinia pestis / С. В. Дентовская, М. Е. Платонов, Т. И. Комбарова, Г. М. Титарева, И. В. Бахтеева, Р. 3. Шайхутдинова, С. А. Иванов, А. П. Анисимов И Проблемы особо опасных инфекций. - 2009. - Вып. 99. - С. 50-51.
25. Федорова, В. А. Аттенуированный штамм Yersinia pestis с генетически модифицированным липополисахаридом как кандидатная противочумная вакцина с улучшенными характеристиками / В. А. Федорова, Л. Н. Панысина, Е. П. Савостина, Л. В. Саяпина, О. Е. Кузнецов, Н. П. Коннов, С. А. Агеев, С. В. Дентовская, Р. 3. Шайхутдинова, А. П. Анисимов, А. И. Кондакова, Ю. А. Книрель, В. Л. Мотин Н Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения: Тезисы научно-практической конференции (25-30 мая 2009 г., Новый Свет, Крым, Украина). - Киев: Mavis Publisher, 2009. - С. 275-276.
26. Агеев, С. А. Конструирование варианта вакцинного штамма Yersinia pestis со сниженной реактогенностъю / С. А. Агеев, Р. 3. Шайхутдинова, С. В. Дентовская. А. П. Анисимов // Молекулярная медицина и биобезопасность: Тезисы VI Международной конференции (10-11 ноября 2009 г., Москва). - Москва: ©ММА им. И.М. Сеченова, 2009. - С. 29-30.
27. Агеев, С. А. Изучение иммуногснности ЬрхМ-отрицательных вариантов вакцинного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ с помощью «феномена переживания» при экспериментальной чуме / С. А. Агеев, Р. 3. Шайхутдинова, И. В. Бахтеева, Г. М. Титарева, Т. И. Комбарова, С. В. Дентовская, А. П.
Анисимов // Материалы научно практической школы конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г.). - Оболенск, 2010. - С. 255-257.
28. Платонов М. Е. Устойчивость Yersinia pestis к бактерицидной активности сыворотки опосредуется белком наружной мембраны Ail / М. Е. Платонов, Г. М. Титарева, С. В. Дентовская, А. П. Анисимов // Инфекции, обусловленные иерсиниями: Материалы Ш Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (12-14 октября 2011 г., Санкт-Петербург) / Под рея. ГЛ. Ценевой. - СПб: НИИЭМ им. Пасгера, 2011. - С. 89-90.
29. Агеев, С. А. Конструирование кандидата в вакцинные штаммы Yersinia pestis с пониженной реактогенносгыо / С. А. Агеев, Р. 3. Шайхутдинова, И. В. Бахтеева, Г. М. Титарева, Т. И. Комбарова, С. В. Дентовская. А. П. Анисимов // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 107. - С. 70-73.
30. Дентовская, С. В. Функциональная характеристика и биологическая роль генов биосинтеза липополисахарида Yersinia pestis / С. В. Дентовская, А. П. Анисимов, А. Н. Кондакова, Б. Линднер, О. В. Быстрова, Т. Э. Светоч, Р. 3. Шайхутдинова, С. А. Иванов, И. В. Бахтеева, Г. М. Титарева, Ю. А. Книрель // Биохимия. - 2011. - Т. 76. - № 7. - С. 989-1005.
31. Shaikhutdinova, R. Z. Phage-susceptibility testing and LPS-electrophoretic mobility analysis of different Yersinia pestis "subspecies" / R Z. Shaikhutdinova, T. A. Gremyakova, E. L. Zhilenkov, S. V. Dentovskava. A. P. Anisimov // Abstracts of the 8th International Symposium on Yersinia (September 4-8, 2002, Turku, Finland). - Turku, 2002. -P. 71.
32. Knirel, Y. A. Diversity and variations of the lipopolysaccharide (LPS) structure in Yersinia pestis / Y. A. Knirel, E. Vinogradov, B. Lindner, R. Z. Shaikhutdinova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, S. V. Dentovskava. N. K. Fursova, I. V. Bakhteeva, G. M. Titareva, S. V. Balakhonov, O. Hoist, A. S. Shashkov, G. B. Pier, T. A. Gremyakova, A. Anisimov // Abstracts of the 104th ASM General Meeting (May 23-27,2004, New Orleans, Louisiana). - J-012.
33. Shaikhutdinova, R. Z. Mutation in the nisbB (IpxM) gene of Yersinia pestis KM218 caused modifications in lipid A structure and influences biological properties of bacterial cell / R Z. Shaikhutdinova, S. N. Senchenkova, S. V. Dentovskava. B. Lindner, A. N. Mokrievich, G. M. Titareva, Y. A. Knirel, A. P. Anisimov // Abstracts of the IN-TAS strategic workshop, Bacterial glycoconjugates in prevention and diagnostics of emerging pathogens: 3rd Gemian-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates (October 6-9, 2004, Wroctaw, Poland), P12. - Wroctaw, Poland - P. 72-73.
34. Knirel, Y. A. Temperature-dependent variations and intraspecies diversity of the structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis / Y. A. Knirel, B. Lindner, E. V. Vinogradov, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, R Z. Shaikhutdinova, S. V. Dentovskava, N. К Fursova, L V. Bakhteeva, G. M. Titareva, S. V. Balakhonov, O. Hoist, T. A. Gremyakova, G. B. Pier, A. P. Anisimov // Biochemistry. - 2005. - Vol 44. -P. 1731-1743.
35. Anisimov, A. P. Intraspecies and temperature-dependent variations in susceptibility of Yersinia pestis to bactericidal action of serum and polymyxin
B / A. P. Anisimov, S. V. Dentovskaya, G. M. Titareva, I. V. Bakhtecva, R. Z. Shaikhutdinova, S. V. Balakhonov, B. Lindner, N. A. Kocharova, S. N. Senchen-kova, O. Hoist, G. B. Pier, Y. A. Knirel // Infect. Immun. - 2005. - Vol. 73. -P. 7324-7331.
36. Knirel, Y. A. Cold temperature-induced modifications to the chemical composition and biologic activity of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis / Y. A. Knirel, E. Vinogradov, B. Lindner, R. Z. Shaikhutdinova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, S. V. Dentovskaya, I. V. Bakhteeva, G. M. Titareva, O. Hoist, G. B. Pier, A. P. Anisimov // Abstracts of the 105th ASM General Meeting (June 5-9,2005, Atlanta, GA). - J-002.
37. Knirel, Y. A. Structural features and structural variability of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis, the cause of plague / Y. A. Knirel, S. V. Dentovskaya, S. N. Senchenkova, R. Z. Shaikhutdiniva, N. A. Kocharova, A. P. Anisimov //J. Endotoxin Res. - 2006. - Vol. 12. - № 1. - P. 3-9.
38. Knirel, Y. A. Mutational analysis of the Yersinia pestis YP00186/YP00187 locus / Y. A. Knirel, S. V. Dentovskaya, O. V. Bystrova, B. Lindner, R. Z. Shaikhutdinova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, O. Hoist, G. B. Pier, A. P. Anisimov // Abstracts of the 106lh ASM General Meeting (May 21-25, 2006, Orlando, FL). - D-090.
39. Knirel, Y. A. A role of the lipopolysaccharide structure in the resistance of Yersinia pestis to the bactericidal action of polymyxin B and serum / Y. A. Knirel, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, O. V. Bystrova, S. V. Dentovskaya. R. Z. Shaikhutdinova, G. M. Titareva, A. P. Anisimov, B. Lindner, O. Hoist, G. B. Pier // Abstracts of the 2006 NIAID Research Conference (June 24-30,2006, Opatija, Croatia). - P. 27.
40. Kopylov, P. Detection of Yersinia pestis: Search for new antigen targets / P. Kopylov,N. Kiseleva, E. Kruglova, S. Abbasova, V. Levchuk, A. Ulitin, M. Platonov, S. Dentovskaya. V. Nesmeyanov, A. Anisimov // Abstracts of the 2006 NIAID Research Conference (June 24-30,2006, Opatija, Croatia). - P. 30.
41. Shaikhutdinova, R. Influence of a IpxM mutation on Yersinia pestis virulence and immunogenicity / R. Shaikhutdinova, L. Pan'kina, V. Fedorova, E. Savosti-na, O. Bystrova, N. Kocharova, S. Senchenkova, B. Lindner, A. Mokrievich. S. Dentovskaya. Y. Knirel, A. Anisimov // Abstracts of the 2006 NIAID Research Conference (June 24-30,2006, Opatija, Croatia). - P. 47.
42. Knirel, Y. A. Role of the lipopolysaccharide structure in the resistance of Yersinia pestis to the bactericidal action of polymyxin B and serum / Y. A. Knirel, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, O. V. Bystrova, S. V. Dentovskaya. R. Z. Shaikhutdinova, G. M. Titareva, A. P. Anisimov, B. Lindner, O. Hoist, G. B. Pier // Program and abstracts for the 2006 meeting of the society for Glycobiology. - Glycobiology. -2006,-Vol. 16.-P. 1144-1144.
43. Knirel, Y. A. Relationship of structural variation in the lipopolysaccharide of Yersinia pestis to resistance to antimicrobial peptides and complement-mediated killing / Y. A. Knirel, S. V. Dentovskaya, O. V. Bystrova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, R. Z. Shaikhutdinova, G. M. Titareva, I. V. Bakhteeva, B. Lindner, G. B. Pier, A. P. Anisimov // Abstracts of the 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14,
2006, Lexington, Kentucky, USA), S7:3. - American Society for Microbiology, Washington, D.C., 2006. - P. 23-24.
44. Dentovskava, S. V. The full lipopolysaccharide core structure in Yersinia pestis is essential for manifestation of plasminogen activator tricks / S. V. Dentovskaya, M. E. Platonov, I. V. Bakhteeva, О. V. Bystrova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, B. Lindner, Y. A. Knirel, A. P. Anisimov // Abstracts of the 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA), S4:1. - American Society for Microbiology, Washington, D.C., 2006. - P. 63.
45. Anisimov, A. P. Influence of a lpx\{ mutation on Yersinia pestis virulence and immunogenicity / A. P. Anisimov, R. Z. Shaikhutdinova, L. N. Pan'kina, V. A. Feodorova, E. P. Savostina, О. V. Bystrova, B. Lindner, A. N. Mokrievich, I. V. Bakhteeva, G. M. Titareva, S. V. Dentovskava, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, Z. L. Devdariani, Y. A. Popov, G. B. Pier, Y. A. Knirel // Abstracts of the 9th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA), S4:l. - American Society for Microbiology, Washington, D.C., 2006. - P. 84.
46. Anisimov, A. P. Effect of deletion of the IpxM gene on virulence and vaccine potential of Yersinia pestis in mice 1 A. P. Anisimov, R. Z. Shaikhutdinova, L. N. Pan'kina, V. A. Feodorova, E. P. Savostina, О. V. Bystrova, B. Lindner, A. N. Mokrievich, I. V. Bakhteeva, G. M. Titareva, S. V. Dentovskava, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, O. Hoist, Z. L. Devdariani, Y. A. Popov, G. B. Pier, Y. A. Knirel // J. Med. Microbiol. - 2007. -Vol. 56. - № 4. - P. 443-453. (цитировано в международной базе PubMed)
47. Knirel, Y. A. Relationship of the lipopolysaccharide structure of Yersinia pestis to resistance to antimicrobial factors / Y. A. Knirel, S. V. Dentovskava, О. V. Bystrova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, R. Z. Shaikhutdinova, G. M. Titareva, I. V. Bakhteeva, B. Lindner, G. B. Pier, A. P. Anisimov // Adv. Exp. Med. Biol. - 2007. - Vol. 603. - P. 88-96. (цитировано в международной базе PubMed)
48. Feodorova, V. A. A Yersinia pestis //vdVf-mutant live vaccine induces enhanced immunity against bubonic plague in mice and guinea pigs / V. A. Feodorova, L. N. Pan'kina, E. P. Savostina, L. V. Sayapina, V. L. Motin, S. V. Dentovskava, R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Ivanov, B. Lindner, A. N. Kondakova, О. V. Bystrova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, O. Hoist, G. B. Pier, Y. A. Knirel, A. P Anisimov // Vaccine. - 2007. - Vol. 25. - P. 7620-7628.
49. Feodorova, V. A. Genetically modified live plague vaccine with improved characteristics to safety and immunogenicity / V. A. Feodorova, L. N. Pan'kina, E. P. Savostina, L. V. Sayapina, V. L. Motin, S. V. Dentovskava, R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Ivanov, B. Lindner, A. N. Kondakova, О. V. Bystrova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, O. Hoist, G. B. Pier, Y. A. Knirel, A. P Anisimov // Proceedings of the 50th ABSA Annual Biological Safety Conference (October 7-10, 2007, Nashville, Tennessee, USA), S4:l. - American Society for Microbiology, Mundelein, Illinois, 2007. - P. 18-19.
50. Knirel, Y. A. Structural studies of Yersinia lipopolysaccharides by highresolution electrospray ionization mass spectrometry / Y. A. Knirel, A. N. Kondakova. О. V. Bystrova, B. Lindner, R. Z. Shaikhutdinova, S. V. Dentovskava, A. P. Anisi-
mov II Glycobiology 2007: Annual Conference of the Society for Glycobiology. Boston, USA, 15-19 November 2007. - Glycobiology. - 2007. - Vol. 17. - P. 1237.
51. Kondakova, A. N. Reinvestigation of the O-antigens of Yersinia pseudotuberculosis: revision of the 02c and confirmation of the ОЗ antigen structures / A. N. Kondakova, О. V. Bystrova, R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Iva-nov, S. V. Dentovskaya. A. S. Shashkov, Y. A. Knirel, A. P. Anisimov // Carbo-hydr Res. - 2008. - Vol. 343. - № 14. - P. 2486-2488. (цитировано в международной базе PubMed)
52. Knirel, Y. A. New features of Yersinia lipopolysaccharides as revealed by high-resolution electrospray ionization mass spectrometry / Y. A. Knirel, A. N. Kondakova, О. V. Bystrova, B. Lindner, R. Z. Shaikhutdinova, S. V. Dentovskaya, A. P. Anisimov//Adv. Sci. Lett - 2008. - Vol. 1. - № 2. - P. 192-198. (цитировано в международной базе PubMed)
53. Knirel, Y. A. Elucidation of the lipopolysaccharide structure of Yersinia pseudotuberculosis / Y. A. Knirel, A. N. Kondakova, О. V. Bystrova, S. V. Dentovskaya, R. Z. Shaikhutdinova, B. Lindner, N. Ho, C. Creuzenet, A. P. Anisimov //XXIV International Carbohydrate Symposium, Oslo, Norway, July 26-August 1,2008. - F-P057.
54. Kondakova, A. N. Structure of the O-antigen of Yersinia pseudotuberculosis 0:4b / A. N. Kondakova, О. V. Bystrova, R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Ivanov, S. V. Dentovskaya. A. S. Shashkov, Y. A. Knirel, A. P. Anisimov // Carbohydr Res. -2009. - Vol. 344. - № 1. - P. 152-154.
55. Kondakova, A. N. Structure of the O-poly saccharide of Yersinia pseudotuberculosis 0:2b / A. N. Kondakova, О. V. Bystrova, R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Ivanov, S. V. Dentovskaya. A. S. Shashkov, Y. A. Knirel, A. P. Anisimov // Carbohydr Res. - 2009. - Vol. 344. - № 3. - P. 405-407.
56. Kondakova, A. N. Structure of the O-antigen of Yersinia pseudotuberculosis 0:4a revised / A. N. Kondakova, О. V. Bystrova, R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Ivanov, S. V. Dentovskaya. A. S. Shashkov, Y. A. Knirel, A. P. Anisimov // Carbohydr Res. - 2009. - Vol. 344. - № 4. - P. 531-534.
57. Feodorova, V. A. Pleiotropic effects of the IpxM mutation in Yersinia pestis resulting in modification of the biosynthesis of major immunoreactive antigens / V. A. Feodorova, L. N. Pan'kina, E. P. Savostina, O. S. Kuznetsov, N. P. Konnov, L. V. Sayapina, S. V. Dentovskaya, R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Ageev, B. Lindner, A, N. Kondakova, О. V. Bystrova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, O. Hoist, G. B. Pier, Y. A. Knirel, A. P. Anisimov, V. L. Motin // Vaccine. - 2009. - VoL 27. - P. 22402250.
58. Kondakova, A. N. Revision of the O-polysaccharide structure of Yersinia pseudotuberculosis 0:1b / A. N. Kondakova, R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Ivanov, S. V. Dentovskaya. A. S. Shashkov, A. P. Anisimov, Y. A. Knirel // Carbohydr. Res. - 2009. - Vol. 344. - № 17. - P. 2421-2423.
59. Feodorova, V. A. Yersinia pestis live vaccine with improved characteristics / V. A. Feodorova, L. N. Pan'kina, E. P. Savostina, O. S. Kuznetsov, N. P. Konnov, L. V. Sayapina, S. V. Dentovskaya. R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Ageev, B. Lindner, A. N. Kondakova, О. V. Bystrova, N. A. Kocharova, S. N.
Senchenkova, О. Hoist, G. В. Pier, Y. A. Knirel, A. P. Anisimov, V. L. Motin // Procedia Vaccinol. - 2009. - Vol. 1. - № 1. - P. 97-100. (цитировано в международной базе Scopus)
60. Feodorova, V. A. Development of new generation of plague vaccines with improved safety and immunity / V. A. Feodorova, L. N. Pan'kina, E. P. Savostina, O. S. Kuznetsov, N. P. Konnov, L. V. Sayapina, S. V. Dentovskava. R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Ageev, B. Lindner, A. N. Kondakova, О. V. Bystrova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, O. Ilolst, G. B. Pier, Y. A. Knirel, A. P. Anisimov, V.L. Motin // Abstracts of the 1st annual Biosafety Association for Central Asia and Caucasus conference "Biosafety and Bacterial-Viral Zoonotic Diseases" (May 18-20, 2009, Almaty, Kazakhstan). - Almaty: BACAC, 2009. - P. 85.
61. Anisimov, A. P. Yersinia pestis lipopolysaccharide in host-pathogen interactions / A. P. Anisimov, S. V. Dentovskava. A. N. Kondakova, B. Lindner, R. Z. Shaikhutdinova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, Y. A. Knirel // Abstracts of the 46lh Oholo Conference: "The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms -Mechanism of Virulence and Novel Medical Countermeasures" (October 25-29, 2009, Eilat, Israel). - Ness-Ziona: Institute for Biological Research, 2009. - P. 9.
62. Anisimov, A. P. Yersinia pestis lipopolysaccharide in host-pathogen interactions / A. P. Anisimov, S. V. Dentovskava. A. N. Kondakova, B. Lindner, R. Z. Shaikhutdinova, N. A. Kocharova, S. N. Senchenkova, Y. A. Knirel // The challenge of highly pathogenic microorganisms — mechanism of virulence and novel medical countermeasures (SchafTerman, A., Ordentlich, A., and Velan, В., eds), - Springer, Dordrecht, 2010. - P. 7787.
63. Feodorova, V. A. A live plaque vaccine candidate with improved safety and immunogenicity / V. A. Feodorova, L. N. Pan'kina, E. P. Savostina, O. S. Kuznetsov, N. P. Konnov, L. V. Sayapina, S. V. Dentovskava. R. Z. Shaikhutdinova, S. A. Ageev, B. Lindner, A. N. Kondakova , O. Hoist, G. B. Pier , Y. A. Knirel, A. P. Anisimov, V. L. Motin // The challenge of highly pathogenic microorganisms - mechanism of virulence and novel medical countermeasures (Schafferman, A., Ordentlich, A., and Velan, В., eds), - Springer, Dordrecht, 2010. - P. 261-268.
64. Kiljunen, S. Identification of the lipopolysaccharide core of Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis as the receptor for bacteriophage <pA1122 / S. Kiljunen, N. Datta, S. V. Dentovskava. A. P. Anisimov, Y. A. Knirel, J. A. Bengoe-chea, O. Hoist, M. Skurnik // J. Bacterid. - 2011. - Vol. 193. - № 18. - P. 4963-4972.
65. Kondakova, A. N. Revision of the O-polysaccharide structure of Yersinia pseudotuberculosis 0:1a; confirmation of the function of WbyM as paratosyl-transfcrase / A. N. Kondakova, A. M. Sevillano, R. Z. Shaikhutdinova, B. Lindner, N. A. Komandrova, S. V. Dentovskava. A. S. Shashkov, A. P. Anisimov, M. Skurnik, Y. A. Knirel // Carbohydr. Res. - 2012. - VoL 350. - P. 98-102. (цитировано в международной базе PubMed)
Список сокращений, используемых в тексте
12:0-лауроил 16:0 - пальмитоил 16:1 — пальмитолеоил
в/б - внутрибрюшинно ДСН — додецилсульфат натрия
ИОХ— институт органической химии им. Н.Д. Зелинского КАМП - катионные антимикробные пептиды КОЕ - колониеобразующая единица ЛПС - липополисахарид
ЛПС-6, ЛПС-25, ЛПС-37 - ЛПС из штаммов, выращенных при указанной температуре
МИК - минимальная ингибрующая концентрация
НЧС — нормальная (неиммунная) человеческая сыворотка
п/к - подкожно
ПМВ — полимиксин В
РАН - Российская академия наук
РосНИПЧИ-Российский научно-исследовательский противочумный институт
тНЧС — термоинактивированная НЧС
ЯМР — ядерный магнитный резонанс
Abe — абеквоза (3,6-дидезокси-0-ксило-гексоза)
Ara4N — 4-амино-4-дезоксиарабиноза
DD-HepIV - В-глга/еро-И-манпо-гстоза.
ESI FT-ICR MS - масс-спектры ион-циклотронного резонанса с ионизацией электрораспылением и Фурье-преобразованием EtNP - фосфоэтаноламин Fue - фукоза Gal — галактоза
GalNAc - 2-амино-2-дезоксигалактоза Glc — глюкоза
GlcNAc - N-ацетил-глюкозамин Gly — глицин
ImDjo - доза вакцинного штамма, предохраняющая от гибели 50 % экспериментальных животных
Kdo/Ko — 3-дезокси-0-л1анно-окт-2-улозоновая кислота/ Ъ-глицеро-О-тало-окг-2-улозоновая кислота
LD50 — доза летальная для 50 % животных (dosis letalis 50)
LD-HepI, LD-HepII, LD-HepIII - первый, второй и третий остатки L-глицеро-а-
D-лшнно-гептозы, соответственно
Man — манноза
ORF — открытая рамка считывания
Par - паратоза (3,6-дидезокси-О-рибо-гексоза)
ROESY - спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат
TNF-a - фактор некроза опухолей a ("tumor necrosis factor a") Tyv — тивелоза (3,6-дидеокси-0-арабино-гексоза)
Подписано в печать:
06.09.2012
Заказ № 7713 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.aatoreferat.ru
Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Дентовская, Светлана Владимировна
Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов
ВВЕДЕНИЕ.
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 Общие сведения о возбудителе чумы.
1.2 Липополисахариды - основной компонент внешней мембраны грамотрицательных бактерий.
1.2.1 Химическая структура и биологическая роль ЛПС представителей семейства Enterobacteriaceae.
1.2.2 Генетический контроль биосинтеза ЛПС у представителей семейства Enterobacteriaceae.
1.2.3 ЛПС патогенных для человека представителей рода Yersinia
1.3 Основные направления конструирования чумных вакцин нового поколения.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость липополисахарида Yersinia pestis"
Актуальность проблемы.
В настоящее время полидетерминированность вирулентности патогенных микроорганизмов и, в частности, возбудителя чумы - У. ре$И$ - является общепризнанной. При этом каждая из биомолекул (факторов патогенности) может обладать несколькими активностями, направленными на преодоление различных звеньев системы защиты макроорганизма. Реализация патогенных свойств У. резИБ в организме восприимчивого хозяина требует присутствия у возбудителя чумы целого набора факторов патогенности различной функциональной направленности и систем регуляции, обеспечивающих их координированную экспрессию. Абсолютизирование роли любого отдельно взятого из указанных факторов некорректно [3, 4, 30, 60, 99, 106, 107; 386]. Однако детальный анализ каждого из этих факторов лежит в основе системного подхода при изучении патогенности К резШ и разработке эффективных методов профилактики и лечения чумы.
Один из "классических" факторов патогенности грамотрицательных бактерий - липополисахарид (ЛПС) или эндотоксин - обладает целым рядом свойств, традиционно связываемых со способностью бактерий к эффективному размножению в организме хозяина [9, 95, 162, 163, 410, 424]. Липополисахарид расположен на поверхности грамотрицательных бактерий и участвует в специфическом взаимодействии с различными биологическими системами, в том числе с иммунной системой животных и человека. Вариабельность структур ЛПС у бактерий даже одного вида является защитным механизмом, сформировавшимся в ходе эволюции и являющимся фактором патогенности болезнетворных микробов. Интерес к ЛПС связан как с их использованием в качестве мишеней для диагностических и лекарственных препаратов, так и с фундаментальными задачами классической и молекулярной микробиологии и иммунологии, например, классификацией бактерий, выявлением молекулярных механизмов патогенеза инфекционных заболеваний, формированием врожденного и приобретенного иммунитета.
ЛПС К pestis обладает всеми классическими свойствами эндотоксинов, включая: токсичность для мышей, морских свинок, кроликов и обезьян; анти-генность для кроликов; способность вызывать у кроликов двухфазный пиро-генный ответ, а также местный или генерализованный феномен Швартцмана; способность вызывать у мышей толерантность к летальному действию эндотоксина [52]. Существует мнение, что "сам патогенез чумы в любой ее форме представляет собой собственно стадии развития" инфекционно-токсического шока [16]. Установлено, что ЛПС обеспечивает устойчивость Y. pestis к бактерицидному действию антимикробных катионных пептидов [82] и нормальной человеческой сыворотки [392], определяет функциональную активность другого фактора патогенности - активатора плазминогена [284, 396]. Особенностью ЛПС Y. pestis является вариабельность его структуры, которая является защитным механизмом, препятствующим распознаванию патогена иммунной системой [12; 331].
Основные сведения об ЛПС Y pestis были получены в последние годы. В работе E.V. Vinogradov et al. [500], представленной коллективом авторов, включающим сотрудников нашей лаборатории, впервые установлена полная структура углеводной части ЛПС, которая ограничена у Y. pestis олигосахари-дом кора. К. Kawahara et al. [255] обнаружили зависимость строения липидной части ЛПС (липида A) Y. pestis и его биологических свойств от температуры культивирования бактерий. P.G. Hitchen et al. [219] продемонстрировали роль двухкомпонентной системы передачи сигналов PhoPQ в контроле за биосинтезом кора ЛПС Y. pestis. Позднее R. Rebeil et al. [415] показали, что включение в липид А катионного моносахарида 4-амино-4-дезоксиарабинозы, обеспечивающего устойчивость Y. pestis к ПМВ, также находится под контролем системы PhoPQ.
В серии экспериментов, проведенных до начала настоящего исследования на ограниченном наборе штаммов, нами была выявлена взаимосвязь структуры ЛПС с чувствительностью к бактерицидному действию ПМВ и сыворотки различных подвидов Y pestis, различающихся по эпидемиологическому значению и выращенных при температурах тела млекопитающего (37 °С), блохи (25 °С) или животных в период зимней спячки (6 °С). В частности, высказано предположение о том, что для устойчивости Y. pestis к ПМВ важны не только высокое содержание 4-амино-4-дезоксиарабинозы в липиде А, но и определенная комбинация моносахаридов в коре, формирующаяся при 25 °С, а устойчивость к нормальной сыворотке человека связана с высоким содержанием в коре N-ацетилглюкозамина [62, 264, 267]. В то же время установление точной роли отдельных компонентов и участков структуры ЛПС в обеспечении устойчивости Y. pestis к антимикробным катионным пептидам и сыворотке и их вклада в вирулентность штаммов требовали дальнейшего изучения. Оставались невыяв-ленными и ^охарактеризованными гены, участвующие в биосинтезе кора ЛПС Y. pestis, - потенциальные молекулярные мишени для поиска ингибиторов вирулентности возбудителя чумы.
Y. pseudotuberculosis — эволюционный предшественник Y. pestis. Дивергенция этих бактерий произошла относительно недавно (1500-20000 лет назад) [48]. По строению генома и антигенным свойствам Y. pseudotuberculosis и Y. pestis имеют значительное сходство, однако если псевдотуберкулез - это преимущественно кишечная инфекция с относительно легким течением, то чума является острой генерализованной инфекцией с высокой летальностью [99].
Возбудитель чумы утратил способность к синтезу О-специфических по-лисахаридных цепей ЛПС (О-полисахарида, О-антигена), образуя так называемый липоолигосахарид (ЛОС) или R-форму ЛПС. По данным М. Skurnik et al. [449] наиболее вероятным предшественником Y. pestis является Y. pseudotuberculosis серовара О:lb: нуклеотидная последовательность кластера генов его О-антигена на 98,9 % гомологична аналогичному, но криптическому кластеру генов чумного микроба. Из 17 генов кластера, выявленных у Y. pseudotuberculosis, пять инактивированы в геноме чумного микроба за счет инсерций или делеций.
К моменту начала наших исследований были надежно установлены структуры О-полисахаридов лишь некоторых сероваров Y. pseudotuberculosis, в их составе идентифицированы такие характерные для этого вида бактерий компоненты как 3,6-дидезоксигексозы с различной конфигурацией и б-дезокси-D-лганно-гептоза, выявлены гены и установлены пути биосинтеза этих моносахаридов (для б-дезокси-О-лшнно-гептозы только на основании биоинформатиче-ского анализа соответствующих генов без биохимического подтверждения [375]). Однако строению кора и липида A Y. pseudotuberculosis уделялось мало внимания и не проводилось систематического и детального изучения их структурных и функциональных особенностей [100; 222]. Липид А этого микроорганизма анализировали с помощью плазменной и лазерной масс-спектрометрии [472], однако полученные результаты не были подкреплены данными химического анализа и представлялись ненадежными. Строение кора ЛИС Y. pseudotuberculosis современными методами до начала наших исследований не изучалось.
Проведение в рамках настоящей диссертационной работы систематического исследования молекулярно-генетических механизмов образования ЛПС Y pestis с привлечением комплекса методов бактериологии, генной инженерии, биохимии, биофизики и иммунологии, а также сравнительной оценки структуры ЛПС возбудителя чумы и его менее вирулентного прародителя, Y. pseudotuberculosis, необходимо для получения новых сведений о биосинтезе ЛПС, роли отдельных структурных компонентов ЛПС в патогенезе и иммуногенезе чумы. Оно позволит выявить новые молекулярные мишени для создания высокоспецифичных и эффективных препаратов для терапии чумы, а также разработать методологию получения экспериментальных вакцинных штаммов нового поколения, способных продуцировать ЛПС с пониженной токсичностью, что приведет к значительному снижению реактогенности живых чумных вакцин.
Цель исследования - получение новых сведений о структурной организации и генетическом контроле биосинтеза ЛПС Y. pestis, функциональной значимости его структурных компонентов в патогенезе и иммуногенезе чумы; конструирование экспериментальных вакцинных штаммов со сниженной реак-тогенностью.
Задачи исследования:
1. Установить структуры ЛПС дикого типа представителей различных внутривидовых групп Y. pestis и прародителя возбудителя чумы -Y pseudotuberculosis.
2. Изучить цитокин-индуцируюшую активность и летальную токсичность ЛПС штаммов Y. pestis - представителей различных внутривидовых групп, а также их устойчивость к бактерицидным катионным пептидам и литическому действию системы комплемента.
3. Провести in silico анализ опубликованных полногеномных последовательностей Y. pestis и выявить гены, предположительно отвечающие за биосинтез ЛПС.
4. Создать коллекцию изогенных штаммов Y. pestis, образующих различные структурные варианты ЛПС, и на их основе получить эффективную систему для комплексной сравнительной оценки биологических свойств возбудителя чумы, опосредованных ЛПС.
5. Выявить роль конкретных компонентов ЛПС и температурозависимых вариаций в структуре ЛПС в патогенезе чумы.
6. Определить потенциальные молекулярные мишени для разработки высокоспецифичных и эффективных препаратов для терапии чумы.
7. Обнаружить клеточный рецептор для бактериофага срА1122.
8. Разработать методологию конструирования экспериментальных вакцинных штаммов со сниженной реактогенностью с учетом полученных данных о молекулярно-генетических механизмах образования ЛПС Y. pestis.
Научная новизна.
В ходе исследований уточнена структура ЛПС Y. pestis subsp. pestis и установлено, что глицин присоединяется в одно из свободных положений остатка LD-HepI. Выявлено, что при повышенной температуре (37 °С) происходит замена одного из остатков Ara4N на фосфатную группу с образованием пирофосфатной группы, то есть повышение температуры культивирования Y. pestis сопровождается не только уменьшением положительного заряда на поверхности клетки за счет снижения содержания катионного моносахарида Ara4N в липиде А, но и увеличением отрицательного заряда путем дополнительного фосфорилирования. Полученные данные расширяют представления о структурном разнообразии и характере температурозависимых вариаций ЛПС Y pestis.
Впервые определена структура ЛПС представителей Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica, altaica, hissarica и ulegeica и показано, что ЛПС Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica, altaica и hissarica отличается от ЛПС Y. pestis subsp. pestis и ЛПС subsp. microtus bv. ulegeica отсутствием DD-Hep в любой из гликоформ олигосахарида.
Впервые установлена полная структура олигосахарида кора ЛПС представителей четырех сероваров Y. pseudotuberculosis (О: la, О:lb, 0:2b, 0:2с, 0:3, 0:4b) и обнаружены температурозависимые вариации строения кора и липида А. Сопоставление с ранее полученными данными для ЛПС Y. pestis не выявило существенных различий в строении и вариациях кора, тогда как высокотемпературные варианты липополисахарида Y. pseudotuberculosis отличались включением в состав липида А пальмитоильной группы, отсутствующей у возбудителя чумы.
Определены новые структуры и уточнены ранее предложенные структуры О-полисахаридов Y. pseudotuberculosis, в результате чего впервые получены данные о строении всех сероваров, входящих в серогруппы от 0:1 до 0:4. Уточнения коснулись положений замещения моносахаридов, находящихся в узле разветвления О-полисахаридов. Для серовара 0:3 установлена структура биологического повторяющегося звена, полимеризацией которого осуществляется синтез высокомолекулярного О-полисахарида. Сопоставление структур О-полисахаридов серог-рупп 0:1-0:4 подтвердило роль конфигурации 3,6-дидезоксигексозы в сероспеци-фичности бактерий и выявило сходства и различия в строении основной цепи О-полисахаридов различных сероваров Y. pseudotuberculosis.
Показано, что культивирование при температуре 6 °С, характерной для грызунов в период зимней спячки, приводит к повышению чувствительности возбудителя чумы к бактерицидному действию катионных пептидов и сыворотки. Изменение чувствительности к факторам врожденного иммунитета сопровождается изменением структуры ЛПС.
С помощью сайт-направленного мутагенеза сконструированы наборы изо-генных мутантов на модели аттенуированного штамма Y. pestis по 14 одиночным генам биосинтеза ЛПС: waaE (YP00054), waaA (YP00055), waaC (YP00056), waaF (YP00057), wabC (YP00186), wabD (YP00187), waaQ (YP00416), waaL (YP00417), MdE (YP00654), IpxM (YP02063), arnT (YP02421), IpxP (YP03632), wecA (YP03866), yhjW (YP04013), а также по четырем парам генов: YP00186/YP00417 (wabC/waaL), YP00187/YP00417 (wabD/waaL), YP00186/YP00187 (wabC/wabD) и YP00416/YP00417 waaQ/waaL)-, на модели вирулентного штамма Y. pestis по 6 генам биосинтеза ЛПС: waaE (YP00054), wabD (YP00187), waaQ (YP00416), waaL (YP00417), hldE (YP00654), IpxM (YP02063). С использованием масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением установлено строение ЛПС генерированных мутантных штаммов Y. pestis с единичными мутациями по генам гликозилтрансфераз и ацилтрансфераз и четырех двойных мутантов по генам гликозилтрансфераз в каждом штамме. Полученные данные позволили выяснить последовательность переноса моносахаридов при сборке олигосахарида кора ЛПС.
Впервые выявлены взаимосвязи между отдельными структурными элементами ЛПС и биологическими свойствами Y pestis, раскрывающие новые молекулярные механизмы патогенеза чумы. Показано, что структура ЛПС определяет устойчивость к действию полимиксина В и системы комплемента, а поэтапное укорочение кора ЛПС ведет к снижению и затем исчезновению фибринолитической и плазмокоагулазной активностей Pia, тогда как уменьшение степени ацилирования липида А не влияет на их проявление. Установлено, что мутанты Y pestis с двумя и менее остатками Сахаров в коре ЛПС не только чувствительны к КАМП и мем-брано-атакующему комплексу системы комплемента, но и авирулентны для лабораторных животных. Эти данные позволяют предложить гены waaC, hldE и waaA и/или кодируемые ими белки в качестве потенциальных молекулярных мишеней для ингибиторов вирулентности Y. pestis.
Установлено, что рецептор для фага срА1122 включает остатки НерИ и Hepl, а также остаток Glc, связанной с Hepl, присоединенные к липиду А Y. pestis через Kdo/Ko.
Показано, что ЫрхМ вариант высоковирулентного штамма, способного вызвать клинически выраженное заболевание при инокуляции малого числа бактериальных клеток, может индуцировать эндотоксический шок, несмотря на образование менее токсичных форм ЛПС, в то время как менее вирулентные бактерии для проявления этой активности нуждаются в синтезе высокотоксичных форм ЛПС. IpxM мутация приводила к снижению остаточной вирулентности аттенуиро-ванных штаммов Y. pestis, но не снижала вирулентность штамма Г. pestis 231 дикого типа. IpxM мутанты вакцинного штамма EV обладали пониженной реакто-генностью, сочетавшейся с повышенной протективностью.
Теоретическая значимость.
Определена функциональная значимость генов, ответственных за биосинтез ЛПС чумного микроба, и выявлены молекулярные патогенетические механизмы действия ЛПС Y. pestis. Научно обоснована и разработана концепция поэтапной сборки ЛПС чумного микроба из остатков Сахаров и жирных кислот.
Полученные новые данные о структуре ЛПС Y. pestis, генетической детерминированности его биосинтеза и влиянии изменений его структуры на биологические свойства бактерий позволили предложить потенциальные молекулярные мишени для поиска ингибиторов вирулентности возбудителя чумы, открывающие новые перспективы в разработке методов противодействия этому особо опасному патогену.
Выявлена степень филогенетической близости ферментов биосинтеза ЛПС Y. pestis гомологичным ферментам близкородственных (Yersinia spp.) и отдал еннородственных бактерий {Serratia proteamaculans, Klebsiella pneumoniae, Erwinia carotovora, Burkholderia spp., Photorhabdus luminescens, Legionella pneumophila, Shigella dysenteriae, Escherichia coli и Salmonella enterica), что расширяет представления о роли горизонтального переноса генов в ходе эволюционирования микроорганизмов.
Практическая значимость.
Сконструировано два набора изогенных мутантов чумного микроба, отличающихся по степени редуцированности ЛПС, которые позволяют получать достоверные данные о роли отдельных структурных компонентов ЛПС Y. pestis в проявлении патогенных и иммуногенных свойств возбудителя чумы. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск Московской обл.) депонировано 24 штамма Y. pestis.
Разработана методология направленного конструирования лишенных маркеров антибиотикоустойчивости неревертирующих ЫрхМ мутантов Y pestis, сочетающая прямой сайт-направленный мутагенез, клонирование мутантной аллели bdpxMv.cat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск Московской обл.) депонированы: штамм Е. coli DH5-Xpir/pCVD442-AlpxM: :cat, продуцирующий суицидный вектор pCVD442-АlpxM::cat, и донорный штамм Е. coli S\7-Xpir/pCVD442-AlpxM::cat, предназначенный для конъюгативной передачи суицидного вектора при создании кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной степенью ацилирования липида А на основе любых аттенуированных штаммов Y pestis.
Внедрение результатов исследования.
В базе данных Bacterial Carbohydrate Structure DataBase (Bacterial CSDB) version 3 DELTA (http://csdb.glycoscience.ru/bacterial/index.html) депонировано 50 структур молекул ЛПС Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. Номера доступа к структурам (Structure IDs): 101, 673, 675, 3722, 3723, 3724, 3725, 3726, 3727, 3728, 3729, 3730, 3731, 3914, 4230, 6782, 6783, 6784, 7353, 7354, 7355, 7356, 7357, 7358, 7359, 7360, 7361, 7362, 7439, 7567, 7568, 7569, 7668, 7669, 7670, 7671, 7672, 7691, 8397, 8401, 8402, 8403, 8647, 8648, 8649, 8650, 8651, 8652, 8653, 8654.
В базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) депонировано девять нуклеотидных последовательностей различных аллелей гена wabC из штаммов подвида microtus Y. pestis (регистрационные номера: JX262141, JX262142, JX262143, JX262144, JX262145, JX262146, JX262147, JX262148, JX262149) и одна - гена ail из штамма 1146 Y. pestis microtus bv. caucasica (регистрационный номер GenBank FJ447341).
Разработанные методические приемы, сконструированные плазмиды, штаммы и выделенные из них препараты ЛПС в настоящее время применяются в микробиологических, генетических, молекулярно-биологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск, Московская обл.), ФКУЗ РосНИПЧИ "Микроб", Ростовского НИПЧИ и ФИБХ РАН.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Разработанный комплекс методических приемов и сконструированная коллекция изогенных штаммов У реяНБ, отличающихся по степени редуцированности ЛПС, являются основой для проведения микробиологического, биохимического, биофизического и генетического изучения роли ЛПС в патогенезе и иммуногенезе чумы.
2. ЛПС - основной полифункциональный фактор патогенности У резШ, структура которого определяет способность к уклонению от распознавания иммунной системой организма хозяина, устойчивость к сыворотке крови и антимикробным катионным пептидам, ферментативную активность фактора распространения - активатора плазминогена, а также (после неконтролируемого размножения У резШ в организме хозяина) развитие эндотоксического шока и гибель, необходимую для дальнейшей передачи У резШ блохами.
3. Наличие полной структуры кора ЛПС (восемь остатков Сахаров) необходимо для максимальной ферментативной активности активатора плазминогена. При количестве остатков в составе олигосахарида кора менее пяти фибриноли-тическая и плазмокоагулазная активности не выявляются.
4. Полный рецептор фага фА1122 включает остатки НерП и Нер1, а также остаток С1с, связанной с Нер1, присоединенные к липиду А У реБйБ через Кёо/Ко.
5. Отсутствие в клетках 1рхМ мутанта вакцинного штамма У резйБ ЕУ линии НИИЭГ гексаацилированных молекул ЛПС вызывает сочетанное снижение остаточной вирулентности и повышение протективной активности. По сравнению с исходным штаммом, величина ЬО50 мутанта ЕУА 1рхМ при подкожном заражении мышей возросла в 4,6 раз, а протективная активность выросла на 2 порядка.
6. Разработанный комплекс методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов обеспечивает контролируемое конструирование лишенных маркеров лекарственной устойчивости 1рхМ мутантов У реяНз - кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью.
Связь темы исследования с планом научной работы учреждения.
Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы отдела особо опасных инфекций ФБУН ГНЦПМБ по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: "Изучение молекулярных механизмов патогенеза и иммуногенеза чумы, псевдотуберкулеза, сибирской язвы и туляремии" научный руководитель темы - А.П. Анисимов, № гос. регистрации 0120.0. 409077"; "Структурная организация и биологические свойства липополисахарида Yersinia pestis" отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации» (договор с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 74-Д от 31 декабря 2005 г.), научные руководители темы: С.В. Дентовская и А.П. Анисимов. Данная работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 06-04-49280-а "Структурно-функциональный и генетический анализ липополисахарида возбудителя чумы, Yersinia pestis, с помощью сайт-направленного мутагенеза", научный руководитель темы - А.П. Анисимов; проект № 08-04-00403-а "Структурно-функциональный и генетический анализ липополисахарида патогенных бактерий Yersinia pseudotuberculosis с помощью сайт-направленного мутагенеза", научный руководитель темы - С.В. Дентовская) и Международного научно-технического центра (проект МНТЦ № 1197 "Изучение роли структурной организации липополисахаридов Yersinia pestis в создании иммунных препаратов", научный руководитель темы - А.П. Анисимов).
Личный вклад соискателя.
Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве с к.б.н. Р.З Шайхутдиновой, к.м.н. Г.М. Титаревой, к.б.н. М.Е. Платоновым и к.б.н. С.А. Агеевым (ФБУН ГНЦПМБ). Эксперименты по получению ЫрхМ мутанта на модели вирулентного штамма Y. pestis 231 и его оценке выполнены совместно с Панькиной Л.Н. (РосНИПЧИ "Микроб", Саратов). На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея которых принадлежит автору данной диссертации и в получении которых роль автора была определяющей.
Масс-спектрометрию препаратов ЛПС проводила А.Н. Кондакова и ЯМР-спектроскопию выполнял A.C. Шашков (ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН, г. Москва). Эксперименты по поиску клеточного рецептора для бактериофа фА1122 проводились совместно с сотрудниками лаборатории М. Skurnik (University of Helsinki, Finland). Всем им автор выражает глубокую благодарность.
Апробация работы.
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на Ученом Совете ФГУН ГНЦПМБ 14 апреля 2006 г. протокол № 2. Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научной конференции ФБУН ГНЦ ПМБ 13 июля 2012 г. протокол № 25.
Материалы диссертации доложены и представлены на: 8th International Symposium on Yersinia (September 4-8, 2002, Turku, Finland); 2-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (10-14 ноября 2003 г., Москва); 104th ASM General Meeting (May 23-27, 2004, New Orleans, Louisiana, USA); Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (12-15 июля 2004 г., Санкт-Петербург); Международной конференции "Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний" (8-10 сентября 2004 г., "Сосновка", Новосибирская область, Россия); INTAS strategic workshop, Bacterial glycoconjugates in prevention and diagnostics of emerging pathogens: 3rd German-Polish-Russian meeting on bacterial carbohydrates (October 6-9, 2004, Wroclaw, Poland); 105th ASM General Meeting (June 5-9, 2005, Atlanta, GA, USA); VI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях" (13-14 сентября 2005, Волгоград); Международной конференции "Предотвращение распространения биологического оружия: The cooperative biological research: Annual review" (10-13 октября 2005 г., Санкт-Петербург); 106th ASM General Meeting (May 21-25, 2006, Orlando, FL, USA), 2006 NIAD Research Conference (June 24-30, 2006, Opatija, Croatia); VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств:» (3th
5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.); 9 International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA); VIII-ой Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (25-26 сентября 2007 г., Саратов); Пятой научно-практической конференции "Инфекционные болезни и антимикробные средства" (4-5 октября 2007 г., Москва); Annual Conference of the Society for Glycobiology. (15-19 November 2007, Boston, USA); 50th ABSA Annual Biological Safety Conference (October 7-10, 2007, Nashville, Tennessee, USA); Vaccine Congress, (9-11 December 2007, Amsterdam, The Netherlands); IV-ой Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (2-4 июня 2008 г., Санкт-Петербург); Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (2-6 июня 2008 г., Минск); XXIV International Carbohydrate Symposium, July (26-August 1, 2008, Oslo, Norway); IX-ой Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств» (30 сентября - 2 октября, 2008 г., Волгоград); 1st annual Biosafety Association for Central Asia and Caucasus conference "Biosafety and Bacterial-Viral Zoonotic Diseases" (May 18-20, 2009, Almaty, Kazakhstan); 46th Oholo Conference: "The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms - Mechanism of Virulence and Novel Medical Countermeasures" (October 25-29, 2009, Eilat, Israel);: II-ой научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспот-ребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (25-27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.); 10th International Symposium on Yersinia (October 23-27, 2010, Recife, Brazil); III-ей Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (12-14 октября 2011 г., Санкт-Петербург); IV-ом ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (26-28 марта 2012 г., Москва).
Материалы диссертации широко обсуждаются в научной периодике - на 02.07.2012 г. по данным Web of Science®, Scopus и РИНЦ зафиксировано 224 цитирования публикаций С.В. Дентовской по теме диссертации.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 65 научных работ, в том числе, 18 - в рецензируемых изданиях (6 - в отечественных, 12 - рецензируемых в международных библиографических базах Web of Science/Web of Knowledge, Scopus и/или PubMed); 2 главы - в коллективной международной монографии; 7 -в других научных изданиях; 3 - в сборниках научных трудов; 35 - в материалах конференций. Список публикаций приведен в автореферате.
Структура и объем диссертации.
Работа состоит из введения; обзора литературы; 7 глав собственных исследований, включающих описание и обсуждение полученных результатов экспериментальной части; заключения; выводов; списка литературы, состоящего из 537 цитируемых работ (46 работ отечественных и 491 работа зарубежных авторов). Текст включает 21 таблицу и иллюстрирован 31 рисунком. Общий объем диссертации составляет 311 страниц.
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дентовская, Светлана Владимировна
248 ВЫВОДЫ
1. Установлены особенности строения ЛПС Y. pestis subsp. pestis: глицин присоединяется в одно из свободных положений остатка LD-HepI в коре ЛПС; при повышенной температуре (37 °С) происходит замена одного из остатков Ara4N в липиде А на фосфатную группу с образованием пирофосфатной группы; фосфо-рилирование кора фосфоэтаноламином обнаружено в культурах Y. pestis, выращенных при температуре 25 °С; входящий в ЛПС остаток N-ацетилглюкозамина является не составной частью кора, а единственным сохранившимся компонентом утраченного О-антигена, выполнявшего в нем роль первого акцепторного моносахарида О-единицы.
2. Определена структура ЛПС представителей биоваров caucasica, altaica, hissarica и ulegeica Y. pestis subsp. microtus, филогенетически наиболее близких к прародителю чумного микроба - Y. pseudotuberculosis, общей чертой которых, кроме bv. ulegeica, является отсутствие одного из терминальных моносахаридов кора - DD-Hep, не являющееся причиной их избирательной вирулентности.
3. Установлено ранее неизвестное строение О-полисахаридов серова-ров 0:2Ь и 0:4b Y. pseudotuberculosis', уточнены структуры О-полисахаридов се-роваров 0:1а, О:lb, 0:2с и 0:4а и подтверждена структура О-полисахарида се-ровара 0:3; впервые определено строение кора ЛПС сероваров 0:1-0:4.
4. Найдено, что остаток GalNAc является первым моносахаридом биологического повторяющегося звена, присоединение которого к липидному носителю инициирует биосинтез О-антигена Y. pseudotuberculosis серовара 0:3. Определена последовательность переноса на GalNAc других компонентов О-единицы - фукозы, маннозы и паратозы - и впервые обнаружена транслокация через мембрану недостроенных О-единиц с последующим переносом на олиго-сахарид кора.
5. Сконструирован набор нокаутных мутантов Y. pestis с дефектами в одном или двух генах, участвующих в биосинтезе ЛПС. Установлены структуры мутантных ЛПС и на их основании определены функции генов всех глико-зилтрансфераз и двух ацилтрансфераз, а также порядок присоединения отдельных компонентов кора в ходе биосинтеза ЛПС.
6. Получены данные, свидетельствующие о том, что ЛПС является одним из основных факторов патогенности Y. pestis: укорочение кора в ЛПС-мутантах значительно уменьшает устойчивость бактерий к КАМП и НЧС, снижает ферментативную активность активатора плазминогена, что сопровождается снижением вирулентности ЛПС-мутантов для мышей и морских свинок.
7. Определено, что укорочение кора ЛПС чумного микроба до двух моносахаридов полностью подавляет вирулентность для морских свинок и мышей при подкожном заражении - гены waaC, hldE и waaA или кодируемые ими белки, ответственные за синтез внутренней области кора ЛПС, являются перспективными мишенями для поиска ингибиторов вирулентности Y. pestis.
8. Установлено, что полный рецептор бактериофага фА1122 находится во внутренней области кора ЛПС и включает остатки HepII и HepI, а также связанный с HepI остаток Glc, присоединенные к липиду А через остаток Kdo/Ko.
9. Показано, что препараты ЛПС, выделенные из IpxM мутантов Y. pestis с нарушенным синтезом ацилтрансферазы, отвечающей за включение в липид А лауриновой кислоты, в 5-10 раз менее токсичны, чем их исходные варианты, что приводит к 2,5-16-кратному снижению остаточной вирулентности аттенуированных штаммов Y. pestis, но не влияет на вирулентность штамма Y. pestis 231 дикого типа. Мутанты по гену IpxM вакцинного штамма ЕУ обладают пониженной реактогенностью и повышенной протективностью.
10. Предложено при конструировании живых чумных вакцин для аттенуа-ции вирулентных штаммов Y. pestis использовать мутагенез генов waaC, hldE и waaA, а для снижения реактогенности вводить в штаммы мутацию по гену IpxM.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Исследования, посвященные изучению факторов и механизмов патоген-ности болезнетворных бактерий, представляют интерес для ученых во всем мире. На фоне быстрого развития методологии молекулярной биологии - доступности полных нуклеотидных последовательностей геномов отдельных микроорганизмов, разработки новых методов клеточной биологии и клеточной иммунологии, более широкого использования кристаллографии и других способов изучения структурно-функциональной организации отдельных биомолекул - появляется возможность по-новому оценить, казалось бы, уже хорошо изученные бактериальные факторы патогенности. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей отдельных факторов патогенности различных видов бактерий в ряде случаев позволяет выявить их филогенетическое родство, вскрывает существующие в природе взаимосвязи, дает обобщенную картину путей эволюции микроорганизмов. Понимание молекулярной и клеточной основы взаимодействий патоген-хозяин необходимо для разработки современных диагностических, профилактических и лечебных препаратов.
ЛПС болезнетворных грамотрицательных бактерий играет важную роль в патогенезе вызываемых ими инфекционных заболеваний [335]. Структура компонентов ЛПС: О-полисахарида, олигосахарида кора и липида А влияет на вирулентность микроорганизма [507]. Кроме того, она определяет распознавание грамотрицательных бактерий системой врожденного иммунитета [72], широко используется в качестве основы для серологической классификации бактерий [138] и может быть мишенью для протективного приобретенного иммунитета [443].
Представленные в настоящем исследовании данные имеют общебиологическое значение и направлены на получение новых сведений о структурной организации и генетическом контроле образования ЛПС Y. pestis, функциональной значимости его структурных компонентов в патогенезе и иммуногенезе чумы; они также открывают путь к созданию экспериментальных вакцинных штаммов со сниженной реактогенностью. Наибольшее внимание в работе уделено роли ЛПС, а также его отдельных структурных компонентов во взаимодействии чумного микроба с окружающей средой (организмами лабораторных животных, отдельными компонентами системы врожденного иммунитета, бактериофагами).
На первом этапе мы попытались выявить характерные особенности и тем-пературозависимые вариации в структуре ЛПС представителей различных внутривидовых групп Y. pestis и прародителя возбудителя чумы - Y. pseudotuberculosis. В ходе выполнения этой части исследования уточнена структура ЛПС «дикого типа» Y. pestis subsp. pestis. Так, найдено, что глицин присоединяется в одно из свободных положений остатка LD-HepI. Показано, что фосфоэта-ноламин может включаться в состав кора ЛПС не только при культивировании бактерий при пониженной температуре (6 °С), но и при обычной температуре (25 °С). Обнаружено, что при повышенной температуре (37 °С) происходит замена одного из остатков Ara4N на фосфатную группу с образованием пирофос-фатной группы. Таким образом, Y. pestis реагирует на повышение температуры культивирования не только уменьшением положительного заряда на поверхности клетки за счет снижения содержания катионного моносахарида Ara4N в ли-пиде А, но и увеличением отрицательного заряда путем дополнительного фос-форилирования.
Выявлено, что у штаммов Y. pestis subsp. pestis 10-35 % коровых олигоса-харидов лишены терминального остатка GlcNAc, и для всех изученных штаммов subsp. microtus, кроме bv. caucasica 1146, данный показатель также составляет 6-32 %. Мы предположили, что входящий в ЛПС возбудителя чумы остаток N-ацетилглюкозамина является не составной частью кора, а единственным сохранившимся компонентом утраченного возбудителем чумы О-антигена, выподнявшем в нем роль первого и, следовательно, акцепторного моносахарида О-единицы. Это предположение подтверждается низкой идентичностью (лишь 90,4 %) wzx генов для транспортера О-единиц (флиппазы), представленных в Wzy-зависимом пути сборки О-антигена Y. pestis и Y. pseudotuberculosis 0:1b, при том,, что идентичность всех других генов кластеров О-антигена составляет почти 100%. Тот факт, что лигаза WaaL, а не обычная гликозилтрансфераза, необходима для присоединения GlcNAc к ЛПС, также подтверждает, что данный моносахарид не является компонентом собственно кора, а заменяет О-антиген, биосинтез которого нарушен у Y. pestis [449]. Далее, нам удалось установить структуру и порядок сборки, так называемого, биологического повторяющегося звена (О-единицы) О-полисахарида возбудителя псевдотуберкулеза - олигосахарида, предварительно собранного на липидном носителе по Wzy-зависимому пути биосинтеза [410], который затем переносятся через цитоплаз-матическую мембрану и присоединяется к кору-липиду А с образованием SR-формы ЛПС. На примере штамма Y. pseudotuberculosis В-5962, принадлежащего к серовару 0:3, показано, что остаток GalNAc является первым моносахаридом биологической О-единицы, чей перенос на липидный носитель инициирует биосинтез О-антигена. Выявление GalNAc или GlcNAc во всех исследованных нами сероварах Y. pseudotuberculosis, включая штаммы, относящиеся к наиболее вероятному прародителю серовару О:lb (табл.9), еще раз свидетельствует в пользу того, что GlcNAc является первым моносахаридом биологической О-единицы и у штаммов Y pseudotuberculosis серовара О: lb и соответственно единственным моносахаридом О-антигена у Y pestis. По-видимому, у Y. pestis произошло изменение субстратной специфичности флиппазы, приспособившей ее к транслокации через мембраны лишь единичного остатка GlcNAc, а не единицы О-антигена, как у Y. pseudotuberculosis.
С помощью масс-спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением, примененной к интактному высокоочищенному ЛПС, мы изучили строение липополисахаридов Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica, bv. altaica и bv. hissarica (по два штамма каждого биовара), а также одного штамма bv. ulegeica. Показано, что основным отличием ЛПС Y. pestis subsp. microtus bv. caucasica, altaica и hissarica с одной стороны от ЛПС У. pestis subsp. pestis и subsp. microtus bv. ulegeica с другой стороны является отсутствие терминального моносахарида DD-Hep в любой из гликоформ корового олигосахарида. Молекулярная основа данного феномена, установленная нами путем секвенирования, заключается в наличии мутаций со сдвигом рамки считывания в гене wabC, кодирующем DD-Нер-трансферазу. Эта мутация приводит к синтезу белка размерами не 326 аминокислот, как у штаммов основного подвида, а 192 аминокислоты в случае биоваров caucasica и hissarica или 34 аминокислоты у изолятов био-варов altaica и talassica.
Найдено, что как и в ЛПС одного из изученных нами штаммов Y. pestis subsp. pestis, в ЛПС-25 и ЛПС-37 subsp. microtus bv. caucasica (три штамма) и bv. altaica (два штамма), но не bv. hissarica, присутствует в нестехиометрическом количестве глицин, присоединенный к Hepl.
В ходе настоящего исследования фосфорилирование фосфоэтаноламином впервые обнаружено в ЛПС, выделенных из 25-градусных культур Y. pestis subsp. microtus bv. altaica, bv. hissarica и bv. ulegeica. Установлено, что в ЛПС-25, как и в ЛПС-6, фосфоэтаноламин является компонентом только Ко-содержагцих гликоформ кора, наиболее вероятно расположенным в таком же положении 8 латерального остатка Ко.
Обнаружено, что, как и у штаммов Y pestis subsp. pestis, содержание галактозы в ЛПС из штаммов subsp. microtus bv. caucasica и bv. altaica снижается с повышением температуры культивирования, и изменения в относительном содержании Kdo и Ко носят такой же отчетливо выраженный температурозависи-мый характер.
Ранее было показано, что Y. pseudotuberculosis, в отличие от Y. pestis, продуцирует S- и SR-формы ЛПС, содержащие длинную О-полисахаридную цепь или одну О-единицу, связанные с кором соответственно. В ходе нашей работы впервые установлены (0:2b, 0:4Ь), уточнены (0:1а, О:lb, 0:2с, 0:4а) или подтверждены (0:3) структуры О-антигенов Y. pseudotuberculosis. Отметим, что в О-полисахаридах всех изученных сероваров Y. pseudotuberculosis в боковой цепи находятся необычные моносахариды - 3,6-дидезоксигексозы, и именно их конфигурация определяет серологическую специфичность штамма и, соответственно, его принадлежность к тому или иному серовару. Так, паратофураноза характерна для серогруппы 0:1, абеквоза - для серогруппы 0:2, паратопираноза -для серогруппы 0:3 и тивелоза - для серогруппы 0:4. Иммунодоминирующий характер 3,6-дидезоксигексоз объясняется их положением в боковой цепи О-полисахаридов, что делает их наиболее доступными для взаимодействия с иммунной системой организма-хозяина. Наряду с 3,6-дидезоксигексозами в состав О-полисахаридов сероваров 0:1а и 0:4Ь входит еще один редко встречающийся моносахарид - б-декозси-Б-лшяногептоза. Сероспецифичность сероваров внутри серогрупп определяется различиями в строении основной цепи О-полисахаридов, включая число моносахаридных остатков в повторяющемся звене, которое в основной цепи варьируется от двух в сероварах 0:1а и 0:4Ь до трех в сероварах 0:2Ь и 0:3 и четырех в сероварах О:lb, 0:2с и 0:4а.
Впервые продемонстрировано, что кор R-форм ЛПС исследованных нами штаммов Y. pseudotuberculosis сероваров 0:1-0:4 не имеет существенных отличий от изученного нами ранее кора ЛПС Y. pestis subsp. pestis, включая подобный характер температурозависимых структурных вариаций. Кроме того, тем-пературозависимые изменения в степени ацилирования липида А также подобны у возбудителей чумы и псевдотуберкулеза, за исключением того, что Y. pestis потеряла способность включать в липид А группу 16:0 при высокой температуре культивирования вследствие мутации в гене pagP. Результаты, полученные в настоящем разделе работы, легли в основу исследований по оценке вклада отдельных структурных компонентов ЛПС в биологические свойства Y. pestis, определяющие патогенез чумы.
Следующий этап нашей работы был посвящен изучению цитокин-индуцирующей активности и летальной токсичности ЛПС из штаммов Y. pestis «дикого типа» - представителей различных внутривидовых групп, а также определению устойчивости возбудителя чумы к бактерицидным катионным пептидам и литическим пептидам системы комплемента. Выявлены определенные корреляции между биологической активностью и химической структурой ЛПС. Так, получили подтверждение полученные ранее данные [255, 415] о том, что повышение эндотоксической активности коррелирует с более высокой степенью ацилирования низкотемпературных ЛПС, в частности, с присутствием в них гексаацилированных форм липида А, которые отсутствуют в высокотемпературных препаратах. Показано отсутствие строгой корреляции между индукцией ФНО-а в клетках мышиной макрофагоподобной клеточной линией J774A. 1 в ответ на стимуляцию ЛПС in vitro и летальной токсичностью ЛПС in vivo, что характерно и для препаратов ЛПС, выделенных из других грамотрица-тельных бактерий [58, 304]. Полученные нами данные позволили предположить, что различие в строении кора ЛПС представителей основного и неосновного подвидов, а именно, отсутствие в последних терминального остатка DD-Hep, является причиной различной конформации липида А, которая в конечном счете и определяет эндотоксическую активность ЛПС.
При оценке взаимосвязи между биологическими свойствами штаммов Y. pestis и структурой ЛПС нами показана прямая корреляция устойчивости к полимиксину В с содержанием в коровой части ЛПС катионного компонента -глицина. Это дополняет известную для представителей Enterobacteriaceae прямую корреляции данного свойства с содержанием другого катионного компонента - Ara4N, присоединенного к фосфатным группам липида А, и обратную взаимосвязь с уровнем адсорбции ПМВ на ЛПС [197, 415, 477, 535]. Биологическая роль глицина в ЛПС до настоящего времени не установлена, однако можно предположить, что наряду с Ага4Ы глицин вносит определенный вклад в снижение проницаемости наружной мембраны бактерий для катионных антимикробных пептидов путем уменьшения ее суммарного отрицательного заряда [330].
Анализ полученных нами данных позволил предположить, что чувствительность У реьйБ к НЧС связана с сочетанной утратой способности включения в кор терминального остатка ОБ-Нер и снижением включения в эту же часть молекулы ЛПС еще одного терминального остатка - в1сКАс.
Что касается незначительного числа обнаруженных нами штаммов биовара саисаэюа, чувствительных к действию ПМВ при 25 °С, то это расхождение с данными И.Л. Мартиневского и И.С. Аракеляна (цитируется по А.Р. Агшипоу е1 а!., [63]) может быть связано с тем, что, в отличие от цитируемой работы, мы не имели возможности работать со свежими изолятами. Все наши исследования проведены на лабораторных штаммах, подвергавшихся неоднократным пересевам, в ходе которых могла произойти селекция ПМВ-устойчивых клонов. Аналогичная ситуация имеет место и с чувствительностью исследованных нами лабораторных штаммов биовара саисазюа к НЧС.
Таким образом, настоящий раздел нашего исследования выявил взаимосвязи температурозависимых изменений в структуре ЛПС представителей различных внутривидовых групп У. резйБ с токсичностью препаратов ЛПС, а также частичную корреляцию между температурозависимыми и внутривидовыми особенностями строения ЛПС и способностью У. реБйз выживать и размножаться в присутствии ПМВ и комплемента НЧС.
Так как только нокаутный мутагенез генов, включенных в биосинтез ЛПС, с последующей комплементацией могут пролить свет на вклад отдельных частей молекулы в устойчивость к действию факторов врожденного иммунитета и патогенез чумы, мы провели функциональный анализ генов, ответственных за синтез отдельных участков кора и липида A Y. pestis. На первом этапе были проанализированы опубликованные полногеномные нуклеотидные последовательности Y. pestis с целью обнаружения генов, гомологичных уже охарактеризованным генам других грамотрицательных бактерий с подобными структурами/структурными компонентами ЛПС. Таким образом, мы выбрали 14 генов-мишеней для проведения сайт-направленного мутагенеза. Затем мы сконструировали 14 одинарных и 4 двойных мутанта по генам биосинтеза ЛПС на основе авирулентного штамма КМ260(11) для подтверждения их функции и оценки влияния отдельных структурных компонентов ЛПС на ряд факторов патогенно-сти чумного микроба, в том числе и взаимодействие со специфичным для Y. pestis бактериофагом фА1122. Вирулентный штамм «дикого типа» 231 использовали для получения шести одинарных мутантов, необходимых для изучения взаимосвязи структуры ЛПС с вирулентностью Y. pestis в отношении лабораторных животных.
Таким образом, одним из основных итогов методической части работы является создание комплекса приемов, позволяющих проводить направленное конструирование штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis с редуцированной в различной степени молекулой ЛПС. Разработанный нами подход позволяет получать достоверные данные о роли отдельных структурных компонентов ЛПС в проявлении патогенности и иммуногенности возбудителя чумы.
Определение и сравнительный анализ структур ЛПС из мутантных штаммов позволил установить функциональную значимость всех подвергнутых мутагенезу генов, в том числе выявить два уникальных гена, обнаруженных к настоящему моменту только у чумного микроба, - wabC и wabD, кодирующих гликозилтрансферазы для температурозависимого присоединения терминальных моносахаридов DD-Hep и Gal соответственно. Показано, что функционально охарактеризованные гены биосинтеза ЛПС локализованы в виде трех кластеров и отдельно расположенных генов на хромосоме Y. pestis. Определены бактериальные виды - наиболее вероятные доноры генов биосинтеза ЛПС (или реципиенты схожих генов от одного и того же донора), переданных в результате неоднократного горизонтального переноса.
Изучение химической структуры ЛПС сконструированного набора нока-утных мутантов Y. pestis по генам биосинтеза ЛПС позволило нам установить порядок присоединения отдельных компонентов кора в ходе биосинтеза ЛПС. Известно, что первым на цитоплазматической поверхности внутренней мембраны собирается липидА [410]. При этом, как и у остальных энтеробактерий, процесс сборки липида A Y. pestis, завершаемый в случае возбудителя чумы путем присоединения вторичных ацильных заместителей - остатков пальмито-олеиновой и лауриновой кислот, заканчивается только после предварительного присоединения Kdo к остатку GlcNII липида А, осуществляемого Kdo-трансферазой WaaA. Подтверждением этого служит установленная структура ЛПС AwaaA мутанта, лишенного Kdo и состоящего только из липида А с четырьмя (основной вариант) или тремя (минорный вариант) группами ЗН014:0. Затем гептозилтрансфераза I, кодируемая геном waaC, переносит остаток LD-HepI на собранный ^о2-липид А, после чего гептозилтрансфераза II, кодируемая геном waaF, присоединяет остаток LD-HepII к остатку LD-HepI. Обнаруженное нами отсутствие Glc в waaF мутанте подтверждает, что ее присоединение к кору, опосредуемое глюкозилтрансферазой WaaE, происходит только после предварительного присоединения остатка LD-HepII к LD-HepI. Отсутствие в ЛПС waaE мутанта одновременно Glc и LD-HepIII показывает, что включение LD-HepIII в кор, являющееся функцией WaaQ, требует предварительного присоединения остатка Glc к LD-HepI. Последующее добавление терминальных остатков DD-Hep (HepIV) или Gal к LD-HepIII осуществляют ферменты гептозилтрансфераза IV (WabC) и галактозилтрансфераза (WabD) соответственно. Процесс сборки кора завершается после его транслокации на периплазматиче-скую поверхность внутренней мембраны добавлением остатка GlcNAc, опосредуемого лигазой WaaL.
Установление функций генов, участвующих в биосинтезе ЛПС Y. pestis, позволило нам перейти к выявлению роли конкретных компонентов ЛПС в па-тогенности возбудителя чумы, включая устойчивость бактерии к различным антимикробным факторам, и определению биологической роли температуро-зависимых вариаций в структуре ЛПС. Для этого мы изучили биологические свойства сконструированных неполярных мутантов, связанные с вирулентностью Y. pestis. Известно, что для проявления патогенности Y. pestis в организме восприимчивого хозяина требуется наличие у заражающего штамма целого комплекса факторов патогенности различной функциональной направленности и систем регуляции, обеспечивающих их координированную экспрессию [3, 4, 30, 60, 99, 106, 107, 386]. В настоящем разделе диссертационной работы мы оценивали влияние степени редуцированности ЛПС на такой интегративный показатель, как вирулентность возбудителя чумы, так и на некоторые из его составных компонентов - ЛПС-зависимых факторов патогенности: устойчивость к КАМП, устойчивость к НЧС, фибринолитическую и плазмокоагулазную активности активатора плазминогена. Мы идентифицировали структурные части ЛПС возбудителя чумы, которые прямо или опосредованно обеспечивают устойчивость Y pestis к КАМП и комплементу сыворотки крови in vitro. На основании изучения экспериментальных данных достоверно показано, что укорочение кора ЛПС возбудителя чумы значительно снижает устойчивость бактерии к нормальной человеческой сыворотке и полимиксину В; уменьшает ферментативную активность активатора плазминогена; сопровождается снижением вирулентности мутантов для мышей и морских свинок.
В ходе наших экспериментов показано отсутствие строгой корреляции между вирулентностью и устойчивостью к факторам врожденного иммунитета. Так, чувствительный к КАМП и сыворотке крови waaQ мутант сохранял вирулентность на уровне исходного штамма 231 и только дальнейшее укорочение кора приводило к аттенуации. Эти данные еще раз подчеркивают то, что моделирование вне организма такого сложного явления как инфекционное заболевание с оценкой взаимодействия Y. pestis только с одним из звеньев врожденного иммунитета, хотя и позволяет изучать тонкие механизмы пато- и иммуногенеза, является крайней степенью упрощения изучаемого процесса. Вследствие этого сравнение результатов, полученных в опытах in vivo и в экспериментах in vitro, требует серьезной критичной оценки. Суммируя представленные в данной главе результаты следует отметить целесообразность продолжения исследований по оценке возможности использования генов waaC, hldE и waaA или кодируемых ими белков в качестве молекулярных мишеней для терапии чумы. Аттенуация мутанта hldE для мышей и морских свинок при подкожном введении, сочетавшаяся с персистенцией возбудителя у 60-90 % зараженных животных как минимум в течение срока наблюдения (22 дня), свидетельствует о перспективности проведения дальнейших работ по конструированию на основе этого мутанта кандидата в вакцинные штаммы.
Возрождение интереса к лизирующим чумной микроб бактериофагам [178; 179; 438; 533] связано с выделением в природном очаге инфекции на Мадагаскаре штамма Y. pestis, устойчивого ко всем рекомендованным для лечения чумы антибиотикам, и необходимостью поиска альтернативных способов терапии чумы. Одним из таких методов может стать фаготерапия при условии одновременного использования набора из 2-4 фагов с разными рецепторами, что будет залогом от селекции фагоустойчивых бактерий, вероятной в случае использования для лечения только одного фага [60]. На примере бактериофага фА1122 мы показали принципиальную возможность и эффективность использования сконструированного нами набора мутантов, отличающихся по степени редуцированности ЛПС, для обнаружения рецептора бактериофага. Впервые путем изучения адсорбции и инфекционности бактериофага фА1122 в отношени созданных нами генетически измененных штаммов возбудителя чумы, экспресси-рующих модифицированные структуры ЛПС, установлено, что полный фаговый рецептор находится во внутренней области кора и включает остатки HepII и Не-pl, а также связанный с HepI остаток Glc, присоединенные к липиду А через остаток Kdo. Позднее, наши данные были подтверждены A.A. Филипповым с со-авт. [161] на менее представительном комплекте мутантов по генам биосинтеза корового олигосахарида. Соответственно, наш набор изогенных мутантов Y. pestis может быть использован для верификации данных наших коллег, первыми определивших рецепторы для семи других фагов, лизирующих клетки чумного микроба [161].
Известно, что модификация пути биосинтеза липида А предоставляет возможность создания новых структурных вариантов ЛПС, наиболее подходящих для включения в состав убитых вакцин, либо для конструирования живых аттенуированных вакцинных штаммов со сниженной реактогенностью. Мы изучили влияние вариаций в строении липида А на эндотоксическую активность ЛПС и вирулентность Y. pestis для последующей разработки методологии генно-инженерной модификации липида А, направленной на снижение его эн-дотоксической активности, с целью получения штамма Y. pestis, лишенного маркеров лекарственной устойчивости, как основы для новой живой чумной вакцины со сниженной реактогенностью. Учитывая, что степень ацилирования липида А зависит от активности поздних ацилтрансфераз, мы подвергли сайт-направленному мутагенезу ген, кодирующий лаурилтрансферазу LpxM (MsbB), в трех аттенуированных штаммах Y pestis КМ218, KIMD1, КМ260(11), одном вакцинном - ЕУ линии НИИЭГ и одном вирулентном штамме 231. Показано, что МрхМу.прШ вариант высоковирулентного штамма, способного вызвать клинически выраженное заболевание при инокуляции малого числа бактериальных клеток, может индуцировать эндотоксический шок, несмотря на образование менее токсичных форм ЛПС. В то же время менее вирулентные бактерии для проявления этой активности нуждаются в синтезе высокотоксичных форм ЛПС. Так, 1рхМ мутация не снижала вирулентность штамма У реБШ 231 дикого типа У. реяйз, но приводила к 2,5-16-кратному снижению остаточной вирулентности аттенуированных штаммов возбудителя чумы. Согласующееся с этим десятикратное уменьшение токсичности для актиномицин Д-сенсибилизированных мышей препарата ЛПС, выделенного из 1рхМ::прШ мутанта КМ218, позволило нам предположить, что снижение вирулентности А 1рхМ мутантов аттенуированных штаммов опосредуется снижением токсичности их ЛПС. Установлено достоверное повышение протективной эффективности А1рхМ:\прШ мутанта вакцинного штамма ЕУ линии НИИЭГ по сравнению с исходным при заражении большими дозами вирулентного штамма У реъйз 231.
Наличие в геноме штамма гена, определяющего устойчивость к антибиотику, не позволяет рассматривать его в качестве кандидата в вакцинный штамм [168, 230]. Поэтому в рамках настоящего исследования мы разработали методологию получения мутантов чумного микроба по гену 1рхМ, лишенных маркеров лекарственной устойчивости. Предложенный нами комплекс методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов обеспечивает контролируемое конструирование таких мутантов У реБШ - кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью, а также может быть легко адаптирован для других грамотрицательных бактерий.
Сконструированный нами штамм У резИя ЕУА 1рхМ с делегированным геном 1рхМ, лишенный маркера антибиотикоустойчивости, синтезировал ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-a. При этом степень снижения провоспалительной активности ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis EVAIpxM, была значительно выше в тестах на клетках-мишенях человека по сравнению с мышиной моделью. In vivo на модели мышей линии BALB/c, сенсибилизированных актиномицином Д, установлено, что уровни сывороточного TNF-a после введения ЛПС исходного вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ достоверно превышали аналогичный показатель для препарата ЛПС EVA IpxM (р < 0,05). Кроме того, подкожное введение препарата ЛПС Y. pestis EVA IpxM мышам линии BALB/c продемонстрировало пятикратное снижение его токсических свойств по сравнению с препаратом, выделенным из исходного штамма EV линии НИИЭГ. И, наконец, проведенная нами оценка безвредности штамма EWAlpxM для белых мышей линии BALB/c и беспородных мышей по сравнению с исходным штаммом EV НИИЭГ также выявила снижение его токсических свойств. Подкожное введение от 102 до 107 КОЕ мутантного штамма EVA IpxM мышам не вызывало гибели животных, тогда как инокуляция эталонного штамма EV НИИЭГ в дозах 105 и 107 КОЕ на мышь приводило к гибели 10-40 % животных.
Таким образом, аттенуация вирулентных штаммов Y. pestis путем мутагенеза генов waaC, hldE и waaA с последующим введением мутации по гену IpxM для снижения их реактогенности представляется одним из перспективных направлений конструирования живых вакцин для профилактики чумы.
В заключение следует отметить, что при обсуждении результатов исследований, представленных в различных разделах данной диссертационной работы, мы пытались кратко остановиться на том, какое значение может иметь разбираемый в соответствующей главе феномен для патогенеза чумы, и как теоретические знания о конкретных феноменах могут быть использованы в совершенствовании диагностики и профилактики чумы.
Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Дентовская, Светлана Владимировна, Москва
1. Алексеев А.Н., Бибикова В.А., Хрусцелевская Н.М., Кантарбаева З.К. О характере действия и природе бактерицидного фактора кишечника блох // Паразитология. 1972. - № 6. - С. 338-345.
2. Анисимов А.П. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis: Дисс. . докт. мед. наук. -Саратов, Оболенск, 1999. 326 с.
3. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных сообществ. Сообщение 1 // Молекул, генетика. 2002. - № 3. - С. 3-23.
4. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных сообществ. Сообщение 2 // Молекул, генетика. 2002. - № 4. - С. 3-11.
5. Анисимов А.П. Факторы, обеспечивающие блокообразующую активность Yersinia pestis II Молекул, генетика. 1999. - № 4. - С. 11-15.
6. Анисимова Т.И., Свинцова Е.М. «Феномен переживания» при чуме у морских свинок и испытание безвредности новых вакцинных штаммов чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. 1976. - № 47. - С. 32-35.
7. Апарин Г.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы. Руководство. Иркутск: Иркутский государственный университет, 1989. - 92 с.
8. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - С. 85-104.
9. Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий // Журн. микробиол. 1994. - Приложение. - С. 4-13.
10. Васильева Г.И., Дорошенко Е.П., Киселева А.К. Вирулентность штаммов Yersinia pestis, прошедших культивирование в перитонеальных макрофагах морских свинок // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1988. -№9. -С. 63-66.
11. Гремякова Т.А. Структурно-функциональная вариабельность антигенов Yersinia pestis и методология конструирования противочумных иммуно-профилактических препаратов: Дисс. . док. мед. наук. Оболенск, 2004. -320 с.
12. Дентовская C.B., Шайхутдинова Р.З., Книрель Ю.А. Иванов С.А., Анисимов А.П. Конструирование вакцинных штаммов грамотрицательных бактерий со сниженной реактогенностью // Мол. генетика. 2006. - № 2. - С. 3-8.
13. Домарадский И.В. Чума. М.: Медицина, 1998. - 176 с.
14. Домарадский И.В. Чума: современное состояние, гипотезы, проблемы. -Саратов: Саратовский медицинский институт, 1993. 130 с.
15. Дюбо Р.Ж. Бактериальная клетка в связи с проблемами вирулентности, иммунитета и химиотерапии / Пер. с англ. М.Г. Бражниковой. М.: Государственное издательство иностранной литературы, 1948. - 459 с.
16. Еремин С.А. Электростимулируемая трансформация чумного и сибиреязвенного микроба: Автореф. дисс. . к.м.н. Саратов, 1991. -22 с.
17. Калабухов Н.И. Периодические (сезонные и годичные) изменения в организме грызунов. Ленинград: Изд-во «Наука», 1969. - 249 с.
18. Классовский Л.Н., Степанов В.М., Мартиневский И.Л., Шмутер М.Ф., Пак Г.Ю. Наставление по изучению свежевыделенных штаммов возбудителя чумы. Алма-Ата, 1972. - 36 с.
19. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрица-тельных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А // Биохимия. 1993. - Т. 58. - С. 166-201.
20. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Структура ЛПС грамотрицательных бактерий III. Структура О-антигенов: обзор // Биохимия. 1994. - Т. 59. - С. 1784-1851.
21. Козлов М.П. Чума (природная очаговость, эпизоотология, эпидемиологические проявления). М.: Медицина, 1979. - 192 с.
22. Кокушкин A.M. Социальные и биологические аспекты эпидемиологии чумы: Дисс. . докт. мед. наук. Саратов, 1995. - 392 с.
23. Кокушкин A.M. Трансформирующая активность плазмид чумного микроба: Дисс. канд. мед. наук. Саратов, 1983. - 183 с.
24. Лившиц Ю.И. Требования к качеству лабораторных грызунов и условия их содержания // Руководство по вакцинному и сывороточному делу. М.: Медицина, 1978. - С. 24-36.
25. Мишанькин Б.Н. Интегративный характер вирулентности Yersinia pestis II Журн. микробиол. 1987. - № 2. - С. 102-108.
26. МУ 3.3.1.1113-02. Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба (методические указания) / Утверждены Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 26 февраля 2002 г. Саратов, 2002. - 69 с.
27. Наумов A.B., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология чумы. Саратов, 1992.- 172 с.
28. Оводов Ю.С., Горшкова Р.П. Липополисахариды псевдотуберкулезного микроба // Химия природных соединений. 1988. - № 2. - С. 163-171
29. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири. Москва: ОАО "Издательство "Медицина", 2004.- 192 с.
30. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1981.-288 с.
31. Платонов М.Е., Евсеева В.В., Ефременко Д.В., Кузнецова И.В., Чиркова Е.В., Дентовская C.B., Куличенко А.Н., Анисимов А.П. DFR-типирование штаммов Yersinia pestis из природных очагов СНГ // Проблемы особо опасных инфекций. 2011. -№ 108. - С. 42-45.
32. Руднев Г.П. Клиника чумы. Ростов на Дону: Ростовское областное книгоиздательство, 1938. - 268 с.
33. Руководство по профилактике чумы / Под ред. А.В. Наумова и JI.B. Самойловой Саратов, 1992. - 280 с.
34. Руководство по профилактике чумы / Под ред. Н.И. Николаева. Саратов, 1972.-200 с.
35. Салтыкова Р.А., Файбич М.М. Опыт 30-летнего изучения стабильности свойств чумного вакцинного штамма EV в СССР // Журн. микробиол. -1975.-№6.-С. 3-8.
36. Самойлова C.B. Влияние условий культивирования на популяционный состав штаммов чумного микроба, обладающих различным плазмидным профилем: Дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1991. - 157 с.
37. Слудский А.А. Природные очаги чумы полевочьего типа (структура и функционирование): Автореф. дисс. . д.б.н. Саратов, 1998. -43 с.
38. Топорков В.П., Подсвиров А.В., Яшкулов К.Б. Эколого-эпидемиологический мониторинг за предикторами экстремальных эпидемических ситуаций в природно-очаговом по чуме регионе Северозападного Прикаспия. Элиста, 1999. - 126 с.
39. Abd H., Johansson T., Golovliov I., Sandstrôm G., Forsman M. Survival and growth of Francisella tularensis in Acanthamoeba castellanii II Appl. Environ. Microbiol. 2003. - Vol. 69. - P. 600-606.
40. Achtman M., Zurth K., Morelli G., Torrea G., Guiyoule A., Carniel E. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis II Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1999. - Vol. 96. - P. 14043-14048.
41. Acker G., Wartenberg K. Ultrastructure of lipopolysaccharides of Yersinia ente-rocolitica, Salmonella typhimurium and Escherichia coli II Zentral. Bakteriol. Hyg. I. Abt. 1976. - Vol. A235. - P. 439-452.
42. Adams M.H. Bacteriophages. New York, NY: Interscience Publishers, Inc., 1959.-521 p.
43. Albizo J.M., Surgalla M.J. Isolation and biological characterization of Pasteu-rella pestis endotoxin // Infect. Immun. 1970. - Vol. 2. - P. 229-236.
44. Alexander C., Rietschel E.T. Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity // J. Endotoxin Res. 2001. - Vol. 7. - P. 167-202.
45. Al-Hendy A., Toivanen P., Skurnik, M. Expression cloning of the Yersinia enter ocolitica 0:3 rfb gene cluster in Escherichia coli Kl 2 11 Microbial Pathogenesis. 1991.-Vol. 10.-P. 47-59.
46. Al-Hendy A., Toivanen P., Skurnik, M. Lipopolysaccharide O side chain of Yersinia enterocolitica 0:3 is an essential virulence factor in an orally infected murine model // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 870-875.
47. Alvarez M.L., Cardineau G.A. Prevention of bubonic and pneumonic plague using plant-derived vaccines // Biotechnol. Adv. 2010. - Vol. 28. - P. 184-196.
48. Amor K., Heinrichs D.E., Frirdich E., Ziebell K., Johnson R.P., Whitfield C. Distribution of core oligosaccharide types in lipopolysaccharides from Escherichia coli II Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 1116-1124.
49. Amura C.R., Silverstein R., Morrison D.C. Mechanisms involved in the pathogenesis of sepsis are not necessarily reflected by in vitro cell activation studies // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 5372-5378.
50. Ancuta P., Pedron T., Girard R., Sandstrom G., Chaby R. Inability of the Francisella tularensis lipopolysaccharide to mimic or to antagonize the induction of cell activation by endotoxins // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 20412046.
51. Anisimov A.P., Amoako K.K. Treatment of plague: promising alternatives to antibiotics // J. Med. Microbiol. 2006. - Vol. 55. - P. 1461-1475.
52. Anisimov A.P., Dentovskaya S.V., Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Segelke B.W., Zemla A., Telepnev M.V., Motin V.L. Amino acid and structural variability of Yersinia pestis LcrV protein // Infect. Genet. Evol. 2010. - Vol. 10. -P. 137-145.
53. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific diversity of Yersinia pestis H Clin. Microbiol. Rev. 2004. - Vol. 17. - P. 434^64.
54. Anisimov A.P., Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Dentovskaya S.V. Variability of the protein sequences of LcrV between epidemic and atypical rhamnose-positive strains of Yersinia pestis II Adv. Exp. Med. Biol. 2007; 603: 23-27.
55. Appelmelk B.J., An Y.-Q., Hekker T.A.M., Thijs L.G., MacLaren D.M., de Graaf J. Frequencies of lipopolysaccharide core types in Escherichia coli strains from bacteraemic patients // Microbiology. 1994. - Vol. 140. - P. 1119-1124.
56. Aspinall G.O., Monteiro M.A. Lipopolysaccharides of Helicobacter pylori strains P466 and MO 19: Structures of the O antigen and core oligosaccharide regions // Biochemistry. 1996. - Vol. 35. - P. 2498-2504.
57. Aussel L., Therisod H., Karibian D., Perry M.B., Bruneteau M., Caroff M. Novel variation of lipid A structures in strains of different Yersinia species // FEBS Lett. 2000. - Vol. 465. - P. 87.
58. Austin E.A., Graves J.F., Hite L.A., Parker C.T., Schnaitman C.A. Genetic analysis of lipopolysaccharide core biosynthesis by Escherichia coli K-12: insertion mutagenesis of the rfa locus // J. Bacteriol. 1990. - Vol. 172. - P. 5312-5325.
59. Bardoel B.W., Strijp J.A. Molecular battle between host and bacterium: recognition in innate immunity // J. Mol. Recognit. 2011. - Vol. 24. - P. 1077-1086.
60. Barnes M.G., Weiss A.A. BrkA Protein of Bordetella pertussis inhibits the classical pathway of complement after CI deposition // Infect. Immun. 2001. -Vol. 69.-P. 3067-3072.
61. Bartra S.S., Styer K.L., O'Bryant D.M., Nilles M.L., Hinnebusch B.J., Aballay A., Piano G.V. Resistance of Yersinia pestis to complement-dependent killing is mediated by the Ail outer membrane protein // Infect. Immun 2008. - Vol. 76. -P. 612-622.
62. Batley M., McNicholas P.A., Redmond J.W. Analytical studies of lipopolysaccharide and its derivatives from Salmonella minnesota R595. III. Reappraisal of established methods // Biochim. Biophys. Acta. 1985. - Vol. 821. - P. 205-216.
63. Batley M., Packer N.H., Redmond J.W. Analytical studies of lipopolysaccharide and its derivatives from Salmonella minnesota R595. II. Proton and carbon magnetic resonance spectra // Biochim. Biophys. Acta. 1985. - Vol. 821. - P. 195-204.
64. Baxa U., Steinbacher S., Miller S., Weintraub A., Huber R., Seckler R. Interactions of phage P22 tails with their cellular receptor, Salmonella O-antigen polysaccharide // Biophysical Journal. 1996. - Vol. 71. - P. 2040-2048.
65. Belunis C.J., Mdluli K.E., Raetz C.R., Nano F.E. A novel 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid transferase from Chlamydia trachomatis required for expression of the genus-specific epitope // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267. - P. 18702-18707.
66. Bengoechea J.A., Diaz R., Moriyon I. Outer membrane differences between pathogenic and environmental Yersinia enterocolitica biogroups probed with hydrophobic permeants and polycationic peptides // Infect. Immun. 1996. -Vol. 64. - P. 4891-4899.
67. Bengoechea J.A., Lindner B., Seydel U., Diaz R., Moriyon I. Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia pestis are more resistant to bactericidal cationic peptides than Yersinia enterocolitica II Microbiology. 1998. - Vol. 144. - P. 1509-1515.
68. Bennett H.P.J., Clarke D.J. The pbgPE operon in Photorhabdus luminescens is required for pathogenicity and symbiosis // J. Bacterid. 2005. - Vol. 187. - P. 77-84.
69. Biedzka-Sarek M., Venho R., Skurnik M. Role of YadA, Ail, and lipopolysaccharide in serum resistance of Yersinia enterocolitica serotype 0:3 // Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 2232-2244.
70. Birnboim H.C., Doly I. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. 1979. - Vol.7. - P. 1515-1523.
71. Bishop R.E. The lipid A palmitoyltransferase PagP molecular mechanisms and role in bacterial pathogenesis // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 57. - P. 900-912.
72. Bishop R.E., Gibbons H.S., Guina T., Trent M.S., Miller S.I., Raetz C. R. Transfer of palmitate from phospholipids to lipid A in outer membranes of Gramnegative bacteria // EMBO J. 2000. - Vol. 19. - P. 5071-5080.
73. Blisnick T, Ave P, Huerre M, Carniel E, Demeure CE. Oral vaccination against bubonic plague using a live avirulent Yersinia pseudotuberculosis strain // Infect. Immun. 2008. - Vol. 76. - P. 3808-3816.
74. Bölin, I., L. Norlander, and H. Wolf-Watz. Temperature-inducible outer membrane protein of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica is associated with the virulence plasmid // Infect. Immun. 1982. - Vol. 37. - P. 506-512.
75. Bosio C.M., Goodyear A.W., Dow S.W. Early interaction of Yersinia pestis with APCs in the lung // J. Immunol. 2005. - Vol. 175. - P. 6750-6756.
76. Brade H., Moll H., Rietschel E.T. Structural investigations on the inner core region of lipopolysaccharides from Salmonella minnesota rough mutants // Bio-med. Environ. Mass Spectrom. 1985. - Vol. 12. - P. 602-609.
77. Brandenburg K., Wiese A. Endotoxins: relationships between structure, function, and activity // Curr. Top. Med. Chem. 2004. - Vol. 4. - P. 1127-1146.
78. Brozek K.A., Raetz C.R.H. Biosynthesis of lipid A in Escherichia coli. Acyl carrier protein-dependent incorporation of laurate and myristate// J. Biol. Chem. 1990.-Vol. 265.-P. 15410-15417.
79. Brubaker R. R. Factors promoting acute and chronic diseases caused by Yersinia II Clin. Microbiol. Rev. 1991. - Vol. 4. - P. 309-324.
80. Bruneteau M, Minka S. Lipopolysaccharides of bacterial pathogens from the genus Yersinia: a mini-review // Biochimie. 2003. - Vol. 85. - P. 145-152.
81. Brygoo E.R., Rajenison S. Technical improvement of the experimental diagnosis of plague. Use of mice sensitized by cyclophosphamide // Bull. Soc. Pathol. Exot. Filiales. 1973. - Vol. 66. - P. 255-257.
82. Bubeck SS, Dube PH. Yersinia pestis C092 AyopH is a potent live, attenuated plague vaccine // Clin. Vaccine Immunol. 2007. - Vol. 14. - P. 1235-1238.
83. Burland V., Shao Y., Perna N.T., Plunkett G., Sofia HJ., Blattner F.R. The complete DNA sequence and analysis of the large virulence plasmid of Escherichia coli 0157:H7 // Nucleic Acids Res. 1998. - Vol. 26. - P. 4196-4204.
84. Burns S.M., Hill S.I. Comparison of loss of serum resistance by defined lipopolysaccharides mutants and an acapsular mutants of uropathogenic Escherichia coli 075 :K5 11 Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 4244-4253.
85. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis II Nature. 1957. - Vol. 179. -P. 1246-1247.
86. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis and immunogenicity to plaque // Ergeb. Mikrobiol. Immun. Exp. Ther. 1963. - Vol. 37. - P. 59-113.
87. Butler T. Plague and other Yersinia infections. New York: Plenum Press, 1983.-220 p.
88. Carlsson A., Nystrom T., de Cock H., Bennich H. Attacin an insect immune protein - binds LPS and triggers the specific inhibition of bacterial outer-membrane protein synthesis // Microbiology. - 1998. - Vol. 144. - P. 2179-2188.
89. Carty S.M., Sreekumar K.R., Raetz C.R.H. Effect of cold shock on lipid A biosynthesis in Escherichia coli. Induction At 12 °C of an acyltransferase specific for palmi-toleoyl-acyl carrier protein // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 9677-9685.
90. Cavanaugh D.C., Randall R. The role of multiplication of Pasteurella pestis in mononuclear phagocytes in the pathogenesis of fleaborne plague // J. Immunol. 1959.-Vol. 83.-P. 348-371.
91. Chart H., Cheasty T., Rowe B. Differentiation of Yersinia pestis and Y. pseudotuberculosis by SDS-PAGE analysis of lipopolysaccaride // Lett. Appl. Microbiol. 1995. - Vol. 20. - P. 369-370.
92. Cherepanov P.P., Wackernagel W. Disruption in Escherichia coir. TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant // Gene. 1995 - Vol. 158. - P. 9-14.
93. Cho U.S., Bader M.W, Amaya M.F., Daley M.E., Klevit R.E., Miller SI, Xu W. Metal bridges between the PhoQ sensor domain and the membrane regulate transmembrane signaling // J. Mol. Biol. 2006. - Vol. 356. - P. 1193-1206.
94. Chu M.C. Laboratory manual of plague diagnostic tests. World Health Organization, Geneva, 2000 - 129 p.
95. Chung H.S., Raetz C.R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2011.-Vol. 108.-P. 510-515.
96. Clementz T., Raetz C.R.H. A gene coding for 3-deoxy-D-manno-octulosonic-acid transferase in Escherichia coli. Identification, mapping, cloning, and sequencing // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266. - P. 9687-9696.
97. Cohen S.N., Chang A.C.Y. Recircularization and autonomous replication of a sheared R-factor DNA segment in Escherichia coli transformants // Proc. Natl. Acad. Sci. 1973. - Vol. 70. - P. 1293-1295.
98. Conchas R.F., Carniel E. A highly efficient electroporation system for transformation of Yersinia II Gene. 1990. - Vol. 87. - P. 133-137.
99. Conter A., Sturny R., Gutierrez C., Cam K. The RcsCB His-Asp phosphorelay system is essential to overcome chlorpromazineinduced stress in Escherichia coli II J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 2850-2853.
100. Cornelis G.R. Yersinia type III secretion: send in the effectors // J. Cell. Biol. -2002. Vol. 158. - P. 401-408.
101. Currie C.G., Poxton I.R. The lipopolysaccharide core type of Escherichia coli 0157:H7 and other non-0157 verotoxinproducing E. coli II FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1999. - Vol. 24. - P. 57-62.
102. Darby C., Ananth S.L., Tan L., Hinnebusch B.J. Identification of gmhA, a Yersinia pestis gene required for flea blockage, by using a Caenorhabditis elegans biofilm system //Infect. Immun. 2005. - Vol. 73. - P. 7236-7242.
103. DebRoy C., Roberts E., Fratamico P.M. Detection of O antigens in Escherichia coli II Anim. Health Res. Rev. 2011. - Vol. 12. - P. 169-185.
104. Delude R.L., Savedra R., Zhao Jr.H., Thieringer R., Yamamoto S., Fenton M.J., Golenbock D.T. Cdl4 enhances cellular responses to endotoxin without imparting ligand-specific recognition // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -Vol. 92.-P. 9288-9292.
105. Demerec M., Adelberg E.A., Clark A.J., Hartman P.E. A proposal for a uniform nomenclature in bacterial genetics // J. Gen. Microbiol. 1968. - Vol. 50. - P. 1-14.
106. Dennis D.T., Gage K.L., Gratz N. Plague Manual: Epidemiology, Distribution, Surveillance. Geneva: World Health Organization, 1999. - 171 p.
107. Devignat R. Variétés de l'espèce Pasteurellapestis: nouvelle hyphothèse II Bull. W. H. O. 1951. - Vol. 4. - P. 247-263.
108. Dimopoulos G. Insect immunity and its implication in mosquitomalaria interactions // Cell. Microbiol. 2003. - Vol. 5. - P. 3-14.
109. Ding L., Seto B.L., Ahmed S.A., Coleman W.G., Jr. Purification and properties of the Escherichia coli K-12 NAD-dependent nucleotide diphosphosugar epimerase, ADP-L-g(vcero-D-ma««oheptose-6-epimerase // J. Biol. Chem. -1994. Vol. 269. - P. 24384-24390.
110. Donnenberg M.S., Kaper J.B. Constraction of eae deletion mutant of entero-hemorrhagic Escherichia coli by using of positive-selection suicide vector // Infect. Immun. 1991. - Vol. 59. - P. 4310-4317.
111. Ebeling W., Hennrich N., Klockow M., Metz H., Orth H.D., Lang H. Proteinase K from Tritirachium album Limber I I Eur. J. Biochem. 1974. - Vol. 47. - P. 91-97.
112. Egan A.M., Gordon D.L. Burkholderia pseudomallei activates complement and is ingested but not killed by polymorphonuclear leukocytes // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - 4952-4959.
113. Ehrenkranz N.F., Meyer K.F. Studies on immunization against plague. VIII: study of three immunizing preparations in protecting primates against pneumonic plague II J. Infect. Dis. 1955. - Vol. 96. - P. 138-144.
114. Elliott J.M., Ramanculov E., Chain P.S., Chu M.C., Molineux I.J. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage coAl 122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes I I J. Bacterid. 2003. - Vol. 185. - P. 5248-5262.
115. Ernst R.K., Yi E.C., Guo L., Lim K.B., Burns J.L., Hackett M., Miller S.I. Specific lipopolysaccharide found in cystic fibrosis airway Pseudomonas aeruginosa II Science. 1999. - Vol. 286. - P. 1561-1565.
116. Fearon D.T. Regulation by membrane sialic acid of /?lH-dependet decay-dissociation of amplification of C3 convertase of the alternative complement pathway // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1978. - Vol. 75. - P. 1971-1975.
117. Felek S., Krukonis E.S. The Yersiniapestis Ail protein mediates binding and Yop delivery to host cells required for plague virulence // Infect. Immun. -2009. Vol. 77. - P. 825-836.
118. Feng L., Tao J., Guo H., Xu J., Li Y., Rezwan F., Reeves P., Wang L. Structure of the Shigella dysenteriae 7 O antigen gene cluster and identification of its antigen specific genes // Microb. Pathog. 2004. - Vol. 36. - P. 109-115.
119. Feodorova V.A., Devdariani Z.L., Nazarova L.S. Adjuvant effect of antiidiotype antibodies to Yersinia pestis lipopolysaccharide // J. Med. Microbiol. -1999.-Vol. 48.-P. 751-756.
120. Feodorova V.A., Corbel M.J. Prospects for new plague vaccines // Expert Rev. Vaccines. 2009. - Vol. 8. - P. 1721-1738.
121. Ferguson A.D., Hofmann E., Coulton J.W., Diederichs K., Welte W. Sidero-phore-mediated iron transport: crystal structure of FhuA with bound lipopolysaccharide // Science. 1998. - Vol. 282. - P. 2215-2220.
122. Ferguson A.D., Welte W., Hofinann E., Lindner B., Hoist O., Coulton J.W., Diederichs K. A conserved structural motif for lipopolysaccharide recognition by pro-caryotic and eucaryotic proteins // Struct. Fold. Des. 2000. - Vol. 8. - P. 585-592.
123. Ferguson G.P., Datta A., Carlson R.W., Walker G.C. Importance of unusually modified lipid A in Sinorhizobium stress resistance and legume symbiosis // Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 56. - P. 68-80.
124. Finlay B.B., Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity // Microbiol. Rev. 1989 - Vol. 53. - P. 210-230.
125. Finlay B.B., Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity revisited // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997 - Vol. 61. - P. 136-169.
126. Fjell C.D., Hiss J.A., Hancock R.E., Schneider G. Designing antimicrobial peptides: form follows function // Nat. Rev. Drug. Discov. 2011. - Vol. 11. - P. 37-51.
127. Frank S., Specter S., Nowotny A., Friedman H. Immunocyte stimulation in vitro by nontoxic bacterial lipopolysaccharide derivatives // J. Immunol. 1977. -Vol. 119.-P. 855-860.
128. Frey J. Biological safety concepts of genetically modified live bacterial vaccines // Vaccine. 2007. - Vol. 25. - P. 5598-5605.
129. Frirdich E., Whitfield C. Lipopolysaccharide inner core oligosaccharide structure and outer membrane stability in human pathogens belonging to the Entero-bacteriaceae // J. Endotoxin. Res. 2005. - Vol. 11. - P. 133-144.
130. Gage K.L., Kosoy M.Y. Natural history of plague: perspectives from more than a century of research // Annu. Rev. Entomol. 2005. - Vol. 50. - P. 505-528.
131. Galanos C., Freudenberg M.A. Mechanisms of endotoxin shock and endotoxin hypersensitivity // Immunobiology. 1993. - Vol. 187. - P. 346-356.
132. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. A new method for the extraction of R li-popolysaccharides // European J. Biochem. 1969. - Vol. 9. - P. 245-249.
133. Galanos C., Luderitz O., Rietschel E.T., Westphal O., Brade H., Brade L. Synthetic and natural Escherichia coli free lipid A express identical endotoxic activities // Eur. J. Biochem. 1985. - Vol. 148. - P. 1-5.
134. Galloway S.M., Raetz C.R.H. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis // J. Biol. Chem. 1990. - Vol. 265. - P. 6394-6402.
135. Galvan E.M., Lasaro M.A.S., Schifferli D.M. Capsular antigen fraction 1 and Pla modulate the susceptibility of Yersinia pestis to pulmonary antimicrobial peptides such as cathelicidin 11 Infect. Immun. 2008. - Vol. 76. - P. 1456-1464.
136. Gamian A., Mieszala M., Katzenellenbogen E., Czarny A., Zal T., Romanows-ka E. The occurrence of glycine in bacterial lipopolysaccharides // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 13, - P. 261-268.
137. Garbom S., Forsberg A., Wolf-Watz H., Kihlberg B.M. Identification of novel virulence-associated genes via genome analysis of hypothetical genes // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P 1333-1340.
138. Garcia E., Chain P., Elliott J.M., Bobrov A.G., Motin V.L., Kirillina O., Lao V., Calendar R, Filippov A.A. Molecular characterization of L-413C, a P2-related plague diagnostic bacteriophage // Virology. 2008. - Vol. 37. - P. 85-96.
139. Garcia E., Elliott J.M., Ramanculov E., Chain P.S., Chu M.C., Molineux I.J. The genome sequence of Yersinia pestis bacteriophage cpA1122 reveals an intimate history with the coliphage T3 and T7 genomes // J. Bacteriol. 2003. -Vol. 185.-P. 5248-5262.
140. Geerlof A., Lewendon A., Shaw W.V. Purification and characterization of phosphopantetheine adenylyltransferase from Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 27105-27 111.
141. Giardina P.C., Apicella M.A., Gibson B., Preston A. Antigenic mimicry in Neisseria species // Endotoxins in Health and Disease / Brade H., Opal S.M., Vogel S.N., Morrison D.C. (ed.). Marcel Dekker: New York, 1999. - P. 55-65.
142. Gibb A.P., Barclay G.R., Poxton I.R., Di Padova F. Frequencies of lipopoly-saccharide core types among clinical isolates of Escherichia coli defined with monoclonal antibodies // J. Infect. Dis. 1992. - Vol. 166. - P. 1051-1057.
143. Girard G. Immunity in plague infection. Results of 30 years of work with the Pasteurella pestis EV strain (Girard and Robic) // Biol. Med., Paris. 1963. -Vol. 52.-P. 631-731.
144. Girard R., Pedron T., Uematsu S., Balloy V., Chignard M., Akira S. Lipopoly-saccharides from Legionella and Rhizobium stimulate mouse bone marrow granulocytes via toll-like receptor 2 // J. Cell Sci. 2003. - Vol. 116. - P. 293-302.
145. Glauser M.P., Zanetti G., Baumgartner J.D., Cohen J. Septic shock: pathogenesis//Lancet. 1991.-Vol. 338.-P. 732-736.
146. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Qureshi N. Takayama K., Raetz C.R.H. Lipid A-like molecules that antagonize the effects of human monocytes // J. Biol. Chem.- 1991.-Vol. 266.-P. 19490-19498.
147. Gorshkova R.P., Komandrova N.A., Kalinovsky A.I., Ovodov Y.S. Structural studies on the O-specific polysaccharide side-chains of Yersinia pseudotuberculosis, type III, lipopolysaccharides I I Eur. J. Biochem. 1980. - Vol. 107. - P. 131-135.
148. Gorshkova R.P., Korchagina N.I., Medonova T.A., Kalmykova E.N., Besednova N.N., Ovodov Y.S. Studies of lipopolysaccharides from Yersinia pseudotuberculosis subtypes VA and VB // Carbohydr. Res. 1980. - Vol. 84. - P. 237-243.
149. Gorshkova R.P., Zubkov V.A., Ovodov Y.S. Chemical and immunochemical studies on lipopolysaccharide from Yersinia pseudotuberculosis type VI // Im-munochemistry. 1976. - Vol. 13. - P. 581-583.
150. Gottesman S. Regulation of capsule synthesis: modification of the two-component paradigm by an accessory unstable regulator // Two-component signal transduction / Hoch J.A., Silhavy T.J. (ed.). ASM Press: Washington, DC, 1995.-P. 253-262.
151. Gremyakova T.A., Vinogradov E.V., Lindner B., Kocharova N.A., Senchenkova S.N., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Hoist O., Shaikhutdinova R.Z., Anisimov A.P.
152. The core structure of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis strain KM218. Influence of growth temperature // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. - Vol. 529. - P. 229-231.
153. Groissman E.A. How bacteria resist killing by host-defence peptides // Trends Microbiol. 1994. - Vol. 2. - P. 444-449.
154. Gunn J.S. Bacterial modification of LPS and resistance to antimicrobial peptides // J. Endotoxin Res. 2001. - Vol. 7. - P. 57-62.
155. Gunn J.S., Lim K.B., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S.I. PmrA-PmrB-regulated genes necessary for 4-aminoarabinose lipid A modification and polymyxin resistance // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 27. - P. 1171-1182.
156. Gunn J.S., Miller S.I. PhoP-PhoQ activates transcription of pmrAB, encoding a two-component regulatory system involved in Salmonella typhimurium antimicrobial peptide resistance // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 6857-6864.
157. Guo L., Lim K.B., Poduje C.M., Daniel M., Gunn J.S., Hackett M., Miller S.I. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides//Cell. 1998. - Vol. 95.-P. 189-198.
158. Gupta D.K., Sharma R.C., Bhatt R.M., Gautam A.S. Sensitivity of mosquito-pathogenic bacterial strains to various antibiotics // Indian J. Exp. Biol. 1992. -Vol. 30.-P. 915-917.
159. Gustman T., Hagge S.O., David A., Roes S., Bouchling M.U., Hammer M.U., Sey-del U. Lipid-mediated resistance of Gram-negative bacteria against various pore-forming antimicrobial peptides // J. Endotoxin Res. 2005. - Vol. 11. - P. 167-173.
160. Gutsmann T., Schramm A.B., Brandenburg K. The physicochemistry of endotoxins in relation to bioactivity // Int. J. Med. Microbiol. 2007. - Vol. 297 - P. 341-352.
161. Hagiwara D., Sugiura M., Oshima T. Mori H., Aiba H., Yamashino T., Mizuno T. Genome-wide analyses revealing a signaling network of the RcsC-YojN-RcsB phosphorelay system in Escherichia coli II J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185 -P. 5735-5746.
162. Haishima Y, Hoist O, Brade H. Structural investigation on the lipopolysaccharide of Escherichia coli rough mutant F653 representing the R3 core type // Eur. J. Biochem. 1992. - Vol. 203. - P. 127-134.
163. Haishima Y., Hoist O., Brade H. Structural investigation on the lipopolysaccharide of Escherichia coli rough mutant F653 representing the R3 core type Erratum. // Eur. J. Biochem. 1992. - Vol. 207. - P. 1129.
164. Hammerling G., Lehmann V., Liideritz O. Structural studies on the heptose region of Salmonella lipopolysaccharides 11 Eur. J. Biochem. 1973. - Vol. 38. - P. 453-458.
165. Hancock R.E.W., Falla T., Brown M. Cationic bactericidal peptides // Adv. Microb. Physiol. 1995.-Vol. 37.-P. 135-175.
166. Heinrichs D.E. Yethon JA, Whitfield C. Molecular basis for structural diversity in the core regions of the lipopolysaccharides of Escherichia coli and Salmonella enterica II Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 30. - P. 221-232.
167. Helander I.M., Kilpelainen I., Vaara M. Increased substitution of phosphate groups in lipopolysaccharides and lipid A of the polymyxin-resistant pmrA mutants of Salmonella typhimurium: a 31P-NMR study 11 Mol. Microbiol. 1994. -Vol. 11.-P. 481-487.
168. Hinnebusch B.J. Transmission factors: Yersinia pestis genes required to infect the flea vector of plague // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. - Vol. 529. - P. 55-62.
169. Hitchcock P.J. Preparation of proteinase K-treated cell lysates for SDS-PAGE //J. Bacteriol. 1983. - Vol. 154. - P. 269-277.
170. Hodgson J.C. Endotoxin and mammalian host responses during experimental disease // J. Comp. Pathol. 2006. - Vol. 135. - P. 157-175.
171. Hoist O. The structures of core regions from enterobacterial lipopolysaccha-rides an update // FEMS Microbiol. Lett. - 2007. - Vol. 271. - P. 3-11.
172. Hoist O. Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides // Endotoxin in health and disease / Brade H., Opal S.M., Vogel S.N., Morrison D.C. (ed.) Marcel Dekker: New York, 1999. - P. 115-154.
173. Hoist O. Lipopolysaccharides of Yersinia. An overview // Adv. Exp. Med. Biol. 2003.-Vol. 529.-P. 219-228.
174. Hoist O., Brade H. Chemical structure of the core region of lipopolysaccha-ride, V. I. // Bacterial endotoxic lipopolysaccharides / Morrison D.C., Rayn J.L. (ed.). Boca Raton, FL: CRC Press, 1992. P. 134-170.
175. Hoist O., Brade H. Structural studies of the core region of the lipopolysaccharide from Salmonella minnesota strain R7 (rough mutant chemotype Rdl) // Carbohydr. Res. 1991. - Vol. 219. - P. 247-251.
176. Hoist O., Zahringer U., Brade H., Zamojski A. Structural analysis of the hep-tose/hexose region of the lipopolysaccharide from Escherichia coli K-12 strain W3100// Carbohydr. Res. 1991-Vol. 215.-P. 323-335.
177. Hone D.M., Powell J., Crowley R.W., Maneval D., Lewis G.K. Lipopolysaccharide from an Escherichia coli htrB msbB mutant induces high levels of MIP1 a and MIP-1 ßsecretion without inducing TNF-a and IL-1 ß // J. Hum. Virol. 1998.-Vol. l.-P. 251-256.
178. Hood D.W., Moxon E.R. Lipopolysaccharide phase variation in Haemophilus and Neisseria (Chapter 3) // Endotoxins in health and disease / Brade H., Opal S.M., Vogel S.N., Morrison D.C. (ed.). Marcel Dekker: New York, 1999. -P. 39-54.
179. Hooke A.M., Bellanti J.A., Oeschger M.P. Live attenuated bacterial vaccines: new approaches for safety and efficacy // Lancet. 1985. - Vol. l.-P. 1472-1474.
180. Hurst M.R., Becher S.A., Young S.D., Nelson T.L., Glare T.R. Yersinia ento-mophaga sp. nov., isolated from the New Zealand grass grub Costelytra zealan-dica II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. - Vol. 61. - P. 844-849.
181. Isakov V.V., Komandrova N.A., Gorshkova R.P., Ovodov Y.S. 13C NMR spectrum of the O-specific polysaccharide from the lipopolysaccharide of Yersinia pseudotuberculosis serovar III //Bioorg. Khim. 1983. - Vol. 9. - P. 1565-1567.
182. Jackson S., Burrows, T.W. The virulence-enhancing effect of iron on non-pigmented mutants of virulent strains of Pasteurella pestis 11 Br. J. Exp. Pathol. 1956. - Vol. 37. - P. 577-583.
183. Jansson P.-E., Lindberg A.A., Lindberg B., Wollin R. Structural studies on the hexose region of the core in lipopolysaccharides from Enterobacteriaceae II Eur. J. Biochem. 1981. - Vol. 115. - P. 571-577.
184. Jarvis G.A. Analysis of C3 deposition and degradation on Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae II Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - p. 1755-1760.
185. Jerala R. Structural biology of the lipopolysaccharide recognition // Int. J. Med. Microbiol. 2007. - Vol. 297. - P. 353-363.
186. Joiner K.A. Complement evasion by bacteria and parasites // Annu. Rev. Microbiol. 1988. - Vol. 42. - P. 201-230.
187. Joiner K.A., Grossman N., Schmetz M., Leive L. C3 binds preferentialle to long-chain lipopolysaccharide during alternative pathway activation by Salmonella montevideo II J. Immunol. 1986. - Vol. 136. - P. 710-715.
188. Kadavy D.R., Hornby J.M., Haverkost T., Nickerson K.W. Natural antibiotic resistance of bacteria isolated from larvae of the oil fly, Helaeomyia petrolei II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66. - P. 4615-4619.
189. Kalupahana R., Emilianus A.R., Maskell D., Blacklaws B. Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing mutant lipid A with decreased endotoxicity causes maturation of murine dendritic cells // Infect. Immun. 2003 - Vol. 70 -P. 6132-6140.
190. Kanamori M. Biological activities of endotoxins from Yersinia enterocolitica II Jpn. J. Microbiol. 1976. - Vol. 20. - P. 273-280.
191. Kaniuk N.A., Monteiro M.A., Parker C.T., Whitfield C. Molecular diversity of the genetic loci responsible for lipopolysaccharide core oligosaccharide assembly within the genus Salmonella II Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 46. - P. 1305-1318.
192. Karow M., Georgopoulos C. Isolation and characterization of the Escherichia coli msbB gene, a multicopy suppressor of null mutations in the high-temperature requirement gene htrB II J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174. - P. 702-710.
193. Kauffman A.S., Paul M.J., Zucker I. Increased heat loss affects hibernation in golden-mantled ground squirrels // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2004. - Vol. 287. - P. R167-R173.
194. Kawahara K., Isshiki Y., Ezaki T., Moll H., Kosma P., Zähringer U. Chemical characterization of the inner core-lipid A region of the lipopolysaccharide isolated from Pseudomonas (Burkholderia) cepacia II J. Endotoxin Res. 1994. - Vol. 1. - P. 52.
195. Kawahara K., Tsukano H., Watanabe H., Lindner B., Matsuura M. Modification of the structure and activity of lipid A in Yersinia pestis lipopolysaccharide by growth temperature // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70. - P. 4092-4098.
196. Kawasaki K., Ernst R.K., Miller S.I. 3-O-deacylation of lipid A by PagL, a PhoP/PhoQ-regulated deacylase of Salmonella typhimurium, modulates signaling through toll-like receptor 4 // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 20044-20048.
197. Khan S.A., Everest P., Servos S., Foxwell N., Zäringer U., Brade H., Rietschel E.Th., Dougan G., Charles I.G., Maskell D.J. A lethal role for lipid A in Salmonella infections // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 29. - P. 571-579.
198. Krüger M., Schroeder C. Bacteriophage T3 and bacteriophage T7 virus-host cell interactions // Microbiol. Rev. 1981. - Vol. 45. - P. 9-51.
199. Kim S.H., Jia W., Bishop R.E., Gyles C. An msbB homologue carried in plas-mid p0157 encodes an acytransferase involved in lipid A biosynthesis in Escherichia coli 0157:H7 // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 1174-1180.
200. Kneidinger B., Maroida C., M. Graninger, A. Zamyatina, F. McArthur, P. Kosma, M. A. Valvano, P. Messner. Biosynthesis pathway of ÄDP-L-glycero-§-D-manno-heptose in Escherichia coli II J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 363-369.
201. Koebnik R., Locher K.P., Van Gelder P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell // Mol. Microbiol. 2000. -Vol. 37.-P. 239-253.
202. Kolodziejek A.M., Sinclair D.J., Seo K.S., Schnider D.R., Deobald C.F., Rohde H.N., Viall A.K., Minnich S.S., Hovde C.J., Minnich S.A., Bohach G.A.
203. Phenotypic characterization of OmpX, an Ail homologue of Yersinia pestis KIM // Microbiology. 2007. - Vol. 153. - P. 2941-2951.
204. Komandrova N.A., Gorshkova R.P., Isakov V.V., Ovodov Y.S. Structure of the O-specific polysaccharide isolated from the lipopolysaccharide of Yersinia pseudotuberculosis serovar 1A // Bioorg. Khim 1984. - Vol. 10. - P. 232-237.
205. Kondakova A.N., Bystrova O.V., Shaikhutdinova R.Z., Ivanov S.A., Dentovs-kaya S.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Anisimov A.P. Structure of the O-polysaccharide of Yersinia pseudotuberculosis 0:2b // Carbohydr. Res. 2009. -Vol. 344. - P. 405-407.
206. Kondakova A.N., Bystrova O.V., Shaikhutdinova R.Z., Ivanov S.A., Dentovs-kaya S.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Anisimov A.P. Structure of the O-antigen of Yersinia pseudotuberculosis 04a revised // Carbohydr. Res. 2009. -Vol. 344.-P. 531-544.
207. Kondakova A.N., Bystrova O.V., Shaikhutdinova R.Z., Ivanov S.A., Dentovs-kaya S.V., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Anisimov A.P. Structure of the O-antigen of Yersinia pseudotuberculosis 04b // Carbohydr. Res. 2009. -Vol. 344.-P. 152-154.
208. Kondakova A.N., Shaikhutdinova R.Z., Ivanov S.A., Dentovskaya S.V., Shashkov A.S., Anisimov A.P., Knirel Y.A. Revision of the O-polysaccharide structure of Yersinia pseudotuberculosis O: lb // Carbohydr. Res. 2009. - Vol. 344. - P. 2421-2423.
209. Kool J.L. Risk of person-to-person transmission of pneumonic plague // Clin. Infect. Dis. 2005. - Vol. 40, - P. 1166-1172.
210. Kox L.F.F., Wo'sten M.M.S.M., Groisman E.A A small protein that mediates the activation of a two-component system by another two-component system // EMBO J.-2000.-Vol. 19.-P. 1861-1872.
211. Krishna G., R. K. Chitkara. Pneumonic plague // Semin. Respir. Infect. 2003. -Vol. 18.-P. 159-167.
212. Kropinski A.M. Measurement of the rate of attachment of bacteriophage to cells // Methods Mol. Biol. 2009. - Vol. 501.-P. 151-155.
213. Kuhn H.-M., Meier-Dieter U., Mayer H. ECA, the enterobacterial common antigen // FEMS Microbiol. Rev. 1988. - Vol. 54. - P. 195-222.
214. Kukkonen M., Korhonen T.K. The omptin family of enterobacterial surface proteases/adhesins: from housekeeping in Escherichia coli to systemic spread of Yersinia pestis II Int. J. Med. Microbiol. 2004. - Vol. 294. - P. 7-14.
215. Kulshin V.A., Zahringer U., Lindner B., Frasch C.E., Tsai C., Dimitriev A., Rietschel E.T. Stuctural characterization of the lipid A component of pathogenic Neisseria meningitides II J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174. - P. 1793-1800.
216. Kusumoto S., Fukase K., Fukase Y., Kataoka M., Yoshizaki H., Sato K., Oikawa M., Suda Y. Structural basis for endotoxic and antagonistic activities: investigation with novel synthetic lipid A analogs // J. Endotoxin Res. 2003. - Vol. 9. - P. 361-366.
217. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.
218. Lähteenmäki K., Kuusela P., Korhonen T.K. Bacterial plasminogen activators and receptors // FEMS Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 25. - P. 531-552.
219. Laird M.W., Kloser A.W., Misra R. Assembly of LamB and OmpF in deep rough lipopolysaccharide mutants of Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. -1994.-Vol. 176.-2259-2264.
220. Lee H., Hsu F.F., Turk J., Groisman E.A. The PmrA-regulatedpmrC gene mediates phosphoethanolamine modification of lipid A and polymyxin resistance in Salmonella enterica II J. Bacteriol. 2004. - V. 186. - P. 4124-4133.
221. Lehmann K.B., Neumann R. Atlas und grundriss der bakteriologie und lehrbuch der speziellen bakteriologischen diagnostic. München, 1896. - 276 .
222. Lehmann V., Luderitz O., Westphal O. The linkage of pyrophosphoiylethanolamine to heptose in the core of Salmonella minnesota lipopolysaccharides II Eur. J. Bio-chem 1971. - Vol. 21. -P. 339-347.
223. Lien-Teh W. Liande Wu. A treatise on pneumonic plague. League of Nations, Health Organisation; printed by Berger-Levrault, 1926. 466 p.
224. Lien-Teh W., Chun J.W.H., Pollitzer R., Wu C.Y. Plague: A manual for medical & public health workers. Shanghai, 1936. - 547 p.
225. Lindberg A.A. Bacteriophage receptors // Ann. Rev. Microbiol. 1973. -Vol. 27.-P. 205-241.
226. Lobo L.A. Functional studies of purified transmembrane proteases, omptins, of Yersinia pestis and Salmonella enteric: Academic Dissertation in General Microbiology. University of Helsinki, Helsinki, 2006. - 40 p.
227. Loppnow H., Brade H., Durrbaum I., Dinarello C.A., Kusumoto S., Rietschel E.T., Flad H.D. IL-1 induction-capacity of defined lipopolysaccharide partial structures // J. Immunol. 1989. - Vol. 142. - P. 3229-3238.
228. Luchi M., Morrison D.C. Comparable endotoxic properties of lipopolysaccha-rides are manifest in diverse clinical isolates of gram-negative bacteria // Infect. Immun. -2000. Vol. 68. -P. 1899-1904.
229. Lysenko E., Richards J.C., Cox A.D., Stewart A., Martin A., Kapoor M., Weiser J.N.The position of phosphorylcholine on the lipopolysaccharide of
230. Haemophilus influenzae affects binding and sensitivity to C-reactive proteinmediated killing // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 35. - P. 234-245.
231. Mandrell R.E. Further antigenic similarities of Neisseria gonorrhoeae lipooli-gosaccharides and human glycosphingolipids // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60-P. 3017-30120.
232. Mandrell R.E., Apicella M.A. Lipo-oligosaccharides (LOS) of mucosal pathogens: molecular mimicry and host-modification of LOS // Immunobiology. -1993.-Vol. 187.-P. 382-402.
233. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. N.Y.: Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory. - 1982. - 480 p.
234. Maniero G.D. Classical pathway serum complement activity throughout various stages of the annual cycle of a mammalian hibernator, the golden-mantled ground squirrel, Spermophilus lateralis II Dev. Comp. Immunol. 2002. - Vol. 26. - P. 563-574.
235. Mansfield L.P., Billett E., Olsen E., Forsythe S.J. Variation in Salmonella core lipopolysaccharide as detected by the monoclonal antibody Ml05 // Lett. Appl. Microbiol. 1996. - Vol. 23 - P. 104-106.
236. Mansfield L.P., Forsythe S.J. Demonstration of the Rb| lipopolysaccharide core structure in Salmonella strains with the monoclonal antibody Ml05 // J. Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50. - P. 339-344.
237. Marceau M., Sebbane F., Collyn F., Simonet M. Function and regulation of the Salmonella like pmrF antimicrobial peptide resistance operon in Yersinia pseudotuberculosis II Adv. Exp. Med. Biol. 2003. - Vol. 529. - P. 253-256.
238. Marra A. Can virulence factors be viable antibacterial targets? // Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2004. - Vol. 2. - P. 61-62.
239. Marshall J.D., Jr., Bartelloni P.J., Cavanaugh D.C., Kadull P.J., Meyer K.F. Plague immunization. II. Relation of adverse clinical reactions to multiple immunizations with killed vaccine // J. Infect. Dis. 1974. - Vol. 129 (Suppl.). - P. 19-25.
240. Masoud H., Martin A., Thibaut P., Moxon E.R., Richards J.C. Structure of extended lipopolysaccharide glycoforms containing two globotriose units in Haemophilus influenzae serotype b strain RM7004 // Biochemistry. 2003. - Vol. 42. - P. 4463-4475.
241. Mata-Haro V. Cekic C., Martin M., Chilton P.M., Casella C.R., Mitchell T.C. The vaccine adjuvant monophosphoryl lipid A as a TRIF-biased agonist of TLR4 // Science. 2007. - Vol. 316. - P. 1628-1632.
242. McCoy A.J., Liu H., Falla T.J., Gunn J.S. Identification of Proteus mirabilis mutants with increased sensitivity to antimicrobial peptides // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. - Vol. 45. - P. 2030-2037.
243. Meredith T.C., Aggarwal P., Mamat U., Lindner B., Woodard R.W. Redefining the requisite lipopolysaccharide structure in Escherichia coli // ACS Chem. Biol. 2006. - Vol. 1. - P. 33-42.
244. Meri S., Pangburg M.K. A mechanism of activation of the alternative complement pathway by the classical pathway: protection of C3b from inactivation by covalent attachment to C4b // Eur. J. Immunol. 1990. - Vol. 20. - P. 2555-2561.
245. Merino S., Camprubi S., Albert! S., Benedi V.J., Tomás J.M. Mechanisms of Klebsiella pneumoniae resistance to complement-mediated killing // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 2529-2535.
246. Meyer K.F. Effectiveness of live or killed plague vaccines in man // Bull. World Health Organ. 1970. - Vol. 42. - P. 653-666.
247. Miller V.L., Beer K.B., Heusipp G., Young B.M., Wachtel M.R. Identification of regions of Ail required for the invasion and serum resistance phenotypes // Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 41. - P. 1053-1062.
248. Miller V.L., Finlay B.B., Falkow S. Factors essential for the penetration of mammalian cells by Yersinia II Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1988. - Vol. 138. - P. 15-39.
249. Minka S., Bruneteau M. Isolement et caractérisation chimique des lipopoly-saccharides de type R dans une souche hypovirulente de Yersinia pestis // Can. J. Microbiol. 1998. - Vol. 44. - P. 477-481.
250. Moran A.P., Prendergast M.M. Molecular mimicry in Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori lipopolysaccharides: contribution of gastrointestinal infections to autoimmunity // J. Autoimmun. 2001. - Vol. 16. - P. 241-256.
251. Moran E.E., Brandt B.L., Zollinger W.D. Expression of the L8 lipopolysaccha-ride determinant increases the sensitivity of Neisseria meningitidis to serum bactericidal activity // Infect. Immun. 1994. Vol. 62. - P. 5290-5295.
252. Morris M., Li L. Molecular mechanisms and pathological consequences of endotoxin tolerance and priming // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.). 2012. -Vol. 60.-P. 13-18.
253. Morrison D.C., Rayn D.L. Endotoxins and disease mechanisms // Annu. Rev. Med. 1987.-Vol. 38.-P. 417-432.
254. Mouslim C, Groisman EA. Control of the Salmonella ugd gene by three two-component regulatory systems // Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 47. - P. 335-344.
255. Mouslim C, Latifi T, Groisman EA. Signal-dependent requirement for the co-activator protein RcsA in transcription of the RcsB-regulated ugd gene // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 50588-50595.
256. Miiller-Loennies S, Hoist O, Brade H. Chemical structure of the core region of Escherichia coli J-5 lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. -1994. Vol. 224. - P. 751-760.
257. Miiller-Loennies S., Hoist O., Lindner B., Brade H. Isolation and structural analysis of phosphorylated oligosaccharides obtained from Escherichia coli J-5 lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 260. - P. 235-249.
258. Miiller-Loennies S., Lindner B., Brade H. Structural analysis of deacylated lipopolysaccharide of Escherichia coli strains 2513 (R4 core-type) and F653 (R3 core-type) // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol. 269. - P. 5982-5991.
259. Muller-Eberhard H.J. Complement // Ann. Rev. Biochem. 1975. - Vol. 44. -P. 695-724.
260. Murray G.L., Attridge S.R., Morona R. Regulation of Salmonella typhimurium lipopolysaccharide O antigen chain length is required for virulence; identification of FepE as a second Wzz // Mol Microbiol. 2003. - Vol. 47. - P. 1395-406.
261. Murray S.R., Bermudes D., de Felipe K.S., Low K.B. Extragenic suppressors of growth defects in msbB Salmonella II J. Bacterid. 2001. - Vol. 183. - P. 5554-5561.
262. Murros-Kontiainen A., Fredriksson-Ahomaa M., Korkeala H., Johansson P., Rahkila R., Bjorkroth J. Yersinia nurmii sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. - Vol. 61. - P. 2368-2372.
263. Naylor H.B., Fukui G.M., McDuff C.R. Effect of temperature on growth and virulence of Pasteurella pestis. Physical and nutritional requirements for restoration of virulence // J. Bacteriol. 1961. - Vol. 81. - P. 649-655.
264. Nicolas P., Mor A. Peptides as weapons against microorganism in the chemical defense system of vertebrates // Annu. Rev. Microbiol. 1995. - Vol. 49. - P. 277-304.
265. Nikaido H. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. - Vol. 67. - P. 593-656.
266. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability // Microbiol. Rev. 1985. - Vol. 49. - P. 1-32.
267. Nizet V. Antimicrobial peptide resistance mechanisms of human bacterial pathogens // Curr. Issues Mol. Biol. 2006. - Vol. 8. - P. 223-238.
268. Noreen M., Shah M.A., Mall S.M., Choudhary S., Hussain T., Ahmed I., Jalil S.F., Raza M.I. TLR4 polymorphisms and disease susceptibility // Inflamm. Res.-2012.-Vol. 61.-P. 177-188.
269. Novik R., Clowes R., Cohen S., Curtiss R 3rd, Datta N, Falkow S. Uniform nomenclature for bacterial plasmids: a proposal // Bacteriol. Rev. 1976. -Vol. 40. - P. 168-189.
270. O'Toole G., Kaplan H.B., Kolter R. Biofilm formation as microbial development//Annu. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. - P.49-79.
271. Oertelt C., Lindner B., Skurnik M., Hoist O. Isolation and structural characterization of an R-form lipopolysaccharide from Yersinia enterocolitica serotype 0:8 // Eur. J. Biochem. 2001. - Vol. 268. - P. 554-564.
272. Okan N.A., Mena P., Benach J.L., Bliska J.B., Karzai A.W. The smpB-ssrA mutant of Yersinia pestis functions as a live attenuated vaccine to protect mice against pulmonary plague infection // Infect. Immun. 2010. - Vol. 78. - P. 1284-1293.
273. Olsthoorn M.M.A., Petersen B.O., Schlecht S., Haverkamp J., Bock K., Thomas-Oates J.E., Hoist O. Identification of a novel core type in Salmonella lipopolysaccharide
274. Complete structural analysis of the core region of the lipopolysaccharide from Salmonella enterica sv. Arizonae 062 // J. Biol. Chem. -1998. Vol. 273. - P. 3817-3829.
275. Ong G.L., Baker A.E., Mattes M.J. Analysis of high complement levels in Mus hortulanus and BUB mice I I J. Immunol. Methods. 1992. - Vol. 154. - P. 37-45.
276. Onishi H.R., Pelak B.A., Gerckens L.S., Silver L.L., Kahan F.M., Chen M.H., Pat-chett A.A., Galloway S.M., Hyland S.A., Anderson M.S., Raetz C.R. Antibacterial agents that inhibit lipid A biosynthesis // Science. -1996. Vol. 274. - P. 980-982.
277. Opal S.M. The host response to endotoxin, antilipopolysaccharide strategies, and the management of severe sepsis // Int. J. Med. Microbiol. 2007. -Vol. 297. - P. 365-377.
278. Ortmann S., Heldmaier G. Regulation of body temperature and energy requirements of hibernating alpine marmots {Marmota marmota) II Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2000. - Vol. 278. - P. R698-R704.
279. Pacinelli E., Wang L, Reeves PR. Relationship of Yersinia pseudotuberculosis O antigens I A, II A, and IVB: the IIA gene cluster was derived from that of IVB // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70. - P. 3271-3276.
280. Pajunen M., Kiljunen S., Skurnik M. Bacteriophage (|)Ye03-12, specific for Yersinia enterocolitica serotype 0:3, is related to coliphages T3 and T7 // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182.-P. 5114-5120.
281. Pangburg M.K., Muller-Eberhard H.J. Complement C3 convertase: cell surface restriction of |31H control and generation of restriction on neuraminidase-treated cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - Vol. 75. - P. 2416-2420.
282. Paquette S.M. Evasion of LPS-TLR4 signaling as a virulence determinate for Yersinia pestis: GSBS Dissertations and Theses. University of Massachusetts Medical School, 2009. - P. 458.
283. Parillo JE. Pathogenic mechanisms of septic shock // N. Engl. J. Med. 1993. -Vol. 328.-P. 1471-1478.
284. Parker C.T., Pradel E., Schnaitman C.A. Indentification and sequences of lipopolysaccharide core biosynthetic genes rfaQ, rfaP, and rfaG of Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174. - P. 930-934.
285. Pawelek J.M., Low K.B., Bermudes D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector// Cancer Research. 1997. - Vol. 57. - P. 4537-4544.
286. Pérez-Gutiérrez C., Llobet E., Llompart C.M., Reinés M., Bengoechea J.A. Role of lipid A acylation in Yersinia enterocolitica virulence // Infect. Immun. 2010. Vol. 78. - P. 2768-2781,
287. Perry R.D. A plague of fleas survival and transmission of Yersinia pestis II ASM News. - 2003. - Vol. 69. - P. 336-340.
288. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague // Clin. Microbiol. Rev. - 1997. - Vol. 10. - P. 35-66.
289. Persing D.H., Coler R.N., Lacy M.J., Johnson D.A., Baldridge J.R., Hershberg R.M., Reed S.G. Taking toll: lipid A mimetics as adjuvants and immunomodulators // Trends Microbiol. 2002. - Vol. 10. - S32-S37.
290. Peschel A. How do bacteria resist human antimicrobial peptides? // Trens Microbiol. 2002. - Vol. 10.-P. 179-186.
291. Pierson D.E., Falkow S. The ail gene of Yersinia enterocolitica has a role in the ability of the organism to survive serum killing // Infect Immun. 1993. -Vol. 61. - P. 1846-1852.
292. Pollitzer R. Plague. Geneva: World Health Organization, 1954. - 698 p.
293. Porat R., McCabe W.R., Brubaker R.R. Lipopolysaccharide associated resistance to killing of yersiniae by complement // J. Endotoxin Res. 1995. - Vol. 2. - P. 91-97.
294. Portnoy D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1981. - Vol. 148. - P. 877-883.
295. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Characterization of plasmids and plasmid-associated determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis // Infect. Immun. 1981. - Vol. 31. - P. 775-782.
296. Post D.M.B., Phillips N.J., Shao J.Q., Entz D.D., Gibson B.W., Apicella M.A. Intracellular survival of Neisseria gonorrhoeae in male urethral epithelial cells: importance of a hexaacyl lipid A // Infect. Immun. 2002 - Vol. 70. - P. 909-920.
297. Pouillot F., Derbise A., Kukkonen M., Foulon J., Korhonen T.K., Carniel E. Evaluation of O-antigen inactivation on Pla activity and virulence of Yersinia pseudotuberculosis harbouring the pPla plasmid // Microbiology. 2005. -Vol. 151. - P. 3759-3768.
298. Prehm P., Jann B., Jann K., Schmidt G., Stirm S. On a bacteriophage T3 and T4 receptor region within the cell wall lipopoly saccharide of Escherichia coli II J. Mol. Biol. 1976.-Vol. 101.-P. 277-281.
299. Prendergast B.J., Freeman D.A., Zucker I., Nelson R.J. Periodic arousal from hibernation is necessary for initiation of immune responses in ground squirrels // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2002. - Vol. 282. - P. R1054-R1062.
300. Prior J.L., Hitchen P.G., Williamson E.D., Reason A.J., Morris H.R., Dell A., Wren B.W., Titball R.W. Characterization of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis II Microb. Pathog. 2001. - Vol. 30. - Vol. 49-57.
301. Quenee L.E., Schneewind O. Plague vaccines and the molecular basis of immunity against Yersiniapestis II Hum. Vaccin. 2009. - Vol. 5. - P. 817-823.
302. Radziejewska-Lebrecht J., Shashkov A.S., Stroobant V., Wartenberg K., Warth C., Mayer H. The inner core region of Yersinia enterocolitica Ye 75 R (O: 3) lipopolysaccharide // Eur. J. Biochem. 1994. - Vol. 221. - P. 343-351.
303. Radziejewska-Lebrecht J., Skurnik M., Shashkov A.S., Brade L., Bartodzieska B., Mayer H. Immunochemical studies on R mutants of Yersinia enterocolitica O: 3 // Acta Biochim. Pol. 1998. - Vol. 45. - P. 1011-1019.
304. Raetz C.R.H. Bacterial endotoxins: extraordinary lipids that activate eucaryo-tic signal transduction // J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 5745-5753.
305. Raetz C.R.H. Biochemistry of endotoxins // Annu. Rev. Biochem. 1990. -Vol. 59.-P. 129-170.
306. Raetz C.R.H., Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins // Annu. Rev. Biochem. 2002. - Vol. 71. - P. 635-700.
307. Rappuoli R. Reverse vaccinology // Curr. Opin. Microbiol. 2000. - Vol. 3. -P. 445-450.
308. Ray M.K., Kumar G.S., Shivaji S. Phosphorylation of lipopolysaccharides in the antarctic psychotropic Pseudomonas syringae: a possible role in temperature adaptation I I J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. - P. 4243-4249.
309. Rebeil R., Ernst R.K., Gowen B., Miller S.I., Hinnebusch B.J. Variation in lipid A structure pathogenic yersiniae // Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 52. - P. 1363-1373.
310. Rebeil R, Ernst R.K., Jarrett C.O., Adams K.N., Miller S.I., Hinnebusch B.J. Characterization of late acyltransferase genes of Yersinia pestis and their role in temperature-dependent lipid A variation // J. Bacteriol. 2006. - Vol. 188. - P. 1381-1388.
311. Reeves P., Pacinelli E., Wang L. O antigen gene clusters of Yersinia pseudotuberculosis 11 Adv. Exp. Med. Biol. 2003. - Vol. 529. - P. 199-209.
312. Reeves P.R., Hobbs M., Valvano M.A., Skurnik M., Whitfield C., Coplin D., Kido N., Klena J., Maskell D., Raetz C.R.H., Rick P.D. Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature // Trends Microbiol. 1996. - Vol. 4. - P. 495-503.
313. Regué M., Cliement N., Abitiu N. Genetic characterisation of the Klebsiella pneumoniae waa gene cluster, involved in core lipopolysaccharide biosynthesis //J. Bacteriol.-2001.-Vol. 183.-P. 3564-3573.
314. Reisman R.E. Allergic reactions due to plague vaccine // J. Allergy. 1970. -Vol. 46.-P. 49-56.
315. Rick P.D. Lipopolysaccharide biosynthesis. In: Neidhardt F.C., Ingraham J.L., Low K.B., Magasanik B., Schaechter M., Umbarger H.E., eds. Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Vol. 1. Washington, DS: ASM Press, 1987: 648-662.
316. Riehm J.M., Vergnaud G, Kiefer D, Damdindorj T, Dashdavaa O, Khurelsukh T, Zöller L, Wölfel R, Le Flèche P, Scholz HC. Yersinia pestis lineages in Mongolia II PLoS One. 2012. - Vol. 7. - e30624.
317. Rietschel E.T., Kirikae T., Schade F.U., Mamat U., Schmidt G, Loppnow H., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function // FASEB J. 1994. - Vol. 8. - P. 217-225.
318. Robey M., O'Connell W., Cianciotto N.P. Identification of Legionella pneumophila rep, a pagP-Yike gene that confers resistance to cationic antimicrobial peptides and promotes intracellular infection // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69.-P. 4276-4286.
319. Robinson V.L., Oyston P.C., Titball R.W. A dam mutant of Yersinia pestis is attenuated and induces protection against plague // FEMS Microbiol Lett. -2005. Vol. 252. - P. 251-256.
320. Roland K.L., Martin L.E., Esther C.R., Spitznagel J.K. Spontaneous pmrA mutants of Salmonella typhimurium LT2 define a new two-component regulatory system with possible role in virulence // J. Bacteriol. 1993. - 175. - P. 4154-4164.
321. Rothfield L., Romeo D. Role of lipids in the biosynthesis of the bacterial cell envelope // Bacteriol. Rev. 1971. - Vol. 35. - P. 14-38.
322. Ruckdeschel K., Roggenkamp A., Lafont V., Mangeat P., Heesemann J., Rouot B. Interaction of Yersinia enterocolitica with macrophages leads to macrophage cell death through apoptosis // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 4813-4821.
323. Ruff M.R., Gifford G.E. Purification and physico-chemical characterization of rabbit tumor necrosis factor // J. Immunol. 1980. - Vol. 125. - P. 1671-1677.
324. Samuelsson K., Lindberg B., Brubaker R.R. Structure of O-specific side chains of lipopolysaccharides from Yersinia pseudotuberculosis II J. Bacteriol. -1974.-Vol. 117.-P. 1010-1016.
325. Sandstrom G., Sjostedt A., Johansson T., Kuoppa K., Williams J. C. Immuno-genicity and toxicity of lipopolysaccharide from Francisella tularensis LVS II FEMS Microbiol. Immunol. 1992. - Vol. 5. - P. 201-210.
326. Schnaitman C.A., Klena J.D. Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in enteric bacteria // Microbiol. Rev. 1993. - Vol. 53. - P. 655-682.
327. Schnaitman C.A., Parker C.T., Klena J.D. Physical maps of the rfa locus of Escherichia coli K-12 and Salmonella typhimurium II J. Bacteriol. 1991. -Vol. 173.-P. 7410-7411.
328. Schwab G.E., Reeves P.R. Comparison of the bactericidal activity of different vertebrate sera // J. Bacteriol. 1966. - Vol. 91. - P. 106-112.
329. Sebbane F., Gardner D., Long D., Gowen B.B., Hinnebusch B. J. Kinetics of disease progression and host response in a rat model of bubonic plague // Am. J. Pathol.-2005.-Vol. 166.-P. 1427-1439.
330. Seyberth H.W., Schmidt-Gayk H., Hackental E. Toxicity, clearance and distribution of endotoxin in mice as influenced by actinomycin D, cycloheximide, amanitin and lead acetate // Toxicon. 1972. - Vol. 10. - P. 491-500.
331. Skrzypek E., Haddix P.L., Piano G.V., Straley S.C. New suicide vector for gene replacement in yersiniae and other gram-negative bacteria // Plasmid. -1993.-Vol. 29.-P. 160-163.
332. Skurnik M. Lack of correlation between the presence of plasmids and fimbriae in Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotuberculosis II J. Appl. Bact. -1984.-Vol. 56.-P. 355-363.
333. Skurnik M. Molecular genetics of Yersinia lipopolysaccaharide. In: Goldberg JB. (ed) Genetics of bacterial polysaccharides. Boca Raton, FL: CRC Press LLC, 1999; 23-51.
334. Skurnik M., Bengoechea J.A. The biosynthesis and biological role of lipopoly-saccharide O-antigens of pathogenic yersiniae // Carbohyd. Res. 2003. -Vol. 338. - P. 2521-2529.
335. Skurnik M., Venho R, Bengoechea J.A., Moriyon I. The lipopolysaccharide outer core of Yersinia enterocolitica serotype 0:3 is required for virulence and plays a role in outer membrane integrity // Mol Microbiol. -1999. Vol. 31. - P. 1443-1462.
336. Skurnik M., Venho R., Toivanen P., al-Hendy A. A novel locus of Yersinia enterocolitica serotype 0:3 involved in lipopolysaccharide outer core biosynthesis // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 17. - P. 575-594.
337. Skurnik M., Zang L. Molecular genetics and biochemistry of Yersinia lipopolysaccaharide // APMIS. 1996. - Vol. 104. - P. 849-872.
338. Smiley S.T. Immune defense against pneumonic plague // Immunol. Rev. -2008. Vol. 225. - P. 256-271.
339. Somerville J. E., Cassiano L., Bainbridge B., Cunningham M.D., Darveau R.P. A novel Escherichia coli lipid A mutant that produces an anti-inflammatory lipopolysaccharide // J. Clin. Invest. 1996. - Vol. 97. - P. 359-365.
340. Somerville J.E., Cassiano L., Darveau R.P. Escherichia coli msbB gene as a virulence factor and a therapeutic target // Infect. Immun. -1999. Vol. 67. - P. 6583-6590.
341. Soncini F.C., Groisman E.A. Two-component regulatory systems can interact to process multiple environmental signals // J. Bacteriol. -1996. Vol. 178. - P. 6796-6801.
342. Starner T.D., Swords W.E., Apicella M.A., McCray P.B., Jr. Susceptibility of nontypeable Haemophilus influenzae to human ß-defensins is influenced by li-pooligosaccharide acylation // Infect. Immun. 2002. - Vol. 70. - P. 5287-5289.
343. Steeghs L., den Hartog R., den Boer A., Zomer B., van der Ley P. Meningitis bacterium is viable without endotoxin // Nature. 1998. - Vol. 392. - P. 449-450.
344. Straley SC, Perry RD Environmental modulation of gene expression and pathogenesis in Yersinia II Trends Microbiol. 1995. - Vol. 3. - P. 310-317.
345. Sun W., Roland K.L., Branger C.G., Kuang X., Curtiss R. The role of relA and spoT in Yersiniapestis KIM5 pathogenicity // PLoS One. 2009. - Vol. 4. - e6720.
346. Sun W., Wang S., Curtiss R. Highly efficient method for introducing successive multiple scarless gene deletions and markerless gene insertions into the Yersinia pestis chromosome // Appl. Environ. Microbiol. 2008. - Vol. 74. - P. 4241-4245.
347. Tan L., Darby C. Yersinia pestis is viable with endotoxin composed of only lipid A // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187. - P. 6599-6600.
348. Tan L., Darby C. Yersinia pestis YrbH is a multifunctional protein required for both 3-deoxy-D-ma««o-oct-2-ulosonic acid biosynthesis and biofilm formation // Mol. Microbiol. 2006. - Vol. 61. - P. 861-870.
349. Taylor V.L., Titball R.W., Oyston P.C. Oral immunization with a dam mutant of Yersinia pseudotuberculosis protects against plague // Microbiology. 2005. -Vol. 151 -P. 1919-1926.
350. Tenner A.J., Ziccardi R.J., Cooper N.R. Antibody-independent CI activation by Escherichia coli II J. Immunol. 1984. - Vol. 133. - P. 886-891.
351. Therisod H., Karibian D, Perry M.B, Caroff M. Structural analysis of Yersinia pseudotuberculosis ATCC 29833 lipid A // Int. J. Mass Spectrom. 2002. -Vol. 219.-P. 540-557.
352. Titball R.W., Williamson E.D. Vaccination against bubonic and pneumonic plague//Vaccine.-2001.-Vol. 19.-P. 4175-4184.
353. Tomshich S.V., Gorshkova R.P., Ovodov Y.S. Structural study of the core of Yersinia pseudotuberculosis lipopolysaccharides // Khim. Prirod. Soed. 1985. -N 6.- 751-755.
354. Tsai C.M. Frash C.E. A sensitive silverstain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1982. - Vol. 119. - P. 115-119.
355. Tsubokura M., Aleksic S. A simplified antigenic scheme for serotyping of Yersinia pseudotuberculosis: phenotypic characterization of reference strains and preparation of O and H factor sera // Contrib. Microbiol. Immunol. 1995. -Vol. 13.-P. 99-105.
356. Vaara M., Vaara T., Jensen M., Helander I., Nurminen M., Rietschel E.T., Makela P.H. Characterization of the lipopolysaccharide from the polymyxin-resistant pmrA mutants of Salmonella typhimurium IIFEBS Lett. 1981. - Vol. 129.-P. 145-149.
357. Vaara M. Agents that increase the permeability of the outer membrane // Microbiol. Rev. 1992. - Vol. 56. - P. 395^111.
358. Vaara M. Antibiotic-supersusceptible mutants of Escherichia coli and Salmonella typhimurium II Antimicrob. Agents Chemother. 1993. - Vol. 37. - P. 2255-2260.
359. Vaara M. Lipopolysaccharide and the permeability of the bacterial outer membrane // Endotoxin in health and disease / Brade H., Opal S.M., Vogel S.N., Morrison D.C. (ed.) Marcel Dekker: New York, 1999. - P. 31-38.
360. Vaara M., Nurminen M. Outer membrane permeability barrier in Escherichia coli mutants that are defective in the late acyltransferases of lipid A biosynthesis // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - P. 1459-1462.
361. Valvano M.A., Messner P., Kosma P. Novel pathways for biosynthesis of nucleo-tide-activated glycero-manno-hspiosQ precursors of bacterial glycoproteins and cell surface polysaccharides // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 1979-1989.
362. Van Amersfoort E.S., Van Berkel T.J., Kuiper J. Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis and septic shock // Clin. Microbiol. Rev.-2003.-Vol. 16.-P. 379-414.
363. Van der Poll T., van Deventer S.J. Cytokines and anticytokines in the pathogenesis of sepsis // Infect. Dis. Clin. North. Am. 1999. - Vol. 13. - P. 413-426.
364. Van Loghem J.J. The classification of plague-bacillus // Antonie van Leeuwen-hoek Journal of Microbiology and Serology. 1944. - Vol. 10. - P. 15-16.
365. VanPutten J.P. Phase variation of lipopolysaccharide directs interconversion of invasive and immuno-resistant phenotypes of Neisseria gonorrhoeae II EMBO J. 1993.-Vol. 12.-P. 4043-4051.
366. Venkatesan M.M., Goldberg M.B., Rose D.J., Grotbeck E.J., Burland V., Blattner F.R. Complete DNA sequence and analysis of the large virulence plas-mid of Shigella flexneri II Infect. Immun. 2001. - Vol. 69. - P. 3271-3285.
367. Viboud G.I., Bliska J.B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis // Annu. Rev. Microbiol. 2005. -Vol. 59. - P. 69-89.
368. Vinogradov E, Cedzynski M, Ziolkowski A, Swierzko A. The structure of the core region of the lipopolysaccharide from Klebsiella pneumoniae 0:3 // Eur. J. Biochem. 2001. - Vol. 268. - P. 1722-1729.
369. Vinogradov E., Lindner B., Seltmann G., Radziejewska-Lebrecht J., Hoist O. The structures of the core-lipid a regions of lipopolysaccharides from Serratia marcescens IIXXI Intern. Carbohydr. Symp., Cairns, Australia 2002. - P. 279.
370. Vinogradov E., Perry M.B. Structural analysis of the core region of the lipopolysaccharides from eight serotypes of Klebsiella pneumoniae II Carbohydr. Res. -2001.-Vol. 335.-P. 291-296.
371. Vinogradov E.V., Bock K., Petersen B.O., Hoist O., Brade H. The structure of the carbohydrate backbone of the lipopolysaccharide from Acinetobacter strain ATCC 17905 // Eur. J. Biochem. 1997. - Vol. 243. - P. 122-127.
372. Vishwanath S., Hackstadt T. Lipopolysaccharide phase variation determines the complement-mediated serum susceptibility of Coxiella burnetii II Infect. Immun. 1988. - Vol. 56. - P. 40-44.
373. Walker R.V., Barnes M.G., Higgins E.D. Composition of and physiopathology produced by plague endotoxins // Nature. 1966. - Vol. 209. - P. 1246.
374. Walsh A.G., Matewish M.J., Burrows L.L., Monteiro M.A., Perry M.B., Lam J.S. Lipopolysaccharide core phosphates are requered for viability and intrinsic drug resistance of Pseudomonas aeruginosa II Mol. Microbiol. -2000. -Vol. 35.-P. 718-727.
375. Wang X., Quinn P.J. Lipopolysaccharide: Biosynthetic pathway and structure modification // Prog. Lipid Res. 2010. - Vol 49. - P. 97-107.
376. Wauters G, Aleksis S., Charlier J., Schutze G. Somatic and flagellar antigens of Yersinia enterocolitica and related species // Contrib. Microb. Immunol. -1991.-Vol. 12.-P. 239-243.
377. Weidel W. Bacterial viruses (With particular reference to adsorption penetration) // Ann. Rev. Microbiol. 1958. - Vol. 12. - P. 27-48.
378. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides: extraction with phenol-water and further application of the procedure // Methods in carbohydrate chemistry / Roy L. Whistler (ed.). New York: Academic Press. Inc., 1965. Vol. 5. - P. 83-91.
379. Whitfield C., Heinrichs D.E., Yethon J.A., Amor K.L., Monteiro M.A., Perry M.B. Assembly of the Rl-core oligosaccharide of Escherichia coli lipopolysac-charide // J. Endotoxin. Res. 1999. - Vol. 5. - P. 151-156.
380. Wiese A., Gustman T., Seydel U. Towards antibacterial strategies: studies on the mechanisms of interaction between antibacterial peptides and model membranes // J. Endotoxin Res. 2003. - Vol. 9. - P. 67-84.
381. Winfield M.D., Latifi T., Groisman E.A. Transcriptional regulation of the 4-amino-4-deoxy-L-arabinose biosynthetic genes in Yersinia pestis // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 14765-14772.
382. Worku M., Morris A. Binding of different forms of lipopolysaccharide and gene expression in bovine blood neutrophils // J. Dairy Sei. 2009. - Vol. 92. -P. 3185-3193.
383. World Health Organization. Health aspects of chemical and biological weapons. Geneva, Switzerland: World Health Organization, 1970. - P. 98-109.
384. Wösten M.M.S.M., Groisman E.A. Molecular characterization of the PmrA regulon // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 27185-27190.
385. Wright A., McConnell M., Kanegasaki S. Lipopolysaccharide as a bacteriophage receptor // Virus Receptors / Randall L.L., Philipson L. (ed.). London: Chapmann and Hall, 1980. - P. 27-57.
386. Yethon J.A., Whifield C. Lipopolysaccharide is a taget for the development of novel therapeutics in Gram-negative bacteria // Curr. Drug Tagets Infect. Disord. 2001.-Vol. 1.-P. 91-106.
387. Yethon J.A., Whifield C. Purification and characterization of WaaP from Escherichia coli, a lipopolysaccharide kinase essential for outer membrane stability // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276. - P 5498-5504.
388. Yoshizaki H., Fukuda N., Sato K., Oikawa M., Fukase K., Suda Y., Kusumoto S. First total synthesis of the Re-type lipopolysaccharide // Angew. Chem. Int. Ed.-2001.-Vol. 8-P. 1475-1480.
389. Zahringer U., Lindner B., Rietschel E.T. Molecular structure of lipid A, the en-dotoxic center of bacterial lipopolysaccharides // Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1994. - Vol. 50. - P. 211-276.
390. Zhao X., Lam J.S. WaaP Pseudomonas aeruginosa is a novel eukaryotic type protein-tyrosine kinase as well as a sugar kinase essential for the biosynthesis of core lipopolysaccharide // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. - P. 4722-4730.
391. Zhao X., Wenzel C.Q., Lam J.S. Nonradiolabeling assay for WaaP, an essential sugar kinase involved in biosynthesis of core lipopolysaccharide // Antimi-crob. Agents Chemother. 2002. - Vol. 46. - P. 2035-2037.
392. Zhao X., Wu W., Qi Z., Cui Y., Yan Y., Guo Z., Wang Z., Wang H., Deng H., Xue Y., Chen W., Wang X., Yang R. The complete genome sequence and pro-teomics of Yersinia pestis phage Yep-cp // J. Gen. Virol. 2011. - Vol. 92. -P. 216-221.
393. Zhou D., Han Y., Song Y., Huang P., Yang R. Comparative and evolutionary genomics of Yersinia pestis II Microbes Infect. 2004. - Vol. 6. - P. 1226-1234.
394. Zimmer S.M., Zughaier S.M., Tzeng Y.-L., Stephens D. S. Human MD-2 discrimination of meningococcal lipid A structures and activation of TLR4 // Gly-cobiology. 2007. - Vol. 17. - P. 847-856.
395. Zughaier S.M., Tzeng Y.L., Zimmer S.M., Datta A., Carlson R.W., Stephens D.S. Neisseria meningitidis lipooligosaccharide structure-dependent activation of the macrophage CD14/Toll-like receptor 4 pathway // Infect. Immun. 2004. -Vol. 72.-P. 371-380.
-
Дентовская, Светлана Владимировна
-
доктора медицинских наук
-
Москва, 2012
-
ВАК 03.02.03
- Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба
- Молекулярное моделирование внутрифаголизосомальной среды макрофагов млекопитающих для изучения антигенов, синтезируемых патогенными иерсиниями
- Структурно-функциональная вариабельность антигенов Y. pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов
- Структурно-функциональная организация и генно-инженерная модификация липополисахарида Yersinia pestis
- Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов
