Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов

Одиноков, Георгий Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов"

094613038

На правах рукописи

ОДИНОКОВ Георгий Николаевич

Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersiniapestis основного и неосновных подвидов

03.02.03 - микробиология 03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 8 НОЯ 2010

Саратов-2010

004613038

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательсю противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфе; защиты прав потребителей и благополучии человека»

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Ерошенко Галина Александровна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна доктор медицинских наук Микшис Наталья Ивановна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских на; «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии име! почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН»

Защита состоится « / 6'» Ы>£ 2010 г. ( S часов на заседай

диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидаток диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумн: институт «Микроб»» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российск научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»».

Автореферат разослан « I ОьсТ^е •А_2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник

А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Чума - зоонозная природно-очаговая особо опасная карантинная бактериальная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя [Черкасский, 1996]. Чума представляет реальную угрозу для населения из-за существования многочисленных природных очагов чумы, часть из которых расположена в Российской Федерации и ближнем зарубежье [Оншценко с соавт., 2004]. Высока вероятность заноса возбудителя чумы на территорию России из соседних, неблагополучных по этой болезни стран, а также в результате биотеррористических актов. По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется более 2000 случаев заболевания чумой, многие из которых заканчиваются летальным исходом. Большая вспышка легочной чумы в 2009 г. произошла в Хайнань-Тибетском автономном округе Китая, в которой тоже был зарегистрирован ряд смертельных случаев [WHO / plague sheets, 2009]. Все эти факты настоятельно требуют разработки новых, основанных на современных технологиях высокоэффективных методов диагностики возбудителя чумы, средств профилактики и лечения вызываемой им особо опасной болезни.

Используемые до настоящего времени классификации Yersinia pestis учитывали лишь морфологические, культуральные, биохимические и другие фенотипические признаки [Безсонова, 1928; Борзенков, 1938; Туманский, 1957; Тимофеева, 1968; Ку-тырев, Проценко, 1998; Devignat, 1951] и были не лишены недостатков, связанных с изменчивостью этих свойств. Однако достигнутые в последнее время успехи в фундаментальной генетике и молекулярной микробиологии позволяют перевести решение задач по систематизации возбудителя чумы на качественно новый уровень, основанный на использовании его молекулярно-генетических особенностей.

В соответствии с принятой в настоящее время отечественной классификацией штаммы возбудителя чумы делят на основной и 4 неосновных (кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский) подвида [Тимофеева, 1985; Кутырев, Проценко, 1998]. Согласно распространенной зарубежной классификации штаммы Y. pestis на основании различий по ряду биохимических свойств (способность к ферментации глицерина, редукции нитратов, окислению аммиака) и по историко-географическому принципу [Devignat, 1951] делят на три биовара: antiqua (античный), medievalis (средневековый) и orientalis (восточный). По фенотипическим характеристикам штаммы основного подвида соответствуют трем биоварам (античному, средневековому и восточному), принятым в зарубежной классификации. Однако штаммы К pes-

tis, циркулирующие в природных очагах чумы в РФ и ближнем зарубежье, остаютс не систематизированными по их принадлежности к определенным биоварам.

По экспрессии дифференциально-значимых биохимических признаков наиб( лее активными являются штаммы античного биовара. Они ферментируют глицерин обладают денитрифицирующей активностью. Штаммы средневекового биовара ! pestis не способны редуцировать нитраты, но ферментируют глицерин и арабиноз; Штаммы восточного биовара не ферментируют глицерин, но активно редуцирук нитраты и утилизируют арабинозу.

Штаммы основного подвида, циркулирующие на территории РФ и ближнег зарубежья, как правило, высоко вирулентны и имеют высокую эпидемическую зн: чимость. Они не ферментируют рамнозу и мелибиозу, не чувствительны к пестицт I, имеют высокий уровень продукции изоцитралиазы. Штаммы неосновных подвиде ферментируют рамнозу и мелибиозу, чувствительны к пестицину I, не проявляк изоцитрат-лиазной активности, избирательно вирулентны для лаборторных живо1 ных, эпидемически малозначимы.

Генетические причины различной экспрессии биохимических признаков, и пользуемых при делении штаммов Y. pestis на биовары и подвиды, остаются к н стоящему моменту изученными недостаточно. Достоверно установлено лишь то, чт причиной отсутствия ферментации глицерина у штаммов восточного биовара являе ся мутация в гене глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (glpD). Показано, что в этом rei у всех штаммов восточного биовара присутствует делеция размером 93 п.н. [Parhill al., 2001; Motin et al., 2002]. В литературе имеются лишь единичные работы по опр делению различий в структуре генов Y. pestis основного и неосновных подвидов, ю дирующих редукцию нитратов и ферментацию рамнозы [Куклева с соавт., 200 2009; Anisimov et al., 2004; Zhou et al., 2004].

Остаются не установленными причины гетерогенности штаммов чумного ми роба по питательным потребностям. Штаммы из различных природных очагов чум отличаются по питательным потребностям, определяемым нарушениями генов пр межуточного метаболизма, что может быть использовано в генетической схеме ди( ференциации штаммов Y. pestis из различных природных очагов чумы.

Выявление изменений в структуре генов, лежащих в основе различной эк прессии микробиологических и биохимических признаков, послужит надежной о новой для создания генетической схемы классификации штаммов возбудителя чум а также для определения основных направлений внутривидовой эволюции Y. pestis.

Цель работы. Определение генетических основ различной экспрессии биохимических признаков, используемых для деления штаммов возбудителя чумы на подвиды и биовары.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать использованные в работе штаммы У. ре^м, выделенные в природных очагах чумы в РФ и ближнего зарубежья, по биохимическим свойствам (редукция нитратов, продукция изоцитрат-лиазы, ферментация арабинозы и мелибиозы), лежащим в основе деления на подвиды и биовары. Установить принадлежность штаммов, циркулирующих на территории России и сопредельных стран, к определенным биоварам.

2. Изучить структурно-функциональную организацию генов, кодирующих дифференциальные признаки, используемые при делении на биовары, - редукцию нитратов и ферментацию арабинозы.

3. Выявить изменения в генах У. реяНз, детерминирующих ферментацию мелибиозы и продукцию изоцитрат-лиазы, лежащих в основе дифференциации основного и неосновных подвидов возбудителя чумы.

4. Определить питательные потребности штаммов У резНя кавказского подвида и установить генетические основы их ауксотрофности.

5. Оценить перспективность использования полученных результатов для создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов У резИэ и установления основных направлений внутривидовой эволюции этого возбудителя.

Научная новизна работы. На основании данных комплексного микробиологического, биохимического и генетического анализа установлено, что штаммы возбудителя чумы, циркулирующие в природных очагах РФ и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам.

Впервые показано, что причиной отсутствия нитратредуцирующей активности у части штаммов основного подвида, циркулирующих на территории РФ и ближнего зарубежья, является наличие замены единичного нуклеотида С —*Т в позиции 613 гена периплазматической нитратредуктазы - пар А, что доказывает принадлежность этих штаммов к средневековому биовару. Отсутствие экспрессии этого признака у штаммов алтайского и гиссарского подвидов вызвано вставкой тиминового нуклеотида (+Т) в 302 позиции другого гена - ¿¿иА, которая приводит к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры кодируемого транспортного белка - БзиА, также участвующего в восстановлении нитратов.

Впервые установлено, что отсутствие ферментации арабинозы у штаммов ] pestis алтайского и гиссарского подвидов связано с наличием мутации в регулято{ ном гене арабинозного оперона - агаС, который содержит инсерцию гуаниновог нуклеотида (+G) в позиции 773 от начала гена, приводящую к сдвигу рамки считыв: ния и нарушению структуры регуляторного белка АгаС, необходимого для иници; ции транскрипции генов арабинозного оперона.

Впервые установлена генетическая основа различной продукции изоцитра' лиазы у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, связанная наличием вставки двух нуклеотидов (+СС) в регуляторном гене iclR в позиции 26* 270, которая приводит к инактивации кодируемого им белка-репрессора ацетатног оперона IclR и является причиной конститутивного синтеза фермента изоцитра' лиазы у штаммов основного подвида. Штаммы неосновных подвидов содержат ш тактный ген iclR и не способны к конститутивному синтезу изоцитрат-лиазы.

Показано, что отсутствие ферментации мелибиозы у штаммов Y. pestis ochoj ного подвида обусловлено внедрением инсерционной последовательности IS2&5 ген melB, кодирующий фермент галактозидпермеазу. У штаммов неосновных подв] дов вставка IS285 в гене melB отсутствует.

Впервые выявлены генетические основы ауксотрофности штаммов кавказско1 подвида, которые связаны с внедрением инсерционных последовательностей IS ¡00 гены argA и aroF, вставкой 10 п.н. в ген aroG, инсерцией тиминового нуклеотида ген thiH и делецией 13 п.н. в гене thiG.

Полученная молекулярная характеристика штаммов Y. pestis основного и нео новных подвидов по генам, кодирующим биохимические признаки, лежащие в осн ве деления на подвиды и биовары, создает основу для разработки генетической сх мы внутривидовой классификации возбудителя чумы.

По результатам работы оформлены заявки на изобретение «Способ определ ния подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы методом секвениров ния» (№2009116913. Приоритет от 14.05.2009. Получено решение о выдаче патент и «Способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультил кусного сиквенс - типирования (№2009146094. Приоритет от 11.12.2009).

Практическая значимость работы. По результатам работы оформлены и у верждены методические рекомендации «Определение подвидовой принадлежнос штаммов возбудителя чумы на основе секвенирования генов rhaS и агаС, контрол рующих ферментацию рамнозы и арабинозы» (утверждены директором РосНИПЧ «Микроб». Протокол № 6 от 16 июня 2009) и «Определение подвидовой принадле;

ности штаммов Yersinia pestis методом мультилокусмного сиквенс - типирования (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Протокол № 1 от 23 февраля 2010).

В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы три штамма: Y. pestis КМ 910 алтайского, КМ 596 гиссарского и КМ 1861 улегейского подвидов в качестве референс-штаммов этих подвидов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы возбудителя чумы основного подвида, циркулирующие в природных очагах РФ и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам, о чем свидетельствуют данные комплексного анализа микробиологических, биохимических и генетических свойств этих штаммов.

2. В основе разного проявления биохимических признаков, используемых при делении штаммов Y. pestis на подвиды и биовары, лежат различные типы мутаций в генах, кодирующих эти признаки. Отсутствие способности к редукции нитратов у штаммов основного подвида средневекового биовара связано с наличием нонсенс-мутации (G —> Т) в гене парА периплазматической нитратредуктазы, а у штаммов алтайского и гиссарского подвидов - с инсерцией единичного нуклеотида в ген ssuA транспортного периплазматического белка SsuA. Отсутствие ферментации арабинозы у штаммов алтайского и гиссарского подвидов обусловлено вставкой гуанинового нуклеотида в последовательность гена агаС.

3. Разная биохимическая активность штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы по ряду дифференциальных признаков вызвана редукцией кодирующих их генов у основного подвида и их интактностью у неосновных подвидов. Отсутствие ферментации мелибиозы штаммами основного подвида обусловлено внедрением IS285 в ген те!В галактозидпермеазы, а конститутивный синтез изоцитрат-лиазы у штаммов этого подвида - вставкой двух нуклеотидов (СС) в последовательность регуляторного гена iclR. Штаммы неосновных подвидов содержат интактные гены melB и iclR.

ного нуклеотида в thiH. На основе всего комплекса выявленных мутаций для штаи мов кавказского и других подвидов, а также биоваров возбудителя чумы определен характерные генотипы, которые могут быть использованы при создании генетическс схемы внутривидовой классификации Y. pestis.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены н IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участнико СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфек ционными болезнями на территории государств - участников содружества независ» мых государств», Волгоград, 2008; VI Международной конференции «Молекулярна диагностика и биобезопасность», М., 2009; научно-практической школь конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технолс гии обеспечения биологической безопасности», 25 - 27 мая 2010 г.; на ежегодны итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов 2008 - 2010 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 периодических изданиях из «Перечня ведущих рецензируемых научных журнало] рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России...».

Структура и объём диссертации. Диссертация представлена на 157 страт цах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти гла собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 11 та( лицами и 34 рисунками. Библиографический указатель содержит 203 отечественны и зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В работе использовано 111 штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, из них : штамм возбудителя чумы основного и 50 штаммов неосновных подвидов, выделе иых на территории РФ, ближнего и дальнего зарубежья. Исследовано также 10 шта мов Y. pseudotuberculosis различного происхождения. Изучение культуральн морфологических и биохимических свойств штаммов проводили с помощью трад ционно используемых методов [Практическое руководство по лабораторной диагн стики опасных инфекционных болезней, 2009 г.]. Выделение ДНК штаммов Y. pes осуществляли стандартным методом в соответствии с методикой, приведенной в М. 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификащ нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I - 1 групп патогенности». Анализ полученных в ПЦР продуктов проводили в 0,8 - 2

агарозном геле в соответствии с руководством Т. Маниатиса с соавт. [1984]. Определение нуклеотидных последовательностей генов осуществляли на генетическом анализаторе модели "CEQ 8000" (Beckman Coulter) по методу F. Sanger [1977]. Сравнительный анализ геномов У. pestis и У. pseudotuberculosis и метаболических путей биосинтеза факторов роста проводили с помощью алгоритма BLAST базы данных NCBI GenBank и KEGG Metabolic Pathways. Филогенетический анализ штаммов выполняли на основе программ Mega 4.0, PHYLIP и SplitsТгее4 и дистанционно-матричных методов: UPGMA, FITCH, Kitch, Neighbor-Joining, Minimum Evolution.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Анализ микробиологических и биохимических свойств штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов из различных природных очагов чумы

Все использованные в работе штаммы У. pestis были исследованы по их биохимической активности: способности к редукции нитратов, ферментации глицерина, арабинозы, мелибиозы, рамнозы, продукции изацитрат-лиазы - признакам, используемым при делении на подвиды и биовары. Как было установлено, все изученные штаммы основного подвида - Y. pestis ssp. pestis не ферментировали рамнозу и мели-биозу, но продуцировали изоцитрат-лиазу. В отличие от них все штаммы Y. pestis неосновных подвидов ферментировали рамнозу и мелибиозу, но не продуцировали изоцитрат-лиазу. Полученные сведения коррелировали с литературными данными о биохимических особенностях штаммов Y. pestis, используемых для дифференциации основного и неосновных подвидов возбудителя чумы.

При изучении биохимических признаков, применяемых при делении штаммов У. pestis на биовары, - редукции нитратов, ферментации арабинозы и глицерина была установлена гетерогенность по этим свойствам у штаммов основного и неосновных подвидов. Часть штаммов основного подвида, выделенных на территории РФ и ближнего зарубежья, не редуцировала нитраты, что свидетельствовало об их принадлежности к средневековому биовару. Штаммы неосновных подвидов - алтайского, гиссарского и улегейского также не редуцировали нитраты, в то время как кавказские штаммы были положительны по этому признаку.

По второму дифференциальному признаку - ферментации арабинозы, все исследованные в работе штаммы У. pestis основного, кавказского и улегейского подвидов были однородными и утилизировали этот моносахарид. Штаммы алтайского и гиссарского подвидов не ферментировали арабинозу, и генетические основы различной экспрессии этого признака оставались не известными.

Отсутствие способности ферментировать глицерин (еще один дифференциал] ный биохимический признак) является характерным признаком штаммов биовар orientalis. Однако в РФ и странах ближнего зарубежья не выявлено очагов с постоя! ной циркуляцией таких штаммов. В литературе имеются лишь отдельные сообщена о выделении на этих территориях единичных глицериннегативных штаммов Y. pest [Сагымбек с соавт., 2003; Онищенко с соавт., 2004].

Характерной генетической меткой штаммов биовара orientalis является делец» размером 93 п.н. в гене glpD - глицерол-3-фосфатдегидрогеназы [Parhill et al., 2001 Нами установлено, что все штаммы Y. pestis из природных очагов чумы РФ и ближнего зарубежья не содержали в гене glpD характерной для восточного биовара дел< ции размером 93 п.н., что подтверждает отсутствие среди них штаммов биовара oriei talis (рисунок 1). Такие штаммы выявлялись лишь среди изолятов, полученных странах дальнего зарубежья.

t 2 » « S < Г > ' I II Я -I II II It Я Я К

щ||1| !!!!!! * ■ :-11!1Ш1!! ■■ * i Ш и|

: : ' 1 : ' г'' ' W ' ^Ш^ШШ^МШ^ Щ '

Рисунок 1. ПЦР анализ штаммов Y. pestis с прайм ерами на ген glpD : 1 - 16 - штаммы основного подвида из природных очагов чумы РФ и ближнего зарубежья; 17— 19 — штаммы восточного биовара из дальнего зарубежья; 20 - отрицательный контроль. Стрелками указаны размеры образуемых амплификатов.

Таким образом, изученные нами штаммы Y. pestis, выделенные на территорн РФ и ближнего зарубежья, по комплексу биохимических признаков (ферменташ-глицерина, редукция нитратов) принадлежат к античному и средневековому биов -рам, что коррелирует с общепринятым мнением о приуроченности штаммов эть биоваров к континентальным очагам чумы, а штаммов восточного биовара - к очап крысиного типа, расположенным вдоль океанических побережий.

Большое внимание в ходе выполнения этой работы было уделено исследов нию штаммов возбудителя чумы кавказского подвида, поскольку, по мнению ряда и следователей [Бобров, Филиппов, 1997], они являются самыми древними из сохр нившихся штаммов возбудителя чумы и наиболее близки к предшественнику - I pseudotuberculosis. По биохимическим свойствам штаммы этого подвида оказали: наиболее активными среди всех подвидов Y. pestis. Они обладали нитратредуциру! щей активностью, ферментировали глицерин, арабинозу, рамнозу, мелибиозу. П -скольку в литературе имелись противоречивые данные по питательным потребноеп

штаммов этого подвида [Мартиневский, 1969; Апарин, Голубинский, 1989], нами проведены исследования по уточнению питательных потребностей штаммов кавказского подвида.

Установлено, что все изученные штаммы кавказского подвида вели себя достаточно единообразно. У них выявлена потребность в аминокислотах - фенилаланине, тирозине, аргинине и витамине В] (тиамине). У штаммов из Восточно-Кавказского высокогорного очага чумы кроме потребностей в этих факторах роста также обнаружена зависимость по лейцину, в то время как штаммы кавказского подвида из Лени-наканского, Присеванского, Зангезуро-Карабахского, Приараксинского природных очагов такой зависимости не имели.

Поскольку причины ауксотрофности штаммов кавказского подвида по аминокислотам и витамину В, (тиамину) не известны, нами в дальнейшем было проведено исследование генетических основ ауксотрофности штаммов этого подвида.

2. Определение структурно-функциональной организации генов, кодирующих биохимические признаки, используемые для дифференциации биоваров возбудителя чумы

Отсутствие способности редуцировать нитраты является характерным признаком штаммов У. pestis средневекового биовара, который отличает их от штаммов античного и восточного биоваров. Штаммы неосновных подвидов чумного микроба, циркулирующие в природных очагах на территории РФ и стран ближнего зарубежья, также различаются по их денитрифицирующей активности. Однако генетические причины различного проявления у них этого признака остаются не установленными.

Нами на основе сравнительного компьютерного анализа геномов штаммов У. pestis и У. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, установлено, что гены, участвующие в редукции нитратов объединены в пар оперон, который имеет у них идентичную структуру и состоит из шести генов: napA-F и парР (рисунок 2).

Были исследованы и другие гены, также принимающие участие в восстановлении нитратов, - пагР и ssuA, кодирующие соответственно регуляторный белок NarP и транспортный белок SsuA

Рисунок 2. Структура пар оперона у штаммов У. pestis

В результате проведенного компьютерного анализа генов пар оперона был выявлено наличие единичных нуклеотидных замен во всех генах этого оперона, н наиболее значимой оказалась замена нуклеотида G —* Т в позиции 613 от начала ген парА - периплазматической нитратредуктазы, которая была выявлена ранее у Y. pest, KIM и других штаммов биовара medievalis [Deng et al., 2002]. По данным компьюте} ного анализа с использованием программы MEGA 4.0 установлено, что эта мутаци приводит к смене триплета GAA —» ТАА, который является стоп-кодоном и служи причиной преждевременной терминации трансляции полипептидной цепи (после 20< го аминокислотного остатка) молекулы этого фермента.

Другая значимая для проявления денитрифицирующей активности мутация вь явлена нами в хромосомном гене ssuA (размер гена - 1123 п.н.), который содержг вставку тиминового нуклеотида в 302 позиции у штамма 91001 биовара microti (NCBI GenBank). По данным компьютерного анализа с использованием программ Mega 4.0 эта мутация приводит к сдвигу рамки считывания и нарушению структур белка SsuA.

На вариабельные участки генов парА и ssuA были сконструированы праймер! с помощью которых проводили амплификацию фрагментов этих генов в ПЦР и, дальнейшем, определяли их нуклеотидную последовательность. Для выявления npi чин различной денитрифицирующей активности у штаммов Y. pestis нами был изуч> но 90 штаммов У. pestis основного и неосновных подвидов из различных природнь очагов чумы, а также 10 штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения, результате проведенного анализа установлено, что выделенные в РФ и ближнем зар; бежье штаммы основного подвида, неспособные редуцировать нитраты, имели ед] ничную нуклеотидную замену G —> Т в позиции 613, характерную для штаммов би< вара medievalis, которая приводит к смене кодона (GAA —► ТАА) и преждевременнс терминации трансляции полипептидной цепи молекулы периплазматической нитра редуктазы. Наличие характерной нуклеотидной замены в позиции 613, являющей« генетической меткой биовара medievalis, у части изученных штаммов основного по, вида, наряду с отсутствием у них денитрифицирующей активности служит основан: ем для отнесения их к средневековому биовару.

В тоже время нами не было выявлено наличие этой мутации в гене парА штаммов алтайского и гиссарского подвидов, также не способных редуцировать ни раты. Было установлено, что причиной отсутствия денитрифицирующей активности этих штаммов является другая мутация, вызванная вставкой тиминового нуклеотида 302 позиции гена ssuA транспортного периплазматического белка SsuA. Эта мутащ

обнаружена не только у штаммов алтайского и гиссарского подвидов, но и у штамма 91001 биовара microtus, который также не способен редуцировать нитраты.

Другим важным биохимическим признаком, используемым для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы, является ферментация арабинозы. Все штаммы основного, кавказского и улегейского подвидов способны утилизировать этот углевод, в то время как штаммы алтайского и гиссарского подвидов, а также биовара microtus не способны его использовать. Однако генетические причины отсутствия проявления этого признака у штаммов алтайского и гиссарского подвидов возбудителя чумы остаются не установленными.

Нами на основе сравнительного компьютерного анализа геномов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank) установлено, что у всех штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов арабинозный оперон имеет идентичную структуру и состоит из шести генов. В него входят пять структурных - araA, araB, araH, araF, araG, и один регуляторный ген агаС (рисунок 3).

8568 п.н.

1502 П.н. ПОЗ П.н. 98? п.н 1538 п.н. 1049 п.н 931 п.н

агаВ araF araG ara'd агаС

8-4 п.н 40S л н 151 ПН IS ПК 221 ПН.

Рисунок 3. Структура арабинозного оперона Y. pestis

В результате сравнительного компьютерного анализа генов арабинозного оперона, а также гена araD у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank), было установлено наличие значимой мутации в регуляторном гене агаС, который содержал делецию в 112 п.н. (26 - 137) и инсерцию гуанина в позиции 773 у штамма 91001 биовара microtus, как это ранее было установлено D. Zhou et al. [2004]. На вариабельные области гена агаС были сконструированы две перекрывающиеся пары праймеров, фланкирующие полную нуклеотидную последовательность этого гена, и в ПЦР получены его амплификаты.

Секвенирование полной последовательности гена агаС, проведенное нами у 95 природных штаммов Y. pestis и 10 штаммов Y. pseudotuberculosis, установило, что штаммы только алтайского и гиссарского подвидов имели мутацию в гене агаС, которая была связана со вставкой гуанинового нуклеотида в 773 позиции, в то время как штаммы других подвидов и штаммы псевдотуберкулезного микроба имели интакт-ную структуру этого гена. Наличия делеции размером 112 п.н., характерной для

штаммов биовара microtias [Zhou et al., 2002], у изученных штаммов Y. pestis, выделенных на территории РФ и ближнего зарубежья, выявлено не было.

Таким образом, нами впервые установлено, что отсутствие способности утилизировать арабинозу у штаммов алтайского и гиссарского подвидов связано с инсер-цией единичного нуклеотида в гене агаС.

3. Выявление изменений в генах, кодирующих дифференциальные признаки, используемые при делении возбудителя чумы на основной и неосновные подвиды

Штаммы возбудителя чумы неосновных подвидов, также как и штаммы Y. pseudotuberculosis обладают ферментативной активностью в отношении дисахарида -мелибиозы. Способность утилизировать мелибиозу обнаружена и у штаммов Y. pestis биовара microtus [Zhou et al., 2004]. В отличие от них все высоковирулентные штаммы Y. pestis основного подвида не ферментируют мелибиозу. Генетические причины отсутствия у них этой биохимической активности остаются неизвестными.

На основе сравнительного компьютерного анализа геномов штаммов К pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, нами установлено, что мелибиозный оперон возбудителей чумы и псевдотуберкулеза имеет идентичную структуру и представлен тремя генами - melA (YP_1469), melB (YP_1470) и melR (YPJ471) (рисунок 4).

В результате анализа структуры этих генов было установлено, присутствие важной для проявления изучаемого свойства мутации в структурном

4613 п.н.

21S1 п н. 130S П Н 1050 п н

melA melB melR

25 п н 49 п.н.

Рисунок 4. Структура мелибиозного оперона Y. pestis Pestoides F

гене melB, кодирующем транспортный белок MelB - галактозидпермеазу. В нуклео-тидной последовательности этого гена у штаммов основного подвида - С092, KIM, Antiqua и Nepal516 (NCBI GenBank), обнаружена вставка инсерционной последовательности - IS285 после 73 нуклеотида. В отличие от них у штамма К pestis Pestoides F (кавказскиий подвид) и у всех штаммов Y. pseudotuberculosis обнаружена интактная структура гена melB.

На вариабельные области гена те!В была сконструирована пара праймеров, фланкирующая область внедрения 18285, и в ПЦР проведена амплификация фрагмента этого гена. У всех использованных в работе штаммов У. резйэ основного подвида (51 штамм) амплификаты, полученные с помощью этой пары праймеров, имели размер 1648 п.н., что свидетельствовало о внедрении 18285 (1324 п.н.) в последовательность гена те1В у этих штаммов и коррелировало с отсутствием у них ферментативной активности в отношении мелибиозы. В отличие от основного подвида у штаммов неосновных в ПЦР выявляли амплификаты меньшего размера (325 п.н.), что свидетельствовало об интактной структуре гена те1В и соответствовало их способности ферментировать этот дисахарид (рисунок 5).

Таким образом, нами установлено, что причиной отсутствия способности штаммов У. рейШ основного подвида к ферментации мелибиозы является нарушение структуры гена те/5, обусловленное вставкой 18285. Штаммы неосновных подвидов содержат интактный ген те1В.

Для дифференциации штаммов основного подвида возбудителя чумы от штаммов неосновных подвидов и псевдотуберкулезного микроба используется также способность первых к конститутивному синтезу фермента изоцитрат-лиазы.

Рисунок 5. ПЦР-анализ гена melB у штаммов возбудителя: 1 - 3 - кавказский подвид; 4-5 гиссарский подвид; 6 - 7 - алтайский подвид; 8 - улегейский подвид; 9 — 17 — основной подвид; 18 - отрицательный контроль. Слева представлены маркеры молекулярных масс фХ174/HincII.

Показано, что штаммы У. pseudotuberculosis и У. pestis неосновных подвидов, в отличие от штаммов основного подвида, не способны к конститутивному синтезу этого фермента. Однако генетические причины различий в экспрессии этого признака у штаммов основного и неосновных подвидов к настоящему моменту не известны.

По данным проведенного нами анализа геномов возбудителя чумы и псевдотуберкулеза у штаммов, представленных в базе данных NCBI GenBank, установлено, что структура ацетатного оперона у всех штаммов возбудителя чумы идентична и

включает три структурных гена - асеА, асеВ, асеК, которые находятся под негатив- | ной регуляцией гена /с/Л (рисунок 6).

5903 ПН.

843 п.н.

1728 П.н.

1308 П.н.

1599 П.н.

асеК

ш _4

i:i п н

257 n н

47 п н

Рисунок 6. Структура ацетатного оперона у штаммов Y. pestis

Сравнительный компьютерный анализ генов ацетатного оперона показал наличие значимой для фенотипического проявления изучаемого свойства мутации в регу-ляторном гене iclR (843 п.н.). Установлено, что у штаммов Y. pestis С092, KIM, Antiqua, Nepal516 (основного подвида) ген iclR инактивирован вставкой двух нуклеоти-дов (+СС) в позиции 269-270 от начала гена, и его размер составлял у этих штаммов 845 п.н. Выявленная нами инсерция (+СС) в 269-270 позиции гена iclR приводит к преждевременной терминации трансляции полипептидной цепи белка-репрессора IclR, что влечет за собой конститутивную экспрессию генов ацетатного оперона и, как следствие, высокий уровень синтеза изоцитрат-лиазы.

На вариабельную область гена iclR была сконструирована пара праймеров, с помощью которой была изучена структура этого гена у 95 природных штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов и у 10 штаммов возбудителя псевдогуберку- I леза. Было установлено, что нуклеотидные последовательности фрагментов гена iclR ] у всех штаммов Y. pestis кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов , идентичны, составляют 370 п.н. и полностью соответствуют аналогичной последова- | тельности штаммов псевдотуберкулезного микроба, а также штамма Pestoides F (NCBI GenBank), что свидетельствует об интактности секвенированного участка гена iclR и коррелирует с низкой активностью у них фермента изоцитрат-лиазы. Иная картина обнаружена у штаммов основного подвида возбудителя чумы. В гене iclR у них выявлена инсерция - вставка двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269 - 270, которая приводит к сдвигу рамки считывания регуляторного гена iclR и, как следствие, к конститутивному синтезу фермента изоцитрат-лиазы у штаммов Y. pestis основного под-

вида.

4. Установление генетических основ ауксотрофности штаммов Y. pestis кавказского подвида

Как было показано нами выше, все штаммы кавказского подвида нуждаются для своего роста в аминокислотах: аргинине, тирозине, фенилалание и витамине В1 -тиамине. Однако генетические причины ауксотрофности штаммов Y. pestis ssp.caucasica до сих пор не изучались.

На первом этапе нами был проведен компьютерный анализ пути биосинтеза аргинина, тирозина, фенилалана и витамина В1 (тиамина) у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных KEGG Metabolic Pathways, и определены ключевые ферменты биосинтеза этих факторов роста и кодирующие их гены. С помощью алгоритма BLAST, проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов биосинтеза аргинина, тирозина, фенилалана и витамина В1 (тиамина) у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis (NCBI GenBank). По результатам компьютерного анализа значимой для проявления зависимости по аргинину оказалась мутация, обнаруженная нами у штамма Pestoides F в структурном гене N-ацетилглутаматсинтазы - argA, которая представляла собой вставку инсерционной последовательности IS 100 после 196 нуклеотида от начала гена.

В ПЦР-анализе с использованием пары праймеров, фланкирующих внедрение IS 100, было установлено, что размер образуемого фрагмента гена argA у всех использованных в работе штаммов возбудителя чумы основного, алтайского и улегейского подвидов, а также псевдотуберкулеза составлял 215 п.н., что соответствовало интакт-ной структуре гена. Фрагменты гена argA у штаммов Y. pestis кавказского подвида имели большую молекулярную массу (2143 п.н.), обусловленную наличием вставки IS 100, приводящей к инактивации гена.

Анализ генов, участвующих в биосинтезе ароматических аминокислот, показал, что ген aroG (1053 п.н.), кодирующий изофермент ДАГФС-fPhe] (З-дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфат-синтаза), у штамма Pestoides F инактивирован вставкой 10 нуклеотидов (в позиции 820 - 829), приводящей к сдвигу рамки считывания и нарушению синтеза фенилаланина.

При секвенировании фрагмента aroG у 95 природных штаммов основного и неосновных подвидов было установлено, что у штаммов чумного микроба основного, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов этот ген имеет интактную структуру и кодирует функционально активный белок ДАГФС-[РЬе]. В отличие от них у штаммов кавказского подвида Y. pestis в гене aroG обнаружена инсерция 10 п.н. в позиции 820 - 829, приводящая к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры фермента.

Наличие этой мутации у всех штаммов кавказского подвида коррелировало с отсутствием у них способности синтезировать фенилаланин.

Другой структурный ген - агор (1071 п.н.), кодирующий изофермент ДАГФС-[Туг], у штамма Рез1о1с1е5 Б инактивирован внедрением инсерционной последовательности 18700 после 888 нуклеотида от начала гена, что вызывает потерю способности синтезировать тирозин. В ПЦР-анализе у штаммов основного, алтайского, гиссарско-го и улегейского подвидов образовывались амплификаты гена агор размером 563 п.н., что соответсвовало интактной структуре гена У штаммов кавказского подвида специфический амплификат гена агор в ПЦР не образовывался, что свидетельствовало об утрате его фрагмента после внедрения инсерционной последовательности \S100 и коррелировало с ауксотрофностью по тирозину

Структурный анализ генов метаболического пути биосинтеза витамина В1 (тиамина) показал наличие значимых мутации в генах, кодирующих фермент тиазол-синтазу - Мй и МН, которые инактивированы у штамма РеэШИез Б делецией 13 п.н. в позиции 384 - 396 и инсерцией тиминового нуклеотида (+Т) в позиции 552.

Проведенное нами секвенирование фрагментов 1ИЮ и МН у природных штаммов К рея№ выявило интактную структуру этих генов у штаммов основного, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов, что коррелировало с их способностью синтезировать витамин В1. В отличие от других подвидов у штаммов кавказского подвида обнаружена инсерция тиминового нуклеотида в 552 позиции гена МН и деления 13 п.н. в позиции 384 - 396 гена МО, что совпадало с отсутствием у них способности синтезировать тиамин.

Таким образом, нами впервые определены генетические основы ауксотрофно-сти штаммов К резНя кавказского подвида. Установлено, что ауксотрофность по аргинину обусловлена внедрением IЪЮО в ген а^А, по фенилаланину - вставкой 10 нуклеотидов в агоО , по тирозину - инсерцией 18700 в агор, по витамину В! - делецией в 13 п.н в Мй и инсерцией тиминового нуклеотида в МН. Такие мутации не встречаются у штаммов К рел/и других подвидов (основного, алтайского, гиссарского и улегейского) и поэтому могут быть использованы как характерные генетические метки кавказских штаммов.

5. Оценка перспективности использования полученных данных для создания генетической схемы внутривидовой классификации возбудителя чумы

В результате выполненных исследований нами были установлены генетические основы различной экспрессии биохимических признаков, используемых при делении штаммов У. на подвиды и биовары. Выявленная в ходе выполнения этой

работы вариабельность генов пар A, ssuA, araC, melB, iclR, argA, aroH, aroF, thiH и thiG, наряду с ранее установленной вариабельностью гена glpD [Parhill et al., 2001; Motin et al., 2002], а также вариабельностью регуляторного гена rhaS рамнозного опе-рона [Куклева с соавт., 2008] может быть положена в основу генетической схемы классификации штаммов возбудителя чумы на биовары и подвиды. На основе сравнительного анализа последовательностей этих генов нами определены характерные генетические особенности основного (античный, средневековый, восточный биовары) и неосновных подвидов Y. pestis (таблица). Вариабельность нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих дифференциальные биохимические признаки, а также биосинтез различных факторов роста была использована нами для определения эволюционных связей штаммов У. pestis и построения филогенетических деревьев с помощью компьютерных программ Mega 4.0, PHYLIP, SplitsTree 4 с помощью дистанционно-матричных методов: UPGMA, взвешенных средних квадратов Фитча-Маргулиса, Kitch, Neighbor-Joining.

Таблица. Генетические особенности штаммов У. рей/у основного и неосновных подвидов из природных очагов РФ и ближнего зарубежья.

Ген, ^\позиция Подвид, Биовар пар А, 613 агаС, 773 glpD, делеция 19-111 iclR, вставка 269 - 270 melB инсерция IS2S5 после 1231 ssuA, 302

Основной п/в

античный б/в G Т - + + С

средневековый б\в Т Т - + С

Кавказский п/в G Т - - - с

Алтайский п/в G G - - - т

Гиссарский п/в G G - - - т

Улегейский п/в G Т - - - с

Как следует из рисунка 7, применение выбранных ДНК-мишеней позволяет в полной мере проводить дифференциацию штаммов возбудителей чумы и псевдотуберкулеза, а также внутривидовое деление штаммов У рез№ не только на биовары и на основной и неосновные подвиды, но и на отдельные подвиды этого возбудителя.

Анализ филогенетических данных подтверждает высказанное ранее предположение о том, что наиболее древней ветвью эволюции чумного микроба являются штаммы кавказского подвида, обладающего наибольшим генетическим сходством с предшественником - псевдотуберкулезным микробом (рисунок 8).

Другие неосновные подвиды - алтайский, гиссарский и улегейский филогенетически близки друг другу и составляют еще одну древнюю ветвь эволюции У. рез^.

Полученные нами данные указывают на то, что штаммы microtus, которые недавно китайские исследователи [Zhou et al., 2004] предложили выделить в отдельный био-вар, принадлежат к группе штаммов алтайского и гиссарского подвидов и являются их разновидностью.

После отделения от общего ствола кавказского подвида, а затем группы уле-гейско-алтайско-гиссарского подвидов дальнейшая эволюция вида Y. pestis сопровождалась накоплением мутаций в генах жизнеобеспечения (связанным с усилением паразитизма, патогенности и вирулентности возбудителя) и привела к формированию трех биоваров основного подвида: античного, средневекового и восточного.

Рисунок 7. Дендрограммы (программа Mega 4,0, методы: А - UPGMA и Б -Neighbor Joining) штаммов Y. pestis основного (античного, средневекового, восточного биоваров) и неосновных (кавказского, алтайского, гиссарского, улегейского) подвидов, а также штаммов У. pseudotuberculosis.

Рисунок 8. Схема внутривидовой эволюции Y. pestis

Проведенные в этой работы исследования составляют основу для разработки молекулярной систематики возбудителя чумы, целью которого является создание полной внутривидовой таксономии Y. pestis на основе вариабельности генов дифференциально-значимых микробиологических и биохимических признаков чумного микроба.

ВЫВОДЫ

1. На основании проведенного комплексного анализа биохимических и генетических свойств природных штаммов pestis из различных природных очагов чумы установлено, что штаммы основного подвида, циркулирующие на территории РФ и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам.

2. Причиной отсутствия экспрессии дифференциального биохимического признака - редукции нитратов у штаммов Y. pestis основного подвида, выделенных в природных очагах чумы в России и ближнего зарубежья, является наличие мутации -замены единичного нуклеотида в гене парА периплазматической нитратредуктазы, а у штаммов алтайского и гиссарского подвидов - инсерции единичного нуклеотида в гене ssuA периплазматического транспортного белка.

3. Впервые установлены генетические основы различной экспрессии признаков ферментации мелибиозы и продукции изоцитрат-лиазы у штаммов основного и неосновных подвидов чумного микроба. Показано, что отсутствие способности штаммов основного подвида ферментировать дисахарид мелибиозу обусловлено инсерцией IS285 в последовательность структурного гена melB, кодирующего галактозидпер-меазу. Установлено, что конститутивный синтез изоцитрат-лиазы, характерный для основного подвида чумного микроба, обусловлен вставкой двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269 - 270 гена -репрессора iclR.

4. Причиной арабинозонегативности штаммов Y. pestis алтайского и гиссарского подвидов является мутация в регуляторном гене арабинозного оперона - агаС, которая вызвана вставкой единичного гуанинового нуклеотида в 773 позиции этого гена.

5. Впервые определены генетические основы ауксотрофности штаммов Y. pestis кавказского подвида. Установлено, что ауксотрофность по аргинину обусловлена внедрением IS100 в ген argA, по фенилаланину - вставкой 10 р.н. в aroG, по тирозину - инсерцией IS100 в aro F, по витамину Bt - делецией 13 п.н в thiG и инсерцией тимина в thiH.

6. Определены характерные генотипы основного (античного, средневекового, восточного биоваров) и неосновных подвидов возбудителя чумы, использование которых позволяет проводить внутривидовую дифференциацию Y pestis. Показана перспективность использования полученных результатов для создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов Y. pestis.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Куклев В.Е., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Одинокое Г.Н., Кутырев В.В. Сравнение полной нуклеотидной последовательности гена rhaS у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов // Проблемы особо опасных инф. - 2008. - Вып. 3 (97). - С. 38 - 42.

2. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Видяева H.A., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Структурно-функциональный анализ генов пар оперона у Yersinia pestis разных подвидов // Проблемы особо опасных инф. - 2008. - Вып. 4 (98). - С. 12 - 16.

3. Ерошенко Г.А., Куклева Л.М., Видяева H.A., Одиноков Г.Н., Шавина Н.Ю., Кутырев В.В. Генетические особенности неосновных подвидов возбудителя чумы // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств - участников содружества независимых государств. Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С. 71 - 73.

4. Ерошенко Г.А., Видяева H.A., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Краснов Я.М., Гусева Н.М., Кутырев В.В. Структурно-функциональный анализ гена агаС у штаммов Yersinia pestis различного происхождения // Молекул, генетика, микробиол. и виру-сол. - 2009. - №3. - С. 36 - 40.

5. Куклева Л.М., Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Кутырев В.В. Дифференциация штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов на основе вариабельности генов rhaS и агаС // Сборник материалов VI Международной конференции «Молекулярная диагностика и биобезопасность». М., 2009. - С. 124.

6. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Шавина Н.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Вариабельные локусы генов пар A, aspA, rhaS, zwf и tcaB как эффективные ДНК-мишени для генотипирования штаммов Yersinia pestis II Проблемы особо опасных инф. - 2010. - Вып. 2 (104). - С. 57 - 59.

7. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А. Генетические особенности биохимической дифференциации штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов // Мат. науч.- практ. шк.- конф. молодых ученых и специалистов Фед. службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», 25 - 27 мая 2010 г., С. 289 - 291.

"О

Подписано к печати 11.10.2010 Формат 60 х 84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Одиноков, Георгий Николаевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления об организации генома 15 возбудителя чумы

1.2. Схемы внутривидовой классификации Yersinia pestis 28 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы бактерий, использованные в работе, и условия 36 их культивирования

2.2. Методы исследования денитрифицирующей активности, 46 ферментации глицерина, арабинозы, рамнозы, мелибиозы, продукции изоцитралиазы у штаммов Y. pestis

2.3. Определение питательных потребностей штаммов Y. pestis

2.4. Выделение бактериальной ДНК

2.5. Проведение полимеразной цепной реакции

2.6. Электрофоретический учет результатов

2.7. Определение нуклеотидных последовательностей генов

2.8. Проведение филогенетического анализа

ГЛАВА 3. АНАЛИЗ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИ- 51 ЧЕСКИХ СВОЙСТВ ШТАММОВ Y. pestis ОСНОВНОГО И НЕОСНОВНЫХ ПОДВИДОВ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ПРИРОДНЫХ

ОЧАГОВ ЧУМЫ

3.1. Характеристика штаммов Y. pestis из различных природных Оча- 51 гов чумы по биохимическим признакам, лежащим в основе деления на подвиды и биовары

3.2. Определение питательных потребностей штаммов К резНБ кавказ- 56 ского подвида

ГЛАВА 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ 60 ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БИОВАРОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

4.1. Определение структурно-функциональной организации генов пар 60 оперона и других генов кодирующих редукцию нитратов

4.2. Сравнительный анализ вариабельности нуклеотидных 71 последовательностей генов арабинозного оперона у штаммов К реяШ

ГЛАВА 5. ВЫЯВЛЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ В ГЕНАХ КОДИРУЮЩИХ 83 ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ДЕЛЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ НА ОСНОВНОЙ И НЕОСНОВНЫЕ ПОДВИДЫ

5.1. Выявление изменений в структуре генов, у штаммов возбудителя 83 чумы основного и неосновных подвидов, кодирующих ферментацию мелибиозы

5.2 Определение мутаций в генах биосинтеза изоцитрат-лиазы у штаммов У. реяШ

ГЛАВА 6. УСТАНОВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ АУКСОТ- 99 РОФНОСТИ ШТАММОВ К рехГм КАВКАЗСКОГО ПОДВИДА

6.1. Сравнительный компьютерный анализ вариабельности нуклео- 100 тидных последовательностей генов, участвующих в биосинтезе аргинина

6.2. Выявление мутаций в генах биосинтеза фенилаланина, тирозина и 101 витамина В1 (тиамина)

6.3. Исследование структурно-функционального состояния генов био- 103 синтеза аргинина, фенилаланина, тирозина и витамина В1 (тиамина) у штаммов кавказского подвида

ГЛАВА 7. ОЦЕНКА ПЕРСПЕКТИВНОСТИ ПОЛУЧЕННЫХ ДАН- 113 НЫХ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ВНУТРИВИДОВОЙ КЛАССИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов"

Актуальность проблемы

Чума - зоонозная природно-очаговая особо опасная карантинная бактериальная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя [Черкасский, 1996]. Чума представляет реальную угрозу для населения из-за существования многочисленных природных очагов чумы, 42 из которых расположены в Российской Федерации и ближнем зарубежье [Они-щенко и др., 2004]. Существует опасность заноса возбудителя чумы на территорию России из соседних, неблагополучных по этому заболеванию стран, а также в результате биотеррористических актов. По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется более 2000 случаев заболевания чумой, многие из которых заканчиваются летальным исходом. Большая вспышка легочной чумы в 2009 г. произошла в Хайнань-Тибетском автономном округе Китая, в которой тоже был зарегистрирован ряд смертельных случаев [WHO / plague sheets, 2009]. Все эти факты настоятельно требуют разразботки новых, основанных на современных технологиях высокоэффективных методов диагностики возбудителя чумы, средств профилактики и лечения, вызываемой им особо опасной болезни.

Использованные до настоящего времени классификации Yersenia pestis учитывали лишь морфологические, культуральные, биохимические и другие фенотипические свойства, а также различия в вирулентности штаммов возбудителя [Безсонова, 1928; Берлин A.JL и др., 1938; Туманский, 1959; Тимофеева, 1972; Кутырев с соавт., 1998; Devignat, 1951; Dale et al., 2002; Cobbs et al., 2004; Dennis et al, 2004; Lazarus et al., 2004]. Такие классификации, безусловно, внесли свой вклад в систематизацию Y. pestis и в целом отражают реально существующие филогенетические связи внутри этого вида. Они не утратили-своего значения и по сей день и по-прежнему широко используются, в практи- ' ческой микробиологии. Однако достигнутые в последнее время успехи в фундаментальной генетике и молекулярной микробиологии позволяют перевести решение задач по систематизации возбудителя чумы на качественно новый уровень, основанный на использовании его молекулярно-генетических особенностей [1л е1 а1., 2009; ЫпсИег е! а1., 2009]. Перевод существующей классификации возбудителя чумы на генетическую основу позволит повысить надежность, достоверность и качество систематизации, а также избежать присущих классическим схемам недостатков, обусловленных изменчивостью фе-нотипических свойств возбудителя. Геном бактерий имеет достаточно консервативную структуру, защищенную от случайных изменений системами репарации ДНК, и поэтому схемы генетической дифференциации являются более надежными, воспроизводимыми и обладают большей разрешающей способностью по сравнению с используемыми фенотипическими классификациями.

В соответствии с принятой в настоящее время отечественной классификацией штаммы возбудителя чумы делят на основной и 4 неосновных (кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский) подвида [Кутырев и др., 1998]. Согласно распространенной зарубежной классификации штаммы 7. реяйБ на основании различий по ряду биохимических свойств (способность к ферментации глицерина, редукции нитратов, окислению аммиака) и по историко-географическому принципу [Devignat, 1951], делят на три биовара: апйяиа (античный), тесНеуаНз (средневековый) и опеп1аНз (восточный). По феноти-пическим характеристикам штаммы основного подвида соответствуют трем биоварам (античному, средневековому и восточному), принятым в зарубежной классификации. Однако штаммы возбудителя чумы, циркулирующие в природных очагах чумы, в. Российской Федерации и ближнем зарубежье, остаются не систематизированными по биоварной принадлежности.

По экспрессии дифференциально-значимых биохимических признаков наиболее активными являются штаммы античного биовара. Они ферментируют глицерин и обладают денитрифицирующей активностью. Штаммы средневекового биовара У. реяйз не способны редуцировать нитраты, но ферментируют глицерин и арабинозу. Штаммы восточного биовара не ферментируют глицерин, но активно редуцируют нитраты и утилизируют арабинозу.

Генетические причины различной экспрессии биохимических признаков, используемых при делении штаммов Y. pestis на биовары, остаются к настоящему моменту изученными недостаточно. В литературе имеется ограниченное число публикаций по этому вопросу. Достоверно установлено лишь то, что причиной отсутствия ферментации глицерина у штаммов восточного биовара является мутация в гене глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (glpD). Показано, что в этом гене у всех штаммов восточного биовара присутствует делеция размером 93 п.н. [Parhill et al., 2001; Motin et al., 2002]. В отношении изменений в генах, детерминирующих другие биохимические особенности, используемые при дифференциации биоваров, имеются противоречивые данные [Motin et al., 1998; Richardson et al., 2001; Deng et al., 2002; Zhou et al., 2004].

В основе деления Y. pestis на подвиды в соответствии с классификацией, принятой в 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба, лежит неодинаковая биохимическая активность штаммов, их различия в вирулентности по отношению к лабораторным животным и разная ландшафт-но-географическая приуроченность [Кутырев, Проценко, 1998; Anisimov et al., 2004]. Штаммы основного подвида, как правило, высоко вирулентны и имеют высокую эпидемическую значимость. Они не ферментируют рамнозу и мели-биозу, не чувствительны к пестицину I, имеют высокий уровень продукции изоцитралиазы. Штаммы неосновных подвидов, ферментируют рамнозу и ме-либиозу, чувствительны к пестицину I, не проявляют изоцитрат-лиазной активности, избирательно вирулентны для лаборторных животных, эпидемически малозначимы.

Генетические основы различной биохимической активности штаммов, возбудителя чумы разных подвидов практически не исследованы. За рубежом этот вопрос мало изучен в связи с отсутствием в зарубежных коллекциях штаммов неосновных подвидов, которые распространены, в основном, в природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья. В отечественной литературе имеются лишь единичные работы по определению различий в структуре генов, У. резИя основного и неосновных подвидов; кодирующих редукцию нитратов и ферментацию рамнозы [Ерошенко и др., 2008; Куклева и др., 2008, 2009]. Штаммы возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, циркулирующие в России и ближнем зарубежье, остаются не изученными по структуре генов, участвующих в редукции нитратов, ферментации глицерина, арабинозы, мелибиозы, изоцитрат-лиазы и других важных для классификации признаков. Не установлена причина гетерогенности штаммов чумного микроба по питательным потребностям. Штаммы из различных природных очагов чумы имеют различные питательные потребности, определяемые нарушениями генов промежуточного метаболизма, что может быть использовано в генетической схеме дифференциации штаммов ¥. реяйз из различных природных очагов чумы.

Выявление изменений в структуре генов, лежащих в основе различной экспрессии микробиологических и биохимических признаков, послужит надежной основой для создания генетической схемы классификации штаммов возбудителя чумы, а также для определения основных направлений внутривидовой эволюции У. рехНя.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать использованные в работе штаммы Г. резИз, выделенные в природных очагах чумы в Российской Федерации и ближнего зарубежья, по биохимическим свойствам (редукция нитратов, продукция изо-цитрат-лиазы, ферментация арабинозы и мелибиозы), лежащим в основе деления на подвиды и биовары. Установить принадлежность штаммов, циркулирующих на территории России и сопредельных стран, к определенным био-варам.

2. Изучить структурно-функциональную организацию генов, кодирующих дифференциальные признаки, используемые при делении^ на биова-ры, - редукцию нитратов и ферментацию арабинозы.

3. Выявить изменения в генах У. реБйБ, детерминирующих ферментацию мелибиозы и продукцию изоцитрат-лиазы, лежащих в основе дифференциации основного и неосновных подвидов возбудителя чумы.

4. Определить питательные потребности штаммов У. реяНз кавказского подвида и установить генетические основы их ауксотрофности.

5. Оценить перспективность использования полученных результатов для создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов У. реяШ и установления основных направлений внутривидовой эволюции этого возбудителя.

Научная новизна работы. На основании данных комплексного микробиологического, биохимического и генетического анализа установлено, что штаммы возбудителя чумы, циркулирующие в природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам.

Впервые показано, что причиной отсутствия нитратредуцирующей активности у части штаммов основного подвида, циркулирующих на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья, является наличие замены единичного нуклеотида О на Т в позиции 613 гена периплазматической нит-ратредуктазы - пар А, что доказывает принадлежность этих штаммов к средневековому биовару. Отсутствие экспрессии этого признака у штаммов алтайского и гиссарского подвидов вызвано вставкой тиминового нуклеотида (+Т) в 302 позиции другого гена — гена которая приводит к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры кодируемого транспортного белка -8 эй А, также участвующего в восстановлении нитратов.

Впервые установлено, что отсутствие ферментации арабинозы у штаммов У. резИя алтайского и гиссарского подвидов связано с наличием мутации в регуляторном гене, арабинозного оперона — агаС, который' содержит инсер-цию гуанинового нуклеотида (+в) в позиции 773 от начала гена, приводящую к сдвигу рамки считывания и нарушению структуры регуляторного белка АгаС, необходимого для инициации транскрипции генов арабинозного оперона.

Впервые установлена генетическая основа различной продукции изо-цитрат-лиазы у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, связная с наличием вставки двух нуклеотидов (+СС) в регуляторном гене ШК. в позиции 269-270, которая приводит к инактивации кодируемого им бел-ка-репрессора ацетатного оперона 1с1Я и является причиной конститутивного синтеза фермента изоцитрат-лиазы у штаммов основного подвида. Штаммы неосновных подвидов содержат интактный ген юШ и не способны к конститутивному синтезу изоцитралиазы.

Показано, что отсутствие ферментации мелибиозы у штаммов 7. резНз основного подвида обусловлено внедрением инсерционной последовательности 18255 в генте1В, кодирующий фермент галактозидпермеазу. У штаммов неосновных подвидов вставка 1Б255 в гене те1В отсутствует.

Впервые выявлены генетические основы ауксотрофности штаммов кавказского подвида, которые связаны с внедрением инсерционных последовательностей 1$>100 в гены а^А и агор, вставкой 10 п.н. в ген агоО, инсерцией тиминового нуклеотида в ген й/Яи делецией 13 п.н. в гене гкЮ.

Полученная молекулярная, характеристика штаммов У. реяШ основного и неосновных подвидов по генам, кодирующим биохимические признаки, лежащие в основе деления на подвиды и биовары, создает основу для разработки генетической схемы внутривидовой классификации возбудителя чумы.

По результатам работы оформлены заявки на изобретение «Способ определения подвидовой- принадлежности штаммов возбудителя'чумы, методом секвенирования» (№ 2009116913. Приоритет от 14.05.2009. Получено положительное решение о выдаче патента) и «Способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного сиквенс — типирования (№ 2009146094. Приоритет от 11.12.2009).

Практическая значимость работы. По результатам работы оформлены и утверждены методические рекомендации «Определение подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы на основе секвенирования генов rhaS и агаС, контролирующих ферментацию рамнозы и арабинозы» (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Протокол № 6 от 16 июня 2009) и «Определение подвидовой принадлежности штаммов Yersinia pestis методом мультилокусмного сиквенс — типирования (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб». Протокол № 1 от 23 февраля 2010).

В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы три штамма: Y. pestis КМ 910 алтайского, КМ 596 гиссарского и КМ 1861 улегей-ского подвидов в качестве референс-штаммов этих подвидов.

Полученные в ходе выполнения исследования данные по генетической организации штаммов Y. pestis используются при чтении лекций по предмету «Генетика возбудителя чумы» на курсах специализации по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб» и курсах повышения квалификации по программе усовершенствования врачей по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы возбудителя чумы основного подвида, циркулирующие в природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам, о чем свидетельствуют данные комплексного анализа микробиологических, биохимических и генетических свойств этих штаммов.

2. В основе разного проявления, биохимических признаков, используемых при делении штаммов Y. pestis на подвиды и биовары, лежат различные типы мутаций в генах, кодирующих эти признаки. Отсутствие способности к редукции нитратов у штаммов основного подвида средневекового биовара связано с наличием нонсенс-мутации (G Т) в гене парА периплазматической нитратредуктазы, а у штаммов алтайского и гиссарского подвидов — с инсерцией единичного нуклеотида в ген ssuA транспортного периплазмати-* ческого белка SsuA. Отсутствие ферментации арабинозы у штаммов алтайского и гиссарского подвидов обусловлено вставкой гуанинового нуклеотида в последовательность гена агаС.

3. Разная биохимическая активность штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы по ряду дифференциальных признаков вызвана редукцией кодирующих их генов у основного подвида и их интактно-стью у неосновных подвидов. Отсутствие ферментации мелибиозы штаммами основного подвида обусловлено внедрением IS2S5 в ген melB галактозидпер-меазы, а конститутивный синтез изоцитрат-лиазы у штаммов этого подвида — вставкой двух нуклеотидов (СС) в последовательность регуляторного гена iclR. Штаммы неосновных подвидов содержат интактные гены melB и iclR.

4. Причиной множественных питательных потребностей штаммов Y. pestis кавказского подвида является инактивация у них ряда генов биосинтеза аминокислот и витаминов. Зависимость штаммов этого подвида по аргинину вызвана инсерцией 100 в ген argA, по фенилаланину — вставкой 10 п.н. в ген aroG, по тирозину - внедрением IS100 в ген aroF, по тиамину (В]) делецией 13 п.н. - в ген thiG и инсерцией единичного нуклеотида в thiH. На основе всего комплекса выявленных мутаций для штаммов кавказского и других подвидов, а также биоваров возбудителя чумы определены характерные генотипы, которые могут быть использованы при создании генетической схемы-, внутривидовой классификации Y. pestis.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств — участников содружества независимых государств», Волгоград, 2008; VI Международной конференции «Молекулярная диагностика и биобезопасность», М., 2009; научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», 25 — 27 мая 2010 г.; на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов 2008 - 2010 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 4 в периодических изданиях из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России.». Оформлено два патента на изобретения «Способ подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом секвенирования» (№ 2009116913. Приоритет от 14.05.2009. Получено положительное решение о выдаче патента) и «Способ подвидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis методом мультилокусного-сиквенс типирования» (№ 2009146094. Приоритет от 11.12.2009).

Структура и объём диссертации. Диссертация представлена на 156 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 34 рисунками. Библиографический указатель содержит 203 отечественных и зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Одиноков, Георгий Николаевич

выводы

1. На основании проведенного комплексного анализа биохимических и генетических свойств природных штаммов У pestis из различных природных очагов чумы установлено, что штаммы основного подвида, циркулирующие на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья, относятся к античному и средневековому биоварам.

2. Причиной отсутствия экспрессии дифференциального биохимического признака - редукции нитратов у штаммов Y. pestis основного подвида, выделенных в природных очагах чумы в России и ближнего зарубежья, является наличие мутации - замены единичного нуклеотида в гене парА периплазма-тической нитратредуктазы, а у штаммов алтайского и гиссарского подвидов — инсерции единичного нуклеотида в гене ssuA периплазматического транспортного белка.

3. Впервые установлены генетические основы различной экспрессии признаков ферментации мелибиозы и продукции изоцитрат-лиазы у штаммов основного и неосновных подвидов чумного микроба. Показано, что отсутствие способности штаммов основного подвида ферментировать дисахарид мели-биозу обусловлено инсерцией IS2&5 в последовательность структурного гена melB, кодирующего галактозидпермеазу. Установлено, что конститутивный синтез изоцитрат-лиазы, характерный для основного подвида чумного микро1 ба, обусловлен вставкой двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269 — 270 гена -репрессора iclR.

4. Причиной арабинозонегативности штаммов У pestis алтайского и гиссарского подвидов является мутация в регуляторном гене арабинозного оперона - агаС, которая вызвана вставкой единичного гуанинового нуклеотида в 773 позиции этого гена.

5. Впервые определены генетические основы ауксотрофности штаммов У. pestis кавказского подвида. Установлено, что ауксотрофность по аргинину обусловлена внедрением IS 100 в ген argA, по фенилаланину — вставкой 10 р.н. в aroG , по тирозину - инсерцией IS 100 в aro F , по витамину Bi - делецией 13 п.н в thiG и инсерцией тимина в thiH.

6. Определены характерные генотипы основного (античного, средневекового, восточного биоваров) и неосновных подвидов возбудителя чумы, использование которых позволяет проводить внутривидовую дифференциацию Y. pestis. Показана перспективность использования полученных результатов для создания генетической схемы внутривидовой классификации штаммов Y. pestis.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На протяжении более чем столетней истории изучения возбудителя чумы после его открытия в 1894 г. А. Иерсеном и С. Китазато неоднократно предлагались разнообразные схемы классификации Y. pestis, которые были основаны на различном проявлении микробиологических, биохимических и других фенотипических свойств. Предложенные классификации, безусловно, соответствовали тому уровню знаний и методических подходов, которыми располагали исследователи. Так в 1928 г. A.A. Безсоновой все штаммы Y.pestis были разделены по способности ферментировать глицерин на две группы: глицеринонегативные и глицеринопозитивные. В 1938 г А.Л. Берлин и А.К. Борзенков разделили штаммы возбудителя чумы на океаническую и континентальную расы. R. Devignat в 1951 на основании ряда биохимических свойств (различной способности к денитрификации и ферментации глицерина) и особенностей ландшафтно-географического происхождения предложил деление штаммов Y. pestis на три группы, которые в настоящее обозначают как биовары чумного микроба: античный, средневековый и восточный. В 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба была принята единая систематическая схема подвидовых категорий для возбудителя чумы, основанная на фенотипических свойствах, вирулентности по отношению к лабораторным животным, ареале распространения. Штаммы чумного микроба, циркулирующие на территории стран СНГ и Монголии, были разделены на пять подвидов: основной, кавказский, алтайский, гиссарский, улегей-ский (Тимофеева 1972; Кутырев, Проценко, 1985).

Все предложенные схемы были, безусловно, полезны для исследователей и внесли свой вклад в систематизацию Y. pestis, а многие из них (деление на подвиды и биовары) широко используются и в настоящее время. Однако бурное развитие современных технологий молекулярной биологии, секвени-рование полных геномов патогенных иерсиний позволяет решать задачу по усовершенствованию внутривидовой классификации возбудителя чумы на современном молекулярно-генетическом уровне, основанном на сравнительной геномике штаммов возбудителя чумы. Перевод существующих дифференциальных схем классификации этого возбудителя на генетический уровень повысит их разрешающую способность, эффективность и надежность, а также улучшит качество систематизации видов Y. pestis.

Генетические основы различной биохимической активности штаммов возбудителя чумы разных подвидов остаются практически не исследованными. Определены лишь отдельные генетические дефекты в генах, используемых для внутривидового деления Y. pestis. Так, показано, что у штаммов основного подвида средневекового биовара отсутствие способности редуцировать нитраты связано с наличием мутации в структурном гене пар Л пери-плазматической нитратредуктазы, необходимой для проявления этого свойства, а неспособность штаммов восточного биовара (глицериннегатиные штаммы или океаническая раса) к ферментации глицерина собусловлена делецией в гене glpD глицерол-3-фосфатдегидрогеназы [Parhill et al., 2001; deng et al., 2002; Motin et al., 2002; Zhou et al., 2004]. Получены данные о том, что причиной рамнозонегативности всех изученных штаммов основного подвида является наличие несинонимической замены единичного нуклеотида в регулятор-ном гене rhaS рамнозного оперона [Куклева и др., 2008; 2009]. В отношении других генов, детерминирующих значимые биохимические признаки, имеется либо достаточно противоречивая информация [Brubaker et al., 1972; Wren, 2003; Brubaker, 2004], либо данные просто отсутствуют. Практически не исследованы по генам дифференциально-значимых биохимических признаков штаммы Y. pestis основного и неосновных подвидов, персистирующие в природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья. Изучение генетической организации штаммов различных подвидов, находящихся на разных ступенях эволюции Y. pestis, представляет важную задачу, поскольку позволит определить те эволюционные преобразования генома возбудителя, которые привели к становлению высоковирулентной бактерии Y. pestis.

Для установления генетических основ различной экспрессии биохимических признаков, используемых при делении штаммов возбудителя чумы на подвиды и биовары, нами были использованы как традиционные микробиологические и биохимические методы, так и современные методы молекулярной биологии — полимеразная цепная реакция, секвенирование, а таюке методы биоинформатики. Были применены ресурсы сети Интернет - базы данных NGBI GenBank, KEGG Metabolic Pathways, PF AM, Modeller и использованы компьютерные программы: Mega 4.0 и PHYLIP с дистанционно-матричными методами.

Для установления генетических основ различной экспрессии биохимических признаков, используемых для деления штаммов возбудителя чумы на подвиды и биовары, использовали общий алгоритм проведения анализа. На первом этапе изучали экспрессию исследуемого микробиологического или биохимического признака у природных штаммов Y. pestis. Была изучена экспрессия дифференциально-значимых признаков (редукции нитратов, ферментации арабинозы, мелибиозы, продукции изоцитрат-лиазы) у большого количества (около ста) штаммов Y. pestis из различных природных очагов чумы.

Одновременно с помощью компьютерного анализа штаммов Y. pestis KIM (средневековый биовар), С092 (восточный биовар), Antiqua, Angola, Ne-ра1516 (античный биовар), 91001 (биовар microtus), Pestoides F (кавказский подвид) и Y. pseudotuberculosis РВ1/+, IP32953, IP31758, YPIII, полные нук-леотиды геномов которых представлены в базе данных NCBI GenBank выявляли вариабельные участки генов, продукты которых в соответствии с базами данных KEGG Metabolic Pathways и PF AM принимают участие в экспрессии данного признака. На вариабельные участки генов, которые предположительно являлись причиной отсутствия фенотипического проявления признака, конструировали праймеры, с помощью которых амплифицировали в ПЦР вариабельные фрагменты генов у различных природных штаммов, возбудителя чумы. На основе сравнения нуклеотидных последовательностей генов у штаммов, отличающихся по экспрессии изучаемого признака, выявляли мутации, которые послужили причиной отсутствия этого признака.

С использованием этого алгоритма нами проведено изучение структурно-функциональной организации генов, продукты' которых принимают участие в проявлении дифференциальных признаков, лежащих в основе деления« штаммов Y. pestis на биовары, — редукции нитратов и ферментации арабино-зы. Выполнен сравнительный компьютерный анализ генов пар оперона, а также генов пагР и ssuA — регуляторного (NarP) и транспорного (SsuA) белков, участвующих в восстановлении нитратов, у штаммов, представленных в базе данных NCBI GenBank, а также у большого количества (около ста) природных штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов, выделенных в различных природных очагах чумы в Российской Федерации, ближнем и дальнем зарубежье.

Установлено, что причиной отсутствия денитрифицирующей способности у части штаммов основного подвида является наличие единичной нуклео-тидной замены G на Т в 613 позиции гена пар А, кодирующего белок - пери-плазматическую нитратредуктазу. Причина неспособности восстанавливать нитраты штаммами алтайского и гиссарского подвидов иная и связана с наличием мутации в гене транспортного белка — ssuA, который у этих штаммов в позиции 302 содержит инсерцию единичного нуклеотида (+Т). Полученные данные, наряду с биохимическими характеристиками штаммов (способности к редукции нитратов, ферментации арабинозы и глицерина), позволили сделать вывод о том, что на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья циркулируют штаммы античного и средневекового биоваров, в то время как штаммы восточного биовара выявляются только среди штаммов из дальнего зарубежья.

По-видимому, причиной отсутствия нитратредуцирующей активности • у штаммов биовара microtus является-та же мутация, что и у штаммов алтайского и гиссарского подвида — инсерция единичного нуклеотида в гене ssu. Нами установлено, что мутация в гене парА - вставка единичного в позиции 1021 гена пар А не может быть причиной отсутствия экспрессии признака у штаммов microtus [как это предположено D. Zhou et al., 2004], поскольку она выявлена нами и у штаммов кавказского подвида, а также у штаммов 7 pseudotuberculosis, которые редуцируют нитраты. "

Впервые у большого количества природных штаммов, возбудителя чумы проведен структурно-функциональный анализ генов арабинозного оперо-на, и определена полная нуклеотидная последовательность регуляторного гена агаС, участвующего в регуляции экспрессии ферментации арабинозы. Установлено, что причиной отсутствия этого признака у алтайского и гиссарско-го подвидов является наличие вставки единичного нуклеотида в гене агаС в позиции 773 от начала гена. Штаммы основного, кавказского и улегейского подвидов не содержат такой мутации, что коррелирует с их способностью ферментировать арабинозу.

Проведено исследование структуры генов, кодирующих ферментацию мелибиозы и продукции изоцитрат-лиазы, которые используются при делении штаммов Y. pestis на основной и неосновные подвиды. Ранее генетическая детерминированность различного проявления этих свойств у штаммов основного и неосновных подвидов не исследовалась. Данные по этому вопросу в литературе отсутствуют.

Проведенный сравнительный компьютерный анализ нуклеотидной последовательности генов ферментации мелибиозы (melA, melB и melR) у штаммов Y. pestis и 7. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, показал наличие в гене melB (1232 п.н.), детерминирующем синтез галактозидпермеазы, вставки инсерционной последовательности IS2&5 (1322 п.н.) после 73 п.н. у штаммов возбудителя4 чумы С092, KIM, Antiqua, Nepal516. У других штаммов 7 pestis Angola, 91001, Pestoides F и у всех штаммов 7 pseudotuberculosis обнаружена интактная структура гена melB. В ПЦР анализе с помощью рассчитанных праймеров, фланкирующих область внедрения IS2SJ, у большого количества природных штаммов возбудителя чумы получены специфические фрагменты гена melB. У изученных штаммов 7 pestis неосновных подвидов - кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского, в ПЦР образовывались амплификаты размером 325 п.н., что соответствовало интактной структуре гена melB. В отличие от них у штаммов основного подвида фрагменты имели больший размер 1648 п.н., что свидетельствовало о внедрении инсерционной последовательности в этот ген и коррелировало с отсутствием у них ферментативной активности в отношении ме-либиозы. Таким образом, нами впервые установлена генетическая причина; различной экспрессии дифференциального признака — ферментации мели-биозы у штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, которая связана с нарушением структуры гена melB у штаммов основного подвида за счет внедрения инсерционной последовательности IS2&5.

Для дифференциации штаммов Y. pestis основного подвида от неосновных и возбудителя псевдотуберкулеза, используется их способность к конститутивному синтезу фермента изоцитрат-лиазы. Сравнительный компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей генов ацетатного оперона (асеА, асеВ, асеК, iclR) у штаммов Г. pestis и Y. pseudotuberculosis, представленных в базе данных NCBI GenBank, показал наличие в iclR (размер гена 843 п.н.) вставки двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269-270 от начала гена у штаммов Y. pestis С092, KIM, Antiqua, Nepal516. В отличие от них у других штаммов чумного микроба Angola, 91001, Pestoides F и у всех штаммов псевдотуберкулезного обнаружена интактная структура гена iclR. Секвенирование вариабельной области гена iclR, проведенное нами у природных штаммов Y. pestis, выявило наличие у штаммов основного подвида Y. pestis одинаковой мутации — инсерции двух нуклеотидов (+СС) в позиции 269 — 270., в отличие от неосновных подвидов у которых обнаружена интактная структура этого гена. Выявленная мутация приводит к инактивации гена и нарушению структуры (и функции) белка-репрессора ацетатного оперона IclR, связанному с потерей с С-терминального конца домена (148 - 271 а.о.), который связывает молекулу индуктора. Это приводит к конститутивной экспрессии генов ацетатного оперона и коррелирует с высокой активностью у штаммов основного подвида Y. pestis фермента изоцитрат-лиазы.

Ранее высказывались предположения о том, что наиболее древними штаммами чумного микроба являются штаммы кавказского подвида [Бобров, Филлипов, 1997; Куклева и др., 2002]. Их изучение представляет значительный интерес, поскольку позволяет определить те этапы эволюционных изменений генома, которые привели к преобразованию сапрофитной энтеропато-генной бактерии - псевдотуберкулезного микроба в высоковирулентный системный патоген с принципиально другим механизмом передачи возбудителя. Полученные нами результаты указывают на то, что кавказский подвид наиболее активен по дифференциальным биохимическим признакам и содержит интактные гены {парА, ssuA, glpD, araC, melB, iclR), как и возбудитель псевдотуберкулеза. Это подтверждает большую близость кавказского подвида к предшественнику - Y. pseudotuberculosis по сравнению с другими подвидами Y. pestis.

Нами были также проведены микробиологические исследования по изучению питательных потребностей штаммов Y. pestis кавказского подвида, поскольку в литературе имелись противоречивые сведения по этому вопросу. Установлено, что все изученные штаммы кавказского подвида вели себя единообразно. У них выявлена потребность в двух ароматических аминокислотах - фенилаланине и тирозине, а также в аминокислоте аргинине и витамине Bi (тиамине). У штаммов из Восточно-Кавказского высокогорного очага чумы кроме потребностей в аргинине, фенилаланине, тирозине, и витамине В1 обнаружена также зависимость по лейцину, в то время как штаммы кавказского подвида из Ленинаканского, Присеванского, Зангезуро-Карабахского, При-араксинского природных очагов такой зависимости не имели.

Для установления генетических основ ауксотрофности штаммов кавказского подвида с помощью баз данных KEGG и PFAM был проведен анализ метаболических путей и определение ферментативных систем, участвующих в биосинтезе ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина, аминокислоты аргинина и витамина Bt (тиамина). В генах биосинтеза аргинина (argA), фенилаланина (aroG), тирозина (aroF), и витамина Bl( thiH, thiG) у штаммов кавказского подвида обнаружены значимые мутации. В структурном гене а^А выявлена вставка инсерционной последовательности \S100 по-* еле 196 п.н., что является причиной ауксотрофности кавказского подвида по аргинину. В гене аго<Э кодирующем изофермент ДАГФС-рРЬе] (З-дезокси-Б-арабиногептулозонат-7-фосфат-синтаза), у штаммов кавказского подвида присутствует вставка 10 нуклеотидов (в позиции 820 - 829), приводящая к сдвигу рамки считывания и являющаяся причиной неспособности синтезировать аминокислоту фенилаланин. Другой структурный ген агор (1071 п.н.), кодирующий изофермент ДАГФС-[Туг], у штаммов кавказского подвида, инактивирован внедрением инсерционной последовательности 18100 после 888 нуклеотида от начала гена, что является причиной отсутствия способности синтезировать тирозин. Структурный анализ генов метаболического пути биосинтеза витамина В] (тиамина) показал наличие мутаций в генах ¿/г/Сг и МН, кодирующих фермент тиазолсинтазу, которые инактивированы соответственно делецией размером 13 п.н. в позиции 384 - 396 и инсерцией тимина (+Т) в позиции 552.

Таким образом, нами впервые установлены генетические основы ауксотрофности штаммов кавказского подвида. Полученная генетическая характеристика штаммов кавказского подвида по генам дифференциальных биохимических признаков {{ггарА, вви, glpD, агаС, те1В, юШ) и по генам биосинтеза факторов роста (а^А, агоС, агор, ¿/г/С и ШН) свидетельствует о наибольшей древности этого подвида, а также длительном периоде его эволюции, независимой от других подвидов У. ре,М'я.

На основе проведенного развернутого молекулярно-генетического анализа природных штаммов У. резИБ из различных очагов чумы также определены генетические особенности штаммов других подвидов, циркулирующих на территории России, ближнего и дальнего зарубежья. Применение выявленных генетических мутаций в генах парА, агаС, glpD, теШ, ШЯ позволяет с высокой эффективностью и надежностью определять принадлежность штаммов У. реБИз к основному или неосновным подвидам, а штаммов основного подвида к одному из трех биоваров — античному, средневековому или восточному. Выявлены характерные генотипы" каждой из этих таксономических единиц— вида Y. pestis.

Установленная в ходе выполнения этой работы вариабельность генов пар A, ssu, araC, melB, iclR, argA, aroH, aog F, thiH и thiG, наряду с ранее выявленной вариабельностью гена glpD [Parhill et al., 2001] была использована для реконструкции филогенетической схемы эволюции штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов, которая подтвердила древность штаммов кавказского, а также других неосновных подвидов Y. pestis (рисунок 34).

Как следует из этой схемы, возбудитель чумы ведет свое происхождение от псевдотуберкулезного микроба и является ветвью эволюции этой энте-ропатогенной иерсинии. Наиболее древний подвид Y. pestis филогенетически более близок Y. pseudotuberculosis по сравнению с другими подвидами чумного микроба. Другую древнюю ветвь эволюции Y pestis представляют собой улегейский, алтайский и гиссарский подвиды, которые генетически близки друг другу и, по-видимому, отделились от общего ствола эволюции единой группой, которая в дальнейшем распалась на отдельные подвиды. По-видимому, наиболее древним среди них является, улегейский подвид, который содержит меньшее число мутаций в генах жизнеобеспечения (в частности, у него отсутствует мутация в гене агаС) по сравнению со штаммами алтайского и гиссарского подвидов. Последние филогенетически близки друг другу, а также штаммам группы microtus, которые содержат такие же мутации в генах дифференциальных биохимических признаков, что и штаммы алтайского и гиссарского подвидов. Нами впервые высказано предположение о том, что штаммы microtus относятся к группе алтайско-гиссарских подвидов.

С092 (orientalis)

ЮМ

KIM 776 (meclievalis) (meclievalis)

NepalSlö (antiqua) subsp. ulegeica subsp. hismrica

91001 (microtus) subsp. altaica .

Ansoia

231, 680 subsp. caucasica

F. pestis

Y. pseu dotu bereu losis

Yersinia spp.

Рисунок 34. Схема внутривидовой эволюции У. реяТ^я

После отделения неосновных подвидов в ходе дальнейшей эволюции вида, связанной с нарастанием паразитизма, патогенности и вирулентности и сопровождавшейся дальнейшей редукцией генома, сформировался античный биовар У. резШ, который дал начало средневековому и восточному биоварам (рисунок 34). Многие штаммы, представляющие отдельные этапы и ветви эволюции возбудителя чумы сохранились в природе и циркулируют в различных очагах чумы, в том числе и на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья, что создает надежную основу для разработки полной схемы генетической классификации У. реБШ. В настоящее время уже очевидно, что внутривидовая популяционная структура У. резйз достаточно сложна, и принятое деление на подвиды и биовары не отражает в полной мере всего многообразия внутривидовой таксономии этого возбудителя. Для выявления всего мирового разнообразия штаммов Y. pestis требуется проведение дальнейших исследований генетических особенностей штаммов из различных природных очагов чумы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Одиноков, Георгий Николаевич, Саратов

1. Акиев А.К. О физиологической изменчивости чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. — 1969. Вып. 6 (10). - С. 22 - 25.

2. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 1 // Молекул, генетика. 2002. - № 3. - С. 3 - 23.

3. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов. Сообщение 2 // Молекул, генетика. 2002. - № 4. - С. 3 - 11.

4. Апарин Т.П., Голубинский Е.П. Микробиология чумы: Руководство. — Иркутск / Изд во Иркут. ун - та, 1989. — 90 с.

5. Базанова Л.П., Иннокентьева Т.И. О роли блох — основных и второстепенных переносчиков чумы — в циркуляции возбудителя в сибирских природных очагах // Мед. параз. и параз. болезни. 2008. - № 3. - С. 54 - 60.

6. Балахонов C.B., Ценджаев С.Н., Эрдэмэбат A.B. Новые плазмидовары штаммов возбудителя чумы, изолированных в Монголии // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. — 1991. — № 11. 27 — 29.

7. Безсонова A.A., О двух разновидностях 7. pestis, обнаруживаемых при росте на глицериновых средах // Вестник микробиологии, эпидемиологии и паразитологии. 1928. - Т. 7. - Вып. 3. - С. 325 - 326.

8. Берлин А.Л., Борзенков А.К., Рамнозо-позитивные варианты 7. pestis и дифференциально-диагностическое значение среды с рамнозой // Вестник микробиологии, эпидемиологии и паразитологии. 1938. - Т. 17. - Вып. 3-4. -С. 238-246.

9. Бибикова В.А., Классовский В.Н., Передача чумы блохами. — М.: — Медицина, 1974. 188 с.

10. Бобров А.Г., Филлипов А.А. Распространенность IS285 и IS 100 в геномах Yersinia pestis и Yersinia pseudotuberculosis II Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1997. - № 2. - С. 36 - 40.f

11. Ващенок B.C. Блохи переносчики возбудителей болезней человека и животных. - Л.: Наука, 1988. — 160 с.

12. Величко Л.Н., Кондрашкина К.И., Ермилов А.П. и др. Экскременты блох естественная среда долговременного хранения микроба чумы // Проблемы особо опасных инфекций. — 1978. - Вып. (64). — С. 51 — 53.

13. Волков Ю.П., Ерошенко Г.А. Анализ эффективности некоторых методов построения филогенетических деревьев, используемых при оценке эволюционного родства микроорганизмов // Проблемы особо опасных инфекций. 2009. - Вып. 1 (99). - С. 35 - 41.

14. Гасфилд Дж. Строки, деревья и последовательности в алгоритмах: Информатика и вычислительная биология. — СПб.: Невский диалект, БХВ-Петербург, 2003. 654 с.

15. Гольдфарб Л.М., Домарадская Т.И., Джапаридзе М.Н. К оценке изоцит-рат-лиазного теста для дифференциации возбудителей чумы и псевдотуберкулеза// Актуальные вопросы лабораторной диагностики и биохимии возбудителей чумы и холеры. — 1984. С. 23 - 27.

16. Гольдфарб Л.М., Домарадская Т.И., Джапаридзе М.Н. Изоцитрат-лиазная активность тест для внутривидовой дифференциации иерсиний чумы // Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций. - 1984. — ч. 2.-С. 21 -22.

17. Домарадский И.В. Чума. М.: Медицина, 1998. - 173 с.

18. Ильина Т.С., Романова ЮМ., Гинцбург A.JI. Биопленка как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. — 2004. -Т. 40, № 11. — С. 1 12.

19. Классовский Л.Н., Мартиневский И.Л., Степанов В.М. О факторах роста штаммов бактерий чумы, выделяемых на Закавказском нагорье от полевок и их блох // Проблемы особо опасных инфекций. 1972. - Вып. 1. - С. 186 — 188.

20. Козлов М.П. Чума. М.: Медицина, 1979. - 192 с.

21. Кокушкин A.M. Некоторые особенности алиментарного заражения и проявления чумы у диких грызунов // Пробл. особо опасных инфекций. — 1994.-№5.-С. 23-31.

22. Кокушкин A.M. Социальные и биологические аспекты эпидемиологии чумы: Автореф. дис. докт. мед. наук. 1995. — 46 с.

23. Куклева Л.М. Ерошенко Г.А. Шавина Н.Ю. и др. Сравнительный анализ распределения псевдогенов в. геноме штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы // Молекул.генет., микробиол. и вирусол. 2009. - №2. - С. 32-36.

24. Куклева Л.М., Ерошенко- Г.А., Павлова А.И. и др. Характеристика штаммов возбудителя чумы» разных подвидов по признакам нитратредукции, ферментации глицерина и арабинозы // Проблемы особо опасных инфекций. — 2007.-№ 94.-С. 50-53.

25. Куклева Л.М., Ерошенко Г.А., Шавина Н.Ю. и др. Сравнительный анализ распределения псевдогенов в геноме штаммов основного и неосновныхподвидов возбудителя чумы // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. — 2008. -№ 2.-С. 32-36.

26. Куклева JI.M., Кузьмиченко И.А., Проценко О.А. Сравнительная характеристика биохимических свойств штаммов разных подвидов Yersinia pestis и штаммов Yersinia pseudotuberculosis II Проблемы особо опасных инфекций. — 2001.-Вып. 1.-С. 105-110.

27. Куклева JI.M., Проценко О.А., Кутырев В.В. Современные представления о родстве возбудителей чумы и псевдотуберкулеза / Молекул, генет., микробиол. и вирусол // 2002. №.1 - С. 3 - 7.

28. Кутырев В.В., Ерошенко Г.А., Попов Н.В. и др. Молекулярные механизмы взаимодействия возбудителя чумы с беспозвоночными животными // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 2009. № 4. - С. 7 — 12.

29. Кутырев В.В., Коннов Н.П., Волков Ю.П. Возбудитель чумы ультраструктура и локализация в переносчике / Под ред. В.В. Кутырева. — М.: Медицина. 2007. 224 с.

30. Кутырев В.В., Попов Ю.А., Проценко О.А. Плазмиды патогенности чумного микроба// Мол. генет., микробиол., вирусол. 1986. - № 6. - С.З -11.

31. Кутырев В.В., Проценко О.А. Классификация и молекулярно-генетические исследования Yersinia pestis II Проблемы особо опасных инфекций. 1998. - № 78. - С. 11 - 12.

32. Кутырев В.В., Смирнова Н.И., Генодиагностика и молекулярное типи-рование возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. — 2003 — № 1. — С. 6 14.

33. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генетическое разнообразие и эволюция геномов возбудителей особоопасных инфекций чумы, холеры и сибирской язвы: настоящее и будующее // Биотехнология: состояние и переспективы раз-видия.-М., 2005.-Ч. 1.-С. 17.

34. Лаборатрорная диагностика особо .опасных инфекциооных болезней. Практическое руководство/ Под ред Г.Г.Онищенко, В.В.Кутырев.-М.: Медицина, Шико , 2009. 472 с.

35. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-480 с.

36. Мартиневский И.Л. Таксономия рода Yersinia II Мат. 4-ой науч. конф. по прир. очаг, и проф. чумы. — Алма-Ата, 1965. С. 142 — 148.

37. Мартиневский И.Л. Биология и генетические особенности чумного и близкородственных ему микробов. М.: Медицина, 1969. — 295 с.

38. Мартиневский И. Л., Степанов В.М., Кенжебаев А .Я. Таксономия, мутация и генетика патогенности чумного и родственных ему микробов. Нукус. Из-во «Каракалпакстан», 1990. — 151 с.

39. Методы общей бактериологии под ред. Ф. Герхардта и др. М.: Мир, 1984. —264 с.

40. Михайлова P.C. Таксономия чумного микроба, циркулирующего среди полевок в Закавказском нагорье // Материалы к конф., посвящ. 50 летию института «Микроб». Саратов, 1968. - С. 67 - 68.

41. Определитель Бактерий Берджи под ред. Дж. Хоулта. Н. Крига, П.Снита, Дж. Стейли и Уильямса. — М.: Мир, 1997. 9-е изд. (в 2-х томах). — 799 с.

42. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., Попов Н.В. и др. Природные очаги чумы Кавказа, Прикаспия, Средней Азии и Сибири / Под ред. Г.Г.Онищенко, В.В. Кутырева. -М.: Медицина, 2004. 192 с.

43. Пейсахис Л.А., Степенов В.М. Внутривидовая классификация*возбудителя чумы по принципу географического районирования // Проблемы особо опасных инфекций. 1975. — Вып. 2. - С. 5 — 9.

44. Попов Ю.А. Конструирование и использование ДНК зондов на представителях рода Yersinia// Генетика, микробиол. и совершенствование методов лаб. диагностики особо опасн. инф. Саратов, 1991. — С. 3-13.

45. Попов Ю.А. Структурная и функциональная организация плазмид и генно-инженерные разработки на этой модели: Дис.докт. биол. наук. Саратов, 1991. - 248 с.

46. Попов Ю.А., Горшков О.В., Савостина Е.П. и др., Генотипирование штаммов Yersinia pestis из различных природных очагов чумы // Молекул, генетика, микробиология и вирусология 2000. - № 3. — С. 12-17.

47. Попов Ю.А., Проценко O.A., Анисимов П.И., Кокушкин A.M., Можаров

48. Т. Обнаружение плазмид пестициногенности чумного микроба методом электрофареза в агарозном геле // Профилактика особо опасн. инф.- Саратов, 1980.-С. 20-25.

49. Попов Н.В., Слудский A.A. Удовиков А.И. и др. Роль биопленок Yersinia pestis в механизме энзоотий чумы // Журн. микробиол., эпидемиол. иммунол. 2008. - № 4. - С.118 - 120.

50. Попов Ю.А., Фурсов В.В., Структурная организация производных плазмиды пестициногенности, меченных транспозонами Тп1 и Тп9 // Мол. биол., генет. и иммунол. чумы и холеры Саратов, 1983. - С. 34 - 39.

51. Попов Ю.А., Яшечкин Ю.И., Дроздов И.Г. Молекулярно-генетический анализ структуры ДНК плазмид pFra штаммов возбудителя чумы различных биоваров // Генетика. 1998. - Т. 34. - С. 198 - 205.

52. Проценко O.A., Анисимов П.И., Можаров О.Т. и др. Выявление и характеристика плазмид чумного микроба, детерминирующих синтез пестицина1, антигена фракция I и экзотоксина «мышиного» токсина // Генетика. 1983. -Т. 19, №7.-С. 1081-1090.

53. Ратнер В.А. Молекулярная генетика: принципы и механизмы. Новосибирск: Наука, 1983. - 256 с.

54. Розанова Г.Н., Сердюкова Т.В., Шехикян М.Т. и др. Возбудитель чумы из очагов полевочьего типа на Кавказе Науч.-исслед. противочумный ин-т Кавказа и Закавказья. Ставрополь, 1987. 17 с.

55. Савостина Е.П., Попов Ю.А., Геномный полиморфизм штаммов основного подвида возбудителя чумы // Молекул, генетика, микробиология и вирусология 2009. - № 4. - С. 23 - 26.

56. Смирнов Г.Б. Механизмы приобретения и потери генетической информации бактериальными геномами // Успехи современной биологии. 2008. — Т. 128. — № 1.-С. 52-76.

57. Смирнов И.В. Возбудитель иерсиниоза и близкие к нему микроорганизмы // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. — 2004. — Т. 6, № 1. — С. 10 -21.

58. Смирнова Н.И., Кутырев В.В., Сравнительный анализ молекуярно-генетических особенностей геномов и их эволюционных преобразований у возбудителей холеры, чумы и сибирской язвы // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 2006. - № 2. - С. 9 - 19.

59. Стыбаева Г.С., Атшабар Б.Б. Молекулярно-генетические особенности возбудителя чумы (обзор литературы) // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. 2003. - № 1 (7). - С. 52 - 67.

60. Сулейменов Б.М. Механизм энзоотии чумы. Алматы, 2004. — 236 с.

61. Султанов Г.В., Козлов М.П. Чума. Микробиология, патогенез, диагностика. Том 1. Махачкала: Из-во Акад. сельск. наук, 1995. 223 с.

62. Тимофеева Л.А. О таксономии чумного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. 1972. - Вып. 1(23).- С. 15 - 22.

63. Тимофеева Л.А., Апарин Т.П., Трофименко Н.З. Потребности в аминокислотах штаммов чумного микроба, выделенных в очагах Сибири // Докл. Иркутск, противочумного ин-та. Иркутск, 1971. - Вып. 9. — С. 43 — 44.

64. Тимофеева Л.А., Жамьян Сурен, Сотникова А.Н. и др. Биологические свойства штаммов чумного микроба, выделенных в Монголии в 1969 — 1971 гг. // Проблемы особо опасных инфекций. 1974. - №3 (37). - С. 37 - 42.

65. Тимофеева JI. А., Логачёв А. И. Yersinia pestis ulegeica новый подвид чумного микроба, выделенный в МНР. В кн.: Эпидемиология и профилактика особо опасных инфекций в МНР и СССР. - Улан-Батор.: Б.и., 1975. - С. 63 -64.

66. Туманский В.М. Изменчивость чумного микроба в природных условиях очаговости чумы // Кн.: Природ, очагов, и эпидемиол. особо опасных инф. — Саратов, 1959. С. 189 - 199.

67. Филиппов A.A., Кутырев В.В., Видяева H.A. и др. Клонирование локуса плазмиды кальций зависимости Yersinia pestis (Lehmann, Neumann), кодирующего синтез белка внешней мембраны (БВМ2) // Генетика. 1991. - Т. 27, №4.-С. 598-606.

68. Филиппов A.A., Солодовников Н.С., Куклева Л.М. и др. Изучение плаз-мидного состава штаммов возбудителя чумы из различных природных очагов // ЖМЭИ. 1992. - № 3. - С. 10 - 13.

69. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний // Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. 2002. - Т. 4, № 3. - С. 248 - 266.

70. Черкасский Б. Л. Инфекционные и паразитарные болезни человека,- М.: Медицинская газета, 1994. — 617с.

71. Яшечкин Ю.И., Кириллина O.A., Попов Ю.А. и др. Физическая картирование 68 мд плазмиды Y pestis 231 // Проблемы особо опасных инфекций. -1999. -№ 1 С. 26-28.

72. Achtman М., Morelli G., Zhu Р. et al. Microevolution and histoiy of the plague bacillus, Yersinia pestis II Proc. Natl'. Acad. Sei. USA. 2004. - 101. - P. 17837-17842.

73. AchtmanM., Zurth K., Morelli G. et al. Yersinia pestis, the cause of plague, is a recently emerged clone of Yersinia pseudotuberculosis II PNAS. 1999. - V. 96;N24. -P. 14043-14048.

74. Anisimov A.P.*, Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific Diversity of Yersinia pestis II Clin. Microbiol. 2004. - V. 17(2). - P. 434 - 464.

75. Anisimov P.I., Popov Iu.A., Kokushkin A.M. Functional phenotypic variability in a plague pathogen and plague enzootics // Med. Parazitol. (Mosk). 2001. — N2.-P. 35-40.

76. Bai G., Smith E., Golubov A., Pata J. et al. Differential gene regulation in Yersinia pestis versus Yersinia pseudotuberculosis: effects of hypoxia and potential role of a plasmid regulator // Adv. Exp. Med. Biol. 2007. - V. 603. - P. 131 — 144.

77. Baxevanis A.D., Francis-Ouellette B.F./ Bioinformatics. A practical guide to the analysis of genes and proteins / John-Willey N.Y., 2001. 470 p.

78. Bearden S.W., Sexton C., Pare J. et al. Attenuated enzootic (pestoides) isolates of Yersinia pestis express active aspartase // Microbiology. 2009 - V.155. -P. 198-209.

79. Beale J., Lee S.Y., Iwata S., Beis K. Structure of the aliphatic sulfonate-binding protein SsuA from Escherichia coli II Acta Cryst. 2010. - V. 66. - P. 391 -396.

80. Ben-Gurion R., Hertman J., Bacteriocin-like material linear plasmid prophage of Yersinia enterocolitica with covalently closed ends // Moll. Microbiol. — 1958-V. 48.-P. 989-1003.

81. Bercovier H. Intra- and interspecies relatedness of Yersinia pestis by DNA hybridization and its relationship to Yersinia pseudotuberculosis II Curr. Microbiol. 1980. - Nu 4. - P. 225 - 229.

82. Bobrov A.G., Kirillina O.A., Forman S. et al. Insight into Yersinia pestis biofilm development: topology and co-interaction of hms inner membrane proteins involved in exopolisaccharide production // Environ.microbiol. — 2008. V. 10, N 6.-P. 1419-1432.

83. Bobrov A.G., Perry R.D. Yersinia pestis lacZ expresses a beta-galactosidase with low enzymatic activity // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 255, N 1. - P. 43 -51.

84. Brubaker R.R. Interconversion of purine mononucleotides in Pasteurella pestis II Infect. Immun. 1970. - V. 1. - P. 446 - 454.

85. Brubaker R.R. The genus Yersinia: biochemistry and genetics of virulence // Current Topics in Microbiol, and Immunol. 1972. -N 57. - P. 293 - 299.

86. Brubaker R.R. The recent emergence of plague: a process of felonious evolution // Microbial ecology. 2004. - V. 47. - P. 293 - 299.

87. Burrows T.W. Virulence of Pasteurella pestis and immunity to plague // Er-geb Mikrobiol Immunitatsforsch Exp Ther. 1963 - V. 37. - P. 59-113.

88. Buchrieser C., Prentice M., Carniel E. The 102-kilobase unstable region of Yersinia pestis comprises a high-pathogenicity island linked to a pigmentation segment which undergoes internal rearrangement // J. Bacterid. — 1998. — V. 180. — P. 2321-2329.

89. Cao Y., Huang H., Meng K. et al. Cloning and functional expression of an a-galactosidase from Yersinia pestis biovar Microtus str. 91001 //Biosci. Biotechnol. Biochem. 2008. -V. 72, N 8. - P. 2203 - 2205.

90. Chain P.S., Carniel E., Larimer F.W. et al. Insights into the evolution of Yersinia pestis through whole genome comparison with Yersinia pseudotuberculosis! I Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. - V. 191,N38.-P. 13826-13831.

91. Chain P.S., Hu P., Malfatti S. A. et al. Complete genom sequence of Yersinia pestis strain Antiqua and Nepal516: evidence of gene reduction in an emerging pathogen // J. Bacterid. 2006. - V. 188, N 12. - P. 4453 - 4463.

92. Chuang Peng / Distance based methods in phylogtetic tree construction, p. 1 -11,2007.

93. Cobbs C.G., Chansolme D.H. Plague. // Clin. Dermatol. 2004. - V. 22(3). -P. 303-312f

94. Cornells G.R., Boland A., Boyd A.P. et al. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62, №4. -P. 1315-1352.

95. Cowan C. et al., Invasion of epithelial cells by Yersinia pestis: evidence for a Y. pestis-specific invasion // Infect. Immun. 2000. - V. 68(8). - P. 4523 - 4530.

96. Dale C., Wang B. et al. Plague // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2002. -Vol.99, № 19.-P. 12397-12402.

97. Darby C., Ananth S.L., Tan L., Hinnebusch B.J. Identification of gmhA a Yersinia pestis gene required for flea blockage by using a Caenorhabditis elegans biofilm// Infect.Immun.- 2005. V.73, N11. - P. 7236 - 7242.

98. Deng W., Burland V., Plunkett G. et al. Genome sequence of Yersinia pestis KIM // J. Bacteriol. 2002 - V. 184 - P. 4601 - 4611.

99. Dennis D.T., Chow C.C. Plague // J. Pediatr. Infect. Dis. 2004. - V. 23(1). -P. 69-71.

100. DeSalle R., Giribet G., Wheeler W. / Techniques in molecular systematics and evolution/ Birkhauser, 2002. 420 p.

101. Devignat R. Variétés de l'espèce Pasteurella pestis // Bull. WHO. 1951. — V. 4.-P. 247-263.

102. Epinger M., Guo Z., Sebastian T., Song Y., Lindl er L.E., Yang R., Ravel J. Draft genome sequences of Yersinia pestis isolates from natural foci of endemic plague in Cine // J. Bacteril. 2009. - V. 191. - P. 7628 - 7629.

103. Epinger M., Rosovitz M.J., Fricke W.F. et al. The complete genome sequence of Yersinia pseudotuberculosis IP31758, the causative agent of Far East Scarlet-Like Fever // Plos Genetics 2007. - V. 3 - P. 1508 - 1522.

104. Eppinger M., Worsham P.L., Nikolich M.P. et al. Genome sequence of the deep-rooted Yersinia pestis strain Angola reveals new insights into the evolutionand pangenome of the plague bacterium // J. Bacteriol. 2010. - V. 192, N 6. - P.i1685-1699.

105. Felek S., Tsang T.M., Krukonis E.S. Three Yersinia pestis adhesins facilitate Yop delivery to eukaryotic cells and contribute to plague virulence // Infect. Immun. V. 77(2). - P. 825 - 836.

106. Felsenstein J., PHYLIP—Phylogeny Inference Package (version 3.2). Cladis-tics, 1989, vol. 5, pp. 164 -166, http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html.

107. Fetherston J.D., Perry R.D. The pigmentation locus of Yersinia pestis KIM6+ is flanked by an insertion sequence and includes the structural genes for pesticin sensitivity and HMWP2 // Mol. Microbiol. 1994. - V. 13, №4. - P. 697 - 708.

108. Forman S., Wulff C.R., Myers-Morales T. et al. yadBC of Yersinia pestis, a new virulence determinant for bubonic plague // Infect Immun. — 2008. V. 76(2). -P. 578-587.

109. Garcia E., Worsham P., Bearden S. et al. Pestoides F, an atypical Yersinia pestis strain from the former Soviet Union // Adv Exp Med Biol. 2007. - V. 603. -P. 17-22.

110. Gascuel O. / Mathematics of evolution and phylogeny. / Clarendon press. Oxford. 2004.-33 p.

111. Gintsburg A.L., Shovadaeva G.A., Shubin F.N. et al. Integration with the chromosome-an alternative state of calcium-dependency plasmids in Yersinia // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 1989. -N 5. -P. 7 - 11.

112. Guiyoule A., Gerbaud G., Buchriester C. et al. Transferable plasmid-mediated resistance to streptomycin in a clinical isolate of Yersinia pestis II Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7, № 1. - P. 43 - 48.

113. Guo Y., Zhang L., Xia L. et al. Biochemical characters of Yersinia pestis isolated from Yulong County of Yunnan Province in China // Endem. Dis. Bull. -2008.-V. 23.-P. 12-14.

114. Hall-Stoodley L., Costerton J.W., Stoodley P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat. Rev. Microbiol. 2004, N2. - P 95 -108.

115. Hare J.M., McDonough K.A. High-frequency RecA-dependent and -independent mechanisms of Congo red binding mutations in Yersinia pestis. H J. Bacteriol. 1999. -V. 181(16). - P. 4896-4904.

116. Hillier S.L., Charnetzky W.T. Rapid diagnostic test that uses isocitrate lyase activity for identification of Yersinia pestis II J.Clin.Microbiol. — 1981. V.13, N4. -P. 661-665.

117. Hinnebusch B .J. The evolution of flea-borne transmission in Yersinia pestis II Curr. Issues Mol. Biol. 2005. - V. 7, N2. - P. 197 - 212.

118. Hinnebusch BJ., Fisher E.R., Schwan T.G. Evaluation of the role of the Yersinia pestis plasminogen activator and other plasmid encoded factors in temperate dependent blockage of the flea // Infect. Immun. 1998. - V. 178. - P. 1406 -1415.

119. Hinnebusch B .J., Perry R.D., Schwan T.G. Role of the Yersinia pestis hemin storage (hms) locus in the transmission of plague by fleas// Science. 1996. — V 273,N5273-P. 367-370.

120. Hinnebusch B.J., Rudolf A.E., Cherepanov P.et al. Role of Yersinia murine toxin in survival of Yersinia pestis in the midgut of the flea vector // Science. — 2002.-V. 296.-P. 733-735.

121. Hoiczyk E., Roggenkamp A., Reichenbecher M. et al. Structure and sequence analysis of Yersinia YadA and Moraxella UspAs reveal a novel class of adhesins // J. EMBO 2000. - V. 19(22). - P. 5989 - 5999.

122. Iriarte M., Cornelis G.R. Molecular determinants of Yersinia pathogenesis // Microbiologia. 1996. -V. 12(2). - P. 267- 280.

123. Jackson S., Burrows T.W. The virulence-enhancing effect of iron on non-pigmented mutants of virulent strains of Pasteurella pestis // Br. J. Exp. Pathol. — 1956. —Y. 37.- P. 577-583.

124. Joshua G.W.P., Karlyshev A.V., Smith M.P. et al. A Caenorhabditis elegans model of Yersinia infection: biofilm formation on a biotic surfaces // Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 3221 - 3229.

125. Kienle Z., Emody L., Svanborg C., O'Toole P.W. Adhesive properties conferred by the plasminogen activator of Yersinia pestis. II J. Gen. Microbiol. 1992. -V. 138.-1679-1687.

126. Kitching I.J., Forey P.L., Humphries C.J., Williams D.M. / Cladistics. The theory and practice of parsimony analysis. — Oxford science publications, 1998. — 223 p.

127. Kutyrev V.V., Boolgakova E.G., Yidyaeva N.A. et al. Comparative characteristics of different bacterial groups of the genus Yersinia // Natural Infect. Dis.: Abst. of Scient. Conf. 6 December. Ulanbaatar, 2001. - P. 39 - 40.

128. Kutyrev V.V., Filippov A.A., Oparina O.S. et al. Analysis of Yersinia pestis chromosomal determinants Pgm+ and Psts associated with virulence // Microb. Pa-tog. 1992.-V. 12.- P. 177-186.

129. Kutyrev V.Y., Vidyaeva N.A., Bobrov A.G. et al. The murine toxin gene encodes for a secreted phospholipase D // Bacterial protein toxins. Jena- Stuttgart. — 1997.-P. 59-60.

130. Lahteenmaki K., Virkola R., Saren A. et al. Expression of plasminogen activator pla of Yersinia pestis enhances bacterial attachment to the mammalian extracellular matrix // Infect Immun. 1998. - V. 66(12). - P. 5755 - 5762.

131. Lathem W.W., Price P.A., Miller V.L., Goldman W.E. A plasminogen-activating protease specifically controls the development of primary pneumonic plague // Science. 2007. - V. 315 (5811). - P. 509 - 513.

132. Lazarus A.A., Decker C.F. Plague // Respir Care Clin. N Am. 2004. -V. 10(1).-P. 83-98.

133. Li Y., Hauck Y., Platonov M.E. et al., Genotyping and analysis of Yersinia pestis by ML VA: insights into the worldwide expasion of Central Asia plague foci // PLoS ONE. 2009. -V. 4 (6)., e6000.j

134. Liang Y., Hou X., Wang Y. et al. Genome rearrangements of completely sequenced strains of Yersinia pestis II J. Clin. Microbiol. — 2010. — V. 48 (5). — P. 1619-1623.

135. Lillard J.W., Fetherston J.D., Pedersen L. et al. Sequence and genetic analysis of the hemin storage (hms) system of Yersinia pestis II Gene. — 1997. V. 193. — P. 13-21.

136. Lindler LE. Typing methods for the plague pathogen, Yersinia pestis II J. AOAC Int. 2009. - V. 92(4). - P. 1174 - 1183.

137. Lindler L.E. The Yersinia pestis — specific plasmids pFra and pPla // Yersinia molecular and cellular biology / Ed.: E. Carniel, B.J. Yinnebusch. Horison Bio-sciense, 2004. - Chapt.

138. Matsumoto H., Young G.M. Translocated effectors of Yersinia // Curr. Opin. Microbiol. 2009. - V. 12(1). - P. 94 - 100.

139. McDonough K.A., Barnes A.M., Quan T.J. et al. Mutation in the pla gene of Yersinia pestis alters the course of the plague bacillus-flea (Siphonaptera: Cerato-phyllidae) interaction I I J.Med. Enthomil. 1993. - V. 30. - V. 772 - 780.

140. Mollaret H., Mollaret C. Melibiose fermentation in the genus Yersina and its importance in the diagnosis of the varieties of Y. pestis II Bull Soc Pathol Exot Filiales. 1965.-V. 58(2).-P. 154-156.

141. Mount D. W. / Bioinformatics. Sequence and genome analysis. Gold Spring Harbor laboratory press, 2003. - 50 p.

142. Naumov A.V., Kuz'michenko I.A., Taranenko T.M. et al. The biochemical aspects of the pathogenicity of the causative agent of plague // Med. Parazitol. (Mosk). 1995. - N 4 - P. 17-22.

143. Navid A., Almaas E. Genome-scale reconstruction of the metabolic network in Yersinia pestis, strain 91001 // Mol. Biosyst. 2009. - V. 5(4). - P. 368 -375.

144. Odaert M., Berche P., Simonet M. Molecular typing of Yersinia pseudotuberculosis by using an IS200-like element // J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34(9). -P. 2231-2235.

145. Paerregaard A., Espersen F., Skurnik M. Role of the Yersinia outer membrane protein YadA in adhesion to rabbit intestinal tissue and rabbit intestinal brush border membrane vesicles // APMIS. 1991. - V. 99(3). - P. 226 - 232.

146. Paiva Nunes M., Suassuna I., Rocco Suassuna I. Biochemical characteristics of Yersinia pestis samples isolated in Brazil // Rev. Latinoam. Microbiol. 1977. -V. 19(4).-P. 189- 197.

147. Pan N.J., Brady M.J., Leong J.M., Goguen J.D. Targeting type III secretion in Yersinia pestis II Antimicrob. Agents Chemother. 2009. — V. 53(2). - P. 385 -392.

148. Panina E.M., Vitreschak A.G., Mironov A.A., Gelfand M.S. Regulation of aromatic Amino acid byosynthesis in Gamma-proteobacteria // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 3, N 4. - P. 529 - 543.

149. Parhill J., Wren B:W., Thomson N.R. et al. Genome sequence of Yersinia pestis, the causative agent of plague// Nature. 2001. - V. 413. - P. 523 - 527.

150. Patel C.N., Wortham B.W., Lines J.L. et al. Poliamines are essential for the formation of plague biofilm// J.Bacteriol. 2006. -V. 188, N 7. - P. 2355 - 2363.

151. Pendrak M.L., Perry R.D. Characterization of a hemin-storage locus of Yersinia pestis I I Biol. Metals 1991. - V. 4. - P. 41 - 47.

152. Pendrak M.L., Perry R.D. Proteins essential for expression of the Hms+ phe-notype of Yersinia pestis II Mol. Microbiol. 1993. - V.8. - P. 857 - 864.

153. Perry R.D., Pendrak M., Schuetze P. Identification and cloning of a hemin storage locus involved in the pigmentation phenotype of Yersinia pestis II J. Bacte-riol. 1990. - V. 172. - P. 5929 - 5937.

154. Perry R.D., Balbo P.B., Jones H.A. et al. Yersiniabactin from Yersinia pestis'. biochemical characterization of the siderophore and its role in iron transport and regulation // Microbiology. 1999. - V. 145, Part. 5. - P. 1181 - 1190.

155. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiological agent of plague // Clin. Mcrobiol. Rev. 1997. - V. 10. - P. 35.

156. Perry R.D., Lucier T.S., Sikkema D.J. et al., Storage reservoirs of hemin and inorganic iron in Yersinia pestis II Infect. Immun. — 1993. V. 61. - P. 32 — 39.

157. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D. et al. DNA sequencing and analysis of the low-Ca2+-response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5 // Infect. Immun. 1998. - V. 6, N 10. - P. 4611 - 4623.

158. Perry R.D. A plague of fleas: survival and transmission of Yersinia pestis II ASM News. 2003. - V.69, N 7. - P. 385 - 389.

159. Plague. Fact sheets N267. World Health Organization, Available at: http//www.who.int/mediacentre/factssheets/fs267/en/index.htm.Accessed April 18, 2006.

160. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Characterization of plasmids and plasmid-associated determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis // Infect. Immun. 1981. - V. 31. - P. 775 - 782.

161. Pouillot F., Fayolle C., Camiel E. Characterization of chromosomal regions conserved in Yersinia pseudotuberculosis and lost by Yersinia pestis I I Infect. Immun. 2008. - V. 76(10). - P. 4592 - 4599.

162. Prasad Maharjan R., Yu P.L., Seeto S., Ferenci T. The role of isocitrate lyase and the glyoxylate cycle in Escherichia coli growing under glucose limitation // Res. Microbiol. 2005. - V. 156(2). - P. 178 - 183.

163. Prentice MB, Rahalison L. Plague // Lancet. 2007. - V. 369, N 9568. - P. 1196-1207.

164. Price S.B., Cowan C., Perry R.D., Straley S.C. The Yersiniapestis V antigen is a regulatory protein necessary for Ca2(+)-dependent growth and maximal expression of low-Ca2+ response virulence genes // J. Bacterid. 1991. - V. 173(8). - P. 2649 - 2657.

165. Rakin A., Boolgakowa E., Heesemann J. Structural and functional organization of the Yersinia pestis bacteriocin pesticin gene cluster // J. Microbiol. 1996. -V. 142.-P. 3415-3424.

166. Richardson D.J., Berks B.C., Russell D.A. et al. Functional, biochemical and genetic diversity of prokaryotic nitrate reductases // CMLS. 2001. - V. 58. - P. 165-178.

167. Sneath P.H., Socal R.R. Numerical taxonomy II Nature. 1962. - N 193. - P. 855 - 860.

168. Quan T., Van der Linden J., Tsuchiya K. Evaluation of a gualitative isocitrate lyase assay for rapid presumptive identification of Yersinia pestis II J. Clin. Microbiol. 1982.-V. 15,N16.-P. 1178-1179.

169. Sanger F., Nicklen L., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminatinginhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol. 74. - P. 5463 -5467.

170. Savostina E.P., Popov Iu.A., Kashtanova T.N. et al. Genomic polymorphism of the main subspecies of the plague agent strains // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. -2009-N4. P. 23-27.

171. Sebbane F., Jarrett C.O., Gardner D. et al. Role of the Yersinia pestis plasminogen activator in the incidence of distinct septicemic and bubonic forms of fleaiborne plague // Proc.Natl. AcadlSci.USA. 2006. - V.103, N 14 - P.5526 - 5530.

172. Sebbane F., Jarrett G.O., Linkenhoker J.R., Hinnebusch B.J. Evaluation of the role of constitutive isocitrate lyase activity in Yersinia pestis infection of the flea vector and'mammalian host // Infect, and Immun. — 2004. V. 72, N 12. - P. 7334-7337.

173. Semple C., Steel M. / Phylogenetics. Oxford university press, 2003. - 256 P

174. Simonet M., Riot B., Fortineau N., Berche P. Invasin production by Yersinia pestis is abolished by insertion of an IS200-like element within the inv gene // Infect Immun. 1996. - V. 64(1). - P. 375 - 379.

175. Skrzypek E., Straley S.C. Differential effects of deletions in lcrV on secretion of V antigen, regulation of the low-Ca2+ response, and virulence of Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1995. - V. 177(9). - P. 2530 - 2542.

176. Song Y., Tong Z., Wang J. et al., Complete genome sequence of Yersinia pestis strain 91001, an isolate avirulent to humans // DNA Res. 2004. - V. 11 (3). -P. 179-197.

177. Stenseth N.C., Atshabar B.B., Begon M. et al. Plague: past, present, and future // PLoS Med. 2008. - V. 5(1)., e3.

178. Straley et al., Environmental modulation of gene expression and pathogenesis in Yersinia // Trends Microbiol. 1995. - V. 3(8). - P. 310 - 317.

179. Sun Y.C., Hinnebusch B.J., Darby C. Experimental evidence for negative selection in the evolution of a Yersinia pestis pseudogene // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2008. V. 105, N 2. - P. 8097 - 8101.tyf

180. Surgalla M. J., Beesley E. D. Congo red-agar plating medium for detecting pigmentation in Pasteurella pestis // Appl. Microbiol. — 1969. V. 18(5). - P. 834 -837.

181. Tahir Y., Skurnik M. YadA, the multifaceted Yersinia adhesin // Int. J. Med. Microbiol. 2001. - V. 291(3). - P. 209 - 218.

182. Takahashi H., Watanabe H. Plague // Nippon Rinsho. 2007. - V. 65. - P. 54-59.

183. Tiball R.W., Hill J., Lawton D.J., Brown K.A. Yersinia pestis and plague I I Biochem. Soc. Trans. 2003. - V. 31. - P. 104 - 107.

184. Weerasingle J.P., Dong T., Schertzberg M.R. et al. Stationary phase expression of arginine biosynthetic operon argCBH in Escherichia coli II BMC Microbiology. 2006. - V. 6. - P. 14 - 26.

185. Williamson ED. Plague. // Vaccine. 2009. - V. 4. - P. 56 - 60.

186. Wren B.W. Microbial genome analysis: insights into virulence. Host adaptation and evolution// Nature Rev.Genet. 2000. - V. 1. - P. 30 - 39.

187. Wren B.W. The Yersinia a model genus to study the rapid evolution of bacterial pathogen//Nature reviews. Microbiology. 2003.-V.l. - P.55-64.

188. Worsham P.L., Roy C. Pestoides F, a Yersinia pestis strain lacking plasminogen activator, is virulent by the aerosol route // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. — V. 529. -P. 129-131.

189. Xiong Jin / Essential bioinformatics. Cambridge univ. press. 2006. 361 p.

190. Zhou D., Han Y., Song Y. et al. Comparative and evolutionary genomics of Yersinia pestis II Microbes Infect. 2004. - V. 6(13). - P. 1226 - 1234.

191. Zhou D., Tong Z., Song Y. et al. Genetics of metabolic variations between Yersinia pestis biovars and proposal of a new biovar, microtus // J. Bacteriol. -2004. V. 186. - P. 5147 - 5152.

Информация о работе

Одиноков, Георгий Николаевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Генетический анализ биохимических особенностей штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы