Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное типирование штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное типирование штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов"

На правах рукописи

ПАВЛОВА Алла Ивановна

Молекулярное типирование штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов

03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

і ид? ш

005015143

Саратов-2012

005015143

Работа выполнена в ФКУЗ «Российский научно-исследовательски противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфер защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Ерошенко Галина Александровна

Официальные оппоненты:

Швиденко Инна Григорьевна - доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития Российской Федерации, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии

Микшис Наталья Ивановна - доктор медицинских наук ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора,

ведущий научный сотрудник лаборатории прикладной генетики Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиолог имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития Российск Федерации

Защита состоится <&Л^у> 2012 г. в часов на заседай

диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатск диссертаций при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумнь институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российск научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан « / _2012 г.

Ученый секретарь диссертационног-------

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник

Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Чума - особо опасная инфекционная болезнь, которая и в настоящее время требует к себе пристального внимания и координированного контроля со стороны всего мирового сообщества. Природные очаги чумы расположены на территории Азии, Африки, Европы, Северной и Южной Америк. В Российской Федерации и ближнем зарубежье существует 45 природных очагов чумы, 11 из которых находятся непосредственно на территории России [Онищенко Г.Г.с соавт., 2004; Попов Н.В.с соавт., 2011]. Широкое распространение возбудителя чумы, его высокие поражающие свойства делают чуму важной социально-значимой проблемой международного масштаба. Решение этой проблемы требует разработки новых высокоэффективных методов и средств диагностики и профилактики чумы.

Применение современных молекулярных технологий в изучении возбудителя чумы и секвенирование последовательностей полных геномов ряда штаммов показало, что возбудитель чумы является ветвью эволюции псевдотуберкулезного микроба, от которого он отделился относительно недавно [Achtman М. et al., 1999; Parkhill J. et al„ 2001; Deng W. et al., 2002; Chain P. et al., 2004; Garcia E. et al., 2008; Eppinger M. et al., 2010; Morelli G. et al., 2010]. Несмотря на свою эволюционную молодость, возбудитель чумы отличается значительным внутривидовым разнообразием и вариабельностью его фенотипических свойств, что связано с существованием штаммов Yersinia pestis в различных ландшафтно-географических условиях. Развитие методов современной фундаментальной генетики и молекулярной микробиологии позволяют перевести существующие классификации Y.pestis на качественно новый уровень, основанный на генетических свойствах возбудителя. Создание генетической классификации повысит надежность систематизации и позволит избежать недостатков, присущих фенотипическим схемам. Особую актуальность приобретает разработка системы молекулярного типирования штаммов Y.pestis, которая необходима для определения принадлежности выделяемых штаммов возбудителя чумы к подвиду, биовару и природному очагу, а также для получения молекулярных характеристик штаммов, циркулирующих в различных природных очагах чумы.

Для молекулярного типирования возбудителя чумы применяются различные генетические методы, такие как анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) и его варианты - IS - и риботипирование; мультилокусное или полногеномное секвенирование; мультилокусный анализ вариабельного числа тандемных повторов (MLVA); анализ отличающихся участков (DFR) и кластерных регулярно разделенных коротких палиндромных повторов (CRISPRs) [Бобров А.Г., Филиппов А.А. 1997; Горшков О.В. с соавт., 2000; Guiyoule A. et al., 1994; 1997; Achtman М. et al., 1999; 2004; Keim P. et al., 2000; Kotetishwili M. et al., 2005; Kingston J. et al., 2008; Li Y. et al., 2008; 2009; Morelli G. et al., 2010]. Также используются варианты ПЦР

типирования: с праймерами на случайно амплифицируемую полиморфную Д1 (RAPD), повторяющуюся экстрагенную палиндромную ДНК (REP), на повторяю щиеся межгенные консенсусные последовательности энтеробактерий (ERIC) и дру гие [Kim W. et al., 2003; De Gregorio E. et al., 2005; Kingston J. et al, 2008].

Каждый из перечисленных методов был апробирован на возбудителе чумы имеет свои преимущества и недостатки. С помощью метода IS типирования прове ден анализ родственных связей штаммов Y.pestis, циркулирующих на различных reo графических территориях, и осуществлена реконструкция внутривидовой эволюци возбудителя чумы [Бобров А.Г., Филиппов А.А. 1997; Горшков О.В. с соавт., 2000 Achtman M. et al., 1999, 2004]. Другой вариант RFLP - риботипирование был исполь зован для изучения мировой коллекции штаммов Y.pestis [Guiyoule A. et al, 199 1997], однако, этот метод практически не применялся для исследования штаммо Y.pestis из природных очагов Российской Федерации и ближнего зарубежья.

В изучении эволюционного родства чумного и псевдотуберкулезного микроб широкое распространение получил метод мультилокусного секвенировани [Achtman M. et al., 1999; 2004; Kotetishwili M. et al., 2005]. В то же время число и пользуемых ДНК мишеней ограничено, и необходимо значительно расширить их к личество для повышения эффективности внутривидовой дифференциации Y.pesti Все более очевидным становится преимущество полногеномного секвенировани однако, необходимость применения дорогостоящего оборудования значительно о раничивает его использование [Parkhill J. et al., 2001; Deng W. et al., 2002; Garcia E. al., 2008; Eppinger M. et al., 2007; Morelli G. et al., 2010].

Высокой разрешающей способностью обладают методы генотипирования, о нованные на использовании высоко вариабельных участков ДНК -VNTR, DFR CRISPRs [Сучков И.Ю. с соавт., 2004; Keim P. et al., 2000; Le Fie'che P. et al., 200 2002; Zhou D. et al, 2004; Pourcel C. et al., 2004; Cui Y. et al., 2008; Li Y. et al., 200 2009]. Эти методы позволяют выявлять близкородственные штаммы Y.pestis, однак ввиду высокой вариабельности используемых ДНК-мишеней необходимо совмес ное применение этих методов в комплексе с другими, дающими более стабильн результаты.

Данные по разрешающей способности еще одной группы методов - П (RAPD, ERIC, REP) носят противоречивый характер, и их место в общей схеме м лекулярного типирования штаммов Y.pestis остается неясным [Kim W. et al., 2003; Gregorio E. et al., 2005; Kingston J. et al., 2008].

Таким образом, в настоящее время не разработан единый методический по ход к молекулярному типированию штаммов Y.pestis, и не определено оптимальн сочетание методов для проведения внутривидового генотипирования штамм Y.pestis. Не создана система молекулярного типирования возбудителя чумы, котор

может решать задачи по многоуровневой дифференциации штаммов Y.pestis, в том числе, отделять штаммы основного высоковирулентного подвида от штаммов неосновных подвидов и от возбудителя псевдотуберкулеза; дифференцировать неосновные: кавказский, алтайский, гиссарский и улегейский подвиды; делить штаммы Y.pestis основного подвида по их биоварной принадлежности, а также устанавливать принадлежность штаммов Y.pestis к определенным природным очагам.

Создание системы молекулярного типирования необходимо и для выяснения современной структуры вида Y.pestis и оценки правильности используемых феноти-пических классификаций возбудителя чумы. Стандартизация используемых методических подходов и создание эффективной системы молекулярного типирования штаммов Y.pestis позволит внести необходимые изменения в существующую классификацию возбудителя чумы.

Цель работы. Сравнительный анализ эффективности методов молекулярного типирования возбудителя чумы и выбор их оптимального сочетания для определения подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности штаммов Y. pestis.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ микробиологических, биохимических и генетических особенностей штаммов Y. pestis из природных очагов Российской Федерации и ближнего зарубежья и установить приуроченность штаммов античного и средневекового биоваров к очагам определенного (сурочьего, сусликового и песчаночьего) типов.

2. На основе метода ПЦР разработать способ дифференциации штаммов У. pestis основного и неосновных подвидов и Yersinia pseudotuberculosis. Провести анализ эффективности методов ПЦР типирования для внутривидового генотипирования возбудителя чумы.

3. Модифицировать метод анализа полиформизма длин рестрикционных фрагментов генов биосинтеза рРНК (риботипирования) для повышения его эффективности для молекулярного типирования возбудителя чумы. Создать классификацию риботипов штаммов У. pestis, циркулирующих в Российской Федерации и в зарубежных странах.

4. Провести поиск высокоразрешающих ДНК мишеней и разработать схему дифференциации штаммов У. pestis по подвидовой и биоварной принадлежности на основе метода мультилокусного секвенирования.

5. Изучить эффективность совместного использования трех участков вариабельных тандемных повторов - msOl, ms04 и ms46 для установления очаговой принадлежности штаммов У. pestis.

6. Провести выбор оптимального сочетания методов молекулярного типирования для определения подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности штаммов Y. pestis.

Научная новизна работы. На основе комплексного исследования генетических и микробиологических свойств штаммов возбудителя чумы из природных очагов России и ближнего зарубежья установлена приуроченность штаммов средневе кового биовара к очагам сусликового и песчаночьего типов (за исключением Заба кайльского степного очага), а штаммов античного биовара к очагам сурочьего типа.

Впервые выявлены генетические локусы - гены жизнеобеспечения terC, ilvN inv, вариабельность которых позволяет быстро и эффективно проводить разделени штаммов основного и неосновных подвидов методом ПЦР. Штаммы основного под вида содержат в генах terC и ilvN, соответственно, делении размером 89 п.н. и 4 п.н., что отличает их от неосновных подвидов, у которых эти гены находятся в ин тактном виде. Наличие инсерции последовательности IS 1541 размером 708 п.н в ген inv отличает штаммы У. pestis основного и неосновных подвидов от штаммо У. pseudotuberculosis. Получено решение о выдаче патента по заявке № 201011979 (приоритет от 17.05.2010 г.) на изобретение «Способ дифференциации штаммов воз будителя чумы основного и неосновных подвидов методом полимеразной цепної реакции». Установлено, что ERIC ПЦР обладает большей эффективностью для гено типирования штаммов У. pestis по сравнению с другим методом ПЦР типирования RAPD ПЦР.

На основе изучения вариабельности участков хромосомы, содержащих ген 16S-rRNA, разработана схема классификации риботипов, по которой штаммы осно ного подвида из очагов России и сопредельных государств отнесены к I и III рибот пам, а неосновных подвидов - к VI риботипу.

Выявлены ДНК мишени - гены жизнеобеспечения rhaS, aspA, metB, парА tcaB, применение которых на основе метода мультилокусного секвенирования обе печивает определение принадлежности штаммов У. pestis к определенному подвид и биовару.

Показано, что совместное применение трех участков вариабельных тандемнь повторов - локусов msOl, ms04 и ms46 позволяет проводить кластеризацию штамм возбудителя чумы по очаговой принадлежности, а комплексное использование мет дов мультилокусного секвенирования и мультилокусного анализа числа вариабел ных тандемных повторов обеспечивает дифференциацию штаммов возбудителя ч мы по их принадлежности к подвидам, биоварам и природным очагам.

Практическая значимость работы. По результатам работы разработаны м тодические рекомендации «Выделение и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пр годной для тонких молекулярно-биологических экспериментов» (утверждены дире

тором РосНИПЧИ «Микроб» 17 апреля 2007 г.) и «Дифференциация штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов и возбудителя псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции» (утверждены директором РосНИПЧИ «Микроб» 14 октября 2010 г.).

В Государственной коллекции патогенных бактерий депонированы два штамма: У. pestis КМ 229 и КМ 956. в качестве референс-штаммов античного и средневекового биоваров для внутривидовой дифференциации Y. pestis методом мультило-кусного секвенирования, циркулирующих в Российской Федерации и в ближнем зарубежье.

Полученные в ходе выполнения данные по генетической организации штаммов Y. pestis используются при чтении лекций по предмету «Генетика возбудителя чумы» на курсах специализации по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб» и курсах повышения квалификации по программе усовершенствования врачей по специальности «бактериология» при РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. На территории Российской Федерации и ближнего зарубежья в природных очагах

чумы сусликового и песчаночьего типов (за исключением Забайкальского степного очага) циркулируют штаммы Y. pestis, содержащие мутацию (G —>на Т) в позиции 613 гена периплазматической нитратредуктазы парА (средневековый биовар), а в очагах сурочьего типа - штаммы, у которых эта мутация отсутствует (античный биовар).

2. Мультилокусная ПЦР с использованием эффективных ДНК мишеней, таких как гены terC (устойчивость к теллуру), ilvN (ацетолактатсинтаза) и im> (инвазин-адге-зин) обеспечивает надежную дифференциацию штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов, а также штаммов Y.pseudotuberculosis. Метод ПЦР типирования с праймерами на повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности энте-робактерий - ERIC ПЦР может быть использован для установления генетического родства штаммов возбудителя чумы.

3. Вариабельность хромосомных участков ДНК, содержащих гены биосинтеза рРНК, позволяет проводить дифференциацию штаммов Y.pestis по их происхождению. Штаммы основного подвида из природных очагов России и ближнего зарубежья относятся к I и III риботипам, а штаммы неосновных подвидов к VI риботипу.

4. Метод мультилокусного секвенирования с применением вариабельных последовательностей генов жизнедеятельности (rhaS, aspA, metB, парА, tcaB) обеспечивает установление принадлежности штаммов Y. pestis к подвиду и биовару; а метод мультилокусного анализа трех областей вариабельных тандемных повторов msOl, ms04 и ms46 проводит кластеризацию штаммов по их очаговой принадлежности. Комплексное использование методов мультилокусного секвенирования и мультилокусного

анализа числа вариабельных тандемных повторов позволяет проводить определение подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности штаммов Y. pestis.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на: 2-ой Всероссийской научно-практической конференции «Инфекции, обусловленные иерсиниями», г. Санкт-Петербург, 12-13 октября 2006 г.; Российском медицинском форуме «Фундаментальная наука и практика», Москва, 2006 г.; научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», Нижний Новгород, 31 мая 2006 г.; 7-ой Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ, Оболенск, 2006 г.; X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств - участников СНГ», 2010 г.; а также на ежегодных итого вых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», Саратов, 2006- 2011 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них в периодических изданиях, входящих в перечень ведущих рецензируемых научнь журналов, рекомендованных ВАК России.

Структура и объём диссертации. Диссертация представлена на 166 страни цах, состоит из введения, главы обзора литературы, пяти глав собственных исследо ваний (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения выводов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 27 рисунками. Библиографически указатель содержит 218 отечественных и зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В работе использовано более 130 штаммов У. pestis, выделенных в природны

очагах на территории Российской Федерации и за рубежом, а также 10 штаммо У. pseudotuberculosis различного происхождения. Культуры Y. pestis и У. pseudotuber culosis выращивали на агаре и бульоне LB при 28 °С в течение 24 - 48 часов. Для оп ределения денитрифицирующей активности, ферментации глицерина, арабинозь рамнозы, мелибиозы применяли общепринятые методы исследования биохимиче ской активности штаммов возбудителей чумы и псевдотуберкулеза [Руководство п лабораторной диагностики чумы, 2009 г.]. Питательные потребности штаммо У. pestis определяли на минимальной синтетической среде, предложенной R. Вг baker (1970) с небольшими модификациями.

Выделение ДНК штаммов У. pestis осуществляли стандартным методом с п мощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинтиоизоцианата [МУ 1.3.179 03]. Полимеразную цепную реакцию проводили на программируемом термоциклер БИС-Н (ООО «БИС-Н», Россия), а продукты ПЦР анализировали методом электр

фореза в 0,8 - 2 % агарозном геле, согласно рекомендациям, изложенным в руководствах Л.А. Остермана (1981) и Т. Маниатиса с соавт. (1984).

Рестрикцию ДНК бактериальных штаммов с помощью эндонуклеаз рестрикции и ДНК-ДНК гибридизацию по Саузерну осуществляли, как это описано в руководстве по молекулярному клонированию [Маниатис Т. с соавт., 1984]. В качестве ДНК зонда использовали фрагменты генов 16S-rRNA, которые получали в ПЦР и метили дигоксигенином («Roche Diagnostics», Германия).

Определение нуклеотидной последовательности продуктов амплификации осуществляли на генетическом анализаторе модели "CEQ 8000" (Beckman Coulter). Сравнительный анализ геномов бактерий проводили с помощью алгоритма BLAST базы данных NCBI GenBank. Построение дендрограмм выполняли с помощью компьютерных программ Mega 5.0 и SplitsTree 4.0 с использованием дистанционно-матричного метода UPGMA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Изучение микробиологических и биохимических свойств штаммов Y. pestis

основного и неосновных подвидов из природных очагов чумы различного типа

Для оценки эффективности различных молекулярно-генетических методов, применяемых при генотипировании возбудителя чумы, была изучена коллекция из 130 природных штаммов Y. pestis, отражающих внутривидовое разнообразие возбудителя и относящихся к различным подвидам, биоварам и природным очагам, расположенным в Российской Федерации и за рубежом.

Таблица 1. Характеристика биохимических свойств штаммов К выделенных в Российской Федерации и ближнем зарубежье ___

Штаммы Yersinia pestis Редукция нитратов/ мутация в папЛ Ферментация арабинозы Ферментация мели-биозы, рам-нозы Ферментация глицерина/ мутация в glpD

subsp. pestis (основной подвид): очаги сурочьего типа (античный биовар): 20 штаммов очаги сусликового и песчаночьего типов (средневековый биовар):25 штаммов + /--/ + + + - + /-+ /-

subsp. caucasica (кавказский подвид"): + /- + + + /-

15 штаммов

subsp. altaica (алтайский подвид): 13 штаммов -/- _ + + /-

subsp. hissarica (гиссарский подвид): 11 штаммов + + /-

subsp. uleseica (улегейский подвид): 6 штаммов + + + /-

Все использованные в работе штаммы возбудителя чумы имели типичные культурально-морфологические свойства, характерные для бактерий К рея^. Обоб-

щенные биохимические характеристики использованных в работе штаммов Y. pestis, представлены в таблице 1.

Ранее при анализе фенотипических и генетических свойств штаммов Y. pestis было показано, что на территории Российской Федерации и ближнего зарубежья распространены штаммы античного и средневекового биоваров, в то время как очагов с постоянной циркуляцией штаммов восточного биовара здесь не выявлено [Султанов Г.В, Козлов М.П., 1995; Одиноков Г.Н., 2010]. Нами проведены дальнейшие исследования по изучению особенностей распространения штаммов Y. pestis античного и средневекового биоваров на территории России и сопредельных стран и исследована приуроченность этих биоваров к очагам сусликового, песчаночьего и сурочьего типов. Изучение денитрифицирующей активности показало, что неспособные к денитрификации штаммы циркулируют в очагах сусликового и песчаночьего типа, в то время как денитрифицирующие штаммы распространены в очагах су рочьего типа.

С помощью специфических праймеров на ген парА и амплификации вариа бельного участка гена в ПЦР нами проведено сравнительное секвенирование парА штаммов чумного микроба из очагов сурочьего, сусликового и песчаночьего типов Полученные результаты показали, что штаммы из очагов сурочьего типа не содер жат характерной для штамма средневекового биовара мутации - замены единичног нуклеотида (G —► Т) в позиции 613 от начала гена [Deng W. et al., 2002; Motin V. e al., 2002], что наряду с наличием денитрифицирующей активности доказывает и принадлежность к античному биовару. В противоположность им штаммы Y. pestis и очагов сусликового и песчаночьего типов содержат характерную мутацию в ген парА и не денитрифицируют нитраты, что определяет их принадлежность к средне вековому биовару. Единственным исключением из этого правила является Забай кальский степной очаг сусликового типа, в котором циркулируют штаммы антично го биовара. По-видимому, это исключение связано со сменой носителя (сурка н суслика), которое произошло ранее в этом природном очаге чумы. 2. Использование метода ПЦР для проведения внутривидовой дифференциаци штаммов Y. pestis

Нами были изучены возможности метода ПЦР для проведения внутривидово дифференциации штаммов возбудителя чумы. Для разработки простого способ дифференциации штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов и возбудител псевдотуберкулеза в ПЦР нами был проведен поиск перспективных ДНК мишеней отобраны хромосомные гены terC, ilvN и inv, кодирующие, соответственно, белок р зистентности к теллуру, ацетолактатсинтазу и инвазин-адгезин. На основе проведе ного компьютерного анализа впервые установлено, что все штаммы Y. pestis ocho ного подвида из NCBI GenBank содержат в гене terC делецию размером 89 п.н., а

гене ilvN - делению размером 45 п.н. В гене inv у всех штаммов У. pestis выявлено присутствие вставки инсерционной последовательности IS 1541 размером 708 п.н., отсутствующей у штаммов У. pseudotuberculosis. На вариабельные области генов terC, ilvN и inv нами рассчитаны праймеры, с помощью которых изучены природные штаммы У. pestis и У. pseudotuberculosis (рис. 1).

Как оказалось, у штаммов основного подвида образовывались амплификаты размером 300 п.н. (terC), 515 п.н. (ilvN) и 877 п.н. (inv); у неосновных подвидов -389 п.н. (terC), 560 п.н. (ilvN) и 877 п.н. (inv); у Y.pseudotuberculoisis - 389 п.н. (terC), 560 п.н. (ilvN) и 169 п.н. (inv). Всего с помощью разработанной мультилокусной ПЦР было исследовано 130 природных штаммов У. pestis и 10 штаммов У. pseudotuberculosis, и показана эффективность выбранных ДНК мишеней для проведения внутривидовой дифференциации возбудителя чумы.

Таким образом, впервые сконструирована мультилокусная ПЦР, которая позволяет просто и эффективно разделять штаммы У. pestis основного и неосновных подвидов и У. pseudotuberculosis. При этом дифференциация штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов проводится по двум ДНК локусам - terC и ilvN, расположенным в разных участках хромосомы, что повышает надежность идентификации штаммов У. pestis основного высоковирулентного подвида.

Рисунок 1. ПЦР анализ штаммов У. pestis и У. pseudotuberculosis с праймерами на гены terC, ilvN и inv. Штаммы У. pestis основного: 1- 8; 9: маркер молекулярных масс O'Range Ruler™ 100 bp DNA Ladders (Fermentas); штаммы кавказского: 10 - 11; алтайского: 12; гиссарского: 13; улегейского: 14 подвидов; У. pseudotuberculosis'. 15-17.

Нами также исследована эффективность методов ПЦР типирования с применением случайных праймеров (RAPD ПЦР) и праймеров на повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности энтеробактерий (ERIC ПЦР) для генотипиро-вания штаммов У. pestis, циркулирующих в очагах России и за рубежом. Полученные результаты свидетельствуют о том, что RAPD ПЦР [Булат С.А. с соавт., 1992; Ако-pyantz N. et al., 1992] имеет ограниченные типирующие возможности в отношении штаммов возбудителя чумы. Профили RAPD амплификации штаммов основного и

неосновных подвидов мало отличались друг от друга, как и у штаммов внутри группы неосновных подвидов. Наибольшую разрешающую способность этот метод имел в отношении штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов.

Большую по сравнению с RAPD ПЦР эффективность имеет метод ERIC ПЦР. Профили амплификации в ERIC ПЦР, полученные с помощью специфических прай-меров [Versalovic J. et al., 1991], у штаммов Y. pestis основного и неосновных подвидов отличаются между собой (за исключением штаммов улегейского подвида). В тоже время ERIC ПЦР не позволяет дифференцировать штаммы античного и средневекового биоваров, а также не разделяет штаммы неосновных подвидов. Штаммы Y. pseudotuberculosis имеют принципиально отличающиеся профили ERIC амплификации.

С помощью метода ERIC ПЦР нами проведено изучение штаммов, выделенных на Американском континенте. Из всех изученных американских штаммов идентичные ПЦР профили имели штаммы, выделенные в Бразилии - Ехи 21 и Ехи 33, которые были очень близки штамму 65/23 восточного биовара из Вьетнама. ПЦР - профили штаммов М-23 и 193 Hawai из США были идентичны между собой и близки| штаммам Ехи 21, Ехи 33 и 65/23, но, все же, отличались от них. Уникальные ПЦР фингерпринты имели штаммы 14 Аргентина, А-1122 и Sonche, которые отличались от других американских штаммов, а также от изолятов античного и средневекового биоваров (рис. 2).

1 i 's в в v ю гз 3.2

Рисунок 2. ERIC ПЦР типирование штаммов Y. pestis. Американские штаммы: 1) Exil 21, 2) Ехи 33, 3) 14 Аргентина, 4) М-23, 5) А-1122, 6) Sonche, 7) 193 Hawai; 8) Kenyíj 102 - античный, 9) А-161 - средневековый, 10) 65/23 - восточный, 11) С-621 - сред' невековый, 12) 1 kb Ladders (Gibco - BRL).

Таким образом, по данным ERIC ПЦР типирования большая часть изученный нами американских штаммов близка штамму восточного биовара 65/23, выделенно) му в Юго-Восточной Азии. В то же время наличие среди них штаммов с отличаю| щимися ПЦР - фингерпринтами позволяют высказать предположение о том, что эта штаммы представляют различные филогенетические линии Y. pestis восточного био вара.

Как следует из полученных результатов, методы ГТЦР являются полезным инструментом внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы. В целом они позволяют разделять виды У. pseudotuberculosis и У. pestis, основной и неосновные подвиды чумного микроба, изоляты различного географического происхождения. Ввиду простоты выполнения методы ПЦР могут быть использованы для быстрого генотипирования штаммов У.pestis и определения их филогенетической близости. 3. Риботипирование штаммов возбудителя чумы основного и неосновных подвидов

Нами была разработана модификация метода риботипирования с применением в качестве ДНК зонда на гены биосинтеза рРНК фрагмента гена 16S-rRNA, который получали в ПЦР с помощью рассчитанных праймеров. Проведенное секвенирование гена 16S-rRNA у ряда штаммов У. pestis и У. pseudotuberculosis выявило их полную идентичность у этих близкородственных бактерий, что обеспечивает гибридизацию используемого зонда со штаммами У. pestis всех биоваров и подвидов, а также со штаммами У. pseudotuberculosis.

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК, содержащих гены биосинтеза рРНК, исследован нами у 127 штаммов чумного микроба основного и неосновных подвидов, выделенных в природных очагах чумы в Российской Федерации и в ближнем (всего 89 штаммов), а также дальнем (38 штаммов) зарубежье. На основании изучения ЕсоШ профилей рестрикции ггп генов у штаммов У. pestis нами выделено 11 риботипов (рис. 3).

1 II III IV Y VI VII VIII IX X XI i'pslbc

Рисунок 3. Схема риботипов штаммов У. pestis их различных географических регионов

Установлено, что на территории РФ и ближнего зарубежья циркулируют штаммы, относящиеся к риботипам -1, III (основной подвид) и VI (неосновные подвиды). Штаммы У. pestis основного подвида, выделяемые из различных природных очагов Российской Федерации и ближнего зарубежья, относятся к риботипу I. На территории Монголии выделяют штаммы основного подвида III риботипа. Все штаммы неосновных подвидов относятся к риботипу VI (рис.3).

Нами также изучен полиморфизм длин рестрикционных фрагментов генов биосинтеза рРНК у штаммов, полученных в странах дальнего зарубежья, в том числе в

Африке (Кения, Конго, Сенегал, Мадагаскар, Марокко), Америке (Бразилия, Аргентина, США), Азии (Монголия, Китай, Индия, Иран, Израиль, Вьетнам, Камбоджа) и Европе (Франция, Германия, Италия, Турция). Выявлено большое разнообразие ри-ботипов в Африке, где выделяются штаммы всех трёх биоваров - antiqua, medievalis, orientalis. Штаммы, распространённые на этом континенте, относятся ко II, IV, VIII, IX, X, XI риботипам. В глубине материка (Конго, Кения и другие), где имеются древние эндемичные очаги чумы, выделяют штаммы биоваров antiqua, medievalis, относящиесяк риботипам VIII, X, XI, в то время как штамммы биовара orientalis, изолированные на побережье (Мадагаскар, Марокко, Сенегал), относятся ко II и IV риботипам и занесены сюда во время третьей пандемии чумы, вызванной этим биоваром в начале XX века. Нами установлено, что штамм Y. pestis EV восточного биовара, выделенный в 1926 г. на о. Мадагаскар, имеет уникальный риботип, отличительной чертой которого является наличие низкомолекулярного фрагмента, не встречающегося у других штаммов. Риботипу штамма EV присвоен номер IX, который позволяет отличать этот штамм от других штаммов Y.pestis.

К биовару orientalis относятся изученные нами штаммы, выделенные в странах Американского континента - Аргентине, Бразилии, в США и на Гавайских островах. Эти штаммы представляют собой преимущественно II риботип.

На территории Азиатского континента (Монголия, Китай, Иран, Индия, и другие) циркулируют штаммы биовара medievalis, а также биовара antiqua. Изученные нами штаммы этих биоваров азиатского происхождения относятся, в основном, к I и III риботипам (хотя встречаются штаммы и других риботипов), совпадающим с ри-ботипами штаммов основного подвида Y. pestis из природных очагов РФ и других стран СНГ, что свидетельствует о филогенетической близости штаммов, циркулирующих в Азиатском регионе. Риботипы штаммов antiqua и medievalis азиатского происхождения отличаются от риботипов африканских штаммов этих биоваров.

Штаммы Y. pestis, выделенные в Юго-Восточной Азии (Вьетнам, Камбоджа), относятся к биовару orientalis и как штаммы восточного биовара с других континентов относятся к риботипам II и IV. Штаммы Y. pestis из Европы (Франция, Италия, Германия, Турция и другие), так же относятся к восточному биовару и имеют риботипы II и IV.

Изучение штаммов У. pseudotuberculosis, выделенных в Российской Федерации (Дальний Восток, Астраханская область) и в Средней Азии (Туркмения), а также за рубежом, показало, что штаммы этого возбудителя имеют другие профили рестрикции генов рРНК, которые значительно отличаются от штаммов Y. pestis.

Таким образом, разработанная нами классификация риботипов штаммов чумного микроба позволяет проводить дифференциацию штаммов чумного и псевдотуберкулёзного микробов, штаммов возбудителя чумы основного подвида от неоснов-

ных подвидов; штаммов биовара orientalis от биоваров antiqua и medievalis. С помощью полученных результатов определена приуроченность различных риботипов к конкретным географическим территориям.

4. Анализ эффективности методов мультилокусного секвенирования и мульти-локуеного анализа числа вариабельных тандемных повторов для типирования штаммов Y.pestis

Метод мультилокусного секвенирования является одним из самых эффективных методов генотипирования, однако, достаточно сложную задачу представляет собой поиск эффективных ДНК мишеней для проведения внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis. Нами в качестве таких ДНК мишеней выбраны гены: rhaS (активатор транскрипции L-рамнозного оперона), aspA (аспартатаммониум-лиаза), metB (цистатионин-у-синтаза), парА (периплазматическая нитратредуктаза) и tcaB (белок ТсаВ комплекса инсектицидных токсинов).

Ранее JI.M. Куклевой с соавт. (2009) при секвенирования полной нуклеотид-ной последовательности гена rhaS у штаммов Y. pestis выявлены три вариабельных локуса в позициях 482, 494 и 671. Нами в рамках этой работы при анализе 46 штаммов возбудителя чумы подтверждено, что наличие замены нуклеотида A—>G в позиции 671 от начала регуляторного гена rhaS рамнозного оперона, является характерным только для штаммов основного подвида (табл. 2). В позиции 482 у штаммов Y. pestis основного, кавказского, алтайского и улегейского подвидов и у штаммов Y. pseudotuberculosis выявлено присутствие нуклеотида G, а у штаммов гиссарского подвида - нуклеотида А, что отличает его от штаммов других подвидов и может рассматриваться как характерная генетическая метка штаммов гиссарского подвида. В локусе 494 гена rhaS у штаммов кавказского подвида и возбудителя псевдотуберкулеза содержится нуклеотид С, а у всех остальных подвидов - Т. Таким образом, вариабельность нуклеотидной последовательности гена rhaS по трем ранее выявленным локусам единичных нуклеотидных замен делает его высокоэффективной ДНК мишенью для проведения внутривидовой дифференциации возбудителя чумы.

Выявлена также значительная вариабельность нуклеотидной последовательности другого гена - aspA, кодирующего белок AspA (табл. 2). При секвенировании природных штаммов Y. pestis установлено, что в последовательности гена aspA содержится вариабельный локус в позиции 1087 - 1089 от начала гена, в котором у штаммов основного подвида присутствует триплет TTG, кодирующий аминокислоту лейцин в положении 363 белка AspA. Штаммы кавказского и улегейского подвидов содержат в позиции 1087-1089 триплет TCG, который кодирует аминокислоту серии. У штаммов алтайского и гиссарского подвида в этой позиции присутствует триплет GTG, детерминирующий в белке AspA аминокислоту валин. Часть штаммов из высокогорного очага чумы в Киргизии, как и штаммы кавказского и улегейского

подвидов, имеют в этом локусе триплет TCG и аминокислоту серии в AspA. Еще один штамм основного подвида из высокогорного очага чумы на Кавказе - КМ776 содержит в этой позиции триплет ТТТ, который кодирует аминокислоту фенилала-нин. Такую же мутацию имеют и два штамма-Nepal516 и Angola, представленные в базе данных NCBI GenBank. Таким образом, использование вариабельности нуклео-тидной последовательности гена aspA позволяет выделять дополнительные группы штаммов внутри основного подвида Y. pestis.

Таблица 2. Вариабельность генов rhaS, aspA, metB, парА и tcaB у штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis. *Указаны размеры (в п.н.) секвенированного фрагмента гена

Штаммы СТ\ оо rhaS (822) *

aspA 1087- 10 (436)* 482 494 671 пар А 61 (719)* metB 988 - 98 (483)* fV4 " t^ Ч О С а — S ^ CN < W *—'

Yersinia pestis GenBank: С092 (orientalis) KIM10 (medievalis) Antiqua Nepal516 (antiqua) Angola 91001 (microtus) Pestoides F (кавказский п/в) Y.pseudotubercu-losis: 5 шт. TTG TTG TTG ТТТ ТТТ GTG TCG GTG G G G G G G G G Т Т Т Т Т Т С С А А А А G G G G G т G G G G G G T(-G) А T(-G)A T(-G)A T(-G)A GT GT GT GT T А А А А А А А

Yersinia pestis Основной п/в 4 шт. (восточный б/в) TTG G Т А G T(-G)A Т

8 шт. (античный б/в) TTG G Т А G T(-G)A А

9 шт. (средневековый б/в) TTG G Т А Т T(-G)A А

2 шт. (античный б/в) TCG G Т А G T(-G)A Т

1 шт. (средневековый б/в) ТТТ G Т А Т T(-G)A А

Кавказский п/в 4 шт. TCG G С G G GT А

Алтайский п/в 4 шт. GTG G т G G GT А

Гиссарский п/в 4 шт. GTG А т G G G(+G) А

Улегейский п/в 4 шт. TCG G т G G GT А

Еще одной эффективной ДНК мишенью для проведения внутривидового гено-типирования является ген met В, продукт которого цистатионин-у-синтаза участвует в биосинтезе серосодержащей аминокислоты - метионина. При секвенировании этого гена нами впервые показано, что в гене metB у штаммов основного подвида в позиции 988 от начала гена присутствует делеция единичного нуклеотида - гуанина, которая приводит к сдвигу рамки считывания и преждевременной остановке трансляции полипептидной цепи молекулы фермента после 329 аминокислотного остатка за счет образования стоп-кодона TAG в позициях 988-990. У всех штаммов кавказского, алтайского и улегейского подвидов, а также У. pseudotuberculosis делеция G в гене metB отсутствует. В отличие от других неосновных подвидов у штаммов У. pestis гиссарского подвида выявлена инсерция единичного нуклеотида (+ G) в позиции 989 гена metB, которая может рассматриваться как характерная генетическая метка этого подвида. Применение вариабельных локусов всех трех генов - rhaS, aspA и metB позволяет разделять штаммы У. pestis, относящиеся к основному, кавказскому, алтайскому, гиссарскому и улегейскому подвидам.

С помощью проведенного нами компьютерного анализа, а также данных литературы были определены еще две ДНК-мишени, применение которых обеспечивает проведение дифференциации штаммов У. pestis основного подвида по их принадлежности к трем биоварам - античному, средневековому и восточному. Для выделения штаммов средневекового биовара была использована мутация в гене периплаз-матической нитратредуктазы пар А - замена единичного нуклеотида G —>Т в позиции 613, которая присутствует только у штаммов этого биовара [Deng W. et al., 2002; Motin V. et al., 2002]. Для дифференциации штаммов восточного биовара нами использована обнаруженная ранее мутация в одном из генов комплекса инсектицидных токсинов - tcaB [Одиноков Г.Н. с соавт., 2010]. Штаммы У. pestis восточного биовара содержат делецию единичного нуклеотида (-А) в позиции 1037 от начала гена tcaB, которая нарушает его функциональность. Проведенное нами секвенирова-ние полученных в ПЦР фрагментов гена tcaB у различных штаммов У. pestis показало, что у всех изученных штаммов восточного биовара присутствовала мутация -делеция единичного нуклеотида (-А) в позиции 1370 от начала гена). В то же время подобная мутация отсутствовала у штаммов других биоваров и подвидов, из чего следует, что делеция единичного нуклеотида в позиции 1370 гена tcaB является специфическим генетическим маркером штаммов восточного биовара.

Таким образом, использование двух локусов парА и tcaB обеспечивает эффективное разделение штаммов всех трех биоваров У. pestis, а их применение в сочетании с тремя вышеуказанными мишенями - rhaS, aspA, metB позволяет определять как подвидовую так и биоварную принадлежности штаммов У. pestis, что подтвер-

ждено при построении дендрограмм штаммов К ревйь различных подвидов с помощью дистанционно-матричного метода ШвМА (рис.4).

Рисунок 4. UPGMA дендрограмма штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis, построенная на основе вариабельных локусов генов rhaS, aspA, metB, парА и tcaB.

Однако значительный консерватизм генов жизнеобеспечения у возбудителя чумы не позволяет на их основе в полной мере провести определение очаговой принадлежности штаммов Y.pestis. В связи с этим требуется совместное использование метода мультилокусного секвенирования в комплексе с другим высокоразрешающим методом, основанном на применении более вариабельных ДНК локусов, таких как VNTR. Мы изучили типирующие возможности трех VNTR локусов: msOl, ms04 и ms046 [Le Fle'che P. et al., 2002; Pourcel C. et al., 2004] для определения очаговой принадлежности штаммов Y. pestis, циркулирующих в природных очагах Российской Федерации, ближнего и дальнего зарубежья. Всего было исследовано 83 природных штамма Y. pestis.

При использовании VNTR локуса- msOl изученные штаммы разделились на 10 генотипов. Применение локуса msOl обеспечивало выделение в отдельную группу штаммов алтайского и гиссарского подвидов, а также штаммов основного подвида средневекового биовара, но не позволяло разделять их по очаговой принадлежности, как и не разделяло штаммы античного, восточного биоваров и улегейского подвида, объединяя их в один кластер. Наибольшая разрешающая способность локуса msOl отмечалась по отношению к штаммам кавказского подвида, которые делились на несколько VNTR-типов. С помощью локуса ms04 было выделено 8 генотипов, в которые входили штаммы восточного биовара, а также штаммы улегейского и гис-

сарского подвидов. Однако применение гпэОД не позволяло дифференцировать штаммы алтайского и кавказского подвидов, а также не разделяло между собой штаммы средневекового биовара. Наиболее вариабельным оказался локус гш46, использование которого позволило выделить 15 генотипов среди изученных штаммов. Использование этого локуса не обеспечивало четкой дифференциации штаммов античного и восточного биоваров, но позволяло разделять штаммы средневекового биовара по очаговой принадлежности.

В то же время нами установлено, что использование трех локусов - тз01, шбСМ, тз46 позволяет дифференцировать штаммы античного, средневекового, восточного биоваров, а также гиссарского, улегейского, кавказского и алтайского подвидов. Совместное использование трех УЫТЯ локусов создает основу для дифференциации штаммов У ре5/« и по очаговой принадлежности. Однако в целом правильно выделяя в отдельные кластеры штаммы У. р&г/и по подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности, метод МЬУА не обеспечивает эффективного анализа филогенетического родства штаммов и реконструкции внутривидовой эволюции возбудителя чумы. На одной ветви дендрограммы одновременно присутствуют кластеры штаммов разных подвидов и биоваров возбудителя чумы, что свидетельствует об ограниченных возможностях применения этого метода для проведения классификации штаммов У.

Для повышения надежности генотипирования штаммов У. ре^/« по их, принадлежности к подвидам, биоварам и очаговой приуроченности нами была изучена возможность комплексного использования вариабельных локусов генов жизнеобеспечения гИаЗ, аэрА, теШ, парА и 1саВ (определение подвидов и биоваров) в сочетании с анализом трех вариабельных УЫТЯ локусов - гш01, гпбСМ, гш46 (определение очаговой принадлежности) (рис. 5).

Совместное использование вариабельных участков генов жизнеобеспечения и УЖИ. локусов повышает надежность дифференциации штаммов У. реэйх по подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности, и в целом правильно отражает внутривидовые филогенетические связи вида. В дальнейшем для создания более надежной и высокоразрешающей системы молекулярного типирования возбудителя чумы следует расширить данные по штаммам У. pe.il¡5 из различных природных очагов Российской Федерации, ближнего и дальнего зарубежья.

Таким образом, нами проведено сравнительное изучение эффективности ряда современных молекулярно-генетических методов для молекулярного типирования штаммов возбудителя чумы и выявлено очевидное преимущество использования для этих целей двух методов - мультилокусного секвенирования и мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов. Их совместное использование позволяет проводить определение видовой, подвидовой, биоварной и очаговой принад-

лежности штаммов У. резИз. При этом метод мультилокусного секвенирования обеспечивает определение подвидовой, биоварной и, частично, природно-очаговой принадлежности, а метод мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов - кластеризацию штаммов по очаговой приуроченности.

К-S-*-s-1

Рисунок 5. UPGMA дендрограмма штаммов У. pestis на основе вариабельности генов жизнеобеспечения: rhaS, aspA, metB, парА, tcaB и трех VNTR локусов: msOl, ms04 и ms46.

Полученные в ходе этого диссертационного исследования данные создают основу для разработки системы молекулярного типирования штаммов возбудителя чумы; составления молекулярных портретов штаммов из природных очагов Российской Федерации и ближнего зарубежья, а также для определения современной структуры вида У. pestis.

ВЫВОДЫ

1. На основе комплексного изучения генетических и фенотипических свойств штам- j мов У. pestis различного происхождения установлено, что в природных очагах сусликового и песчаночьего типа (за исключением Забайкальского степного очага), расположенных в Российской Федерации и странах ближнего зарубежья, циркулируют штаммы средневекового биовара, а в очагах сурочьего типа - штаммы античного биовара.

2. Сконструированная мультилокусная ПЦР на вариабельные участки генов жизне-, обеспечения terC, ilvN и inv позволяет проводить дифференциацию штаммов У. pestis\ основного и неосновных подвидов и У. pseudotuberculosis. Надежность разделения

штаммов основного и неосновных подвидов возбудителя чумы обеспечивается применением двух локусов terC и ilvN, которые отличаются у этих подвидов.

3. Сравнительное изучение методов ПЦР типирования с применением случайных праймеров (RAPD ПЦР) и праймеров на повторяющиеся межгенные консенсусные последовательности энтеробактерий (ERIC ПЦР) выявило более высокую эффективность ERIC ПЦР, которая может быть применена для установления генетического родства штаммов возбудителя чумы.

4. Разработанная модификация метода риботипирования с использованием в качестве ДНК зонда фрагмента гена l6S-rRNA повышает его эффективность для внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis. В соответствии с созданной классификацией риботипов штаммы основного подвида из природных очагов чумы в Российской Федерации и ближнего зарубежья отнесены к I и III риботипам, а неосновных подвидов - к VI риботипу.

5. Создана система мультилокусного секвенирования возбудителя чумы на основе вариабельности последовательностей генов жизнеобеспечения rhaS, aspA, metB, парА, tcaB, которая обеспечивает определение подвидовой и биоварной принадлежности штаммов К pestis.

6. Установлена эффективность кластеризации штаммов Y. pestis по их очаговой принадлежности на основе применения трех участков вариабельных тандемных повторов - msOl, ms04 и ms46. Использование метода мультилокусного анализа числа вариабельных тандемных повторов в комплексе с мультилокусным секвенированием позволяет проводить дифференциацию штаммов Y.pestis по подвидовой, биоварной и очаговой принадлежности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куклева JIM., Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Шавина Н.Ю., Солодовников

Н.С Кутырев В.В. Характеристика штаммов возбудителя чумы разных подвидов по признакам нитратредукции, ферментации глицерина и арабинозы// Пробл. особо опасных инф. - 2007. - Вып. (94) - С.50-53. (Журнал из перечня ВАК)

2. Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Куклева JI.M., Шавина Н.Ю., Кутырев В.В. Генотипирование штаммов Yersinia pestis на основе вариабельности генов биосинтеза рРНК// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунбиол. - 2007. - №3. - С.6-10. (Журнал из перечня ВАК)

3. Куклева JIM., Ерошенко Г.А., Шавина Н.Ю., Павлова А.И., Кутырев В.В. Молекулярно-генетические особенности штаммов возбудителя чумы, выделенные на Американском континенте// Пробл. особо опасных инф. - 2007. - Вып. (93). - С.55-57. (Журнал из перечня ВАК)

4. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Павлова А.И., Шавина Н.Ю., Краснов Я.М., Гусева Н.П., Кутырев В.В. Вариабельные локусы генов пар A, aspA,

rhaS, zwf и tcaB как эффективные ДНК-мишени для генотипирования штаммов Yersinia pestisll Пробл. особо опасных инф. - 2010. - Вып. (104). - С. 57-59. (Журнал из перечня ВАК)

5. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Краснов Я.М., Куклева JI.M., Шавина Н.Ю., Павлова А.И., Кутырев В.В. Генетические основы метионинзависимости штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов// Генетика. - 2011. -№ 2. -С. 1519. (Журнал из перечня ВАК)

6. Павлова А.И., Ерошенко Г.А., Куклева JI.M., Шавина Н.Ю., Кутырев В.В. Использование вариабельности /ттг-участков хромосомы для типирования штаммов Yersinia pestis// Инфекции, обусловленные иерсиниями: Матер. 2-й Всерос. науч.-практ.конф. - СПб., 2006. - С.104-106.

7. Куклева JI.M., Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Шавина Н.Ю., Солодовников Н.С Кутырев В.В. Изучение особенностей проявления признака нитратредукции штаммами основного и неосновных подвидов возбудителя чумы// Фундаментальная наука и практика: Тез. докл. - М., 2006. - С.81.

8. Павлова А.И., Ерошенко Г.А., Куклева JI.M., Шавина Н.Ю Кутырев В.В. Риботипирование штаммов патогенных иерсиний// Фундаментальная наука и практика: Тез-докл. - М„ 2006.-С.118.

9. Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Куклева JI.M.. Шавина Н.Ю., Кутырев В.В. Рибо- и ПЦР типирование штаммов чумного микроба// Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний: Ма-тер.научн;Конф - Н. Новгород, 2006. - С.76.

10. Павлова А.И., Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Куклева JI.M., Шавина Н.Ю., Кутырев В.В. Использование молекулярно-генетических методов для изучения основных и неосновных подвидов возбудителя чумы и штаммов с измененными свойствами// Матер. 7-й Межгос.науч.-практ. конф.госуд.-участников СНГ. - Оболенск, 2006.-С.231-232.

11. Ерошенко Г.А., Кутырев В.В., Куклева JI.M., Павлова А.И. Комплексный подход к молекулярному типированию штаммов Yersinia pestis// Материалы IX съезда Всероссийс. науч.-практ. об-ва эпидемиол., микробиол. и паразитол. - 2007. - Т.З. - С. 46-47.

12. Одиноков Г.Н., Ерошенко Г.А., Павлова А.И., Кутырев В.В. Генетические особенности экспрессии биохимических признаков у штаммов Yersinia pestis основного и неосновных подвидов// Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств - участников СНГ: Матер. X Межгос. научно-практической конф. государств-участников СНГ. - 2010. - 216-217.

Подписано к печати 06.02.2012 Формат 60 х 84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46